JP2018534327A - レンチウイルス調製物の安定化のための緩衝液 - Google Patents

Abstract

本発明は、スルホン酸緩衝液、例えば、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）および３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸（ＭＯＰＳ）、クエン酸ナトリウム緩衝液またはリン酸塩緩衝液を含むレンチウイルス調製物を提供する。本発明には更に、レンチウイルス精製の方法ならびにヒト細胞を形質導入する方法が包含される。

Description

本発明は、改善された形質導入能力および保存安定性を示すレンチウイルス調製物、ならびに標的細胞における異種遺伝子発現方法に関する。

遺伝子治療技術の進歩により、治療用ウイルスベクターの使用は、ますます有効なヒト疾患の治療方法として代表的なものとなっている。ウイルスベクターの中で、遺伝子治療用途に利用できるものはレンチウイルスベクターである。かかるベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）から誘導される再構築されたウイルスベクター系が挙げられ、それは動物およびヒトの初代細胞または細胞系に目的遺伝子を導入できる。レンチウイルスベクターのゲノムはＲＮＡのコーディング鎖を含み、それは宿主細胞の細胞質に入るとウイルス由来のリバーストランスクリプターゼによって、ＤＮＡに逆転写され、ＤＮＡプレインテグレーション複合体が形成される。この複合体は、宿主細胞の核内に輸送され、一部のウイルスＤＮＡが宿主細胞ゲノムにその後組み込まれる。その次に、組み込まれたＤＮＡはタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡなどのＲＮＡに転写され得、それは続く目的タンパク質の発現のために最終的に細胞質に輸送され得る。

レンチウイルスベクターにより媒介される遺伝子発現は、持続的および安定的なタンパク質産生に用いることができるが、その理由は、目的の遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより細胞***の際に複製されるからである。レンチウイルスベクターは、細胞周期を通じて、非***細胞にも、活発に***を進行させている細胞と同様に、効果的に感染できる。対照的に、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび古典的レトロウイルスベクターなどの他のウイルスベクターは、***細胞に感染できるだけである。レンチウイルスベクターにより媒介される目的遺伝子の慢性的発現が可能な組織および細胞としては、とりわけ、脳、肝臓、筋細胞、網膜、造血幹細胞、髄間葉系幹細胞およびマクロファージが挙げられる。

レンチウイルスベクターの製造は、幾つかの課題によって、これまで不成功であったが、その課題一つはベクターの低い安定性である。レンチウイルスベクター製造のための操作は、生成、精製、保存および遺伝子導入の適用など、幾つかのステップを含む（Carmo et al., J. Gene Med. 11:670-678, 2009）。レンチウイルスベクターは、これらの工程の間に失活を受けやすく、それにより最終的にベクター調製物の品質や性能の低下が生じ得る。以前の研究において、ウイルスベクターが不活性化される機構の一つとして、ウイルスの逆転写能力の喪失が挙げられることが示されている（Carmo et al., Hum. Gene Ther. 20:1168-76, 2009およびCarmo et al., J. Gene Med. 10:383-391, 2008）。更に、レンチウイルスベクター調製物を安定化させ、感染性の喪失をもたらし得る不可逆的凝集を防止するための方法が依然として必要とされている。更に、レンチウイルスベクターの精製の間、安定化成分がレンチウイルス調製物から除去されるため、ベクターがますます不安定となり得る。したがって、精製プロセス全体にわたってベクターの安定性を保持するレンチウイルスの製剤も必要とされている。

精製および保存の間、ベクターは通常４℃で保存される（Rodrigues et al., J. Biotechnol. 127:520-541, 2007）。レンチウイルスベクターには、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定化成分が更に必要であることが報告されている（Carmo et al., J. Gene Med. 11:670-678, 2009）。これは、単に外因性タンパク質を添加するだけで細胞培養上清と同等の安定性が回復するγ−レトロウイルスとは正反対のものである。リポタンパク質はコレステロール、ホスホリピドなどの幾つかの脂質およびタンパク質から構成される複雑な構造を有する。（Olson, J. Nutr. 128:S439-S443, 1998）。それらは、ＨＳＡと共に血液中の脂質トランスポータとして作用する。リポタンパク質−ＨＳＡ構造は、レンチウイルスベクターの膜周辺で保護的な配置を形成すると考えられている（Carmo et al., J. Gene Med. 11:670-678, 2009）。またアルブミンが強固に細胞表面と会合することが知られているため（Dziarski et al., J. Biol. Chem. 269:20431-20436, 1994）、これらのリポタンパク質／ＨＳＡ複合体は、細胞膜と同様にベクターの膜とも会合できる。この会合により、それらの構造が保護され、ＨＳＡ単独より効率的に立体配置の変化を防止できる。

保存の間の安定性を確保するため、感染性ウイルスベクターのストックは通常、それらの複雑さゆえ、低温で（例えば、−８０℃で）保存されている。脂質エンベロープを有するウイルスは−６０℃を下回る温度で十分に生存して、「ウイルス感染性の保持が必須でない」場合にのみ、−２０℃または４℃での保存が使われなければならないだけであることが示唆された（Gould et al., Mol. Biotechnol. 13:57-66, 1999）。他の研究では、特定のウイルスベクターは、感染性を保持するために−７０℃以下で保存しなければならないと結論している（Harper, Virology Ed. BIOS Scientific Publishers Limited, Oxford, UK, 1993）。典型的には、レンチウイルスベクター調製物はウイルスゲノムによってコードされる、脂質二重層膜に埋め込まれたエンベロープタンパクなどのタンパク質を含む。低温では、タンパク質は変性に影響されやすくなり、また脂質二重層も構造的な一体性を喪失する傾向を示し得る。したがって、低温で、長期間にわたりウイルスベクター調製物の安定性を向上させることができるレンチウイルス製剤が必要とされている。

ウイルスベクターの凍結および融解を反復させると、形質導入の能力が低下し得るため、レンチウイルスベクターは、長期間の保存のためにかかる低温にて維持されることが多い。このように、複数の凍結／融解サイクル後にも感染性が保持されるレンチウイルス調製物が依然として必要とされている。

エクスビボでの適用（例えば、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲＴ）細胞療法）に有用なレンチウイルスベクターは、精製および保存の間の安定性に加えて、生理的に適切な温度（例えば、３７℃）、すなわちレンチウイルスベクターが宿主細胞と共にインキュベートされて形質導入が促進され得る温度において、好適な安定性を保持するであろう。したがって、遺伝子導入イベントの間にウイルスベクターの構造一体性がエクスビボで維持される、レンチウイルス調製物が必要とされている。

上記の生物学的考慮に加え、ウイルスベクターの安定性を保持するレンチウイルスベクター調製物は、更に商業的な展望からも有用であり得る。組換えレンチウイルスベクターが非常に長い期間低温で保存されるとき、または、組換えベクターが実験的使用または製造操作の間、度重なる凍結／融解サイクルを受けるとき、生物学的活性は著しく低下する。これにより感染性粒子の回収率が低下し、更に商品コスト（ＣＯＧ）も上昇する。加えて、ベクター粒子が活性を失いやすいと、前臨床または臨床試験の結果も不正確なものとなり得る。臨床状況では、超低温（例えば、−６０℃以下）での保存装置の使用は費用負担を増加させ、病院および他のポイントオブケア施設での物流に関する問題を生じさせる。通常、これらの施設は、処置を行うための超低温凍結装置を備えていると考えられる。したがって、効率的な製造操作および現実的な低温保存方法を促進するための、ベクター安定性が保持される組換えレンチウイルスベクター調製物が必要とされている。

本発明は、レンチウイルスベクターと、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）緩衝液と、塩とをそれぞれ含む水性組成物を提供する。

様々な実施形態では、ＰＩＰＥＳ緩衝液は、約１０〜約５０ｍＭ（例えば、約２０ｍＭ）の濃度で存在し、水性組成物のｐＨは、約６．０〜約７．０（例えば、約６．５）であり、および／または、塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムからなる群から選択される。水性組成物中の塩の濃度は、例えば、約２５ｍＭ〜約１５０ｍＭ（例えば、約５０ｍＭまたは約７５ｍＭ）であり得る。具体的実施形態では、水性組成物は、レンチウイルスベクター、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳおよび７５ｍＭ塩化ナトリウムを含み、約６．５のｐＨを有する。

水性組成物は、炭水化物、例えば、スクロースまたはトレハロースなどの非還元炭水化物を更に含んでもよい。様々な実施形態では、炭水化物は、水性組成物の体積当たりの重量で、約１％〜約１０％（例えば、約２％〜約５％、または約２．５％）の濃度で存在する。具体的実施形態では、水性組成物は、レンチウイルスベクター、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、７５ｍＭ塩化ナトリウムおよび水性組成物の体積当たりの重量で２．５％のスクロースを含み、水性組成物は約６．５のｐＨを有する。

様々な実施形態では、水性組成物のモル浸透圧濃度は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ（例えば、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ）であり、および／または、レンチウイルスベクターは、約２×１０^８ＴＵ／ｍＬ（１ミリリットル当たりの形質導入単位）〜約１×１０^９ＴＵ／ｍＬ（例えば、約３×１０^８ＴＵ／ｍＬ〜約５×１０^８ＴＵ／ｍＬ）の濃度で存在する。

レンチウイルスベクターは、組換えヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）であってもよく、任意に、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）タンパク質（例えば、レンチウイルスベクターの表面に存在する）を含んでもよい。更にまた、レンチウイルスベクターは、例えばタンパク質（例えば、１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ））をコードする導入遺伝子など、１つまたは複数の導入遺伝子を含んでもよい。

様々な実施形態では、ＣＡＲは各々、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数のシグナリングドメインを含む。シグナリングドメインは、１つもしくは複数の一次シグナリングドメイン（例えば、ＣＤ３−ゼータ刺激性ドメイン）および／または１つもしくは複数の共刺激シグナリングドメイン（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３からなる群から選択される共刺激タンパク質から選択される細胞内ドメイン、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンド）を含んでもよい。

ＣＡＲの抗原結合ドメインは、任意にｓｃＦｖであってもよく、またはそれを含んでもよい。更にまた、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１；Ｃ型レクチン様分子−１；ＣＤ３３；表皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２；メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）；ステージ特異的胎児抗原−４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体チロシン−プロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面会合（ＭＵＣ１）；表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；延長因子２変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）；炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）およびアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ−ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クラウディン（ｃｌａｕｄｉｎ）６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；グロボ（ｇｌｏｂｏ）Ｈグリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン（ｕｒｏｐｌａｋｉｎ）２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パンネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体；座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；ＥＴＳ転座変異体遺伝子６、染色体１２ｐ上に位置（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；***タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンギオポエチン結合性細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；黒色腫がん精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫がん精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原−１、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原１；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；アポトーシスの黒色腫阻害因子（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；チトクロームＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様、Ｔ細胞により認識される扁平上皮細胞癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグメイン（ｌｅｇｕｍａｉｎ）；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０−２突然変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）のＦｃ断片；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン−３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；および免疫グロブリンガンマ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）からなる群から選択される抗原と任意に結合できる。

