JP2018529947A - 生物学的試料の多重分析におけるクロストークの修正 - Google Patents

Abstract

多重分析の１組のＩ個の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の蛍光値｛φ^ｓｐｅ _ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}を決定するための方法であって、微粒子が単層配列であって、本方法が、１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}のデジタル蛍光画像を取得する段階と、１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}における各蛍光微粒子μＰ_ｉについて、蛍光微粒子μＰ_ｉに対応する取得画像の画素のみに基づいて蛍光値φ_ｉ ^ｍｅａｓを計算する段階と、を含み、本方法が、１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}における他の蛍光微粒子｛μＰ_ｊ｝_ｊ≠ｉからの第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓにおけるクロストーク蛍光寄与φ_ｉ ^{ｃｒｏｓｓ}によって第１の蛍光値φ_ｉ ^ｍｅａｓを修正することによって、蛍光微粒子μＰ_ｉの蛍光値φ_ｉ ^ｓｐｅを計算する段階を含む、方法が開示される。

Description

本発明は、特に生物学的試料の複数のバイオマーカーの検出に基づく複合的な疾病の診断における生物学的多重分析に関する。

複合的な疾病の診断および治療への反応は、単一の識別可能なバイオマーカーよりもむしろ複数の生体分子に関することが多い。一度に１つの検体を測定する従来の技術とは対照的に、多重化技術は、単一のアッセイ内で、数十から数千の異なる生体分子、例えばたんぱく質や核酸を、識別条件を用いて単一の生物学的試料から測定しうる。基本的に、例えば抗体、目標たんぱく質、ペプチドまたは核酸などの様々な種類の捕捉分子が、試料で満たされたアッセイ装置内に提供され、それぞれの種類の捕捉分子は、試料内で探索されるバイオマーカーとともに、特定の蛍光標識された複合体（通常、「目標蛍光標識バイオマーカー」と呼ばれる）を形成するように設計される。多重化技術の１つの主要な問題は、相補的な捕捉分子に結合された単一の種類の蛍光標識バイオマーカーに起因する蛍光（以後「個別蛍光」）の単一のアッセイの間に決定することである。

様々な多重化技術が利用可能であり、これらはそれぞれ、通常この問題に対応する特定のエンコード戦略によって分類される。最も一般的な市販の多重化技術はアッセイベース及びビードベースである。アレイベース技術では、捕捉分子は「捕捉スポット」の２次元アレイを形成する周知の配置でパネル上に結合されており、それぞれ特定のバイオマーカーの捕捉に特化されている。そのため、そのような平面アレイは各バイオマーカーの蛍光を決定するために捕捉スポットのｘ−ｙ座標に頼る。ビードベース技術は、色及び強度が各ビード群の識別を可能とするスペクトルエンコードに基づいている。これらは高度に柔軟で拡張性があることが証明されている。しかし、現在利用可能なビードベースシステムは、バッチでコスト効率よく実行するように設計されており、プレートを満たすために十分な試料を待つ必要性があるため、ルーチンの臨床試験において所要時間を遅延させうる。さらに、どちらの技術も、主に拡散によって駆動されるため、遅い結合動力学という問題がある。通常これはプロセスの加速のために撹拌が使用されたとしても、長い試料培養時間を強いる。さらに、拡散に制限される結合方式は、報告されている高いアッセイ中及びアッセイ間の変動にも寄与しうる。

上述の制限に対応するために、エンコードされた微粒子及び微小流動流路に基づく多重化技術が設計されている。この技術は例えば非特許文献１及びウェブサイトhttp://pubs.arc.orgからダウンロード可能な補足情報に説明されている。この技術を実施する１つの装置は、ベルギー国ゲントのＭｙＣａｒｔｉｓ社によって「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）」という名称で販売されている。ここで、この技術の主要な構成要素（エンコードされた微粒子、微小流動流路カートリッジ及び器具）を図１に関して簡単に説明する。

図１Ａを参照すると、エンコードされた微粒子１０または「キャリア」は円盤形状であり、直径４０μｍ、高さ１０μｍであり、シリコンウェハから例えばＭＥＭＳ製造技術を用いて製造される。各微粒子１０の縁は、穴１４の存在または不存在によって形成された１０進バイナリーコードＩｄ_ｍ１２または「識別部」を用いて明確にエンコードされている。捕捉分子は微粒子１０の両面に結合されており、そのためこれは抗体、目標たんぱく質、ペプチド、核酸またはその他の生体分子を含みうる多数の捕捉分子のための固体支持部として働く。より具体的には、単一の種類の捕捉分子（すなわち特定のバイオマーカーの捕捉に特化された捕捉分子）が、同じコードＩｄ_ｍを共有する微粒子に結び付けられている。

図１Ｂを参照すると、カートリッジ２０または「アッセイプレート」は、エンコードされた微粒子混合物をホストすることができる複数の微小な流路２２を特徴とし、そのため同時にまたは順次（すなわち異なる時間で）複数の試料の実行を可能にする。各流路２２は透明な壁からなり、大気圧よりも高い圧力で流路２２を加圧し、流路の微小流動動作を可能にする流入ウェル２４及び流出ウェル２６を接続する。流路２２は、微粒子の直径の少なくとも５倍、例えば１０倍幅広く、流路の検出領域内の微粒子を動かないようにするためのフィルター構造をそれぞれ含む。流路の高さは、効率的な微粒子のローディング及びタイリングのために最適化される。流路の高さが浅いと、微粒子がたがいに重なるのを防ぎ、微粒子は面の１つを画像取得の目的のために完全に取得可能にして、単一層配列の状態で流路内に配列される。そのため、この流路内の微粒子の単一層配置は、デコーディング及び蛍光定量化のために高解像度の画像取得の使用を可能にする。各流路は、最大数千の微粒子でロード可能であり、完全にロードされた流路は、探索される各バイオマーカーについて数十の微粒子で１００以上の異なるバイオマーカーの多重化を可能にする。多重化分析の目的のために、流路内にロードされた微粒子混合物は、同一のコードを共有する複数の微粒子を含み、それによって統計的信頼性のために測定冗長性を提供する群を形成する。

