JP2018520164A - プロテアソームインヒビターと組み合わせてmekインヒビターを投与することによりがんを処置する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
プロテアソームインヒビターと組み合わせてMEKインヒビターでがんを処置するための方法。
がん処置、特に、黒色腫のようながんを処置することが困難ながん処置は、その疾患の顕著な罹患率および死亡率なしに、患者が健康的な生活を取り戻す必要があるという臨床上の利益を達成するために、さらなる進展を要する。
記載によれば、がんを処置するための方法は、MEKインヒビターをプロテアソームインヒビターと組み合わせて投与する工程を包含する。
表1は、本明細書で参照されるある特定の配列のリストを提供する。
I.がんを処置するための方法
がんを処置するための方法は、MEKインヒビターをプロテアソームインヒビターと組み合わせて投与する工程を包含する。本発明者らは、HSF1をMEK(これは、HSF1媒介性タンパク質毒性ストレス応答を活性化する)の新たな基質として同定した。本発明者らはまた、MEK阻害がタンパク質恒常性を撹乱し、腫瘍抑制性アミロイド生成を誘発することを見出した。本発明者らは、MEKインヒビターとプロテアソームインヒビターとの併用が、さらなる利点を提供すると考える。
II.薬学的組成物および投与
上記MEKインヒビターおよび上記プロテアソームインヒビターは、別個の組成物において調製され得るか、またはそれらは、単一の合わされた投与形態へと製剤化され得る。例えば、上記インヒビターは、錠剤またはカプセル剤として調製され得る。両方の薬剤は、単一の錠剤もしくはカプセル剤の中に、二層錠剤もしくはカプセル剤の中の別個の区画として、または別個の錠剤またはカプセル剤の中に、共製剤化され得る。別の実施形態において、上記インヒビターは、非経口投与経路を介する投与前に、注射用水で混合されるべき乾燥粉末化形態で調製され得る。このような実施形態において、それらは、同じバイアルの中に共製剤化されてもよいし、それらは患者への投与のために別個に調製されてもよい。
上記インヒビターが別個に製剤化される場合、それらは、同時にまたは逐次的な順序で(同日にまたは異なる日に、のいずれも含む)投与され得る。
A.近傍ライゲーションアッセイ
細胞を、PBS中の4% ホルムアルデヒドで、15分間室温において固定した。0.3% Triton X−100を含むPBS中の5% ヤギ血清でブロッキングした後、細胞を、ブロッキング緩衝液中で1:200希釈した1対のウサギおよびマウス一次抗体とともに、一晩4℃においてインキュベートした。Duolink(登録商標)PLA(登録商標)抗ウサギプラスおよび抗マウスマイナスプローブ(OLINK Bioscience)とともに37℃において1時間インキュベートした後、ライゲーション、ローリングサークル増幅、および検出を、Duolink(登録商標) In Situ Detection Reagents Red(OLINK Bioscience)を使用して行った。核を、Hoechst 33342で染色した。シグナルを、Leica TCS SP5共焦点顕微鏡を使用して可視化した。
脱パラフィン化および再湿潤化(rehydration)の後に、腫瘍切片を、PBS中の0.5% CRで室温において20分間染色し、続いて、アルカリ性溶液(0.01% NaOH、50% アルコール)中で区別した。核を、Hoechst 33342またはヘマトキシリンのいずれかで染色した。Leica TCS SP5共焦点顕微鏡を使用して蛍光を可視化し、偏光フィルタを装備したLeica DM5000B正立顕微鏡を使用して複屈折を可視化した。ThT染色のために、切片を、PBS中の0.2% ThTで室温において10分間染色し、1% 酢酸中で2分間すすぎ、ddH2Oで3回洗浄した。核を、SYTO(登録商標)62(Life Technologies)で染色した。
A2058細胞を、9週齢の雌性NOD.CB17−Prkdc<scid>/J(NOD/SCID)マウス(The Jackson Laboratory)の左側腹部にs.c.注射した。CR処置のために、マウスに、AZD6244およびボルテゾミブ処置の併用の1日前に、PBSまたはCRをi.p.注射した。腫瘍容積を、式4/3πR3に従って計算した。実験的転移のために、操作したA2058細胞を、10週齢の雌性NOD/SCIDマウスへと、尾静脈注射を介して移植した。全てのマウス実験を、The Jackson Laboratory動物実験委員会によって承認されるプロトコルの下で行った。
全ての統計分析を、Prism 6.0(GraphPadソフトウェア)を使用して行った。統計的有意性:*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001。
1.配列
qRT−PCRのためのプライマー配列を表1(配列番号1〜22)に提供し、ChIPのためのプライマー配列を表1(配列番号23〜32)に提供する。
