JP2018515426A - 細菌組成物およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、細菌組成物およびその使用方法に関する。細菌組成物は、フィーカリバクテリウム属、ラクノスピラ属、ベイロネラ属またはロチア属の2種以上の細菌を含むことができる。細菌組成物は、それを必要とする対象における、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーを治療すること、または腸内微生物叢を改変すること、または胃腸管に定植させることにおいて使用され得る。
Description
本発明は、細菌組成物およびその使用方法に関する。
ぜんそくは、子供において最も蔓延している慢性疾患であり、世界中で2億3500万人の人々が罹患している1。先進国と発展途上国の間におけるぜんそくの有病率の著しい差異2は、初期の微生物の暴露を変え、免疫過敏症の発症(development)を促進する、乳児期間の食事や抗生物質の使用を含む、環境要因の影響を浮き彫りにする3。腸内微生物の変化(ディスバイオシス)の効果が免疫発達および実験的ぜんそくにおいて最も影響を与える生後の初期の「クリティカル・ウインドウ」が、マウスにおける最近の研究により暗示された4。短鎖脂肪酸(short−chain fatty acids;SCFA)を含む腸内ミクロビオームおよび腸内微生物由来化合物の変化は、ぜんそく6を含む多くの疾患5に関係付けられているものの、これらの変化がぜんそくに先行するか、およびヒトのぜんそくに関わっているか否かは不明確である。
本発明は、部分的に、細菌組成物およびその使用方法を提供する。細菌組成物は、それを必要とする対象において、腸内微生物叢を改変させ、胃腸管に定植し、または腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーもしくはアトピーを診断もしくは治療するために、制限なく使用され得る。
1つの態様において、フィーカリバクテリウム(Faecalibacterium)、ラクノスピラ(Lachnospira)、ベイロネラ(Veillonella)またはロチア(Rothia)属の2種以上の細菌を含む、有効な量の細菌組成物を対象に投与することによって、そのような治療を必要とする対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの1種または複数種を治療する方法が提供される。
別の態様において、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の2種以上の細菌を含む、有効な量の細菌組成物を対象に投与することによって、そのような治療を必要とする対象における腸内微生物叢を改変する方法が提供される。
1つの態様において、フィーカリバクテリウム(Faecalibacterium)、ラクノスピラ(Lachnospira)、ベイロネラ(Veillonella)またはロチア(Rothia)属の2種以上の細菌を含む、有効な量の細菌組成物を対象に投与することによって、そのような治療を必要とする対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの1種または複数種を治療する方法が提供される。
別の態様において、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の2種以上の細菌を含む、有効な量の細菌組成物を対象に投与することによって、そのような治療を必要とする対象における腸内微生物叢を改変する方法が提供される。
別の態様において、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の2種以上の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することによって、そのような治療を必要とする対象の胃腸管に定植する方法が提供される。
いくつかの実施形態において、対象は抗生物質療法を受けているか、受けるであろうか、または受けたかのいずれかである。
いくつかの実施形態において、対象は、ヒト胎児、ヒト乳児、または妊娠女性である。
いくつかの実施形態において、ヒト乳児は1歳未満である。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は予防的に投与される。
いくつかの実施形態において、対象は抗生物質療法を受けているか、受けるであろうか、または受けたかのいずれかである。
いくつかの実施形態において、対象は、ヒト胎児、ヒト乳児、または妊娠女性である。
いくつかの実施形態において、ヒト乳児は1歳未満である。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は予防的に投与される。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、経口または直腸投与される。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、液体懸濁液として製剤化される。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ(Faecalibacterium prausnitzii)、ラクノスピラ・マルチパラ(Lachnospira multipara)、ベイロネラ・パルブラ(Veillonella parvula)、またはロチア・ムシラギノサ(Rothia mucilaginosa)の2種以上を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の3種以上の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラ、またはロチア・ムシラギノサの3種以上を含む。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、液体懸濁液として製剤化される。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ(Faecalibacterium prausnitzii)、ラクノスピラ・マルチパラ(Lachnospira multipara)、ベイロネラ・パルブラ(Veillonella parvula)、またはロチア・ムシラギノサ(Rothia mucilaginosa)の2種以上を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の3種以上の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラ、またはロチア・ムシラギノサの3種以上を含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア属の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサを含む。
