JP2018527939A - 抗ヒトｃｄ１３７の完全ヒト抗体及びその用途 - Google Patents

抗ヒトｃｄ１３７の完全ヒト抗体及びその用途 Download PDF

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Abstract

本発明により、ＣＤ１３７に特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合部分が開示される。一方では、該抗体のＣＤＲ／可変領域の配列及びそのコードする核酸配列が提供され、他方では、該抗体又はその抗原結合部分を用いた疾患治療方法が提供される。【選択図】図１１

Description

本発明は、完全ヒト抗体に関する。具体的には、本発明は、抗ヒトＣＤ１３７の完全ヒト抗体及びその用途に関する。
ＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９等とも称する）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであり、Ｉ型膜貫通タンパク質に属している。ヒトのＣＤ１３７は、２５５個のアミノ酸を有するサイズが３０ＫＤのタンパク質（Ｕｎｉｐｏｒｔ：Ｑ０７０１１）であり、一般に、５５ＫＤのホモダイマーの形態で細胞膜に発現し、リガンドの誘導により三量化して細胞内シグナル伝達が開始される。ＣＤ１３７Ｌは、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーであり、ＩＩ型膜貫通タンパク質に属している。
従来の研究結果により、ＣＤ１３７Ｌは主に、例えば樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ（macrophage）及びＢ細胞のような活性化されたＡＰＣに発現し（非特許文献１）、一方、ＣＤ１３７は、抗原に特異的なシグナルを受けてからＴ細胞において発現が誘導される（非特許文献２）ことが明らかになっている。
Ｔ細胞におけるＣＤ１３７の機能は、既に十分に証明されている。一定量のＣＤ３抗体の存在下では、ＣＤ１３７シグナルの開始によりＴ細胞の増殖とサイトカインの合成（主にＩＦＮ−γ）とが誘導され、活性化したＴ細胞のアポトーシスが阻害され、Ｔ細胞の寿命を延ばすことができる（非特許文献３、非特許文献４）。従来の研究から、ＣＤ１３７アゴニスト（Agonist）ｍＡｂにより多くのマウス腫瘍モデルにおいてＴリンパ球の殺傷能が増大し、抗腫瘍効果がもたらされることが明らかになっている（非特許文献５）。また、既に認可された癌治療方法をＣＤ１３７アゴニストｍＡｂと併用すると、興味深い結果が得られた。SHI他（非特許文献６）の研究結果から、ＣＤ１３７アゴニストｍＡｂを放射線治療と併用すると大きな腫瘍の増殖が有意に阻害され得ることが明らかになっている。
したがって、腫瘍免疫治療におけるＣＤ１３７の作用に基づき、アゴニスト作用を有する抗ヒトＣＤ１３７抗体を癌、腫瘍、感染症及び自己免疫疾患等のヒトの疾患の治療及び予防に用いることが求められている。
Pollok、K.E.他、1994, Eur.J.Immunol. 24:367-74 Kwon、B.S.他、1989, PNAS 86:1963-67 D.Laderach他、2002, Int.mmunol., 14(10):1155-67 Croft他、2009, Nat Rev Immuno l19:271-285 Melero,I.他、1997, Nat.Med., 3:682-85 Shi.W.他、2006, Anticancer Res., 26:3445-53
本発明により、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ＣＤ１３７に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、
前記重鎖可変領域が、配列番号５で示されるＣＤＲ１と、配列番号６で示されるＣＤＲ２と、配列番号７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
前記軽鎖可変領域が、配列番号１０で示されるＣＤＲ１と、配列番号１１で示されるＣＤＲ２と、配列番号１２で示されるＣＤＲ３とを含むか、
前記重鎖可変領域が、配列番号１５で示されるＣＤＲ１と、配列番号１６で示されるＣＤＲ２と、配列番号１７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるＣＤＲ１と、配列番号２１で示されるＣＤＲ２と、配列番号２２で示されるＣＤＲ３とを含むか、
前記重鎖可変領域が、配列番号１５で示されるＣＤＲ１と、配列番号２９で示されるＣＤＲ２と、配列番号１７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるＣＤＲ１と、配列番号２１で示されるＣＤＲ２と、配列番号２２で示されるＣＤＲ３とを含むか、
前記重鎖可変領域が、配列番号３２で示されるＣＤＲ１と、配列番号１６で示されるＣＤＲ２と、配列番号１７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるＣＤＲ１と、配列番号２１で示されるＣＤＲ２と、配列番号２２で示されるＣＤＲ３とを含むか、
前記重鎖可変領域が、配列番号１５で示されるＣＤＲ１と、配列番号１６で示されるＣＤＲ２と、配列番号１７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるＣＤＲ１と、配列番号３５で示されるＣＤＲ２と、配列番号２２で示されるＣＤＲ３とを含むか、
前記重鎖可変領域が、配列番号１５で示されるＣＤＲ１と、配列番号１６で示されるＣＤＲ２と、配列番号１７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるＣＤＲ１と、配列番号２１で示されるＣＤＲ２と、配列番号３８で示されるＣＤＲ３とを含むか、
前記重鎖可変領域が、配列番号１５で示されるＣＤＲ１と、配列番号１６で示されるＣＤＲ２と、配列番号１７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるＣＤＲ１と、配列番号２１で示されるＣＤＲ２と、配列番号４１で示されるＣＤＲ３とを含むか、又は、
前記重鎖可変領域が、配列番号１５で示されるＣＤＲ１と、配列番号１６で示されるＣＤＲ２と、配列番号１７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるＣＤＲ１と、配列番号３５で示されるＣＤＲ２と、配列番号４１で示されるＣＤＲ３とを含む、抗体又はその抗原結合部分が提供される。
本発明の一態様では、本発明により、
重鎖が、配列番号４で示される可変領域を含むと共に、
軽鎖が、配列番号９で示される可変領域を含むか、
重鎖が、配列番号１４で示される可変領域を含むと共に、
軽鎖が、配列番号１９で示される可変領域を含むか、
重鎖が、配列番号２８で示される可変領域を含むと共に、
軽鎖が、配列番号１９で示される可変領域を含むか、
重鎖が、配列番号３１で示される可変領域を含むと共に、
軽鎖が、配列番号１９で示される可変領域を含むか、
重鎖が、配列番号１４で示される可変領域を含むと共に、
軽鎖が、配列番号３４で示される可変領域を含むか、
重鎖が、配列番号１４で示される可変領域を含むと共に、
軽鎖が、配列番号３７で示される可変領域を含むか、
重鎖が、配列番号１４で示される可変領域を含むと共に、
軽鎖が、配列番号４０で示される可変領域を含むか、又は、
重鎖が、配列番号１４で示される可変領域を含むと共に、
軽鎖が、配列番号４３で示される可変領域を含む、ＣＤ１３７に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合部分が提供される。
本発明の更なる態様では、本発明により、完全抗体、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖである、ＣＤ１３７に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合部分が提供される。
本発明の別の態様では、本発明により、ＶＨ、ＶＬ及びＣ−ペプチドを含む一本鎖抗体であって、前記ＶＨの配列が配列番号４であり、前記ＶＬの配列が配列番号９であり、前記Ｃ−ペプチドの配列が配列番号１であることを特徴とする、一本鎖抗体が提供される。
本発明の更なる態様では、本発明により、ＶＨ、ＶＬ及びＣ−ペプチドを含む一本鎖抗体であって、前記ＶＨの配列が配列番号１４であり、前記ＶＬの配列が配列番号２３であり、前記Ｃ−ペプチドの配列が配列番号１であることを特徴とする、一本鎖抗体が提供される。
本発明の別の態様では、本発明により、
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合部分と、
医薬担体と、
を含む、医薬組成物が提供される。
本発明の更なる態様では、本発明により、被験者の癌の治療方法であって、前記被験者に治療有効量の前記モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を投与することを含む、方法が提供される。
本発明の更なる態様では、本発明により、被験者の癌の併用治療方法であって、前記被験者に治療有効量の前記モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を投与することを含み、前記被験者に治療有効量の他の癌治療薬を投与するか、又は他の癌治療方法を用いることを更に含む、方法が提供される。
本発明の具体的な実施形態では、本発明により、被験者の感染症又は自己免疫疾患の治療方法であって、前記被験者に治療有効量の前記モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を投与することを含む、方法が提供される。
本発明の具体的な実施形態では、本発明により、被験者の腫瘍の治療方法であって、前記被験者に治療有効量の前記モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を投与することを含む、方法が提供される。
本発明の具体的な実施形態では、本発明により、被験者の感染症又は自己免疫疾患の併用治療方法であって、前記被験者に治療有効量の前記モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を投与することを含み、前記被験者に治療有効量の他の感染症若しくは自己免疫疾患の治療薬を投与するか、又は他の感染症若しくは自己免疫疾患の治療方法を用いることを更に含む、方法が提供される。
本発明の具体的な実施形態では、本発明により、被験者の腫瘍の併用治療方法であって、前記被験者に治療有効量の前記モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を投与することを含み、前記被験者に治療有効量の他の腫瘍治療薬を投与するか、又は他の腫瘍治療方法を用いることを更に含む、方法が提供される。
本発明の前記他の癌治療方法又は前記他の腫瘍治療方法には、放射線治療又は既に認可された他の癌治療方法若しくは他の腫瘍治療方法が含まれる。
本発明により、配列番号４、配列番号１４、配列番号２８、配列番号３１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は相同性が９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが更に提供される。具体的には、配列番号８、配列番号１８、配列番号３０、配列番号３３のヌクレオチド配列、又は相同性が９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド配列が含まれる。
本発明により、配列番号９、配列番号１９、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は相同性が９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドが更に提供される。具体的には、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４のヌクレオチド配列、又は相同性が９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド配列が含まれる。
本発明には、ヒトＣＤ１３７タンパク質に結合可能な、完全にヒト由来の、親和性が大幅に向上した抗体が、酵母表面ディスプレイ技術によって得られる点で有益な効果がある。
以下、図面を参照しながら本発明を更に詳細に説明する。後述の詳細な記載から、本発明の上述した態様及び本発明の他の態様が明らかになる。
精製された抗ｈＣＤ１３７ｓｃＦｖのｈＣＤ１３７−ＥＧＦＰ細胞に対する結合結果を示す図である。なお、Ｘ軸はＥＧＦＰの蛍光強度を示し、Ｙ軸は抗ｈＩｇ−ＰＥの蛍光強度を示している。 精製された抗ｈＣＤ１３７ｓｃＦｖのｈＣＤ１３７−ＥＧＦＰ細胞に対する特異的結合の結果を示す図である。なお、Ｘ軸はＥＧＦＰの蛍光強度を示し、Ｙ軸は抗ｈＩｇ−ＰＥの蛍光強度を示している。 抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖとｈＣＤ１３７タンパク質との結合能の検出を示す図である。 Ｃ２ｓｃＦｖ及びＣ１４ｓｃＦｖのアゴニスト活性の測定結果を示す図である。 親和性成熟後にＣＤ１３７タンパク質を用いて酵母染色した結果を示す図である。 精製された抗ｈＣＤ１３７Ｃ１４＃ｍＡｂのｈＣＤ１３７−ＥＧＦＰ細胞に対する特異的結合の結果を示す図である。なお、Ｘ軸はＥＧＦＰの蛍光強度を示し、Ｙ軸は抗ｈＩｇ−ＰＥの蛍光強度を示している。 抗ｈＣＤ１３７抗体とｈＣＤ１３７との結合能を示す図である。 抗ＣＤ１３７抗体とアカゲザルＣＤ１３７との結合能を示す図である。 抗ＣＤ１３７抗体とｈＣＤ１３７Ｌとが競合したｈＣＤ１３７への結合の結果を示す図である。 抗ＣＤ１３７Ｃ１４＃ｍＡｂによりＰＢＭＣ又はＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激したＩＦＮ−γ分泌能の検出を示す図である。 抗ＣＤ１３７Ｃ１４＃ｍＡｂにより腫瘍の増殖が有意に阻害された実験結果を示す図である。 抗ＣＤ１３７Ｃ１４＃ｍＡｂの加速安定性試験の結果を示す図である。 ＤＳＣ方法による抗ＣＤ１３７Ｃ１４＃ｍＡｂの熱安定性の検出結果を示す図である。
