JP2018516978A - 深部イントロン突然変異の遺伝子編集 - Google Patents
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Abstract
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本明細書において記載されるか、または参照される技術および手順は、一般的に十分に理解され、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrookら、第4版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、2012);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelら編、2003);the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.);PCR2:A Practical Approach(M.J.MacPherson、B.D.HamesおよびG.R.Taylor編、1995);Antibodies、A Laboratory Manual(HarlowおよびLane編、1988);Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney、第6版、J.Wiley and Sons、2010);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);Methods in Molecular Biology、Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編、Academic Press、1998);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.MatherおよびP.E.Roberts、Plenum Press、1998);Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.GriffithsおよびD.G.Newell編、J.WileyおよびSons、1993〜8);Handbook of Experimental Immunology(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編、1996);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction、(Mullisら編、1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coliganら編、1991);Short Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、J.WileyおよびSons、2002);Immunobiology(C.A.Janewayら、2004);Antibodies(P.Finch、1997);Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.編、IRL Press、1988〜1989);Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.ShepherdおよびC.Dean編、Oxford University Press、2000);Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.HarlowおよびD.Lane、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999);The Antibodies(M.ZanettiおよびJ.D.Capra編、Harwood Academic Publishers、1995);およびCancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVitaら編、J.B.Lippincott Company、2011)において記載される、広く使用される方法論などの従来方法論を使用して当業者によって一般的に使用される。
本明細書において、「CRISPR−Cas」は、ガイドRNAおよびCasエンドヌクレアーゼを有する2成分リボヌクレオタンパク質複合体を指す。CRISPRは、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats II型システムを指す。CRISPRは、細菌および古細菌が、外来核酸(例えば、ウイルスまたはプラスミド由来の)を検出し、サイレンシングすることを可能にする適応防御システムとして発見されたが、配列特異的にポリヌクレオチド編集することを可能にするために種々の細胞種における使用のために適応されてきた(例えば、Jinek,M.ら(2012)Science 第337巻:816〜821頁およびRan,F.A.ら(2013)Nat.Protoc.第8巻:2281〜2308頁を参照のこと)。II型システムでは、ガイドRNAは、Casと相互作用し、Cas酵素のヌクレアーゼ活性を、ガイドRNAガイド配列と同一の標的DNA配列に向ける。ガイドRNAは、標的配列の逆鎖と塩基対形成する。次いで、Casヌクレアーゼ活性は、標的DNAにおいて二本鎖切断を生成する。いくつかの実施形態では、Casタンパク質は、Cas9タンパク質である。
本開示の特定の態様は、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムに関する。これらのシステムは、とりわけ、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害、例えば、深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、CRISPR−Casシステムは、深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAと、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含み、Casタンパク質は、深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的DNA分子を切断し、それによって、深部イントロン突然変異を含む標的DNAの部分を切り出す。
本開示のある特定の態様は、深部イントロン突然変異に関する。上記のように、深部イントロン突然変異によって、成熟(例えば、スプライスされた)mRNAに異常にイントロン配列を含めることが起こりうる。例えば、深部イントロン突然変異は、遺伝子にスプライス供与部位、スプライス受容部位、またはスプライシングエンハンサー部位を導入しうる。その結果、イントロン配列が潜在性エキソンとして含められる。これによって典型的に、特に潜在性エキソンがフレームシフト突然変異または未成熟終止コドンを含む場合は、突然変異したポリペプチドが起こる。
本開示のある特定の態様は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療することに関する。いくつかの態様において、本発明は、個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療する方法であって、個体に本開示の組成物、例えば本開示の遺伝子操作された、天然に存在しないCRISPR−Casシステムをコードする核酸を含む組成物の治療有効量を投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された、天然に存在しないCRISPR−Casシステムをコードする核酸は、DNAまたはRNAでありうる。いくつかの実施形態において、Casタンパク質はタンパク質として送達される。
いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上の第1のガイドRNA、第2のガイドRNA、またはCasタンパク質をコードする核酸は、システムの同じまたは異なるベクターに位置する。いくつかの実施形態において、CRISPRシステムの1つまたはそれ以上のエレメントの発現を駆動する(driving)1つまたはそれ以上のベクターは、CRISPRシステムのエレメントの発現が、1つまたはそれ以上の標的部位でCRISPR複合体の形成を導くように、細胞に導入される。例えば、Cas酵素、tracrメイト配列に連結したガイド配列、およびtracr配列をそれぞれ、別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に連結することができる。あるいは、2つまたはそれ以上の上記のエレメントを、同じもしくは異なる調節エレメントから発現させてもよく、および/または場合により第1のベクターに含まれないCRISPRシステムの任意の構成要素を提供する1つもしくは複数の追加のベクターと共に単一のベクターにおいて組み合わせてもよい。ベクターにおいて組み合わせたCRISPRシステムのエレメントを、任意の適した方向に配置してもよい。例えば、1つのエレメントのコード配列は、第2のエレメントのコード配列の同じもしくは逆の鎖に位置してもよく、および/または同じもしくは逆方向を向いてもよい。
通常の非ウイルス遺伝子移入方法もまた、細胞または標的組織に核酸を導入するために使用することができる。非ウイルスベクター送達システムは、DNAプラスミド、RNA(例えば、ガイドRNAまたはCasタンパク質をコードするヌクレオチド配列)、裸の核酸(例えば、DNAまたはRNA)、および送達システムと複合体形成した核酸(例えば、DNAまたはRNA)を含む。例えば、ベクターは、脂質(例えば、カチオン性または中性脂質)、リポソーム、ポリカチオン、ナノ粒子、または核酸の細胞取り込みを増強する試剤と複合体形成してもよい。ベクターは、本明細書において記述されるいかなる送達方法にも適した試剤と複合体を形成することができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクター、または組換え単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターである。
いくつかの実施形態において、ベクターは、組換えAAV(rAAV)ベクターである。いくつかの実施形態において、第1のガイドRNA、第2のガイドRNA、またはCasタンパク質の1つまたはそれ以上をコードする核酸は、1つまたはそれ以上のAAV逆方向末端反復(ITR)配列がその両端に位置する。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、1つまたは2つのITRが両端に位置するトランスジーンを含む核酸を含む組換えAAV粒子である。いくつかの実施形態において、第1のガイドRNA、第2のガイドRNA、またはCasタンパク質の1つまたはそれ以上をコードする核酸は2つのAAV ITRがその両端に位置する。
いくつかの実施形態において、ベクターは組換えアデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子はアデノウイルス粒子である。いくつかの実施形態において、アデノウイルス粒子は組換えアデノウイルス粒子、例えば本開示の1つまたは2つのガイドRNAおよび/または2つのITRの間に本開示のCasタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドベクターである。いくつかの実施形態において、アデノウイルス粒子は、アデノウイルスを複製欠損にする1つまたはそれ以上のE1遺伝子を欠如するか、または欠損コピーを含む。アデノウイルスは、大きい(約950Å)非エンベロープの正二十面体キャプシド内に直線状の二本鎖DNAゲノムを含む。アデノウイルスは、30kb超の異種配列を組み込むことができる大きいゲノムを有し(例えば、E1および/またはE3領域の代わりに)、それによって、それらはより大きい異種遺伝子と共に使用するために独自に適している。それらはまた、***中および非***細胞に感染することが知られており、宿主ゲノムに本来組み込まれない(ハイブリッド変異体はこの能力を保有しうる)。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、E1の代わりに異種配列を有する第一世代アデノウイルスベクターでありうる。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、E2A、E2B、および/またはE4に追加の突然変異または欠失を有する第二世代アデノウイルスベクターでありうる。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、全てのウイルスコード遺伝子を欠如するが、ITRおよびパッケージングシグナルのみを保持し、複製およびパッケージングのためにヘルパーアデノウイルスをトランスで必要とする第三世代またはguttedアデノウイルスベクターでありうる。アデノウイルス粒子は、哺乳動物細胞の一過性のトランスフェクションのためのベクターとしてならびに遺伝子治療ベクターとしての使用が研究されている。詳しい説明に関しては、Danthinne,X.and Imperiale,M.J.(2000)Gene Ther.7:1707〜14頁およびTatsis,N.and Ertl,H.C.(2004)Mol.Ther.10:616〜29頁を参照されたい。
アデノウイルスベクター粒子の産生に関して、多数の方法が当技術分野で公知である。例えば、guttedアデノウイルスベクターに関して、アデノウイルスベクターゲノムおよびヘルパーアデノウイルスゲノムを、パッケージング細胞株(例えば、293細胞株)にトランスフェクトしてもよい。いくつかの実施形態において、ヘルパーアデノウイルスゲノムは、そのパッケージングシグナルの両端に位置する組換え部位を含み、両方のゲノムを、目的のアデノウイルスベクターがヘルパーアデノウイルスより効率的にパッケージングされるように、リコンビナーゼ(例えば、Cre/loxPシステムを使用してもよい)を発現するパッケージング細胞株にトランスフェクトしてもよい(例えば、Alba,R.et al.(2005)Gene Ther.12 Suppl 1:S18〜27頁を参照されたい)。アデノウイルスベクターは、本明細書において記述される方法のような標準的な方法を使用して回収および精製してもよい。
本開示のある特定の態様は、例えば上記のような、本開示の遺伝子操作された、天然に存在しないCRISPR−Casシステムをコードする核酸を含む組成物の治療有効量を個体に投与することを含む。
網膜下送達方法は当技術分野において公知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第2009/105690号を参照されたい。簡単に説明すると、組成物(例えば、上記のウイルス送達または非ウイルス送達を通して送達してもよい、本開示の遺伝子操作された、天然に存在しないCRISPR−Casシステムをコードする核酸)を黄斑および中心窩の網膜下に送達する一般的な方法を、以下の簡単な概要によって例証する。この例は、単に方法の特定の特徴を例証することを意味しており、決して制限的であることを意味しない。
ノムコピー/mLの少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約5×1012〜6×1012、6×1012〜7×1012、7×1012〜8×1012、8×1012〜9×1012、9×1012〜10×1012、10×1012〜11×1012、11×1012〜15×1012、15×1012〜20×1012、20×1012〜25×1012、25×1012〜30×1012、30×1012〜50×1012、または50×1012〜100×1012ゲノムコピー/mLのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約5×1012〜10×1012、10×1012〜25×1012、または25×1012〜50×1012ゲノムコピー/mLのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、10×109、11×109、15×109、20×109、25×109、30×109、または50×109形質導入単位/mLの少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約5×109〜6×109、6×109〜7×109、7×109〜8×109、8×109〜9×109、9×109〜10×109、10×109〜11×109、11×109〜15×109、15×109〜20×109、20×109〜25×109、25×109〜30×109、30×109〜50×109、または50×109〜100×109形質導入単位/mLのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約5×109〜10×109、10×109〜15×109、15×109〜25×109、または25×109〜50×109形質導入単位/mLのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、10×1010、11×1010、15×1010、20×1010、25×1010、30×1010、40×1010、または50×1010感染単位/mLの少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約5×1010〜6×1010、6×1010〜7×1010、7×1010〜8×1010、8×1010〜9×1010、9×1010〜10×1010、10×1010〜11×1010、11×1010〜15×1010、15×1010〜20×1010、20×1010〜25×1010、25×1010〜30×1010、30×1010〜40×1010、40×1010〜50×1010、または50×1010〜100×1010感染単位/mLの少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約5×1010〜10×1010、10×1010〜15×1010、15×1010〜25×1010、または25×1010〜50×1010感染単位/mLの少なくともいずれかである。
一般的な硝子体内注射方法を以下の簡単な概要によって例証する。本実施例は、方法のある特定の特徴を例証することを意味しており、決して制限することを意味していない。硝子体内注射の技法は当技術分野で公知である(例えば、Peyman,G.A.,et al.(2009)Retina 29(7):875〜912頁およびFagan,X.J.and Al−Qureshi,S.(2013)Clin.Experiment.Ophthalmol.41(5):500〜7頁を参照されたい)。
網膜は多数の層を含むことが知られている。網膜の細胞層は、内境界膜、神経線維、神経節細胞、内網状層、内顆粒層、外網状層、外顆粒層、外境界膜、光受容体、および網膜色素上皮層を含みうる。硝子体に対して最も近位の層は、内境界膜である。この層は、神経膠細胞の一種であるミュラー細胞を含みうる。神経線維層は、視神経を形成する神経節細胞からの軸索を含みうる。神経節細胞層は、神経節細胞およびアマクリン細胞を含みうる。内網状層は、神経節およびアマクリン細胞の樹状突起と、双極細胞の軸索との間のシナプスを含みうる。内顆粒層はアマクリン、双極、および水平細胞の細胞核を含みうる。外網状層は、水平細胞樹状突起と光受容細胞の突起との間のシナプスを含みうる。外顆粒層は、光受容細胞体を含みうる。外または内境界膜は、ミュラー細胞の先端突起における接着結合およびデスモゾームのような、ならびにこれらの突起と光受容細胞の内部セグメントとの間の細胞接続部を含みうる。光受容体層は、桿錐状体層およびヤコブ膜としても知られ、桿体および椎体を含む光受容細胞を含みうる。硝子体に対して最も遠位の網膜層は、網膜色素上皮(RPE)であり、これは色素顆粒を含む六角形の上皮細胞の層を含みうる。
本明細書において記述される組成物、核酸、およびウイルス粒子は、本明細書において記述される本発明の方法の1つにおいて使用するために設計されたキットに含めることができる。
方法
プラスミド
pSpCas9を発現するpSpCas9プラスミドを、Sigma(カタログ番号:CAS9P−1EA)に注文した。BGHポリAにおけるBbsI制限部位を、QuikChange Lightning部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)および一対の突然変異誘発プライマー(配列番号28〜29)を使用して製造元のプロトコールに従って除去した。U6プロモーター−BbsI:BbsI−sgRNAスキャホールド−U6ターミネーターカセット(配列番号30)を、GeneArt(Life Technologies)によって合成して、pSpCas9−BbsIヌルプラスミドのPciIおよびNruI制限部位に挿入し、pSpCas9(BB)プラスミドを作製した。sgRNAオリゴ(配列番号1〜2)を、既に記述されたプロトコールに従って(Ran,F.A.et al.(2013)Nat.Protoc.8:2281〜2308頁)、pSpCas9(BB)プラスミドの2つのBbsI制限部位にサブクローニングした。
pSpCas9(BB)−U6−sgRNAプラスミドDNA 2.5マイクログラムおよびssODN(10マイクロモル濃度)(配列番号3)5マイクロリットルを、Amaxa SF細胞株4D−Nucleofector XキットL(Lonza)および4D−Nucleofectorシステム(Lonza)のプログラムCM−130を使用して、製造元のプロトコールに従って、1x106個のHEK 293FT細胞に同時トランスフェクトした。
CEP290のc.2991+1655A>G突然変異を有するクローンを同定するために、細胞を、48時間の同時トランスフェクション後に単細胞に解離させて、ウェルあたり複数の細胞を有する可能性を低減させるために、100マイクロリットルあたり細胞0.5個の最終濃度に連続希釈した。希釈した細胞100マイクロリットルを96ウェルプレート9枚のそれぞれのウェルに播種した。細胞を5%CO2、37℃のインキュベーター内で2週間増殖させた。
mRNAを、RNeasy Plusミニキット(Qiagen)を使用して、製造元のプロトコールに従ってWT、Het、およびMT細胞から抽出した。総RNA 1マイクログラムを使用して、iScript cDNA合成キット(Bio−Rad)を使用して製造元のプロトコールに従ってcDNAを合成した。cDNAを、ABI Prism7500リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)において、低濃度ROX(Biotium)を含むFast Plus EvaGreen qPCRマスターミックス、ならびに野生型CEP290 mRNA(配列番号7〜8)および突然変異体CEP290 mRNA(配列番号9〜10)をそれぞれ特異的に検出するプライマーを含む緩衝液中でリアルタイムPCR増幅に供した。以下の条件を使用した:50℃で2分間を1サイクル;95℃で10分間を1サイクル;95℃で15秒間および60℃で60秒間を40サイクル。増幅産物の特異性を、95℃で15秒間、60℃で60秒間、95℃で15秒間および60℃で15秒間のサイクルを使用してそれぞれの試行の最後に実施した融解曲線分析から決定した。データをSDS 2.3ソフトウェア(Applied Biosystems)を使用して分析した。CEP290発現レベルを、PPIA mRNAの発現レベルに対して標準化した(プライマーの配列に関しては、配列番号31〜32を参照されたい)。