いくつかの実施形態において、本投与は、対象におけるフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の細菌の少なくとも1種または複数種の個体群の増加をもたらす。
いくつかの実施形態において、増加は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定される。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサを含む。
いくつかの実施形態において、本投与は、対象におけるフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の細菌の少なくとも1種または複数種の個体群の増加をもたらす。
いくつかの実施形態において、増加は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定される。
いくつかの実施形態において、増加は、前記対象からのサンプル中に存在する代謝産物の検出によってモニターされる。
いくつかの態様において、担体と組み合わせた、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア属の2種以上の細菌を含む細菌組成物が提供される。
いくつかの実施形態において、細菌は、それを必要とする対象において、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーを治療するため、または腸内微生物叢を改変するため、または胃腸管に定植させるために有効な量で存在する。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、それを必要とする対象における、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーの治療、または腸内微生物叢の改変、または胃腸管への定植に使用するためのものである。
いくつかの実施形態において、細菌は実質的に純粋である。
いくつかの態様において、担体と組み合わせた、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア属の2種以上の細菌を含む細菌組成物が提供される。
いくつかの実施形態において、細菌は、それを必要とする対象において、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーを治療するため、または腸内微生物叢を改変するため、または胃腸管に定植させるために有効な量で存在する。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、それを必要とする対象における、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーの治療、または腸内微生物叢の改変、または胃腸管への定植に使用するためのものである。
いくつかの実施形態において、細菌は実質的に純粋である。
いくつかの態様において、対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの発症の可能性を、前記対象からのサンプル中のフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の2種以上の細菌のレベルを決定し、前記レベルを比較対象または健康な対象と比較することによって決定する方法であって、ここで、細菌のレベルの減少は、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの発症の可能性を示す方法が提供される。
いくつかの実施形態において、本方法は、対象からのサンプル中に存在する代謝産物のレベルを決定することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、請求項18または19に記載の組成物の有効な量を、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの発症の可能性が高いと決定された対象に投与することをさらに含む。
この要約は、本発明の全ての特徴を必ずしも記載するものではない。
いくつかの実施形態において、本方法は、対象からのサンプル中に存在する代謝産物のレベルを決定することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、請求項18または19に記載の組成物の有効な量を、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの発症の可能性が高いと決定された対象に投与することをさらに含む。
この要約は、本発明の全ての特徴を必ずしも記載するものではない。
本発明は、部分的に、細菌組成物およびその使用方法を提供する。細菌組成物は、それを必要とする対象において、腸内微生物叢を改変させ、胃腸管に定植し、または腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーもしくはアトピーを診断もしくは治療するために、限定されることなく使用することができる。
細菌組成物およびその使用
本明細書に記載の細菌組成物は、ルミノコッカス科の1種または複数種の細菌、またはラクノスピラ科の1種または複数種の細菌、またはベイロネラ科の1種または複数種の細菌、またはミクロコッカス科の1種または複数種の細菌を含むことができる。
細菌組成物およびその使用
本明細書に記載の細菌組成物は、ルミノコッカス科の1種または複数種の細菌、またはラクノスピラ科の1種または複数種の細菌、またはベイロネラ科の1種または複数種の細菌、またはミクロコッカス科の1種または複数種の細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム属の1種または複数種の細菌、ラクノスピラ属の1種または複数種の細菌、ベイロネラ属の1種または複数種の細菌、またはロチア属の1種または複数種の細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の2種以上の細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の3種以上の細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア属の4種以上の細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の2種以上の細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