WM115、WM278、およびA2058を除く全ての腫瘍細胞株は、以前に記載された(Daiら, 2007)。WM115およびWM278細胞は、Luke Whitesell博士から親切にも贈られた。A2058細胞は、ATCCから購入した。全ての細胞培養物を、10% ウシ胎仔血清を補充したDMEM中で維持した。初代ヒト乳腺上皮細胞(PHMC)を、Lonzaから購入し、完全乳腺上皮細胞培地(ScienCell Research Laboratories)中でポリ−L−リジン被覆プレート上で培養した。初代ヒトシュワン細胞(PHSC)を、ScienCell Research Laboratoriesから購入し、完全シュワン細胞培地(ScienCell Research Laboratories)中でポリ−L−リジン被覆プレート上で培養した。
全RNAを、RNA STAT−60試薬(Tel−Test, Inc.)を使用して抽出し、RNAを、Verso cDNA合成キット(Thermo Fisher Scientific)を使用して逆転写のために使用した。等量のcDNAを、DyNAmo SYBR Green qPCRキット(Thermo Fisher Scientific)を使用して定量的PCR反応のために使用した。シグナルを、ABI 7500 Real−Time PCR System(Applied Biosystems)によって検出した。各遺伝子に関する個々のプライマーの配列を、補足資料中に列挙する。
プラスミドを、TurboFectトランスフェクション試薬(Thermo Scientific)でトランスフェクトした。培養上清中のSEAPおよびルシフェラーゼ活性を、それぞれ、Ziva(登録商標) Ultra SEAP Plus Detection Kit(Jaden BioScience)およびGaussia Luciferase Glow Assay Kit(Thermo Scientific)を使用して定量した。ルミネッセンスシグナルを、VICTOR3 Multilabelプレートリーダー(PerkinElmer)によって測定した。
ビオチン化理想HSE(
陰性コントロールsiRNA(これは、ヒトおよびマウスにおける既知の遺伝子を標的としない)を、Thermo Fisher Scientific(D−001810−01)から購入した。siERK1_1(SIHK1207)、siERK1_2(SIHK1208)、siERK1_3(SIHK1209)、siERK2_1(SIHK1183)、およびsiERK2_2(SIHK1184) siRNAを、Sigma−Aldrichから購入した。siRNAを、10nM最終濃度で、Mission(登録商標) siRNAトランスフェクション試薬(Sigma−Aldrich)を使用してトランスフェクトした。MEK1(TRCN0000002329)、MEK2(TRCN0000007006)、MEK1/2(TRCN0000007007)、およびPSMB5(TRC0000003918およびTRC0000003919)を標的とするレンチウイルスshRNAを、Thermo Fisher Scientificから購入した。レンチウイルススクランブルおよびHSF1標的化(hA6)shRNAは、以前に記載された(Daiら, 2007)。
全細胞タンパク質抽出物を、冷細胞溶解緩衝液(100mM NaCl、30mM Tris−HCl pH7.6、1% Triton X−100、30mM NaF、1mM EDTA、1mM オルトバナジン酸ナトリウム、およびThermo ScientificのHaltTM プロテアーゼインヒビターカクテル)中で調製した。タンパク質を、SDS−PAGEゲルで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。一次抗体を、洗浄緩衝液中で、一晩4℃において添加した。ペルオキシダーゼ結合体化二次抗体を、室温において1時間添加し、シグナルを、SuperSignal West化学発光基質(Thermo Fisher Scientific)によって可視化し、続いてフィルムへ曝露した。
免疫沈降させたERK複合体を、1×インビトロキナーゼ緩衝液(25mM MOPS pH7.2、12.5mM β−グリセロホスフェート、25mM MgCl2、5mM EGTA、2mM EDTA、0.25mM DTT、およびThermo ScientificのHaltTM プロテアーゼインヒビターカクテル)中に再懸濁し、室温において20分間、U0126またはFR180204とともにインキュベートした。100μM ATPおよび精製組換えHisタグ付きHSF1、GSTタグ付きERK1、またはウシMBPタンパク質を添加した後、キナーゼ反応物を、25℃において30分間、サーモミキサーで穏やかに振盪しながらインキュベートした。サンプルを、5分間煮沸して、反応を停止させた。