装置は、流路の画像を取得すること、流路内の流体の作動及び温度を制御すること、並びに取得された画像の分析をすることを目的とする。より具体的には、装置は、例えば長いワーキング距離の対物系及び高感度ＣＭＯＳカメラを有し、カートリッジの検出領域の明視野及び落射蛍光画像を（例えばレーザーを用いて、例えば６４０ｎｍの励起）取得する光学系２８を含む。対物系は、アッセイの間、リアルタイムの読出しのために、または終了点において、各流路を走査するための自動化されたｘ−ｙ−ｚステージに取り付けられる。装置はさらに、デコードの目的のために明るい背景内の微粒子の高コントラスト画像を得ることができるように、検出領域を均一に照射するための照明システム（図示されない）と、光学系の動作とともにカートリッジの微小流動動作（流入／流出ウェル、加圧、温度など）を制御するための制御ユニット（図示されない）と、場合によっては制御ユニットの一部であるかそれらから独立し、画像を受け取るためにカメラに結合された、光学系によって取得された蛍光及び明視野画像に基づいて、試験される試料内のバイオマーカーを自動的に定量化するための多重分析コンピューティングプログラムを実行するコンピューティングユニット３０（例えばパーソナルコンピュータ、サーバーまたはより一般的な、データをカメラから受信し、メモリに保存された命令に従ってデータを処理するように構成された任意のコンピューティングハードウェアなど）と、を含む。

図２を参照すると、前述の多重化技術によって具現化される多重分析は、微粒子３２の懸濁混合物を生成する段階であって、微粒子１０は試験される試料内で探索されるバイオマーカーに基づいて選択され、１つまたは複数の流路２２を満たすためにカートリッジ２０内の微粒子３２の液体混合物をロードして微粒子の平面配列が最適な読み出し目的のために提供される、微粒子３２の懸濁混合物を生成する段階（図２Ａ）と、流路２２内で必要な場合には試薬に従って（例えばサンドイッチ反応のために）試験される液体試料をロードし、それによって試験される試料内のバイオマーカー３４と微粒子１０に結合される捕捉分子３６との間の微小流動環境における培養及び／または結合反応を開始する段階（図２Ｂ）と、流路２２の検出領域の画像を（例えばリアルタイムでまたはプロセス終了時に一度に）取得する段階と、からなる。微粒子１０は加圧及びフィルター要素のために流路２２内で移動しない一方で、好適には画像取得のサイクルは、明視野画像３８及び蛍光画像４０をまたはその反対で連続して取得する段階からなり、各微粒子の位置は両画像で同一である（図２Ｃ）。多重分析はさらに、各流路２２並びに流路の明視野及び蛍光画像３８、４０の各対について、流路２２内の各微粒子１０の位置Ｘ_ｉを識別し、各微粒子１０のコードＩｄ_ｍ１２を読み取るために明視野画像３８を分析する段階と、（例えば微粒子の中心位置に対応する画像の一部の画素にフィットした核密度の最大値に対応する）蛍光画像内の各微粒子１０の蛍光φ^ｍｅａｓを決定するために蛍光画像４０を分析する段階と、各流路２２及び流路内で同一のコードＩｄ_ｍを共有する微粒子１０の各群について、その群について蛍光φ^ｐｏｐの合計値を計算し、例えば異常な蛍光値φ^ｍｅａｓをフィルターで除去するために、蛍光φ^ｍｅａｓにテューキーの箱ひげ図を適用し、次いで残りの蛍光φ^ｍｅａｓの数平均値としての合計値を計算する段階（図２Ｄ）と、バイオマーカーについてあらかじめ決定され、コンピューティングユニット３０のデジタルメモリ内に保存された濃度（例えば表、分析数学モデルなど）に対する、保存された蛍光の関連性を用いる合計値φ^ｐｏｐに基づく検査される試料内のバイオマーカー濃度［ｂ］を決定する段階（または「滴定法」）（図２Ｅ）と、からなる。

次いで、計算された濃度は使用者に表示され、及び／またはデジタルメモリ（例えばコンピューティングユニットのメモリ）に保存される。

この多重化技術は、（ｉ）反応制限結合方式による短いアッセイ時間及び高い再現性、（ｉｉ）単一のアッセイ実行中に複数のパラメータの最適化を可能とするアッセイ条件の動的制御およびリアルタイム結合監視、（ｉｉｉ）試料及び検出抗体を同時に流し、ワークフローを単純化するなどの様々な免疫学的測定フォーマットに対する互換性、（ｉｖ）システムダイナミックレンジの増大につながる初期結合レートに基づく検体定量化、（ｖ）蛍光収集の改善による高い感度、（ｖｉ）望ましい場合には単一のアッセイを実行する機会（すなわち、特定のバイオマーカーの定量測定のために１種類の捕捉分子のみを提供する）を可能にする。

しかし、いくつかの例では、多重アッセイデータから計算されるバイオマーカー濃度［ｂ］と、単一アッセイデータから計算されるバイオマーカー濃度［ｂ］との間に相違がみられる。

"Rapid, Sensitive and Real-Time Multiplexing Platform for the Analysis of Protein and Nucleic-Acid Biomarkers", Didier Falconnet and al., Anal. Chem. 2015, 87, 1582-1589

本発明の１つの目的は、多重化分析において、多重アッセイと単一アッセイとの間の差を修正する微粒子蛍光の計算を提案することである。

この目的を達成するために、本発明の１つの対象は、多重分析の１組のＩ個の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の蛍光値｛φ^ｓｐｅ _ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}を決定するための方法であって、微粒子が単層配列であって、本方法が、
１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}のデジタル蛍光画像を取得する段階と、
１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}における各蛍光微粒子μＰ_ｉについて蛍光微粒子μＰ_ｉに対応する取得画像の画素のみに基づいて第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓを計算する段階と、を含む。