の3種以上の細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア属の4種以上の細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の細菌の以下の組み合わせを含むことができる:フィーカリバクテリウムおよびラクノスピラ;フィーカリバクテリウムおよびベイロネラ;フィーカリバクテリウムおよびロチア;ラクノスピラおよびベイロネラ;ラクノスピラおよびロチア;ベイロネラおよびロチア;フィーカリバクテリウム、ラクノスピラおよびベイロネラ;フィーカリバクテリウム、ラクノスピラおよびロチア;フィーカリバクテリウム、ベイロネラおよびロチア;ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア;フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム属の細菌は(以前、フソバクテリウム・プラウスニッツィイ(Fusobacterium prausnitzii)、バシラス・ムコサス・アナエロビウス(Bacillus mucosus anaerobius)もしくはバクテロイデス・プラウスニッツィイ(Bacteroides praussnitzii)としても知られている)フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイまたは前記種を包含する操作的分類単位(operational taxonomic unit;OTU)を含むことができる。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム属の細菌は(以前、フソバクテリウム・プラウスニッツィイ(Fusobacterium prausnitzii)、バシラス・ムコサス・アナエロビウス(Bacillus mucosus anaerobius)もしくはバクテロイデス・プラウスニッツィイ(Bacteroides praussnitzii)としても知られている)フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイまたは前記種を包含する操作的分類単位(operational taxonomic unit;OTU)を含むことができる。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウムは、フィーカリバクテリウムsp.CAG:1138(フィーカリバクテリウムsp.MGS:1138としても知られている)、フィーカリバクテリウムsp.CAG:82(フィーカリバクテリウムsp.MGS:82としても知られている)、フィーカリバクテリウムsp.CAG:74(フィーカリバクテリウムsp.MGS:74としても知られている)、フィーカリバクテリウムsp.DJF_VR20、フィーカリバクテリウムsp.イヌ口腔分類群147(canine oral taxon 147)、またはフィーカリバクテリウムsp.MC_41を含むことができる。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイは、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイL2−6、フィーカリバクテリウムcf.プラウスニッツィイKLE1255、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイSL3/3、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイM21/2、またはフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイA2−165を含むことができる。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイは、ATCC 27766またはATCC 27768の下でアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)に寄託されたフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイであってもよい。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイは、ATCC 27766またはATCC 27768の下でアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)に寄託されたフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイであってもよい。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイATCC 27766は、ジェンバンク受入番号X85022.1(配列番号1)に明記の16S rRNA遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイは、ジェンバンク受入番号X85022.1(配列番号1)に明記の16S rRNA遺伝子に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する16S rRNA遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイATCC 27768は、ジェンバンク受入番号AJ413954.1(配列番号2)に明記の16S rRNA遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイは、ジェンバンク受入番号X85022.1(配列番号1)に明記の16S rRNA遺伝子に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する16S rRNA遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイATCC 27768は、ジェンバンク受入番号AJ413954.1(配列番号2)に明記の16S rRNA遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイは、ジェンバンク受入番号AJ413954.1(配列番号2)に明記の16S rRNA遺伝子に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する16S rRNA遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ属の細菌は、(以前にラクノスピラ・マルチパリス(Lachnospira multiparis)としても知られている)ラクノスピラ・マルチパラもしくはラクノスピラ・ペクチノシザ(Lachnospira pectinoschiza)または前記種を包含する操作的分類単位(OTU)を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・マルチパラは、ラクノスピラ・マルチパラD32、ラクノスピラ・マルチパラLB2003、ラクノスピラ・マルチパラMC2003、またはラクノスピラ・マルチパラDSM−3073であってもよい。