具体的実施形態では、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、メソテリンまたはＣＤ１２３と結合する。更なる具体的実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９抗体またはその断片、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）膜貫通ドメインおよびＣＤ３−ゼータシグナリングドメインを含む。

様々な実施形態では、水性組成物は、１つまたは複数（例えば、全て）のタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびリポタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の１つまたは複数（例えば、全て）を含まず、ならびに／あるいはレンチウイルスベクターは、血清の非存在下で培養された細胞において産生される。

特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定したとき、１００±２５ｎｍの流体力学半径により特徴づけられる。例えば、レンチウイルスベクターは、２５℃〜５５℃の温度範囲内で、１００±２５ｎｍの流体力学半径を維持できる。

特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、１０％〜２５％の多分散性により特徴づけられる。例えば、レンチウイルスベクターは、２５℃〜５５℃の温度範囲内で、１０％〜２５％の多分散性を維持できる。

様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、３、６または９回の、水性組成物を凍結させ、その後水性組成物を室温で融解させることを含む凍結／融解サイクルの後の濃度が、凍結／融解サイクル前の水性組成物中のレンチウイルスベクター濃度に対して約７０％〜約１００％で維持される。

本発明はまた、各々、レンチウイルスベクターと、リン酸塩緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液からなる群から選択される緩衝液と、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムまたは塩化カルシウム）とを含む水性組成物を提供する。これらの組成物は、炭水化物、例えば、非還元炭水化物（例えば、スクロースまたはトレハロース）を更に含んでもよい。

本発明には、本明細書に記載の水性組成物を乾燥または凍結乾燥することによって調製される、乾燥または凍結乾燥された組成物、ならびにかかる乾燥または凍結乾燥された組成物を本明細書に記載の緩衝液（または別の標準的な投与用ビヒクル）中で再構成することによって調製される水性組成物が更に含まれる。

本発明にはまた、レンチウイルスベクターを精製する方法も含まれる。これらの方法では、本明細書に記載の水性組成物をフィルターに通すことにより、微生物を実質的に含まない水性組成物を製造する。様々な実施形態では、フィルターは、複数の孔、例えば、約０．２μｍの直径を有する孔を含む。様々な実施形態では、微生物を実質的に含まない水性組成物は、接触より前の水性組成物中のレンチウイルスベクターの濃度に対して約８０％の濃度でレンチウイルスベクターを含む。

本発明はまた、レンチウイルスベクターを精製する方法であって、（ａ）本明細書に記載の水性組成物を、複数の粒子を含む材料と接触させることと、（ｂ）材料中を流れた物質を、材料内に残留する物質から分離することにより、レンチウイルスベクターが富化された水性組成物を生成することとを含む方法を提供する。

更に本発明は、レンチウイルスベクターを精製する方法であって、本明細書に記載の水性組成物をヌクレアーゼと接触させることにより、混入ポリヌクレオチドを実質的に含まない水性組成物を生成することを含む方法を提供する。

本発明ではまた、細胞において１つまたは複数の導入遺伝子を発現させる方法であって、細胞を本明細書に記載の水性組成物と接触させることを含む方法が提供される。様々な実施形態では、細胞は哺乳動物細胞（例えばヒトＴ細胞などのＴ細胞）である。特定の実施形態では、細胞は２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはヒト初代Ｔ細胞である。

本発明にはまた、本明細書に記載の水性組成物と、任意による添付文書、例えば、キットのユーザーに、本明細書に記載の方法に従って細胞において導入遺伝子を発現させるよう指示する添付文書とを含むキットが含まれる。キットは、本明細書に記載のような細胞培養に使用できる１つまたは複数の試薬を任意に更に含んでもよい。

本発明には更に、導入遺伝子を任意に含むウイルスベクターを対象の細胞に送達する方法における、本明細書に記載の水性組成物の使用であって、当該方法が、対象に組成物を投与することを含む、使用が含まれる。本発明にはまた、例えば、本明細書に記載の疾患もしくは症状を予防もしくは処置する方法、および／または、例えば、本明細書に記載の導入遺伝子（例えば、ＣＡＲＳをコードする遺伝子）を送達する方法が含まれ、また本明細書に記載の組成物の投与を含むこともできる。

定義
本明細書で用いられる「約」という用語は、記載される値の大小１０％以内にある値を指す。例えば、「約５０ｍＭ」の値は、４５ｍＭ〜５５ｍＭの濃度を表す。

本明細書で用いられる「緩衝液」という用語は、弱酸とその共役塩基との、または弱塩基とその共役酸との混合物を指す。例えば、本明細書で用いられる「１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸緩衝液」は、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸および１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸アニオン（例えば、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸ナトリウム）を含む混合物を指す。同様に、本明細書で用いられる「クエン酸ナトリウム緩衝液」は、クエン酸ナトリウムおよびその共役酸（クエン酸）を含む混合物を指す。弱酸とその共役塩基の間で定められる化学平衡のため、緩衝液を含む溶液は、溶液に少量の酸または塩基を添加してもｐＨの突然の変化は生じにくい。

本明細書で用いられる「混入ポリヌクレオチド」という用語は、レンチウイルスベクターに由来しないポリヌクレオチドを指す。混入ポリヌクレオチドとしては、例えば、レンチウイルスベクターの導入遺伝子または他のコンポーネント中に含まれない哺乳動物染色体ＤＮＡ（例えば、ヒトＤＮＡ）などの、レンチウイルスベクターが産生される細胞に由来する非レンチウイルスポリヌクレオチドが挙げられる。

本明細書で用いられる「凍結／融解サイクル」という用語は、液体混合物（例えば、水溶液または懸濁液）を、混合物が凍結するまでその凍結点以下の温度に曝露し、それに続き、その凍結点より高い温度で混合物を融解させることを指す。凍結ステップは例えば、温度が約−８０℃〜約−２０℃の環境に、混合物を置くことによって実施できる。混合物は、融解の前に、例えば、１〜数日、数週間、数カ月または数年の間凍結させたままであることができる。融解ステップは、混合物を約２℃〜約８℃の温度条件に曝露するか、または、混合物を室温（例えば、実験室の周囲温度または約２５℃）で保存することによって実施できる。あるいは、水浴（例えば、３７℃で）を用いて融解を行うこともできる。

本明細書で用いられる「流体力学半径」という用語は、粒子の拡散の特徴から推定される溶液の粒子の見かけの半径（ｎｍのＲ_ｈ）を指す。ウイルス粒子の流体力学半径は、水溶液中でのウイルス粒子の拡散速度、ならびに巨大分子のゲル中での粒子の移動能力を表す１つの要因である。ウイルス粒子の流体力学半径は一部には、粒子の各コンポーネントの質量および分子構造、ならびにその水和状態によって決定される。ウイルス粒子の流体力学半径を決定する方法は当技術分野で周知であり、動的光散乱およびサイズ排除クロマトグラフィーの使用を含む。

本明細書で用いられる、「非還元炭水化物」という用語は、アルデヒドとの化学平衡状態で存在しない炭水化物であって、そのため銀（Ａｇ^＋）および銅（Ｃｕ^２＋）などの遷移金属カチオンによってカルボン酸に酸化される能力を欠如するものを指す。典型的な非還元炭水化物としては、スクロース、トレハロースおよびパラチニトールなどの二糖、ラフィノースおよびメレチトースなどの三糖、ならびにスタキオースなどの四糖が挙げられるが、これらに限定されない。非還元炭水化物には更に、ソルビトール、マンニトール、エリトリトールおよびキシリトールなどの単糖誘導体、ラクチトールおよびマルチトールなどの二糖誘導体、グルコン酸やグルコン酸γ−ラクトンなどのアルドン酸およびそれらのラクトン、リバラ酸（ribaraic acid）、アラビナル酸およびガラクタル酸などのアルダル酸およびそれらのラクトン、グルクロン酸、ガラクツロン酸およびマンヌロン酸などのウロン酸、トレハロースオクタアセテート、オクタアセチルスクロースおよびセロビオースオクタアセテートなどのエステル誘導体、ならびに、水酸基がＯ−アルキル化されたエーテル誘導体が含まれる。非還元炭水化物には、ＤまたはＬ型の立体化学的配向を有するものが含まれる。

本明細書で用いられる「モル浸透圧濃度」という用語は、水溶液中に溶解した溶質粒子の浸透圧の尺度を指す。溶質粒子には、両イオンならびに非イオン化分子が含まれる。モル浸透圧濃度は、１ｋｇの溶媒（すなわち水）に溶解させた浸透活性粒子の濃度（すなわちオズモル）で表される。本明細書においては、モル浸透圧濃度を１ｋｇの水当たりのミリオズモル（ｍＯｓｍ／ｋｇ）を単位として表す。

本明細書で用いられる、「体積当たりの重量パーセント」または「％ｗ／ｖ」という用語は、ある単一の成分を含有する混合液の総体積に対する、当該成分の重量（グラム）パーセンテージを表す。例えば、８ｍＬの総体積中の５００ｍｇの成分は６．２５％ｗ／ｖであり、５ｍＬの総体積中の５００ｍｇの成分は１０％ｗ／ｖである。

本明細書で用いられる、「多分散性」という用語は、サンプル内における粒子（例えば、レンチウイルス粒子）のサイズの均一性の程度を指す。高い多分散性は、低い均一性を示し、また低い多分散性は高いレベルの均一性を示す。例えば、均一性のレベルが高いときは、レンチウイルス粒子は同じサイズに近いものと考えることができ、ゆえに単分散である。当業者により理解されるように、多分散性が低い程、均一性のレベルは向上する。ゆえに、低い多分散性は高いレベルの均一性を示す。例えば、１５％の多分散性を有する製剤は、１０％の多分散性を有する製剤より低い均一性を有する。均一性のレベルが低いときは、粒子集団は、著しく異なるサイズを含むと考えることができ、ゆえに多分散系となる。