細胞を、氷中で、1ミリモル/リットルのフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF;Cell Signaling Technology)および1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル(Cell Signaling Technology)を補充したRIPA溶解緩衝液(Cell Signaling Technology)中で溶解した。次に、細胞をこすり取り、エッペンドルフチューブに収集して、ライセートを13,000rpm、4℃で6分間の遠心分離によって透明にした。NuPage 4X LDS試料緩衝液およびNuPage 10X還元剤(いずれもLife Technologies)を添加して、70℃で10分間加熱し、13,000rpmで1分間遠心分離することによって、試料を調製した。タンパク質試料を、HiMark染色済みタンパク質標準物質(いずれもLife Technologies)と共にNuPAGE 3〜8%Tris−酢酸ゲルにロードした。試料をゲル電気泳動によって、180ボルトで1時間分離した。使用した泳動緩衝液は、Tris−酢酸SDS泳動緩衝液(Life Technologies)であった。転写のために、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンを、親水性にするためにメタノール中で短時間処理して水ですすいだ。XCell IIブロットモジュール(Life Technologies)においてPVDFメンブレンおよびゲルを濾紙およびスポンジの間に挟むことによって、転写サンドイッチを調製した。使用した転写緩衝液は、20%メタノールを含むNuPage 20X転写緩衝液(Life Technologies)であった。転写は、XCell SureLock Mini−Cell(Life Technologies)中、30ボルトで2時間実施した。転写後、PVDFメンブレンを、1%脱脂粉乳を含むPierce TBST緩衝液(Tween20洗浄剤を含むTris−緩衝食塩水;Thermo Fisher Scientific)中、室温で1時間振とうさせながらブロックした。ブロットをブロック溶液中で作製した一次抗体溶液中でインキュベートして、4℃で終夜揺り動かした。使用した一次抗体は、ウサギポリクローナル抗CEP290抗体(ウスター、マサチューセッツ大学のHemant Khanna教授の寄贈)、マウスモノクローナル抗Cas9抗体(クローン7A9;Millipore)、HRPコンジュゲートウサギモノクローナル抗ベータ−アクチン抗体(クローン13E5;Cell Signaling Technology)であった。未結合の一次抗体をTBSTで各10分間3回洗浄した。ブロック溶液中の二次抗体(Alexa Fluor 647コンジュゲート抗ウサギまたは抗マウスIgG;Cell Signaling Technology)を、メンブレンに添加して、シェーカーにおいて室温で1時間維持した。非特異的バックグラウンドを低減させるために、メンブレンをTBSTによって各10分間3回洗浄した。メンブレンを、Pierce増強化学発光(ECL)ウェスタンブロット用基質(Thermo Fisher Scientific)を使用して4分間現像した。最後に、ブロット中のタンパク質バンドを、Kodak X−OMAT 2000プロセッサにおいて、フィルムを様々な時間間隔で露出することによって可視化した。抗ベータ−アクチン抗体のブロットを再プロービングするために、メンブレンを最初に、回復用ウェスタンブロットストリッピング緩衝液(Thermo Fisher Scientific)中、37℃で30分間インキュベートすることによってストリッピングした後、抗ベータ−アクチン抗体によって再プロービングした。本試験で示したブロッティングデータは、少なくとも3回の独立した実験の代表であった。
最初に、CRISPR−Cas9ゲノム編集技術を使用して、CEP290においてイントロンスプライス突然変異c.2991+1655A>Gを有する細胞モデルを作製した。この細胞モデルは、CEP290においてc.2991+1655A>G突然変異を有するLCA患者を治療する治療薬を評価するための貴重なツールであった。
方法
プラスミド
オールインワン型発現ベクターを、既に記述されたGolden Gateクローニング法(Sakuma,T.et al.(2014)Sci.Rep.4:5400)によって構築した。簡単に説明すると、U6プロモーター−BbsI:BbsI−sgRNAスキャホールド−U6ターミネーター−CMVプロモーター(配列番号33)を含むDNA断片を、GeneArt(Life Technologies)によって合成して、上記のpSpCas9−BbsIヌルプラスミドのPciIおよびNheI制限部位に挿入して、上流のsgRNAガイド配列をサブクローニングするために使用するpSpCas9(BBU)プラスミドを作製した。下流のsgRNAガイド配列をサブクローニングするために使用するpSpCas9(BBD)プラスミドを構築するために、DNA鋳型としてのpSpCas9(BB)プラスミドDNAおよび一対のPCRプライマー(配列番号34〜35)と共に、Phusion高忠実度DNAポリメラーゼ(New England BIoLabs Inc)を使用してPCR反応を実施した。サイクリングパラメータは、98℃で1分間を1サイクル;98℃で20秒間、および72℃で30秒間を35サイクル;72℃で5分間を1サイクルであった。PCR産物を、pSpCas9(BBU)プラスミドのPciIおよびKpnI部位に挿入した。このpSpCas9(BBD)プラスミドでは、2つのBsaI部位がU6プロモーター駆動sgRNAの両端に位置する。U1 sgRNAオリゴ(配列番号11〜12)をアニールした後、pSpCas9(BBU)プラスミドの2つのBbsI制限部位にサブクローニングし、D1、D2、およびD3 sgRNAオリゴ(配列番号13〜18)をアニールして、既に記述されたプロトコール(Ran,F.A.et al.(2013)Nat.Protoc.8:2281〜2308頁)に従って、pSpCas9(BBD)プラスミドの2つのBbsI制限部位にサブクローニングした。得られたD1〜D3 sgRNAをU6プロモーターと共に、制限酵素BsaIを使用してpSpCas9(BBD)プラスミドからさらに切り出し、pSpCas9(BBU)−U1 sgRNAプラスミドにおける2つのBsaI部位にサブクローニングした。得られたpSpCas9(BBUD)プラスミドは、2つのU6プロモーター駆動sgRNAおよび1つのCMVプロモーター駆動SpCas9を発現した。2つの対照sgRNA(配列番号36〜39)のオリゴを、上記の方法を使用して、対照プラスミドとしてオールインワン型発現ベクターのBbsI制限部位にサブクローニングした。
sgRNA対−SpCas9プラスミドを、Lipofectamine3000トランスフェクション試薬(Life Technologies)を使用して、製造元のプロトコールに従って、野生型、ヘテロ接合、および突然変異体細胞にトランスフェクトした。
上記で得られたPCR産物をNGSシークエンシングのためにACGT(Wheeling,IL)に送付した。試料DNAを、超音波処理によって平均で350bpの標的断片サイズに断片化して、Illumina TruSeq DNA PCRフリー試料調製キットを使用してシークエンシングライブラリを構築するために使用した。ライブラリをQubitおよび2100バイオアナライザによって定量して、Illuminaプラットフォームにロードして、PE150のリードを得た。試料あたりおよそ150Kリード(±20%)を得た。未加工のIlluminaを逆多重化して、fastqフォーマットに変換し、低品質(Q<20)および短いリード(N<50)を除外した。フィルター処理したリードを、Bowtie2を使用して参照配列(野生型DNAおよびトランケート型DNA)とアラインした。定量のために、野生型DNAまたはトランケート型DNAのいずれかに対して独自であるU1 sgRNA切断部位の両端に位置する(切断部位の前20bpおよび後20bp)40bpの配列とアラインしたリードの数を使用して、それぞれの試料における野生型およびトランケート型DNAの百分率を計算した。
次に、本明細書において記述されるモデルを使用して、c.2991+1655A>G突然変異の標的化欠失を生成するためのアプローチを試験した。
方法
プラスミド
AAVパッケージングプラスミドpAAV−minCMV−SpCas9−NLS−SV40pAを、自己限定性Crispr−Cas9システムのために構築した。簡単に説明すると、CMVプロモーター由来の最小プロモーター断片(minCMVプロモーター)(配列番号56)を含むDNA断片を、GeneArt(Life Technologies)によって合成し、上記のSigma pSpCas9プラスミドのMluIおよびApoI制限部位に挿入して、pminCMV−SpCas9−NLS−BGH pAプラスミドを作製した。次に、SV40初期ポリ(A)シグナル(SV40pA)(配列番号57)を含むDNA断片を、GeneArt(Life Technologies)によって合成し、上記のプラスミドのXhoIおよびBbsI制限部位に挿入して、pminCMV−SpCas9−NLS−SV40 pAプラスミドを作製した。最後に、minCMV−SpCas9−NLS−SV40 pA断片を、AAVパッケージングプラスミドにサブクローニングして、pAAV−minCMV−SpCas9−NLS−SV40 pAを作製した。
CRISPR−Cas9は、強力なゲノム編集ツールであるが、細菌タンパク質であるCas9の発現が患者においてどのように忍容されるのかは不明である。CRISPR−Cas9は、急速(数時間〜数日)に作用し、それが細胞に持続的に存在する必要はない。望まれない免疫反応および起こりうる安全性の問題は、外因性のタンパク質が持続的に発現することによって引き起こされる。例えば、外因性のマーカータンパク質である緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現は、かなりの望まれない免疫反応を誘発しうる(Stripecke R et al.(1999)Gene Ther.6:1305〜1312頁)。加えて、最近の報告により、CRISPR−Cas9のin vivo送達後に、Cas9に対する液性免疫の誘導およびCas9特異的細胞免疫反応が存在する可能性があることが示唆された(Wang,D.et al.(2015)Hum.Gene Ther.26:432〜442頁)。したがって、Cas9タンパク質に対する曝露を制限する「ヒット&ゴー」アプローチは、CRISPR−Cas9のin vivo送達にとって有益でありうる。そのような「ヒット&ゴー」アプローチはまた、これがCas9と意図されない標的との間の相互作用時間を低減させることから、オフターゲット効果も低減させることができる。
方法
プラスミド
本発明者らは、マウス網膜における標的化ゲノム欠失のためにデュアルAAVシステムを使用した。第1のAAVを上記のように、AAVパッケージングプラスミドpAAV−minCMV−SpCas9−NLS−SV40 pAによって産生した。第2のAAVは、AAVパッケージングプラスミドpAAV−U6−U11 sgRNA−U6−D11 sgRNA−RK−EGFP−BGH pAによって産生した。このプラスミドを構築するために、U11 sgRNAガイド配列(配列番号61)およびD11 sgRNAガイド配列(配列番号62)を、上記のようにpSpCas9(BBUD)プラスミドにサブクローニングして、pSpCas9(BBUD)−U11D11プラスミドを作製した。RKプロモーター−EGFP−BGH pA断片(配列番号63)を、このプラスミドのKpnIおよびXhoI部位に挿入した後、U6−U11 sgRNA−U6−D11 sgRNA−RK−EGFP−BGH pAカセット全体を、制限酵素PciIおよびPmeIを使用してこのプラスミドから切り出して、上記のAAVパッケージングプラスミドのBamHIおよびSphI部位にサブクローニングして、最終的なプラスミドを作製した。対照プラスミドpAAV−RK−EGFP−BGH pAも作製した。
組換えAAVベクターを、既に記述されたように(Xiao,X.et al.(1998)J.Virol.72:2224〜2232頁)、ヒト胎児腎癌293細胞(HEK293)のトリプルトランスフェクションによって産生した。簡単に説明すると、AAVパッケージングプラスミド、血清型2からのrep遺伝子および血清型5からのキャプシド遺伝子とを含むプラスミド、ヘルパーアデノウイルスプラスミド(Stratagene)を使用した。ウイルスをトランスフェクションの72時間後に回収して、AVBセファロースアフィニティクロマトグラフィー(GE Healthcare)によって精製した。AAVベクターのゲノムコピー(GC)力価を、既に記述された(Gerits,A.et al.(2015)Neurophotonics.2:031209)TaqManベースの定量的PCR分析(Applied Biosystems)によって決定した。
8〜10週齢の雌性C57BL/6JマウスをJackson Laboratories(Bar Harbor,ME)から購入して、Sanofiの動物飼育施設で維持した。試験期間中、動物に飼料および水を自由に与えた。動物技法は全て、実験動物福祉部門(the Office of Laboratory Animal Welfare)の動物保護法、実験動物の飼育および使用に関するガイド(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)を遵守して、ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Researchに従って実施した。
マウスを、鼻の円錐形部(nose cone)から動物に送達した酸素800ml/分中の3.5%イソフルランを使用して鎮静化した。散瞳および毛様体筋麻痺を、トロピカミド(Alcon,Fort Worth,TX)の局所適用によってマウスに誘導した。角膜に予備切開を行い、33ゲージの鈍端の針を、切開部を通過するように導き、虹彩と水晶体嚢の間の後方に、先端が後部網膜神経感覚上皮を貫通するまで進めた。AAV5−minCMV−SpCas9−NLS−SV40 pA(図7AのAAV5−SpCas9)の1×109個のウイルスゲノム粒子を、AAV5−U6−U11 sgRNA−U6−D11 sgRNA−RK−EGFP−BGH pA(図7AのAAV5−U11D11−RK−EGFP)または対照AAV5−U6−RK−EGFP−BGH pA(図7BのAAV5−RK−EGFP)の1×109個のウイルスゲノム粒子と共に、各マウスのOS眼に、1マイクロリットルの体積で1秒間かけて送達した。針を、引き抜くまでおよそ5秒間その位置に保持した。動物を麻酔から回復させた後、ケージに戻した。
マウスの眼の眼球を摘出してリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に入れた。網膜を、解剖顕微鏡下で微小解剖用ハサミによって単離した。網膜色素上皮(RPE)層を注意深く切除した。
網膜をQuickExtract DNA抽出溶液(Epicentre)中で、コードレスモーター(VWR)を動力源とする乳棒によってホモジナイズした。ゲノムDNAを、製造元の説明書(Epicentre)に従って抽出し、10ナノグラム/マイクロリットルに希釈した後、GoTaq Hot Start Greenマスターミックス(Promega)および欠失領域の両端に位置するPCRプライマー(配列番号64〜65)によって増幅した。PCR産物の増幅は以下のサイクリングパラメータによって得られた:95℃で2分間を1サイクル;95℃で30秒間、62℃で30秒間、および72℃で2分間を35サイクル;72℃で12分間を1サイクル。次に、PCR産物を、アガロースゲル電気泳動に供した。
LCA10の細胞モデルにおける本発明者らの研究は、in vitroでLCA10 c.2991+1655A>G突然変異を除去するための本発明者らのsgRNA対およびSpCas9アプローチの有効性を裏付けた。次に、本発明者らは、in vivoの状況で本発明者らのCRISPR−Cas9アプローチを評価した。現在、LCA10イントロンスプライス突然変異によって引き起こされた潜在性エキソンを発現する動物モデルはないことから、本発明者らは、SpCas9と共にsgRNA対が、c.2991+1655A>G突然変異が位置する場所でヒトCEP290遺伝子のイントロン26に対して相同であるマウスCep290遺伝子のイントロン25における標的化ゲノム欠失を誘導できるか否かを試験した。
方法
プラスミド
SaCas9プラスミドを構築するために、minCMV−SaCas9−NLS−FLAG−BGH pA−U6−BsaI:BsaI−sgRNAスキャホールド断片(配列番号66)をGenScriptにおいて合成し、Sigma pSpCas9プラスミドのPciIおよびBbsI制限部位にサブクローニングして、CMV−SpCas9−BGH pAカセットを交換し、pminCMV−SaCas9−BGH pA−U6プラスミドを作製した。5個のsgRNAガイド配列(aU1、aU2、aU3、aD1、aD2;配列番号45〜49)を、Benchlingのオンラインゲノム編集設計ツールを使用して同定した後、上記のプラスミドの2つのBsaI制限部位にサブクローニングした。上流のsgRNA(aU1、aU2、aU3)と下流のsgRNA(aD1、aD2)を対にするために、U6−aD1 sgRNAカセットおよびU6−aD2 sgRNAカセットを、制限酵素KpnIおよびNotIを使用してそのプラスミドから切り出した後、aU1、aU2、またはaU3 sgRNAを発現するプラスミドのNotI部位にサブクローニングした。その結果、本発明者らは、異なる6つのsgRNA対(aU1aD1、aU1aD2、aU2aD1、aU2aD2、aU4aD1、aU4aD2)を発現する6つのプラスミドを作製した。最後に、これらの6つのプラスミドにおけるminCMV−SaCas9−BGH pA−U6−sgRNA対断片を、AAVパッケージングプラスミドにサブクローニングして、pAAV−minCMV−SaCas9−BGH pA−U6−sgRNA対プラスミドを作製した。sgRNAを発現しない対照プラスミドpAAV−minCMV−SaCas9−BGH pAも作製した。
上記の試験から、本発明者らは、上流/下流のsgRNAの対が、効率的にSpCas9を導き、LCA10c.2991+1655A>G突然変異を除去して野生型CEP390発現を回復することができることを証明した。SpCas9コード配列の長さ(約4.1kb)により、1つのminCMV−SpCas9構成要素と2つのU6−sgRNA構成要素とを単一のAAVベクターにパッケージングすることが難しくなる。Ranら(Ran,F.A.et al.(2015)Nature 520:186〜191頁)は、最近、哺乳動物細胞においても切断活性を示す、より短いCas9酵素である黄色ブドウ球菌(S.aureus)Cas9(SaCas9;1053アミノ酸;配列番号55)を発見した。SaCas9のサイズがより小さいことにより、1つのminCMV−SaCas9構成要素と2つのU6−sgRNA構成要素とを単一のAAVベクターにパッケージングすることができる。sgRNA対およびSaCas9はまた、LCA10イントロン突然変異を除去することができるか否かを試験するために、本発明者らは、SaCas9に対して特異的な3つの上流のsgRNAガイド配列(aU1、aU2、aU3;配列番号45〜47)および2つの下流のsgRNAガイド配列(aD1、aD2;配列番号48〜49)を、Benchlingのオンラインゲノム編集設計ツールを使用して設計した。上流/下流のsgRNAを対にして、AAVパッケージングプラスミドにサブクローニングした。同じプラスミドも、minCMVプロモーター駆動およびヒトコドン最適化SaCas9(配列番号66)を発現した。
核酸配列は全て、特に明記していなければ5’から3’で表す。
アミノ酸配列は全て、特に明記していなければN末端からC末端で表す。
相同性組換え修復(HDR)に使用したsgRNAのトップ鎖オリゴヌクレオチド(配列番号1)
caccgAAGACACTGCCAATAGGGAT
相同性組換え修復(HDR)に使用したsgRNAのボトム鎖オリゴヌクレオチド(配列番号2)
aaacATCCCTATTGGCAGTGTCTTc
HDR鋳型(配列番号3)
CCACCCGCCTCGGCCTCCTAAAGTGCTGGGATTACAGATGTGAGCCACCGCACCTGGCCCCAGTTGTAATTGTGAGTATCTCATACGTATCCCTATTGGCAGTGTCTTAGTTTTATTTTTTATTATCTTTATTGTGGCAGCCATTATTCCTGTCTCTA
CEP290イントロン26F核酸プライマー(配列番号4)
GGTCCCTGGCTTTTGTTCCT
CEP290イントロン26R核酸プライマー(配列番号5)
CAGGAGGCTGAGGGTGTTTT
CEP290イントロン26シークエンシングプライマー(配列番号6)
AGTAGAGATGGGGTTTCACC
野生型CEP290F核酸プライマー(配列番号7)
TGACTGCTAAGTACAGGGACATCTTG
野生型CEP290R核酸プライマー(配列番号8)
AGGAGATGTTTTCACACTCCAGGT
突然変異体CEP290F核酸プライマー(配列番号9)
CTGGCCCCAGTTGTAATTTGTGA
野生型CEP290R核酸プライマー(配列番号10)
CTGTTCCCAGGCTTGTTCAATAGT
U1 sgRNAのトップ鎖オリゴヌクレオチド(配列番号11)
caccGGCGGGTGGATCACGAGTTC
U1 sgRNAのボトム鎖オリゴヌクレオチド(配列番号12)
aaacGAACTCGTGATCCACCCGCC
D1 sgRNAのトップ鎖オリゴヌクレオチド(配列番号13)
caccgAAAGCTACCGGTTACCTGAA
D1 sgRNAのボトム鎖オリゴヌクレオチド(配列番号14)
aaacTTCAGGTAACCGGTAGCTTTc
D2 sgRNAのトップ鎖オリゴヌクレオチド(配列番号15)
caccgTCATTCTTGTGGCAGTAAGG
D2 sgRNAのボトム鎖オリゴヌクレオチド(配列番号16)
aaacCCTTACTGCCACAAGAATGAc
D3 sgRNAのトップ鎖オリゴヌクレオチド(配列番号17)
caccGGAGTCACATGGGAGTCACA
D3 sgRNAのボトム鎖オリゴヌクレオチド(配列番号18)
aaacTGTGACTCCCATGTGACTCC
U1 sgRNA配列(配列番号19)
GGCGGGTGGATCACGAGTTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT
D1 sgRNA配列(配列番号20)
GAAAGCTACCGGTTACCTGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT
D2 sgRNA配列(配列番号21)
GTCATTCTTGTGGCAGTAAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT
D3 sgRNA配列(配列番号22)
GGAGTCACATGGGAGTCACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT
CEP290イントロン26配列(注意:c.2991+1655A>G突然変異は、この配列における1655番目のヌクレオチドであり、太字および下線で示す)(配列番号23)
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG
tracr配列(配列番号25)
TAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC
NLS配列
PKKKRKV (配列番号26)
PKKKRKVEDPKKKRKVD (配列番号27)
BbsI制限部位突然変異のフォワード核酸プライマー(配列番号28)
GGGAGGATTGGGAAGAGAATAGCAGGCATGCTG
BbsI制限部位突然変異のリバース核酸プライマー(配列番号29)
CAGCATGCCTGCTATTCTCTTCCCAATCCTCCC
U6プロモーター配列を下線で示す、pSpCas9(BB)を構築するためのU6プロモーター−BbsI:BbsI−sgRNAスキャホールド−U6ターミネーターカセット(配列番号30)
CACATGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTCTTCGAGAAGACCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCTCTAGAGGTACCC
PPIA F核酸プライマー(配列番号31)
TTCATCTGCACTGCCAAGAC
PPIA R核酸プライマー(配列番号32)
TCGAGTTGTCCACAGTCAGC
U6プロモーターおよびCMVプロモーター配列を下線で示す、pSpCas9(BBU)を構築するためのU6プロモーター−BbsI:BbsI−sgRNAスキャホールド−U6ターミネーター−CMVプロモーター(配列番号33)
CTCACATGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTCTTCGAGAAGACCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCTCTAGAGACCGGCGCCGCTACAGGCTTTCCACCGGTGGTCTCTTCTAGAGGTACCCGTTACATCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCAAGCTGGCTAGCCGC
pSpCas9(BBD)を構築するためのフォワード核酸プライマー(配列番号34)ATAACATGTGGTCTCACTCTAGAGGCATGTGAGGGCCTATTTCCC
pSpCas9(BBD)を構築するためのリバース核酸プライマー(配列番号35)
TATGGTACCGGTCTCATAGAGCCATTTGTCTGCAGA
対照1 sgRNAのトップ鎖オリゴヌクレオチド(配列番号36)
caccGCACTACCAGAGCTAACTCA
対照1 sgRNAのボトム鎖オリゴヌクレオチド(配列番号37)
aaacTGAGTTAGCTCTGGTAGTGC
対照2 sgRNAのトップ鎖オリゴヌクレオチド(配列番号38)
caccgTGCGAATACGCCACGCGAT
対照2 sgRNAのボトム鎖オリゴヌクレオチド(配列番号39)
aaacATCGCGTGGCGTATTCGCAc
化膿連鎖球菌Cas9アミノ酸配列(配列番号40)
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
U1 sgRNAガイド/プロトスペーサー配列(配列番号41)
GGCGGGTGGATCACGAGTTC
D1 sgRNAガイド/プロトスペーサー配列(配列番号42)
AAAGCTACCGGTTACCTGAA
D2 sgRNAガイド/プロトスペーサー配列(配列番号43)
TCATTCTTGTGGCAGTAAGG
D3 sgRNAガイド/プロトスペーサー配列(配列番号44)
GGAGTCACATGGGAGTCACA
aU1 sgRNAガイド/プロトスペーサー配列(配列番号45)
TTTAACGTTATCATTTTCCCA
aU2 sgRNAガイド/プロトスペーサー配列(配列番号46)
AGTTTCATTCTGTCACCCAGG
aU3 sgRNAガイド/プロトスペーサー配列(配列番号47)
AAAAATTAGCCGGGCATGATG
aD1 sgRNAガイド/プロトスペーサー配列(配列番号48)
TGTAAGACTGGAGATAGAGAC
aD2 sgRNAガイド/プロトスペーサー配列(配列番号49)
CTTTTGACAGTTTTTAAGGCG
aU1 sgRNA配列(配列番号50)
GTTTAACGTTATCATTTTCCCAGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTT
aU2 sgRNA配列(配列番号51)
GAGTTTCATTCTGTCACCCAGGGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTT
aU3 sgRNA配列(配列番号52)
GAAAAATTAGCCGGGCATGATGGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTT
aD1 sgRNA配列(配列番号53)
GTGTAAGACTGGAGATAGAGACGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTT
aD2 sgRNA配列(配列番号54)
GCTTTTGACAGTTTTTAAGGCGGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTT
黄色ブドウ球菌Cas9アミノ酸配列(配列番号55)
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
minCMVプロモーターを下線で示す、pAAV−minCMV−SpCas9−NLS−SV40 pAを構築するためのminCMVプロモーター−SpCas9配列(配列番号56)
TATACGCGTGTTGACACTAGTTCGCGAAATATTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAG
SV40初期ポリ(A)シグナルを下線で示す、pAAV−minCMV−SpCas9−NLS−SV40 pAを構築するためのSV40 pA配列(配列番号57)
TGACTCGAGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGCAATATTTCGCGAGAAGACAATAGCAGG
U1 sgRNA認識配列(U1T;U1 sgRNAガイド配列+PAM)(配列番号58)
GGCGGGTGGATCACGAGTTCAGG
D3 sgRNA認識配列(D3T;D3 sgRNAガイド配列+PAM)(配列番号59)
GGAGTCACATGGGAGTCACAGGG
BGH pAを下線で示す、BGH pA含有断片(配列番号60)
CTAGTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGCTAGAGTCGACCGGACCGCTGCAGGCATGCA
U11 sgRNAガイド/プロトスペーサー配列(配列番号61)
GCATAAGGACTAAAGACCTA
D11 sgRNAガイド/プロトスペーサー配列(配列番号62)
GGTAGTGGTTGAACTCACAA
RKプロモーター−キメライントロン−EGFP−BGH pA断片(配列番号63)
GGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTTCGAAAGATCTGCTAGCTTAATTAACCCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCAAATCGTACGCCTAGGTGATCAAGATCTGCTAGCTTAATTAACCCGGGACTAGTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGA
マウスCep290イントロン25F核酸プライマー(配列番号64)
CCCCTCGCCTGTACTGAAAG
マウスCep290イントロン25R核酸プライマー(配列番号65)
GCACATCATCTGAGGCAGGT
minCMVおよびSaCas9配列を下線で示す、minCMV−SaCas9−NLS−FLAG−BGH pA−U6−BsaI:BsaI−sgRNAスキャホールド断片(配列番号66)
ATGAATTCTCTAGACAATTGGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACGCGTGCCACCATGAAGCGGAACTACATCCTGGGCCTGGACATCGGCATCACCAGCGTGGGCTACGGCATCATCGACTACGAGACACGGGACGTGATCGATGCCGGCGTGCGGCTGTTCAAAGAGGCCAACGTGGAAAACAACGAGGGCAGGCGGAGCAAGAGAGGCGCCAGAAGGCTGAAGCGGCGGAGGCGGCATAGAATCCAGAGAGTGAAGAAGCTGCTGTTCGACTACAACCTGCTGACCGACCACAGCGAGCTGAGCGGCATCAACCCCTACGAGGCCAGAGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTGAGCGAGGAAGAGTTCTCTGCCGCCCTGCTGCACCTGGCCAAGAGAAGAGGCGTGCACAACGTGAACGAGGTGGAAGAGGACACCGGCAACGAGCTGTCCACCAAAGAGCAGATCAGCCGGAACAGCAAGGCCCTGGAAGAGAAATACGTGGCCGAACTGCAGCTGGAACGGCTGAAGAAAGACGGCGAAGTGCGGGGCAGCATCAACAGATTCAAGACCAGCGACTACGTGAAAGAAGCCAAACAGCTGCTGAAGGTGCAGAAGGCCTACCACCAGCTGGACCAGAGCTTCATCGACACCTACATCGACCTGCTGGAAACCCGGCGGACCTACTATGAGGGACCTGGCGAGGGCAGCCCCTTCGGCTGGAAGGACATCAAAGAATGGTACGAGATGCTGATGGGCCACTGCACCTACTTCCCCGAGGAACTGCGGAGCGTGAAGTACGCCTACAACGCCGACCTGTACAACGCCCTGAACGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGACGAGAACGAGAAGCTGGAATATTACGAGAAGTTCCAGATCATCGAGAACGTGTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCCACCCTGAAGCAGATCGCCAAAGAAATCCTCGTGAACGAAGAGGATATTAAGGGCTACAGAGTGACCAGCACCGGCAAGCCCGAGTTCACCAACCTGAAGGTGTACCACGACATCAAGGACATTACCGCCCGGAAAGAGATTATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCCAAGATCCTGACCATCTACCAGAGCAGCGAGGACATCCAGGAAGAACTGACCAATCTGAACTCCGAGCTGACCCAGGAAGAGATCGAGCAGATCTCTAATCTGAAGGGCTATACCGGCACCCACAACCTGAGCCTGAAGGCCATCAACCTGATCCTGGACGAGCTGTGGCACACCAACGACAACCAGATCGCTATCTTCAACCGGCTGAAGCTGGTGCCCAAGAAGGTGGACCTGTCCCAGCAGAAAGAGATCCCCACCACCCTGGTGGACGACTTCATCCTGAGCCCCGTCGTGAAGAGAAGCTTCATCCAGAGCATCAAAGTGATCAACGCCATCATCAAGAAGTACGGCCTGCCCAACGACATCATTATCGAGCTGGCCCGCGAGAAGAACTCCAAGGACGCCCAGAAAATGATCAACGAGATGCAGAAGCGGAACCGGCAGACCAACGAGCGGATCGAGGAAATCATCCGGACCACCGGCAAAGAGAACGCCAAGTACCTGATCGAGAAGATCAAGCTGCACGACATGCAGGAAGGCAAGTGCCTGTACAGCCTGGAAGCCATCCCTCTGGAAGATCTGCTGAACAACCCCTTCAACTATGAGGTGGACCACATCATCCCCAGAAGCGTGTCCTTCGACAACAGCTTCAACAACAAGGTGCTCGTGAAGCAGGAAGAAAACAGCAAGAAGGGCAACCGGACCCCATTCCAGTACCTGAGCAGCAGCGACAGCAAGATCAGCTACGAAACCTTCAAGAAGCACATCCTGAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCAGAATCAGCAAGACCAAGAAAGAGTATCTGCTGGAAGAACGGGACATCAACAGGTTCTCCGTGCAGAAAGACTTCATCAACCGGAACCTGGTGGATACCAGATACGCCACCAGAGGCCTGATGAACCTGCTGCGGAGCTACTTCAGAGTGAACAACCTGGACGTGAAAGTGAAGTCCATCAATGGCGGCTTCACCAGCTTTCTGCGGCGGAAGTGGAAGTTTAAGAAAGAGCGGAACAAGGGGTACAAGCACCACGCCGAGGACGCCCTGATCATTGCCAACGCCGATTTCATCTTCAAAGAGTGGAAGAAACTGGACAAGGCCAAAAAAGTGATGGAAAACCAGATGTTCGAGGAAAAGCAGGCCGAGAGCATGCCCGAGATCGAAACCGAGCAGGAGTACAAAGAGATCTTCATCACCCCCCACCAGATCAAGCACATTAAGGACTTCAAGGACTACAAGTACAGCCACCGGGTGGACAAGAAGCCTAATAGAGAGCTGATTAACGACACCCTGTACTCCACCCGGAAGGACGACAAGGGCAACACCCTGATCGTGAACAATCTGAACGGCCTGTACGACAAGGACAATGACAAGCTGAAAAAGCTGATCAACAAGAGCCCCGAAAAGCTGCTGATGTACCACCACGACCCCCAGACCTACCAGAAACTGAAGCTGATTATGGAACAGTACGGCGACGAGAAGAATCCCCTGTACAAGTACTACGAGGAAACCGGGAACTACCTGACCAAGTACTCCAAAAAGGACAACGGCCCCGTGATCAAGAAGATTAAGTATTACGGCAACAAACTGAACGCCCATCTGGACATCACCGACGACTACCCCAACAGCAGAAACAAGGTCGTGAAGCTGTCCCTGAAGCCCTACAGATTCGACGTGTACCTGGACAATGGCGTGTACAAGTTCGTGACCGTGAAGAATCTGGATGTGATCAAAAAAGAAAACTACTACGAAGTGAATAGCAAGTGCTATGAGGAAGCTAAGAAGCTGAAGAAGATCAGCAACCAGGCCGAGTTTATCGCCTCCTTCTACAACAACGATCTGATCAAGATCAACGGCGAGCTGTATAGAGTGATCGGCGTGAACAACGACCTGCTGAACCGGATCGAAGTGAACATGATCGACATCACCTACCGCGAGTACCTGGAAAACATGAACGACAAGAGGCCCCCCAGGATCATTAAGACAATCGCCTCCAAGACCCAGAGCATTAAGAAGTACAGCACAGACATTCTGGGCAACCTGTATGAAGTGAAATCTAAGAAGCACCCTCAGATCATCAAAAAGGGCGGATCCCCCAAGAAAAAGCGCAAAGTGGACTACAAAGACGATGACGACAAGTGAGCTAGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGAGAATAGCAGGCATGCTGGTACCTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAGACCACGGCAGGTCTCAGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTGCGGCCGCGTCGACAT
Claims (458)
- 個体の遺伝子における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物は、
a)該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする、第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAと、
b)Casタンパク質と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムを含み、該Casタンパク質は、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的DNA分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的DNAの部分を切り出す、前記組成物。 - 個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物は、
a)該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする、第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAと、
b)Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly
Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムをコードする核酸を含み、該Casタンパク質は、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的DNA分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的DNAの部分を切り出す、前記組成物。 - 深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ia型、先天性グリコシル化異常症II型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病A、遺伝性巨赤芽球性貧血1、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症II型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症I型、ニーマン・ピック病C型、眼白子症I型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、X連鎖高免疫グロブリンM血症またはX連鎖低リン酸血症である、請求項1または2に記載の組成物。
- 深部イントロン突然変異は、表1に示される深部イントロン突然変異である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 個体の核酸における、深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物は、
a)該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAと、
b)Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムをコードする核酸を含み、該Casタンパク質は、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的DNA分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的DNAの部分を切り出す、前記組成物。 - 個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物は、
a)該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAと、
b)Casタンパク質と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムを含み、該Casタンパク質は、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的DNA分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的DNAの部分を切り出す、前記組成物。 - 眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはX連鎖網膜色素変性症である、請求項5または6に記載の組成物。
- 深部イントロン突然変異は、表2に示される深部イントロン突然変異である、請求項5〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 眼の疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項5〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAガイド配列は、中心体タンパク質290kDa(CEP290)遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする、請求項5〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 深部イントロン突然変異は、c.2991+1655A>G突然変異である、請求項5〜10のいずれか1項に記載の組成物。