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・マルチパラは、ATCC 19207またはDSM−3073の下でATCCに寄託されたラクノスピラ・マルチパラであってもよい。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ属の細菌は、(以前にラクノスピラ・マルチパリス(Lachnospira multiparis)としても知られている)ラクノスピラ・マルチパラもしくはラクノスピラ・ペクチノシザ(Lachnospira pectinoschiza)または前記種を包含する操作的分類単位(OTU)を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・マルチパラは、ラクノスピラ・マルチパラD32、ラクノスピラ・マルチパラLB2003、ラクノスピラ・マルチパラMC2003、またはラクノスピラ・マルチパラDSM−3073であってもよい。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・マルチパラは、ATCC 19207またはDSM−3073の下でATCCに寄託されたラクノスピラ・マルチパラであってもよい。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・マルチパラDSM−3073は、ジェンバンク受入番号FR733699.1(配列番号3)に明記の16S rRNA遺伝子、型株DSM3073Tを含むことができる。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・マルチパラは、ジェンバンク受入番号FR733699.1(配列番号3)に明記の16S rRNA遺伝子に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する16S rRNA遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・ペクチノシザは、ラクノスピラ・ペクチノシザ、菌株150−1であってもよい。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・ペクチノシザは、ATCC 49827の下でATCCに寄託されたラクノスピラ・ペクチノシザであってもよい。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・マルチパラは、ジェンバンク受入番号FR733699.1(配列番号3)に明記の16S rRNA遺伝子に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する16S rRNA遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・ペクチノシザは、ラクノスピラ・ペクチノシザ、菌株150−1であってもよい。
いくつかの実施形態において、ラクノスピラ・ペクチノシザは、ATCC 49827の下でATCCに寄託されたラクノスピラ・ペクチノシザであってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ属の細菌はベイロネラ・パルブラ、ベイロネラ・アチピカ(Veillonella atypica)、ベイロネラ・パルブラ・パルブラ(Veillonella parvula parvula)、ベイロネラ・ディスパー(Veillonella dispar)、ベイロネラ・ロゴサエ(Veillonella rogosae)、ベイロネラ・セミナリス(Veillonella seminalis)、ベイロネラsp.口腔分類群780 str.F0422(Veillonella sp.oral taxon 780 str.F0422)、ベイロネラ・トベツェエンシス(Veillonella tobetsuensis)、ベイロネラ・モントペリエレンシス(Veillonella montpellierensis)、ベイロネラ・マグナ(Veillonella magna)、ベイロネラsp.口腔分類群158 str.F0412(Veillonella sp.oral taxon 158 str.F0412)、ベイロネラ・ラッティ(Veillonella ratti)、ベイロネラ・クリセティ(Veillonella criceti)、または前記種を包含する操作的分類単位(OTU)を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・パルブラは、ベイロネラ・パルブラATCC 10790/DSM 2008/JCM 12972/Te3、ベイロネラ・パルブラACS−068−V−Sch12、ベイロネラ・パルブラATCC 17745、またはベイロネラ・パルブラHSIVP1であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・パルブラは、ATCC 10790の下でATCCに寄託されたベイロネラ・パルブラであってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・パルブラATCC 10790は、ジェンバンク受入番号NR_043332.1(配列番号4)に明記の16S rRNA遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・パルブラは、ATCC 10790の下でATCCに寄託されたベイロネラ・パルブラであってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・パルブラATCC 10790は、ジェンバンク受入番号NR_043332.1(配列番号4)に明記の16S rRNA遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・パルブラは、ジェンバンク受入番号NR_043332.1(配列番号4)に明記の16S rRNA遺伝子に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する16S rRNA遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・アチピカはベイロネラ・アチピカKON/ATCC 