本明細書で用いられる「ｓｃＦｖ」という用語は、抗体由来の重鎖および軽鎖の可変ドメインが連結して１つの鎖を形成した単鎖Ｆｖ抗体を指す。ｓｃＦｖ断片は、抗体軽鎖の可変領域（ＶＬ）（例えば、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２および／またはＣＤＲ−Ｌ３）と、リンカーによって分離された抗体重鎖の可変領域（ＶＨ）（例えば、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２および／またはＣＤＲ−Ｈ３）を含む単一ポリペプチド鎖を含む。ｓｃＦｖ断片のＶＬおよびＶＨ領域を連結するリンカーは、タンパク質を構成するアミノ酸からなるペプチドリンカーであってもよい。他のリンカーを用いて、ｓｃＦｖ断片のタンパク質分解抵抗性を増加させ（例えば、Ｄ−アミノ酸含有リンカー）、ｓｃＦｖ断片の溶解性を向上させ（例えば、ポリエチレングリコール含有リンカーや、グリシンおよびセリン残基の繰り返しを含むポリペプチドなどの親水性リンカー）、分子の生物物理学的安定性を改善し（例えば、分子内であるか分子間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むリンカー）、またはｓｃＦｖ断片（例えば、グリコシル化部位を含むリンカー）の免疫原性を低下させてもよい。ＳｃＦｖ分子は、当技術分野において公知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号明細書、Flo et al. (Gene 77:51, 1989)、Bird et al. (Science 242:423, 1988)、Pantoliano et al. (Biochemistry 30:10117, 1991)、Milenic et al. (Cancer Research 51:6363, 1991)、およびTakkinen et al. (Protein Engineering 4:837, 1991)に記載されている。ｓｃＦｖ分子のＶＬおよびＶＨドメインは、１つまたは複数の抗体分子に由来してもよい。当業者であれば、本発明のｓｃＦｖ分子の可変部は、それらが由来する抗体分子とアミノ酸配列が異なるように修飾され得ることを理解するであろう。例えば、一実施形態では、（例えば、ＣＤＲおよび／またはフレームワークの残基において）保存的置換またはアミノ酸残基の変更をもたらすヌクレオチドまたはアミノ酸の置換を行ってもよい。あるいは、またはそれに加えて、ＣＤＲのアミノ酸残基を変異させ、当分野で認識される技術を用いて抗原との結合を最適化する。ＳｃＦｖ断片は例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０８４７１４号パンフレットに記載されている。

本明細書で用いられる、「特異的に結合する」および「結合する」という句は、タンパク質および他の生体分子の不均一な集団内において、（例えば、特異的リガンドによって）認識される特定のタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。タンパク質と特異的に結合するリガンド（例えば、タンパク質、プロテオグリカンまたはグリコサミノグリカン）は、５００ｎＭ未満のＫ_Ｄでタンパク質と結合する。例えば、タンパク質と特異的に結合するリガンドは、最高５００ｎＭ（例えば、１ｐＭから５００ｎＭの間）のＫ_Ｄでタンパク質と結合する。タンパク質またはそのドメインに対する特異的結合を示さないリガンドは、特定のタンパク質またはそのドメインに対して５００ｎＭ超（例えば、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、１００μＭ、５００μＭまたは１ｍＭ超）のＫ_Ｄを示す。様々なアッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質に対するリガンドの親和性を測定することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡアッセイは、標的タンパク質に特異的に結合するリガンドを同定するためにルーチン的に用いられる。タンパク質の特異的結合の測定に使用できるアッセイフォーマットおよび条件の説明に関しては、例えば、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988)およびHarlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1999)を参照。

本明細書で用いられる、「導入遺伝子」という用語は、導入遺伝子が導入される細胞において天然には発現しないタンパク質または機能性ＲＮＡ生成物をコードする核酸配列を指すこともある。あるいは、導入遺伝子は、導入遺伝子が導入される細胞に固有の遺伝子と相同でもよいが、標的細胞のゲノムに挿入されることにより、挿入される細胞のゲノムを変化させるような設計がなされているものである。例えば、導入遺伝子は、標的細胞の固有の遺伝子に相同でもよいが、標的細胞のゲノム内の、天然の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入されるものである。

本明細書で用いられる「水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質」または「ＶＳＶ−Ｇタンパク質」という用語は、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質に対して実質的な相同性を有する単離されたポリペプチドを指す。例えばあるポリペプチドが野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質の膜融合特性を示す場合、ポリペプチドはＶＳＶ−Ｇタンパク質と実質的な相同性を有する。ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、そのポリペプチドが核酸−脂質粒子と会合し、トランスフェクションを促進する能力を保持する限り、例えば、全長ＶＳＶ−Ｇタンパク質またはその断片を含むポリペプチドであってもよい。

本明細書で用いられる、「ウイルスタイター」という用語は、標的細胞における導入遺伝子産物の産生をもたらす、感染性のベクター粒子または「形質導入ユニット」の数を指す。ウイルスタイターは、参照により両方の開示内容が本明細書に組み込まれるXiao et al., Exp. Neurobiol. 144:113-124, 1997またはFisher et al., J. Virol. 70:520-532, 1996に記載のアッセイなどの、機能的アッセイにより測定できる。あるいは、ウイルスタイターは、宿主細胞ゲノムに取り込まれたウイルスＤＮＡの量を、例えば、当技術分野で公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて求めることにより測定することができる。

本明細書で用いられる「ウイルスベクター」という用語は、核酸分子を宿主に導入する能力を有するウイルス粒子を意味する。「レンチウイルスベクター」には、ＨＩＶ−１に由来する配列を含むウイルスベクターが含まれる。外因性遺伝子を保持するレンチウイルスベクターは、特定の細胞系を用い、パッケージングプラスミドの補助のもと、ウイルスパッケージングを経て感染性ウイルス粒子にパッケージングされる。感染性ウイルス粒子は細胞に感染し、外因性遺伝子の発現をもたらす。「組換え」ウイルスベクターとは、遺伝子組換え技術により構築されるウイルスベクターを指す。遺伝子組換えウイルスベクターは、当技術分野で公知の方法を使用し、例えば、ウイルスゲノムをコードする核酸をパッケージング細胞系に導入し、その後新規にパッケージングされたウイルス粒子を単離することにより構築できる。

