JP2018520164A

JP2018520164A - プロテアソームインヒビターと組み合わせてｍｅｋインヒビターを投与することによりがんを処置する方法

Info

Publication number: JP2018520164A
Application number: JP2018500632A
Authority: JP
Inventors: チェンカイダイ，; ジジャンタン，
Original assignee: Jackson Laboratory
Current assignee: Jackson Laboratory
Priority date: 2015-07-09
Filing date: 2015-08-11
Publication date: 2018-07-26
Also published as: AU2015401587A1; WO2017007495A1; KR20180021198A; US20180369203A1; CA2991777A1

Abstract

ＭＥＫインヒビターをプロテアソームインヒビターと組み合わせて投与する工程を包含する、がんを処置するための方法が、ここで開示される。いくつかの実施形態において、上記がんは、固形腫瘍である。ある場合には、上記がんは、ＮＦ１、ＲＡＳ（Ｎ−ＲＡＳ、Ｋ−ＲＡＳおよびＨ−ＲＡＳを含む）、ＲＡＦ（Ａ−ＲＡＦ、Ｂ−ＲＡＦ、およびＣ−ＲＡＦを含む）、およびＭＥＫ（ＭＥＫ１およびＭＥＫ２を含む）の変異から選択される少なくとも１つの変異を有する。いくつかの実施形態において、上記がんは、プロテアソームインヒビターまたはＭＥＫインヒビターのうちの少なくとも一方での処置に抵抗性である。いくつかの実施形態において、併用療法は、相乗効果を生じる。

Description

この発明は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈによって付与された助成金第１ＤＰ２ＯＤ００７０７０号の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

分野
プロテアソームインヒビターと組み合わせてＭＥＫインヒビターでがんを処置するための方法。

背景
がん処置、特に、黒色腫のようながんを処置することが困難ながん処置は、その疾患の顕著な罹患率および死亡率なしに、患者が健康的な生活を取り戻す必要があるという臨床上の利益を達成するために、さらなる進展を要する。

さらなる研究は、がんの作用機構、および種々のクラスの薬剤の作用機構を理解するために必要とされている。これらの作用機構が一旦認識された後、新たな併用療法アプローチが、これらの作用機構に基づいてその薬剤の相互の効果を増強するために使用され得る。

環境からの攻撃に従って、細胞は、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）の生成を刺激する。このＨＳＰ誘導は、ヒートショック、またはタンパク質毒性ストレス応答（ＰＳＲ）の顕著な特徴である（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６）。分子シャペロンとして、ＨＳＰは、他のタンパク質の折りたたみ、輸送、および分解を促進する（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，２００８）。誤った折りたたみおよび凝集に対してプロテオームを守るにあたって、ＰＳＲは、タンパク質恒常性を保存する（Ｂａｌｃｈら，２００８）。

脊椎動物において、ヒートショック転写因子（ＨＳＦ）は、ＰＳＲを左右する。それらの中には、この応答の主要調節因子であるＨＳＦ１がある（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，２００８；Ｘｉａｏら，１９９９）。マルチステッププロセスとして、ＨＳＦ１活性化は、トリマー化、核トランスロケーション、翻訳後修飾、およびＤＮＡ結合を必要とする（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，２００８）。しかし、このプロセスの以前の理解は、不完全であった。

このＨＳＦ１媒介性ＰＳＲは、多くの病理的状態（高体温、重金属被毒（ｈｅａｖｙ−ｍｅｔａｌｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、虚血および再灌流、および酸化的損傷が挙げられる）に拮抗し、加齢および神経変性に影響を与える（Ｄａｉら，２０１２ａ）。ＨＳＦ１は、驚くべきことではないものの、長寿因子として作用する（Ｈｓｕら，２００３）。対照的に、本発明者らおよび他者の研究は、ＨＳＦ１の腫瘍形成促進（ｐｒｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）の役割を明らかにした（Ｄａｉら，２００７；Ｄａｉら，２０１２ｂ；Ｊｉｎら，２０１１；Ｍｅｎｇら，２０１０；Ｍｉｎら，２００７）。非ストレス条件下でのその非必須性にもかかわらず、ＨＳＦ１は、腫瘍細胞の増殖および生存に非常に重要である（Ｄａｉら，２００７）。にもかかわらず、悪性疾患におけるその活性化の根底にある機構は不明であった。

本明細書では、本発明者らは、ＲＡＳ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達がＰＳＲを厳密に調節することを報告する。それは、ＨＳＦ１をリン酸化し、活性化するＭＥＫである。ＭＥＫ阻害は、プロテオームを不安定化し、タンパク質凝集およびアミロイド生成を誘発する。コンビナトリアルプロテアソーム遮断は、この腫瘍抑制性アミロイド生成効果を強く増大させる。

ＭＥＫインヒビターは、プロテアソームインヒビターと同様に当該分野で公知であったが、本発明より前にそれらを組み合わせる理由も動機づけも存在せず、各処置は、効能のその制限（薬物耐性を含む）を有した。

これを理解して、本発明者らは、ＭＥＫインヒビターをプロテアソームインヒビターと組み合わせて投与する工程を包含する、がんを処置するための方法を開発した。本発明者らは、ＨＳＦ１を、ＭＥＫ（これは、ＨＳＦ１媒介性タンパク質毒性ストレス応答を抑制する）の新たな基質として同定した。本発明者らは、ＭＥＫ阻害がタンパク質恒常性を撹乱し、腫瘍抑制性アミロイド生成（ｔｕｍｏｒ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅａｍｙｌｏｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）を誘発することも見出した。本発明者らは、ＭＥＫインヒビターとプロテアソームインヒビターとの併用が、いずれかの処置単独にさらなる利点を提供すると考える。

Ｈｓｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３００、１１４２〜１１４５Ｄａｉら、Ｃｅｌｌ（２００７）１３０、１００５〜１０１８Ｄａｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２０１２）２２７、２９８２〜２９８７

要旨
記載によれば、がんを処置するための方法は、ＭＥＫインヒビターをプロテアソームインヒビターと組み合わせて投与する工程を包含する。

いくつかの実施形態において、上記がんは、固形腫瘍（例えば、胆道（胆管癌）、膀胱がん、脳のがん（ｂｒａｉｎｃａｎｃｅｒ）、乳がん、子宮頚がん（ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌、子宮内膜がん、類表皮がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ（ｓｔｏｍａｃｈ）ｃａｎｃｅｒ）、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、頭頚部がん、肝細胞がん（肝がん）、腎臓がん、肺がん、中皮腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、小児悪性疾患、前立腺がん、腎がん、肉腫、皮膚がん（黒色腫を含む）、小腸腺がん、小細胞肺がん、精巣がん、または甲状腺がんが挙げられるが、これらに限定されない）である。

場合によっては、上記がんは、ＮＦ１、ＲＡＳ（Ｎ−ＲＡＳ、Ｋ−ＲＡＳ、およびＨ−ＲＡＳを含む）、ＲＡＦ（Ａ−ＲＡＦ、Ｂ−ＲＡＦ、およびＣ−ＲＡＦを含む）、およびＭＥＫ（ＭＥＫ１およびＭＥＫ２を含む）の変異から選択される少なくとも１つの変異を有する。例えば、ＲＡＳ変異は、少なくともコドン１２、コドン１３、またはコドン６１にあり得る。いくつかの実施形態において、上記ＲＡＦ変異は、少なくともコドン６００にある。いくつかの実施形態において、上記ＭＥＫ１変異は、少なくともＰ１２４ＳもしくはＳ２０３Ｋであるか、または上記ＭＥＫ２変異は、少なくともＱ６０Ｐである。

いくつかの実施形態において、上記ＭＥＫインヒビターは、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、ビニメチニブ（ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ）（ＭＥＫ１６２）、ＰＤ−３２５９０１、コビメチニブ、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ−１０４０）、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ、レファメチニブ（ＲＤＥＡ１１９）、ＰＤ９８０５９、ＢＩＸ０２１８９、ピマセルチブ（ｐｉｍａｓｅｒｔｉｂ）（ＡＳ−７０３０２６）、ＳＬ−３２７、ＢＩＸ０２１８８、ＡＺＤ８３３０、ＴＡＫ−７３３、ホノキオール、またはＰＤ３１８０８８、ＰＤ０３２５９０１、ＷＸ−５５４、ＧＤＣ−０６２３、Ｅ６２０１、ＲＯ４９８７６５５、ＲＯ５１２６７６６である。

いくつかの実施形態において、上記プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブ、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン−３−ガレート、サリノスポラミドＡ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ（ｏｐｒｏｚｏｍｉｂ）（ＯＮＸ０９１２）、デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）、ＭＬＮ９７０８、エポキソミシン、ＭＧ１３２、イキサゾミブ（ＭＬＮ２２３８）、ＰＩ−１８４０、またはセラストロールである。

いくつかの実施形態において、上記プロテアソームインヒビターおよび上記ＭＥＫインヒビターは、いずれかの薬剤が単独で投与される場合に治療上の利益を引き起こさない投与量で投与される。いくつかの実施形態において、セルメチニブは、約５ｍｇ／Ｋｇで投与され、ボルテゾミブは、約０．５ｍｇ／Ｋｇで投与される。

いくつかの実施形態において、上記がんは、プロテアソームインヒビターまたはＭＥＫインヒビターのうちの少なくとも一方での処置に抵抗性である。いくつかの実施形態において、上記併用療法は、相乗効果を生じる。いくつかの実施形態において、上記がんは、プロテアソームインヒビターまたはＭＥＫインヒビターのうちの少なくとも一方での処置に抵抗性である。

さらなる目的および利点は、一部は以下の詳細な説明に示され、一部は、詳細な説明から明らかであるか、または実施することによって学習され得る。その目的および利点は、添付の特許請求の範囲の中で特に指摘されるエレメントおよび組み合わせによって実現されかつ獲得される。

前述の一般的説明および以下の詳細な説明の両方が、例示でありかつ例示に過ぎず、請求項の限定ではないことは、理解されるべきである。

添付の図面（これは、本明細書の中に組み込まれ、かつ本明細書の一部を構成する）は、一（いくつかの）実施形態を例証し、詳細な説明と一緒になって、本明細書で記載される原理を説明するのに役立つ。