17744/DSM 20739/NCTC 11830、ベイロネラ・アチピカD15、ベイロネラ・アチピカACS−049−V−Sch6、またはベイロネラ・アチピカACS−134−V−Col7aであってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・アチピカはベイロネラ・アチピカKON/ATCC 17744/DSM 20739/NCTC 11830、ベイロネラ・アチピカD15、ベイロネラ・アチピカACS−049−V−Sch6、またはベイロネラ・アチピカACS−134−V−Col7aであってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・ディスパーは、ベイロネラ・ディスパーATCC 17748またはベイロネラ・ディスパーDORA_11であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・ロゴサエは、ベイロネラ・ロゴサエCCUG 54233/DSM 18960/JCM 15642/ベイロネラsp.NVG 05cf.であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・セミナリスは、(ベイロネラ・ラッティACS−216−V−Col6bとしても知られている)ベイロネラ・セミナリスACS−216−V−Col6b、またはベイロネラ・セミナリスCIP 107810/MG 28162/ベイロネラsp.ADV 4313.2/ベイロネラsp.VA109であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・ロゴサエは、ベイロネラ・ロゴサエCCUG 54233/DSM 18960/JCM 15642/ベイロネラsp.NVG 05cf.であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・セミナリスは、(ベイロネラ・ラッティACS−216−V−Col6bとしても知られている)ベイロネラ・セミナリスACS−216−V−Col6b、またはベイロネラ・セミナリスCIP 107810/MG 28162/ベイロネラsp.ADV 4313.2/ベイロネラsp.VA109であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・トベツェエンシスは、ベイロネラ・トベツェエンシスATCC BAA−2400/JCM 17976/ベイロネラsp.A16/ベイロネラsp.B4/ベイロネラsp.IM−2011/ベイロネラsp.JCM 17976/菌株ベイロネラsp.Y6/B16であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・モントペリエレンシスは、ベイロネラ・モントペリエレンシスCCUG 48299/CIP 107992/DSM 17217/ベイロネラsp.2001−112662/ベイロネラsp.ADV 2216.03/ベイロネラsp.ADV 281.99/ベイロネラsp.ADV 3198.03/菌株ADV 281.99、またはベイロネラ・モントペリエレンシスDNF00314であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・モントペリエレンシスは、ベイロネラ・モントペリエレンシスCCUG 48299/CIP 107992/DSM 17217/ベイロネラsp.2001−112662/ベイロネラsp.ADV 2216.03/ベイロネラsp.ADV 281.99/ベイロネラsp.ADV 3198.03/菌株ADV 281.99、またはベイロネラ・モントペリエレンシスDNF00314であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・マグナは、ベイロネラ・マグナDSM 19857(ベイロネラ・マグナlac18としても知られている)であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・ラッティは、ベイロネラ・ラッティATCC 17746/DSM 20736/JCM 6512/NCTC 12019であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・クリセティは、ベイロネラ・クリセティATCC 17747/DSM 20734/JCM 6511/NCTC 12020であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・ラッティは、ベイロネラ・ラッティATCC 17746/DSM 20736/JCM 6512/NCTC 12019であってもよい。
いくつかの実施形態において、ベイロネラ・クリセティは、ベイロネラ・クリセティATCC 17747/DSM 20734/JCM 6511/NCTC 12020であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア属の細菌は、ロチア・ムシラギノサ(以前、ストマトコッカス・ムシラギノサス(Stomatococcus mucilaginosus)またはマイクロコッカス・ムシラギノス(Micrococcus mucilaginous)として知られている)、ロチア・デントカリオサ(Rothia dentocariosa)、ロチア・アエリア(Rothia aeria)、ロチア・ナシムリウム(Rothia nasimurium)、ロチア・マリナ(Rothia marina)、ロチア・テラエ(Rothia terrae)、ロチア・エンドフィチカ(Rothia endophytica)、ロチア・アマラエ(Rothia amarae)、ロチア・アルフィジアエ(Rothia arfidiae)、ロチアsp.CCUG 25688(Rothia sp.CCUG 25688)、ロチアsp.ChDC B201(Rothia sp.ChDC B201)、ロチアsp.