- 第1のガイドRNAは、配列番号41、配列番号45、配列番号46または配列番号47の配列を含むDNAによってコードされる、請求項5〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 第1のガイドRNAは、配列番号19、配列番号50、配列番号51または配列番号52の配列を含むDNAによってコードされる、請求項5〜12のいずれか1項に記載の組成物。
- 第2のガイドRNAは、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号48または配列番号49の配列を含むDNAによってコードされる、請求項5〜13のいずれか1項に記載の組成物。
- 第2のガイドRNAは、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号53または配列番号54の配列を含むDNAによってコードされる、請求項5〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- CEP290は、ヒトCEP290である、請求項10〜15のいずれか1項に記載の組成物。
- CEP290は、配列番号23に示される配列の深部イントロン突然変異を含む、請求項10〜16のいずれか1項に記載の組成物。
- 深部イントロン突然変異は、核酸の5’スプライス供与部位の約1〜10,000ヌクレオチド、約1〜1000ヌクレオチドまたは約100〜1000ヌクレオチド下流に位置する、請求項1〜17のいずれか1項に記載の組成物。
- 深部イントロン突然変異は、核酸の3’スプライス受容部位の約1〜10,000ヌクレオチド、約1〜1000ヌクレオチドまたは約100〜1000ヌクレオチド上流に位置する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の組成物。
- 深部イントロン突然変異は、核酸中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項1〜19のいずれか1項に記載の組成物。
- Casタンパク質は、Cas9タンパク質である、請求項1〜20のいずれか1項に記載の組成物。
- Cas9タンパク質は、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9タンパク質、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)Cas9タンパク質、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)Cas9タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)Cas9タンパク質である、請求項21に記載の組成物。
- Cas9は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項21または22に記載の組成物。
- 真核細胞は、哺乳動物細胞である、請求項23に記載の組成物。
- 真核細胞は、ヒト細胞である、請求項23または24に記載の組成物。
- CRISPR−Casシステムは、1つまたはそれ以上の核局在性シグナル(NLS)をさらに含む、請求項1〜25のいずれか1項に記載の組成物。
- Casタンパク質は、1つまたはそれ以上のNLSを含む、請求項26に記載の組成物。
- NLSは、SV40ラージT抗原中のC末端配列である、請求項26または27に記載の組成物。
- NLSは、配列PKKKRKV(配列番号26)またはPKKKRKVEDPKKKRKVD(配列番号27)を含む、請求項28に記載の組成物。
- 第1のガイドRNAおよび/または第2のガイドRNAは、トランス活性化cr(tracr)配列と融合されている、請求項1〜29のいずれか1項に記載の組成物。
- tracr配列は、配列番号25によってコードされるヌクレオチド配列を含む、請求項30に記載の組成物。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAおよびCasタンパク質をコードする核酸は、真核細胞において発現される、請求項2〜4および6〜31のいずれか1項に記載の組成物。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAおよび/またはCasタンパク質をコードする核酸は、1つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている、請求項2〜4および6〜32のいずれか1項に記載の組成物。
- 第1のガイドRNAおよび/または第2のガイドRNAは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターと作動可能に連結されている、請求項33に記載の組成物。
- RNAポリメラーゼIIIプロモーターは、U6、7SKまたはH1プロモーターである、請求項34に記載の組成物。
- Casタンパク質をコードする核酸は、RNAポリメラーゼIIプロモーターと作動可能に連結されている、請求項33〜35のいずれか1項に記載の組成物。
- RNAポリメラーゼIIプロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、CMVプロモーター(minCMVプロモーター)由来の最小プロモーター断片、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サルウイルス40(SV40)プロモーター、CK6プロモーター、トランスサイレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、LSPプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、EF1αプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン/ウサギβ−グロビンプロモーター(CAG)プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ(PDE)プロモーター、網膜色素変性症(RP1)プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子(IRBP)プロモーターである、請求項36に記載の組成物。
- CRISPR−Casシステムは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸および/もしくはタンパク質の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項1、3〜5または7〜31のいずれか1項に記載の組成物。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAまたはCasタンパク質のうちの1つまたはそれ以上をコードする核酸は、システムの同一または異なるベクター上に位置する、請求項2〜4および6〜37のいずれか1項に記載の組成物。
- ベクターは、プラスミドである、請求項39に記載の組成物。
- ベクターは、送達システムと複合体形成されている、請求項39または40に記載の組成物。
- ベクターは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項41に記載の組成物。
- ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターである、請求項29に記載の組成物。
- ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである、請求項43に記載の組成物。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAdまたはブタAd3型に由来する、請求項44に記載の組成物。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2またはアデノウイルス血清型5の変異体に由来する、請求項44または45に記載の組成物。
- ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである、請求項43に記載の組成物。
- 組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス(Mokala virus)、狂犬病ウイルス、RD114またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する、請求項47に記載の組成物。
- ベクターは、rHSVベクターである、請求項43に記載の組成物。
- rHSVベクターは、rHSV−1またはrHSV−2に由来する、請求項49に記載の組成物。
- ベクターは、組換えAAV(rAAV)ベクターである、請求項43に記載の組成物。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAまたはCasタンパク質のうちの1つまたはそれ以上をコードする核酸は、1つまたはそれ以上のAAV逆方向末端反復(ITR)配列がその両端に位置する、請求項51に記載の組成物。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAまたはCasタンパク質のうちの1つまたはそれ以上をコードする核酸は、2つのAAV ITRがその両端に位置する、請求項52に記載の組成物。
- AAV ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、ヤギAAV、ウシAAVまたはマウスAAVキャプシド血清型ITRである、請求項52または請求項53に記載の組成物。
- AAV ITRは、AAV2 ITRである、請求項52〜54のいずれか1項に記載の組成物。
- ベクターは、自己相補的ベクターである、請求項52〜55のいずれか1項に記載の組成物。
- ベクターは、ウイルス粒子中にキャプシド封入されている、請求項43に記載の組成物。
- ウイルス粒子は、組換えアデノウイルスベクターをキャプシド封入する組換えアデノウイルス粒子である、請求項57に記載の組成物。
- 組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAdまたはブタAd3に由来するキャプシドを含む、請求項58に記載の組成物。
- 組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2キャプシドまたはアデノウイルス血清型5キャプシドの変異体を含む、請求項58または59に記載の組成物。
- ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド封入する組換えレンチウイルス粒子である、請求項57に記載の組成物。
- 組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス(Mokala virus)、狂犬病ウイルス、RD114またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む、請求項61に記載の組成物。
- ウイルス粒子は、組換えHSVベクターをキャプシド封入する組換えHSV粒子である、請求項57に記載の組成物。
- 組換えHSV粒子は、rHSV−1粒子またはrHSV−2ウイルス粒子である、請求項63に記載の組成物。
- ウイルス粒子は、組換えAAVベクターを含む組換えAAVウイルス粒子である、請求項57に記載の組成物。
- 組換えAAVウイルス粒子は、クレードA〜Fに由来するAAV血清型キャプシドを含む、請求項65に記載の組成物。
- AAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2−7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、ヤギAAV、AAV1/AAV2キメラ、ウシAAVまたはマウスAAVキャプシドrAAV2/HBoV1血清型キャプシドを含む、請求項65または66に記載の組成物。
- rAAVウイルス粒子のITRおよびキャプシドは、同一AAV血清型に由来する、請求項65〜67のいずれか1項に記載の組成物。
- rAAVウイルス粒子のITRおよびキャプシドは、異なるAAV血清型に由来する、請求項65〜67のいずれか1項に記載の組成物。
- 組換えAAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9および/またはAAVrh10キャプシドを含む、請求項65〜69のいずれか1項に記載の組成物。
- AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9および/またはAAVrh10キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む、請求項70に記載の組成物。
- rAAVベクターは、AAV2 ITRを含む、請求項65〜71のいずれか1項に記載の組成物。
- 個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための方法であって、該方法は、
a)該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする、第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAと、
b)Casタンパク質と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムを含む組成物の治療有効量を、個体に投与することを含み、該Casタンパク質は、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的DNA分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的DNAの部分を切り出す、前記方法。 - 個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害を治療するための方法であって、該方法は、
a)該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする、第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAと、
b)Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムをコードする核酸を含む組成物の治療有効量を、個体に投与することを含み、該Casタンパク質は、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的DNA分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的DNAの部分を切り出す、前記方法。 - 深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ia型、先天性グリコシル化異常症II型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病A、遺伝性巨赤芽球性貧血1、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症II型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症I型、ニーマン・ピック病C型、眼白子症I型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、X連鎖高免疫グロブリンM血症またはX連鎖低リン酸血症である、請求項73または74に記載の方法。
- 深部イントロン突然変異は、表1に示される深部イントロン突然変異である、請求項73〜75のいずれか1項に記載の方法。
- 個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための方法であって、該方法は、
a)該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする、第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAと、
b)Casタンパク質と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムを含む組成物の治療有効量を、個体に投与することを含み、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的DNA分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的DNAの部分を切り出す、前記方法。 - 個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための方法であって、該方法は、
a)該深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする、第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAと、
b)Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムをコードする核酸を含む組成物の治療有効量を、個体に投与することを含み、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的DNA分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的DNAの部分を切り出す、前記方法。 - 眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはX連鎖網膜色素変性症である、請求項77または78に記載の方法。
- 深部イントロン突然変異は、表2に示される深部イントロン突然変異である、請求項77〜79のいずれか1項に記載の方法。
- 個体は、哺乳動物である、請求項73〜80のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳動物は、ヒトである、請求項81に記載の方法。
- 眼の疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項77〜82のいずれか1項に記載の方法。
- 組成物は、個体の眼に投与される、請求項77〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 投与は、網膜下または硝子体内である、請求項84に記載の方法。
- 第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAガイド配列は、中心体タンパク質290kDa(CEP290)遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする、請求項77〜85のいずれか1項に記載の方法。
- 深部イントロン突然変異は、c.2991+1655A>G突然変異である、請求項77〜86のいずれか1項に記載の方法。
- 第1のガイドRNAは、配列番号41、配列番号45、配列番号46または配列番号47の配列を含むDNAによってコードされる、請求項77〜87のいずれか1項に記載の方法。
- 第1のガイドRNAは、配列番号19、配列番号50、配列番号51または配列番号52の配列を含むDNAによってコードされる、請求項77〜88のいずれか1項に記載の方法。
- 第2のガイドRNAは、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号48または配列番号49の配列を含むDNAによってコードされる、請求項77〜89のいずれか1項に記載の方法。
- 第2のガイドRNAは、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号53または配列番号54の配列を含むDNAによってコードされる、請求項77〜90のいずれか1項に記載の方法。
- CEP290は、ヒトCEP290である、請求項86〜91のいずれか1項に記載の方法。
- CEP290は、配列番号23に示される配列の深部イントロン突然変異を含む、請求項86〜92のいずれか1項に記載の方法。
- 深部イントロン突然変異は、核酸の5’スプライス供与部位の約1〜10,000ヌクレオチド、約1〜1000ヌクレオチドまたは約100〜1000ヌクレオチド下流に位置する、請求項73〜93のいずれか1項に記載の方法。
- 深部イントロン突然変異は、核酸の3’スプライス受容部位の約1〜10,000ヌクレオチド、約1〜1000ヌクレオチドまたは約100〜1000ヌクレオチド上流に位置する、請求項73〜94のいずれか1項に記載の方法。
- 深部イントロン突然変異は、核酸中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項73〜95のいずれか1項に記載の方法。
- Casタンパク質は、Cas9タンパク質である、請求項73〜96のいずれか1項に記載の方法。
- Cas9タンパク質は、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9タンパク質、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)Cas9タンパク質、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)Cas9タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)Cas9タンパク質である、請求項97に記載の方法。
- Cas9は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項97または98に記載の方法。
- 真核細胞は、哺乳動物細胞である、請求項99に記載の方法。
- 真核細胞は、ヒト細胞である、請求項99または100に記載の方法。
- CRISPR−Casシステムは、1つまたはそれ以上の核局在性シグナル(NLS)をさらに含む、請求項73〜101のいずれか1項に記載の方法。
- Casタンパク質は、1つまたはそれ以上のNLSを含む、請求項102に記載の方法。
- NLSは、SV40ラージT抗原中のC末端配列である、請求項102または103に記載の方法。
- NLSは、配列PKKKRKV(配列番号26)またはPKKKRKVEDPKKKRKVD(配列番号27)を含む、請求項102〜104のいずれか1項に記載の方法。
- 第1のガイドRNAおよび/または第2のガイドRNAは、トランス活性化cr(tracr)配列と融合されている、請求項73〜105のいずれか1項に記載の方法。
- tracr配列は、配列番号25によってコードされるヌクレオチド配列を含む、請求項106に記載の方法。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAおよびCasタンパク質は、真核細胞において発現される、請求項73〜107のいずれか1項に記載の方法。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAおよび/またはCasタンパク質をコードする核酸は、1つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている、請求項74〜76および78〜108のいずれか1項に記載の方法。