図１Ａ〜Ｏは、ＭＥＫおよびＥＲＫが、ＰＳＲを反対方向に調節することを示す。（Ａ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、４３℃において３０分間ＨＳで、、１０μＭツバスタチンＡで５時間、４０μＭＶＥＲ１５５００８で１時間、５００ｎＭＭＧ１３２で１時間、２００ｎＭ１７−ＤＭＡＧで１時間、および２．５ｍＭアゼチジンで１５分間、処理した。（Ｂ）その二重ＥＬＫ１レポーター系（血清応答エレメント（ＳＲＥ）駆動性分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）プラスミドおよびＣＭＶ駆動性Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）プラスミドを含む）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトした。２４時間後、細胞を（Ａ）にあるように処理し、レポーター活性を測定する前に一晩回復させた（平均±ＳＤ、ｎ＝６、ＡＮＯＶＡ）。（ＣおよびＤ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、２０μＭＵ０１２６または２０ｎＭＡＺＤ６２４４で３時間処理し、続いて、ＨＳおよび４時間の回復を行った。ｍＲＮＡレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、スチューデントのｔ検定）。（Ｅ）ＨＳの直後に、（Ｃ）にあるように処理したＮＩＨ３Ｔ３細胞の核タンパク質を抽出して、ＥＬＩＳＡベースのアッセイによってＨＳＦ１−ＤＮＡ結合を測定した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（Ｆ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、二重ＨＳＦ１レポータープラスミド、ヒートショックエレメント（ＨＳＥ）駆動性ＳＥＡＰプラスミドおよびＣＭＶ−ＧＬｕｃプラスミドでトランスフェクトした。２４時間後、細胞を、２０μＭＵ０１２６、２０ｎＭＡＺＤ６２４４、１μＭＦＲ１８０２０４、または１００ｎＭＳｃｈ７７２９８４で３時間処理し、続いて、ＨＳを３０分間および一晩の回復を行った（平均±ＳＤ、ｎ＝６、ＡＮＯＶＡ）。（Ｇ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、種々のインヒビターで一晩処理した。（Ｈ）〜（Ｋ）ＬａｃＺまたはＭＥＫアイソフォームプラスミドを、二重ＨＳＦ１レポータープラスミドとともに、レンチウイルスｓｈＲＮＡを形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと共トランスフェクトした。２４時間後、細胞に、４３℃において３０分間ヒートショックを与え、続いて、一晩回復させた（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（Ｌ）〜（Ｏ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトし、続いて、ＨＳの前に二重ＨＳＦ１レポータープラスミドで２４時間トランスフェクトした（平均±ＳＤ、ｎ＝６、ＡＮＯＶＡ）。図８も参照のこと。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図２Ａ〜Ｊは、ＥＲＫ、ＭＥＫ、およびＨＳＦ１がストレス誘導性タンパク質複合体を形成することを示す。（ＡおよびＢ）４３℃において３０分間のＨＳの後、内因性ＨＳＦ１タンパク質を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から沈殿させた。ＷＣＬ：全細胞溶解物；ＨＣ：重鎖。（Ｃ）内因性ＭＥＫ１−ＨＳＦ１相互作用を、ＰＬＡによって、ＨｅＬａ細胞において、ウサギ抗ＭＥＫ１抗体およびマウス抗ＨＳＦ１抗体を使用して検出した。スケールバー：ＬＭに関しては５０μｍ、ＨＭに関しては１０μｍ。（ＤおよびＥ）内因性ＭＥＫ−ＨＳＦ１相互作用を、ＩＰによって、ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検出した。（Ｆ）内因性ＭＥＫ−ＨＳＦ１相互作用を、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で検出した。（Ｇ）内因性ＨＳＦ１−ＭＥＫ相互作用およびＨＳＦ１−ＧＦＰ−ＥＲＫ１相互作用を、示されたプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検出した。（Ｈ）３つの考えられるシナリオの模式的描写。Ｐ：リン酸化。（Ｉ）ＨＳの直後に、ＨＳＦ１−ＥＲＫ相互作用を、ｃｏ−ＩＰによって検出した。（Ｊ）内因性ＥＲＫ−ＨＳＦ１相互作用を、ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検出した。（ＫおよびＬ）内因性ＥＲＫ−ＭＥＫ相互作用およびＥＲＫ−ＨＳＦ１相互作用を、ＰＬＡによってＨｅＬａ細胞において検出した。スケールバー：ＬＭに関しては５０μｍ、ＨＭに関しては１０μｍ。図９も参照のこと。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図３Ａ〜Ｏは、ＭＥＫがＳｅｒ３２６をリン酸化して、ＨＳＦ１を活性化することを示す。（ＡおよびＢ）ＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６リン酸化を、ｓｈＲＮＡを安定して発現するかまたはＭＥＫ１^ＤＤプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてイムノブロットすることによって測定した。（Ｃ）ＧＦＰプラスミドまたはＭＥＫ１^ＤＤプラスミドを、二重ＨＳＦ１レポータープラスミドとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと共トランスフェクトした（平均±ＳＤ、ｎ＝５、スチューデントのｔ検定）。（Ｄ）コントロールまたはＥＲＫ標的化ｓｉＲＮＡ、Ａ（ｓｉＥＲＫ１＿１およびｓｉＥＲＫ２＿１）およびＢ（ｓｉＥＲＫ１＿３およびｓｉＥＲＫ２＿２）を、ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトした。（Ｅ）ＧＦＰプラスミドまたはＦＬＡＧ−ＨＳＦ１プラスミドを、二重ＨＳＦ１レポータープラスミドとともに、ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと共トランスフェクトした（平均±ＳＤ、ｎ＝６、ＡＮＯＶＡ）。（Ｆ）ＦＬＡＧ−ＨＳＦ１プラスミドを、ＨＳＦ１標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトした。ＨＳＦ１−ＤＮＡ結合を、抗ＦＬＡＧ抗体を使用して図１Ｅに記載されるようにＨＳ後に測定した。この結果を、核ＦＬＡＧ−ＨＳＦ１レベルに対して正規化した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、スチューデントのｔ検定）。（Ｇ）ＦＬＡＧ−ＨＳＦ１タンパク質を、２０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドで処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検出した。共発現したＧＦＰタンパク質は、内部コントロールとして働いた。（Ｈ）１００ｎｇ精製ＧＳＴ−ＭＥＫ１タンパク質を、Ｕ０１２６とともに室温において２０分間インキュベートし、続いて、４００ｎｇ精製Ｈｉｓ−ＨＳＦ１タンパク質とともに室温において３０分間インキュベートした。ＨＳＦ１リン酸化を、イムノブロッティングによって検出した。（Ｉ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から沈殿させたＥＲＫ複合体を、Ｕ０１２６またはＦＲ１８０２０４で処理し、続いて、４００ｎｇＨｉｓ−ＨＳＦ１、４００ｎｇＧＳＴ−ＥＲＫ１、または１０００ｎｇＭＢＰタンパク質とともにインキュベートした。（Ｊ）不活性ＧＳＴ−ＥＲＫ１タンパク質を、１００ｎｇＧＳＴ−ＭＥＫ１および４００ｎｇＨｉｓ−ＨＳＦ１タンパク質とともに室温において３０分間インキュベートした。（Ｋ）ＬａｃＺまたはＧＦＰ−ＥＲＫ１プラスミドを、ＭＥＫ１^ＷＴまたはＭＥＫ１^{Ｔ２９２Ａ，Ｔ３８６Ａ}プラスミドとともに、ＭＥＫ標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと共トランスフェクトした。（Ｌ）ＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６リン酸化を、示されたプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検出した。（Ｍ）ＨＳＦ１活性を、二重レポーター系によって、示されたプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検出した（平均±ＳＤ、ｎ＝６、ＡＮＯＶＡ）。（Ｎ）ＷＭ１１５細胞を、２０ｎＭＡＺＤ６２４４または２０μＭＵ０１２６で一晩処理した。（Ｏ）ＨＳＦ１ＣｈＩＰアッセイを、ＤＭＳＯまたは２０ｎＭＡＺＤ６２４４で一晩処理したＷＭ１１５細胞を使用して行った。その結果を、ＩｇＧコントロールの値に対して正規化した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。図１０も参照のこと。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図４Ａ〜Ｒは、ＭＥＫがタンパク質恒常性を保存することを示す。（Ａ）ＧＦＰプラスミドおよびＧＦＰ−ＧＲプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと共トランスフェクトし、続いて、２０ｎＭＡＺＤ６２４４、２０μＭＵ０１２６、または２００ｎＭ１７−ＤＭＡＧで４時間処理した。（Ｂ）ＧＦＰ−ＧＲプラスミドを、ＨＡ−Ｕｂ−Ｋ４８プラスミド（これは、タンパク質基質へとリジン４８を介してのみ結合体化し得る変異体ユビキチンをコードする）とともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと共トランスフェクトした。２０ｎＭＡＺＤ６２４４または２００ｎＭ１７−ＤＭＡＧで４時間処理した後に、ＧＦＰ−ＧＲタンパク質を沈殿させ、ユビキチン化を、抗ＨＡ抗体を使用して検出した。（Ｃ）変性ホタルルシフェラーゼを、ＤＭＳＯまたは２０ｎＭＡＺＤ６２４４で処理したＡ２０５８細胞の溶解物とともにインキュベートした（平均±ＳＤ、ｎ＝４、ＡＮＯＶＡ）。（Ｄ）Ａ２０５８細胞を、２０ｎＭＡＺＤ６２４４で処理し、ユビキチン化タンパク質を、界面活性剤可溶性および界面活性剤不溶性両方の画分において、Ｌｙｓ４８特異的ユビキチン抗体を使用して検出した。（Ｅ）ＬａｃＺまたはＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}を安定して発現するＡ２０５８細胞を、２０ｎＭＡＺＤ６２４４で８時間処理した。（Ｆ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＤＭＳＯまたはＡＺＤ６２４４を１週間に３回、２週間にわたってｉ．ｐ．注射した。Ｓ：脾臓；Ｋ：腎臓；Ｌ：肝臓。（Ｇ）ユビキチン化ペプチドのＭＳベースの定量の実験手順、１処理あたり２つの技術的複製物。（Ｈ）処理条件とコントロール条件との間のペプチド存在量における相対的変化の散布図。緑の線および赤の線は、２．５倍カットオフを示す。（Ｉ）６８種のタンパク質の分類を、ＰＡＮＴＨＥＲ遺伝子リスト分析ツール（ｐａｎｔｈｅｒｄｂ．ｏｒｇ）を使用して行った。（Ｊ）遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセスエンリッチメント分析を、ウェブベースのＥｎｒｉｃｈｒソフトウェアアプリケーションを使用して行った。（Ｋ）６８種のタンパク質の相互作用ネットワーク。公知のおよび推定されるタンパク質相互作用を、ＳＴＲＩＮＧデータベース（ｗｗｗ．ｓｔｒｉｎｇ−ｄｂ．ｏｒｇ）から導き出し、そのネットワークを、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅソフトウェアを使用して可視化した。（ＬおよびＭ）Ｖ５−ＴＯＲ１ＡＩＰ２プラスミドまたはＶ５−ＲＰＬ３プラスミドを、ＨＡ−Ｕｂ−Ｋ４８プラスミドとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと共トランスフェクトした。８時間の２０ｎＭＡＺＤ６２４４処理の後に、タンパク質を、抗Ｖ５抗体で沈殿させた。（Ｎ）ＡＺＤ６２４４処理の後、内因性ｃ−ＭＹＣタンパク質を、Ａ２０５８細胞から沈殿させ、抗ユビキチン抗体でイムノブロットした。（ＯおよびＰ）Ｖ５−ＲＰＬ１５プラスミドおよびＶ５−ＲＰＬ３プラスミドを、ＨＡ−Ｕｂ−Ｋ４８プラスミドとともに、ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと共トランスフェクトした。細胞を、８時間、５００ｎＭＭＧ１３２単独で処理したか、または２０ｎＭＡＺＤ６２４４とともに共処理した。（Ｑ）内因性ＲＰＬ１５およびＲＰＬ３タンパク質を、２０ｎＭＡＺＤ６２４４単独で処理したかまたは５００ｎＭＭＧ１３２とともに共処理したＡ２０５８細胞において検出した。（Ｒ）内因性ＲＰＬ１５およびＲＰＬ３タンパク質を、ＡＺＤ６２４４処理でＬａｃＺまたはＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}を安定して発現するＡ２０５８細胞において検出した。図１１も参照のこと。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図５Ａ〜Ｙは、ＭＥＫおよびプロテアソーム阻害がタンパク質凝集およびアミロイド生成を誘発することを示す。（Ａ〜Ｂ）２０ｎＭＡＺＤ６２４４、１００ｎＭボルテゾミブ、または両方で、２４時間処理したＷＭ１１５細胞を、Ｌｙｓ４８特異的ユビキチン抗体で染色した。矢尻は、ユビキチン陽性凝集物をマークする。スケールバー：１０μｍ。１細胞あたりの凝集物の量を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量した（メジアン、ｎ≧１００、ＡＮＯＶＡ）。（Ｃ〜Ｆ）ｐｏｌｙＱ７９プラスミド単独で、またはｐｏｌｙＱ７９プラスミドおよびＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}プラスミドの両方で、１日トランスフェクションを行った後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、（Ａ〜Ｂ）に記載されるとおりのインヒビターで処理した。細胞は、凝集物サイズに関して分析したか、または１０μＭＴｈＴで染色したのいずれかであった。（Ｇ）処理した腫瘍細胞株を、１０μＭＴｈＴで染色した。幾何平均を使用して、ＴｈＴ蛍光強度における倍数変化を計算し、そのｌｏｇ_２（ＦＣ）値を、ヒートマップとして示した。（Ｈ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＬａｃＺまたはｐｏｌｙＱ７９プラスミドでトランスフェクトした。処理後、ＡＯを、ＥＬＩＳＡによってＡ１１抗体を使用して定量した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（Ｉ）内在性のＡＯを、ヒト腫瘍細胞株において検出した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（ＪおよびＫ）ＬａｃＺまたはＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}を安定して発現するＡ２０５８細胞を、２４時間処理した。アミロイドを、ＥＬＩＳＡによって定量した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、スチューデントのｔ検定）。（Ｌ）２０μＭ合成Ａβ１−４２ペプチドを、室温において穏やかに振盪しながら、インヒビターで処理したＡ２０５８細胞の２０μｇ溶解物とともにインキュベートした。ＡＦ形成を、ＴｈＴ結合によってモニターした（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（Ｍ）ＴＥＭ研究（左パネルは８０，０００×、右パネルは２００，０００×）に関しては、２０μＭ合成Ａβ１−４２ペプチドを、３７℃において穏やかに振盪しながら２日間、ＰＢＳ中のＡ２０５８細胞溶解物とともにインキュベートした。スケールバー：１００ｎｍ。（Ｎ）種々のｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０μＭＴｈＴで染色した。（ＯおよびＰ）１０μＭＴｈＴとともに６時間予備インキュベートした後、Ａ２０５８細胞を、２４時間処理した。アミロイドを定量した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、スチューデントのｔ検定）。（ＱおよびＲ）１０μＭＴｈＴとともに６時間の予備インキュベーションまたはＪＢＳ−Ｐｒｏｔｅｏｄｕｃｉｎを使用して１６時間、１００ｎｇＡ１１抗体とともにトランスフェクションを行った後、Ａ２０５８細胞を、２４時間処理した。生細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）ブルーによって定量した（平均±ＳＤ、ｎ＝６、スチューデントのｔ検定）。（ＳおよびＴ）ＬａｃＺまたはＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}を安定して発現するＡ２０５８細胞を、ＤＭＳＯまたは２０ｎＭＡＺＤ６２４４で処理した。生細胞を定量した（平均±ＳＤ、ｎ＝６、ＡＮＯＶＡ）。処理後の生細胞における相対的変化を、各時点で、ＤＭＳＯ処理細胞の値に対してＡＺＤ６２４４処理細胞の値を正規化することによって計算した。（Ｕ）〜（Ｗ）２０ｎＭＡＺＤ６２４４、１００ｎＭボルテゾミブ、または両方での２４時間の処理後に、初代ＭＥＦおよびヒト細胞においてＡＯを定量した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（ＸおよびＹ）細胞を、５０μＭＱ−ＶＤ−ＯＰｈで一晩処理し、ＡＯを定量した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、スチューデントのｔ検定）。図１２も参照のこと。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図６Ａ〜Ｎは、ＭＥＫおよびプロテアソーム阻害を併用すると、強力な腫瘍抑制効果が発揮されることを示す。（Ａ）２０ｎＭＡＺＤ６２４４、１００ｎＭボルテゾミブ、または両方で２４時間処理した後、生細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）ブルーによって定量した（平均±ＳＤ、ｎ＝６、ＡＮＯＶＡ）。（ＢおよびＣ）１×１０^６Ａ２０５８細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにｓ．ｃ．注射した。７日後、マウスを、ＤＭＳＯ、５ｍｇ／ＫｇＡＺＤ６２４４、０．５ｍｇ／Ｋｇボルテゾミブ、またはその組み合わせで、１週間に３回ｉ．ｐ．注射を介して処理した。腫瘍容積を、毎週カリパスを使用して測定した（平均±ＳＥＭ、ＡＮＯＶＡ）。腫瘍増殖曲線を、指数関数的増殖モデルにフィットさせて、腫瘍倍加時間（ＤＴ）を導き出した。カプラン−マイアー生存曲線を、各群に関してプロットした（ログ−ランク検定）。（Ｄ）タンパク質を、イムノブロッティングによって検出した（１群あたり３腫瘍）。（Ｅ）腫瘍溶解物を使用して、ＡＯを定量した（１群あたり５腫瘍）（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（Ｆ）腫瘍溶解物を使用して、Ａβ１−４２ペプチドを播種した（１群あたり５腫瘍）（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（Ｇ〜Ｈ）腫瘍切片を、ＣＲで染色した（１群あたり５腫瘍）。１０個の無作為の視野を、各切片に対して取った。スケールバー：５０μｍ。各視野における合計ＣＲ蛍光を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量し、合計の核に対して正規化した（メジアン、ｎ＝５０、ＡＮＯＶＡ）。（Ｉ）ＣＲ染色後、腫瘍切片を、偏光顕微鏡法の下で可視化した。スケールバー：５０μｍ。（Ｊ）ＡＦ特異的抗体（ＯＣ）での染色後に、併用処置を受けた腫瘍の切片を、ＣＲでさらに染色した。スケールバー：５０μｍ。（Ｋ）ホタルルシフェラーゼ導入遺伝子を安定して発現する１×１０^６Ａ２０５８細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへとｉ．ｖ．注射した。６週間にわたって、（Ｂ）に記載されるように１日後に処理を開始した。体重を毎週モニターした（平均±ＳＤ、ｎ＝１０、ＡＮＯＶＡ）。（Ｌ）インビボでのバイオルミネッセンス画像化による転移の検出。（Ｍ）代表的顕微鏡写真は、肺、骨格筋、骨盤脂肪組織、および卵巣における転移黒色腫を図示する。Ｔ：腫瘍；Ｌ：肺；Ｍ：筋；Ｂ：骨；Ａ：脂肪組織；ＯＦ：卵胞。スケールバー：５００μｍ。（Ｎ）ＭＥＫおよびプロテアソーム阻害を併用すると、黒色腫転移が防止される（Ｂａｒｎａｒｄの正確検定）。図１３および表２も参照のこと。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図７Ａ〜Ｈは、アミロイド生成が腫瘍増殖を抑制することを示す。（Ａ）併用処置を受けた黒色腫の切片を、切断型カスパーゼ３抗体で染色し、続いて、ＣＲ染色を行った。矢尻および矢印は、それぞれ、縮合した核およびフラグメント化した核を示す。スケールバー：５０μｍ。（Ｂ）１×１０^６Ａ２０５８細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへとｓ．ｃ．注射した。７日後、マウスを、併用処置の１日前に、ｉ．ｐ．注射を介して１ｍｇ／３０ｇＣＲで処置した。腫瘍容積を毎週測定した（平均±ＳＤ、ＡＮＯＶＡ）。（Ｃ）ＣＲ処理腫瘍の溶解物は、４９８ｎｍでの吸光度を示した（１群あたり３腫瘍）（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。ＣＲを含む溶解緩衝液を、陽性コントロールとして供した。（Ｄ）カプラン−マイアー生存曲線を比較した（ログ−ランク検定）。（ＥおよびＦ）腫瘍溶解物の界面活性剤可溶性および界面活性剤不溶性両方の画分を使用して、アミロイドを定量した（１群あたり３腫瘍）（平均±ＳＤ、ｎ＝３、スチューデントのｔ検定）。（Ｇ）タンパク質を、イムノブロッティングによって検出した（１群あたり３腫瘍）。（Ｈ）ＭＥＫ、ＥＲＫ、およびＨＳＦ１の間の相互作用の模式的説明、ならびにプロテオーム安定性を調節することにおけるその役割。均衡のとれたタンパク質恒常性は、毒性タンパク質凝集およびアミロイド生成を抑制し、それによって、腫瘍生成を促進する。図１４も参照のこと。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図８Ａ〜Ｈは、ＭＥＫおよびＥＲＫがＰＳＲを反対に調節することを図示する。この図は、図１に関連する。（Ａ）細胞生存度は、タンパク質毒性ストレッサーへの一過性の曝露によって損なわれない。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、図１Ａに記載されるとおりの多様なストレッサーで処理した。細胞生存度を、ＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｅ^ＴＭフローサイトメーターによって、ＧｕａｖａＶｉａＣｏｕｎｔ^ＴＭ試薬を使用して測定した（平均±ＳＤ、ｎ＝５、スチューデントのｔ検定）。（Ｂ）ＭＥＫ遮断は、多様なタンパク質毒性ストレッサーによって引き起こされるＨＳＦ１活性化を抑制する。二重ＨＳＦ１レポータープラスミドでのトランスフェクション後に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、図１Ｂに記載されるとおりの多様なストレッサーで処理した。処理後、ストレッサーを除去し、細胞を、新鮮な培地とともに２４時間インキュベートし、その後、レポーター活性を測定した（平均±ＳＤ、ｎ＝５、スチューデントのｔ検定）。（Ｃ）ＭＥＫ遮断は、ＨＳＦ１活性化を損ない、ＥＲＫ遮断は、ＨＳＦ１活性化を増強する。ＧＦＰまたはＨＳＦ１プラスミドを二重ＨＳＦ１レポータープラスミドとともに共トランスフェクションした後に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２０μＭＵ０１２６、２０ｎＭＡＺＤ６２４４、１μＭＦＲ１８０２０４、または１００ｎＭＳｃｈ７７２９８４で２４時間処理し、その後、レポーター活性を測定した（平均±ＳＤ、ｎ＝６、ＡＮＯＶＡ）。（Ｄ）ＭＥＫおよびＥＲＫ両方の遮断は、ＥＬＫ１を不活性化する。二重ＥＬＫ１レポータープラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２０μＭＵ０１２６、２０μＭＵ０１２６、２０ｎＭＡＺＤ６２４４、１μＭＦＲ１８０２０４、または１００ｎＭＳｃｈ７７２９８４で２４時間処理し、その後レポーター活性を測定した（平均±ＳＤ、ｎ＝５、ＡＮＯＶＡ）。（ＥおよびＦ）ＥＲＫ１ノックダウンは、ＥＲＫ２ｍＲＮＡを低減しない。ＥＲＫ１ｍＲＮＡおよびＥＲＫ２ｍＲＮＡのレベルは、ＥＲＫ１標的化ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（ＧおよびＨ）ＥＲＫ２ノックダウンは、ＥＲＫ１ｍＲＮＡを低減しない。ＥＲＫ２ｍＲＮＡおよびＥＲＫ１ｍＲＮＡのレベルは、ＥＲＫ２標的化ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図９Ａ〜Ｆは、ＭＥＫがＨＳＦ１と物理的に相互作用することを示す。この図は、図２に関連する。（ＡおよびＢ）ＨＳＦ１を、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２と共沈させる。ＦＬＡＧ−ＨＳＦ１プラスミドを、ＨＡ−ＭＥＫ１またはＭＥＫ２−Ｖ５プラスミドのいずれかとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと共トランスフェクトした。ＨＡ−ＲａｐｔｏｒおよびＬａｃＺ−Ｖ５プラスミドは、陰性コントロールとして供した。４３℃において３０分間のヒートショック後に、ＨＳＦ１タンパク質を、抗ＦＬＡＧアフィニティー樹脂を使用して免疫沈降させた。（ＣおよびＤ）ＭＥＫ１およびＨＳＦ１抗体の検証。スクランブルまたはＭＥＫ１／２標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨｅＬａ細胞を、ウサギ抗ＭＥＫ１抗体で免疫染色した。スクランブルまたはＨＳＦ１標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨｅＬａ細胞を、マウス抗ＨＳＦ１抗体で免疫染色した。スケールバー：５０μｍ。（Ｅ）ＥＲＫは、ＨＳＦ１活性化を抑制する。ＧＦＰまたはＧＦＰ−ＥＲＫ１プラスミドを、二重ＨＳＦ１レポータープラスミドとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと共トランスフェクトした。２４時間後、細胞に、４３℃において３０分間のヒートショックを与え、続いて、一晩の回復を行った（平均±ＳＤ、ｎ＝６、スチューデントのｔ検定）。（Ｆ）ＥＲＫ１／２抗体の検証。ＨｅＬａ細胞を、コントロールまたはＥＲＫ１／２標的化（ｓｉＥＲＫ１＿３およびｓｉＥＲＫ２＿２を併用した）ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、細胞を、ウサギ抗ＥＲＫ１／２抗体で免疫染色した。スケールバー：５０μｍ。同上。同上。同上。同上。同上。