本発明によれば、本方法は、１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}における他の蛍光微粒子｛μＰ_ｊ｝_ｊ≠ｉから第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓにおけるクロストーク蛍光寄与φ_ｉ ^{ｃｒｏｓｓ}によって第１の蛍光値φ_ｉ ^ｍｅａｓを修正することによって、蛍光微粒子μＰ_ｉの蛍光値φ_ｉ ^ｓｐｅを計算する段階を含む。

換言すれば、微粒子μＰ_ｊに対応する取得画像の部分は、この微粒子によって生成された光には厳密には対応しない。各微粒子は、散乱し、他の微粒子の光と重なる光を発生させる。比喩として描写すれば、微粒子間の「クロストーク」効果が存在する。具体的には、クロストーク効果は、異なる蛍光の少なくとも２つの群の微粒子（例えば暗い群と明るい群）が一緒に混合されている場合に観察されうる。例えば、蛍光の違いが２つの群の間で十分に大きい場合、蛍光の増加が、明るい方の群の微粒子の近傍に存在するより暗い方の群の微粒子のいくつかにおいて観察される。クロストークはまた単一アッセイでも存在しうる。

１つの実施形態によれば、蛍光値φ_ｉ ^ｓｐｅの計算が、
１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}における各蛍光微粒子μＰ_ｉに関してデジタル蛍光画像内の位置Ｘ_ｉを計算する段階と、
全ての蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の位置｛Ｘ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}及び蛍光値｛φ_ｉ ^ｓｐｅ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の関数として、第１の蛍光値φ_ｉ ^ｍｅａｓをモデル化する段階と、
蛍光値φ_ｉ ^ｓｐｅを得るために関数の逆関数を計算する段階と、を含む。

１つの実施形態によれば、蛍光φ_ｉ ^ｓｐｅを計算する段階が、以下の関係式に基づいて実行され、

φ_ｊ ^ｓｐｅがｊ番目の蛍光微粒子μＰ_ｊの蛍光であり、
α_ｉｊが、ｊ番目の蛍光微粒子μＰ_ｊの第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓにおけるユニタリークロストーク蛍光寄与であり、ユニタリークロストーク蛍光寄与α_ｉｊが、蛍光微粒子μＰ_ｉとμＰ_ｊとの間の距離のみに依存する。

換言すれば、所定の微粒子について、他の微粒子によって生成された光は、（例えば画像の明るさの平均を計算することによって）測定可能な均一な背景ノイズまで減少せず、微粒子の蛍光から差し引かれる。発明者らは、他の微粒子からのかく乱が、微粒子の特定の配列に応じて変動しうることにさらに気づいた。そのため、微粒子のクロストーク効果を修正するために、本発明は他の微粒子のそれぞれの寄与を計算する。各寄与を考慮することにより、微粒子間の高コントラスト条件であっても、単一測定と同様な多重測定を行うこととなる。

さらに、発明者は、クロストーク効果が等方的な減衰プロファイルの和によってモデル化されうることに気づいた。これは、寄与を計算することについて他から独立に微粒子を考慮しうること並びに、微粒子によって散乱された蛍光が微粒子からの距離及び微粒子の蛍光にのみ依存することを意味する。ユニタリークロストーク蛍光寄与α_ｉｊは、例えば微粒子が発生し、例えば多重分析機の製造者によって事前に決定され、分析機のメモリに保存された定数パラメータに基づいて計算される規格化された蛍光に対応する。

具体的には、本方法は、デジタル蛍光画像内のｉ番目の蛍光微粒子とｊ番目の蛍光微粒子との間の距離ｄ_ｉ，ｊを計算する段階と、１組のＩ個の蛍光微粒子における微粒子（μＰ_ｉ、μＰ_ｊ）の各対について、距離ｄ_ｉ，ｊに基づいて対（μＰ_ｉ、μＰ_ｊ）のユニタリークロストーク蛍光寄与α_ｉｊを計算する段階と、
以下の関係式

に基づいて、１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の蛍光｛φ_ｉ ^ｓｐｅ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}を計算する段階と、を含む。

換言すれば、計算は２つの特定の換算に基づき、後述のように、これは単純である一方非常に正確なクロストーク効果の修正を可能にする。

具体的には、ｉ番目の蛍光微粒子の第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓにおけるｊ番目の微粒子のユニタリークロストーク蛍光が、以下の関係式

に基づいて計算され、Ｎが２以上の整数であり、θ_ｎ、ｋ_ｎ及びβ_ｎが所定のパラメータである。

指数関数の和は、ユニタリークロストーク蛍光寄与α_ｉｊをモデル化するのに有効な方法であり、その一方同時にパラメータθ_ｎ、ｋ_ｎ及びβ_ｎを計算するための凸最適化の柔軟性を提供する。具体的には、３つの指数が、α_ｉｊを計算するのに十分である。

１つの実施形態において、１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の各蛍光微粒子μＰ_ｉが、１組の異なる固有のＭ個の識別部｛ｉｄ_ｍ｝_{ｍ∈{1, 2,…, M}}の識別部Ｉｄ_ｍ（ｉ）を含み、識別部Ｉｄ_Ｍ（ｉ）が、蛍光微粒子μＰ_ｉのデジタル画像の処理において可読であり、
方法がさらに、
１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}のデジタル画像を取得する段階と、
デジタル画像内の各微粒子μＰ_ｉの識別部Ｉｄ_ｍ（ｉ）を読み取る段階と、
１組のＭ個の異なる固有の識別部｛ｉｄ_ｍ｝_{ｍ∈{1, 2,…, M}}の各識別部Ｉｄ_ｍについて、識別部を含む蛍光微粒子の蛍光φ_ｉ ^ｓｐｅに基づいて合計蛍光φ_ｍ ^ａｇを計算する段階と、を含む。