- 第1のガイドRNAおよび/または第2のガイドRNAは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターと作動可能に連結されている、請求項109に記載の方法。
- RNAポリメラーゼIIIプロモーターは、U6、7SKまたはH1プロモーターである、請求項110に記載の方法。
- Casタンパク質をコードする核酸は、RNAポリメラーゼIIプロモーターと作動可能に連結されている、請求項109〜111のいずれか1項に記載の方法。
- RNAポリメラーゼIIプロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、CMVプロモーター(minCMVプロモーター)由来の最小プロモーター断片、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サルウイルス40(SV40)プロモーター、CK6プロモーター、トランスサイレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、LSPプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、EF1αプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン/ウサギβ−グロビンプロモーター(CAG)プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ(PDE)プロモーター、網膜色素変性症(RP1)プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子(IRBP)プロモーターである、請求項112に記載の方法。
- CRISPR−CASシステムは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項73、75〜77および79〜107のいずれか1項に記載の方法。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAまたはCasタンパク質のうちの1つまたはそれ以上をコードする核酸は、システムの同一または異なるベクター上に位置する、請求項74〜76および78〜114のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターは、プラスミドである、請求項115に記載の方法。
- ベクターは、送達システムと複合体形成されている、請求項115または116に記載の方法。
- ベクターは、脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項117に記載の方法。
- ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターである、請求項115に記載の方法。
- ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである、請求項119に記載の方法。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAdまたはブタAd3型に由来する、請求項120に記載の方法。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2またはアデノウイルス血清型5の変異体に由来する、請求項120または121に記載の方法。
- ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである、請求項119に記載の方法。
- 組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス(Mokala virus)、狂犬病ウイルス、RD114またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する、請求項123に記載の方法。
- ベクターは、rHSVベクターである、請求項119に記載の方法。
- rHSVベクターは、rHSV−1またはrHSV−2に由来する、請求項125に記載の方法。
- ベクターは、組換えAAV(rAAV)ベクターである、請求項119に記載の方法。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAまたはCasタンパク質のうちの1つまたはそれ以上をコードする核酸は、1つまたはそれ以上のAAV逆方向末端反復(ITR)配列がその両端に位置する、請求項127に記載の方法。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAまたはCasタンパク質のうちの1つまたはそれ以上をコードする核酸は、2つのAAV ITRがその両端に位置する、請求項128に記載の方法。
- AAV ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、ヤギAAV、ウシAAVまたはマウスAAVキャプシド血清型ITRである、請求項128または129に記載の方法。
- AAV ITRは、AAV2 ITRである、請求項128〜130のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターは、自己相補的ベクターである、請求項127〜131のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターは、ウイルス粒子中にキャプシド封入されている、請求項119に記載の方法。
- ウイルス粒子は、アデノウイルスベクターをキャプシド封入する組換えアデノウイルス粒子である、請求項133に記載の方法。
- 組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAdまたはブタAd3型に由来するキャプシドを含む、請求項134に記載の方法。
- 組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2キャプシドまたはアデノウイルス血清型5キャプシドの変異体を含む、請求項135に記載の方法。
- ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド封入する組換えレンチウイルス粒子である、請求項133に記載の方法。
- 組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス(Mokala virus)、狂犬病ウイルス、RD114またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む、請求項137に記載の方法。
- ウイルス粒子は、組換えHSVベクターをキャプシド封入する組換えHSV粒子である、請求項133に記載の方法。
- 組換えHSV粒子は、rHSV−1粒子またはrHSV−2ウイルス粒子である、請求項139に記載の方法。
- ウイルス粒子は、組換えAAVベクターを含む組換えAAVウイルス粒子である、請求項133に記載の方法。
- 組換えAAVウイルス粒子は、クレードA〜Fに由来するAAV血清型キャプシドを含む、請求項141に記載の方法。
- AAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2−7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、ヤギAAV、AAV1/AAV2キメラ、ウシAAVまたはマウスAAVキャプシドrAAV2/HBoV1血清型キャプシドを含む、請求項141または142に記載の方法。
- rAAVウイルス粒子のITRおよびキャプシドは、同一AAV血清型に由来する、請求項141〜143のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVウイルス粒子のITRおよびキャプシドは、異なるAAV血清型に由来する、請求項141〜143のいずれか1項に記載の方法。
- 組換えAAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9および/またはAAVrh10キャプシドを含む、請求項141〜145のいずれか1項に記載の方法。
- AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9および/またはAAVrh10キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む、請求項146に記載の方法。
- rAAVベクターは、AAV2 ITRを含む、請求項141〜147のいずれか1項に記載の方法。
- 組成物は、医薬組成物である、請求項73〜148のいずれか1項に記載の方法。
- 個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連している障害を治療するための、請求項1〜72のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- 個体の核酸における深部イントロン突然変異と関連している障害を治療するための医薬の製造における、請求項1〜72のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- 深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ia型、先天性グリコシル化異常症II型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病A、遺伝性巨赤芽球性貧血1、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症II型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症I型、ニーマン・ピック病C型、眼白子症I型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、X連鎖高免疫グロブリンM血症またはX連鎖低リン酸血症である、請求項150または151に記載の使用。
- 深部イントロン突然変異は、表1に示される深部イントロン突然変異である、請求項150〜152のいずれか1項に記載の使用。
- 深部イントロン突然変異と関連する疾患または障害は、眼の疾患である、請求項150〜153のいずれか1項に記載の使用。
- 眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはX連鎖網膜色素変性症である、請求項154の使用。
- 深部イントロン突然変異は、表2に示される深部イントロン突然変異である、請求項154または155に記載の使用。
- 個体は、哺乳動物である、請求項150〜156のいずれか1項に記載の使用。
- 哺乳動物は、ヒトである、請求項157に記載の使用。
- 眼の疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項154〜158のいずれか1項に記載の使用。
- 組成物は、個体の眼への投与のために製剤化される、請求項154〜159のいずれか1項に記載の使用。
- 投与は、網膜下または硝子体内投与のために製剤化される、請求項160に記載の使用。
- 第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAガイド配列は、中心体タンパク質290kDa(CEP290)遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする、請求項154〜161のいずれか1項に記載の使用。
- 深部イントロン突然変異は、c.2991+1655A>G突然変異である、請求項154〜162のいずれか1項に記載の使用。
- 第1のガイドRNAは、配列番号41、配列番号45、配列番号46または配列番号47の配列を含むDNAによってコードされる、請求項154〜163のいずれか1項に記載の使用。
- 第1のガイドRNAは、配列番号19、配列番号50、配列番号51または配列番号52の配列を含むDNAによってコードされる、請求項154〜164のいずれか1項に記載の使用。
- 第2のガイドRNAは、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号48または配列番号49の配列を含むDNAによってコードされる、請求項154〜165のいずれか1項に記載の使用。
- 第2のガイドRNAは、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号53または配列番号54の配列を含むDNAによってコードされる、請求項154〜166のいずれか1項に記載の使用。
- CEP290は、ヒトCEP290である、請求項162〜167のいずれか1項に記載の使用。
- CEP290は、配列番号23に示される配列の深部イントロン突然変異を含む、請求項162〜168のいずれか1項に記載の使用。
- 深部イントロン突然変異は、核酸の5’スプライス供与部位の約1〜10,000ヌクレオチド、約1〜1000ヌクレオチドまたは約100〜1000ヌクレオチド下流に位置する、請求項150〜169のいずれか1項に記載の使用。
- 深部イントロン突然変異は、核酸の3’スプライス受容部位の約1〜10,000ヌクレオチド、約1〜1000ヌクレオチドまたは約100〜1000ヌクレオチド上流に位置する、請求項150〜170のいずれか1項に記載の使用。
- 深部イントロン突然変異は、スプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項150〜171のいずれか1項に記載の使用。
- 請求項1〜72のいずれか1項に記載の組成物を含むキット。
- 請求項73〜149のいずれか1項に記載の方法において使用するためのキットであって、請求項1〜73のいずれか1項に記載の組成物を含む前記キット。
- 使用のための説明書をさらに含む、請求項173または174に記載のキット。
- ウイルスベクターを含むウイルス粒子であって、該ウイルスベクターは、
a)個体の核酸における深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする、第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAと、
b)Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムをコードする核酸を含み、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的DNA分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的DNAの部分を切り出す、前記ウイルス粒子。 - 個体の核酸における深部イントロン突然変異は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ia型、先天性グリコシル化異常症II型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病A、遺伝性巨赤芽球性貧血1、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症II型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症I型、ニーマン・ピック病C型、眼白子症I型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、X連鎖高免疫グロブリンM血症またはX連鎖低リン酸血症と関連する、請求項176に記載のウイルス粒子。
- 個体の核酸における深部イントロン突然変異は、表1に示される深部イントロン突然変異である、請求項176または177に記載のウイルス粒子。
- 無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ia型、先天性グリコシル化異常症II型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病A、遺伝性巨赤芽球性貧血1、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症II型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症I型、ニーマン・ピック病C型、眼白子症I型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、X連鎖高免疫グロブリンM血症またはX連鎖低リン酸血症を有する個体を治療するために使用される、請求項176〜178のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- ウイルスベクターを含むウイルス粒子であって、該ウイルスベクターは、
a)眼の疾患または障害と関連する個体の核酸における深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする、第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAと、
b)Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列と
を含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムをコードする核酸を含み、該深部イントロン突然変異の両端に位置する部位で標的DNA分子を切断し、それによって、該深部イントロン突然変異を含む標的DNAの部分を切り出す、前記ウイルス粒子。 - 眼の疾患または障害は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはX連鎖網膜色素変性症である、請求項180に記載のウイルス粒子。
- 深部イントロン突然変異は、表2に示される深部イントロン突然変異である、請求項180または181に記載のウイルス粒子。
- レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはX連鎖網膜色素変性症を治療するために使用される、請求項180〜182のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 眼の疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項180〜183のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAガイド配列は、中心体タンパク質290kDa(CEP290)核酸の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする、請求項180〜184のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 深部イントロン突然変異は、c.2991+1655A>G突然変異である、請求項180〜185のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 第1のガイドRNAは、配列番号41、配列番号45、配列番号46または配列番号47の配列を含むDNAによってコードされる、請求項180〜186のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 第1のガイドRNAは、配列番号19、配列番号50、配列番号51または配列番号52の配列を含むDNAによってコードされる、請求項180〜187のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 第2のガイドRNAは、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号48または配列番号49の配列を含むDNAによってコードされる、請求項180〜188のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 第2のガイドRNAは、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号53または配列番号54の配列を含むDNAによってコードされる、請求項180〜189のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- CEP290は、ヒトCEP290である、請求項185〜190のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- CEP290は、配列番号23に示される配列の深部イントロン突然変異を含む、請求項185〜191のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 深部イントロン突然変異は、核酸の5’スプライス供与部位の約1〜10,000ヌクレオチド、約1〜1000ヌクレオチドまたは約100〜1000ヌクレオチド下流に位置する、請求項176〜192のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 深部イントロン突然変異は、核酸の3’スプライス受容部位の約1〜10,000ヌクレオチド、約1〜1000ヌクレオチドまたは約100〜1000ヌクレオチド上流に位置する、請求項176〜193のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 深部イントロン突然変異は、核酸中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項176〜194のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- Casタンパク質は、Cas9タンパク質である、請求項176〜195のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- Cas9タンパク質は、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9タンパク質、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)Cas9タンパク質、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)Cas9タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)Cas9タンパク質である、請求項196に記載のウイルス粒子。
- Cas9は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項196または197に記載のウイルス粒子。
- 真核細胞は、哺乳動物細胞である、請求項198に記載のウイルス粒子。