図１０Ａ〜Ｈは、ＭＥＫがＳｅｒ３２６でＨＳＦ１をリン酸化することを図示する。この図は、図３に関連する。（Ａ）ホスホ−ＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６抗体の検証。ＦＬＡＧ−ＨＳＦ１^ＷＴまたはＦＬＡＧ−ＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ａ}プラスミドのいずれかを、ＨＳＦ１標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトした。４３℃において３０分間のヒートショックを与えた後、リン酸化したおよび全ＨＳＦ１タンパク質を、イムノブロッティングによって検出した。（Ｂ）ＭＥＫ遮断は、ＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６リン酸化を損なう。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、２０μＭＵ０１２６で３時間処理し、続いて、４３℃において３０分間のヒートショックを与えた。ＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６リン酸化を、イムノブロッティングによって検出した。（Ｃ）ＭＥＫ遮断は、ＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６リン酸化を損ない、ＥＲＫ遮断は、ＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６リン酸化を増強する。２０μＭＵ０１２６、２０ｎＭＡＺＤ６２４４、１μＭＦＲ１８０２０４、または１００ｎＭＳｃｈ７７２９８４で一晩処理した後、ＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６リン酸化を、イムノブロッティングによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検出した。（Ｄ〜Ｅ）Ｓ３２６Ａ変異は、ＨＳＦ１核トランスロケーションを損なう。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＦＬＡＧ−ＨＳＦ１^ＷＴプラスミドまたはＦＬＡＧ−ＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ａ}プラスミドでトランスフェクトした。４３℃において３０分間のヒートショックを与えた後、細胞性ＦＬＡＧタグ付きＨＳＦ１タンパク質を、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体で免疫染色し、画像を、蛍光顕微鏡法によって取り込んだ。スケールバー：ＬＭに関しては５０μｍ、ＨＭに関しては１０μｍ。細胞質および核蛍光シグナルを、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ細胞画像分析ソフトウェアを使用して定量し、Ｃ／Ｎ比として計算した（メジアン、ｎ＞１５０、ＡＮＯＶＡ）。（Ｆ）急性のＭＥＫ枯渇は、ＨＳＦ１タンパク質を減少させる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、スクランブルまたはＭＥＫ１／２標的化ｓｈＲＮＡで４日間、一過性にトランスフェクトした。ＨＳＦ１タンパク質を、イムノブロッティングによって検出した。（Ｇ）ＥＲＫ媒介性ＨＳＦ１Ｓｅｒ３０７リン酸化は、ＭＥＫに依存する。スクランブルまたはＭＥＫ１／２標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、図３Ｄに記載されるように、ＥＲＫ１／２標的化ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ホスホ−ＨＳＦ１Ｓｅｒ３０７のレベルを、イムノブロッティングによって測定した。（Ｈ）ＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６リン酸化は、Ｓｅｒ３０７リン酸化を阻害する。ＨＳＦ１標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＦＬＡＧ−ＨＳＦ１^ＷＴプラスミドまたはＦＬＡＧ−ＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}プラスミドでトランスフェクトした。８時間の２０ｎＭＡＺＤ６２４４処理後、ＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６およびＳｅｒ３０７リン酸化を、イムノブロッティングによって検出した。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図１１Ａ〜Ｐは、ＭＥＫがプロテオーム安定性を調節することを示す。この図は、図４に関連する。（Ａ）ＨＳＦ１は、ＧＲ−ＧＦＰタンパク質を安定化する。ＧＲ−ＧＦＰプラスミドおよびＨＡ−Ｕｂ−Ｋ４８プラスミドの両方を、ＬａｃＺプラスミドまたはＦＬＡＧ−ＨＳＦ１プラスミドとともに、スクランブルまたはＨＳＦ１標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと共トランスフェクトした。ＨＡ−Ｕｂ−Ｋ４８プラスミドは、リジン４８を介してのみタンパク質基質に結合体化され得る変異体ユビキチンをコードする。ＧＦＰ−ＧＲタンパク質を沈殿させ、ユビキチン化を、抗ＨＡイムノブロッティングによって検出した。（Ｂ）ＨＳＦ１は、細胞のシャペロン能（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙ）を維持する。変性ホタルルシフェラーゼを、ＬａｃＺプラスミドまたはＦＬＡＧ−ＨＳＦ１プラスミドでトランスフェクトしたスクランブルまたはＨＳＦ１標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出したタンパク質とともにインキュベートした（平均±ＳＤ、ｎ＝５、ＡＮＯＶＡ）。（Ｃ）ＭＥＫ遮断は、ＧＲタンパク質を不安定化する。ＧＦＰプラスミドおよびＧＲ−ＧＦＰプラスミドで共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２００ｎＭ１７−ＤＭＡＧ、２０ｎＭＡＺＤ６２４４、または１００ｎＭボルテゾミブで４時間処理した。ＧＦＰおよびＧＲ−ＧＦＰタンパク質のレベルを、イムノブロッティングによって検出した。（ＤおよびＥ）ＭＥＫ阻害は、プロテアソーム活性に全く影響を有しない。２０μＭＵ０１２６、２０ｎＭＡＺＤ６２４４、または１００ｎＭボルテゾミブで４時間処理した後に、Ａ２０５８細胞（Ｄ）およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｅ）におけるキモトリプシン様の、トリプシン様の、およびカスパーゼ様のプロテアソーム活性を、それぞれ、２５μＭＺ−ＬＬＬ−ＡＭＣ、Ｂｏｃ−ＬＲＲ−ＡＭＣ、およびＺ−ＬＬＥ−ＡＭＣ基質を使用してインビトロで測定した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（Ｆ）ＭＥＫ欠損は、細胞のシャペロン能を減少させる。インビトロルシフェラーゼ再折りたたみアッセイを、スクランブルまたはＭＥＫ１／２標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物を使用して行った（平均±ＳＤ、ｎ＝５、ＡＮＯＶＡ）。（Ｇ）ＨＳＦ１は、タンパク質ユビキチン化を抑制する。ＬａｃＺプラスミドまたはＦＬＡＧ−ＨＳＦ１プラスミドを、スクランブルまたはＨＳＦ１標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトした。Ｌｙｓ４８特異的タンパク質ユビキチン化を、イムノブロッティングによって、界面活性剤可溶性および界面活性剤不溶性両方の画分において検出した。（Ｈ）ＡＺＤ６２４４は、ＨＳＦ１ユビキチン化を促進する。Ａ２０５８細胞を、２０ｎＭＡＺＤ６２４４で処理した。内因性ＨＳＦ１タンパク質を免疫沈降させ、抗ユビキチン抗体でブロットした。（Ｉ）ＭＥＫ欠損は、タンパク質ユビキチン化を促進する。Ｌｙｓ４８特異的タンパク質ユビキチン化を、イムノブロッティングによって、スクランブルまたはＭＥＫ１／２標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の界面活性剤可溶性および界面活性剤不溶性両方の画分において検出した。（Ｊ）Ｓ３２６Ｄ変異は、ＨＳＦ１タンパク質を、ＡＺＤ６２４４誘導性不安定化に対して抵抗性にする。ＬａｃＺまたはＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}を安定して発現するＡ２０５８細胞を、２０ｎＭＡＺＤ６２４４で一晩処理した。（Ｋ）質量分析法による分析の再現性。技術的複製物の変動係数（ＣＶ）の分布のヒストグラムをプロットした。（Ｌ）〜（Ｎ）ＭＥＫ阻害は、リボソームタンパク質レベルを低減する。Ｖ５タグ付きリボソームタンパク質およびＨＡ−Ｕｂ−Ｋ４８を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において共発現させた。２０ｎＭＡＺＤ６２４４で８時間処理した後に、リボソームタンパク質を、抗Ｖ５抗体で免疫沈降させ、これらリボソームタンパク質のユビキチン化を、イムノブロッティングによって抗ＨＡ抗体で検出した。（ＯおよびＰ）ＭＥＫおよびＨＳＦ１欠損は、リボソームタンパク質を不安定化する。内因性ＲＰＬ１５およびＲＰＬ３タンパク質を、２４時間の５００ｎＭＭＧ１３２処理ありまたはなしで、スクランブル、ＭＥＫ１／２標的化ｓｈＲＮＡ、またはＨＳＦ１標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検出した。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図１２Ａ〜Ｕは、ＭＥＫおよびプロテアソーム阻害がタンパク質恒常性を撹乱することを示す。この図は、図５に関連する。（Ａ〜Ｂ）ＡＺＤ６２４４は、黒色腫細胞においてＨＳＦ１タンパク質を枯渇させる。ＷＭ１１５およびＡ２０５８細胞を、２０ｎＭＡＺＤ６２４４、１００ｎＭボルテゾミブ、または両方で２４時間処理した。（Ｃ）タンパク質凝集物サイズの定量。ＬａｃＺプラスミドまたはｐｏｌｙＱ７９プラスミドでのトランスフェクションの４日後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の界面活性剤不溶性画分を抽出して、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ^ＴＭ３コールターカウンターを使用して粒子サイズを定量した。（Ｄ）ＨＳＦ１は、タンパク質凝集を抑制する。スクランブルまたはＨＳＦ１標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐｏｌｙＱ７９およびＬａｃＺまたはＦＬＡＧ−ＨＳＦ１プラスミドで２日間、共トランスフェクトした。凝集物サイズを測定した。（ＥおよびＦ）ＴｈＴおよびＣＲによる無傷の細胞におけるアミロイドの検出。ＬａｃＺまたはｐｏｌｙＱ７９プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０μＭＴｈＴ（Ｅ）または５０ｎＭＣＲ（Ｆ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｇ）処理後に、ＷＭ１１５細胞における内因性アミロイドを、ＣＲ染色によって検出した。（ＨおよびＩ）ＨＳＦ１は、アミロイド生成を抑制する。スクランブルまたはＨＳＦ１標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＬａｃＺまたはＨＳＦ１プラスミドのいずれかでトランスフェクトした。アミロイドオリゴマーおよび原線維のレベルを、ＥＬＩＳＡによって定量した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（Ｊ）ＨＳＦ１欠損細胞は、増強したアミロイド播種能を示す。２０μＭ合成Ａβ１−４２ペプチドを、スクランブルまたはＨＳＦ１標的化ｓｈＲＮＡを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の２０μｇ溶解物とともに、室温において穏やかに振盪しながらインキュベートした。アミロイド形成を、ＴｈＴ結合によってモニターした（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（Ｋ）ＭＥＫおよびプロテアソームインヒビターで処理したＡ２０５８細胞の溶解物は、増強した播種能を示す。合成Ａβ１−４２ペプチドを、ＤＭＳＯ、２０ｎＭＡＺＤ６２４４、１００ｎＭボルテゾミブ、ならびに２０ｎＭＡＺＤ６２４４および１００ｎＭボルテゾミブの併用で処理したＡ２０５８細胞の溶解物とともにインキュベートした。アミロイド原線維を、可溶性および不溶性両方の画分においてＥＬＩＳＡによってアミロイド原線維特異的（ＯＣ）抗体を使用して検出した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（ＬおよびＭ）ＰＳＭＢ５ノックダウンは、プロテアソーム機能を損ない、アミロイド播種を増強する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２種の独立したＰＳＭＢ５標的化ｓｈＲＮＡでトランスフェクトした。（Ｎ）〜（Ｒ）ＭＥＫおよびプロテアソームの遺伝的阻害は、タンパク質恒常性を撹乱し、アミロイド生成を誘発する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＭＥＫ１／２、ＰＳＭＢ５、または両方を標的化するレンチウイルスｓｈＲＮＡで形質導入した。タンパク質恒常性の撹乱を、増大したタンパク質ユビキチン化によって証明した（Ｎ）。アミロイド生成効果を、インビトロアミロイド播種アッセイ（Ｏ、平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ、およびＰ）ならびに内因性ＡＯおよびＡＦレベルの定量（ＱおよびＲ、平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）によって測定した。ＴＥＭ研究（Ｐ、左パネル８０，０００×、右パネル２００，０００×）に関しては、２０μＭ合成Ａβ１−４２ペプチドを、ＰＢＳ中の細胞溶解物とともに、３７℃において穏やかに撹拌しながら２６時間インキュベートした。スケールバー：１００ｎｍ。注意すべきは、スクランブル細胞の溶解物での播種のみが、乱れた短いプロトフィブリル（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌ）の形成を生じた。対照的に、ＭＥＫ欠損またはＰＳＭＢ５欠損細胞の溶解物での播種は、線維様構造または豊富な成熟原線維の密な格子を生じた。（Ｓ）ＣＲは、ＭＥＫおよびプロテアソームインヒビターで処理した黒色腫細胞の増殖および生存を改善する。Ａ２０５８細胞を、１０μＭＣＲおよび種々のインヒビターで２４時間共処理した。生細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒブルー（登録商標）試薬によって定量した（平均±ＳＤ、ｎ＝６、スチューデントのｔ検定）。（Ｔ）主要組織は、ＭＥＫ阻害によって誘導されるアミロイド生成に抵抗性である。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、種々の用量のＡＺＤ６２４４で処理し、種々の組織中のアミロイドオリゴマーのレベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した（平均±ＳＤ、ｎ＝２、ＡＮＯＶＡ）。（Ｕ）重篤なタンパク質毒性ストレスは、ＭＥＦにおいてアミロイド生成を誘導し得る。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、種々の濃度のボルテゾミブで２４時間処理した。内因性アミロイドオリゴマーのレベルを、ＥＬＩＳＡによって定量した（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図１３Ａ〜Ｊは、ＭＥＫおよびプロテアソーム阻害の併用が、タンパク質恒常性を撹乱し、インビボ腫瘍増殖を妨げることを図示する。この図は、図６に関連する。（Ａ）ＡＺＤ６２４４およびボルテゾミブ処置の併用は、黒色腫増殖を強力に抑制する。腫瘍を、マウスを屠殺したときに解剖し、秤量した（平均±ＳＤ、ＡＮＯＶＡ）。（Ｂ）ＡＺＤ６２４４およびボルテゾミブ処置の併用は、体重減少を防止する。異種移植前および屠殺時に体重を記録した。腫瘍重量を、総体重から差し引いて、異種移植後の正味の体重を導き出した。結果を、異種移植前後の体重変化として表す（対応のあるスチューデントのｔ検定）。（Ｃ〜Ｆ）ＡＺＤ６２４４は、ボルテゾミブ誘導性ＰＳＲを抑制し、タンパク質ユビキチン化を増大させる。イムノブロッティングの定量から、図６Ｄを得た（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（Ｇ）アミロイドオリゴマーのレベルは、腫瘍重量と反対に相関する。（Ｈ）ＡＺＤ６２４４およびボルテゾミブ処置の併用は、腫瘍のＴｈＴ染色を顕著に増強する。核を、ＳＹＴＯ６２で染色した。スケールバー：５０μｍ。（Ｉ）ＡＺＤ６２４４およびボルテゾミブ処置の併用は、正常組織においてアミロイド生成を誘導しない。アミロイドオリゴマーを、１群あたり３個のマウス脾臓において、ＥＬＩＳＡによってアッセイした（平均±ＳＤ、ｎ＝３、ＡＮＯＶＡ）。（Ｊ）ＡＺＤ６２４４およびボルテゾミブ処置の併用は、タンパク質ユビキチン化を増大させるが、マウス脾臓においてアポトーシスを誘導しない。Ｌｙｓ４８特異的タンパク質ユビキチン化およびカスパーゼ３切断を、イムノブロッティングによって、１群あたり３個の脾臓において測定した。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。