配列の説明
本発明に係る配列は、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を含んでおり、配列表として整理して明細書の後に添付されている。また、発明者は、配列表のコンピューター可読形式ファイルも提出している。
本発明は、本文に記載された特定の方法論、手段、抗体、又は細胞株に限定されるものではない。なぜなら、それらは或る程度変更し得るからである。また、本文で用いられる用語は、特定の実施形態を記載するために用いられているにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
ここでは、別の定義がない限り、全ての技術及び科学技術的用語、並びにいずれの略称も、当業者が通常理解する意味と同じ意味を有している。本発明の実施においては本文に記載されたそれらの方法及び材料と近似又は均等な方法及び材料を用いることができるが、ここでは、例証的な方法、機器及び材料が記載されている。
特に断らない限り、本発明の用語は、当該分野で通常用いられる意味を有している。
本発明において、「抗体」という用語は、特定のエピトープに結合するいずれかの免疫グロブリン又は完全分子及びそのフラグメントを指す。上記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、及び完全抗体のフラグメント及び／又は一部を含むが、これらに限定されるものではなく、これらのフラグメント又は一部が親抗体の抗原結合能を維持するものであればよい。例えば、本発明では、「抗ヒトＣＤ１３７抗体」とは、ヒトＣＤ１３７又はその機能的変異体若しくは機能的フラグメントに特異的に結合可能なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、及び免疫活性を有するそれらのフラグメント又は一部を指す。
本発明において、「抗体の位置」という用語は、ウェブサイトhttp://www.bioinf.org.uk/abysis/index.htmlにおける比較に基づいて得られるものであり、配列におけるアミノ酸の実際の位置付けを指しているわけではない。
本発明において、「結合」又は「特異的結合」という用語は、精製された野生型抗原を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ測定法における、好ましくはプラズモン共鳴法（ＢＩＡｃｏｒｅ、GE-Healthcare、ウプサラ、スウェーデン）における、抗原のエピトープに対する抗体の結合を指す。
本発明において、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された可変領域及び定常領域を有し、単一結合特異性を示す抗体を指す。
実施例１．組換えヒトＣＤ１３７の発現及び関連するＥＧＦＰ細胞の調製
タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるヒトＣＤ１３７のアミノ酸配列（Ｑ０７０１１）に基づいて、ヒトＣＤ１３７の細胞外ドメインのアミノ酸配列（すなわち、Ｑ０７０１１における１位の残基〜１８６位の残基）を取得した。タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるアカゲザルＣＤ１３７（ＲｈＣＤ１３７）のアミノ酸配列（Ｆ６Ｗ５Ｇ６）に基づいて、サルＣＤ１３７の細胞外ドメインのアミノ酸配列（すなわち、Ｆ６Ｗ５Ｇ６における１位の残基〜１８６位の残基）を取得した。タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ（γ）１（ＩｇＧ１）の定常領域のアミノ酸配列（Ｐ０１８５７）に基づいて、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃの結合領域のアミノ酸配列（すなわち、Ｐ０１８５７における１０４位の残基〜３３０位の残基）を取得した。タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるマウス免疫グロブリンｇａｍｍａ（γ）１（ＩｇＧ１）の定常領域のアミノ酸配列（Ｐ０１８６８）に基づいて、マウスＩｇＧ１−Ｆｃ（ｍｕＦｃ）の結合領域のアミノ酸配列（すなわち、Ｐ０１８６８における９８位の残基〜３２４位の残基）を取得した。オンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて、対応するコーディングＤＮＡ配列を設計してｈＣＤ１３７−Ｆｃ、ｈＣＤ１３７−ｍｕＦｃ及びＲｈＣＤ１３７−ｍｕＦｃの融合タンパク質の遺伝子を取得した。タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおける情報に基づいて、高感度緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰのアミノ酸配列（Ｃ５ＭＫＹ７）、ヒトＣＤ１３７のアミノ酸配列（Ｑ０７０１１）、マウスＣＤ１３７のアミノ酸配列（Ｐ２０３３４）、ヒトＣＤ１３７Ｌのアミノ酸配列（Ｐ４１２７４）、ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列（Ｐ４３４８９）、ヒトＧＩＴＲのアミノ酸配列（Ｑ９Ｙ５Ｕ５）、ヒトＣＤ２７のアミノ酸配列（Ｐ２６８４２）を取得し、オンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて、対応するコーディングＤＮＡ配列を設計して上記の配列とＥＧＦＰとの融合タンパク質の遺伝子を取得した。これには、ｈＣＤ１３７−ＥＧＦＰ、ｈＣＤ１３７Ｌ−ＥＧＦＰ、ｍＣＤ１３７−ＥＧＦＰ、ｈＯＸ４０−ＥＧＦＰ、ｈＣＤ２７−ＥＧＦＰ及びｈＧＩＴＲ−ＥＧＦＰの遺伝子が含まれる。人工合成の手法によってそれらのＤＮＡ断片を取得した。合成された遺伝子の配列は、それぞれFermentas社のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩのダブルダイジェストによって市販のベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（Invitrogen、Ｖ８６３−２０）にサブクローニングし、プラスミド構築の正確性をシークエンシングして検証し、組換えプラスミドＤＮＡ、すなわち、ｐｃＤＮＡ４−ｈＣＤ１３７−ｈＦｃ、ｐｃＤＮＡ４−ｈＣＤ１３７−ｍｕＦｃ、ｐｃＤＮＡ４−ＲｈＣＤ１３７−ｍｕＦｃ、ｐｃＤＮＡ４−ｈＯＸ４０−ＥＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ４−ｈＣＤ１３７−ＥＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ４−ｍＣＤ１３７−ＥＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ４−ｈＣＤ１３７Ｌ−ＥＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ４−ｈＣＤ２７−ＥＧＦＰ、及びｐｃＤＮＡ４−ｈＧＩＴＲ−ＥＧＦＰを取得した。
関連するＥＧＦＰ組換えプラスミドをＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションの４８時間後に蛍光活性化シグナルソーター（ＦＡＣＳ）によってｈＯＸ４０、ｈＣＤ１３７、ｍＣＤ１３７、ｈＣＤ２７の発現を確認した。
ｐｃＤＮＡ４−ｈＣＤ１３７−Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ４−ｈＣＤ１３７−ｍｕＦｃ及びｐｃＤＮＡ４−ＲｈＣＤ１３７−ｍｕＦｃをタンパク質産生用のＨＥＫ２９３細胞に一過性トランスフェクションした。組換え発現プラスミドをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地で希釈して形質転換に必要なＰＥＩ（ポリエチレンイミン）溶液に加え、プラスミド／ＰＥＩ混合物をグループ毎にそれぞれ細胞懸濁液に加え、３７℃で静置し、１０％のＣＯ２、９０ｒｐｍで培養した。５日〜６日培養した後に一過性発現培養上清を集め、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーによってｈＣＤ１３７−Ｆｃ、ｈＣＤ１３７−ｍｕＦｃ及びＲｈＣＤ１３７−ｍｕＦｃのタンパク質サンプルを予備精製し、以下の各実施例に用いた。得られたタンパク質サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって一次検出を行い、目的のバンドをはっきりと見ることができた。
実施例２．酵母ディスプレイライブラリーからの抗ｈＣＤ１３７抗体のスクリーニング、クローニング、発現及び同定
ヒトＣＤ１３７を対象とした完全ヒト抗体を酵母ディスプレイ技術によってスクリーニングした。健康な１５０人に由来するＰＢＭＣのＩｇＭ及びＩｇＧのｃＤＮＡにおけるＶＨ及びＶＬ遺伝子をクローニングすることによって、容量５×１０８のｓｃＦＶ酵母ディスプレイライブラリーを構築した（ＶＨとＶＬとの間の結合配列はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣ−ペプチド（配列番号１）である）。１０倍の容量の酵母バンクを回復させ、酵母表面での抗体発現を誘導し、１００ｎＭのビオチン化ｈＣＤ１３７−Ｆｃ抗原を用いて磁気分離の手法によって２回濃縮し、その後、ビオチン化ｈＣＤ１３７を用いてフローサイトメトリー分離によって更に２回濃縮した。得られた酵母コーティングプレートは、単クローンを選択した。単クローン酵母は増殖及び誘導によって発現した後、ビオチン化ｈＣＤ１３７又は対照抗原ｈＯＸ４０を用いて染色、分析し、抗原陽性の酵母／酵母陰性と対照的な酵母を陽性酵母とした。
ＦＡＣＳによって確認された酵母クローンについて酵母コロニーのＰＣＲ及びシークエンシングを行った。ＰＣＲプライマーは配列Ｆ：ＣＧＴＡＧＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＧＡＧＧＡＧＡ（配列番号２）、配列Ｒ：ＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＡＧＣ（配列番号３）とし、シークエンシングプライマーは配列Ｒとした。シークエンシングの結果を得て、ソフトウェアＢｉｏＥｄｉｔを用いて配列を比較分析した。
このようにして得られた一本鎖抗体のｓｃＦｖ遺伝子を上述したヒトＩｇＧ１−Ｆｃ遺伝子と融合させた後、Fermentas社のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩのダブルダイジェストによって市販のベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡにクローニングし、分子クローニングの標準操作通りにクローニングしてプラスミドを小量抽出した。抽出したプラスミドは、ＨＥＫ２９３細胞で一過性発現させ、ｐｒｏｔｅｉｎＡカラムで精製した。
ｈＣＤ１３７−ＥＧＦＰ細胞を０．５％のＰＢＳ−ＢＳＡバッファーに再懸濁し、上述の精製した２μｇの抗ｈＣＤ１３７ｓｃＦｖ抗体を加え、同時に、関連の対照をセットした。陰性対照は、２μｇのｈＩｇＧ１タンパク質とした。二次抗体は、eBioscienceの抗ｈＩｇ−ＰＥとした。染色が終わってからフローサイトメーターで検出した。細胞表面のｈＣＤ１３７抗原に結合可能な抗体をこの手法で同定した。
スクリーニング及び同定によって得られた比較的特性が良い２株の抗体は、それぞれＣ２ｓｃＦｖ及びＣ１４ｓｃＦｖであった。図１に示すように、２株の抗ｈＣＤ１３７抗体はいずれも細胞表面のｈＣＤ１３７と結合することができ、陰性対照は細胞表面のｈＣＤ１３７と結合することができなかった。
Ｃ２ｓｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＶＳＤＹＹＭＮＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＡＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＮＮＳＬＹＬＨＭＤＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＦＣＡＲＶＶＰＡＧＳＧＷＲＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４）
下線部に対応するアミノ酸は、それぞれＣＤＲ１（配列番号５）、ＣＤＲ２（配列番号６）、ＣＤＲ３（配列番号７）である。
その対応する核酸配列
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＴＴＡＧＴＡＧＴＡＧＴＧＣＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＣＡＴＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＡＴＡＴＡＣＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＴＣＧＴＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＣＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号８）