- 真核細胞は、ヒト細胞である、請求項198または199に記載のウイルス粒子。
- CRISPR−Casシステムは、1つまたはそれ以上の核局在性シグナル(NLS)をさらに含む、請求項176〜200のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- Casタンパク質は、1つまたはそれ以上のNLSを含む、請求項201に記載のウイルス粒子。
- NLSは、SV40ラージT抗原中のC末端配列である、請求項201または202に記載のウイルス粒子。
- NLSは、配列PKKKRKV(配列番号26)またはPKKKRKVEDPKKKRKVD(配列番号27)を含む、請求項201〜203のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 第1のガイドRNAおよび/または第2のガイドRNAは、トランス活性化cr(tracr)配列と融合されている、請求項176〜204のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- tracr配列は、配列番号25によってコードされるヌクレオチド配列を含む、請求項205に記載のウイルス粒子。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAおよびCasタンパク質は、真核細胞において発現される、請求項176〜206のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAおよび/またはCasタンパク質をコードする核酸は、1つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている、請求項176〜207のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 第1のガイドRNAおよび/または第2のガイドRNAは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターと作動可能に連結されている、請求項208に記載のウイルス粒子。
- RNAポリメラーゼIIIプロモーターは、U6、7SKまたはH1プロモーターである、請求項209に記載のウイルス粒子。
- Casタンパク質をコードする核酸は、RNAポリメラーゼIIプロモーターと作動可能に連結されている、請求項208〜210のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- RNAポリメラーゼIIプロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、CMVプロモーター(minCMVプロモーター)由来の最小プロモーター断片、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サルウイルス40(SV40)プロモーター、CK6プロモーター、トランスサイレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、LSPプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、EF1αプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン/ウサギβ−グロビンプロモーター(CAG)プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ(PDE)プロモーター、網膜色素変性症(RP1)プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子(IRBP)プロモーターである、請求項211に記載のウイルス粒子。
- ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターである、請求項176〜212のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである、請求項213に記載のウイルス粒子。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAdまたはブタAd3型に由来する、請求項214に記載のウイルス粒子。
- 組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAdまたはブタAd3型に由来するキャプシドを含む、請求項214または215に記載のウイルス粒子。
- 組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2キャプシドまたはアデノウイルス血清型5キャプシドの変異体を含む、請求項216に記載のウイルス粒子。
- ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである、請求項213に記載のウイルス粒子。
- 組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス(Mokala virus)、狂犬病ウイルス、RD114またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する、請求項218に記載のウイルス粒子。
- 組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス(Mokala virus)、狂犬病ウイルス、RD114またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む、請求項218または219に記載のウイルス粒子。
- ベクターは、rHSVベクターである、請求項213に記載のウイルス粒子。
- rHSVベクターは、rHSV−1またはrHSV−2に由来する、請求項221に記載のウイルス粒子。
- 組換えHSV粒子は、rHSV−1粒子またはrHSV−2ウイルス粒子である、請求項221または222に記載のウイルス粒子。
- ベクターは、組換えAAV(rAAV)ベクターである、請求項213に記載のウイルス粒子。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAまたはCasタンパク質のうちの1つまたはそれ以上をコードする核酸は、1つまたはそれ以上のAAV逆方向末端反復(ITR)配列がその両端に位置する、請求項224に記載のウイルス粒子。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAまたはCasタンパク質のうちの1つまたはそれ以上をコードする核酸は、2つのAAV ITRがその両端に位置する、請求項225に記載のウイルス粒子。
- AAV ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、ヤギAAV、ウシAAVまたはマウスAAVキャプシド血清型ITRである、請求項225または226に記載のウイルス粒子。
- AAV ITRは、AAV2 ITRである、請求項224〜227のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- ベクターは、自己相補的ベクターである、請求項224〜228のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 組換えAAVウイルス粒子は、クレードA〜Fに由来するAAV血清型キャプシドを含む、請求項224〜229のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- AAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2−7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、ヤギAAV、AAV1/AAV2キメラ、ウシAAVまたはマウスAAVキャプシドrAAV2/HBoV1血清型キャプシドを含む、請求項224〜230のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- rAAVウイルス粒子のITRおよびキャプシドは、同一AAV血清型に由来する、請求項225〜231のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- rAAVウイルス粒子のITRおよびキャプシドは、異なるAAV血清型に由来する、請求項225〜231のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 組換えAAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9および/またはAAVrh10キャプシドを含む、請求項224〜233のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9および/またはAAVrh10キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む、請求項234に記載のウイルス粒子。
- rAAVベクターは、AAV2 ITRを含む、請求項224〜235のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 医薬製剤中にある、請求項176〜236のいずれか1項に記載のウイルス粒子。
- 核酸における深部イントロン突然変異と関連する眼の疾患のin vitroモデルを作製するための方法であって、
a)真核細胞に、
i)核酸中のイントロンの標的DNA配列への単一ガイドRNA、
ii)Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
iii)所望のイントロン突然変異およびプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の両端に位置する相同性アームを含む相同性組換え修復(HDR)鋳型を含む一本鎖オリゴヌクレオチド
を含むCRISPR−Casシステムをコードする核酸を導入することと、
b)核酸中に組み込まれた突然変異を含む細胞を単離することと
を含む前記方法。 - 深部イントロン突然変異は、核酸の5’スプライス供与部位の約1〜10,000ヌクレオチド、約1〜1000ヌクレオチドまたは約100〜1000ヌクレオチド下流に位置する、請求項238に記載の方法。
- 深部イントロン突然変異は、核酸の3’スプライス受容部位の約1〜10,000ヌクレオチド、約1〜1000ヌクレオチドまたは約100〜1000ヌクレオチド上流に位置する、請求項238または239に記載の方法。
- 深部イントロン突然変異は、核酸中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項238〜240のいずれか1項に記載の方法。
- PAMは、細胞において発現されたCasタンパク質による一本鎖オリゴヌクレオチドの切断を避けるために突然変異を含む、請求項238〜241のいずれか1項に記載の方法。
- Casタンパク質は、Cas9タンパク質である、請求項238〜242のいずれか1項に記載の方法。
- Cas9タンパク質は、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9タンパク質、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)Cas9タンパク質、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)Cas9タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)Cas9タンパク質である、請求項243に記載の方法。
- Cas9は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項243または244に記載の方法。
- 真核細胞は、哺乳動物細胞である、請求項238〜245のいずれか1項に記載の方法。
- 真核細胞は、ヒト細胞である、請求項246に記載の方法。
- 真核細胞は、眼の細胞である、請求項238〜247のいずれか1項に記載の方法。
- 眼の細胞は、網膜細胞である、請求項248に記載の方法。
- CRISPR−Casシステムは、1つまたはそれ以上の核局在性シグナル(NLS)をさらに含む、請求項238〜249のいずれか1項に記載の方法。
- Casタンパク質は、1つまたはそれ以上のNLSを含む、請求項250に記載の方法。
- NLSは、SV40ラージT抗原中のC末端配列である、請求項250または251に記載の方法。
- NLSは、配列PKKKRKV(配列番号26)またはPKKKRKVEDPKKKRKVD(配列番号27)を含む、請求項250〜252のいずれか1項に記載の方法。
- 単一ガイドRNAは、トランス活性化cr(tracr)配列と融合されている、請求項238〜253のいずれか1項に記載の方法。
- tracr配列は、配列番号25によってコードされるヌクレオチド配列を含む、請求項254に記載の方法。
- 単一ガイドRNAおよび/またはCasタンパク質をコードする核酸および一本鎖オリゴヌクレオチドは、1つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている、請求項238〜255のいずれか1項に記載の方法。
- 単一ガイドRNAは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターと作動可能に連結されている、請求項256に記載の方法。
- RNAポリメラーゼIIIプロモーターは、U6、7SKまたはH1プロモーターである、請求項257に記載の方法。
- Casタンパク質をコードする核酸および/または一本鎖オリゴヌクレオチドは、RNAポリメラーゼIIプロモーターと作動可能に連結されている、請求項256〜258のいずれか1項に記載の方法。
- RNAポリメラーゼIIプロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、CMVプロモーター(minCMVプロモーター)由来の最小プロモーター断片、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サルウイルス40(SV40)プロモーター、CK6プロモーター、トランスサイレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、LSPプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、EF1αプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン/ウサギβ−グロビンプロモーター(CAG)プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ(PDE)プロモーター、網膜色素変性症(RP1)プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子(IRBP)プロモーターである、請求項259に記載の方法。
- 単一ガイドRNA、Casタンパク質または一本鎖オリゴヌクレオチドのうちの1つまたはそれ以上をコードする核酸は、システムの同一または異なるベクター上に位置する、請求項238〜260のいずれか1項に記載の方法。
- 眼の疾患は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群またはX連鎖網膜色素変性症である、請求項238〜261のいずれか1項に記載の方法。
- 深部イントロン突然変異は、表2に示される深部イントロン突然変異である、請求項262に記載の方法。
- 眼の疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項262または263に記載の方法。
- 単一ガイドRNAは、中心体タンパク質290kDa(CEP290)遺伝子のイントロン配列をターゲッティングする、請求項262〜264のいずれか1項に記載の方法。
- 導入された深部イントロン突然変異は、c.2991+1655A>G突然変異である、請求項262〜265のいずれか1項に記載の方法。
- 単一ガイドRNAは、配列番号1および配列番号2の配列を含むDNAによってコードされる、請求項262〜266のいずれか1項に記載の方法。
- 一本鎖オリゴヌクレオチドは、配列番号3の配列を含む、請求項262〜267のいずれか1項に記載の方法。
- CEP290は、ヒトCEP290である、請求項262〜268のいずれか1項に記載の方法。
- CEP290は、配列番号23に示される深部配列(deep the sequence)を含む、請求項269に記載の方法。
- 細胞において標的核酸を切断するための方法であって、該方法は、
細胞に、
a)突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムをコードする核酸と、
b)i)Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ii)第1のガイドRNAまたは第2のガイドRNAがハイブリダイズする第1のガイドRNA標的部位
を含むCas発現カセットと
を含む組成物の有効量を送達することを含み、
該Casタンパク質は、該Cas発現カセットから発現され、
該Casタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的DNA配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的DNAの部分を切り出し、
該Casタンパク質は、該第1のガイドRNA標的部位で該Cas発現カセットを切断し、それによって、該Cas発現カセットの切断前の該Casタンパク質の発現と比較して、該Casタンパク質の発現を低減する、前記方法。 - 個体の核酸における突然変異と関連する疾患または障害を治療するための方法であって、該方法は、
a)突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムをコードする核酸と、
b)i)Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ii)第1のガイドRNAまたは第2のガイドRNAがハイブリダイズする第1のガイドRNA標的部位
を含むCas発現カセットと
を含む組成物の治療有効量を個体に投与することを含み、
該Casタンパク質は、該Cas発現カセットから発現され、
該Casタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的DNA配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的DNAの部分を切り出し、
該Casタンパク質は、該第1のガイドRNA標的部位で該Cas発現カセットを切断し、それによって、該Cas発現カセットの切断前の該Casタンパク質の発現と比較して、該Casタンパク質の発現を低減する、前記方法。 - 個体の核酸における突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための方法であって、該方法は、
a)突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムをコードする核酸と、
b)i)Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ii)第1のガイドRNAまたは第2のガイドRNAがハイブリダイズする第1のガイドRNA標的部位
を含むCas発現カセットと
を含む組成物の治療有効量を個体に投与することを含み、
該Casタンパク質は、該Cas発現カセットから発現され、
該Casタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的DNA配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的DNAの部分を切り出し、
該Casタンパク質は、該Cas発現カセットを、該第1のガイドRNA標的部位で切断し、それによって、該Cas発現カセットの切断前の該Casタンパク質の発現と比較して、該Casタンパク質の発現を低減する、前記方法。 - Cas発現カセットは、
iii)第1のガイドRNAまたは第2のガイドRNAがハイブリダイズする第2のガイドRNA標的部位
をさらに含み、
Casタンパク質は、該Cas発現カセットを、第1および第2のガイドRNA標的部位で切断し、それによって、該Cas発現カセットの切断前の該Casタンパク質の発現と比較して、該Casタンパク質の発現を低減する、請求項271〜273のいずれか1項に記載の方法。 - 第1のガイドRNAは、第1のガイドRNA標的部位および第2のガイドRNA標的部位とハイブリダイズする、請求項274に記載の方法。
- 第2のガイドRNAは、第1のガイドRNA標的部位および第2のガイドRNA標的部位とハイブリダイズする、請求項274に記載の方法。
- 第1のガイドRNAは、第1のガイドRNA標的部位とハイブリダイズし、第2のガイドRNAは、第2のガイドRNA標的部位とハイブリダイズする、請求項274に記載の方法。
- Cas発現カセットは、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているポリアデニル化(ポリA)配列をさらに含む、請求項271〜277のいずれか1項に記載の方法。
- ポリA配列は、SV40ポリA配列である、請求項278に記載の方法。
- Casタンパク質による第1または第2のガイドRNA標的部位の切断は、該Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリA配列間の作動可能な連結を妨げる、請求項278または279に記載の方法。
- 第1または第2のガイドRNA標的部位は、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリA配列の間にある、請求項278〜280に記載の方法。
- Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Cas発現カセットから発現される該Casタンパク質が、1つまたはそれ以上のNLSとインフレームで融合されるように、1つまたはそれ以上の核局在性シグナル(NLS)をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されている、請求項271〜281のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のNLSをコードするヌクレオチド配列は、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリアデニル化(ポリA)配列の間にある、請求項282に記載の方法。