図１４Ａ〜Ｂは、ＣＲ処置が腫瘍増殖を促進し、ＭＥＫおよびプロテアソーム阻害の併用によって課された腫瘍抑制に拮抗することを示す。この図は、図７に関連する。（Ａ）ＣＲ処置は、インビボでの黒色腫増殖を刺激し、黒色腫をＭＥＫおよびプロテアソーム阻害の併用に対して部分的に抵抗性にする。腫瘍を屠殺時に採取し、秤量した（平均±ＳＤ、ｎ＝１０、ＡＮＯＶＡ）。（Ｂ）ＣＲ処置は、腫瘍を有するマウスにおいて体重減少を増悪させる。異種移植前および屠殺時に、体重を記録した。黒色腫を有するマウスの正味の体重を導き出すために、腫瘍重量を、総体重から差し引いた。結果を、異種移植前後の体重変化として表す（対応のあるスチューデントのｔ検定）。同上。

配列の説明
表１は、本明細書で参照されるある特定の配列のリストを提供する。

実施形態の説明
Ｉ．がんを処置するための方法
がんを処置するための方法は、ＭＥＫインヒビターをプロテアソームインヒビターと組み合わせて投与する工程を包含する。本発明者らは、ＨＳＦ１をＭＥＫ（これは、ＨＳＦ１媒介性タンパク質毒性ストレス応答を活性化する）の新たな基質として同定した。本発明者らはまた、ＭＥＫ阻害がタンパク質恒常性を撹乱し、腫瘍抑制性アミロイド生成を誘発することを見出した。本発明者らは、ＭＥＫインヒビターとプロテアソームインヒビターとの併用が、さらなる利点を提供すると考える。

いくつかの実施形態において、上記がんは、固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、上記固形腫瘍は、胆道（胆管癌）、膀胱がん、脳のがん、乳がん、子宮頚がん、結腸直腸癌、子宮内膜がん、類表皮がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、頭頚部がん、肝細胞がん（肝がん）、腎臓がん、肺がん、中皮腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、小児悪性疾患、前立腺がん、腎がん、肉腫、皮膚がん（黒色腫を含む）、小腸腺がん、小細胞肺がん、精巣がん、または甲状腺がんである。いくつかの実施形態において、上記固形腫瘍は、黒色腫である。

上記方法は、上記がんが少なくとも１つの変異を有する場合にさらなる利点を提供し得る。例えば、上記がんは、ＮＦ１、ＲＡＳ（Ｎ−ＲＡＳ、Ｋ−ＲＡＳ、およびＨ−ＲＡＳを含む）、ＲＡＦ（Ａ−ＲＡＦ、Ｂ−ＲＡＦ、およびＣ−ＲＡＦを含む）、およびＭＥＫ（ＭＥＫ１およびＭＥＫ２を含む）の変異から選択される少なくとも１つの変異を有し得る。

ＲＡＳ変異は、少なくともコドン１２、コドン１３、またはコドン６１にあり得る。ＲＡＦ変異は、少なくともコドン６００にあり得る。ＭＥＫ１変異は、少なくともＰ１２４ＳまたはＳ２０３Ｋにあり得る。ＭＥＫ２変異は、少なくともＱ６０Ｐにあり得る。患者サンプルにおける変異は、公知のおよび利用可能な技術を使用して決定され得る。

上記ＭＥＫインヒビターは、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２）、ＰＤ−３２５９０１、コビメチニブ、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ−１０４０）、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ、レファメチニブ（ＲＤＥＡ１１９）、ＰＤ９８０５９、ＢＩＸ０２１８９、ピマセルチブ（ＡＳ−７０３０２６）、ＳＬ−３２７、ＢＩＸ０２１８８、ＡＺＤ８３３０、ＴＡＫ−７３３、ホノキオール、またはＰＤ３１８０８８、ＰＤ０３２５９０１、ＷＸ−５５４、ＧＤＣ−０６２３、Ｅ６２０１、ＲＯ４９８７６５５、ＲＯ５１２６７６６から選択され得るが、これらに限定されない。

上記プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブ、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン−３−ガレート、サリノスポラミドＡ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ（ＯＮＸ０９１２）、デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）、ＭＬＮ９７０８、エポキソミシン、ＭＧ１３２、イキサゾミブ（ＭＬＮ２２３８）、ＰＩ−１８４０、またはセラストロールから選択され得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、上記プロテアソームインヒビターおよび上記ＭＥＫインヒビターは、いずれかの薬剤が単独で投与される場合に治療上の利益を引き起こさない投与量で投与される。いくつかの実施形態において、上記セルメチニブは、５ｍｇ／Ｋｇで投与され得、上記ボルテゾミブは、０．５ｍｇ／Ｋｇで投与され得る。

上記方法は、上記がんが、プロテアソームインヒビターまたはＭＥＫインヒビターのうちの少なくとも一方での処置に抵抗性である場合にさらなる利点を示し得る。いくつかの実施形態において、上記併用療法は、相乗効果を生じ得る。いくつかの実施形態において、上記がんは、プロテアソームインヒビターまたはＭＥＫインヒビターのうちの少なくとも一方（ＭＥＫインヒビターなしで投与されるプロテアソームインヒビターおよび／またはプロテアソームインヒビターなしで投与されるＭＥＫインヒビターを意味する）での処置に対して抵抗性であるが、上記２種の薬剤の併用は、一方または両方が単独で関連し得る抵抗性を克服する。
ＩＩ．薬学的組成物および投与
上記ＭＥＫインヒビターおよび上記プロテアソームインヒビターは、別個の組成物において調製され得るか、またはそれらは、単一の合わされた投与形態へと製剤化され得る。例えば、上記インヒビターは、錠剤またはカプセル剤として調製され得る。両方の薬剤は、単一の錠剤もしくはカプセル剤の中に、二層錠剤もしくはカプセル剤の中の別個の区画として、または別個の錠剤またはカプセル剤の中に、共製剤化され得る。別の実施形態において、上記インヒビターは、非経口投与経路を介する投与前に、注射用水で混合されるべき乾燥粉末化形態で調製され得る。このような実施形態において、それらは、同じバイアルの中に共製剤化されてもよいし、それらは患者への投与のために別個に調製されてもよい。
上記インヒビターが別個に製剤化される場合、それらは、同時にまたは逐次的な順序で（同日にまたは異なる日に、のいずれも含む）投与され得る。

実施例１．実験手順
Ａ．近傍ライゲーションアッセイ
細胞を、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで、１５分間室温において固定した。０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ中の５％ヤギ血清でブロッキングした後、細胞を、ブロッキング緩衝液中で１：２００希釈した１対のウサギおよびマウス一次抗体とともに、一晩４℃においてインキュベートした。Ｄｕｏｌｉｎｋ^{（登録商標）}ＰＬＡ^{（登録商標）}抗ウサギプラスおよび抗マウスマイナスプローブ（ＯＬＩＮＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに３７℃において１時間インキュベートした後、ライゲーション、ローリングサークル増幅、および検出を、Ｄｕｏｌｉｎｋ^{（登録商標）} ＩｎＳｉｔｕＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔｓＲｅｄ（ＯＬＩＮＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して行った。核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。シグナルを、ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ５共焦点顕微鏡を使用して可視化した。

Ｂ．腫瘍切片のＣＲおよびＴｈＴ染色
脱パラフィン化および再湿潤化（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）の後に、腫瘍切片を、ＰＢＳ中の０．５％ＣＲで室温において２０分間染色し、続いて、アルカリ性溶液（０．０１％ＮａＯＨ、５０％アルコール）中で区別した。核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２またはヘマトキシリンのいずれかで染色した。ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ５共焦点顕微鏡を使用して蛍光を可視化し、偏光フィルタを装備したＬｅｉｃａＤＭ５０００Ｂ正立顕微鏡を使用して複屈折を可視化した。ＴｈＴ染色のために、切片を、ＰＢＳ中の０．２％ＴｈＴで室温において１０分間染色し、１％酢酸中で２分間すすぎ、ｄｄＨ_２Ｏで３回洗浄した。核を、ＳＹＴＯ（登録商標）６２（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。

Ｃ．黒色腫異種移植片モデル
Ａ２０５８細胞を、９週齢の雌性ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞／Ｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス（ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）の左側腹部にｓ．ｃ．注射した。ＣＲ処置のために、マウスに、ＡＺＤ６２４４およびボルテゾミブ処置の併用の１日前に、ＰＢＳまたはＣＲをｉ．ｐ．注射した。腫瘍容積を、式４／３πＲ^３に従って計算した。実験的転移のために、操作したＡ２０５８細胞を、１０週齢の雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへと、尾静脈注射を介して移植した。全てのマウス実験を、ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ動物実験委員会によって承認されるプロトコルの下で行った。

Ｄ．統計方法
全ての統計分析を、Ｐｒｉｓｍ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を使用して行った。統計的有意性：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。

Ｅ．補足実験手順
１．配列
ｑＲＴ−ＰＣＲのためのプライマー配列を表１（配列番号１〜２２）に提供し、ＣｈＩＰのためのプライマー配列を表１（配列番号２３〜３２）に提供する。

２．細胞、組織および試薬
ＷＭ１１５、ＷＭ２７８、およびＡ２０５８を除く全ての腫瘍細胞株は、以前に記載された（Ｄａｉら，２００７）。ＷＭ１１５およびＷＭ２７８細胞は、ＬｕｋｅＷｈｉｔｅｓｅｌｌ博士から親切にも贈られた。Ａ２０５８細胞は、ＡＴＣＣから購入した。全ての細胞培養物を、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ中で維持した。初代ヒト乳腺上皮細胞（ＰＨＭＣ）を、Ｌｏｎｚａから購入し、完全乳腺上皮細胞培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でポリ−Ｌ−リジン被覆プレート上で培養した。初代ヒトシュワン細胞（ＰＨＳＣ）を、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、完全シュワン細胞培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でポリ−Ｌ−リジン被覆プレート上で培養した。

ＨＳＰ７２（ＡＤＩ−ＳＰＡ−８１２）、ＨＳＰ２５（ＡＤＩ−ＳＰＡ−８０１）、ＨＳＰ２７（Ｇ３．１）、およびホスホ−ＭＢＰＴ９８（Ｐ１２）に対する抗体を、Ｅｎｚｏ（登録商標）ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓから購入した；ラットモノクローナルＨＳＦ１（１０Ｈ８）抗体、マウスモノクローナルＨＳＦ１（Ｅ−４）抗体、ウサギＨＳＦ１抗体（Ｈ−３１１）、ウサギｐ−ＨＳＦ１Ｓｅｒ３０７、ウサギＭＥＫ１抗体（Ｃ−１８）、ウサギＭＥＫ２抗体（Ｎ−２０）、ユビキチン抗体（Ｐ４Ｄ１）−ＨＲＰ、およびウサギｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｎ−２６２）を、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した；全ＭＥＫ１／２（Ｄ１Ａ５）、ホスホ−ＭＥＫ１／２Ｓ２１８／２２２（４１Ｇ９）、全ＥＲＫ１／２（１３７Ｆ５）、ホスホ−ＥＲＫ１／２Ｔ２０２／Ｙ２０４（Ｄ１３．１４．４Ｅ）、ホスホ−ＭＳＫ１Ｔ５８１、ＭＥＫ１（６１Ｂ１２）、切断型カスパーゼ３Ａｓｐ１７５（Ｄ３Ｅ９）、ＧＦＰ（Ｄ５．１）、およびＧＳＴタグ（９１Ｇ１）に対する抗体は、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製であった；ホスホ−ＭＥＫ１Ｔ２９２、ホスホ−ＭＥＫ１Ｔ３８６、およびＬｙｓ４８特異的ユビキチン（Ａｐｕ２）に対する抗体は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製であった；そして全ＭＳＫ１抗体、βアクチン抗体−ＨＲＰ、ＧＡＰＤＨ抗体−ＨＲＰ、ＨＡ抗体−ＨＲＰ、およびＦＬＡＧ抗体−ＨＲＰの結合体は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ製であった。ｐ−ＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６（ＥＰ１７１３Ｙ）、６×Ｈｉｓタグ（ＧＴ３５９）、ＲＰＬ１５、およびＲＰＬ３に対する抗体は、ＧｅｎｅＴｅｘ製であった。マウスモノクローナル抗Ｖ５抗体は、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製であった。

以下の化学物質を、商業的供給源から購入した：Ｕ０１２６（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＦＲ１８０２０４（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、（Ｓ）−ＭＧ１３２（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ）、ＶＥＲ１５５００８（ＴｏｃｒｉｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１７−ＤＭＡＧ（ＬＣＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ボルテゾミブ（ＬＣＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＡＺＤ６２４４（ＣｈｅｍｉｅＴｅｋ）、ツバスタチンＡ（ＣｈｅｍｉｅＴｅｋ）、アゼチジン（ＢａｃｈｅｍＡｍｅｒｉｃａｓ）、およびＱ−ＶＤ−ＯＰＨ（ＡＰＥｘＢｉｏ）。

以下の精製組換えタンパク質を、商業的供給源から購入した：Ｈｉｓタグ付きヒトＨＳＦ１タンパク質（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）；ＧＳＴおよびＧＳＴタグ付き活性ヒトＭＥＫ１（ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ）；ＧＳＴタグ付き不活性ヒトＥＲＫ１タンパク質（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ならびにウシミエリン塩基性タンパク質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。

細胞質画分および核画分を、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＮＥ−ＰＥＲ核タンパク質抽出キットを使用して調製した。

この研究において使用されるプラスミドは、以下を含む：ｐＬｅｎｔｉ６−ＬａｃＺ−Ｖ５およびｐＬｅｎｔｉ６−ＭＥＫ２−Ｖ５（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ反応を介してｐＤＯＮＲ２２３ベクターから生成）、ＮａｔａｌｉｅＡｈｎのｐＭＣＬ−ＨＡ−ＭＥＫ１（Ａｄｄｇｅｎｅ＃４０８０８）、ｐＭＣＬ−ＨＡ−ＭＥＫ１Ｔ２９２Ａ、Ｔ３８６Ａ（ＨＡ−ＭＥＫ１部位指向性変異誘発によって生成）、ＲｏｎｙＳｅｇｅｒのｐＧＦＰ−ＥＲＫ１（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１４７４７）、ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．のｐＨＳＥ−ＳＥＡＰおよびｐＳＲＥ−ＳＥＡＰ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．のｐＣＭＶ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、ＪｕｎｙｉｎｇＹｕａｎのＨＡ−Ｑ７９−ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃２１１５９）、ＨＡ−Ｑ７９（ＧＦＰ配列を除去することによってＨＡ−Ｑ７９−ＧＦＰプラスミドから生成）、ＤａｖｉｄＳａｂａｔｉｎｉのｐＲＫ５−ＨＡ−Ｒａｐｔｏｒ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃８５３１）、ＩａｎＭａｃａｒａのｐＫ７−ＧＲ−ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１５５３４）、ＴｅｄＤａｗｓｏｎのｐＲＫ５−ＨＡ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−Ｋ４８（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１７６０５）、ｐＬＸ３０４−ＴＯＲ１ＡＩＰ２−Ｖ５（ＤＮＡＳＵ＃ＨｓＣＤ００４３６６８０）、ｐＬＸ３０４−ＲＰＬ３−Ｖ５（ＤＮＡＳＵ＃ＨｓＣＤ００４３５１３９）、ｐＬＸ３０４−ＲＰＬ１５−Ｖ５（ＤＮＡＳＵ＃ＨｓＣＤ００４３９８０２）、ｐＬＸ３０４−ＲＰＳ２０−Ｖ５（ＤＮＡＳＵ＃ＨｓＣＤ００４４３００７）、ｐＬＸ３０４−ＲＰＬ２４−Ｖ５（ＤＮＡＳＵ＃ＨｓＣＤ００４４２９９５）、ＲｏｂｅｒｔＫｉｎｇｓｔｏｎのｐＢａｂｅ−ＦＬＡＧ−ＨＳＦ１（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１９４８）、ｐＢａｂｅ−ＦＬＡＧ−ＨＳＦ１Ｓ３２６ＡおよびＳ３２６Ｄ（部位指向性変異誘発によってＦＬＡＧ−ＨＳＦ１から生成）、ならびにｐＬｅｎｔｉ６−ＦＬＡＧ−ＨＳＦ１（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ反応を介して生成）。

３．リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＲＮＡＳＴＡＴ−６０試薬（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｉｎｃ．）を使用して抽出し、ＲＮＡを、ＶｅｒｓｏｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して逆転写のために使用した。等量のｃＤＮＡを、ＤｙＮＡｍｏＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量的ＰＣＲ反応のために使用した。シグナルを、ＡＢＩ７５００Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって検出した。各遺伝子に関する個々のプライマーの配列を、補足資料中に列挙する。