レンチウイルス調製物を安定化できる緩衝液の同定のためのストラテジーを図解するフローチャートである。緩衝液の同定のための段階的アプローチ（左）は、動的光散乱（ＤＬＳ）などの安定性アッセイを行い、レンチウイルスベクターで形質導入された細胞のレンチウイルスタイター（形質導入単位はＴＵ）を測定し、任意に、１回もしくは複数回の凍結／融解（Ｆ／Ｔ）サイクルの後、広範囲にわたる緩衝液、塩およびｐＨ条件でサンプリングを行い、保存安定性および形質導入能力を最適に促進する条件を段階的に選択するものである。並列アプローチ（右）では、様々なレンチウイルス調製条件を同時にサンプリングし、続いて、例えば、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）への適用のために、最も効率的にレンチウイルスの凝集を防止し、感染性を保持する条件を選択する。 様々な緩衝液および塩を含有し、ｐＨが６．０〜８．０の範囲を示すレンチウイルス調製物によって形質導入された細胞のレンチウイルスタイター（ＴＵ／ｍＬ）を示すグラフである。 異なる流体力学半径分布を図解する一連のグラフである。単峰性の単分散分布（上）は、レンチウイルスモノマーである可能性が高い単一の種であることを特徴とする。単峰性の多分散分布（中央）は、典型的には、動的光散乱によって分離できないことが多い複数の種を示して、単峰性の単分散分布に対してレンチウイルス粒子の凝集性が増加していることを表し得る。多峰性の多分散分布（下）は、動的光散乱により分離できる、複数のレンチウイルス粒子の凝集種を示す。 ヒスチジン緩衝液を含むレンチウイルス調製物の流体力学半径および多分散性に対する温度上昇の効果を実証する一連のグラフである。 ＰＩＰＥＳ緩衝液を含むレンチウイルス調製物の流体力学半径および多分散性に対する温度上昇の効果を実証する一連のグラフである。 クエン酸ナトリウム緩衝液を含むレンチウイルス調製物の流体力学半径および多分散性に対する温度上昇の効果を実証する一連のグラフである。 ＨＥＰＥＳ緩衝液を含むレンチウイルス調製物の流体力学半径および多分散性に対する温度上昇の効果を実証する一連のグラフである。 ＭＯＰＳ緩衝液を含むレンチウイルス調製物の流体力学半径および多分散性に対する温度上昇の効果を実証する一連のグラフである。 ＭＥＳ緩衝液を含むレンチウイルス調製物の流体力学半径および多分散性に対する温度上昇の効果を実証する一連のグラフである。 リン酸塩緩衝液を含むレンチウイルス調製物の流体力学半径および多分散性に対する温度上昇の効果を実証する一連のグラフである。 ３−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］プロパン−１−スルホン酸（ＨＥＰＰＳ）緩衝液を含むレンチウイルス調製物の流体力学半径および多分散性に対する温度上昇の効果を実証する一連のグラフである。 ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（トリス）緩衝液を含むレンチウイルス調製物の流体力学半径および多分散性に対する温度上昇の効果を実証する一連のグラフである。 ヒスチジン（左上）、クエン酸塩（中央上）、ＭＯＰＳ（右上）、ＰＩＰＥＳ（左下）、ＨＥＰＥＳ（中央下）またはＭＥＳ（右下）緩衝液を含むレンチウイルス調製物の流体力学半径に対する、ｐＨおよび塩化ナトリウム濃度の変化の効果を実証する一連のグラフである。星印で強調される条件は、高温（図１５および１６参照）で実施した形質導入実験において最も高いレンチウイルスタイターをもたらすｐＨ値および塩濃度を示す。 リン酸塩（左）、ＨＥＰＰＳ（中央）およびＴｒｉｓ（右）緩衝液を含むレンチウイルス調製物の流体力学半径に対する、ｐＨおよび塩化ナトリウム濃度の変化の効果を実証する一連のグラフである。星印で強調される条件は、高温（図１７および１８参照）で実施した形質導入実験において最も高いレンチウイルスタイターをもたらすｐＨ値および塩濃度を示す。 ４２℃（「ＴＵ^４２」で示す、および５０℃（「ＴＵ^５０」で示す）の高温における、ヒスチジン（上）またはＰＩＰＥＳ（下）緩衝液を含むレンチウイルス調製物の形質導入能力に対する、ｐＨおよび塩化ナトリウム濃度の変化の効果を実証する一連のグラフである。示されるＴＵ^４２およびＴＵ^５０値は、示されるレンチウイルス調製物により示される温度において形質導入された細胞のレンチウイルスタイターを表し、当該値は、示されるレンチウイルス調製物により３７℃で形質導入された細胞のレンチウイルスタイターのパーセンテージとして表す。 ４２℃（「ＴＵ^４２」で示す、および５０℃（「ＴＵ^５０」で示す）の高温における、クエン酸塩（上）またはＨＥＰＥＳ（下）緩衝液を含むレンチウイルス調製物の形質導入能力に対する、ｐＨおよび塩化ナトリウム濃度の変化の効果を実証する一連のグラフである。示されるＴＵ^４２およびＴＵ^５０値は、示されるレンチウイルス調製物により示される温度において形質導入された細胞のレンチウイルスタイターを表し、当該値は、示されるレンチウイルス調製物により３７℃で形質導入された細胞のレンチウイルスタイターのパーセンテージとして表す。 ４２℃（「ＴＵ^４２」で示す、および５０℃（「ＴＵ^５０」で示す）の高温における、ＭＯＰＳ（上）またはＭＥＳ（下）緩衝液を含むレンチウイルス調製物の形質導入能力に対する、ｐＨおよび塩化ナトリウム濃度の変化の効果を実証する一連のグラフである。示されるＴＵ^４２およびＴＵ^５０値は、示されるレンチウイルス調製物により示される温度において形質導入された細胞のレンチウイルスタイターを表し、当該値は、示されるレンチウイルス調製物により３７℃で形質導入された細胞のレンチウイルスタイターのパーセンテージとして表す。 ４２℃（「ＴＵ^４２」で示す、および５０℃（「ＴＵ^５０」で示す）の高温における、リン酸塩（上）またはＨＥＰＰＳ（下）緩衝液を含むレンチウイルス調製物の形質導入能力に対する、ｐＨおよび塩化ナトリウム濃度の変化の効果を実証する一連のグラフである。示されるＴＵ^４２およびＴＵ^５０値は、示されるレンチウイルス調製物により示す温度において形質導入された細胞のレンチウイルスタイターを表し、当該値は、示されるレンチウイルス調製物により３７℃で形質導入された細胞のレンチウイルスタイターのパーセンテージとして表す。 ４２℃（「ＴＵ^４２」で示す、および５０℃（「ＴＵ^５０」で示す）の高温における、Ｔｒｉｓ緩衝液を含むレンチウイルス調製物の形質導入能力に対する、ｐＨおよび塩化ナトリウム濃度の変化の効果を実証する一連のグラフである。示されるＴＵ^４２およびＴＵ^５０値は、示されるレンチウイルス調製物により示される温度において形質導入された細胞のレンチウイルスタイターを表し、当該値は、示されるレンチウイルス調製物により３７℃で形質導入された細胞のレンチウイルスタイターのパーセンテージとして表す。 ３回（左）、６回（中央）または９回（右）の凍結／融解サイクル後における、様々なレンチウイルスベクター調製物の、炭水化物の非存在下での感染性維持能力を示すグラフである。感染性は、１回目の凍結／融解プロセス前のレンチウイルスベクター調製物に存在する形質導入ユニット量に対する、対応する回数の凍結／融解サイクル後の各レンチウイルスベクター調製物に存在するレンチウイルスベクターの形質導入ユニット量のパーセンテージとして測定する。 ３回、６回または９回の凍結／融解サイクル後における、スクリーニングされたレンチウイルスベクター調製物の、炭水化物の非存在下での感染性の相対値を示すグラフである。感染性は、１回目の凍結／融解プロセス前のレンチウイルスベクター調製物に存在する形質導入ユニット量に対する、対応する回数の凍結／融解サイクル後の各レンチウイルスベクター調製物に存在するレンチウイルスベクターの形質導入ユニット量のパーセンテージとして測定する。 図２２は、３回、６回または９回の凍結／融解サイクル後における、スクリーニングされたレンチウイルスベクター調製物の、炭水化物の非存在下での感染性の相対値を示す表である。感染性は、１回目の凍結／融解プロセス前のレンチウイルスベクター調製物に存在する形質導入ユニット量に対する、対応する回数の凍結／融解サイクル後の各レンチウイルスベクター調製物に存在するレンチウイルスベクターの形質導入ユニット量のパーセンテージとして測定する。 上記と同じである。 上記と同じである。 上記と同じである。 上記と同じである。 上記と同じである。 上記と同じである。 上記と同じである。 上記と同じである。 上記と同じである。 ３回、６回または９回の凍結／融解サイクル後の選択されたレンチウイルスベクター調製物の、炭水化物の非存在下での感染性の相対値を示す表である。感染性は、１回目の凍結／融解プロセス前のレンチウイルスベクター調製物に存在する形質導入ユニット量に対する、対応する回数の凍結／融解サイクル後の各レンチウイルスベクター調製物に存在するレンチウイルスベクターの形質導入ユニット量のパーセンテージとして測定する。 ３回、６回または９回の凍結／融解サイクル後における、スクリーニングされたレンチウイルスベクター調製物の、炭水化物の存在下での感染性維持能力を示すグラフである。感染性は、１回目の凍結／融解プロセス前のレンチウイルスベクター調製物に存在する形質導入ユニット量に対する、対応する回数の凍結／融解サイクル後の各レンチウイルスベクター調製物に存在するレンチウイルスベクターの形質導入ユニット量のパーセンテージとして測定する。 ３回、６回または９回の凍結／融解サイクル後における、スクリーニングされたレンチウイルスベクター調製物の、炭水化物の存在下での相対的感染性を示す表である。感染性は、１回目の凍結／融解プロセス前のレンチウイルスベクター調製物に存在する形質導入ユニット量に対する、対応する回数の凍結／融解サイクル後の各レンチウイルスベクター調製物に存在するレンチウイルスベクターの形質導入ユニット量のパーセンテージとして測定する。 ３回、６回または９回の凍結／融解サイクル後の選択されたレンチウイルスベクター調製物の、炭水化物の存在下での相対的感染性を示す表である。感染性は、１回目の凍結／融解プロセス前のレンチウイルスベクター調製物に存在する形質導入ユニット量に対する、対応する回数の凍結／融解サイクル後の各レンチウイルスベクター調製物に存在するレンチウイルスベクターの形質導入ユニット量のパーセンテージとして測定する。 初代Ｔ細胞における、選択されたレンチウイルス調製物の相対的感染性を示す表である。レンチウイルスタイターの測定に関する詳細は、下記の実施例７で説明する。 凝集の程度、高温での活性、凍結融解安定性および初代Ｔリンパ球への形質導入に関して評価した、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳおよびヒスチジン緩衝液中でのレンチウイルスベクターの安定性を比較した表である。 ＰＩＰＥＳ、ヒスチジンまたはＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて、示される条件下での精製後、維持されたレンチウイルスタイター（％ＴＵ）のレベルを示す表である。 ＰＩＰＥＳベースの緩衝液において精製された２つの異なるレンチウイルスベクター（１および２）のタイターの維持を示す表である。 レンチウイルスベクター（ベクター１）の凝集状態での動的光散乱（ＤＬＳ）分析である。 レンチウイルスベクター（ベクター２）の凝集状態での動的光散乱（ＤＬＳ）分析である。 ４℃で０、７、１４および２１日後における、レンチウイルスベクター（ベクター２）の安定性を示すグラフである。 １、３、６および９回の凍結融解サイクル後の、レンチウイルスベクター（ベクター２）の安定性を示すグラフである。

本発明は、ＰＩＰＥＳ緩衝液を含むレンチウイルス調製物が、従来のレンチウイルス製剤の緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）を含むレンチウイルス調製物と比較し、改善された生物学的性質を示すという発見に基づく。これらの改善された生物学的特徴としては、広い温度および塩濃度全体にわたる、凝集に対する高い抵抗性、生理的温度および高い温度（例えば、４２℃および５０℃）における改善された形質導入能力、ならびに複数回の凍結／融解サイクルにおける感染性の喪失に対するより高い抵抗性が挙げられる。本発明のレンチウイルス調製物に関連して有用な他の緩衝液としては、リン酸塩緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、ＭＥＳ緩衝液およびＭＯＰＳ緩衝液が挙げられる。本発明のレンチウイルス調製物は、塩、例えば、塩化ナトリウムを任意に含んでもよく、炭水化物、例えば、非還元炭水化物（下記参照）を任意に含んでもよい。本明細書に記載のように、本発明の組成物および方法に用いられるレンチウイルスベクターは、導入遺伝子、例えば、宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込み用に設計されたタンパク質コーディング遺伝子を含んでもよい。更に、本明細書に記載のレンチウイルス調製物を精製技術、例えば、濾過およびクロマトグラフィー手順と組み合わせて用い、改善された回収率でレンチウイルスベクターを精製することが可能である。本発明の方法はまた、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒトＴ細胞）の形質導入のための方法を含む。

レンチウイルス調製物成分
本発明のレンチウイルスベクター調製物は、様々な成分、例えば、１つまたは複数の塩および／または炭水化物を含んでもよい。驚くべきことに、本明細書に記載のレンチウイルスベクター調製物は、ウイルス安定性を高めるためのタンパク質成分の添加を必要としない。本明細書に記載の組成物は、ゆえに、各々任意に、タンパク質成分の添加がないものとして特徴づけることができる。多くの異なるタイプのアルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）および組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ））に関し、レンチウイルスベクターの安定性を高める能力を試験した。例えば、ｒＨＳＡは、それが動物起源でなく、遺伝子組換え酵母において産生され、ゆえに安全性のレベルが高いため、レンチウイルス調製物にしばしば組み込まれている（Chuang et al., Pharm. Res. 19:569-577, 2002）。これらはベクターの分析的特徴解析を妨げ得るため、本発明を用いることにより、ＨＳＡおよび類似のタンパク質成分を、レンチウイルスベクター調製物から除外することができる。本明細書に記載の緩衝液が、タンパク質成分の添加を要せずにレンチウイルスベクターに安定性を付与する能力を発揮するという意味においても、本発明は特有なものである。例えば、図２〜１９で実証されるように、本明細書に記載の緩衝液はウイルスの凝集を防止し、形質導入能力を強化し、複数回の凍結／融解サイクルの後の感染性を保持することができる。本明細書に記載の組成物はまた、任意に、炭水化物成分の添加があるもの、またはないものとして特徴づけることができる。