- 第1または第2のガイドRNA標的部位は、1つまたはそれ以上のNLSをコードするヌクレオチド配列およびポリA配列の間にある、請求項283に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のNLSは、SV40ラージT抗原中のC末端配列を含む、請求項282〜284のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のNLSは、配列PKKKRKV(配列番号26)またはPKKKRKVEDPKKKRKVD(配列番号27)を含む、請求項282〜285のいずれか1項に記載の方法。
- CRISPR−Casシステムをコードする核酸および/またはCas発現カセットは、1つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている、請求項271〜286のいずれか1項に記載の方法。
- Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されている、請求項287に記載の方法。
- Casタンパク質による第1または第2のガイドRNA標的部位の切断は、調節制御エレメントおよび該Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間の作動可能な連結を妨げる、請求項287または288に記載の方法。
- 第1または第2のガイドRNA標的部位は、プロモーターおよびCasタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間にある、請求項288または289に記載の方法。
- Cas発現カセットは、
iii)第1のガイドRNAまたは第2のガイドRNAがハイブリダイズする第2のガイドRNA標的部位であって、Casタンパク質に特異的なプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と隣接する、前記第2のガイドRNA標的部位
をさらに含み、
Casタンパク質による第1のガイドRNA標的部位の切断は、調節制御エレメントおよび該Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間の作動可能な連結を妨げ、
Casタンパク質による第2のガイドRNA標的部位の切断は、該Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリA配列の間の作動可能な連結を妨げ、
該Casタンパク質の発現および標的DNA配列の切断の際に、該Casタンパク質は、該Cas発現カセットを、第1および第2のガイドRNA標的部位で切断し、それによって、該Cas発現カセットの切断前の該Casタンパク質の発現と比較して、該Casタンパク質の発現を低減する、請求項271〜273のいずれか1項に記載の方法。 - Cas発現カセットは、
iii)第1のガイドRNAまたは第2のガイドRNAがハイブリダイズする、第2のガイドRNA標的部位
をさらに含み、
第1のガイドRNA標的部位は、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列および該Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているプロモーターの間にあり、
第2のガイドRNA標的部位は、該Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列および該Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているポリA配列の間にあり、
該Casタンパク質は、該Cas発現カセットを、第1および第2のガイドRNA標的部位で切断し、それによって、該Cas発現カセットの切断前の該Casタンパク質の発現と比較して、該Casタンパク質の発現を低減する、請求項271〜273のいずれか1項に記載の方法。 - 第1のガイドRNAおよび/または第2のガイドRNAは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターと作動可能に連結されている、請求項288〜292のいずれか1項に記載の方法。
- RNAポリメラーゼIIIプロモーターは、U6、7SKまたはH1プロモーターである、請求項293に記載の方法。
- Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、RNAポリメラーゼIIプロモーターと作動可能に連結されている、請求項288〜294のいずれか1項に記載の方法。
- RNAポリメラーゼIIプロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、CMVプロモーター(minCMVプロモーター)由来の最小プロモーター断片、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サルウイルス40(SV40)プロモーター、CK6プロモーター、トランスサイレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、LSPプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、EF1αプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン/ウサギβ−グロビンプロモーター(CAG)プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ(PDE)プロモーター、網膜色素変性症(RP1)プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子(IRBP)プロモーターである、請求項295に記載の方法。
- 突然変異は、深部イントロン突然変異である、請求項272〜296のいずれか1項に記載の方法。
- 個体の核酸における深部イントロン突然変異は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ia型、先天性グリコシル化異常症II型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病A、遺伝性巨赤芽球性貧血1、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症II型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症I型、ニーマン・ピック病C型、眼白子症I型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、X連鎖高免疫グロブリンM血症またはX連鎖低リン酸血症と関連している、請求項297に記載の方法。
- 個体の核酸における深部イントロン突然変異は、表2に示される深部イントロン突然変異である、請求項297または298に記載の方法。
- 無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ia型、先天性グリコシル化異常症II型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病A、遺伝性巨赤芽球性貧血1、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症II型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症I型、ニーマン・ピック病C型、眼白子症I型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、X連鎖高免疫グロブリンM血症またはX連鎖低リン酸血症を有する個体を治療するために使用される、請求項297〜299のいずれか1項に記載の方法。
- 疾患または障害は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群およびX連鎖網膜色素変性症からなる群から選択される眼の疾患または障害である、請求項272〜297のいずれか1項に記載の方法。
- 眼の疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項301に記載の方法。
- 深部イントロン突然変異は、表2に示される深部イントロン突然変異である、請求項297に記載の方法。
- 個体は、哺乳動物である、請求項272〜303のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳動物は、ヒトである、請求項304に記載の方法。
- 組成物は、個体の眼に投与される、請求項273〜305のいずれか1項に記載の方法。
- 投与は、網膜下または硝子体内である、請求項306に記載の方法。
- 第1および第2のガイドRNAは、中心体タンパク質290kDa(CEP290)遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする、請求項272〜307のいずれか1項に記載の方法。
- 深部イントロン突然変異は、c.2991+1655A>G突然変異である、請求項308に記載の方法。
- 第1のガイドRNAは、配列番号41、配列番号45、配列番号46または配列番号47の配列を含むDNAによってコードされる、請求項272〜309のいずれか1項に記載の方法。
- 第1のガイドRNAは、配列番号19、配列番号50、配列番号51または配列番号52の配列を含むDNAによってコードされる、請求項272〜309のいずれか1項に記載の方法。
- 該第2のガイドRNAは、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号48または配列番号49の配列を含むDNAによってコードされる、請求項272〜311のいずれか1項に記載の方法。
- 第2のガイドRNAは、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号53または配列番号54の配列を含むDNAによってコードされる、請求項272〜312のいずれか1項に記載の方法。
- CEP290は、ヒトCEP290である、請求項308〜313のいずれか1項に記載の方法。
- CEP290は、配列番号23に示される配列の深部イントロン突然変異を含む、請求項308〜314のいずれか1項に記載の方法。
- 深部イントロン突然変異は、核酸の5’スプライス供与部位の約1〜10,000ヌクレオチド、約1〜1000ヌクレオチドまたは約100〜1000ヌクレオチド下流に位置する、請求項297〜315のいずれか1項に記載の方法。
- 深部イントロン突然変異は、核酸の3’スプライス受容部位の約1〜10,000ヌクレオチド、約1〜1000ヌクレオチドまたは約100〜1000ヌクレオチド上流に位置する、請求項297〜316のいずれか1項に記載の方法。
- 深部イントロン突然変異は、核酸中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項297〜317のいずれか1項に記載の方法。
- Casタンパク質は、Cas9タンパク質である、請求項271〜318のいずれか1項に記載の方法。
- Cas9タンパク質は、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9タンパク質、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)Cas9タンパク質、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)Cas9タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)Cas9タンパク質である、請求項319に記載の方法。
- Cas9は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項319または320に記載の方法。
- 真核細胞は、哺乳動物細胞である、請求項321に記載の方法。
- 真核細胞は、ヒト細胞である、請求項321または322に記載の方法。
- 第1のガイドRNAおよび/または第2のガイドRNAは、トランス活性化cr(tracr)配列と融合されている、請求項271〜323のいずれか1項に記載の方法。
- tracr配列は、配列番号25によってコードされるヌクレオチド配列を含む、請求項324に記載の方法。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAおよびCasタンパク質は、真核細胞において発現される、請求項271〜325のいずれか1項に記載の方法。
- CRISPR−CASシステムは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項271〜326のいずれか1項に記載の方法。
- CRISPR−Casシステムをコードする核酸およびCas発現カセットは、同一または異なるベクター上に位置する、請求項271〜327のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターは、プラスミドである、請求項328に記載の方法。
- ベクターは、送達システムと複合体形成されている、請求項328または329に記載の方法。
- ベクターは、脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項330に記載の方法。
- ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターである、請求項328に記載の方法。
- ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである、請求項332に記載の方法。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAdまたはブタAd3型に由来する、請求項333に記載の方法。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2またはアデノウイルス血清型5の変異体に由来する、請求項333または334に記載の方法。
- ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである、請求項332に記載の方法。
- 組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス(Mokala virus)、狂犬病ウイルス、RD114またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する、請求項336に記載の方法。
- ベクターは、rHSVベクターである、請求項332に記載の方法。
- rHSVベクターは、rHSV−1またはrHSV−2に由来する、請求項338に記載の方法。
- ベクターは、組換えAAV(rAAV)ベクターである、請求項332に記載の方法。
- CRISPR−Casシステムをコードする核酸およびCas発現カセットは、異なるrAAVベクター上にある、請求項340に記載の方法。
- CRISPR−Casシステムをコードする核酸および/またはCas発現カセットは、1つまたはそれ以上のAAV逆方向末端反復(ITR)配列がその両端に位置する、請求項340または341に記載の方法。
- CRISPR−Casシステムをコードする核酸および/またはCas発現カセットは、2つのAAV ITRがその両端に位置する、請求項342に記載の方法。
- AAV ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、ヤギAAV、ウシAAVまたはマウスAAVキャプシド血清型ITRである、請求項342または343に記載の方法。
- AAV ITRは、AAV2 ITRである、請求項342〜344のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターは、自己相補的ベクターである、請求項340〜345のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターは、ウイルス粒子中にキャプシド封入されている、請求項332に記載の方法。
- ウイルス粒子は、アデノウイルスベクターをキャプシド封入する組換えアデノウイルス粒子である、請求項347に記載の方法。
- 組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAdまたはブタAd3型に由来するキャプシドを含む、請求項348に記載の方法。
- 組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2キャプシドまたはアデノウイルス血清型5キャプシドの変異体を含む、請求項348または349に記載の方法。
- ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド封入する組換えレンチウイルス粒子である、請求項347に記載の方法。
- 組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス(Mokala virus)、狂犬病ウイルス、RD114またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む、請求項351に記載の方法。
- ウイルス粒子は、組換えHSVベクターをキャプシド封入する組換えHSV粒子である、請求項347に記載の方法。
- 組換えHSV粒子は、rHSV−1粒子またはrHSV−2ウイルス粒子である、請求項353に記載の方法。
- ウイルス粒子は、組換えAAVベクターを含む組換えAAVウイルス粒子である、請求項347に記載の方法。
- CRISPR−Casシステムをコードする核酸は、第1の組換えAAVウイルス粒子の第1のrAAVベクター上にあり、Cas発現カセットは、第2の組換えAAVウイルス粒子の第2のrAAVベクター上にある、請求項347または355に記載の方法。
- 組換えAAVウイルス粒子は、クレードA〜Fに由来するAAV血清型キャプシドを含む、請求項355または356に記載の方法。
- AAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2−7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、ヤギAAV、AAV1/AAV2キメラ、ウシAAVまたはマウスAAVキャプシドrAAV2/HBoV1血清型キャプシドを含む、請求項355〜357のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVウイルス粒子のITRおよびキャプシドは、同一AAV血清型に由来する、請求項355〜358のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVウイルス粒子のITRおよびキャプシドは、異なるAAV血清型に由来する、請求項355〜358のいずれか1項に記載の方法。
- 組換えAAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9および/またはAAVrh10キャプシドを含む、請求項355〜360のいずれか1項に記載の方法。
- AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9および/またはAAVrh10キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む、請求項361に記載の方法。
- rAAVベクターは、AAV2 ITRを含む、請求項355〜362のいずれか1項に記載の方法。
- 組成物は、医薬組成物である、請求項272〜363のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞において標的核酸を切断するための組成物であって、該組成物は、
a)突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする第1のガイドRNAおよび第2のガイドを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムをコードする核酸と、
b)i)Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ii)第1のガイドRNAまたは第2のガイドRNAがハイブリダイズする第1のガイドRNA標的部位
を含むCas発現カセットと
を含み、
該Casタンパク質は、該Cas発現カセットから発現され、
該Casタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的DNA配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的DNAの部分を切り出し、
該Casタンパク質は、該第1のガイドRNA標的部位で該Cas発現カセットを切断し、それによって、該Cas発現カセットの切断前の該Casタンパク質の発現と比較して、該Casタンパク質の発現を低減する、前記組成物。 - 個体の核酸における突然変異と関連する疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物は、
a)突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムをコードする核酸と、
b)i)Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ii)第1のガイドRNAまたは第2のガイドRNAがハイブリダイズする第1のガイドRNA標的部位
を含むCas発現カセットと
を含み、
該Casタンパク質は、該Cas発現カセットから発現され、
該Casタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的DNA配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的DNAの部分を切り出し、
該Casタンパク質は、該第1のガイドRNA標的部位で該Cas発現カセットを切断し、それによって、該Cas発現カセットの切断前の該Casタンパク質の発現と比較して、該Casタンパク質の発現を低減する、前記組成物。 - 個体の核酸における突然変異と関連する眼の疾患または障害を治療するための組成物であって、該組成物は、
a)突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする第1のガイドRNAおよび第2のガイドRNAを含む、遺伝子操作された、天然に存在しないClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)システムをコードする核酸と、
b)i)Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および
ii)第1のガイドRNAまたは第2のガイドRNAがハイブリダイズする第1のガイドRNA標的部位
を含むCas発現カセットと
を含み、
該Casタンパク質は、該Cas発現カセットから発現され、
該Casタンパク質は、突然変異の両端に位置する標的DNA配列を切断し、それによって、突然変異を含む標的DNAの部分を切り出し、