４．トランスフェクションおよびルシフェラーゼレポーターアッセイ
プラスミドを、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でトランスフェクトした。培養上清中のＳＥＡＰおよびルシフェラーゼ活性を、それぞれ、Ｚｉｖａ（登録商標）ＵｌｔｒａＳＥＡＰＰｌｕｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＪａｄｅｎＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）およびＧａｕｓｓｉａＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＧｌｏｗＡｓｓａｙＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量した。ルミネッセンスシグナルを、ＶＩＣＴＯＲ^３Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって測定した。

５．ＥＬＩＳＡベースのＨＳＦ１−ＤＮＡ結合アッセイ
ビオチン化理想ＨＳＥ（
（太字は、ＨＳＦ１によって認識されるヌクレオチド配列を示し、５’末端にビオチンが付加される））オリゴヌクレオチドは、自己アニールして、アニーリング緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）中で２本鎖ＤＮＡプローブを形成した。ＨＳＦ１結合のためのこれらのプローブを固定化するために、ＰＢＳ中に希釈した１００μｌの５００ｎＭビオチン化ＨＳＥプローブを、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ被覆９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加し、４℃において一晩インキュベートした。ＰＢＳで１回洗浄した後、ウェルを、２００μｌＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに室温において１時間インキュベートした。１×ＤＮＡ結合緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセロール、ｐＨ７．５）で１回洗浄した後、１×ＤＮＡ結合緩衝液中で希釈した１００μｌ核タンパク質を、各ウェルに添加し、室温において４０分間インキュベートした。その捕捉したタンパク質−ＤＮＡ結合を、上記ウェルを、１×ＤＮＡ結合緩衝液中で希釈した１％ホルムアルデヒドとともに室温において５分間、直ぐインキュベートすることによって安定化した。１×ＤＮＡ結合緩衝液で３回洗浄した後、各ウェルを、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液中に１：１０００希釈した１００μｌウサギＨＳＦ１抗体（Ｂ７１０９、ＡｓｓａｙＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）とともに、室温において２時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、各ウェルを、上記ブロッキング緩衝液中で希釈したＨＲＰ結合体化抗マウスＩｇＧ二次抗体とともに室温において１時間インキュベートした。徹底的にＴＢＳで洗浄した後、比色シグナルを、１−ＳｔｅｐＵｌｔｒａＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して発色させた。

６．ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡノックダウン
陰性コントロールｓｉＲＮＡ（これは、ヒトおよびマウスにおける既知の遺伝子を標的としない）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｄ−００１８１０−０１）から購入した。ｓｉＥＲＫ１＿１（ＳＩＨＫ１２０７）、ｓｉＥＲＫ１＿２（ＳＩＨＫ１２０８）、ｓｉＥＲＫ１＿３（ＳＩＨＫ１２０９）、ｓｉＥＲＫ２＿１（ＳＩＨＫ１１８３）、およびｓｉＥＲＫ２＿２（ＳＩＨＫ１１８４）ｓｉＲＮＡを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ｓｉＲＮＡを、１０ｎＭ最終濃度で、Ｍｉｓｓｉｏｎ（登録商標）ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してトランスフェクトした。ＭＥＫ１（ＴＲＣＮ００００００２３２９）、ＭＥＫ２（ＴＲＣＮ００００００７００６）、ＭＥＫ１／２（ＴＲＣＮ００００００７００７）、およびＰＳＭＢ５（ＴＲＣ００００００３９１８およびＴＲＣ００００００３９１９）を標的とするレンチウイルスｓｈＲＮＡを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。レンチウイルススクランブルおよびＨＳＦ１標的化（ｈＡ６）ｓｈＲＮＡは、以前に記載された（Ｄａｉら，２００７）。

７．イムノブロッティングおよび免疫沈降
全細胞タンパク質抽出物を、冷細胞溶解緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ、３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．６、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、３０ｍＭＮａＦ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、およびＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＨａｌｔ^ＴＭプロテアーゼインヒビターカクテル）中で調製した。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。一次抗体を、洗浄緩衝液中で、一晩４℃において添加した。ペルオキシダーゼ結合体化二次抗体を、室温において１時間添加し、シグナルを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって可視化し、続いてフィルムへ曝露した。

免疫沈降に関しては、細胞を、ＣＨＡＰＳ緩衝液（４０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．４、１２０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、０．３％ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭグリセロホスフェート（ｇｌｙｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５０ｍＭＮａＦ、およびＨａｌｔ^ＴＭプロテアーゼインヒビターカクテル）中に溶解した。溶解物を、正常ウサギＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＨＳＦ１抗体（Ｈ−３１１、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＥＲＫ１／２抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、または抗ＦＬＡＧＧ１アフィニティー樹脂スラリー（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）とともに４℃において一晩インキュベートした。プロテインＧ樹脂（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用して、免疫複合体を沈降させた。溶解緩衝液で３回洗浄した後、タンパク質を、３０μｌ０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）でビーズから溶離し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。

８．インビトロキナーゼアッセイ
免疫沈降させたＥＲＫ複合体を、１×インビトロキナーゼ緩衝液（２５ｍＭＭＯＰＳｐＨ７．２、１２．５ｍＭ β−グリセロホスフェート、２５ｍＭＭｇＣｌ_２、５ｍＭＥＧＴＡ、２ｍＭＥＤＴＡ、０．２５ｍＭＤＴＴ、およびＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＨａｌｔ^ＴＭプロテアーゼインヒビターカクテル）中に再懸濁し、室温において２０分間、Ｕ０１２６またはＦＲ１８０２０４とともにインキュベートした。１００μＭＡＴＰおよび精製組換えＨｉｓタグ付きＨＳＦ１、ＧＳＴタグ付きＥＲＫ１、またはウシＭＢＰタンパク質を添加した後、キナーゼ反応物を、２５℃において３０分間、サーモミキサーで穏やかに振盪しながらインキュベートした。サンプルを、５分間煮沸して、反応を停止させた。

９．ルシフェラーゼ再折りたたみアッセイ
組換えホタルルシフェラーゼタンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、変性緩衝液（２５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、および６ＭグアニジンＨＣｌ）とともに３７℃において２０分間インキュベートすることによって変性させた。再折りたたみアッセイを行うために、再折りたたみ緩衝液（２５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭＤＴＴ、および１ｍＭＡＴＰ）中で希釈した２００ｎＭ変性ルシフェラーゼを、受動溶解緩衝液（ｐａｓｓｉｖｅｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、２ｍＭＤＴＴ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および２ｍＭＥＤＴＡ）中で抽出した５ｍｇ／ｍｌ細胞溶解物とともにインキュベートした。種々の時点で、２０μｌ再折りたたみ混合物を除去し、再折りたたみ緩衝液中で希釈したＤ−ルシフェリン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）とともにインキュベートした。ルミネッセンスシグナルを、ＶＩＣＴＯＲ^３Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって測定した。

１０．クロマチン免疫沈降
１×１０^７細胞を、１％ホルムアルデヒドで８分間固定し、１２５ｍＭグリシンを添加して、架橋を停止させた。冷ＰＢＳで洗浄した後、細胞を集め、細胞質抽出緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、８５ｍＭＫＣｌ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ８．０）中で１０分間溶解し、続いて、５，０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離した。ペレットを、核抽出緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ＳＤＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で１０分間さらに溶解し、超音波処理してクロマチンを平均長５００ｂｐのフラグメントへと剪断した。１６，０００×ｇにおいて１５分間遠心分離した後、上清を集め、１０％をインプット（ｉｎｐｕｔ）としてとっておいた。その上清を事前にきれいにするために、２５μｌＣｈＩＰグレードのプロテインＧアガロースビーズ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加し、４℃において３時間インキュベートした。事前にきれいにした上清を、４μｇウサギ抗ＨＳＦ１抗体（Ｈ−３１１，ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または４μｇ正常ウサギＩｇＧとともに４℃において一晩インキュベートし、続いて、２５ μｌＣｈＩＰグレードのプロテインＧビーズとともに４℃において３時間インキュベートした。ビーズを、短時間遠心分離することによってペレットにし、低塩緩衝液、高塩緩衝液、ＬｉＣｌ緩衝液、およびＴＥ緩衝液で逐次的に洗浄した。最後の洗浄の後、５０μｌＣｈｅｌｅｘ−１００樹脂を各サンプルに、および上記インプットに添加し、そして上記混合物を、９９℃において１０分間煮沸した。架橋を戻すために、４０μｇプロテイナーゼＫを添加し、６５℃において１時間インキュベートし、次いで、９９℃において１０分間煮沸した。１６，０００ｇにおいて２分間遠心分離した後、２μｌ上清を、リアルタイムｑＰＣＲのために使用した。ＩＰシグナルを、インプットシグナルに対して正規化した。

１１．可溶性および不溶性のタンパク質分画
等しい数の細胞を、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む細胞溶解緩衝液とともに氷上で２０分間インキュベートした。その粗製溶解物を、５００×ｇにおいて２分間、４℃においてまず遠心分離した。その上清を、２０，０００×ｇにおいて２０分間、４℃においてさらに遠心分離した。その最終上清およびペレットを、それぞれ、界面活性剤可溶性画分および界面活性不溶性画分として集めた。不溶性画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、２％ＳＤＳ中で、高強度においてＢｉｏｒｕｐｔｏｒ（登録商標）ＳｏｎｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＤｉａｇｅｎｏｄｅＩｎｃ．）を使用してさらに超音波処理した。

１２．フローサイトメトリーのためのＴｈＴおよびＣＲ染色
ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、４％ホルムアルデヒドによって室温において３０分間固定した。固定およびＰＢＳ洗浄後、細胞を、２ｍｌ透過緩衝液（０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、３ｍＭＥＤＴＡ）中で再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ中に溶解した１０μＭＴｈＴまたは５０ｎＭＣＲで３０分間洗浄した。ＴｈＴ蛍光を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ^ＴＭフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定した。

１３．ＥＬＩＳＡによるアミロイドオリゴマーおよび原線維定量
可溶性アミロイドプレフィブリル状（ｐｒｅｆｉｂｒｉｌｌａｒ）オリゴマーを定量するために、ＰＢＳ中で希釈した２０μｇ可溶性細胞タンパク質を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに関して、４℃において一晩インキュベートし、続いて、室温において１時間ブロックした（ＰＢＳ−Ｔ中５％無脂肪乳）。各ウェルを、１００μｌアミロイドオリゴマー抗体（Ａ１１、ブロッキング緩衝液中で１：１０００希釈）とともに室温において２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ヤギ抗ウサギＡｂＨＲＰ結合体（ブロッキング緩衝液中で１：５０００希釈）を各ウェルに添加し、室温において１時間インキュベートした。洗浄後、１００μｌ１−Ｓｔｅｐ^ＴＭＵｌｔｒａＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加した。

アミロイド原線維を定量するために、界面活性剤不溶性タンパク質を抽出した。簡潔には、全細胞溶解物を、５００×ｇにおいて２分間、４℃において遠心分離した。その上清を、２０，０００×ｇにおいて２０分間、４℃においてさらに遠心分離した。その最終ペレットを、界面活性剤不溶性画分として集め、２％ＳＤＳを有するＰＢＳ中で１０分間の超音波処理によって可溶化した。タンパク質定量後、ＰＢＳ中に希釈した可溶化タンパク質のうちの１０μｇを、各ウェルに添加し、３７℃において、覆いなしで一晩インキュベートして、ウェルを乾燥させた。以下の工程は、一次Ａｂとしてアミロイド原線維抗体（ＯＣ）を使用することを除いて、オリゴマー検出と同一であった。

１４．透過型電子顕微鏡法
インビトロ播種の後、アミロイド原線維をペレット化し、蒸留Ｈ_２Ｏ中に再懸濁した。１滴の原線維溶液を、２００メッシュ炭素被覆ニッケルグリッド（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｃｉｅｎｃｅｓ）上に置いた。１分後、その残っている液体を毛管作用で逃がした。直ぐに、１滴の２％酢酸ウラニル溶液をそのグリッドの上に１分間置いた。毛管作用で逃がした後、そのグリッドを風乾し、８０ｋＶで作動するＪＥＯＬ１２３０透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬＵＳＡＩｎｃ．）の下で検鏡した。

１５．バイオルミネッセンス画像化
画像化の前に、ＸｅｎｏＬｉｇｈｔＲｅｄｉＪｅｃｔＤ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）を、ルシフェラーゼ発現Ａ２０５８細胞を予め注射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへとｉ．ｐ．注射した。マウスにイソフルランで麻酔をかけ、ルミネッセンスシグナルを、ＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳ^{（登録商標）} ＬｕｍｉｎａＩＩシステム（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して記録した。背側および腹側の両方の位置からの画像を、取り込んだ。各マウスの全光子フラックスを、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ^{（登録商標）}ソフトウェアを使用して定量した。

１６．凝集物サイズの測定
種々のサンプルに由来する細胞の等しい数を、冷細胞溶解緩衝液で溶解した。２０，０００×ｇにおいて１５分間、４℃において遠心分離した後、界面活性剤不溶性ペレットを、ＲＩＰＡ緩衝液で３回さらに抽出した。その最終の不溶性ペレットを、ピペッティングすることによって１０％ＳＤＳ中に再懸濁し、直ぐに、２０μｍ開口部を備えたＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ^ＴＭ３コールターカウンター（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を使用して、凝集物サイズ分けに供した。

１７．免疫蛍光染色
ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで室温において１５分間固定した後、細胞を、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ中の５％ヤギ血清で室温において６０分間ブロックし、Ｌｙｓ４８特異的ユビキチンＡｂｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ブロッキング緩衝液中で１：５００希釈）とともに一晩４℃においてインキュベートした。腫瘍切片のために、抗原を、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中で回収し、続いて、ブロッキングした。切片を、切断型カスパーゼ３Ａｓｐ１７５Ａｂｓ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ブロッキング緩衝液中で１：５００希釈）またはアミロイド原線維（ＯＣ）Ａｂｓ（ＳｔｒｅｓｓＭａｒｑＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ブロッキング緩衝液中で１：２００希釈）のいずれかとともに一晩４℃においてインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、切片を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５６８または４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧＡｂｓ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ブロッキング緩衝液中で１：１０００希釈）とともにインキュベートした。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２核対比染色を行った後、蛍光画像を、ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ５共焦点顕微鏡によって取り込んだ。

１８．ユビキチン化プロテオミクス
Ａ２０５８細胞を、１５０ｍｍ培養ディッシュ中で増殖させ、ＤＭＳＯまたは２０ｎＭＡＺＤ６２４４で８時間処理した。同じ処理を受けた２×１０^８細胞をプールし、液体窒素中で急速凍結した。細胞ユビキチン化のグローバル定量分析（ｇｌｏｂａｌｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓ）を、ユビキチン分枝（Ｋ−ε−ＧＧ）モノクローナル抗体によるユビキチン化ペプチドの富化と液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）とを併用するＵｂｉＳｃａｎ（登録商標）サービス（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を介して行った。２つの技術的複製物を、各処理に関して分析した。

１９．インビトロアミロイド播種
細胞を、２％ＰＢＳ中で懸濁し、超音波処理して、溶解物を調製した。播種実験を、９６ウェル黒色マイクロプレート（１００μｌ反応容積／ウェル）で行った。各反応物は、８０μｌＰＢＳ中に希釈した２０μｇ細胞タンパク質および０．０１ＭＮａＯＨ中に溶解した１０μｌの２００μＭ合成ヒトＡβ１−４２ペプチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を含んだ。反応物を、室温において穏やかに振盪しながらインキュベートした。アミロイド形成を検出するために、ＰＢＳ中に溶解した１０μｌの１００μＭＴｈＴ（Ｓｉｇｍａ）を反応物に添加し、蛍光を、Ｅｘ４５０ｎｍ／Ｅｍ４８２ｎｍにおいて測定した。

実施例２．ＭＥＫおよびＥＲＫは、ＰＳＲを反対に調節する
リン酸化は、ＨＳＦ１活性化に顕著に影響を与える（Ｇｕｅｔｔｏｕｃｈｅら，２００５）。このことは、シグナル伝達経路の鍵となる役割を示唆する。このような経路がどのようにＰＳＲを調節するかを解明するために、本発明者らは、ＲＡＳ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達に焦点をあてて、ストレスに対するそれらの応答を先ず試験した。タンパク質毒性ストレスを加えるために、本発明者らは、多様な作用機構を有するストレッサー（ヒートショック（ＨＳ）、プロテアソームインヒビターＭＧ１３２、ヒストンデアセチラーゼ６インヒビターであるツバスタチン、アミノ酸アナログであるアゼチジン、およびＨＳＰインヒビター（ＨＳＰ９０に関しては１７−ＤＭＡＧおよびＨＳＰ７０に関してはＶＥＲ１５５００８）を含む）を適用した（Ｋａｗａｇｕｃｈｉら，２００３；Ｍａｓｓｅｙら，２０１０；Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，２００８；ＮｅｃｋｅｒｓａｎｄＷｏｒｋｍａｎ，２０１２）。ストレッサーへの一過性の曝露は、細胞生存度を損なわなかった（図８Ａ）が、この経路の２つの鍵となる成分であるＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化を上昇させた（図１Ａ）。ＭＥＫＳｅｒ２１８／２２２およびＥＲＫＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４リン酸化は、それらの活性状態を表す（Ｄｈｉｌｌｏｎら，２００７；ＲｏｕｘａｎｄＢｌｅｎｉｓ，２００４）。一致して、全てのストレッサーは、ＥＲＫの下流にある転写因子であるＥＬＫ１（ＲｏｕｘａｎｄＢｌｅｎｉｓ，２００４）を活性化させた（図１Ｂ）。

ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達がＰＳＲを調節するか否かを決定するために、本発明者らは、Ｕ０１２６およびＡＺＤ６２４４（２つの特異的ＭＥＫ１／２インヒビター）（Ｆａｖａｔａら，１９９８；Ｙｅｈら，２００７）を使用した。両方のインヒビターが、Ｈｓｐ遺伝子のＨＳ誘導性転写を妨げ、ＨＳＦ１のＤＮＡ結合能および転写活性化を損なった（図１Ｃ〜１Ｆおよび８Ｂ）。このことは、ＭＥＫがＨＳＦ１媒介性ＰＳＲを活性化することを示唆する。ＥＲＫ（これはＭＥＫによってリン酸化される（Ａｈｎら，１９９１））は、この経路の主要エフェクターとして広く認識されている（Ｄｈｉｌｌｏｎら，２００７；ＲｏｕｘａｎｄＢｌｅｎｉｓ，２００４）。驚くべきことに、ＥＲＫインヒビターである、ＦＲ１８０２０４およびＳｃｈ７７２９８４（Ｏｈｏｒｉら，２００５；Ｍｏｒｒｉｓら，２０１３）は、ＨＳＦ１を活性化した（図１Ｆおよび図８Ｃ）。ＭＥＫインヒビターおよびＥＲＫインヒビターの両方が、２つのＥＲＫ媒介性事象であるＭＳＫ１リン酸化およびＥＬＫ１活性化を損なった（図１Ｇおよび図８Ｄ；ＲｏｕｘａｎｄＢｌｅｎｉｓ，２００４）。ＭＥＫインヒビターは、ＥＲＫリン酸化を低減した一方で、２つのＥＲＫインヒビターは、別個の効果を示した（図１Ｇ）。Ｓｃｈ７７２９８４は、ＭＥＫ媒介性リン酸化をブロックするＥＲＫのコンホメーション変化に恐らく起因して、ＥＲＫリン酸化を抑制した（Ｍｏｒｒｉｓら，２０１３）；逆に、ＦＲ１８０２０４は、ＥＲＫリン酸化を促進した（図１Ｇ）。このことは、フィードバックＭＥＫ活性化を示唆する。

ＨＳＦ１に対するＭＥＫインヒビターおよびＥＲＫインヒビターの影響を、ＭＥＫおよびＥＲＫの遺伝的枯渇を介して検証した（図１Ｉ〜１Ｏ）。一方のＥＲＫアイソフォームの枯渇は、タンパク質レベルで他方のアイソフォームを減少させた（図１Ｌおよび図１Ｎ）一方で、標的化されないアイソフォームのｍＲＮＡレベルは、上昇した（図８Ｅ〜８Ｈ）。このことは、低減したタンパク質の根底にある転写後機構を示唆する。これらの結果は、ＰＳＲの鍵となる調節因子としてＲＡＳ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達を際立たせるのみならず、ＨＳＦ１に対するＭＥＫおよびＥＲＫの多様な影響をも明らかにする。

実施例３．ＭＥＫは、ＨＳＦ１と物理的に相互作用する
ＭＥＫがＨＳＦ１を直接的に活性化するか否かを決定するために、本発明者らは、共免疫沈降（ｃｏ−ＩＰ）によって、内因性ＭＥＫ−ＨＳＦ１相互作用を調べた。ＭＥＫ１／２タンパク質がＨＳなしでＨＳＦ１と明らかに沈降しなかった一方で、ＨＳは、顕著なｃｏ−ＩＰを引き起こした（図２Ａおよび２Ｂ）。このことは、ストレス誘導性のＭＥＫ−ＨＳＦ１相互作用を示す。ＨＳＦ１の移動度のシフトは、ＨＳ誘導性リン酸化をマークする（図２Ａ）。これらのＭＥＫ−ＨＳＦ１相互作用を、組換えタンパク質の発現を介して検証した（図９Ａおよび９Ｂ）。ＭＥＫおよびＨＳＦ１が直接接触しているかを決定するために、本発明者らは、近傍ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）技術（Ｃｌａｕｓｓｏｎら，２０１１）を使用した。抗体特異性を、免疫染色することによって検証した（図９Ｃおよび９Ｄ）。ＭＥＫが機能する細胞（ＭＥＫ−ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔｃｅｌｌ）において、ＰＬＡシグナルは、ＨＳなしで僅かに見え、ＨＳは、これらのシグナルを強めた（図２Ｃ）。ＭＥＫ欠損細胞において、ＨＳの後であってもごく弱いシグナルしか検出されなかった（図２Ｃ）。これは、ＰＬＡの特異性を確認する。注意すべきは、ＰＬＡシグナルは、細胞質より核においてより明白であった（図２Ｃ）。このことは、相互作用の顕著に核の局在性を明らかにする。これらの結果は、直接的なＭＥＫ−ＨＳＦ１会合を強く示唆する。

ＭＥＫ１およびＭＥＫ２は、インビボでホモダイマーまたはヘテロダイマーのいずれかを形成する（Ｃａｔａｌａｎｏｔｔｉら，２００９）。ダイマーのどちらのタイプがＨＳＦ１を結合するかに取り組むために、本発明者らは、ＭＥＫ２の欠損の中でＭＥＫ１−ＨＳＦ１相互作用を調べた。ＨＳの下では、より多くのＭＥＫ１タンパク質が、ＭＥＫ２欠損細胞においてＨＳＦ１とともに沈降した（図２Ｄ）。同様に、ＭＥＫ１欠損は、ＭＥＫ２−ＨＳＦ１相互作用を高めた（図２Ｅ）。このことは、ＨＳＦ１結合に関するその２つのＭＥＫアイソフォームの間の競合を明らかにし、ＭＥＫホモダイマーがＨＳＦ１と相互作用し得ることを示唆する。

実施例４．ＥＲＫはＭＥＫ−ＨＳＦ１相互作用を抑制して、ＨＳＦ１を不活性化する
ＥＲＫがどのようにしてＨＳＦ１を不活性化するかを解明するために、本発明者らは、ＭＥＫ媒介性ＨＳＦ１活性化に対するＥＲＫの影響をまず調べた。ＥＲＫ１枯渇はＭＥＫ−ＨＳＦ１相互作用を促進した（図２Ｆ）のに対して、ＥＲＫ１過剰発現は、これらの相互作用を弱めてＨＳＦ１を抑制した（図２Ｇおよび９Ｅ）。従って、本発明者らは、３つの考えられるシナリオを予想した（図２Ｈ）：１）両方のＭＥＫ基質、ＥＲＫおよびＨＳＦ１が、ＭＥＫ相互作用に関して競合する；２）ＥＲＫは、ＭＥＫのように、ＨＳＦ１を結合し、それによってＨＳＦ１相互作用に関して競合する；ならびに３）ＥＲＫは、ＨＳＦ１に向かうＭＥＫキナーゼ活性を阻害する。この最初の２つのシナリオの各々は、２つのタンパク質複合体の間の競合を推測する；対照的に、第３のシナリオは、ＥＲＫがＭＥＫおよびＨＳＦ１と、単一のタンパク質複合体へとアセンブリすることを推定する。興味深いことに、ＨＳの下では、ＨＳＦ１は、ＭＥＫおよびＥＲＫの両方を沈降させ（図２Ｉ）、ＥＲＫは、ＭＥＫおよびＨＳＦ１の両方を沈降させた（図２Ｊ）。これらの結果は、独立したＭＥＫ−ＥＲＫ複合体およびＭＥＫ−ＨＳＦ１複合体の存在を排除しないが、それらは、第１のシナリオで示されるように、その２つの複合体が安定かつ優勢であることの反証となる。第２のシナリオを試験するために、本発明者らは、ＥＲＫ−ＨＳＦ１相互作用をＰＬＡによって検出した。なぜならこのシナリオは、ＨＳＦ１を、ＥＲＫおよびＭＥＫの両方の基質として推定するからである。ＥＲＫ抗体の特異性を、ＥＲＫ枯渇細胞において検証した（図９Ｆ）。明らかなＭＥＫ１−ＥＲＫ相互作用（図２Ｋ）とは対照的に、ＥＲＫ−ＨＳＦ１相互作用を示す明らかなＰＬＡシグナルは検出されなかった（図２Ｌ）。このことは、これら２つのタンパク質の間の直接的接触がないことを示唆する。さらに、ＥＲＫ１過剰発現はＭＥＫ−ＨＳＦ１相互作用を弱めた一方で、ＥＲＫ１タンパク質は、ＨＳＦ１とあまり沈降しなかった（図２Ｇ）。これは、第２のシナリオによって推定される高まったＥＲＫ１−ＨＳＦ１相互作用とは矛盾する。従って、これらの結果は、第２のシナリオを却下するのみならず、ＥＲＫが、第３のシナリオと一致して、ＨＳＦ１とＭＥＫを介して複合体化することをも示唆する。重要なことには、ＭＥＫ枯渇は、ＥＲＫ−ＨＳＦ１ｃｏ−ＩＰを顕著に低下させた（図２Ｊ）。これらの結果は、ＥＲＫ、ＭＥＫ、およびＨＳＦ１を含むタンパク質複合体（ここでＥＲＫは、ＨＳＦ１を間接的に、ＭＥＫの阻害を介して抑制する）の存在を示唆する。

実施例５．ＭＥＫは、Ｓｅｒ３２６をリン酸化して、ＨＳＦ１を活性化する
ＨＳの下で、ＨＳＦ１は、一連のリン酸化事象を受ける。その中でも、Ｓｅｒ３２６リン酸化は、その活性化を刺激する（Ｇｕｅｔｔｏｕｃｈｅら，２００５）。しかし、キナーゼの正体は、捕らえにくいままである。ＭＥＫがＳｅｒ３２６をリン酸化するか否かを決定するために、本発明者らは、ＨＳＦ１^ＷＴタンパク質を認識するが、ＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ａ}タンパク質を認識しないホスホ特異的抗体を使用して、この改変に対するＭＥＫ遮断の効果を調べた（図１０Ａ）。ＭＥＫノックダウンまたはＵ０１２６処置のいずれも、Ｓｅｒ３２６リン酸化を損なった（図３Ａおよび１０Ｂ）。逆に、構成的に活性な変異体であるＭＥＫ１^ＤＤ（Ｓ２１８Ｄ／Ｓ２２２Ｄ）（Ｂｒｕｎｅｔら，１９９４ａ）は、ＨＳＦ１のＳｅｒ３２６リン酸化および活性化をＨＳなしで誘導した（図３Ｂおよび３Ｃ）。ＥＲＫ阻害は、Ｓｅｒ３２６リン酸化を増強し；そして、ＭＥＫ枯渇は、この効果を破壊した（図３Ｄおよび１０Ｃ）。このことは、ＭＥＫ依存性調節を示す。ＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ａ}変異体は、損なわれた転写活性を示し（図３Ｅ）、それらの欠陥のある核トランスロケーションおよびＤＮＡ結合能と一致する（図１０Ｄ〜Ｅおよび図３Ｆ）。さらに、ＨＳＦ１タンパク質は、ＭＥＫ欠損細胞において低下された（図３Ａおよび１０Ｆ）。ＭＥＫがＨＳＦ１安定性に影響を及ぼすか否かを決定するために、本発明者らは、シクロヘキシミド追跡実験（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅｃｈａｓｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）を行った。ＭＥＫ枯渇は、ＨＳＦ１^ＷＴタンパク質の半減期を短縮した；重要なことには、ＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ａ}変異体は、ＭＥＫが機能する細胞においてあまり安定ではなかった一方で、それらの安定性は、ＭＥＫ欠損によって顕著には影響を受けなかった（図３Ｇ）。このことは、ＭＥＫがＨＳＦ１を、Ｓｅｒ３２６リン酸化を主に介して安定化することを示唆する。これらの結果は、ＭＥＫが、その活性化および安定性にとって不可欠な改変であるインビボでのＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６リン酸化を制御することを示す。

インビトロでは、組換えＭＥＫ１タンパク質は、Ｓｅｒ３２６においてＨＳＦ１を直接リン酸化した；そしてＵ０１２６は、この事象をブロックした（図３Ｈ）。ＥＲＫは、ＨＳＦ１をＳｅｒ３０７においてリン酸化することが報告された（Ｃｈｕら，１９９８）。これは、直接的なＥＲＫ−ＨＳＦ１相互作用を示唆する。ＥＲＫによる直接的なＳｅｒ３２６リン酸化を排除するために、本発明者らは、インビトロでのＨＳＦ１リン酸化を、ＭＥＫと会合したまたは会合していないＥＲＫを含む免疫沈降した内因性ＥＲＫ複合体を使用して行った。沈降した複合体はＳｅｒ３２６をリン酸化したものの、この事象は、Ｕ０１２６によってブロックされたが、ＦＲ１８０２０４によってブロックされなかった（図３Ｉ）。Ｕ０１２６は、組換えＥＲＫ１タンパク質のリン酸化を同じ沈降物によってブロックしたが、ＦＲ１８０２０４はそうではなかった（図３Ｉ）。対照的に、ＦＲ１８０２０４は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（公知のＥＲＫ基質（Ａｈｎら，１９９１））のリン酸化を同じ沈降物によってブロックしたが、Ｕ０１２６はそうではなかった（図３Ｉ）。このことは、ＦＲ１８０２０４によるＥＲＫ遮断を示す。これらの結果は、ＭＥＫが、ＥＲＫよりむしろ、Ｓｅｒ３２６を直接リン酸化することを強く示唆する。さらに、組換えＥＲＫ１タンパク質は、インビボでのＥＲＫによるＳｅｒ３２６リン酸化の抑制と一致して、組換えＭＥＫ１タンパク質によってインビトロでのＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６リン酸化を妨げた（図３Ｊ）。対照的に、ＥＲＫは、ＨＳＦ１Ｓｅｒ３０７リン酸化を促進する。ＥＲＫ枯渇は、Ｓｅｒ３０７リン酸化を低減した；しかし、この効果は、ＭＥＫ欠損細胞において大きく破壊された（図１０Ｇ）。このことは、繰り返すと、ＭＥＫ依存性を示す。ＭＥＫ阻害は、Ｓｅｒ３２６リン酸化を損なったが、ＨＳＦ１^ＷＴタンパク質のＳｅｒ３０７リン酸化を増強した（図１０Ｈ）。興味深いことに、リン酸化模倣（ｐｈｏｓｐｈｏｍｉｍｅｔｉｃ）変異体であるＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}タンパク質は、低下した基底Ｓｅｒ３０７リン酸化を示し、ＭＥＫ阻害によるこのリン酸化の誘導に抵抗した（図１０Ｈ）。これらの結果は、ＭＥＫによるＳｅｒ３２６リン酸化が、Ｓｅｒ３０７リン酸化を抑制し、ＥＲＫが、ＭＥＫ阻害を介してＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６およびＳｅｒ３０７リン酸化に影響を及ぼすことを裏付ける。活性化ＥＲＫは、Ｔｈｒ２９２／３８６をリン酸化して、ＭＥＫ１を阻害する（Ｂｒｕｎｅｔら，１９９４ｂ）。ＭＥＫ１^{Ｔ２９２Ａ，Ｔ３８６Ａ}変異体は両方とも、基底ＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６リン酸化を高め、内因性ＭＥＫの枯渇した細胞においてこのリン酸化のＥＲＫ媒介性抑制をブロックした（図３Ｋ）。このことは、ＥＲＫが、ＭＥＫのフィードバックリン酸化を介してＳｅｒ３２６リン酸化を抑制することを示す。

興味深いことに、ヒト黒色腫において同定された２つのＭＥＫ１変異体（Ｐ１２４ＳおよびＥ２０３Ｋ（Ｎｉｋｏｌａｅｖら，２０１２））は、構成的なＨＳＦ１リン酸化および活性化（図３Ｌおよび３Ｍ）を引き起こした。逆に、ヒト黒色腫細胞において、ＭＥＫインヒビターは、構成的ＨＳＦ１リン酸化およびＨＳＰプロモーターへの結合を損なった（図３Ｎおよび３Ｏ）。これらの結果は、ＭＥＫが、ストレスを受けた細胞における誘導性ＨＳＦ１活性化、および悪性細胞における構成的ＨＳＦ１活性化の両方を制御することを示す。