組換えホタルルシフェラーゼタンパク質(Promega)を、変性緩衝液(25mM HEPES(pH7.5)、50mM KCl、5mM MgCl2、5mM β−メルカプトエタノール、および6M グアニジンHCl)とともに37℃において20分間インキュベートすることによって変性させた。再折りたたみアッセイを行うために、再折りたたみ緩衝液(25mM HEPES(pH7.5)、50mM KCl、5mM MgCl2、10mM DTT、および1mM ATP)中で希釈した200nM 変性ルシフェラーゼを、受動溶解緩衝液(passive lysis buffer)(10mM Tris−HCl pH7.5、2mM DTT、1% Triton X−100、および2mM EDTA)中で抽出した5mg/ml 細胞溶解物とともにインキュベートした。種々の時点で、20μl 再折りたたみ混合物を除去し、再折りたたみ緩衝液中で希釈したD−ルシフェリン(PerkinElmer)とともにインキュベートした。ルミネッセンスシグナルを、VICTOR3 Multilabelプレートリーダー(PerkinElmer)によって測定した。
1×107 細胞を、1% ホルムアルデヒドで8分間固定し、125mM グリシンを添加して、架橋を停止させた。冷PBSで洗浄した後、細胞を集め、細胞質抽出緩衝液(20mM Tris−HCl、85mM KCl、0.5% Triton X−100、pH8.0)中で10分間溶解し、続いて、5,000rpmにおいて5分間遠心分離した。ペレットを、核抽出緩衝液(50mM Tris−HCl、1% SDS、10mM EDTA、pH8.0)中で10分間さらに溶解し、超音波処理してクロマチンを平均長500bpのフラグメントへと剪断した。16,000×gにおいて15分間遠心分離した後、上清を集め、10%をインプット(input)としてとっておいた。その上清を事前にきれいにするために、25μl ChIPグレードのプロテインGアガロースビーズ(Cell Signaling Technology)を添加し、4℃において3時間インキュベートした。事前にきれいにした上清を、4μg ウサギ抗HSF1抗体(H−311, Santa Cruz Biotechnology)または4μg 正常ウサギIgGとともに4℃において一晩インキュベートし、続いて、25 μl ChIPグレードのプロテインGビーズとともに4℃において3時間インキュベートした。ビーズを、短時間遠心分離することによってペレットにし、低塩緩衝液、高塩緩衝液、LiCl緩衝液、およびTE緩衝液で逐次的に洗浄した。最後の洗浄の後、50μl Chelex−100樹脂を各サンプルに、および上記インプットに添加し、そして上記混合物を、99℃において10分間煮沸した。架橋を戻すために、40μg プロテイナーゼKを添加し、65℃において1時間インキュベートし、次いで、99℃において10分間煮沸した。16,000gにおいて2分間遠心分離した後、2μl 上清を、リアルタイムqPCRのために使用した。IPシグナルを、インプットシグナルに対して正規化した。
等しい数の細胞を、1% Triton X−100を含む細胞溶解緩衝液とともに氷上で20分間インキュベートした。その粗製溶解物を、500×gにおいて2分間、4℃においてまず遠心分離した。その上清を、20,000×gにおいて20分間、4℃においてさらに遠心分離した。その最終上清およびペレットを、それぞれ、界面活性剤可溶性画分および界面活性不溶性画分として集めた。不溶性画分を、SDS−PAGEのために、2% SDS中で、高強度においてBioruptor(登録商標) Sonication System(Diagenode Inc.)を使用してさらに超音波処理した。
PBSで洗浄した後、細胞を、4% ホルムアルデヒドによって室温において30分間固定した。固定およびPBS洗浄後、細胞を、2ml 透過緩衝液(0.5% Triton X−100、3mM EDTA)中で再懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。PBSで洗浄した後、細胞を、PBS中に溶解した10μM ThTまたは50nM CRで30分間洗浄した。ThT蛍光を、FACSCaliburTM フローサイトメーター(BD Biosciences)によって測定した。
可溶性アミロイドプレフィブリル状(prefibrillar)オリゴマーを定量するために、PBS中で希釈した20μg 可溶性細胞タンパク質を、96ウェルELISAプレートの各ウェルに関して、4℃において一晩インキュベートし、続いて、室温において1時間ブロックした(PBS−T中5% 無脂肪乳)。各ウェルを、100μl アミロイドオリゴマー抗体(A11、ブロッキング緩衝液中で1:1000希釈)とともに室温において2時間インキュベートした。PBS−Tで洗浄した後、ヤギ抗ウサギAb HRP結合体(ブロッキング緩衝液中で1:5000希釈)を各ウェルに添加し、室温において1時間インキュベートした。洗浄後、100μl 1−StepTM Ultra TMB−ELISA基質(Thermo Fisher Scientific)を各ウェルに添加した。