具体的には、１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の各蛍光微粒子μＰ_ｉが、蛍光微粒子μＰ_ｉの識別部Ｉｄ_ｍ（ｉ）に固有に関連した蛍光複合体で被覆された表面を含み、複合体が、微粒子に固定された第１の非蛍光分子と、第１の非蛍光分子に結合された第２の蛍光分子と、を含む。

より具体的には、微粒子が等しい寸法を有する。

変形例において、本方法は、１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}のデジタル蛍光画像を取得する前に、
流路内に第１の非蛍光分子に結合された第２の蛍光分子を有しない微粒子を配置して、微粒子を単一層に配列させる段階と、
流路を液体試料で満たす段階と、
合計蛍光φ_ｍ ^ａｇに基づいて、試料内の第２の蛍光分子の濃度を計算する段階と、を含む。

本発明の別の対象は、前述の方法を実施するためのシステムであって、具体的には１組のＩ個の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の蛍光｛φ_ｉ ^ｓｐｅ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}を決定するためのシステムであって、
１組のＩ個の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}を単一層配列で受容するための少なくとも１つの流路と、
流路内の１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の単一層配列のデジタル蛍光画像を取得するための取得ユニットと、
取得されたデジタル蛍光画像に基づいて、蛍光｛φ_ｉ ^ｓｐｅ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}を計算するためのコンピューティングユニットであって、コンピューティングユニットが、蛍光微粒子μＰ_ｉに対応する取得されたデジタル蛍光画像の画素のみに基づいて第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓを計算する、コンピューティングユニットと、を含み、
コンピューティングユニットが、１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の各蛍光微粒子μＰ_ｉについて、
１組の蛍光微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の他の蛍光微粒子｛μＰ_ｊ｝_ｊ≠ｉからの蛍光微粒子μＰ_ｉの第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓにおけるクロストーク蛍光寄与φ_ｉ ^{ｃｒｏｓｓ}であって、計算が別の微粒子の第１の蛍光｛φ_ｉ ^ｍｅａｓ｝_ｊ≠ｉに基づく、クロストーク蛍光寄与φ_ｉ ^{ｃｒｏｓｓ}と、
クロストーク蛍光寄与φ_ｉ ^{ｃｒｏｓｓ}を用いて第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓを修正することによる蛍光微粒子μＰ_ｉの蛍光φ_ｉ ^ｓｐｅと、を計算する。

本発明は、添付する図面に関して単に例として提供される以下の説明を読むことにより、より理解されるであろう。同一の参照符号は同一または類似の要素を指す。

従来技術のエンコードされた微粒子及びそのような微粒子を用いた多重分析機の概略図である。 従来技術のエンコードされた微粒子及びそのような微粒子を用いた多重分析機の概略図である。 図１の微粒子及び分析機を用いた試料の多重分析を示す。 図１の微粒子及び分析機を用いた試料の多重分析を示す。 図１の微粒子及び分析機を用いた試料の多重分析を示す。 図１の微粒子及び分析機を用いた試料の多重分析を示す。 図１の微粒子及び分析機を用いた試料の多重分析を示す。 単一及び多重アッセイからの蛍光の差を示す。 本発明に従う蛍光減衰プロファイルを決定するための微粒子の配列を示す。 本発明に従う蛍光減衰プロファイルを決定するための微粒子の配列を示す。 本発明に従う蛍光減衰プロファイルを示す。 本発明に従う相対蛍光減衰プロファイルを示す。 相対蛍光減衰プロファイルとフィットするモデルを示す。 明るい微粒子及び暗い微粒子による二重アッセイを示す。 明るい微粒子及び暗い微粒子による二重アッセイを示す。 明るい微粒子及び暗い微粒子による二重アッセイを示す。 明るい微粒子及び暗い微粒子による二重アッセイを示す。 クロストーク効果の測定された二重蛍光における効果を示す。 クロストーク効果の測定された二重蛍光における効果を示す。 本発明に従うクロストーク効果修正の前の暗い微粒子の蛍光を示す。 本発明に従うクロストーク効果修正の後の暗い微粒子の蛍光を示す。

上述したＥｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）システムに基づく本発明の実施形態をこれから説明する。実施形態は、本発明に従う補足的な処理により、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）とは異なる。特に、システムによって計算された蛍光φ^ｍｅａｓにおけるクロストーク効果を修正できるように、取得された流路のデジタル蛍光画像を処理するためのコンピュータ命令及びパラメータは、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）システムのメモリ内に保存される。次いで、修正された蛍光φ^ｓｐｅｃは、検査される試料内の群及びバイオマーカーの濃度［ｂ］について蛍光φ^ｐｏｐの合計値を計算するのに使用される。

特に、カートリッジ２０の流路２２内の１組の微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1,2,…,l}}について、特定の微粒子μＰ_ｉの測定された蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓは、以下に等しい。
φ_ｉ ^ｍｅａｓ＝φ_ｉ ^ｓｐｅ＋φ_ｉ ^{ｃｒｏｓｓ} （１）
ここで、微粒子μＰ_ｉの蛍光φ_ｉ ^ｓｐｅは微粒子μＰ_ｉのみによって生成された蛍光に対応し、φ_ｉ ^{ｃｒｏｓｓ}は、蛍光φ_ｉ ^ｓｐｅに重畳する別の微粒子｛μＰ_ｊ｝_ｊ≠ｉからの蛍光であり、すなわち別の微粒子｛μＰ_ｊ｝_ｊ≠ｉからのクロストーク寄与である。

本発明によれば、クロストーク寄与φ_ｉ ^{ｃｒｏｓｓ}は個別の寄与の和としてモデル化され、それぞれ等方的な減衰プロファイルを有し、すなわち

ここで、α_ｉｊは微粒子μＰ_ｉとμＰ_ｊとの間の距離ｄ_ｉ，ｊ、例えば微粒子の各中心間の距離にのみ依存するｊ番目の蛍光微粒子μＰ_ｊの第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓにおけるユニタリークロストーク蛍光寄与である。