口腔クローンBP1−65(Rothia sp.oral clone BP1−65)、または前記種を包含する操作的分類単位(OTU)を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ロチア・ムシラギノサはロチア・ムシラギノサ(菌株DY−18)、ロチア・ムシラギノサATCC 25296/CCM 2417/CCUG 20962/CIP 71.14、ロチア・ムシラギノサM508、ロチア・ムシラギノサCC87LB、ロチア・ムシラギノサM1710であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・ムシラギノサは、ATCC 49040またはATCC 25296の下でATCCに寄託されたロチア・ムシラギノサであってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・ムシラギノサはロチア・ムシラギノサ(菌株DY−18)、ロチア・ムシラギノサATCC 25296/CCM 2417/CCUG 20962/CIP 71.14、ロチア・ムシラギノサM508、ロチア・ムシラギノサCC87LB、ロチア・ムシラギノサM1710であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・ムシラギノサは、ATCC 49040またはATCC 25296の下でATCCに寄託されたロチア・ムシラギノサであってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・ムシラギノサATCC49040は、ジェンバンク受入番号NR_044873.1(配列番号5)に明記の16S rRNA遺伝子、型株DSM20746を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ロチア・ムシラギノサATCC 49040は、ジェンバンク受入番号NR_044873.1(配列番号5)に明記の16S rRNA遺伝子に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する16S rRNA遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ロチア・デントカリオサは、ロチア・デントカリオサ(菌株ATCC 17931/CDC X599/XDIA)、ロチア・デントカリオサM567であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・ムシラギノサATCC 49040は、ジェンバンク受入番号NR_044873.1(配列番号5)に明記の16S rRNA遺伝子に対して少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する16S rRNA遺伝子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ロチア・デントカリオサは、ロチア・デントカリオサ(菌株ATCC 17931/CDC X599/XDIA)、ロチア・デントカリオサM567であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・アエリアは、ロチア・アエリアF0474、ロチア・アエリアF0184(ロチアsp.口腔分類群188 str.F0184としても知られている)、ロチア・アエリアDSM 14556/GTC 867/JCM 11412/ロチア・アエリウス(Rothia aerius)/菌株A1−17Bであってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・ナシムリウムは、ロチア・ナシムリウムCCUG 35957/CIP 106912/JCM 10909/ロチアsp.M7SW7a/ロチア様sp.CCUG 35957であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・マリナは、ロチア・マリナDSM 21080/KCTC 19432/ロチアsp.G7/ロチアsp.JSM 078151/菌株JSM 078151であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・ナシムリウムは、ロチア・ナシムリウムCCUG 35957/CIP 106912/JCM 10909/ロチアsp.M7SW7a/ロチア様sp.CCUG 35957であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・マリナは、ロチア・マリナDSM 21080/KCTC 19432/ロチアsp.G7/ロチアsp.JSM 078151/菌株JSM 078151であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・テラエは、ロチア・テラエBCRC 17588/JCM 15158/LMG 23708/ロチアsp.L−143/菌株L−143であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・エンドフィチカは、ロチア・エンドフィチカDSM 26247/JCM 18541/ロチアsp.YIM 67072/YIM 67072であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・アマラエは、ロチア・アマラエAS 4.1721/CCUG 47294/JCM 11375/コクリア(Kocuria)sp.j−18/菌株J18であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・エンドフィチカは、ロチア・エンドフィチカDSM 26247/JCM 18541/ロチアsp.YIM 67072/YIM 67072であってもよい。
いくつかの実施形態において、ロチア・アマラエは、ロチア・アマラエAS 4.1721/CCUG 47294/JCM 11375/コクリア(Kocuria)sp.j−18/菌株J18であってもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、以下のフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラ、またはロチア・ムシラギノサの組み合わせを含むことができる:フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイおよびラクノスピラ・マルチパラ;フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイおよびベイロネラ・パルブラ;フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイおよびロチア・ムシラギノサ;ラクノスピラ・マルチパラおよびベイロネラ・パルブラ;ラクノスピラ・マルチパラおよびロチア・ムシラギノサ;ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサ;フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラおよびベイロネラ・パルブラ;フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラおよびロチア・ムシラギノサ;フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサ;ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサ;フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサ。