実施例６．ＭＥＫは、細胞タンパク質恒常性を保存する
ＨＳＦ１は、ＨＳＰを介して細胞タンパク質恒常性を維持し得る。タンパク質折りたたみに対するＨＳＦ１の影響を調べるために、本発明者らは、グルココルチコイドレセプター（ＧＲ）をモデルとして使用した。適切なＧＲ折りたたみは、ＨＳＰ９０に依存し、誤って折りたたまれたタンパク質は、ユビキチン−プロテアソーム系によって除去される（Ｔａｉｐａｌｅら，２０１０）。ＨＳＦ１ノックダウンは、ＧＲ−ＧＦＰユビキチン化および枯渇を誘導した（図１１Ａ）。このことは、ＨＳＦ１欠損によるタンパク質不安定化を示す。このことは、細胞のシャペロン能の低下から生じた。なぜならＨＳＦ１欠損細胞の溶解物は、変性ルシフェラーゼを再活性化するにあたってあまり効率的ではなかったからである（図１１Ｂ）。ＨＳＦ１欠損に類似して、ＭＥＫ遮断は、ＧＲ−ＧＦＰを枯渇させた；そしてこの枯渇は、ＧＦＰ不安定性または一般的な発現変化に起因しなかった。なぜなら共発現したＧＦＰは、影響を受けなかったからである（図４Ａ）。代わりに、ＭＥＫ遮断は、ＧＲ−ＧＦＰをユビキチン化した（図４Ｂ）。これは、損なわれたプロテアソーム機能に起因しない。なぜならボルテゾミブによるプロテアソーム阻害は、ＧＲ−ＧＦＰ蓄積を引き起こし、ＭＥＫインヒビターは、プロテアソーム活性に影響を及ぼさなかったからである（図１１Ｃ〜１１Ｅ）。実際に、ＡＺＤ６２４４およびＭＥＫノックダウンは両方とも、シャペロン能を枯渇させた（図４Ｃおよび１１Ｆ）。このことは、ＭＥＫによるタンパク質の折りたたみの調節および安定性を明らかにする。

細胞のプロテオームを左右するにあたってＨＳＦ１の鍵となる役割と一致して、ＨＳＦ１枯渇は、界面活性剤可溶性および界面活性剤不溶性両方の画分において、プロテアソーム分解の改変マーキングタンパク質であるタンパク質Ｌｙｓ４８特異的ユビキチン化（ＰｉｃｋａｒｔａｎｄＥｄｄｉｎｓ，２００４）を誘導した（図１１Ｇ）。この変化は、全体のタンパク質不安定化を示唆する。ＨＳＦ１不活性化と一致して、ＡＺＤ６２４４は、Ｓｅｒ３２６リン酸化を低減し、ＨＳＰを低下させ、全体的なユビキチン化を誘導した（図４Ｄ）。一晩のＡＺＤ６２４４処理はまた、ＨＳＦ１を不安定化した（図４Ｄおよび図１１Ｈ）。ＭＥＫノックダウンは、全体的なユビキチン化も誘導した（図１１Ｉ）。重要なことには、ＡＺＤ６２４４は、ＨＳＦ１を枯渇させず、ＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}を安定して過剰発現する細胞においてユビキチン化を誘発しなかった（図４Ｅおよび１１Ｊ）。このことは、ＭＥＫ阻害に起因するタンパク質不安定性におけるＨＳＦ１不活性化の原因となる役割を示す。インビボでのＭＥＫ阻害はまた、ＨＳＰおよびＨＳＦ１を枯渇させ、そして主要組織においてユビキチン化を誘導した（図４Ｆ）。

ＭＥＫ阻害に起因するユビキトーム変化（ｕｂｉｑｕｉｔｏｍｉｃｃｈａｎｇｅ）を調査するために、本発明者らは、新規なユビキチン分枝モチーフ抗体によって富化したユビキチン化ペプチドの質量分析（ＭＳ）ベースの分析を行った（図４Ｇ；Ｋｉｍら，２０１１）。本発明者らは、ＡＺＤ６２４４ありまたはなしで８時間処理したＡ２０５８細胞のユビキトームを比較した。合計で、１，７１５の特有のタンパク質に割り当てられた３，４２５の非冗長性のユビキチン化ペプチドの概略を描いた（図４Ｈおよび１１Ｋ）。ＡＺＤ６２４４は、ペプチドユビキチン化を増大も低減もした（図４Ｈ）。２．５倍カットオフを、有意な変化として定義した場合、７６の非冗長性ペプチドの集まりを区別した。これらのペプチドは、多様な分子機能を果たし、幅広い生物学的プロセスに携わる６８の特有のタンパク質を表す。（図４Ｉおよび４Ｊ）。興味をそそることに、最も富化された経路は、翻訳伸長であった（図４Ｊ）。これら６８のタンパク質の分析から、３つの部分ネットワークを包含する機能的関連ネットワークが明らかになった（図４Ｋ）。特に重要なことは、７つのリボソームサブユニットタンパク質からなる「翻訳」部分ネットワークである。これは、リボソーム装置に対するＭＥＫの顕著な影響を強調する。さらに、いくつかの癌遺伝子および腫瘍抑制因子（ｃ−ＭＹＣ、サイクリンＤ１、ＨＩＦ１Ａ、ＴＰ５３、およびＮＦ１を含む）が、そのネットワーク内に埋め込まれている（図４Ｋ）。ＭＥＫが腫瘍形成においてこれらの鍵となるプレイヤーを調節することによる機構は、おそらく多面的であるが、蓄積しつつある証拠は、ＨＳＰがそれらの安定性を調節することを意味する（Ｉｓａａｃｓら，２００２；Ｍｕｅｌｌｅｒら，２００４）。従って、ＭＥＫは、これらタンパク質に少なくとも部分的にＨＳＦ１を介して影響を及ぼし得る。

本発明者らのＭＳ知見を検証するために、本発明者らは、いくつかの標的タンパク質を選択した。Ｔｏｒｓｉｎ−１Ａ相互作用タンパク質２（ＴＯＲ１ＡＩＰ２）およびリボソームタンパク質Ｌ３（ＲＰＬ３）は、それぞれ、ユビキチン化において６１．０倍および１３．７倍の増大を示した。検出を容易にするために、本発明者らは、Ｖ５タグ付きＴＯＲ１ＡＩＰ２およびＲＰＬ３タンパク質を、構成的プロモーターを介して発現した。８時間のＡＺＤ６２４４処理は、両方のＶ５タグ付きタンパク質のレベルを変化させなかったが、それらのユビキチン化を増大させた（図４Ｌおよび４Ｍ）。本発明者らのＭＳの結果はまた、タンパク質（ｃ−ＭＹＣ、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ２４、およびＲＰＳ２０を含む）のユビキチン化の低減を明らかにした。本発明者らは、ユビキチン化および内因性ｃ−ＭＹＣタンパク質の全体レベルの両方の低下を確認した（図４Ｎ）。類似の結果もまた、Ｖ５タグ付きＲＰＬ１５、ＲＰＬ２４、およびＲＰＳ２０に関して観察された（図１１Ｌ〜１１Ｎ）。これは、短縮したタンパク質半減期を示唆する。実際に、ＭＧ１３２によるプロテアソーム遮断は、ＡＺＤ６２４４によるＶ５−ＲＰＬ１５枯渇を防止し、その上昇したユビキチン化を明らかにした（図４Ｏ）。ＨＳＦ１不活性化の不可欠な役割と一致して、Ｖ５タグ付きＲＰＬ１５およびＲＰＬ３タンパク質の両方が、ＨＳＦ１ノックダウン後に高度にユビキチン化され、ＡＺＤ６２４４は、このユビキチン化にかすかに影響を及ぼした（図４Ｏおよび４Ｐ）。重要なことには、ＭＧ１３２は、内因性ＲＰＬ１５およびＲＰＬ３の枯渇を、ＡＺＤ６２４４およびＭＥＫノックダウンによって防止した（図４Ｑおよび１１Ｏ）。このことは、ＭＥＫ欠損によるリボソームタンパク質の不安定化を確認する。ＨＳＦ１ノックダウンは、内因性ＲＰＬ１５およびＲＰＬ３を低減する一方で、ＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}発現は、それらの基底レベルを上昇させ、そしてＡＺＤ６２４４誘導性枯渇からそれらを保護した（図１１Ｐおよび４Ｒ）。これらの知見はまとめると、ＭＥＫ阻害がＨＳＦ１を不活性化して、細胞のシャペロン能を枯渇させることを示す。結果として、タンパク質不安定化およびユビキトーム不均衡が後に起こる。

実施例７．ＭＥＫ阻害は、悪性細胞において凝集およびアミロイド生成を誘発する
界面活性剤不溶性画分中の増大したユビキチン化は、タンパク質凝集を示唆する（図４Ｄ）。このことを示すために、本発明者らは、ユビキチン免疫染色を行った。黒色腫細胞を、ボルテゾミブおよびＡＺＤ６２４４で２４時間処理して、明らかな凝集を誘発した。予測されるように、明るい蛍光の斑点状フォーカスが、ユビキチン含有凝集物を画定して、ボルテゾミブ処理細胞において出現した（図５Ａ〜Ｂ）。ＡＺＤ６２４４はＨＳＦ１を枯渇させ、そしてより少ない程度ではあるが、斑点状フォーカスを誘導した（図１２Ａ〜Ｂおよび５Ａ〜Ｂ）。本発明者らは、ＡＺＤ６２４４誘導性の誤って折りたたまれたタンパク質のプロテアソーム分解の遮断が、凝集をさらに悪化させることを理論化した。実際に、ボルテゾミブ共処理は、ＡＺＤ６２４４誘導性の斑点状フォーカスを増大させた（図５Ａ〜Ｂ）。本発明者らは、拡大型ポリグルタミン鎖タンパク質（ｅｘｐａｎｄｅｄｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅｔｒａｃｔｐｒｏｔｅｉｎ）（ｐｏｌｙＱ７９）（Ｓａｎｃｈｅｚら，２００３）を使用して、凝集に対するＭＥＫの影響をさらに確認した。拡大したｐｏｌｙＱフラグメントを有するタンパク質は、凝集しやすく、神経変性障害に原因として関連する（ＯｒｒａｎｄＺｏｇｈｂｉ，２００７）。ＰｏｌｙＱ７９発現細胞は、予測されるように、大きな凝集物を含んだ（図１２Ｃ）。ＨＳＦ１ノックダウンおよびＡＺＤ６２４４はともに、ｐｏｌｙＱ凝集物を拡大した；重要なことには、ＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}発現は、ＡＺＤ６２４４誘導性凝集物拡大に拮抗した（図１２Ｄおよび５Ｃ〜Ｄ）。ボルテゾミブはまた、凝集を増強し、併用処置は、最大の凝集物を生じた（図５Ｃ〜Ｄ）。従って、ＭＥＫおよびプロテアソームの両方が、タンパク質凝集を抑制する。

凝集しやすいタンパク質は、βシート構造に関して富化されたアミロイド原線維（ＡＦ）を形成し得る（ＥｉｓｅｎｂｅｒｇａｎｄＪｕｃｋｅｒ，２０１２）。ＨＳＦ１およびＭＥＫがアミロイド形成に影響を及ぼすか否かを評価するために、本発明者らは、ｐｏｌｙＱ７９発現細胞を、アミロイドを診断するために広く使用されている２種の蛍光色素（ＣｈｉｔｉａｎｄＤｏｂｓｏｎ，２００６）、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）およびコンゴーレッド（ＣＲ）で染色した。ＰｏｌｙＱ７９発現は、予測されるように、ＴｈＴおよびＣＲ染色を増強した（図１２Ｅおよび１２Ｆ）。ＡＺＤ６２４４、ボルテゾミブ、および併用処理は、この染色をさらに強めた；そして、ＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}発現は、ＡＺＤ６２４４の効果に拮抗した（図５Ｅ〜Ｆ）。処理はまた、ヒト腫瘍細胞株のＴｈＴおよびＣＲ染色を増強した（図５Ｇおよび１２Ｇ）。このことは、内因性アミロイド様構造の出現を示唆する。可溶性アミロイドオリゴマー（ＡＯ）の存在は、アミロイド生成を確認した。ＡＯは、神経変性障害において鍵となる毒性種を構成すると考えられ、コンホメーション依存性抗体Ａ１１（ＣｈｉｔｉａｎｄＤｏｂｓｏｎ，２００６；Ｇｌａｂｅ，２００８；Ｋａｙｅｄら，２００３）によって検出され得る。処理は、ｐｏｌｙＱ７９によるＡＯ誘導を増悪させるのみならず、ヒト腫瘍細胞株において内因性ＡＯの生成をも誘発した（図５Ｈおよび５Ｉ）。ＡＺＤ６２４４に類似して、ＨＳＦ１枯渇は、内因性ＡＯおよびＡＦを誘導した（図１２Ｈおよび１２Ｉ）。以前に特徴付けられた抗体であるＯＣを、ＡＦを検出するために使用した（Ｋａｙｅｄら，２００７）。繰り返すと、ＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}発現は、ＡＺＤ６２４４誘導性アミロイド生成を抑制した（図５Ｊおよび５Ｋ）。

アミロイドの特有の特徴は、ＡＦを播種するそれらの能力である（ＣｈｉｔｉａｎｄＤｏｂｓｏｎ，２００６）。アミロイド播種実験において、ＨＳＦ１枯渇細胞の溶解物は、Ａβ ＡＦの形成を加速させた（図１２Ｊ）。同様に、ＡＺＤ６２４４、ボルテゾミブ、および併用で処理した細胞の溶解物は、全て増大した播種効能を示した（図５Ｌ）。これは、ＯＣ抗体を使用して確認された（図１２Ｋ）。ＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}発現は、ＡＺＤ６２４４の効果を破壊した（図５Ｌ）。さらに、透過型電子顕微鏡法から、ＤＭＳＯ処理細胞溶解物での播種は、無秩序のロッド様プロトフィブリルになる一方で、線維様構造の密な格子がＡＺＤ６２４４処理溶解物での播種後に出現することが明らかにされた；比較すると、ボルテゾミブ処理溶解物での播種は、成熟原線維を生じ、原線維の詰まったネットワークが、併用処置に由来する溶解物での播種後にアセンブリされた（図５Ｍ）。

ＡＺＤ６２４４およびボルテゾミブのアミロイド生成効果を、遺伝的に検証した。ボルテゾミブの主要標的である２６Ｓプロテアソームのβ５サブユニット（ＰＳＭＢ５）（Ｏｅｒｌｅｍａｎｓら，２００８）の枯渇は、ユビキチン化タンパク質の蓄積を引き起こした（図１２Ｌ）。薬理学的インヒビターを模倣して、ＭＥＫ、ＰＳＭＢ５、または両方の遺伝的枯渇は、全てアミロイド生成を誘発した（図１２Ｍ〜１２Ｒおよび５Ｎ）。

アミロイドがインヒビター誘導性の毒性に寄与するか否かを決定するために、本発明者らは、アミロイド生成をＴｈＴ（アミロイド原線維形成を、物理的結合を介して妨げる（Ａｌａｖｅｚら，２０１１））でブロックした。黒色腫細胞において、ＴｈＴは、インヒビターによるアミロイド誘導を抑制し、細胞増殖および生存を５０％改善した（図５Ｏ、５Ｐ、および５Ｑ）。ＣＲ処理およびＡ１１抗体でのＡＯの中和は、類似の保護を発揮した（図１２Ｓおよび５Ｒ）。弱められたアミロイド生成と一致して、ＨＳＦ１^{Ｓ３２６Ｄ}発現は、黒色腫細胞の増殖を刺激したのみならず、黒色腫細胞をＭＥＫ阻害に対して不応性にした（図５Ｓ〜Ｔ）。

驚くべきことに、ＡＺＤ６２４４は、初代マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）および組織においてＡＯを誘導しなかった（図５Ｐおよび１２Ｔ）。これは、マウスアミロイドを検出できないことに起因しない。なぜなら重篤なストレスは、マウス細胞においてＡＯを誘導したからである（図１２Ｕ）。これらの結果は、形質転換されていない細胞が、悪性細胞よりアミロイド生成に対して不応性であり得ることを示唆する。これを評価するために、本発明者らは、ＡＺＤ６２４４、ボルテゾミブ、および併用で処理した、初代ヒト乳腺上皮細胞（ＰＨＭＣ）、固定化ヒト乳腺上皮（ＭＣＦ１０Ａ）細胞、および腫瘍形成性乳腺上皮（ＭＣＦ７）細胞において、ＡＯレベルを比較した。これらの３種の処理の各々は、ＭＣＦ７細胞において顕著なＡＯ誘導、ＭＣＦ１０Ａ細胞において僅かな誘導、およびＰＨＭＣにおいて誘導なしを引き起こした（図５Ｖ）。類似パターンが、初代ヒトシュワン細胞（ＰＨＳＣ）およびそれらの悪性対応物である９０−８ＴＬ細胞およびＳ４６２細胞において観察された（図５Ｗ）。不死化および形質転換された細胞は、Ｓ４６２を除いて、ＡＯの上昇した基底レベルも示した（図５Ｖおよび５Ｗ）。興味をそそることに、ＡＯレベルは、悪性状態と正に相関した（図５Ｘ）。このことは、プロテオミクス不均衡を悪性疾患の内在する特徴として裏付ける。本発明者らは、Ｓ４６２細胞において上昇した基底ＡＯがないことが、アミロイド関連毒性に起因し得ると理論化した。実際に、汎カスパーゼインヒビターによる細胞死の遮断は、不死化および形質転換された細胞においてＡＯレベルを上昇させた。このことは、アミロイド生成を強調し；対照的に、初代細胞においてＡＯを上昇させなかったことを明らかにする（図５Ｘおよび５Ｙ）。このことは、アミロイド生成が存在しないことを裏付ける。これらの結果は、悪性細胞が特有にアミロイド生成に感受性であることを示す。