蛍光φ_ｊ ^ｓｐｅはクロストーク効果修正に関して使用できず、これらは、φ_ｊ ^ｓｐｅ＝φ_ｉ ^ｍｅａｓによって近似され、これは以下の関係を与える。

第１の変数において、φ_ｉ ^ｓｐｅは以下に従って計算される。

この変数はクロストーク効果の修正において良好な結果を示すが、より良好な修正は以下の計算によって行われる。

具体的に∀i,α_ｉｉ＝１とし、α_ｉｊを行列Ａに格納することにより、以下を得る。

全ての蛍光φ_ｉ ^ｓｐｅは以下に従って一緒に計算される。

以下により詳細に説明するように、ユニタリークロストーク蛍光寄与α_ｉｊは以下の関係式に従って計算される。

ここで、Ｎは２以上の整数であり、θ_ｎ、ｋ_ｎ、β_ｎはどの粒子についても同一の、コンピューティングユニット３０のメモリ内に保存された所定のパラメータである。

特に、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）システムの微粒子に関して、Ｎ＝３は、α_ｉｊを近似する際に良好な結果を示す。

上記に基づき、本発明の１つの実施形態に従って、コンピューティングユニットは、以下を計算する。
（ａ）取得された流路のデジタル蛍光画像内の各微粒子の中心の位置（例えば円盤形状の微粒子の中心）を計算し、次いで画像内の微粒子の各対（μＰ_ｉ、μＰｊ）について距離（μＰ_ｉ、μＰｊ）を計算する。
（ｂ）関係式（７）に従ってユニタリークロストーク蛍光寄与α_ｉｊを計算する。
（ｃ）関係式（５）に従って行列Ａ及びその逆行列Ａ^−１を計算する。
（ｄ）関係式（６）に従って蛍光φ_ｉ ^ｓｐｅを計算する。

ユニタリークロストーク蛍光寄与の決定を図４から７に関してこれから説明する。第１の段階は、ただ１つの明るい微粒子を含む少なくとも１つの大きな視野を生成する段階を含む。多重化環境及び微粒子の属性のありうる影響を考慮に入れるために、少数の明るい微粒子（例えば完全に明るいビオチン−ＲＰＥ微粒子）、多数の暗い微粒子（例えばＣＯＯＨ微粒子）で二重アッセイを行い、微粒子の明視野画像およびデジタル蛍光画像が取得される。そうすることによって、クロストークの減衰プロファイルが、明るい孤立した微粒子の周囲のＣＯＯＨ微粒子に対応する画像の画素（「画素」）で測定可能である。明るい微粒子は、最も近い明るい微粒子が少なくとも１０００画素離れていれば孤立していると考えられる。さらに、計算の精度を向上させるために、最小の蛍光φ^ｍｅａｓを有し、その表面における蛍光の均質な分布を有する（例えば、明るい微粒子の画素の変動の係数に従う）明るい微粒子のみが保持される。暗い微粒子によって取り囲まれた孤立した明るい微粒子の蛍光画像は、図４Ａに示されている。図４Ｂは、ＣＯＯＨ微粒子を示すために処理後の多重露光で同じ画像を示す。

第２の段階において、明るい微粒子の中心からの距離における画素への影響を測定するために、ｄとｄ＋ｐ（ｐは所定のステップ、例えば１に等しい）の間の距離における暗い微粒子に対応する全ての画素がビンにまとめてプールされ、それらの平均蛍光及び明るい微粒子の中心までの平均距離が計算される。暗い微粒子の画素は明視野画像で選択される。

図５において、計算された平均蛍光が、計算された平均距離に対してプロットされる。プロットの各点は、１つの孤立した明るい微粒子からの所定の距離における画素の平均蛍光に対応する。ｘ軸の右側のプラトーは、半径が黒い垂直線で示されている明るい微粒子に対応する。そのため、この直線の後の蛍光は、明るい微粒子を取り囲む蛍光のハローに対応し、ハローは蛍光減衰プロファイルを有する。

プロファイルを異なる条件の間で比較可能にするために、相対蛍光が、ビンの平均蛍光を明るい微粒子の蛍光で割ることによって計算される。図６は、図５の１つに対応する相対蛍光減衰プロファイルを示している。図６のＹ軸の値は、明るい微粒子の中心からの所定の距離においてクロストークする明るい微粒子の蛍光の比率として解釈可能である。

相対蛍光減衰プロファイルの決定は、潜在的な変動の原因を評価することができるように、異なる露光時間、異なるバッファ、機器及び微粒子についてなされたものである。この研究から、減衰プロファイルは、明るい微粒子の蛍光並びに使用されるバッファ及び露光条件とは実質的に独立していることが分かる。

さらなる段階において、選択されたモデルが相対蛍光減衰プロファイルにフィットされる。より具体的には、関係式（７）の指数の和がモデルとして選択され、具体的には３つの指数の和である。このモデルは、柔軟である一方で、相対的なクロストーク蛍光と明るい微粒子の中心からの距離との間の解析的な表現を依然として提供する。相対的な蛍光減衰のプロファイルは、３つの指数の和で近似するのが困難でありうる複雑な形状を有する（０から約５０画素のプラトー及び最大８５の鋭い勾配）。したがって、モデルの近似の良好さを改善するために、鋭い勾配のデータは取り除かれる。これは、鋭い勾配に対応する距離は他のいかなる微粒子でも満たされていないという事実から正しい。例えば、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）システムでは、微粒子の半径はおよそ５６画素であり、そのため、２つの微粒子の間の最小距離は８５画素より小さいとは考えられない。そのため、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（登録商標）でデータを近似するために使用されるモデルは以下のようにあらわされる。