Ｃ２ｓｃＦｖの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＳＶＬＩＱＰＰＳＡＳＧＳＰＧＱＳＶＴＩＳＣＴＧＩＳＳＤＶＧＡＹＤＹＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＶＰＫＬＭＩＹＥＶＳＫＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＤＴＡＳＬＴＶＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＨＡＧＳＮＮＦＹＶＦＧＴＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号９）
下線部に対応するアミノ酸は、それぞれＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）、ＣＤＲ３（配列番号１２）である。
その対応する核酸配列
ＣＡＧＴＣＴＧＴＴＣＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＣＣＧＣＧＴＣＣＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＴＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡＴＣＡＧＣＡＧＴＧＡＣＧＴＴＧＧＴＧＣＴＴＡＴＧＡＣＴＡＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＴＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＧＧＴＣＡＧＴＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＣＴＴＣＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡ（配列番号１３）
Ｃ１４ｓｃＦｖの重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＰＳＶＥＳＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＳＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＰＹＶＬＳＴＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号１４）
下線部に対応するアミノ酸は、それぞれＣＤＲ１（配列番号１５）、ＣＤＲ２（配列番号１６）、ＣＤＲ３（配列番号１７）である。
その対応する核酸配列
ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＴＴＴＣＴＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＧＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＡＴＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＧＡＡＴＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＴＴＡＴＧＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号１８）
Ｃ１４ｓｃＦｖの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＮＦＭＬＴＱＰＰＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＮＩＡＳＦＹＶＱＷＦＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＲＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＴＴＤＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＴＮＮＶＩＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１９）
下線部に対応するアミノ酸は、それぞれＣＤＲ１（配列番号２０）、ＣＤＲ２（配列番号２１）、ＣＤＲ３（配列番号２２）である。
その対応する核酸配列
ＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣＣＴＣＴＧＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＣＣＣＧＧＧＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＡＴＴＧＣＣＡＧＣＴＴＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＡＣＡＧＡＴＣＧＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＣＧＡＣＴＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＡＡＴＧＴＣＡＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡ（配列番号２３）
実施例３．抗ｈＣＤ１３７ｓｃＦｖの特性の同定
３．１ ｈＣＤ１３７に対する特異的結合の同定（ＦＡＣＳ法）
ｈＣＤ１３７−ＥＧＦＰ、ｈＯＸ４０−ＥＧＦＰ、ｈＣＤ２７−ＥＧＦＰ及びｈＧＩＴＲ−ＥＧＦＰを発現した実施例１で構築されたＨＥＫ２９３細胞を０．５％のＰＢＳ−ＢＳＡバッファーに再懸濁し、抗ｈＣＤ１３７Ｃ２ｓｃＦｖ及びＣ１４ｓｃＦｖタンパク質を加え、陰性対照をｈＩｇＧ Ｆｃタンパク質とし、氷上で２０分インキュベートした。洗浄後、eBioscienceの二次抗体の抗ｈＩｇ−ＰＥを加え、氷上で２０分。洗浄後、細胞を５００μＬの０．５％のＰＢＳ−ＢＳＡバッファーに再懸濁し、フローサイトメーターで検出した。結果は図２に示す通りであり、抗ｈＣＤ１３７Ｃ２ｓｃＦｖ及びＣ１４ｓｃＦｖはいずれもｈＣＤ１３７−ＥＧＦＰ細胞と結合することができ、他のいくつかの種類のＥＧＦＰ細胞（ｈＯＸ４０−ＥＧＦＰ−２９３Ｆ、ｈＣＤ２７−ＥＧＦＰ−２９３Ｆ及びｈＧＩＴＲ−ＥＧＦＰ−２９３Ｆ）とは結合することができず、良好な特異性が示された。
３．２ ｈＣＤ１３７タンパク質との結合能の検出（ＥＬＩＳＡ法）
コーティングバッファー（５０ｍＭ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）でｈＣＤ１３７−ｍｕＦｃを２μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェル、４℃で一晩静置した。プレート洗浄後、３％のＢＳＡ−ＰＢＳ、３７℃で１時間密閉した。Ｃ２ｓｃＦｖ及びＣ１４ｓｃＦｖ抗体をそれぞれ２０００ｎｇ／ｍＬから始めて合計１１個の濃度で２倍段階希釈を行い、希釈液（１％のＢＳＡ−ＰＢＳ）を対照とし、３７℃で２時間インキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Goat anti-human IgG-HRP conjugated）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。可溶性で単一成分のＴＭＢ基質発色液を加え、室温、遮光下で５分〜１０分発色させた。２ＮのＨ２ＳＯ４、５０μＬ／ウェルで発色反応を終了させた。マイクロプレートリーダーＭＤ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４に置いてＯＤ４５０ｎｍ〜６５０ｎｍにおける値を読み取り、ソフトウェアＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ５．４でデータを処理し、作図、解析した。結果は図３に示す通りである。
３．３ ｈＣＤ１３７タンパク質との結合能の検出（ＳＰＲ法）
組換えヒトＣＤ１３７に対する抗ｈＣＤ１３７Ｃ２ｓｃＦｖ及びＣ１４ｓｃＦｖ抗体の結合反応速度は、表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ：surface plasmon resonance）法によって計測器ＢＩＡｃｏｒｅ Ｘ１００を用いて測定した。チップＣＭ５に抗ヒトＦｃ抗体（マウスＦｃを交差認識しない）をカップリングし、Ｃ２ｓｃＦｖ又はＣ１４ｓｃＦｖをランニングバッファーで５ｎＭに希釈し、リガンドとしてチップ上の抗体により捕獲した。ＣＤ１３７−ｍｕＦｃは、ランニングバッファーで１０００ｎＭから３１．６ｎＭに６つの濃度で２倍希釈した。注入時間は１８０秒とし、解離時間は１８００秒とし、再生時間は６０秒とした。ランニングバッファーはＨＢＳ−ＥＰ＋とし、再生バッファーは１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）とした。シンプルな１対１のＬａｎｇｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェア３．２版（BIAcore Evaluation Software version 3.2））によって結合速度（Ｋｏｎ）及び解離速度（Ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）は、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比率で算出した。
測定された抗ｈＣＤ１３７抗体の結合親和力は、表１を参照されたい。
実施例４．抗ＣＤ１３７Ｃ２ｓｃＦｖ及びＣ１４ｓｃＦｖのアゴニスト活性の測定
ヒトリンパ球分離溶液（Tianjin Hanyang）の密度勾配遠心によって健康なボランティアの末梢血濃縮白血球から末梢血単核球ＰＢＭＣを分離し、ＲＰＭＩ完全培地に播種した。予め５０μＬ、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３で９６ウェルプレートをコーティングして４℃で一晩静置した。実験群は５０μＬ、２μｇ／ｍＬのＣ２ｓｃＦｖ又はＣ１４ｓｃＦｖを用いて３７℃で２時間コーティングするか、又は可溶性で終濃度２μｇ／ｍＬのＣ２ｓｃＦｖ又はＣ１４ｓｃＦｖ＋終濃度２μｇ／ｍＬのｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ（Jackson Immuno Research Laboratories、１０９−００６−００８）を同時に加え、陰性対照はＲＰＭＩ完全培地とした。ＰＢＭＣの量は２×１０５／ウェルとし、５日間培養した後に上清を取った。図４に示すように、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ検出キット（ebioscience）によって上清中のＩＦＮ−γのレベルを検出し（図４）、ＢｒｄＵ染色キット（Roche、１１６４７２２９００１）によってＴ細胞の増殖を検出した（図４）。このことから、Ｃ２ｓｃＦｖ及びＣ１４ｓｃＦｖは、コーティングとｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋとの２種類の方法のいずれにおいても、良好にＰＢＭＣを活性化させると共にＴ細胞の増殖を促進する活性を有しており、また、Ｃ２ｓｃＦｖよりもＣ１４ｓｃＦｖのアゴニスト活性の方がやや強いことがわかる。
ヒトリンパ球分離溶液（Tianjin Hanyang）の密度勾配遠心によって健康なボランティア（４＃及び５＃）の末梢血濃縮白血球から末梢血単核球ＰＢＭＣを分離し、ＲＰＭＩ完全培地に播種した。予め５０μＬ、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３で９６ウェルプレートをコーティングして４℃で一晩静置した。実験群は５０μＬ、２μｇ／ｍＬのＣ１４ｓｃＦｖ＋終濃度２μｇ／ｍＬのｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ（Jackson Immuno Research Laboratories、１０９−００６−００８）を用い、陰性対照はＲＰＭＩ完全培地とした。ＰＢＭＣの量は２×１０５／ウェルとし、５日間培養した後に上清を取った。図４に示すように、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ検出キット（ebioscience）によって５＃ＰＢＭＣ上清中のＩＦＮ−γのレベルと、４＃ＰＢＭＣ上清中のＩＦＮ−γのレベルとを検出した（図４）。このことから、Ｃ１４ｓｃＦｖは、活性化されたＰＢＭＣのＩＦＮ−γ分泌レベルを増加可能であることがわかる。
実施例５．抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける親和性の成熟
５．１ 親和性が向上した酵母発現ライブラリーの構築
実施例２で構築されたｐｃＤＮＡ４−ＣＤ１３７−１４−Ｆｃプラスミドをテンプレートとし、ｐｃＤＮＡ４−Ｆ：ＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＡＧＣ（配列番号２４）及びｃＭｙｃ−ＢＢＸｈｏＩ：ＧＣＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＡＣＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＣＧ（配列番号２５）をプライマーとして標準的なＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物は、Fermentas社のＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩ酵素消化によって組換えプラスミドを構築した。続いて、文献Ginger他、(2006) Nat Protoc 1(2):755-68の方法を参照し、エラープローンＰＣＲ法によって、ｓｃＦｖがランダム変異したＰＣＲ産物を得た。使用するプライマーは、ｅｐ−Ｆ：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号２６）及びｅｐ−Ｒ：ＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＡＡＡＣＡＣＡＣＡＧＴＡＴ（配列番号２７）とした。得られたＰＣＲ産物は、Fermentas社のＧｅｎｅＪＥＴ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製してからエタノール沈殿で濃度が１μｇ／μＬを超えるまで濃縮した。残りの操作手順は、文献Ginger他、(2006) Nat Protoc 1(2):755-68の方法を参照し、酵母電気穿孔法及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え法によって、親和性が成熟した酵母バンクを得た。