本発明のレンチウイルスベクター調製物は、水性混合物、例えば、水溶液または懸濁液であってもよい。レンチウイルスベクター調製物は、塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムまたは塩化カルシウムを任意に含んでもよい。塩は、例えば、水性レンチウイルス調製物中に約１ｍＭ〜約１Ｍの濃度（例えば、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、２７５ｍＭ、３００ｍＭ、３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、３７５ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、４７５ｍＭ、５００ｍＭ、５２５ｍＭ、５７５ｍＭ、６００ｍＭ、６２５ｍＭ、６５０ｍＭ、６７５ｍＭ、７００ｍＭ、７２５ｍＭ、７５０ｍＭ、７７５ｍＭ、８００ｍＭ、８２５ｍＭ、８５０ｍＭ、８７５ｍＭ、９００ｍＭ、９２５ｍＭ、９５０ｍＭ、９５７ｍＭまたは１Ｍ）で存在してもよい。幾つかの実施形態では、塩の濃度は、約２５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭまたは約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭ（例えば２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭまたは１５０ｍＭ）である。幾つかの実施形態では、塩の濃度は、必要に応じて５０ｍＭまたは７５ｍＭであってもよい。

本明細書に記載のレンチウイルスベクター調製物は、例えば、約５．０〜約８．０、例えば、６．０〜約７．０（例えば、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９または７．０）のｐＨを示すものであってもよい。幾つかの実施形態では、レンチウイルスベクター調製物のｐＨは６．５である。

本発明のレンチウイルスベクター調製物は、炭水化物、例えば本明細書に記載の非還元炭水化物を任意に含んでもよい。典型的な非還元炭水化物としては、とりわけスクロースおよびトレハロースが挙げられる。レンチウイルスベクター調製物中に炭水化物を含むときは、水性レンチウイルス調製物の体積当たりの重量（ｗ／ｖ）で、例えば、約１％〜約１０％、約２．５％〜約１０％、または約２．５％〜約５％の濃度で存在してもよい。例えば、炭水化物、例えば、本明細書に記載の非還元炭水化物は、１％ｗ／ｖ、１．５％ｗ／ｖ、２％ｗ／ｖ、２．５％ｗ／ｖ、３％ｗ／ｖ、３．５％ｗ／ｖ、４％ｗ／ｖ、４．５％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ、５．５％ｗ／ｖ、６％ｗ／ｖ、６．５％ｗ／ｖ、７％ｗ／ｖ、７．５％ｗ／ｖ、８％ｗ／ｖ、８．５％ｗ／ｖ、９％ｗ／ｖ、９．５％ｗ／ｖまたは１０％ｗ／ｖの濃度で水性レンチウイルス調製物中に存在し得る。

レンチウイルスベクターは、本発明のレンチウイルス調製物中にある濃度範囲で存在してもよい。例えば、レンチウイルスベクターは、レンチウイルス調製物内に、例えば、約２×１０^８ＴＵ／ｍＬ（１ミリリットル当たりの形質導入単位）〜約１×１０^９ＴＵ／ｍＬ（例えば、２×１０^８ＴＵ／ｍＬ、２．５×１０^８ＴＵ／ｍＬ、３×１０^８ＴＵ／ｍＬ、３．５×１０^８ＴＵ／ｍＬ、４×１０^８ＴＵ／ｍＬ、４．５×１０^８ＴＵ／ｍＬ、５×１０^８ＴＵ／ｍＬ、５．５×１０^８ＴＵ／ｍＬ、６×１０^８ＴＵ／ｍＬ、６．５×１０^８ＴＵ／ｍＬ、７×１０^８ＴＵ／ｍＬ、７．５×１０^８ＴＵ／ｍＬ、８×１０^８ＴＵ／ｍＬ、８．５×１０^８ＴＵ／ｍＬ、９×１０^８ＴＵ／ｍＬ、９．５×１０^８ＴＵ／ｍＬまたは１×１０^９ＴＵ／ｍＬ）の濃度で存在してもよい。望ましくは、レンチウイルス調製物は、約３×１０^８ＴＵ／ｍＬ〜約５×１０^８ＴＵ／ｍＬ（例えば、３×１０^８ＴＵ／ｍＬ、３．５×１０^８ＴＵ／ｍＬ、４×１０^８ＴＵ／ｍＬ、４．５×１０^８ＴＵ／ｍＬまたは５×１０^８ＴＵ／ｍＬ）の濃度でレンチウイルスベクターを含んでもよい。

導入遺伝子の発現
本発明の組成物および方法に用いられるレンチウイルスベクターは、導入遺伝子、例えば、標的細胞の染色体ＤＮＡへの組込み用に設計されたタンパク質コーディング用導入遺伝子を含んでもよい。典型的な導入遺伝子としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするものが挙げられる。ＣＡＲは、幾つかのドメイン、例えば、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数のシグナリングドメイン）を含んでもよい。これらの場合、シグナリングドメインは、１つもしくは複数の一次シグナリングドメイン（例えば、ＣＤ３−ゼータ刺激性ドメイン）および／または１つもしくは複数の共刺激性のシグナリングドメイン（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、またはＣＤ８３と特異的に結合するリガンド）を含んでもよい。

特定の場合、導入遺伝子は、特定の標的タンパク質または炭水化物と結合する抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含んでもよい。典型的な抗原としては、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１；Ｃ型レクチン様分子−１；ＣＤ３３；上皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）；ステージ特異的胎児抗原−４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体チロシン−プロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面会合（ＭＵＣ１）；表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；延長因子２変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）；炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）およびアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ−ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クラウディン（ｃｌａｕｄｉｎ）６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；グロボ（ｇｌｏｂｏ）Ｈグリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン（ｕｒｏｐｌａｋｉｎ）２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パンネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；ＥＴＳ転座変異体遺伝子６、染色体１２ｐ上に位置（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；***タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー；メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンギオポエチン結合性細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；黒色腫がん精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫がん精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原−１、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原１；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；アポトーシスの黒色腫阻害因子（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；チトクロームＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様、Ｔ細胞により認識される扁平上皮細胞癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグメイン（ｌｅｇｕｍａｉｎ）；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０−２突然変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）のＦｃ断片；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン−３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；および免疫グロブリンガンマ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）が挙げられる。

レンチウイルスベクターを精製する方法
本発明の方法には、効率が改善されたレンチウイルスベクターを精製する方法が含まれるので、例えば、従来の緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）を含むレンチウイルス調製物の精製と比較し、レンチウイルスベクターの高収量での回収が可能となる。例えば、本明細書に記載のレンチウイルスベクター調製物は、濾過（例えば、マイクロフィルトレーションまたは限外濾過）によって、および／または、レンチウイルスの高率での回収能を有するクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）により精製できる。例えば上記のような、当技術分野で公知の濾過技術を用いることにより、レンチウイルスベクターが調製される場としての微生物および細胞（例えば、哺乳動物細胞）を実質的に含まないレンチウイルス調製物を製造することが可能となる。それに加え、またはその代わりに、本発明のレンチウイルスベクター調製物をヌクレアーゼで処理することにより、（例えば、レンチウイルスベクターが製造された細胞に由来する非レンチウイルス性のポリヌクレオチド（例えば、哺乳動物の染色体ＤＮＡ、ヒトＤＮＡ、ＲＮＡまたはレンチウイルスの導入遺伝子内に含まれない他のポリヌクレオチドなどの）混入ポリヌクレオチドを実質的に含まない調製物を製造することが可能となる。

以下の実施例は、本明細書に記載の組成物および方法が、どのように使用でき、実施でき、評価できるかに関する説明を当業者に提供するものであり、単に本発明の典型例を示すものに過ぎず、発明者が自らの発明と考えるものの範囲を限定することを目的とするものではない。

＜実施例１＞
無血清細胞培養液におけるレンチウイルスベクターの製造
ＧＦＰ遺伝子導入ベクター、パッケージングベクター、ｒｅｖ発現ベクターおよびＶＳＶ−Ｇ発現ベクターを構築した。遺伝子導入ベクターは、ｃＰＰＴおよびＷＰＲＥ要素を含む。更に詳細には、本研究で使用するレンチウイルスベクターは、自己不活性化導入構築物ｐＥＬＰＳ−ＥＧＦＰであり、ｐＲＲＬ導入構築物（Dull et al., J. Virol. 72(11):8463-8471, 1998）をベースとするものである。ｐＥＬＰＳ−１９−ＢＢｚ（Milone et al., Mol. Ther. 17(8):1453-1464, 2009）を用い、ＣＡＲ導入遺伝子をＥＧＦＰに置換することにより、ｐＥＬＰＳ−ＥＧＦＰを構築した。ｐＭＤＬｇｐＲＲＥ、ｐＲＳＶ−ＲｅｖおよびｐＭＤ．Ｇプラスミドからなる第三世代包装システム（Ｄｕｌｌら、上記）を用いてレンチウイルスを製造した。その際、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩで置換した。

１０Ｌスケールでウイルスの製造を行う。１０Ｌの上清を生成するために必要となる試薬を以下に説明する。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）細胞を、血清なしのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中、５〜６×１０^６細胞／ｍＬの菌体密度、９６％の生存率で播種した。１２．５ｍＬのＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）を０．２５Ｌの培地に添加し、徐々にプラスミド混合液（０．２５Ｌ中、１２．８ｍｇのプラスミド）に添加した。１５分のインキュベート後、０．５Ｌのトランスフェクション混合液を２×５Ｌのフラスコに分割し、フラスコ当たり更に２．２５ＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地を添加した。２４時間のインキュベート後、細胞を５分間２０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄した。次に、８ｍＭ酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社）を含むｐＨ６の培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地、ｐＨ調整済み）を添加する。トランスフェクション４８時間目において、細胞を５分間２０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を精製用に確保する（回収１）。更に２．５ＬのｐＨ６．０の培地を各振とうフラスコに添加し、ロータリーシェーカ（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴインキュベーター、振とう速度１００ｒｐｍ、８％ＣＯ_２、３７℃）でのインキュベートに供した。２回目の回収（回収２）を７２時間目に行い、次に低速遠心分離を行う。４８および７２時間目の回収物をプールし、更なる精製のために処理した。必要に応じて、プールした材料の一部を４℃で保存する。

２×２．５Ｌの培地１つ当たり、ＧＦＰ遺伝子導入ベクター６μｇ、パッケージングベクター３μｇ、ｒｅｖ発現ベクター３μｇおよびＶＳＶＧ発現ベクター０．７５μｇを用いた。トランスフェクション混合液を細胞に添加した後、振とうフラスコを慎重に振とうし、均一な混合液とした。その後、上記のとおり細胞のインキュベートを行う。