図７は、近似されたモデルに対応する赤い曲線とともに、図６の相対蛍光減衰の詳細を示している。任意の適切なモデルが使用されうることは明らかである。

クロストーク効果修正の例が、図８から１２に関して示されている。この例は、二重アッセイに対応し、そのため２種類の微粒子または群に対応し、第１の群の微粒子（ビオチン−ＲＰＥ微粒子）は第２の群の微粒子（ＣＯＯＨ微粒子）と比較して非常に明るい。２つの群を受容する流路の明視野画像は図８Ａに示されている。図８Ｂに示されるように、標準的な画像取得条件（例えば励起出力１０ｍＷ、画像取得の露出４０ｍｓ）について、明るい微粒子の群蛍光は１１２Ａ．Ｕ．（任意の単位）に等しい。図８Ｂを詳細に観察すると、ビオチン−ＲＰＥ微粒子は明りょうであり、それらを取り囲む光のハローは存在しないため、クロストーク現象が生じることを理解することは難しい。しかし、蛍光画像８Ｂのコントラストを最大まで増加させることによって（例えば、画像が８ビットで符号化され、元の蛍光の各画素が値２５５以上に設定され、もともと０であった画素は０に維持される）、クロストーク効果は明らかになる（図８Ｃ）。図８Ａと図８Ｃを重ね合わせると（図４Ｄ）、ビオチン−ＲＰＥ微粒子のハローがＣＯＯＨ微粒子までオーバーフローしていることが分かる。図９は、図９の左上に示されるように、２５０画素の半径の円内に属するＣＯＯＨ微粒子の測定された蛍光φ_ＣＯＯＨ ^ｍｅａｓに基づいて計算されたＣＯＯＨ群の合計蛍光φ_ＣＯＯＨ ^ｐｏｐを示している。合計蛍光φ_ＣＯＯＨ ^ｐｏｐは本明細書では円内のビオチン−ＲＰＥ微粒子の数の関数で示されている。ＣＯＯＨ群の蛍光φ_ＣＯＯＨ ^ｐｏｐは、ビオチン−ＲＰＥ微粒子の数と正の相関を有し、これはクロストーク現象を示している。

具体的には、クロストーク効果は、同一の取得条件における単一アッセイのＣＯＯＨ微粒子の群蛍光（０．０７Ａ．Ｕ．）に対応する水平の破線によって示されるように、φ_ＣＯＯＨ ^ｐｏｐ値の増加という結果をもたらす。例えば、１つのビオチン−ＲＰＥ微粒子でＣＯＯＨ群の群蛍光φ_ＣＯＯＨ ^ｐｏｐは０．４４Ａ．Ｕ．に等しく、すなわち、単一の値の６倍増加している。この群蛍光の、多重アッセイにおける別の群の蛍光への依存性は、アッセイ精度に対して有害であり、偽陽性の結果を顕著にもたらしうる。例えば、サイトカインアッセイにおいて、ＩＮＦ−ｇについて０．０７Ａ．Ｕ．の群蛍光は、ブランク蛍光に対して顕著に高いわけではないと考えられ、そのため陰性であるとされる。しかし、０．４４Ａ．Ｕ．の群蛍光は、検出限界よりも十分高く、１０．３ｐｇ／ｍｌの推定濃度に対応する。図１０は、ＩＦＮ−ｇ実験において蛍光が６倍増加したことの外挿及び、群蛍光φ_ＣＯＯＨ ^ｐｏｐをＩＮＦ−ｇ濃度に変換するのに使用される較正曲線を用いた推定濃度に対する影響を示している。

本発明に従うクロストーク効果修正の適用後、ＣＯＯＨ微粒子で測定された蛍光は同じ視野内に存在する明るい微粒子の蛍光によって影響を受けるべきではない。この独立性を検証することができるように、多重アッセイにおけるＣＯＯＨ微粒子の群蛍光は、参照値と比較される。参照値は、同じ実験条件下で単一アッセイで測定されたＣＯＯＨの対応する群蛍光である。

単一アッセイ及び多重アッセイにおけるＣＯＯＨの比較に使用される統計は、以下の比である。

もしＣＯＯＨ微粒子の信号強度が明るい微粒子の存在によって影響を受けないのであれば、比ρは１に等しくなるべきである。蛍光とＣＯＯＨ微粒子との間のクロストークの場合、比はそれより大きくなると予測される。比ρは、クロストーク修正によって導入される多重性レベルに対する信号の堅牢性の改善を評価するために、クロストーク修正前後で計算されなければならない。

図１１及び１２は、それぞれクロストーク効果修正前後のＣＯＯＨ微粒子で測定された蛍光を示している。図の左側の第１の２つの箱ひげ図は、単一アッセイにおける蛍光の値を表している。右側の箱ひげ図は、様々な二重条件（明るい微粒子／ＣＯＯＨ微粒子の様々な比）におけるＣＯＯＨ蛍光値を示している。ｘ軸におけるラベルは、流路内の明るい微粒子のおよそのパーセンテージの情報を含み、明るい微粒子のコードの種類は二重アッセイで表される（ビオチン−ＲＰＥと１００％結合された微粒子では２７６であり、ビオチン−ＲＰＥと５００％結合された微粒子は４３６である）。

図１１から、修正されていないＣＯＯＨ蛍光は流路内の明るい微粒子のパーセンテージと強い相関を示すことが観察される。微粒子の８０％が１００％−ビオチンＲＰＥである、流路内のＣＯＯＨの群蛍光は、単一流路内の群の値よりも４０倍以上高い。図１２から分かるように、相関はクロストーク修正アルゴリズムの適用後は顕著に低減される。例えば８０％の明るい微粒子を有する流路についての比は、それぞれ０．８７及び１．７１に低減される。定性的には、他の実験条件（露光時間、バッファの種類及び焦点から外れた構成）についての箱ひげ図も同じ挙動を示す。

１０ 微粒子
１２ １０進バイナリーコード
１４ 穴
２０ カートリッジ
２２ 流路
２４ 流入ウェル
２６ 流出ウェル
３０ コンピューティングユニット
３２ 微粒子
３４ バイオマーカー
３６ 捕捉分子
３８ 明視野画像
４０ 蛍光画像