インビトロ播種の後、アミロイド原線維をペレット化し、蒸留H2O中に再懸濁した。1滴の原線維溶液を、200メッシュ炭素被覆ニッケルグリッド(Electron Microscopy Sciences)上に置いた。1分後、その残っている液体を毛管作用で逃がした。直ぐに、1滴の2% 酢酸ウラニル溶液をそのグリッドの上に1分間置いた。毛管作用で逃がした後、そのグリッドを風乾し、80kVで作動するJEOL 1230透過型電子顕微鏡(JEOL USA Inc.)の下で検鏡した。
画像化の前に、XenoLight RediJect D−ルシフェリン(150mg/kg)を、ルシフェラーゼ発現A2058細胞を予め注射したNOD/SCIDマウスへとi.p.注射した。マウスにイソフルランで麻酔をかけ、ルミネッセンスシグナルを、Xenogen IVIS(登録商標) Lumina IIシステム(Caliper Life Sciences)を使用して記録した。背側および腹側の両方の位置からの画像を、取り込んだ。各マウスの全光子フラックスを、Living Image(登録商標)ソフトウェアを使用して定量した。
種々のサンプルに由来する細胞の等しい数を、冷細胞溶解緩衝液で溶解した。20,000×gにおいて15分間、4℃において遠心分離した後、界面活性剤不溶性ペレットを、RIPA緩衝液で3回さらに抽出した。その最終の不溶性ペレットを、ピペッティングすることによって10% SDS中に再懸濁し、直ぐに、20μm開口部を備えたMultisizerTM 3コールターカウンター(Beckman Coulter)を使用して、凝集物サイズ分けに供した。
PBS中の4% ホルムアルデヒドで室温において15分間固定した後、細胞を、0.3% Triton X−100を含むPBS中の5% ヤギ血清で室温において60分間ブロックし、Lys48特異的ユビキチンAbs(Millipore、ブロッキング緩衝液中で1:500希釈)とともに一晩4℃においてインキュベートした。腫瘍切片のために、抗原を、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液中で回収し、続いて、ブロッキングした。切片を、切断型カスパーゼ3 Asp175 Abs(Cell Signaling Technology、ブロッキング緩衝液中で1:500希釈)またはアミロイド原線維(OC)Abs(StressMarq Biosciences、ブロッキング緩衝液中で1:200希釈)のいずれかとともに一晩4℃においてインキュベートした。PBSで洗浄した後、切片を、Alexa Fluor(登録商標) 568または488ヤギ抗ウサギIgG Abs(Life Technologies、ブロッキング緩衝液中で1:1000希釈)とともにインキュベートした。Hoechst 33342核対比染色を行った後、蛍光画像を、Leica TCS SP5共焦点顕微鏡によって取り込んだ。
A2058細胞を、150mm 培養ディッシュ中で増殖させ、DMSOまたは20nM AZD6244で8時間処理した。同じ処理を受けた2×108 細胞をプールし、液体窒素中で急速凍結した。細胞ユビキチン化のグローバル定量分析(global quantitative analysis)を、ユビキチン分枝(K−ε−GG)モノクローナル抗体によるユビキチン化ペプチドの富化と液体クロマトグラフィータンデム質量分析法(liquid chromatograph tandem mass spectrometry)(LC−MS/MS)とを併用するUbiScan(登録商標)サービス(Cell Signaling Technology)を介して行った。2つの技術的複製物を、各処理に関して分析した。
細胞を、2% PBS中で懸濁し、超音波処理して、溶解物を調製した。播種実験を、96ウェル黒色マイクロプレート(100μl反応容積/ウェル)で行った。各反応物は、80μl PBS中に希釈した20μg 細胞タンパク質および0.01M NaOH中に溶解した10μlの200μM 合成ヒトAβ1−42ペプチド(GenScript)を含んだ。反応物を、室温において穏やかに振盪しながらインキュベートした。アミロイド形成を検出するために、PBS中に溶解した10μlの100μM ThT(Sigma)を反応物に添加し、蛍光を、Ex450nm/Em482nmにおいて測定した。