５．２ 産生され、親和性が改善した酵母の抗ＣＤ１３７Ｃ１４＃ｓｃＦｖのスクリーニング
このようにして得られた親和性成熟後の酵母バンクを１０ｎＭ及び１ｎＭのｈＣＤ１３７−Ｆｃタンパク質を用いて２回のフローサイトメトリーによって分離した。分離して得られた酵母産物のコーティングプレートは、単クローンを選択して同定した。低濃度の抗原染色法によって、事前に得られた野生型酵母を対照として、フローサイトメトリー染色で親和性が向上した酵母単クローンを特定した。酵母染色の結果は、図５に示す通りである。
ＦＡＣＳで確認された酵母クローンに対して、上述した方法と同様に酵母コロニーＰＣＲとシークエンシングとを行った。配列の分析結果は、次の表に示す通りである。
実施例６．ｓｃＦｖ型抗体からＩｇＧ型抗体へのフォーマット化
タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ（γ）４（ＩｇＧ４）の定常領域のアミノ酸配列（Ｐ０１８６１）に基づいて、ヒトＩｇＧ４の定常領域のアミノ酸配列を取得した。オンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて、対応するコーディングＤＮＡ配列を設計してヒトＩｇＧ４の定常領域の遺伝子を取得し、スクリーニングして得られたＣ１４の重鎖可変領域ＶＨの配列をヒトＩｇＧ４の定常領域の遺伝子配列と一緒にアセンブリングし、アセンブリングされた遺伝子を合成し、Fermentas社のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩのダブルダイジェストによってベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡにサブクローニングし、ｐｃＤＮＡ４−Ｃ１４ＨＣを取得した。
タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるヒト免疫グロブリンｌａｍｂｄａ（λ）の定常領域のアミノ酸配列（Ａ０Ｍ８Ｑ６）に基づいて、ヒトｌａｍｂｄａの軽鎖定常領域のアミノ酸配列を取得した。オンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を用いて、対応するコーディングＤＮＡ配列を設計してヒトｌａｍｂｄａ（λ）の軽鎖定常領域の遺伝子を取得し、スクリーニングして得られたＣ１４の軽鎖可変領域ＶＬの配列をヒトｌａｍｂｄａ（λ）の軽鎖定常領域の遺伝子配列と一緒にアセンブリングし、アセンブリングされた遺伝子を合成し、Fermentas社のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩのダブルダイジェストによってベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡにサブクローニングし、ｐｃＤＮＡ−Ｃ１４ＬＣを取得した。
このようにして得られた重鎖及び軽鎖のプラスミドをAidLab社の提供するプラスミド大量抽出キット（ＰＬ１４）を用いて大量抽出した。組み換えられ、構築された軽鎖及び重鎖のプラスミドの共トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞について抗体を発現させ、一過性トランスフェクション培養５日〜６日後に培養上清を集め、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーによって抗ｈＣＤ１３７抗体、すなわちＣ１４ｍＡｂを精製して得た。
同様の方法に従って、親和性成熟後のｓｃＦｖ型抗体をＩｇＧ型抗体にフォーマット化し、次の表に示す通り、一連の抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂの変異体を得た。
その配列は、以下に示す通りである。
抗ＣＤ１３７ １４＃Ｈ５４Ｈ５７ｍＡｂの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＮＦＭＬＴＱＰＰＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＮＩＡＳＦＹＶＱＷＦＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＲＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＴＴＤＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＴＮＮＶＩＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１９）
下線部に対応するアミノ酸は、それぞれＣＤＲ１（配列番号２０）、ＣＤＲ２（配列番号２１）、ＣＤＲ３（配列番号２２）である。
その対応する核酸配列
ＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣＣＴＣＴＧＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＣＣＣＧＧＧＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＡＴＴＧＣＣＡＧＣＴＴＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＡＣＡＧＡＴＣＧＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＣＧＡＣＴＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＡＡＴＧＴＣＡＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡ（配列番号２３）
抗ＣＤ１３７ １４＃Ｈ３２ｍＡｂの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＮＦＭＬＴＱＰＰＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＮＩＡＳＦＹＶＱＷＦＱＱＲＰＧＳＳＰＴＴＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＲＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＴＴＤＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＴＮＮＶＩＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号１９）
下線部に対応するアミノ酸は、それぞれＣＤＲ１（配列番号２０）、ＣＤＲ２（配列番号２１）、ＣＤＲ３（配列番号２２）である。
その対応する核酸配列
ＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣＣＴＣＴＧＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＣＣＣＧＧＧＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＡＴＴＧＣＣＡＧＣＴＴＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＡＣＡＧＡＴＣＧＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＣＧＡＣＴＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＡＡＴＧＴＣＡＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡ（配列番号２３）
抗ＣＤ１３７ １４＃Ｌ５０ｍＡｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＰＳＶＥＳＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＳＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＰＹＶＬＳＴＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号１４）
下線部に対応するアミノ酸は、それぞれＣＤＲ１（配列番号１５）、ＣＤＲ２（配列番号１６）、ＣＤＲ３（配列番号１７）である。
その対応する核酸配列
ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＴＴＴＣＴＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＧＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＡＴＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＧＡＡＴＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＴＴＡＴＧＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号１８）
抗ＣＤ１３７ １４＃Ｌ９５ｍＡｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＰＳＶＥＳＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＳＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＰＹＶＬＳＴＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号１４）
下線部に対応するアミノ酸は、それぞれＣＤＲ１（配列番号１５）、ＣＤＲ２（配列番号１６）、ＣＤＲ３（配列番号１７）である。
その対応する核酸配列
ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＴＴＴＣＴＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＧＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＡＴＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＧＡＡＴＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＴＴＡＴＧＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号１８）
抗ＣＤ１３７ １４＃Ｌ９３Ｌ９５ｍＡｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＰＳＶＥＳＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＳＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＰＹＶＬＳＴＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号１４）
下線部に対応するアミノ酸は、それぞれＣＤＲ１（配列番号１５）、ＣＤＲ２（配列番号１６）、ＣＤＲ３（配列番号１７）である。
その対応する核酸配列
ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＴＴＴＣＴＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＧＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＡＴＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＧＡＡＴＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＴＴＡＴＧＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号１８）
抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂ ｎｅｗの重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＰＳＶＥＳＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＳＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＰＹＶＬＳＴＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ（配列番号１４）
下線部に対応するアミノ酸は、それぞれＣＤＲ１（配列番号１５）、ＣＤＲ２（配列番号１６）、ＣＤＲ３（配列番号１７）である。
その対応する核酸配列
ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＴＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＴＴＴＣＴＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＧＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＡＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＴＡＴＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＣＧＡＡＴＡＡＣＣＡＴＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＡＣＣＣＴＣＣＴＴＡＴＧＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号１８）
実施例７．抗ｈＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂ及び変異体の特性の同定
７．１ ｈＣＤ１３７に対する特異的結合の同定（ＦＡＣＳ法）
ｈＣＤ１３７−ＥＧＦＰ、ｈＯＸ４０−ＥＧＦＰ、ｈＣＤ２７−ＥＧＦＰ及びｈＧＩＴＲ−ＥＧＦＰを発現した実施例１で構築されたＨＥＫ２９３細胞を０．５％のＰＢＳ−ＢＳＡバッファーに再懸濁し、抗ｈＣＤ１３７Ｃ１４ｍＡｂタンパク質を加え、陰性対照をｈＩｇＧ Ｆｃタンパク質とし、氷上で２０分インキュベートした。洗浄後、eBioscienceの二次抗体の抗ｈＩｇ−ＰＥを加え、氷上で２０分。洗浄後、細胞を５００μＬの０．５％のＰＢＳ−ＢＳＡバッファーに再懸濁し、フローサイトメーターで検出した。結果は図に示す通りである。図６に示すように、抗ｈＣＤ１３７Ｃ１４ｍＡｂはｈＣＤ１３７−ＥＧＦＰ細胞と結合することができ、他のいくつかの種類のＥＧＦＰ細胞（ｈＯＸ４０−ＥＧＦＰ−２９３Ｆ、ｈＣＤ２７−ＥＧＦＰ−２９３Ｆ及びｈＧＩＴＲ−ＥＧＦＰ−２９３Ｆ）とは結合することができず、良好な特異性が示された。
７．２ ｈＣＤ１３７タンパク質との結合能の検出（ＥＬＩＳＡ法）
コーティングバッファー（５０ｍＭ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）でｈＣＤ１３７−ｍｕＦｃを２μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェル、４℃で一晩静置した。プレート洗浄後、３％のＢＳＡ−ＰＢＳ、３７℃で１時間密閉した。Ｃ１４ｍＡｂ及び変異体をそれぞれ２０００ｎｇ／ｍＬから始めて合計１１個の濃度で２倍段階希釈を行い、希釈液（１％のＢＳＡ−ＰＢＳ）を対照とし、３７℃で２時間インキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Goat anti-human IgG-HRP conjugated）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。可溶性で単一成分のＴＭＢ基質発色液を加え、室温、遮光下で５分〜１０分発色させた。２ＮのＨ２ＳＯ４、５０μＬ／ウェルで発色反応を終了させた。マイクロプレートリーダーＭＤ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４に置いてＯＤ４５０ｎｍ〜６５０ｎｍにおける値を読み取り、ソフトウェアＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ５．４でデータを処理し、作図、解析した。結果は図７に示す通りである。
図７Ａに示すように、重鎖のＨ５４位とＨ５７位とが同時に変異した場合には、抗体と抗原との結合に影響がなく、また、抗体と抗原との親和性は増加しなかった。図７Ｂに示すように、軽鎖の変異は抗体と抗原との親和性を増加させることができ、特に、Ｌ９３位とＬ９５位とが同時に変異した場合に増加させることができた。図７Ｃからわかるように、ｈＣＤ１３７に対する抗ＣＤ１３７ １４＃Ｌ９３Ｌ９５ｍＡｂ及び抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂ ｎｅｗの親和性は、ほとんど違いがなかった。
７．３ ｈＣＤ１３７タンパク質との結合能の検出（ＳＰＲ法）
組換えヒトＣＤ１３７に対する抗ｈＣＤ１３７抗体の結合反応速度は、表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ：surface plasmon resonance）法によって計測器ＢＩＡｃｏｒｅ Ｘ１００を用いて測定した。チップＣＭ５に抗ヒトＦｃ抗体（マウスＦｃを交差認識しない）をカップリングし、Ｃ１４Ｍａｂ又はＣ１４Ｍａｂ ｎｅｗをランニングバッファーで５ｎＭに希釈し、リガンドとしてチップ上の抗体により捕獲した。ＣＤ１３７−ｍｕＦｃは、ランニングバッファーで１０００ｎＭから３１．６ｎＭに（Ｃ１４Ｍａｂ）又は１００ｎＭから３．１６ｎＭに（Ｃ１４Ｍａｂ ｎｅｗ）６つの濃度で２倍希釈した。注入時間は１８０秒とし、解離時間は１８００秒とし、再生時間は６０秒とした。ランニングバッファーはＨＢＳ−ＥＰ＋とし、再生バッファーは１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）とした。シンプルな１対１のＬａｎｇｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェア３．２版（BIAcore Evaluation Software version 3.2））によって結合速度（Ｋｏｎ）及び解離速度（Ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）は、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比率で算出した。測定された抗ｈＣＤ１３７抗体の結合親和力は、表４を参照されたい。
７．４ アカゲザルＣＤ１３７タンパク質との結合能の検出（ＥＬＩＳＡ法）
コーティングバッファー（５０ｍＭ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）でＲｈＣＤ１３７−ｍｕＦｃを５μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬ／ウェル、４℃で一晩静置した。プレート洗浄後、３％のＢＳＡ−ＰＢＳ、３７℃で１時間密閉した。抗ｈＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂ ｎｅｗ抗体をそれぞれ２０００ｎｇ／ｍＬから始めて３倍段階希釈を行い、希釈液（１％のＢＳＡ−ＰＢＳ）を対照とし、３７℃で２時間インキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Goat anti-human IgG-HRP conjugated）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。可溶性で単一成分のＴＭＢ基質発色液を加え、室温、遮光下で５分〜１０分発色させた。２ＮのＨ２ＳＯ４、５０μＬ／ウェルで発色反応を終了させた。マイクロプレートリーダーＭＤ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４に置いてＯＤ４５０ｎｍ〜６５０ｎｍにおける値を読み取り、ソフトウェアＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ５．４でデータを処理し、作図、解析した。結果は図８に示す通りであり、抗ｈＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂ ｎｅｗがアカゲザルＣＤ１３７と結合可能であることがわかる。
７．５ ＣＤ１３７Ｌと競合したＣＤ１３７タンパク質への結合の検出（ＦＡＣＳ法）
細胞表面に発現したＣＤ１３７ＬとＣＤ１３７タンパク質との結合を抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂ ｎｅｗがブロッキング可能であるか否かを検出した。実施例１で構築された５×１０５個のＣＤ１３７Ｌ−ＥＧＦＰ細胞を取り、１０μｇ／ｍＬのＣＤ１３７−ｍｕＦｃタンパク質及び２０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ１３７Ｃ１４＃ｍＡｂ ｎｅｗ抗体を反応系に加え、氷上で２０分インキュベートし、２回洗浄し、さらに、抗ｍＩｇ−ＰＥ二次抗体を加えて染色し、氷上で２０分インキュベートし、２回洗浄した後、ＢＳＡを０．５％含有するＰＢＳに細胞を保存した。抗体を加えずにＣＤ１３７−ｍｕＦｃを加えたものを対照とした。フローサイトメーターで染色結果を検出し、結果は図９に示す通りである。なお、Ｘ軸はＥＧＦＰの蛍光強度であり、Ｙ軸はＰＥの蛍光強度である。結果からわかるように、ここでの抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂ ｎｅｗは、ＣＤ１３７ＬとＣＤ１３７タンパク質との結合をブロッキングしなかった。
実施例８．抗ＣＤ１３７Ｃ１４ｍＡｂのアゴニスト活性の測定
ヒトリンパ球分離溶液（Tianjin Hanyang）の密度勾配遠心によって健康なボランティアの末梢血濃縮白血球から末梢血単核球ＰＢＭＣを分離し、ＲＰＭＩ完全培地に播種した。予め５０μＬ、１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３及び０．５μｇ／ｍＬの可溶性の抗ＣＤ２８で９６ウェルプレートをコーティングして４℃で一晩静置した。実験群は５０μＬ、２μｇ／ｍＬのＣ１４ｓｃＦｖ又はＣ１４ｍＡｂ＋終濃度２μｇ／ｍＬのｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ（Jackson Immuno Research Laboratories、１０９−００６−００８）を用い、陰性対照はＲＰＭＩ完全培地とした。ＰＢＭＣの量は２×１０５／ウェルとし、５日間培養した後に上清を取った。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ検出キット（ebioscience）によってＰＢＭＣ上清中のＩＦＮ−γのレベルを検出し、結果は図１０Ａに示す通りである。結果から、抗ＣＤ１３７ １４＃ＳｃＦｖ及び抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂはいずれも、活性化されたＰＢＭＣのＩＦＮ−γ分泌レベルを引上げ可能であることがわかる。
ヒトリンパ球分離溶液（Tianjin Hanyang）の密度勾配遠心によって健康なボランティアの末梢血濃縮白血球から末梢血単核球ＰＢＭＣを分離し、ＲＰＭＩ完全培地に播種した。磁気分離キット（Miltenyi Biotec、１３０−０９６−５３３）を用い、説明書の方法に従ってＰＢＭＣからＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した。計数してＲＰＭＩ完全培地に再懸濁し、濃度を２００万／ｍＬとした。分離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３及び０．２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８で刺激し、これを活性化させた。実験群は２μｇ／ｍＬのＣ１４ＳｃＦｖ又はＣ１４ｍＡｂ＋終濃度２μｇ／ｍＬのｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ（Jackson Immuno Research Laboratories、１０９−００６−００８）を加え、陰性対照はＲＰＭＩ完全培地とし、５日間培養した後に上清を取った。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ検出キット（ebioscience）によってＣＤ８＋Ｔ細胞上清中のＩＦＮ−γのレベルを検出し、結果は図１０Ｂに示す通りである。結果から、抗ＣＤ１３７ １４＃ＳｃＦｖ及び抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂはいずれも、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌能を増加可能であることがわかる。
実施例９．マウスｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍増殖に対する抗ＣＤ１３７抗体の阻害作用
腫瘍細胞ＰＣ−３及びヒトＰＢＭＣを移植したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス腫瘍モデルを用いて抗ＣＤ１３７抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける薬効を評価した。０日目にＰＣ−３５×１０６（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１４３５（商標））をヒトの末梢血単核球２．５×１０６（ＰＢＭＣ）と共にマウスに皮下（ＳＣ）注射し、０日目及び７日目に１ｍｇ／ｋｇのＣ１４ｍＡｂを、ＰＢＳを陰性対照として腹腔内注射により投与した。腫瘍の形成を毎週２回観察し、腫瘍の長径及び短径をノギスで測定し、腫瘍体積を算出して、腫瘍増殖曲線を作図した。結果は図１１に示す通りであり、抗体Ｃ１４ｍＡｂが腫瘍の増殖を有意に阻害可能であることがわかる。
実施例１０．抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂの安定性の検出
１０．１ ４５℃の加速安定性試験による抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂの安定性の検出
抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂに対して４５℃の加速安定性試験を行った。具体的な試験方法は、ＰｒｏｔｅｉｎＡでシングルステップ精製された抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解して２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、１００μｇの抗体を２００μＬのＰＣＲチューブに入れ、４５℃で水浴させ、０日目、１０日目、２０日目、３０日目に試料を採取してＡ２８０検出及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析を行った。結果は図１２に示す通りである。なお、図１２Ａは抗体濃度の経時変化を示す図であり、それぞれの時点で採取された試料濃度には有意な変化がないことがわかる。図１２Ｂは抗体の二量体の経時変化の百分率であり、時間の経過に伴って抗体の二量体の割合がやや減少していることがわかり、多量体の形成は見られなかった。
１０．２ 示差走査熱量計（ＤＳＣ）による抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂの安定性の検出
ＤＳＣ法によって抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂの熱安定性を検出した。ＤＳＣによって正確にテストを実施するために、単独の緩衝液及びタンパク質含有緩衝液の走査結果を収集した。
抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂタンパク質を１ｍｇ／ｍＬ（ＰＢＳバッファー）に希釈した。次の条件でデータを収集した。すなわち、１０℃〜１１０℃で走査するようにＤＳＣを設定し、走査速度は１時間あたり１００℃とし、毎回走査前に１５分間平衡化した。ＤＳＣ試料チャンバーの体積は、０．５ｍＬとした。緩衝液とタンパク質との走査結果を収集すると、タンパク質の走査結果から緩衝液の走査結果を減じることができるようになる。試料におけるタンパク質の濃度を取得して各走査における濃度を補正し、それによって、抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂのＴｍ値を取得した。結果は図１３に示す通りであり、結果からわかるように、抗ＣＤ１３７ １４＃ｍＡｂのＴｍ値は摂氏６９．７０度であった。
例示して説明するために、本発明の具体的な実施形態を本文に記載したが、本発明の趣旨及び範囲を逸脱せずに種々の変更を行うことができることを当業者は理解するものとする。したがって、本発明の具体的な実施形態及び実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。本発明は、特許請求の範囲でしか限定されない。
［配列表］
<110> SUZHOU DINGFU BADIAN BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
<120> FULLY HUMAN ANTIBODY AGAINST HUMAN CD137 AND USE THEREOF
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
cgtagaatcg agaccgagga ga 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ctggtggtgg tggttctgct agc 23
<210> 4
<211> 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ala Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu His Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Arg Val Val Pro Ala Gly Ser Gly Trp Arg Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Asp Tyr Tyr Met Asn
1 5
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Tyr Ile Ser Ser Ser Ala Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Val Val Pro Ala Gly Ser Gly Trp Arg Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 8
<211> 372
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccgtcagt gactactaca tgaactggat ccgccaggct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtttcatac attagtagta gtgctagtgg tagtaccata 180
tactacgcag actctgtgaa gggccgattc accatctcca gggacaacgc caacaactca 240
ctgtatctgc acatggacag cctgagagcc gaggacacgg ccatatactt ctgtgcgaga 300
gtcgtcccag ctggaagtgg gtggaggtgg ttcgacccct ggggccaggg taccctggtc 360
actgtctcct ca 372
<210> 9
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Gln Ser Val Leu Ile Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ile Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asp Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser His Ala Gly Ser
85 90 95
Asn Asn Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Thr Gly Ile Ser Ser Asp Val Gly Ala Tyr Asp Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Ser Ser His Ala Gly Ser Asn Asn Phe Tyr Val
1 5 10
<210> 13
<211> 333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
cagtctgttc tgattcagcc tccctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60
tcctgcactg gaatcagcag tgacgttggt gcttatgact atgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggca aagtccccaa actcatgatt tatgaggtca gtaagcggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgct tctctggctc caagtctggc gacacggcct ccctgaccgt ctctgggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttactactgc agctcacatg caggcagcaa caatttttat 300
gtcttcggaa ctgggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 14
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Pro Ser Val Glu Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Pro Tyr Val Leu Ser Thr Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn
1 5
<210> 16
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Pro Ser Val
1 5 10 15
Glu Ser
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Asp Pro Pro Tyr Val Leu Ser Thr Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 18
<211> 369
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtttct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgaggggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg caccatctgt ggaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgag ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ctactgtgca 300
agagaccctc cttatgtgct cagtactttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 19
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Thr Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr
85 90 95
Asn Asn Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Gln Ser Tyr Asp Thr Asn Asn Val Ile
1 5
<210> 23
<211> 330
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 23
aattttatgc tgactcagcc cccctctgtg tcggagtccc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg gaacattgcc agcttctatg tgcagtggtt tcaacagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaagatgacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagatcg tccaactctg cctccctcac catttctgga 240
ctgacgactg acgacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgataccaa caatgtcata 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 24
tctggtggtg gtggttctgc tagc 24
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 25
gccagatctc gagctattac aagtcttctt cagaaataag cttttgttct agaattccg 59
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 26
taatacgact cactataggg 20
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 27
ggcagcccca taaacacaca gtat 24
<210> 28
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Arg Trp Tyr Ser Asp Tyr Ala
50 55 60
Ser Ser Val Glu Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Pro Tyr Val Leu Ser Thr Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Arg Trp Tyr Ser Asp Tyr Ala Ser Ser Val
1 5 10 15
Glu Ser
<210> 30
<211> 369
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtttct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgaggggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caggtggtat 180
agtgattatg catcatctgt ggaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgag ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ctactgtgca 300
agagaccctc cttatgtgct cagtactttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 31
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asp