Claims (18)

1. 多重分析の１組の蛍光標識されたＩ個の微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の蛍光値｛φ^ｓｐｅ _ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}を決定するための方法であって、前記微粒子が単層配列であって、前記方法が、
   前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}のデジタル蛍光画像を取得する段階と、
   前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}における各蛍光標識された微粒子μＰ_ｉについて、前記蛍光標識された微粒子μＰ_ｉに対応する取得画像の画素のみに基づいて蛍光値φ_ｉ ^ｍｅａｓを計算する段階と、を含み、
   前記方法が、クロストーク蛍光寄与φ_ｉ ^{ｃｒｏｓｓ}によって第１の蛍光値φ_ｉ ^ｍｅａｓを修正することによって、前記蛍光標識された微粒子μＰ_ｉの蛍光値φ_ｉ ^ｓｐｅを計算する段階を含み、
   前記クロストーク蛍光寄与φ_ｉ ^{ｃｒｏｓｓ}が、前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}における他の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｊ｝_ｊ≠ｉから前記第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓにおける個々の寄与の和としてモデル化されたことを特徴とする、方法。
2. 前記蛍光値φ_ｉ ^ｓｐｅの計算が、
   前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}における各蛍光標識された微粒子μＰ_ｉに関して前記デジタル蛍光画像内の位置Ｘ_ｉを計算する段階と、
   全ての蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の位置｛Ｘ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}及び蛍光値｛φ_ｉ ^ｓｐｅ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の関数として、前記第１の蛍光値φ_ｉ ^ｍｅａｓをモデル化する段階と、
   前記蛍光値φ_ｉ ^ｓｐｅを得るために前記関数の逆関数を計算する段階と、を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記蛍光φ_ｉ ^ｓｐｅを計算する段階が、以下の関係式に基づいて実行され、
   φ_ｊ ^ｓｐｅがｊ番目の蛍光標識された微粒子μＰ_ｊの蛍光であり、
   α_ｉｊが、前記ｊ番目の蛍光標識された微粒子μＰ_ｊの前記第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓにおけるユニタリークロストーク蛍光寄与であり、前記ユニタリークロストーク蛍光寄与α_ｉｊが、前記蛍光標識された微粒子μＰ_ｉとμＰ_ｊとの間の距離ｄ_ｉ，ｊのみに依存することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記方法が、
   前記デジタル蛍光画像内のｉ番目の蛍光標識された微粒子とｊ番目の蛍光標識された微粒子との間の前記距離ｄ_ｉ，ｊを計算する段階と、
   前記１組の蛍光標識されたＩ個の微粒子における標識された微粒子（μＰ_ｉ、μＰ_ｊ）の各対について、前記距離ｄ_ｉ，ｊに基づいて前記対（μＰ_ｉ、μＰ_ｊ）の前記ユニタリークロストーク蛍光寄与α_ｉｊを計算する段階と、
   以下の関係式
   に基づいて、前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の蛍光｛φ_ｉ ^ｓｐｅ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}を計算する段階と、を含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 前記ｉ番目の蛍光標識された微粒子の前記第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓにおけるｊ番目の蛍光標識された微粒子のユニタリークロストーク蛍光が、以下の関係式
   に基づいて計算され、Ｎが２以上の整数であり、θ_ｎ、ｋ_ｎ及びβ_ｎが所定のパラメータであることを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
6. 前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の各蛍光標識された微粒子μＰ_ｉが、１組の異なる固有のＭ個の識別部｛ｉｄ_ｍ｝_{ｍ∈{1, 2,…, M}}の識別部Ｉｄ_ｍ（ｉ）を含み、前記識別部Ｉｄ_Ｍ（ｉ）が、前記蛍光標識された微粒子μＰ_ｉのデジタル画像の処理を通して可読であり、
   前記方法がさらに、
   前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}のデジタル画像を取得する段階と、
   前記デジタル画像内の各標識された微粒子μＰ_ｉの識別部Ｉｄ_ｍ（ｉ）を読み取る段階と、
   前記１組のＭ個の異なる固有の識別部｛ｉｄ_ｍ｝_{ｍ∈{1, 2,…, M}}の各識別部Ｉｄ_ｍについて、前記識別部を含む前記蛍光標識された微粒子の蛍光φ_ｉ ^ｓｐｅに基づいて合計蛍光φ_ｍ ^ａｇを計算する段階と、を含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の各蛍光標識された微粒子μＰ_ｉが、前記蛍光標識された微粒子μＰ_ｉの前記識別部Ｉｄ_ｍ（ｉ）に固有に関連した蛍光複合体で被覆された表面を含み、前記複合体が、前記標識された微粒子に固定された第１の非蛍光分子と、前記第１の非蛍光分子に結合された第２の蛍光分子と、を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 前記標識された微粒子が等しい寸法を有することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 前記方法が、
   前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の前記デジタル蛍光画像を取得する前に、
   流路内に前記第１の非蛍光分子に結合された第２の蛍光分子を有しない前記微粒子を配置して、前記微粒子を単一層に配列させる段階と、
   前記流路を液体試料で満たす段階と、
   前記合計蛍光φ_ｍ ^ａｇに基づいて、前記試料内の第２の蛍光分子の濃度を計算する段階と、を含むことを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
10. １組のＩ個の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の蛍光｛φ_ｉ ^ｓｐｅ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}を決定するためのシステムであって、