リン酸化は、HSF1活性化に顕著に影響を与える(Guettoucheら, 2005)。このことは、シグナル伝達経路の鍵となる役割を示唆する。このような経路がどのようにPSRを調節するかを解明するために、本発明者らは、RAS−MEK−ERKシグナル伝達に焦点をあてて、ストレスに対するそれらの応答を先ず試験した。タンパク質毒性ストレスを加えるために、本発明者らは、多様な作用機構を有するストレッサー(ヒートショック(HS)、プロテアソームインヒビターMG132、ヒストンデアセチラーゼ6インヒビターであるツバスタチン、アミノ酸アナログであるアゼチジン、およびHSPインヒビター(HSP90に関しては17−DMAGおよびHSP70に関してはVER155008)を含む)を適用した(Kawaguchiら, 2003; Masseyら, 2010; Morimoto, 2008; Neckers and Workman, 2012)。ストレッサーへの一過性の曝露は、細胞生存度を損なわなかった(図8A)が、この経路の2つの鍵となる成分であるMEKおよびERKのリン酸化を上昇させた(図1A)。MEK Ser218/222およびERK Thr202/Tyr204リン酸化は、それらの活性状態を表す(Dhillonら, 2007; Roux and Blenis, 2004)。一致して、全てのストレッサーは、ERKの下流にある転写因子であるELK1(Roux and Blenis, 2004)を活性化させた(図1B)。
MEKがHSF1を直接的に活性化するか否かを決定するために、本発明者らは、共免疫沈降(co−IP)によって、内因性MEK−HSF1相互作用を調べた。MEK1/2タンパク質がHSなしでHSF1と明らかに沈降しなかった一方で、HSは、顕著なco−IPを引き起こした(図2Aおよび2B)。このことは、ストレス誘導性のMEK−HSF1相互作用を示す。HSF1の移動度のシフトは、HS誘導性リン酸化をマークする(図2A)。これらのMEK−HSF1相互作用を、組換えタンパク質の発現を介して検証した(図9Aおよび9B)。MEKおよびHSF1が直接接触しているかを決定するために、本発明者らは、近傍ライゲーションアッセイ(PLA)技術(Claussonら, 2011)を使用した。抗体特異性を、免疫染色することによって検証した(図9Cおよび9D)。MEKが機能する細胞(MEK−proficient cell)において、PLAシグナルは、HSなしで僅かに見え、HSは、これらのシグナルを強めた(図2C)。MEK欠損細胞において、HSの後であってもごく弱いシグナルしか検出されなかった(図2C)。これは、PLAの特異性を確認する。注意すべきは、PLAシグナルは、細胞質より核においてより明白であった(図2C)。このことは、相互作用の顕著に核の局在性を明らかにする。これらの結果は、直接的なMEK−HSF1会合を強く示唆する。
ERKがどのようにしてHSF1を不活性化するかを解明するために、本発明者らは、MEK媒介性HSF1活性化に対するERKの影響をまず調べた。ERK1枯渇はMEK−HSF1相互作用を促進した(図2F)のに対して、ERK1過剰発現は、これらの相互作用を弱めてHSF1を抑制した(図2Gおよび9E)。従って、本発明者らは、3つの考えられるシナリオを予想した(図2H):1)両方のMEK基質、ERKおよびHSF1が、MEK相互作用に関して競合する;2)ERKは、MEKのように、HSF1を結合し、それによってHSF1相互作用に関して競合する;ならびに3)ERKは、HSF1に向かうMEKキナーゼ活性を阻害する。この最初の2つのシナリオの各々は、2つのタンパク質複合体の間の競合を推測する;対照的に、第3のシナリオは、ERKがMEKおよびHSF1と、単一のタンパク質複合体へとアセンブリすることを推定する。興味深いことに、HSの下では、HSF1は、MEKおよびERKの両方を沈降させ(図2I)、ERKは、MEKおよびHSF1の両方を沈降させた(図2J)。これらの結果は、独立したMEK−ERK複合体およびMEK−HSF1複合体の存在を排除しないが、それらは、第1のシナリオで示されるように、その2つの複合体が安定かつ優勢であることの反証となる。第2のシナリオを試験するために、本発明者らは、ERK−HSF1相互作用をPLAによって検出した。なぜならこのシナリオは、HSF1を、ERKおよびMEKの両方の基質として推定するからである。ERK抗体の特異性を、ERK枯渇細胞において検証した(図9F)。明らかなMEK1−ERK相互作用(図2K)とは対照的に、ERK−HSF1相互作用を示す明らかなPLAシグナルは検出されなかった(図2L)。このことは、これら2つのタンパク質の間の直接的接触がないことを示唆する。さらに、ERK1過剰発現はMEK−HSF1相互作用を弱めた一方で、ERK1タンパク質は、HSF1とあまり沈降しなかった(図2G)。これは、第2のシナリオによって推定される高まったERK1−HSF1相互作用とは矛盾する。従って、これらの結果は、第2のシナリオを却下するのみならず、ERKが、第3のシナリオと一致して、HSF1とMEKを介して複合体化することをも示唆する。重要なことには、MEK枯渇は、ERK−HSF1 co−IPを顕著に低下させた(図2J)。これらの結果は、ERK、MEK、およびHSF1を含むタンパク質複合体(ここでERKは、HSF1を間接的に、MEKの阻害を介して抑制する)の存在を示唆する。