実施例８．プロテアソームおよびＭＥＫ阻害の併用は、腫瘍タンパク質恒常性を撹乱し、悪性疾患を抑制する
ＭＥＫおよびプロテアソーム阻害は、個々に、ある特定の程度まで、腫瘍細胞においてタンパク質恒常性を撹乱した；しかし、両方の併用は、この効果を増強し、従って、ヒト腫瘍細胞株の増殖および生存を顕著に損なった（図６Ａ）。注意すべきは、この併用は、初代細胞に影響を及ぼさなかった（図６Ａ）。

インビボでは、ＡＺＤ６２４４またはボルテゾミブ単独の低用量は、異種移植された黒色腫に対して顕著な影響を示さなかったのに対して、その併用は、それらの増殖を強力に遅らせた（図６Ｂおよび１３Ａ）。併用処置を受けた全てのマウスは、生存し続け、それらの体重は、一定のままであった；対照的に、他の群における全てのマウスは死滅し、体重の内の約２５％が失われた（図６Ｃおよび１３Ｂ）。ＡＺＤ６２４４またはボルテゾミブ単独は、腫瘍においてユビキチン化を僅かに上昇させた；しかし、その併用は、この効果を顕著に悪化させた（図６Ｄおよび１３Ｃ〜Ｆ）。ボルテゾミブは、ＨＳＦ１Ｓｅｒ３２６リン酸化およびＨＳＰ発現を誘導した一方で、ＡＺＤ６２４４共処置は、このストレス応答を抑制し、カスパーゼ３切断を誘導した（図６Ｄおよび１３Ｃ〜Ｆ）。よって、ＡＯは、併用処置を受けた腫瘍では顕著に上昇した（図６Ｅ）。特に重要なのは、ＡＯの量と腫瘍塊との間の逆相関である（図１３Ｇ）。このことは、悪性増殖に対するＡＯの悪影響を裏付ける。アミロイド生成と一致して、併用処置を受けた腫瘍は、強力な播種能力およびＣＲ染色の増強を示した（図６Ｆおよび６Ｇ−Ｈ）。腫瘍内ＡＦは、ＣＲ染色（図６Ｉ）、ＴｈＴ標識（図１３Ｈ）、およびＯＣ抗体での免疫染色（図６Ｊ）の顕著な特徴である複屈折によってさらに示された。対照的に、その併用処置は、上昇したユビキチン化にもかかわらず、同じ腫瘍を有するマウスの主要組織においてＡＯもアポトーシスも誘導しなかった（図１３Ｉおよび１３Ｊ）。

その併用処置が、実験的転移を妨げるか否かを調査するために、本発明者らは、ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現する黒色腫をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへと静脈内注射した。６週間の期間の間に、併用処置を受けたマウスのみが体重を増大させた（図６Ｋ）。このことは、健康の改善を示唆する。インビボ画像化から、ＤＭＳＯ、ＡＺＤ６２４４、またはボルテゾミブ単独で処置したマウスのうちの４０％においてルミネッセンスが検出された（図６Ｌ）。組織学的検査から、肺、骨格筋、脂肪組織、および卵巣への黒色腫転移が確認された（図６Ｍおよび表２）。対照的に、併用処置を受けたマウスのうちのいずれも、認識できるルミネッセンスも転移も示さなかった（図６Ｌおよび６Ｎ）。まとめると、これらの結果は、ＭＥＫおよびプロテアソーム阻害の併用が、腫瘍内でタンパク質毒性ストレスおよびアミロイド生成を誘発し、堅固な抗腫瘍性効果を発揮することを示す。

実施例９．アミロイド生成は、腫瘍抑制性である
強いＣＲ染色を示す腫瘍領域における顕著なアポトーシスは、処置誘導性毒性におけるアミロイド生成の原因となる役割を示唆する（図７Ａ）。これを確認するために、本発明者らは、インビボＣＲ投与を介して腫瘍内アミロイド誘導をブロックした。ＣＲは、黒色腫増殖を加速させたのみならず、ＭＥＫおよびプロテアソーム阻害の併用によって課された腫瘍抑制にも強力に拮抗した（図７Ｂ）。腫瘍組織へのＣＲの浸透は、このアミロイド染色の特徴である４９８ｎｍにおいて腫瘍溶解物の強い光吸収（Ｓｌａｄｅｗｓｋｉら，２００６）によって示される（図７Ｃ）。増強された悪性疾患と一致して、ＣＲ処置は腫瘍塊を拡大し、身体の状態を悪化させ、そして動物の生存を短くした（図１４Ａ、１４Ｂ、および７Ｄ）。

ＣＲは、腫瘍組織においてアミロイドを低減した一方で、ユビキチン化を低減しなかった（図７Ｅ、７Ｆ、および７Ｇ）。これらの結果は、ＭＥＫおよびプロテアソームインヒビターでのＣＲの干渉はないことを示し、さらに、アミロイド生成をブロックすることにおけるＣＲの特異的作用を裏付ける。加速した増殖に従って、ＣＲ処置マウスは、低下したカスパーゼ３切断を示した（図７Ｇ）。まとめると、これらの結果は、アミロイド生成が腫瘍抑制性でありかつＭＥＫおよびプロテアソーム阻害の併用の抗腫瘍性効果に明らかに寄与することを強く示唆する。

実施例１０．考察
Ａ．ＨＳＦ１は、新たなＭＥＫ基質である
予測外なことに、本発明者らの結果は、ＥＲＫがＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫシグナル伝達の効果を専ら起こさせる有力なパラダイムを疑って、ＭＥＫの生理的基質としてのＨＳＦ１を明らかにする。本発明者らの結果はさらに、ＭＥＫがＨＳＦ１を活性化するが、ＥＲＫがＨＳＦ１を不活性化することを示す。重要なことには、本発明者らの知見は、これら２つの表面上は矛盾する作用を統合し、３要素からなるＥＲＫ−ＭＥＫ−ＨＳＦ１タンパク質複合体のアセンブリを裏付ける。全体として、本発明者らの知見は、直線的な（ｌｉｎｅａｒ）というよりむしろ分岐したＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫカスケードを提唱する。ＭＥＫは、中核（ｃｅｎｔｒａｌｎｅｘｕｓ）として、上流の刺激を伝達し、かつ２つの不連続であるが相互に連結した下流のエフェクター経路（そのうちの一方は、ＥＲＫによって媒介され、他方は、ＨＳＦ１によって媒介される）を左右する（図７Ｈ）。負のフィードバック様式において、ＥＲＫは、ＭＥＫの阻害性リン酸化を介してＨＳＦ１活性化を微細に調和させる（図７Ｈ）。本発明者らの研究は、ＭＥＫ媒介性Ｓｅｒ３２６リン酸化に焦点を当てた一方で、他のキナーゼもまた、ＨＳＦ１を調節し得る。

Ｂ．ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫシグナル伝達によるタンパク質恒常性の保護
本発明者らの知見は、タンパク質恒常性を調節することにおけるＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫシグナル伝達の新たな機能を明らかにする。多様なタンパク質毒性ストレッサーが、一般にＭＥＫを活性化する（図１Ａ）。ＨＳＦ１活性化を通じて、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫシグナル伝達は、プロテオミクス完全性を保護するために細胞のシャペロン能を高める。

ＭＥＫ−ＨＳＦ１調節は、鍵となる生理学的関わり合いを有し得る。マイトジェンは、ＲＡＳ／ＭＡＰＫシグナル伝達および下流のｍＴＯＲＣ１を刺激する（ＬａｐｌａｎｔｅａｎｄＳａｂａｔｉｎｉ，２０１２）。しかし、ｍＴＯＲＣ１によって駆動される、高められたタンパク質合成は、細胞のタンパク質品質制御装置を妨げる。従って、ＭＥＫを介して、ＨＳＦ１制御性のシャペロン系を同時に動員して、生産的なタンパク質合成を担保し、それによって、プロテオミクス不均衡を避けることは、マイトジェンにとって必要なようである。興味深いことに、ＭＥＫはまた、ＨＳＦ１を介して翻訳能を左右する（図４Ｋ）。従って、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫシグナル伝達は、タンパク質量およびタンパク質品質の制御装置を同期化して、細胞増殖を支援する。

同様にＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫシグナル伝達が、タンパク質の誤った折りたたみによる疾患（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇｄｉｓｅａｓｅ）（例えば、アミロイドーシス）に、タンパク質恒常性を守ることを介して拮抗し得ることを推測するように動機付けられる。

Ｃ．がんのプロテオミクス不安定性
本発明者らの知見は、悪性状態のアミロイド生成促進的性質（ｐｒｏ−ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃｎａｔｕｒｅ）を際立たせる。悪性細胞のアミロイド生成に対する感受性は、それらの弱体化したタンパク質恒常性状態からおそらく端を発し、これは、摂動に対して特に脆弱である。形質転換されていない細胞とは異なり、悪性細胞は、アミロイドの上昇した基底レベルによって証明される、プロテオミクス不均衡に絶えず耐えている。（図５Ｘおよび５Ｙ）。よって、ＨＳＦ１（さもなければ初代細胞では潜伏性である）は、脆いプロテオミクス平衡を保持するために腫瘍細胞において構成的に動員されている（図７Ｈ）。プロテオミクスカオス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｃｈａｏｓ）は、ＨＳＦ１不活性化またはさらに軽度のタンパク質毒性の傷害のいずれかの後に結果として必然的に起こる。よって、腫瘍細胞は、それらの悪性表現型を持続させるためにＨＳＦ１に依拠する（Ｄａｉら，２００７）。対照的に、内在性タンパク質毒性ストレスの欠如は、初代細胞に、強いプロテオミクスの変動を有効に緩衝し、それによって、有害な転帰−凝集およびアミロイド生成を避ける能力を与える。

刺激的なことには、初代細胞と悪性細胞との間でプロテオミクス摂動に対する異なる感受性は、悪性疾患と戦うために活用され得る。本発明者らの知見は、悪性疾患におけるＭＥＫ阻害の毒性における、タンパク質毒性ストレスおよびアミロイド生成の重要な役割を裏付ける。タンパク質不安定化を通じて、ＭＥＫインヒビターは、プロテアソームインヒビターとは機械論的に異なるタンパク質毒性ストレッサーとして作用する。単一の薬剤として適用される場合、ＭＥＫインヒビターまたはプロテアソームインヒビターは、腫瘍タンパク質恒常性を弱らせる能力はない。しかし、併用して適用すると、アミロイド生成を惹起して、甚大な影響を発揮する。重要なことには、本発明者らの知見は、アミロイド生成の腫瘍抑制性の性質を強く示唆する（図５Ｏ〜５Ｒおよび７Ｂ）。これらの知見は、アミロイド生成が、相当のプロテオミクス不均衡を示して、腫瘍進行をモニターしかつ治療応答を評価するにあたって、予後における価値があり得ることを暗示する。概念的には、本発明者らの知見は、プロテオミクス不安定性が悪性状態と関連した内在的特徴であり、従って脆い腫瘍タンパク質恒常性の撹乱が実現可能な治療的ストラテジーであり得ることを示唆する。

実施例１１．処置方法
転移性黒色腫を有する患者を、ＭＥＫインヒビターおよびプロテアソームインヒビターの併用で処置する。すなわち、上記患者を、ＭＥＫインヒビターとしてのセルメチニブおよびプロテアソームインヒビターとしてのボルテゾミブで処置する。セルメチニブを、毎日の静脈内注射に関しては水で乾燥粉末を再構成した後に０．３２ｍｇ／Ｋｇで、または毎日の経口投与を通じて食品とともに０．６４ｍｇ／Ｋｇで、投与する。ボルテゾミブを、毎日の静脈内注射に関しては水で乾燥粉末を再構成した後に０．０４ｍｇ／Ｋｇで投与する。

その患者は、腫瘍増殖、腫瘍のサイズ、または他の臨床的徴候および黒色腫の症状の低減を示すと予測される。

均等物
前述の書面による明細書は、当業者が上記実施形態を実施するのを可能にするために十分であると考えられる。前述の説明および実施例は、ある特定の実施形態を詳述し、本発明者らによって企図されるベストモードを記載する。しかし、どれほど詳細にその前述が本文中に現れていようが、その実施形態は多くの方法で実施され得、添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであることは、認識される。

本明細書で使用される場合、用語約とは、明示的に示されていようがいまいが、例えば、整数、有理数、およびパーセンテージを含む数値に言及する。用語約は一般に、当業者がその記載される値に等しい（例えば、同じ機能または結果を有する）と考える数値の範囲（例えば、その記載される範囲の±５〜１０％）に言及する。少なくともおよび約のような用語が、数値または範囲のリストの前にある場合、その用語は、そのリストの中に提供される値または範囲の全てを修飾する。場合によっては、用語約は、最も近い有効数字へと丸められる数値を含み得る。

Claims

ＭＥＫインヒビターをプロテアソームインヒビターと組み合わせて投与する工程を包含する、がんを処置する方法。
前記がんは、固形腫瘍である、請求項１に記載の方法。
前記固形腫瘍は、胆道（胆管癌）、膀胱がん、脳のがん、乳がん、子宮頚がん、結腸直腸癌、子宮内膜がん、類表皮がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、頭頚部がん、肝細胞がん（肝がん）、腎臓がん、肺がん、中皮腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、小児悪性疾患、前立腺がん、腎がん、肉腫、皮膚がん（黒色腫を含む）、小腸腺がん、小細胞肺がん、精巣がん、または甲状腺がんである、請求項２に記載の方法。
前記固形腫瘍は、黒色腫である、請求項２に記載の方法。
前記がんは、ＮＦ１、ＲＡＳ（Ｎ−ＲＡＳ、Ｋ−ＲＡＳ、およびＨ−ＲＡＳを含む）、ＲＡＦ（Ａ−ＲＡＦ、Ｂ−ＲＡＦ、およびＣ−ＲＡＦを含む）、およびＭＥＫ（ＭＥＫ１およびＭＥＫ２を含む）の変異から選択される少なくとも１つの変異を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記がんは、少なくともＲＡＳ変異を有する、請求項５に記載の方法。
前記ＲＡＳ変異は、少なくともコドン１２、コドン１３、またはコドン６１にある、請求項６に記載の方法。
前記がんは、少なくともＲＡＦ変異を有する、請求項５に記載の方法。
前記ＲＡＦ変異は、少なくともコドン６００にある、請求項８に記載の方法。
前記がんは、少なくともＭＥＫ１またはＭＥＫ２の変異を有する、請求項５に記載の方法。
前記ＭＥＫ１変異は、少なくともＰ１２４ＳまたはＳ２０３Ｋである、請求項８に記載の方法。
前記ＭＥＫ２変異は、少なくともＱ６０Ｐである、請求項８に記載の方法。
前記ＭＥＫインヒビターは、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２）、ＰＤ−３２５９０１、コビメチニブ、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ−１０４０）、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ、レファメチニブ（ＲＤＥＡ１１９）、ＰＤ９８０５９、ＢＩＸ０２１８９、ピマセルチブ（ＡＳ−７０３０２６）、ＳＬ−３２７、ＢＩＸ０２１８８、ＡＺＤ８３３０、ＴＡＫ−７３３、ホノキオール、またはＰＤ３１８０８８、ＰＤ０３２５９０１、ＷＸ−５５４、ＧＤＣ−０６２３、Ｅ６２０１、ＲＯ４９８７６５５、ＲＯ５１２６７６６である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
前記ＭＥＫインヒビターは、セルメチニブである、請求項１３に記載の方法。
前記プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブ、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン−３−ガレート、サリノスポラミドＡ、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ（ＯＮＸ０９１２）、デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）、ＭＬＮ９７０８、エポキソミシン、ＭＧ１３２、イキサゾミブ（ＭＬＮ２２３８）、ＰＩ−１８４０、またはセラストロールである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
前記プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブである、請求項１５に記載の方法。
前記プロテアソームインヒビターおよび前記ＭＥＫインヒビターは、いずれかの薬剤が単独で投与される場合に治療利益を引き起こさない投与量で投与される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
セルメチニブは、約５ｍｇ／Ｋｇで投与され、ボルテゾミブは、約０．５ｍｇ／Ｋｇで投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
前記がんは、プロテアソームインヒビターまたはＭＥＫインヒビターのうちの少なくとも一方での処置に抵抗性である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
前記併用療法は、相乗効果を生じる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
前記がんは、プロテアソームインヒビターまたはＭＥＫインヒビターのうちの少なくとも一方での処置に抵抗性である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。