    前記１組のＩ個の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}を単一層配列で受容するための少なくとも１つの流路と、
    前記流路内の前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の単一層配列のデジタル蛍光画像を取得するための取得ユニットと、
    取得された前記デジタル蛍光画像に基づいて、前記蛍光｛φ_ｉ ^ｓｐｅ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}を計算するためのコンピューティングユニットであって、前記コンピューティングユニットが、前記蛍光標識された微粒子μＰ_ｉに対応する取得されたデジタル蛍光画像の画素のみに基づいて第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓを計算する、コンピューティングユニットと、を含み、
    前記コンピューティングユニットが、前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の各蛍光標識された微粒子μＰ_ｉについて、
    クロストーク蛍光寄与φ_ｉ ^{ｃｒｏｓｓ}であって、前記クロストーク蛍光寄与φ_ｉ ^{ｃｒｏｓｓ}が、前記蛍光標識された微粒子μＰ_ｉの第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓにおける、前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の他の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｊ｝_ｊ≠ｉからの個別の寄与の合計としてモデル化され、計算が前記別の微粒子の第１の蛍光｛φ_ｉ ^ｍｅａｓ｝_ｊ≠ｉに基づく、クロストーク蛍光寄与φ_ｉ ^{ｃｒｏｓｓ}と、
    前記クロストーク蛍光寄与φ_ｉ ^{ｃｒｏｓｓ}を用いて前記第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓを修正することによる前記蛍光標識された微粒子μＰ_ｉの蛍光φ_ｉ ^ｓｐｅと、を計算することを特徴とする、システム。
11. 前記コンピューティングユニットが、
    前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の各蛍光標識された微粒子μＰ_ｉについて前記デジタル蛍光画像内の位置Ｘ_ｉを計算し、
    全ての蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の位置｛Ｘ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}及び蛍光値｛φ_ｉ ^ｓｐｅ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の関数として前記第１の蛍光値φ_ｉ ^ｍｅａｓをモデル化し、
    前記蛍光値φ_ｉ ^ｓｐｅを得るために前記関数の逆関数を計算することによって、前記蛍光値φ_ｉ ^ｓｐｅを計算することを特徴とする、請求項１０に記載のシステム。
12. 前記コンピューティングユニットが、以下の関係式
    に基づいて前記蛍光φ_ｉ ^ｓｐｅを計算し、
    φ_ｊ ^ｓｐｅがｊ番目の蛍光標識された微粒子μＰ_ｊの蛍光であり、α_ｉｊがｊ番目の前記蛍光標識された微粒子μＰ_ｊの前記第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓにおけるユニタリークロストーク蛍光寄与であり、前記ユニタリークロストーク蛍光寄与α_ｉｊが、前記蛍光標識された微粒子μＰ_ｉとμＰ_ｊとの間の距離ｄ_ｉ，ｊのみに依存することを特徴とする、請求項１０または１１に記載のシステム。
13. 前記コンピューティングユニットが、
    前記デジタル蛍光画像におけるｉ番目の蛍光標識された微粒子とｊ番目の蛍光標識された微粒子との間の前記距離ｄ_ｉ，ｊを計算し、
    前記１組のＩ個の蛍光標識された微粒子の標識された微粒子（μＰ_ｉ、μＰ_ｊ）の各対について、前記距離ｄ_ｉ，ｊに基づいて前記対（μＰ_ｉ、μＰ_ｊ）の前記ユニタリークロストーク蛍光寄与α_ｉｊを計算し、
    以下の関係式
    に基づいて前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の蛍光｛φ_ｉ ^ｓｐｅ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}を計算することを特徴とする、請求項１２に記載のシステム。
14. 前記ｉ番目の蛍光標識された微粒子の前記第１の蛍光φ_ｉ ^ｍｅａｓにおける前記ｊ番目の微粒子の前記ユニタリークロストーク蛍光が、以下の関係式
    に基づいて計算され、
    Ｎが２以上の整数であり、θ_ｎ、ｋ_ｎ及びβ_ｎが所定のパラメータであることを特徴とする、請求項１３に記載のシステム。
15. 前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の各蛍光標識された微粒子μＰ_ｉが、１組のＭ個の異なる固有の識別部｛ｉｄ_ｍ｝_{ｍ∈{1, 2,…, Ｍ}}の識別部Ｉｄ_ｍ（ｉ）を含み、前記識別部Ｉｄ_Ｍ（ｉ）が、前記蛍光標識された微粒子μＰ_ｉのデジタル画像の処理を通して読み取り可能であり、
    前記コンピューティングユニットが、
    前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}のデジタル画像を取得し、
    前記デジタル画像の各標識された微粒子μＰ_ｉの前記識別部Ｉｄ_ｍ（ｉ）を読み取り、
    前記１組のＭ個の異なる固有の識別部｛ｉｄ_ｍ｝_{ｍ∈{1, 2,…, Ｍ}}の各識別部Ｉｄ_ｍ（ｉ）について、前記識別部を含む前記蛍光標識された微粒子の蛍光φ_ｉ ^ｓｐｅに基づいて、合計蛍光φ_ｍ ^ａｇを計算することを特徴とする、請求項１０から１４のいずれか一項に記載のシステム。
16. 前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の各蛍光標識された微粒子μＰ_ｉが、前記蛍光標識された微粒子μＰ_ｉの前記識別部Ｉｄ_ｍ（ｉ）に固有に関連する蛍光複合体で被覆された表面を含み、前記複合体が、前記標識された微粒子に固定された第１の非蛍光分子と、前記第１の非蛍光分子に結合された第２の蛍光分子と、を含むことを特徴とする、請求項１５に記載のシステム。
17. 前記標識された微粒子が等しい寸法を有することを特徴とする、請求項１６に記載のシステム。
18. 前記システムが、少なくとも１つの流路と、
    前記１組の蛍光標識された微粒子｛μＰ_ｉ｝_{ｉ∈{1, 2,…, I}}の前記デジタル蛍光画像を取得する前に、
    前記流路内に、前記第１の非蛍光分子に結合された第２の蛍光分子を有しない前記標識された微粒子を配置し、前記標識された微粒子を単一層に配列し、
    前記流路を液体試料で満たすための手段と、を含み、
    前記コンピューティングユニットが、前記合計蛍光φ_ｍ ^ａｇに基づいて前記試料内の第２の蛍光分子の濃度を計算することを特徴とする、請求項１６または１７に記載のシステム。