HSの下で、HSF1は、一連のリン酸化事象を受ける。その中でも、Ser326リン酸化は、その活性化を刺激する(Guettoucheら, 2005)。しかし、キナーゼの正体は、捕らえにくいままである。MEKがSer326をリン酸化するか否かを決定するために、本発明者らは、HSF1WTタンパク質を認識するが、HSF1S326Aタンパク質を認識しないホスホ特異的抗体を使用して、この改変に対するMEK遮断の効果を調べた(図10A)。MEKノックダウンまたはU0126処置のいずれも、Ser326リン酸化を損なった(図3Aおよび10B)。逆に、構成的に活性な変異体であるMEK1DD(S218D/S222D)(Brunetら, 1994a)は、HSF1のSer326リン酸化および活性化をHSなしで誘導した(図3Bおよび3C)。ERK阻害は、Ser326リン酸化を増強し;そして、MEK枯渇は、この効果を破壊した(図3Dおよび10C)。このことは、MEK依存性調節を示す。HSF1S326A変異体は、損なわれた転写活性を示し(図3E)、それらの欠陥のある核トランスロケーションおよびDNA結合能と一致する(図10D〜Eおよび図3F)。さらに、HSF1タンパク質は、MEK欠損細胞において低下された(図3Aおよび10F)。MEKがHSF1安定性に影響を及ぼすか否かを決定するために、本発明者らは、シクロヘキシミド追跡実験(cycloheximide chase experiment)を行った。MEK枯渇は、HSF1WTタンパク質の半減期を短縮した;重要なことには、HSF1S326A変異体は、MEKが機能する細胞においてあまり安定ではなかった一方で、それらの安定性は、MEK欠損によって顕著には影響を受けなかった(図3G)。このことは、MEKがHSF1を、Ser326リン酸化を主に介して安定化することを示唆する。これらの結果は、MEKが、その活性化および安定性にとって不可欠な改変であるインビボでのHSF1 Ser326リン酸化を制御することを示す。
HSF1は、HSPを介して細胞タンパク質恒常性を維持し得る。タンパク質折りたたみに対するHSF1の影響を調べるために、本発明者らは、グルココルチコイドレセプター(GR)をモデルとして使用した。適切なGR折りたたみは、HSP90に依存し、誤って折りたたまれたタンパク質は、ユビキチン−プロテアソーム系によって除去される(Taipaleら, 2010)。HSF1ノックダウンは、GR−GFPユビキチン化および枯渇を誘導した(図11A)。このことは、HSF1欠損によるタンパク質不安定化を示す。このことは、細胞のシャペロン能の低下から生じた。なぜならHSF1欠損細胞の溶解物は、変性ルシフェラーゼを再活性化するにあたってあまり効率的ではなかったからである(図11B)。HSF1欠損に類似して、MEK遮断は、GR−GFPを枯渇させた;そしてこの枯渇は、GFP不安定性または一般的な発現変化に起因しなかった。なぜなら共発現したGFPは、影響を受けなかったからである(図4A)。代わりに、MEK遮断は、GR−GFPをユビキチン化した(図4B)。これは、損なわれたプロテアソーム機能に起因しない。なぜならボルテゾミブによるプロテアソーム阻害は、GR−GFP蓄積を引き起こし、MEKインヒビターは、プロテアソーム活性に影響を及ぼさなかったからである(図11C〜11E)。実際に、AZD6244およびMEKノックダウンは両方とも、シャペロン能を枯渇させた(図4Cおよび11F)。このことは、MEKによるタンパク質の折りたたみの調節および安定性を明らかにする。
界面活性剤不溶性画分中の増大したユビキチン化は、タンパク質凝集を示唆する(図4D)。このことを示すために、本発明者らは、ユビキチン免疫染色を行った。黒色腫細胞を、ボルテゾミブおよびAZD6244で24時間処理して、明らかな凝集を誘発した。予測されるように、明るい蛍光の斑点状フォーカスが、ユビキチン含有凝集物を画定して、ボルテゾミブ処理細胞において出現した(図5A〜B)。AZD6244はHSF1を枯渇させ、そしてより少ない程度ではあるが、斑点状フォーカスを誘導した(図12A〜Bおよび5A〜B)。本発明者らは、AZD6244誘導性の誤って折りたたまれたタンパク質のプロテアソーム分解の遮断が、凝集をさらに悪化させることを理論化した。実際に、ボルテゾミブ共処理は、AZD6244誘導性の斑点状フォーカスを増大させた(図5A〜B)。本発明者らは、拡大型ポリグルタミン鎖タンパク質(expanded polyglutamine tract protein)(polyQ79)(Sanchezら, 2003)を使用して、凝集に対するMEKの影響をさらに確認した。拡大したpolyQフラグメントを有するタンパク質は、凝集しやすく、神経変性障害に原因として関連する(Orr and Zoghbi, 2007)。PolyQ79発現細胞は、予測されるように、大きな凝集物を含んだ(図12C)。HSF1ノックダウンおよびAZD6244はともに、polyQ凝集物を拡大した;重要なことには、HSF1S326D発現は、AZD6244誘導性凝集物拡大に拮抗した(図12Dおよび5C〜D)。ボルテゾミブはまた、凝集を増強し、併用処置は、最大の凝集物を生じた(図5C〜D)。従って、MEKおよびプロテアソームの両方が、タンパク質凝集を抑制する。