＜実施例２＞
無血清細胞培養液において製造されたレンチウイルスベクターの精製
４８および７２時間目の部分的な遠心分離後の回収物を、３段階の異なるフィルター、すなわち５ミクロンのガラスフィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、１．２ミクロンのポリプロピレンフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）および０．６／０．２ミクロンのポリエーテルスルホンフィルター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で濾過する。それらの一連の濾過により、プロデューサー細胞、細胞残渣およびオルガネラを除去する。次に、５００ＭＷＣＯ中空糸膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いるタンジェンシャルフロー濾過を行い、ウイルスを含む上清を１００倍濃縮する。室温で３０分間、５０単位／ｍＬでベンゾナーゼ（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）処理を行い、次に２０分間３０００ｒｐｍで遠心分離する。白いペレットが観察されるが、ウイルス粒子のわずかな損失（＜５％）が上清中に存在する。ＰＩＰＥＳおよび他の緩衝液（本発明に記載のベクターへの高い安定性を示す）を使用し、サイズ排除クロマトグラフィーを実施し、次に０．２ミクロンフィルター（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いた濾過滅菌を行う。

＜実施例３＞
レンチウイルス調製物の安定性のハイスループットスクリーニング用のサンプル調製
ＺＥＢＡ（商標）回転脱塩プレート（７ＫのＭＷＣＯ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を、２５０μＬの特定の緩衝液および塩により４回バッファー交換した。ウイルス原液１００μＬを各ウェルにロードし、次に２分間１０００×ｇで遠心分離した。バッファー交換後のボリュームの喪失は観察されない。２０〜１００μＬを用い、各分析（ＤＬＳ、感染性および凍結／融解試験）に供した。ベクターの感染性に対する温度の効果を試験するため、Ｃ−１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒの９６ウェル薄壁ＰＣＲプレートにおいて、温度ショック（２５〜５５℃の範囲で１時間）を実施した。

＜実施例４＞
ハイスループットスクリーニングにおける、動的光散乱によるレンチウイルスの凝集の分析
精製された組換えレンチウイルスベクター（１０^６〜１０^７ＴＵ／ｍＬ）２０μＬを、３８４ウェルプレート（黒色ポリスチレンベース、親水性プレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ社）にピペットで添加した。室温で３分間、２０００ｒｐｍでプレートを遠心分離し、封入された気泡を除去し、次にＭｉｃｒｏｓｅａｌ「Ｂ」シール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でシールする。８３０ｎｍのレーザーおよび温度調節モジュールを装備するＤｙｎａＰｒｏプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ＣＡ、米国）に設置する。Ｄｙｎａｍｉｃｓ（登録商標）ソフトウェア（バージョン７．１．８．９３、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用い、計画的にデータ収集および分析を行った。各ウェルにつき、５秒間の測定を５回行った。単一のシールされた３８４ウェルプレートを２５℃で測定し、次に３７℃で２時間インキュベートし、記載されるように測定する。同じ手順を、４２℃、５０℃および５５℃で繰り返す。Ｄｙｎａｍｉｃｓ（登録商標）ソフトウェアに装備されるアルゴリズムを使用し、正則化分析を行った。相関関数における上下のカットオフ値を、それぞれ０．５および１×１０^６μｓとした。レンチウイルスのピークの流体力学半径を５０〜２００ｎｍとして割り当てる。

＜実施例５＞
ハイスループットスクリーニングにおけるレンチウイルスタイターの測定
レンチウイルスベクターのタイターは、保持される遺伝子によりコードされるＧＦＰタンパク質を発現する細胞数により算出される関数的タイターを含む（ＴＵ／ｍＬ）。１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）および８μｇ／ｍＬ Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）５０μＬの体積のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、平底）に所定の密度（２×１０^４／ウェル）で播種した。ＧＦＰスタンダードウイルスおよびサンプルの希釈液を完全ＤＭＥＭ培地において調製し、細胞に添加する（５０μＬ）。

希釈液としてＤＭＥＭを用いた希釈系列において、ウイルス溶液の１０倍希釈系列を調製した。９６ウェルプレートを３７℃で７２時間、ＣＯ_２インキュベーター中でインキュベートした。細胞をトリプシン処理し、次に完全ＤＭＥＭ培地２００μＬを添加した。プレートを１０分間１０００ｒｐｍで遠心分離し、培地をフローバッファー（ａｕｔｏＭＡＣＳランニングバッファー、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）２００μＬで交換する。次にＧｕａｖａ Ｖｉａｃｏｕｎｔ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）においてＧＦＰ分析を行う。回収時に、形質導入されなかった細胞の計数および状態のモニターを行った。

＜実施例６＞
凍結／融解サイクルの反復後のレンチウイルスの安定性の分析
凍結／融解サイクルの反復による感染性の喪失に対処するため、レンチウイルスベクターの小アリコート（約１００μＬ）を−８０℃で２０分間凍結させ、次に２０分間室温で徐々に融解させた（最悪のケースシナリオを表す）。凍結／融解サイクルを３、６および９サイクル行い、ベクター活性を対照と比較する。Ｓｐｏｔｆｉｒｅを使用しトレンド分析を行う。高い値はレンチウイルスベクターの活性が保持されていることを示す。

＜実施例７＞
初代Ｔ細胞におけるレンチウイルスタイターの測定
３人の健常なドナー由来のＰＢＭＣ入りのバイアルを融解し、遠心分離し、２％ヒトＡＢ血清（Ａｃｃｅｓｓ社）およびＩＬ−２（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｔｈｅｒ社）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ培地（Ｌｏｎｚａ社）中に再懸濁した。細胞を計数し、ドナー毎に１００μＬの１．６×１０^６細胞／ｍＬの密度で播種する操作を２回行った。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をＸ−ｖｉｖｏ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｅｄｉｕｍで洗浄し、最終ビーズ密度が４．８×１０^５ビーズ／ウェルになるように添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内に置いた。

レンチウイルスベクターのアリコートを室温で融解させ、Ｘ−Ｖｉｖｏ培地による１：３の希釈で階段希釈物を調製した。使用したベクターのアリコートは、ＧＦＰ（ストック２６Ｓｅｐｔ１４、ＪＤＧ、２５０μＬ）、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ社、ｈＣＡＲＴ０１９、ＬＮ０１２７−０２１４−０６４）および以下の４つの異なるＧＦＰベクター製剤である：ＡＤ１（２０ｍＭ Ｈｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％スクロースｐＨ６．５）、ＡＤ２（２０ｍＭクエン酸塩、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％スクロースｐＨ６．５）、ＡＤ３（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％スクロース、ｐＨ７）およびＡＤ４（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％スクロース、ｐＨ６．５）。

３日目に細胞を再懸濁して、細胞を１：３で分離させ、新しいプレートの対応するウェル中に、１２０μＬのＸ−ｖｉｖｏ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ中の細胞懸濁液６０μＬを添加した。細胞をインキュベーター内に戻した。５日目に細胞を再度１：２で分離させ、新しいプレートに添加し（１１０μＬのＸ−Ｖｉｖｏ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｅｄｉｕｍへ細胞９０μＬ）、インキュベーター内に戻した。

各プレートからの細胞をプールし、細胞懸濁液を磁石上に配置してアリコートからビーズを除去し、上清を得、１：１０の希釈において、Ｇｕａｖａ Ｖｉａｃｏｕｎｔ溶液を用い計数した。次に、細胞２００μＬを、２０℃で５分間、１０００ｒｐｍでスピンダウンし、２００μＬのＡｕｔｏＭａｃｓ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）中に再懸濁し、新しいＵ字底９６ウェルプレートに移し、Ｇｕａｖａ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用してＧＦＰ蛍光を測定した。ＧＦＰを形質導入された細胞のパーセンテージを算出した。Ｌｅｎｔｉｇｅｎベクターで形質導入された細胞を２０℃で５分間、１０００ｒｐｍでスピンダウンし、ＡｕｔｏＭａｃｓバッファーおよびＰＥ標識抗イディオタイプ抗体の混合液を用いて１：１６０の希釈にて染色した（１ウェルは染色せずに残した）。調製物を、室温で暗所に置き、ＡｕｔｏＭａｃｓ緩衝液２００μＬで２度洗浄した。ＡｕｔｏＭａｃｓ緩衝液２００μＬ中に細胞を再懸濁し、Ｇｕａｖａ装置を用いてモニターした。ＧＦＰとＬｅｎｔｉｇｅｎの両方によるＴＵ／ｍＬとして表すタイターを、以下の式に基づき算出した：Ｄ０^＊における細胞（％形質導入された細胞／１００）／ウイルス体積（ｍＬ）。

＜実施例８＞
実験結果の要約−安定性試験
並列アプローチ（図１）を用いてスクリーニング試験を行い、レンチウイルスベクターの安定化に使用できる条件を同定した。図２に示す、緩衝液、ｐＨおよび塩条件を変化させたスクリーニングにおいて、市販のレンチウイルスベクター（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ社）の安定性を評価した。レンチウイルスベクターを室温（約２５℃）で一晩（約１８時間）インキュベートした。上記実施例５に記載の方法を用いたタイター（ＴＵ／ｍｌ）の評価により、安定性を測定した。ＮａＣｌを含むＰＩＰＥＳ緩衝液は、対照製剤（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ製剤）とほとんど同程度にベクターを安定化させ、それは緩衝液および塩成分に加えて賦形剤を含んでもよい。本実験において使用したレンチウイルスベクターは、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ社製のＣＡＲ１９ ＬＶとした。本実施例に記載の他の全ての試験では、上記実施例１に記載のＧＦＰ−ＬＶを使用した。