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Pro Ser Val Glu Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Ser Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Pro Tyr Val Leu Ser Thr Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Ser Asp Ser Ala Ala Trp Asn
1 5
<210> 33
<211> 369
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtttct agcgacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgaggggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg caccatctgt ggaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgag ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ctactgtgca 300
agagaccctc cttatgtgct cagtactttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 34
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Thr Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr
85 90 95
Asn Asn Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Asp Asp Asp Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 36
<211> 330
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 36
aattttatgc tgactcagcc cccctctgtg tcggagtccc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg gaacattgcc agcttctatg tgcagtggtt tcaacagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gacgatgacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagatcg tccaactctg cctccctcac catttctgga 240
ctgacgactg acgacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgataccaa caatgtcata 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 37
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Thr Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr
85 90 95
Asn Lys Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Gln Ser Tyr Asp Thr Asn Lys Val Ile
1 5
<210> 39
<211> 330
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 39
aattttatgc tgactcagcc cccctctgtg tcggagtccc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg gaacattgcc agcttctatg tgcagtggtt tcaacagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaagatgacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagatcg tccaactctg cctccctcac catttctgga 240
ctgacgactg acgacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgataccaa caaggtcata 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 40
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Thr Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ile
85 90 95
Asn Lys Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Gln Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Val Ile
1 5
<210> 42
<211> 330
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
aattttatgc tgactcagcc cccctctgtg tcggagtccc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg gaacattgcc agcttctatg tgcagtggtt tcaacagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gaagatgacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagatcg tccaactctg cctccctcac catttctgga 240
ctgacgactg acgacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatatcaa caaggtcata 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 43
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Asn Ile Ala Ser Phe
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Asp Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Thr Thr Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ile
85 90 95
Asn Lys Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 44
<211> 330
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 44
aattttatgc tgactcagcc cccctctgtg tcggagtccc cggggaagac ggtaaccatc 60
tcctgcaccc gcagcagtgg gaacattgcc agcttctatg tgcagtggtt tcaacagcgc 120
ccgggcagtt cccccaccac tgtgatctat gacgatgacc aaagaccctc tggggtccct 180
gatcggttct ctggctccat cgacagatcg tccaactctg cctccctcac catttctgga 240
ctgacgactg acgacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatatcaa caaggtcata 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
本発明の別の態様では、本発明により、ＶＨ、ＶＬ及びリンカーペプチドを含む一本鎖抗体であって、前記ＶＨの配列が配列番号４であり、前記ＶＬの配列が配列番号９であり、前記リンカーペプチドの配列が配列番号１であることを特徴とする、一本鎖抗体が提供される。
本発明の更なる態様では、本発明により、ＶＨ、ＶＬ及びリンカーペプチドを含む一本鎖抗体であって、前記ＶＨの配列が配列番号１４であり、前記ＶＬの配列が配列番号２３であり、前記リンカーペプチドの配列が配列番号１であることを特徴とする、一本鎖抗体が提供される。
実施例２．酵母ディスプレイライブラリーからの抗ｈＣＤ１３７抗体のスクリーニング、クローニング、発現及び同定
ヒトＣＤ１３７を対象とした完全ヒト抗体を酵母ディスプレイ技術によってスクリーニングした。健康な１５０人に由来するＰＢＭＣのＩｇＭ及びＩｇＧのｃＤＮＡにおけるＶＨ及びＶＬ遺伝子をクローニングすることによって、容量５×１０８のｓｃＦＶ酵母ディスプレイライブラリーを構築した（ＶＨとＶＬとの間の結合配列はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカーペプチド（配列番号１）である）。１０倍の容量の酵母バンクを回復させ、酵母表面での抗体発現を誘導し、１００ｎＭのビオチン化ｈＣＤ１３７−Ｆｃ抗原を用いて磁気分離の手法によって２回濃縮し、その後、ビオチン化ｈＣＤ１３７を用いてフローサイトメトリー分離によって更に２回濃縮した。得られた酵母コーティングプレートは、単クローンを選択した。単クローン酵母は増殖及び誘導によって発現した後、ビオチン化ｈＣＤ１３７又は対照抗原ｈＯＸ４０を用いて染色、分析し、抗原陽性／対照抗原陰性の酵母を陽性酵母とした。

Claims (13)

  1. 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分であって、
    前記重鎖可変領域が、配列番号５で示されるＣＤＲ１と、配列番号６で示されるＣＤＲ２と、配列番号７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
    前記軽鎖可変領域が、配列番号１０で示されるＣＤＲ１と、配列番号１１で示されるＣＤＲ２と、配列番号１２で示されるＣＤＲ３とを含むか、
    前記重鎖可変領域が、配列番号１５で示されるＣＤＲ１と、配列番号１６で示されるＣＤＲ２と、配列番号１７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
    前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるＣＤＲ１と、配列番号２１で示されるＣＤＲ２と、配列番号２２で示されるＣＤＲ３とを含むか、
    前記重鎖可変領域が、配列番号１５で示されるＣＤＲ１と、配列番号２９で示されるＣＤＲ２と、配列番号１７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
    前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるＣＤＲ１と、配列番号２１で示されるＣＤＲ２と、配列番号２２で示されるＣＤＲ３とを含むか、
    前記重鎖可変領域が、配列番号３２で示されるＣＤＲ１と、配列番号１６で示されるＣＤＲ２と、配列番号１７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
    前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるＣＤＲ１と、配列番号２１で示されるＣＤＲ２と、配列番号２２で示されるＣＤＲ３とを含むか、
    前記重鎖可変領域が、配列番号１５で示されるＣＤＲ１と、配列番号１６で示されるＣＤＲ２と、配列番号１７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
    前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるＣＤＲ１と、配列番号３５で示されるＣＤＲ２と、配列番号２２で示されるＣＤＲ３とを含むか、
    前記重鎖可変領域が、配列番号１５で示されるＣＤＲ１と、配列番号１６で示されるＣＤＲ２と、配列番号１７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
    前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるＣＤＲ１と、配列番号２１で示されるＣＤＲ２と、配列番号３８で示されるＣＤＲ３とを含むか、
    前記重鎖可変領域が、配列番号１５で示されるＣＤＲ１と、配列番号１６で示されるＣＤＲ２と、配列番号１７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
    前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるＣＤＲ１と、配列番号２１で示されるＣＤＲ２と、配列番号４１で示されるＣＤＲ３とを含むか、又は、
    前記重鎖可変領域が、配列番号１５で示されるＣＤＲ１と、配列番号１６で示されるＣＤＲ２と、配列番号１７で示されるＣＤＲ３とを含むと共に、
    前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるＣＤＲ１と、配列番号３５で示されるＣＤＲ２と、配列番号４１で示されるＣＤＲ３とを含む、抗体又はその抗原結合部分。
  2. 重鎖が、配列番号４で示される可変領域を含むと共に、
    軽鎖が、配列番号９で示される可変領域を含むか、
    重鎖が、配列番号１４で示される可変領域を含むと共に、