MEKおよびプロテアソーム阻害は、個々に、ある特定の程度まで、腫瘍細胞においてタンパク質恒常性を撹乱した;しかし、両方の併用は、この効果を増強し、従って、ヒト腫瘍細胞株の増殖および生存を顕著に損なった(図6A)。注意すべきは、この併用は、初代細胞に影響を及ぼさなかった(図6A)。
強いCR染色を示す腫瘍領域における顕著なアポトーシスは、処置誘導性毒性におけるアミロイド生成の原因となる役割を示唆する(図7A)。これを確認するために、本発明者らは、インビボCR投与を介して腫瘍内アミロイド誘導をブロックした。CRは、黒色腫増殖を加速させたのみならず、MEKおよびプロテアソーム阻害の併用によって課された腫瘍抑制にも強力に拮抗した(図7B)。腫瘍組織へのCRの浸透は、このアミロイド染色の特徴である498nmにおいて腫瘍溶解物の強い光吸収(Sladewskiら, 2006)によって示される(図7C)。増強された悪性疾患と一致して、CR処置は腫瘍塊を拡大し、身体の状態を悪化させ、そして動物の生存を短くした(図14A、14B、および7D)。
A.HSF1は、新たなMEK基質である
予測外なことに、本発明者らの結果は、ERKがRAS−RAF−MEKシグナル伝達の効果を専ら起こさせる有力なパラダイムを疑って、MEKの生理的基質としてのHSF1を明らかにする。本発明者らの結果はさらに、MEKがHSF1を活性化するが、ERKがHSF1を不活性化することを示す。重要なことには、本発明者らの知見は、これら2つの表面上は矛盾する作用を統合し、3要素からなるERK−MEK−HSF1タンパク質複合体のアセンブリを裏付ける。全体として、本発明者らの知見は、直線的な(linear)というよりむしろ分岐したRAS−RAF−MEKカスケードを提唱する。MEKは、中核(central nexus)として、上流の刺激を伝達し、かつ2つの不連続であるが相互に連結した下流のエフェクター経路(そのうちの一方は、ERKによって媒介され、他方は、HSF1によって媒介される)を左右する(図7H)。負のフィードバック様式において、ERKは、MEKの阻害性リン酸化を介してHSF1活性化を微細に調和させる(図7H)。本発明者らの研究は、MEK媒介性Ser326リン酸化に焦点を当てた一方で、他のキナーゼもまた、HSF1を調節し得る。
本発明者らの知見は、タンパク質恒常性を調節することにおけるRAS−RAF−MEKシグナル伝達の新たな機能を明らかにする。多様なタンパク質毒性ストレッサーが、一般にMEKを活性化する(図1A)。HSF1活性化を通じて、RAS−RAF−MEKシグナル伝達は、プロテオミクス完全性を保護するために細胞のシャペロン能を高める。
本発明者らの知見は、悪性状態のアミロイド生成促進的性質(pro−amyloidogenic nature)を際立たせる。悪性細胞のアミロイド生成に対する感受性は、それらの弱体化したタンパク質恒常性状態からおそらく端を発し、これは、摂動に対して特に脆弱である。形質転換されていない細胞とは異なり、悪性細胞は、アミロイドの上昇した基底レベルによって証明される、プロテオミクス不均衡に絶えず耐えている。(図5Xおよび5Y)。よって、HSF1(さもなければ初代細胞では潜伏性である)は、脆いプロテオミクス平衡を保持するために腫瘍細胞において構成的に動員されている(図7H)。プロテオミクスカオス(proteomic chaos)は、HSF1不活性化またはさらに軽度のタンパク質毒性の傷害のいずれかの後に結果として必然的に起こる。よって、腫瘍細胞は、それらの悪性表現型を持続させるためにHSF1に依拠する(Daiら, 2007)。対照的に、内在性タンパク質毒性ストレスの欠如は、初代細胞に、強いプロテオミクスの変動を有効に緩衝し、それによって、有害な転帰−凝集およびアミロイド生成を避ける能力を与える。
転移性黒色腫を有する患者を、MEKインヒビターおよびプロテアソームインヒビターの併用で処置する。すなわち、上記患者を、MEKインヒビターとしてのセルメチニブおよびプロテアソームインヒビターとしてのボルテゾミブで処置する。セルメチニブを、毎日の静脈内注射に関しては水で乾燥粉末を再構成した後に0.32mg/Kgで、または毎日の経口投与を通じて食品とともに0.64mg/Kgで、投与する。ボルテゾミブを、毎日の静脈内注射に関しては水で乾燥粉末を再構成した後に0.04mg/Kgで投与する。
前述の書面による明細書は、当業者が上記実施形態を実施するのを可能にするために十分であると考えられる。前述の説明および実施例は、ある特定の実施形態を詳述し、本発明者らによって企図されるベストモードを記載する。しかし、どれほど詳細にその前述が本文中に現れていようが、その実施形態は多くの方法で実施され得、添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであることは、認識される。