「操作的分類単位」または「OTU」は、本明細書中に記載されているか、または当該技術分野で公知の技術を使用して、同一であるかまたは異なるものであるOTU内の微生物の分類を意味する。OTUは、系統樹の末端葉を指し、核酸配列、例えば全ゲノム、または特定の遺伝子配列、および種のレベルでこの核酸配列に対し配列同一性を共有する全ての配列によって定義される。いくつかの実施形態において、特定の遺伝子配列は、細菌の16S rRNA配列、または16S rRNA配列の一部であってよい。他の実施形態において、2つの生物の全ゲノムを配列決定し、比較することができる。別の実施形態において、多座位配列タグ(multilocus sequence tags;MLST)のような領域、特定の遺伝子、または遺伝子のセットの選択領域を遺伝的に比較することができる。16S rRNAの実施形態において、16S rRNA全体または16S rRNAのいくつかの可変領域にわたって>97%の平均ヌクレオチド同一性を共有するOTUは、同じOTUとみなされる31-32。完全ゲノムを含む実施形態において、>95%の平均ヌクレオチド同一性を共有するMLST、特定遺伝子または遺伝子のセットOTUは、同じOTUとみなされる32-33。いくつかの場合、OTUは生物間の配列を比較することによって定義される。一般に、95%未満の配列同一性を有する配列は、同じOTUの一部を形成するとはみなされない。また、OTUは、ヌクレオチドマーカーの任意の組み合わせまたは遺伝子、特に高度に保存された遺伝子(例えば、「ハウスキーピング」遺伝子)、またはそれらの組み合わせによって特徴付けられてもよい。そのような特徴付けは、例えば、WGSデータまたは全ゲノム配列を用いる。「16S配列決定」または「16S−rRNA」または「16S」は、16SリボソームRNA遺伝子を含むヌクレオチドを特徴付けることによって由来する配列を指す。細菌16S rDNAは、およそ1500ヌクレオチドの長さであり、系統学的アプローチを用いて、1つの細菌分離株の他に対する進化的関係および配列類似性を再構築することに使用される。16S配列は、それらが一般的に高度に保存されているように、系統学的な再構築のために使用されるが、真菌と同様にほとんどの細菌の属および種を区別するのに十分なヌクレオチド多様性を抱える特異的超可変領域を含む。いくつかの実施形態において、OTUsはCrunchClust29を使用して決定し、グリーンジーンズ・データベース(Greengenes Database)30に対して97%の類似性によって分類することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、配列番号1から5までの1つまたは複数に明記の配列と実質的に同一の16S rRNA遺伝子配列を含む細菌を含むことができる。「実質的に同一」とは、本明細書中で議論されるように、1つまたは複数の保存的置換のみによって、または核酸分子の生物学的機能を破壊しない配列の位置に位置する1つまたは複数の非保存的置換、欠失、または挿入によって、参照配列とは異なる核酸配列を意味する。そのような配列は、例えば、FASTAを使用した比較について、使用される配列とヌクレオチドレベルで最適に整列された場合に、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%または95%以上、またはより一般的には少なくとも95%、96%、97%、98%、99%または100%同一である。核酸分子については、比較配列の長さは、少なくとも5、10、15、20または25ヌクレオチド、または少なくとも30、40または50ヌクレオチドであってもよい。別の実施形態において、比較配列の長さは、少なくとも60、70、80または90ヌクレオチド、または100、200、または500ヌクレオチド以上であり得る。配列同一性は、公的に利用可能な配列解析ソフトウェアを用いて容易に測定することができる(例えば、the Genetics Computer Groupの配列解析ソフトウェアパッケージ(Sequence Analysis Software Package)、University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wis.53705、または国立医学図書館(the National Library of Medicine)から入手可能なBLASTソフトウェア、または本明細書に記載のもの)。このようなソフトウェアは、相同性の程度を様々な置換、欠失、置換および他の修飾に割り当てることにより、類似の配列を整合させる。
あるいは、または付加的には、2つの核酸配列は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする場合に、「実質的に同一」であり得る。いくつかの実施形態において、高ストリンジェンシー条件は、例えば、65℃の温度における0.5M NaHPO4、pH 7.2、7%SDS、1mM EDTA、および1%BSA(画分V)を含む緩衝液中であるかまたは、42℃の温度における48%ホルムアミド、4.8x SSC、0.2M Tris−Cl、pH 7.6、1xデンハート溶液、10%硫酸デキストラン、および0.1%SDS中で、少なくとも500ヌクレオチド長のDNAプローブを用いて起こるハイブリダイゼーションに匹敵するハイブリダイゼーションを可能にする条件である。(これらは、高ストリンジェンシーのノーザンハイブリダイゼーションまたはサザンハイブリダイゼーションの典型的な条件である。ハイブリダイゼーションは、約20〜30分、または約2〜6時間、または約10〜15時間、または24時間以上にわたって実施してもよい。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはまた、高ストリンジェンシーPCR、DNAシークエンシング、一本鎖高次構造多型解析、およびイン・サイツハイブリダイゼーションのような、分子生物学者によって日常的に行われる多くの技術の成功にも依存する。ノーザンおよびサザンハイブリダイゼーションとは対照的に、これらの技術は、通常、比較的短いプローブ(例えば、通常、PCRまたは配列決定のためには約16ヌクレオチドまたはそれ以上、およびイン・サイツハイブリダイゼーションのためには約40ヌクレオチド以上)で行われる。これらの技術において使用される高ストリンジェンシー条件は、分子生物学の当業者に周知であり、それらの例は、例えば、Ausubelらの文献において見出される34。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、健康なドナーまたは個体からの処理された糞便物質中に存在する、本明細書に記載の細菌を含むことができる。