    軽鎖が、配列番号１９で示される可変領域を含むか、
    重鎖が、配列番号２８で示される可変領域を含むと共に、
    軽鎖が、配列番号１９で示される可変領域を含むか、
    重鎖が、配列番号３１で示される可変領域を含むと共に、
    軽鎖が、配列番号１９で示される可変領域を含むか、
    重鎖が、配列番号１４で示される可変領域を含むと共に、
    軽鎖が、配列番号３４で示される可変領域を含むか、
    重鎖が、配列番号１４で示される可変領域を含むと共に、
    軽鎖が、配列番号３７で示される可変領域を含むか、
    重鎖が、配列番号１４で示される可変領域を含むと共に、
    軽鎖が、配列番号４０で示される可変領域を含むか、又は、
    重鎖が、配列番号１４で示される可変領域を含むと共に、
    軽鎖が、配列番号４３で示される可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  3. 完全抗体、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖである、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合部分。
  4. ＶＨ、ＶＬ及びＣ−ペプチドを含む一本鎖抗体であって、
    前記ＶＨの配列が配列番号４であり、前記ＶＬの配列が配列番号９であり、前記Ｃ−ペプチドの配列が配列番号１であることを特徴とする、一本鎖抗体。
  5. ＶＨ、ＶＬ及びＣ−ペプチドを含む一本鎖抗体であって、
    前記ＶＨの配列が配列番号１４であり、前記ＶＬの配列が配列番号２３であり、前記Ｃ−ペプチドの配列が配列番号１であることを特徴とする、一本鎖抗体。
  6. 請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合部分と、
    医薬担体と、
    を含む、医薬組成物。
  7. 被験者の癌の治療方法であって、
    前記被験者に治療有効量の請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合部分を投与することを含む、方法。
  8. 被験者の癌の併用治療方法であって、
    前記被験者に治療有効量の請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合部分を投与することを含み、
    前記被験者に治療有効量の他の癌治療薬を投与するか、又は他の癌治療方法を用いることを更に含む、方法。
  9. 被験者の腫瘍の併用治療方法であって、
    前記被験者に治療有効量の請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合部分を投与することを含み、
    前記被験者に治療有効量の他の腫瘍治療薬を投与するか、又は他の腫瘍治療方法を用いることを更に含む、方法。
  10. 配列番号４、配列番号１４、配列番号２８、配列番号３１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は相同性が９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  11. 配列番号８、配列番号１８、配列番号３０、配列番号３３のヌクレオチド配列、又は相同性が９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  12. 配列番号９、配列番号１９、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は相同性が９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  13. 配列番号１３、配列番号２３、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４のヌクレオチド配列、又は相同性が９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022510253A (ja) * 2018-11-30 2022-01-26 エービーエル バイオ インコーポレイテッド 抗－４－１ｂｂ抗体およびその用途
JP2022512724A (ja) * 2018-10-19 2022-02-07 ディンフー バイオターゲット カンパニー リミテッド 抗ｃｄ１３７抗体およびその使用

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3484922A1 (en) 2016-07-14 2019-05-22 Genmab A/S Multispecific antibodies against cd40 and cd137
JP7297672B2 (ja) 2017-04-13 2023-06-26 アジェナス インコーポレイテッド 抗ｃｄ１３７抗体およびその使用方法
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
TWI701259B (zh) * 2017-11-09 2020-08-11 大陸商上海懷越生物科技有限公司 ４﹘１ｂｂ抗體及其製備方法和應用
WO2019104716A1 (en) * 2017-12-01 2019-06-06 Adagene Inc. Methods for using cd137 ligand as biomarker for treatment with anti-cd137 antibody
US20210363266A1 (en) * 2018-01-22 2021-11-25 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-4-1bb antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
GB201811408D0 (en) * 2018-07-12 2018-08-29 F Star Beta Ltd CD137 Binding Molecules
WO2020142624A1 (en) * 2019-01-02 2020-07-09 Qlsf Biotherapeutics Inc. Cd137 agonist antibodies and uses thereof
MX2021008453A (es) * 2019-01-16 2021-08-19 Compass Therapeutics Llc Formulaciones de anticuerpos que se unen a cd137 humano y usos de los mismos.
SG11202110287QA (en) 2019-04-24 2021-10-28 Heidelberg Pharma Res Gmbh Amatoxin antibody-drug conjugates and uses thereof
CN112010974B (zh) * 2019-05-30 2022-08-09 山东博安生物技术股份有限公司 一种特异性结合人4-1bb的抗体及其应用
CN112300277A (zh) * 2019-07-25 2021-02-02 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 Csf1r抗体、基因、载体、宿主细胞和csf1r拮抗剂
CN112279914A (zh) * 2019-07-25 2021-01-29 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 Il4ra抗体、基因、载体、宿主细胞和il4ra拮抗剂
CN112279915A (zh) * 2019-07-25 2021-01-29 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 Icos抗体、基因、载体、宿主细胞和icos拮抗剂
CN112794905B (zh) * 2019-11-13 2022-10-04 合肥瀚科迈博生物技术有限公司 一种能够与人4-1bb结合的分子
CN112794904B (zh) * 2019-11-13 2022-09-30 合肥瀚科迈博生物技术有限公司 一种抗4-1bb的人源化抗体的用途
CN113004416B (zh) * 2019-12-19 2022-10-04 合肥瀚科迈博生物技术有限公司 靶向her2-cd137双特异性抗体的构建及其应用
CN113004415B (zh) * 2019-12-19 2022-09-30 合肥瀚科迈博生物技术有限公司 靶向her2和4-1bb的双特异性抗体及其应用
JP2023522024A (ja) * 2020-04-17 2023-05-26 ディンフー バイオターゲット カンパニー リミテッド Ｃｄ１３７と特異的に結合する製剤とその使用について

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002531383A (ja) * 1998-11-17 2002-09-24 エルジ ケミカル リミテッド ヒト４−１ｂｂに特異的なヒト化抗体およびそれを含む医薬組成物
JP2006500921A (ja) * 2002-07-30 2006-01-12 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー ヒト４−１ｂｂに対するヒト化抗体
WO2006088447A1 (en) * 2005-02-15 2006-08-24 Gtc Biotherapeutics, Inc. An anti-cd137 antibody as an agent in the treatement of cancer and glycosylation variants thereof
JP2007532095A (ja) * 2003-10-10 2007-11-15 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー ヒト４−１ｂｂ（ｃｄ１３７）に対する完全ヒト抗体
JP2013544756A (ja) * 2010-09-09 2013-12-19 ファイザー・インク ４−１ｂｂ結合分子

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030118588A1 (en) * 1999-05-22 2003-06-26 Linda Diehl Induction of anti-tumor CTL immunity through in vivo triggering of 4-1BB and/or CD40
AR046094A1 (es) * 2003-10-10 2005-11-23 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos completamente humanos contra 4-1bb humano
US20070253961A1 (en) * 2004-06-09 2007-11-01 Ulsan Industrial Education Foundation Pharmaceutical Composition Comprising the Anti-4-1Bb Antibody for Treating or Preventing Rheumatoid Arthritis

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002531383A (ja) * 1998-11-17 2002-09-24 エルジ ケミカル リミテッド ヒト４−１ｂｂに特異的なヒト化抗体およびそれを含む医薬組成物
JP2006500921A (ja) * 2002-07-30 2006-01-12 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー ヒト４−１ｂｂに対するヒト化抗体
JP2007532095A (ja) * 2003-10-10 2007-11-15 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー ヒト４−１ｂｂ（ｃｄ１３７）に対する完全ヒト抗体
WO2006088447A1 (en) * 2005-02-15 2006-08-24 Gtc Biotherapeutics, Inc. An anti-cd137 antibody as an agent in the treatement of cancer and glycosylation variants thereof
JP2013544756A (ja) * 2010-09-09 2013-12-19 ファイザー・インク ４−１ｂｂ結合分子

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER, 2012, VOL.61, P.1721-1733, JPN6019029402, ISSN: 0004283043 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022512724A (ja) * 2018-10-19 2022-02-07 ディンフー バイオターゲット カンパニー リミテッド 抗ｃｄ１３７抗体およびその使用
JP7466930B2 (ja) 2018-10-19 2024-04-15 ディンフー バイオターゲット カンパニー リミテッド 抗ｃｄ１３７抗体およびその使用
JP2022510253A (ja) * 2018-11-30 2022-01-26 エービーエル バイオ インコーポレイテッド 抗－４－１ｂｂ抗体およびその用途
JP7378474B2 (ja) 2018-11-30 2023-11-13 エービーエル バイオ インコーポレイテッド 抗－４－１ｂｂ抗体およびその用途

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