Claims (21)
- MEKインヒビターをプロテアソームインヒビターと組み合わせて投与する工程を包含する、がんを処置する方法。
- 前記がんは、固形腫瘍である、請求項1に記載の方法。
- 前記固形腫瘍は、胆道(胆管癌)、膀胱がん、脳のがん、乳がん、子宮頚がん、結腸直腸癌、子宮内膜がん、類表皮がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、頭頚部がん、肝細胞がん(肝がん)、腎臓がん、肺がん、中皮腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、小児悪性疾患、前立腺がん、腎がん、肉腫、皮膚がん(黒色腫を含む)、小腸腺がん、小細胞肺がん、精巣がん、または甲状腺がんである、請求項2に記載の方法。
- 前記固形腫瘍は、黒色腫である、請求項2に記載の方法。
- 前記がんは、NF1、RAS(N−RAS、K−RAS、およびH−RASを含む)、RAF(A−RAF、B−RAF、およびC−RAFを含む)、およびMEK(MEK1およびMEK2を含む)の変異から選択される少なくとも1つの変異を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記がんは、少なくともRAS変異を有する、請求項5に記載の方法。
- 前記RAS変異は、少なくともコドン12、コドン13、またはコドン61にある、請求項6に記載の方法。
- 前記がんは、少なくともRAF変異を有する、請求項5に記載の方法。
- 前記RAF変異は、少なくともコドン600にある、請求項8に記載の方法。
- 前記がんは、少なくともMEK1またはMEK2の変異を有する、請求項5に記載の方法。
- 前記MEK1変異は、少なくともP124SまたはS203Kである、請求項8に記載の方法。
- 前記MEK2変異は、少なくともQ60Pである、請求項8に記載の方法。
- 前記MEKインヒビターは、セルメチニブ(AZD6244)、トラメチニブ(GSK1120212)、ビニメチニブ(MEK162)、PD−325901、コビメチニブ、PD184352(CI−1040)、U0126−EtOH、レファメチニブ(RDEA119)、PD98059、BIX 02189、ピマセルチブ(AS−703026)、SL−327、BIX 02188、AZD8330、TAK−733、ホノキオール、またはPD318088、PD0325901、WX−554、GDC−0623、E6201、RO4987655、RO5126766である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記MEKインヒビターは、セルメチニブである、請求項13に記載の方法。
- 前記プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブ、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン−3−ガレート、サリノスポラミドA、カルフィルゾミブ、オプロゾミブ(ONX 0912)、デランゾミブ(CEP−18770)、MLN9708、エポキソミシン、MG132、イキサゾミブ(MLN2238)、PI−1840、またはセラストロールである、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プロテアソームインヒビターは、ボルテゾミブである、請求項15に記載の方法。
- 前記プロテアソームインヒビターおよび前記MEKインヒビターは、いずれかの薬剤が単独で投与される場合に治療利益を引き起こさない投与量で投与される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- セルメチニブは、約5mg/Kgで投与され、ボルテゾミブは、約0.5mg/Kgで投与される、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記がんは、プロテアソームインヒビターまたはMEKインヒビターのうちの少なくとも一方での処置に抵抗性である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記併用療法は、相乗効果を生じる、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記がんは、プロテアソームインヒビターまたはMEKインヒビターのうちの少なくとも一方での処置に抵抗性である、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
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