該Casタンパク質は、該Cas発現カセットを、該第1のガイドRNA標的部位で切断し、それによって、該Cas発現カセットの切断前の該Casタンパク質の発現と比較して、該Casタンパク質の発現を低減する、前記組成物。 - Cas発現カセットは、
iii)第1のガイドRNAまたは第2のガイドRNAがハイブリダイズする第2のガイドRNA標的部位
をさらに含み、
Casタンパク質は、該Cas発現カセットを、第1および第2のガイドRNA標的部位で切断し、それによって、該Cas発現カセットの切断前の該Casタンパク質の発現と比較して、該Casタンパク質の発現を低減する、請求項365〜367のいずれか1項に記載の組成物。 - 第1のガイドRNAは、第1のガイドRNA標的部位および第2のガイドRNA標的部位とハイブリダイズする、請求項368に記載の組成物。
- 第2のガイドRNAは、第1のガイドRNA標的部位および第2のガイドRNA標的部位とハイブリダイズする、請求項368に記載の組成物。
- 第1のガイドRNAは、第1のガイドRNA標的部位とハイブリダイズし、第2のガイドRNAは、第2のガイドRNA標的部位とハイブリダイズする、請求項368に記載の組成物。
- Cas発現カセットは、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているポリアデニル化(ポリA)配列をさらに含む、請求項365〜371のいずれか1項に記載の組成物。
- ポリA配列は、SV40ポリA配列である、請求項372に記載の組成物。
- Casタンパク質による第1または第2のガイドRNA標的部位の切断は、該Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリA配列間の作動可能な連結を妨げる、請求項372または373に記載の組成物。
- 第1または第2のガイドRNA標的部位は、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリA配列の間にある、請求項372〜374のいずれか1項に記載の組成物。
- Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Cas発現カセットから発現される該Casタンパク質が、1つまたはそれ以上のNLSとインフレームで融合されるように、1つまたはそれ以上の核局在性シグナル(NLS)をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されている、請求項365〜375のいずれか1項に記載の組成物。
- 1つまたはそれ以上のNLSをコードする該ヌクレオチド配列は、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリアデニル化(ポリA)配列の間にある、請求項376に記載の組成物。
- 第1または第2のガイドRNA標的部位は、1つまたはそれ以上のNLSをコードするヌクレオチド配列およびポリA配列の間にある、請求項377に記載の組成物。
- 1つまたはそれ以上のNLSは、SV40ラージT抗原中のC末端配列を含む、請求項376〜378のいずれか1項に記載の組成物。
- 1つまたはそれ以上のNLSは、配列PKKKRKV(配列番号26)またはPKKKRKVEDPKKKRKVD(配列番号27)を含む、請求項376〜379のいずれか1項に記載の組成物。
- CRISPR−Casシステムをコードする核酸および/またはCas発現カセットは、1つまたはそれ以上の調節制御エレメントと作動可能に連結されている、請求項365〜380のいずれか1項に記載の組成物。
- Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されている、請求項381に記載の組成物。
- Casタンパク質による第1または第2のガイドRNA標的部位の切断は、調節制御エレメントおよび該Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間の作動可能な連結を妨げる、請求項381または382に記載の組成物。
- 第1または第2のガイドRNA標的部位は、プロモーターおよびCasタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間にある、請求項382または383に記載の組成物。
- Cas発現カセットは、
iii)第1のガイドRNAまたは第2のガイドRNAがハイブリダイズする第2のガイドRNA標的部位であって、Casタンパク質に特異的なプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と隣接する、前記第2のガイドRNA標的部位をさらに含み、
Casタンパク質による第1のガイドRNA標的部位の切断は、調節制御エレメントおよび該Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列の間の作動可能な連結を妨げ、
Casタンパク質による第2のガイドRNA標的部位の切断は、該Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびポリA配列の間の作動可能な連結を妨げ、
該Casタンパク質の発現および標的DNA配列の切断の際に、該Casタンパク質は、該Cas発現カセットを、第1および第2のガイドRNA標的部位で切断し、それによって、該Cas発現カセットの切断前の該Casタンパク質の発現と比較して、該Casタンパク質の発現を低減する、請求項365〜384のいずれか1項に記載の組成物。 - Cas発現カセットは、
iii)第1のガイドRNAまたは第2のガイドRNAがハイブリダイズする第2のガイドRNA標的部位を
をさらに含み
第1のガイドRNA標的部位は、Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列および該Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているプロモーターの間にあり、
該第2のガイドRNA標的部位は、該Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列および該Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されているポリA配列の間にあり、
該Casタンパク質は、該Cas発現カセットを、第1および第2のガイドRNA標的部位で切断し、それによって、該Cas発現カセットの切断前の該Casタンパク質の発現と比較して、該Casタンパク質の発現を低減する、請求項365〜367のいずれか1項に記載の組成物。 - 第1のガイドRNAおよび/または第2のガイドRNAは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターと作動可能に連結されている、請求項382〜386のいずれか1項に記載の組成物。
- RNAポリメラーゼIIIプロモーターは、U6、7SKまたはH1プロモーターである、請求項387に記載の組成物。
- Casタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、RNAポリメラーゼIIプロモーターと作動可能に連結されている、請求項382〜388のいずれか1項に記載の組成物。
- RNAポリメラーゼIIプロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、CMVプロモーター(minCMVプロモーター)由来の最小プロモーター断片、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サルウイルス40(SV40)プロモーター、CK6プロモーター、トランスサイレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、LSPプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、EF1αプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン/ウサギβ−グロビンプロモーター(CAG)プロモーター、桿体オプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、βホスホジエステラーゼ(PDE)プロモーター、網膜色素変性症(RP1)プロモーターまたは光受容体間レチノイド結合タンパク質遺伝子(IRBP)プロモーターである、請求項389に記載の組成物。
- 突然変異は、深部イントロン突然変異である、請求項366〜390のいずれか1項に記載の組成物。
- 個体の核酸における深部イントロン突然変異は、無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ia型、先天性グリコシル化異常症II型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病A、遺伝性巨赤芽球性貧血1、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症II型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症I型、ニーマン・ピック病C型、眼白子症I型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、X連鎖高免疫グロブリンM血症またはX連鎖低リン酸血症と関連している、請求項391に記載の組成物。
- 個体の核酸における深部イントロン突然変異は、表1に示される深部イントロン突然変異である、請求項391または392に記載の組成物。
- 無フィブリノーゲン血症、アルポート症候群、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体劣性多発性嚢胞腎、バース症候群、βサラセミア、先天性無フィブリノーゲン血症、先天性白内障・顔貌異常・ニューロパチー症候群、先天性グリコシル化異常症Ia型、先天性グリコシル化異常症II型、嚢胞性線維症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠乏症、ファブリー病、急性骨髄性白血病を伴う家族性血小板異常症、ファンコニ貧血、ギテルマン症候群、成長ホルモン不応症、フリードライヒ運動失調症、血友病A、遺伝性巨赤芽球性貧血1、ヘルマンスキー・パドラック症候群、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、マルファン症候群、メチオニンシンターゼ欠乏症、メチルマロン酸血症、ミトコンドリア三機能タンパク質欠乏症、ムコ多糖症II型、マルチミニコア病、筋ジストロフィー、神経線維腫症I型、ニーマン・ピック病C型、眼白子症I型、オルニチンデルタアミノトランスフェラーゼ欠損症、全身性エリテマトーデスの素因、プロピオン酸血症、ラブドイド腫瘍、シュワルツ・ヤンペル症候群、スティックラー症候群、全身性エリテマトーデス、結節性硬化症、ウェルナー症候群、X連鎖高免疫グロブリンM血症またはX連鎖低リン酸血症を有する個体を治療するために使用される、請求項391〜393のいずれか1項に記載の組成物。
- 疾患または障害は、レーバー先天黒内障、視神経萎縮症、網膜色素変性症、網膜芽細胞腫、シュタルガルト病、アッシャー症候群およびX連鎖網膜色素変性症からなる群から選択される眼の疾患または障害である、請求項366〜391のいずれか1項に記載の組成物。
- 眼の疾患は、レーバー先天黒内障である、請求項395に記載の組成物。
- 深部イントロン突然変異は、表2に示される深部イントロン突然変異である、請求項391に記載の組成物。
- 個体は、哺乳動物である、請求項366〜397のいずれか1項に記載の組成物。
- 哺乳動物は、ヒトである、請求項398に記載の組成物。
- 個体の眼に投与される、請求項367〜399のいずれか1項に記載の組成物。
- 投与は、網膜下または硝子体内である、請求項400に記載の組成物。
- 第1および第2のガイドRNAは、中心体タンパク質290kDa(CEP290)遺伝子の深部イントロン突然変異の両端に位置する標的DNA配列の逆鎖とハイブリダイズする、請求項367〜401のいずれか1項に記載の組成物。
- 深部イントロン突然変異は、c.2991+1655A>G突然変異である、請求項402に記載の組成物。
- 第1のガイドRNAは、配列番号41、配列番号45、配列番号46または配列番号47の配列を含むDNAによってコードされる、請求項367〜403のいずれか1項に記載の組成物。
- 第1のガイドRNAは、配列番号19、配列番号50、配列番号51または配列番号52の配列を含むDNAによってコードされる、請求項367〜403のいずれか1項に記載の組成物。
- 第2のガイドRNAは、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号48または配列番号49の配列を含むDNAによってコードされる、請求項367〜405のいずれか1項に記載の組成物。
- 第2のガイドRNAは、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号53または配列番号54の配列を含むDNAによってコードされる、請求項367〜406のいずれか1項に記載の組成物。
- CEP290は、ヒトCEP290である、請求項402〜407のいずれか1項に記載の組成物。
- CEP290は、配列番号23に示される配列の深部イントロン突然変異を含む、請求項402〜408のいずれか1項に記載の組成物。
- 深部イントロン突然変異は、核酸の5’スプライス供与部位の約1〜10,000ヌクレオチド、約1〜1000ヌクレオチドまたは約100〜1000ヌクレオチド下流に位置する、請求項391〜409のいずれか1項に記載の組成物。
- 深部イントロン突然変異は、核酸の3’スプライス受容部位の約1〜10,000ヌクレオチド、約1〜1000ヌクレオチドまたは約100〜1000ヌクレオチド上流に位置する、請求項391〜410のいずれか1項に記載の組成物。
- 深部イントロン突然変異は、核酸中にスプライス供与部位またはスプライス受容部位を導入する、請求項365〜411のいずれか1項に記載の組成物。
- Casタンパク質は、Cas9タンパク質である、請求項365〜412のいずれか1項に記載の組成物。
- Cas9タンパク質は、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9タンパク質、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)Cas9タンパク質、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)Cas9タンパク質またはトレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)Cas9タンパク質である、請求項413に記載の組成物。
- Cas9は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項413または414に記載の組成物。
- 真核細胞は、哺乳動物細胞である、請求項415に記載の組成物。
- 真核細胞は、ヒト細胞である、請求項415または416に記載の組成物。
- 第1のガイドRNAおよび/または第2のガイドRNAは、トランス活性化cr(tracr)配列と融合されている、請求項365〜417のいずれか1項に記載の組成物。
- tracr配列は、配列番号25によってコードされるヌクレオチド配列を含む、請求項418に記載の組成物。
- 第1のガイドRNA、第2のガイドRNAおよびCasタンパク質は、真核細胞において発現される、請求項365〜419のいずれか1項に記載の組成物。
- CRISPR−CASシステムは、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項365〜420のいずれか1項に記載の組成物。
- CRISPR−Casシステムをコードする核酸およびCas発現カセットは、同一または異なるベクター上に位置する、請求項365〜421のいずれか1項に記載の組成物。
- ベクターは、プラスミドである、請求項422に記載の組成物。
- ベクターは、送達システムと複合体形成されている、請求項422または423に記載の組成物。
- ベクターは、脂質、リポソーム、ポリカチオンまたは核酸の細胞取り込みを増強する物質と複合体形成されている、請求項424に記載の組成物。
- ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクターまたは組換え単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターである、請求項422に記載の組成物。
- ベクターは、組換えアデノウイルスベクターである、請求項426に記載の組成物。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAdまたはブタAd3型に由来する、請求項427に記載の組成物。
- 組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型2またはアデノウイルス血清型5の変異体に由来する、請求項427または428に記載の組成物。
- ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである、請求項426に記載の組成物。
- 組換えレンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス(Mokala virus)、狂犬病ウイルス、RD114またはその変異体で偽型化されたレンチウイルスに由来する、請求項430に記載の組成物。
- ベクターは、rHSVベクターである、請求項426に記載の組成物。
- rHSVベクターは、rHSV−1またはrHSV−2に由来する、請求項432に記載の組成物。
- ベクターは、組換えAAV(rAAV)ベクターである、請求項426に記載の組成物。
- CRISPR−Casシステムをコードする核酸およびCas発現カセットは、異なるrAAVベクター上にある、請求項434に記載の組成物。
- CRISPR−Casシステムをコードする核酸および/またはCas発現カセットは、1つまたはそれ以上のAAV逆方向末端反復(ITR)配列がその両端に位置する、請求項434または435に記載の組成物。
- CRISPR−Casシステムをコードする核酸および/またはCas発現カセットは、2つのAAV ITRがその両端に位置する、請求項436に記載の組成物。
- AAV ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、ヤギAAV、ウシAAVまたはマウスAAVキャプシド血清型ITRである、請求項436または437に記載の組成物。
- AAV ITRは、AAV2 ITRである、請求項436〜438のいずれか1項に記載の組成物。
- ベクターは、自己相補的ベクターである、請求項436〜439のいずれか1項に記載の組成物。
- ベクターは、ウイルス粒子中にキャプシド封入されている、請求項426に記載の組成物。
- ウイルス粒子は、アデノウイルスベクターをキャプシド封入する組換えアデノウイルス粒子である、請求項441に記載の組成物。
- 組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2、1、5、6、19、3、11、7、14、16、21、12、18、31、8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24〜30、37、40、41、AdHu2、AdHu3、AdHu4、AdHu24、AdHu26、AdHu34、AdHu35、AdHu36、AdHu37、AdHu41、AdHu48、AdHu49、AdHu50、AdC6、AdC7、AdC69、ウシAd3型、イヌAd2型、ヒツジAdまたはブタAd3型に由来するキャプシドを含む、請求項442に記載の組成物。
- 組換えアデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型2キャプシドまたはアデノウイルス血清型5キャプシドの変異体を含む、請求項442または443に記載の組成物。
- ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをキャプシド封入する組換えレンチウイルス粒子である、請求項442に記載の組成物。
- 組換えレンチウイルス粒子は、水泡性口内炎ウイルス(VSV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、ロスリバーウイルス(RRV)、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モカラウイルス(Mokala virus)、狂犬病ウイルス、RD114またはその変異体で偽型化されたキャプシドを含む、請求項445に記載の組成物。
- ウイルス粒子は、組換えHSVベクターをキャプシド封入する組換えHSV粒子である、請求項442に記載の組成物。
- 組換えHSV粒子は、rHSV−1粒子またはrHSV−2ウイルス粒子である、請求項447に記載の組成物。
- ウイルス粒子は、組換えAAVベクターを含む組換えAAVウイルス粒子である、請求項442に記載の組成物。
- CRISPR−Casシステムをコードする核酸は、第1の組換えAAVウイルス粒子の第1のrAAVベクター上にあり、Cas発現カセットは、第2の組換えAAVウイルス粒子の第2のrAAVベクター上にある、請求項442または449に記載の組成物。
- 組換えAAVウイルス粒子は、クレードA〜Fに由来するAAV血清型キャプシドを含む、請求項449または450に記載の組成物。
- AAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2−7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、ヤギAAV、AAV1/AAV2キメラ、ウシAAVまたはマウスAAVキャプシドrAAV2/HBoV1血清型キャプシドを含む、請求項449〜451のいずれか1項に記載の組成物。
- rAAVウイルス粒子のITRおよびキャプシドは、同一AAV血清型に由来する、請求項449〜452のいずれか1項に記載の組成物。
- rAAVウイルス粒子のITRおよびキャプシドは、異なるAAV血清型に由来する、請求項449〜452のいずれか1項に記載の組成物。
- 組換えAAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9および/またはAAVrh10キャプシドを含む、請求項449〜454のいずれか1項に記載の組成物。
- AAV1、AAV2、AAV8、AAVrh8R、AAV9および/またはAAVrh10キャプシドは、チロシン突然変異またはヘパラン結合突然変異を含む、請求項455に記載の組成物。
- rAAVベクターは、AAV2 ITRを含む、請求項449〜456のいずれか1項に記載の組成物。
- 医薬組成物である、請求項365〜457のいずれか1項に記載の組成物。
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