上記実施例４に記載の方法を用い、様々な製剤の流体力学半径の分布を測定し、レンチウイルスベクターの凝集（図３）の程度を評価した。

図４は、ヒスチジン緩衝液（２０ｍＭヒスチジン、５０〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０、６．５および７．０）では、温度上昇によるレンチウイルスベクター凝集の傾向が非常に低い（Ｒｈの変化によりモニター）ことを示す。図５は、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５、ＮａＣｌ濃度範囲５０〜１５０ｍＭ）中のレンチウイルスベクターが、（５５℃における１００ｍＭ ＮａＣｌを除き）全ての温度において凝集傾向を示さなかったことを示す。また、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０、５０〜１５０ｍＭの範囲のＮａＣｌ）中のレンチウイルスベクターは、４２〜５５℃の温度で凝集傾向を示した。図６は、クエン酸塩緩衝液（２０ｍＭクエン酸塩、５０〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０、６．５）では、温度上昇によるレンチウイルスベクター凝集の傾向が非常に低い（Ｒｈの変化によりモニター）ことを示す。図７は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、７．５および８．０）が、ｐＨ ７．５および８．０において高い凝集傾向を示すが、ｐＨ７．０で様々な温度でウイルスのモノマー状態が保持されることを示す。図８は、ＭＯＰＳ緩衝液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ、５０〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５、７．０および７．５）が、ｐＨ６．５および７．０では５０ｍＭ ＮａＣｌで、ならびにｐＨ７．５では全ての条件で、高い凝集傾向を有することを示す。２０ｍＭ ＭＯＰＳ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５の場合にのみ、高温での凝集が示される（５５℃、実際のケースの状況ではこれ程の温度にウイルスを曝露することは決して行わないため、著しく高温である）。図９は、ＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＭＥＳ、５０〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０および６．５）では、これらの条件下でのレンチウイルスベクターの凝集傾向が低いことを示す。図１０は、リン酸塩緩衝液（２０ｍＭリン酸塩、５０〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５、７．０、７．５、８．０）では、ｐＨ６．５でレンチウイルスベクターの凝集傾向が低いが、他の全てのｐＨ条件では凝集傾向が高いことを示す。図１１は、ＨＥＰＰＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＰＳ、５０〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５および８．０）では、全ての条件においてＬＶ（但し２５℃を除く）の凝集が促進されることを示す。図１２は、Ｔｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５および８．０）では、全ての条件においてＬＶ（但し２５℃を除く）の凝集が促進されることを示す。

これらの結果は、ヒスチジン、クエン酸、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳおよびＭＥＳ緩衝液においてレンチウイルスベクターの安定性が改善され得ることを示す。ＤＬＳを用い、レンチウイルス粒子の流体力学半径を測定した。ＤＬＳが半定量的アッセイであるため、異なる温度（低温から高温）における凝集傾向の分析に依存した。

異なる緩衝液条件におけるＲｈのロバスト性を測定するために更なる分析を行った（図１３〜１９）。この分析は、ＤＬＳ（上記実施例４参照）およびタイター（上記実施例５を参照）の測定を含むものとした。図１３は、ＤＬＳのみの評価において、ヒスチジン、クエン酸塩、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳおよびＭＥＳ緩衝液が、レンチウイルスベクターの安定化を選択的に促進し、モノマー状態を安定化させることを示す。図１４は、ＤＬＳのみの評価において、リン酸塩、ＨＥＰＰＳおよびＴｒｉｓベースの緩衝液が、高温において、凝集に対するいかなる保護作用も示さないことを示す。

図１５〜１９は、２つの基準（凝集に対する保護および高温での感染性の喪失に対する保護）を一緒に分析した試験結果を示す。図１５は、ヒスチジンおよびＰＩＰＥＳ緩衝液が、（特有のｐＨおよび塩の組合せにおいて）高温においても感染性を保持しつつ安定性をもたらすことを示す。図１６は、クエン酸塩緩衝液が高温において、ＨＥＰＥＳと比較し感染性の喪失からの保護を提供し、一方図１７は、ＭＯＰＳおよびＭＥＳ緩衝液が高温において、感染性の喪失からの保護を提供することを示す。図１８は、リン酸塩緩衝液が高温において、ＨＥＰＰＳと比較し感染性の喪失からの保護を提供し、一方図１９は、Ｔｒｉｓ緩衝液が高温において、感染性の喪失からの保護を提供しないことを示す。これらの結果は、２つのオーソゴナルな分析手法により測定されるように、選択された緩衝液（例えば、ヒスチジン、ＰＩＰＥＳ、クエン酸塩等）が感染性およびモノマー状態の保持において重要な安定化効果を示すことを示すものである。

凍結融解試験を行い、更に安定性の評価を行った。使用した方法を上記実施例６に記載する。図２０は、レンチウイルスベクターが３、６および９回の凍結融解サイクル後においてタイターを６５％超で維持して生存した条件の数を示す。図２１は、３、６および９回目の凍結融解サイクルに由来するレンチウイルスベクターの失活動態が、緩衝液によるベクター安定性の高低を左右することを示す。データの分析から、９回の凍結融解サイクル後でレンチウイルスベクターがタイターを６５％超で維持して生存するための５つの条件が同定された（例えば、図２２参照）。これらの条件の詳細を図２３に記載する。

更なる試験を行い、複数回の凍結融解サイクル後の安定性維持に対する炭水化物（スクロース）含有による効果を評価した。上記実施例６の方法をこれらの実験に採用した。クエン酸塩、ＨＥＰＥＳおよびＰＩＰＥＳベースの緩衝液では、活性の約２０％の喪失を示したヒスチジン緩衝液と比較し、９回目の凍結融解サイクル後、レンチウイルスベクターの活性喪失が見られない（図２４および２５を参照）。炭水化物存在下における選択された安定化緩衝液条件の例を図２６に示す。

上記実施例７に記載の方法を用いて、初代Ｔ細胞におけるウイルスタイターを評価した。結果を図２７に示す。ＰＩＰＥＳおよびクエン酸塩緩衝液が初代細胞において非常に高いタイターを示し、細胞における効率的な形質導入を示すことが明らかとなった。ＨＥＰＥＳおよびヒスチジン緩衝液も同様に高いタイターを示した。確認された条件全てにおいて、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ社から購入した市販のベクター（市販の製剤、不明）を上回った。

ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳおよびヒスチジン緩衝液を使用した安定性試験のある結果の比較を図２８に示す。ＤＬＳにより測定されたとおり、凝集結果は、レンチウイルスベクターの流体力学半径の増加が温度の関数であることを示す。特定のｐＨ（および５０〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ）における平均値を示す。高温におけるレンチウイルスベクターの活性を２９３Ｔ細胞において評価した。５０℃における値を２５℃における値と比較した。特定のｐＨ（および５０〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ）における平均値を示す。レンチウイルスベクターの安定性の例示として、２９３Ｔ細胞における９回目の凍結融解サイクル後のレンチウイルスベクターの活性を示す（＞１００％の活性は活性の喪失がないことを意味；インビボアッセイとして可変的なアッセイ）。初代Ｔ細胞におけるレンチウイルスベクターの活性を、形質導入能力に関する更なる検査として示す。ＰＩＰＥＳ緩衝液中のレンチウイルスベクターは、ＨＥＰＥＳおよびヒスチジン緩衝液中のレンチウイルスベクターと比較し、それぞれ、約２５％および約３５％多い初代Ｔ細胞にトランスフェクトすることができた。例えば、レンチウイルスベクターはＰＩＰＥＳ緩衝液においてより安定であるため、ＰＩＰＥＳ緩衝液は、標準的なＨＥＰＥＳベースの製剤の代替としてこのように提供されるものである。更に、ＰＩＰＥＳ緩衝液中のレンチウイルスベクターは、ＨＥＰＥＳおよびヒスチジン緩衝液と比較し、約２０〜２５％多い初代Ｔ細胞にトランスフェクトすることができた。

＜実施例９＞
ＰＩＰＥＳ、ヒスチジンおよびＨＥＰＥＳ緩衝液中のレンチウイルスベクターの精製
上記実施例１および２に記載の方法を用いて、レンチウイルスベクターを製造し、精製した。クロマトグラフィー後の精製ステップにおいて、０．２ミクロンのフィルターに通し、無菌性を維持した。凝集による、精製の際の回収率低下が生じ得るため、異なる緩衝液を試験し、最適な回収条件を同定した。図２９に示すように、ＨＥＰＥＳおよびヒスチジン緩衝液と比較し、ＰＩＰＥＳ緩衝液はより良好な回収率を示した。

＜実施例１０＞
更なるレンチウイルスベクターの安定化
上記のように、以上で行った試験では、ＧＦＰレンチウイルスベクター（上記のように、図２に図解された安定性試験を除く）を使用した。更なる実験を行い、異なる導入遺伝子を発現する更に２つのレンチウイルスベクター（ベクター１および２）の安定化において、ＰＩＰＥＳベースの緩衝液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％スクロース）が効果的であることを示した。

ＰＩＰＥＳベースの緩衝液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％スクロース）中の２つのレンチウイルスベクターを、マイクロフィルトレーション、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）、ベンゾナーゼ処理、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および濾過滅菌のステップを含む方法により精製した。ＴＦＦ保持液から得たサンプルを、−８０℃または＋４℃で４日間保存した。更に、ＳＥＣ溶出液から得たサンプルを、−８０℃または＋４℃で３日間保存した。保存期間前後のサンプルからウイルスタイターを得た。両方のベクターは、精製の間、ＰＩＰＥＳ緩衝液中において安定であった。図３０に示すように、タイター測定の結果、−８０℃または＋４℃におけるＴＦＦおよびＳＥＣサンプルの短期保存の間に活性の顕著な変化が見られなかった。

ＰＩＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％スクロース）中に保存されたベクターの凝集状態を評価するため、動的光散乱を用いた。図３１および３２に示すように、「ｄ，ｎｍ」を１４０ｎｍ前後で測定し、両方のベクターとも、２５℃のＰＩＰＥＳ製剤においてモノマー状態であることが明らかとなった。使用した方法は上記実施例４に記載のとおりである。

精製されたベクター２の安定性を、４℃で３週間、ＰＩＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％スクロース）中での保存後に評価した。図３３に示すように、２９３Ｔ細胞のタイター測定、ならびに対照（４℃、０日目、図３３の初期バー、この対照活性を１００％とした）と比較した残存活性パーセンテージの測定の結果、このベクターは、これらの条件下で高い安定性を維持する。Ｘ軸のバーは、それぞれ、１４および２１日目の活性（対照に対するパーセント表示）を示す。

更なる試験において、ＰＩＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％スクロース）中のベクター２の凍結融解安定性を評価した（方法については上記実施例６を参照）。図３４に示すように、２９３Ｔ細胞のタイター測定、ならびに対照（精製されたレンチウイルスのサンプルを精製直後に−８０℃で保存したため、１回目の凍結融解サイクル後のタイター）と比較した残存活性パーセンテージの測定の結果、複数回の凍結融解サイクル（最大９回実施）後、このベクターは高い安定性を維持する。対照サンプルの活性を１００％とし、図３４の初期バーとして表す。Ｘ軸のバーは３、６および９回の凍結融解サイクル後の残存活性（パーセント）を示す（対照に対するパーセント表示）。

他の実施形態
本明細書に記載の全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかもそれぞれ独立の刊行物または特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み込まれる旨示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明を、その特定の実施形態と関連付けて記載したが、その更なる変更が可能であることが理解されるであろう。また本願は全体的に、本発明の原理に従う本発明のいかなるバリエーション、使用または修正を包含することを意図したものであり、本発明が関係する技術分野における周知または慣用的な実施の範囲内に含まれ、上記した必須構成要素に適用でき、また特許請求の範囲に従う、本発明からの逸脱を含むものである。

Claims (67)

1. レンチウイルスベクターと、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）緩衝液と、塩とを含む水性組成物。
2. 前記ＰＩＰＥＳ緩衝液が、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で存在する、請求項１に記載の水性組成物。
3. 前記ＰＩＰＥＳ緩衝液が、約２０ｍＭの濃度で存在する、請求項２に記載の水性組成物。
4. ｐＨが約６．０〜約７．０である、請求項１から３のいずれか一項に記載の水性組成物。
5. ｐＨが約６．５である、請求項４に記載の水性組成物。
6. 前記塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の水性組成物。
7. 前記塩が塩化ナトリウムである、請求項６に記載の水性組成物。
8. 前記塩の濃度が約２５ｍＭ〜約１５０ｍＭである、請求項１から７のいずれか一項に記載の水性組成物。
9. 前記塩の濃度が約５０ｍＭである、請求項８に記載の水性組成物。
10. 前記塩の濃度が約７５ｍＭである、請求項８に記載の水性組成物。
11. ２０ｍＭ ＰＩＰＥＳおよび７５ｍＭ塩化ナトリウムを含み、約６．５のｐＨを有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の水性組成物。
12. 炭水化物を更に含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の水性組成物。
13. 前記炭水化物が非還元炭水化物である、請求項１２に記載の水性組成物。
14. 前記非還元炭水化物が、スクロースおよびトレハロースからなる群から選択される、請求項１３に記載の水性組成物。
15. 前記炭水化物が、前記水性組成物の体積当たりの重量で約１％〜約１０％の濃度で存在する、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の水性組成物。
16. 前記炭水化物が、前記水性組成物の体積当たりの重量で約２％〜約５％の濃度で存在する、請求項１５に記載の水性組成物。
17. 前記炭水化物が、前記水性組成物の体積当たりの重量で約２．５％の濃度で存在する、請求項１６に記載の水性組成物。
18. ２０ｍＭ ＰＩＰＥＳと、７５ｍＭ塩化ナトリウムと、前記水性組成物の体積当たりの重量で２．５％のスクロースとを含み、約６．５のｐＨを有する、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の水性組成物。
19. モル浸透圧濃度が、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の水性組成物。
20. モル浸透圧濃度が、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３００ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項１９に記載の水性組成物。
21. モル浸透圧濃度が約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項２０に記載の水性組成物。
22. 前記レンチウイルスベクターが、約２×１０^８ＴＵ／ｍＬ（１ミリリットル当たりの形質導入単位）〜約１×１０^９ＴＵ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の水性組成物。
23. 前記レンチウイルスベクターが、約３×１０^８ＴＵ／ｍＬ〜約５×１０^８ＴＵ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２２に記載の水性組成物
24. 前記レンチウイルスベクターが組換えヒト免疫不全ウイルスである、請求項１から２３のいずれか一項に記載の水性組成物。
25. 前記レンチウイルスベクターが、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）タンパク質を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の水性組成物。
26. 前記ＶＳＶ−Ｇタンパク質が、前記レンチウイルスベクターの表面に存在する、請求項２５に記載の水性組成物。
27. 前記レンチウイルスベクターが導入遺伝子を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の水性組成物。
28. 前記導入遺伝子がタンパク質をコードする、請求項２７に記載の水性組成物。
29. 前記タンパク質がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項２８に記載の水性組成物。
30. 前記ＣＡＲが、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数のシグナリングドメインを含む、請求項２９に記載の水性組成物。
31. 前記シグナリングドメインが、１つまたは複数の一次シグナリングドメインを含む、請求項３０に記載の水性組成物。
32. 前記シグナリングドメインが、１つまたは複数の共刺激シグナリングドメインを含む、請求項３０または３１に記載の水性組成物。
33. 前記１つまたは複数の一次シグナリングドメインの１つが、ＣＤ３−ゼータ刺激性ドメインを含む、請求項３１に記載の水性組成物。
34. 前記共刺激シグナリングドメインの１つまたは複数が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択される共刺激タンパク質から選択される細胞内ドメインを含む、請求項３２または３３に記載の水性組成物。
35. 前記共刺激シグナリングドメインの前記１つまたは複数が、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインを含む、請求項３４に記載の水性組成物。
36. 前記共刺激ドメインの前記１つまたは複数がＣＤ２８共刺激ドメインを含む、請求項３４または３５に記載の水性組成物。
37. 前記抗原結合ドメインがｓｃＦｖである、請求項３０から３６のいずれか一項に記載の水性組成物。
38. 前記抗原結合ドメインが、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１；Ｃ型レクチン様分子−１；ＣＤ３３；表皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２；メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）；ステージ特異的胎児抗原−４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体チロシン−プロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面会合（ＭＵＣ１）；表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；延長因子２変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）；炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）およびアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ−ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クラウディン（ｃｌａｕｄｉｎ）６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；グロボ（ｇｌｏｂｏ）Ｈグリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン（ｕｒｏｐｌａｋｉｎ）２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パンネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；ＥＴＳ転座変異体遺伝子６、染色体１２ｐ上に位置（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；***タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンギオポエチン結合性細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；黒色腫がん精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫がん精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原−１、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原１；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；アポトーシスの黒色腫阻害因子（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；チトクロームＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様、Ｔ細胞により認識される扁平上皮細胞癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグメイン（ｌｅｇｕｍａｉｎ）；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０−２突然変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）のＦｃ断片；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン−３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）からなる群から選択される抗原に結合する、請求項３０から３７のいずれか一項に記載の水性組成物。
39. 前記抗原結合ドメインが、ＣＤ１９、メソテリンまたはＣＤ１２３と結合する、請求項３８に記載の水性組成物。
40. 前記ＣＡＲが、抗ＣＤ１９抗体またはその断片、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）膜貫通ドメインおよびＣＤ３−ゼータシグナリングドメインを含む、請求項２９から３９のいずれか一項に記載の水性組成物。
41. ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびリポタンパク質からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質を含まない、請求項１から４０のいずれか一項に記載の水性組成物。
42. ＨＳＡ、ｒＨＳＡ、ＢＳＡおよびリポタンパク質を含まない、請求項４１に記載の水性組成物。
43. 前記レンチウイルスベクターが、血清の非存在下で培養された細胞において産生される、請求項１から４２のいずれか一項に記載の水性組成物。
44. 前記レンチウイルスベクターが、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定したとき、１００±２５ｎｍの流体力学半径により特徴づけられる、請求項１から４３のいずれか一項に記載の水性組成物。
45. 前記レンチウイルスベクターが、２５℃〜５５℃の温度範囲内で、１００±２５ｎｍの前記流体力学半径を維持する、請求項４４に記載の水性組成物。
46. 前記レンチウイルスベクターが、１０％〜２５％の多分散性により特徴づけられる、請求項１から４５のいずれか一項に記載の水性組成物。
47. 前記レンチウイルスベクターが、２５℃〜５５℃の温度範囲内で、１０％〜２５％の前記多分散性を維持する、請求項４６に記載の水性組成物。
48. 前記レンチウイルスベクターの３回の凍結／融解サイクルの後の濃度が、前記凍結／融解サイクル前の前記水性組成物中の前記レンチウイルスベクターの濃度に対して約７０％〜約１００％で維持され、前記凍結／融解サイクルがそれぞれ、前記水性組成物を凍結させ、その後前記水性組成物を室温で融解させることを含む、請求項１から４７のいずれか一項に記載の水性組成物。
49. 前記レンチウイルスベクターが、６回の前記凍結／融解サイクルの後、約７０％〜約１００％の前記濃度を維持する、請求項４８に記載の水性組成物。
50. 前記レンチウイルスベクターが、９回の前記凍結／融解サイクルの後、約７０％〜約１００％後の前記濃度を維持する、請求項４９に記載の水性組成物。
51. レンチウイルスベクターと、リン酸塩緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、３−モルホリノプロパン−１−スルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液からなる群から選択される緩衝液と、塩とを含む水性組成物。
52. 前記塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムからなる群から選択される、請求項５１に記載の水性組成物。
53. スクロースおよびトレハロースからなる群から選択される非還元炭水化物を更に含む、請求項５１または５２に記載の水性組成物。
54. レンチウイルスベクターを精製する方法であって、請求項１から５３のいずれか一項に記載の水性組成物をフィルターに通すことにより、微生物を実質的に含まない水性組成物を生成することを含む方法。
55. 前記フィルターが複数の孔を含み、前記孔が約０．２μｍの直径を有する、請求項５４に記載の方法。
56. 前記微生物を実質的に含まない水性組成物が、前記接触より前の前記水性組成物中の前記レンチウイルスベクターの濃度に対して約８０％の濃度で前記レンチウイルスベクターを含む、請求項５５に記載の方法。
57. レンチウイルスベクターを精製する方法であって、
    ａ．請求項１から５３のいずれか一項に記載の水性組成物を、複数の粒子を含む材料と接触させることと、
    ｂ．前記材料中を流れた物質を、前記材料内に残留する物質から分離することにより、前記レンチウイルスベクターが富化された水性組成物を生成することと、
    を含む方法。
58. レンチウイルスベクターを精製する方法であって、請求項１から５３のいずれか一項に記載の水性組成物をヌクレアーゼと接触させることにより、混入ポリヌクレオチドを実質的に含まない水性組成物を生成することを含む方法。
59. 細胞において導入遺伝子を発現させる方法であって、前記細胞を請求項１から５３のいずれか一項に記載の水性組成物と接触させることを含む方法。
60. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項５９に記載の方法。
61. 前記哺乳動物細胞がＴ細胞である、請求項６０に記載の方法。
62. 前記Ｔ細胞がヒトＴ細胞である、請求項６１に記載の方法。
63. 前記ヒトＴ細胞が、２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞または初代ヒトＴ細胞である、請求項６２に記載の方法。
64. 請求項１から５３のいずれか一項に記載の水性組成物と、添付文書とを含むキット。
65. 前記添付文書が、前記キットのユーザーに、請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の方法に従って細胞において導入遺伝子を発現させるよう指示するものである、請求項６４に記載のキット。
66. 請求項６５に記載の細胞の培養に使用できる試薬を更に含む、請求項６５に記載のキット。
67. 導入遺伝子を任意に含むウイルスベクターを対象の細胞に送達する方法における、請求項１から５３のいずれか一項に記載の水性組成物の使用であって、前記方法が、前記対象に前記組成物を投与することを含む、使用。