そのような細菌組成物は、糞便物質を得た後に個体群の複製をもたらすか、またはもたらすように意図される任意の培養または他のプロセスに起因するものではない、「直接的に単離された」ものであってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌は、細菌胞子を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、ヒト細菌株を含むことができる。別の実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、ヒトにおいて一般的に見出されない細菌株を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、ヒト細菌株を含むことができる。別の実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、ヒトにおいて一般的に見出されない細菌株を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、細菌組成物を受ける対象の腸に定着することができる細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、生きている細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよび/またはロチア属の実質的に純粋な細菌を含むことができる。「実質的に純粋」または「単離された」とは、例えば、糞便または腸内で、自然に付随する成分から分離されるフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよび/またはロチア属の細菌を意味する。典型的には、本明細書に記載の細菌組成物は、それがサンプル中の全物質の少なくとも50質量%、60質量%、70質量%、75質量%、80質量%、または85質量%、または90質量%以上、95質量%、または99質量%である場合に、実質的に純粋である。本明細書に記載の実質的に純粋な細菌組成物は、例えば、健康な個体からの糞便物質などの天然源から、または細菌培養物、例えば、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラ、および/またはロチア・ムシラギノサなどの、本明細書に記載の細菌のいずれかの培養物からの抽出によって、得ることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、生きている細菌を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよび/またはロチア属の実質的に純粋な細菌を含むことができる。「実質的に純粋」または「単離された」とは、例えば、糞便または腸内で、自然に付随する成分から分離されるフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよび/またはロチア属の細菌を意味する。典型的には、本明細書に記載の細菌組成物は、それがサンプル中の全物質の少なくとも50質量%、60質量%、70質量%、75質量%、80質量%、または85質量%、または90質量%以上、95質量%、または99質量%である場合に、実質的に純粋である。本明細書に記載の実質的に純粋な細菌組成物は、例えば、健康な個体からの糞便物質などの天然源から、または細菌培養物、例えば、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラ、および/またはロチア・ムシラギノサなどの、本明細書に記載の細菌のいずれかの培養物からの抽出によって、得ることができる。
本明細書に記載の細菌組成物は、それを必要とする対象において、腸内微生物叢を改変するため、胃腸管に定植するため、または腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーもしくはアトピーを診断または治療するために使用され得る。いくつかの実施形態において、腸内ディスバイオシスを治療することは、対象におけるぜんそく、アレルギーまたはアトピーの予防をもたらし得る。
ぜんそくという用語は、変動性および再発性の症状、可逆的気流閉塞および気管支けいれんを特徴とする気道の一般的な慢性炎症性疾患を指す。一般的な症状には、喘鳴、咳、胸部圧迫、息切れなどがある。
ぜんそくという用語は、変動性および再発性の症状、可逆的気流閉塞および気管支けいれんを特徴とする気道の一般的な慢性炎症性疾患を指す。一般的な症状には、喘鳴、咳、胸部圧迫、息切れなどがある。
ディスバイオシス(dysbiosis)という用語は、体または体内の微生物の不均衡を指し、最も一般的には、消化管または腸における状態を指す。微生物叢またはミクロビオームの健全な(例えば、理想的な)状態からの任意の崩壊は、たとえそのようなディスバイオシスが検出可能な健康の低下をもたらさないとしても、ディスバイオシスとみなすことができる。ディスバイオシスの状態は不健康であるかもしれず、それは単に特定の条件の下において不健康であるかもしれず、またはそれは対象がより健康になることを妨げるかもしれない。ディスバイオシスは、例えば多様性の減少によるものかもしれない。それは、炎症性腸疾患、大腸炎、慢性疲労症候群、肥満、癌およびぜんそくなどの病気に関連してきている。
アトピーという用語は、アレルゲン、例えば、環境アレルゲン、に対する過敏反応に対する遺伝的素因を指す。アトピーには、アトピー性皮膚炎(湿疹)、アレルギー性鼻炎(花粉症)、アレルギー性ぜんそくならびに食物アレルギー、アレルギー性結膜炎および好酸球性食道炎などのアトピーに関連する疾患が含まれるが、これらに限定されない。
アレルギーという用語は、アレルゲンに対する異常な免疫反応を指す。
「胃腸管に定植する」とは、微生物叢またはミクロビオームの健康的な状態を対象において確立することを意味する。いくつかの実施形態において、胃腸管に定植することは、対象の胃腸管における特定の細菌のレベルを増加または減少させることを含む。いくつかの実施形態において、胃腸管に定植することは、対象の胃腸管において本明細書に記載の細菌のレベルを増加させることを含む。
アレルギーという用語は、アレルゲンに対する異常な免疫反応を指す。
「胃腸管に定植する」とは、微生物叢またはミクロビオームの健康的な状態を対象において確立することを意味する。いくつかの実施形態において、胃腸管に定植することは、対象の胃腸管における特定の細菌のレベルを増加または減少させることを含む。いくつかの実施形態において、胃腸管に定植することは、対象の胃腸管において本明細書に記載の細菌のレベルを増加させることを含む。
「腸内微生物叢を改変する」とは、対象における微生物叢またはミクロビオームの増加または減少のいずれかの変化を意味する。いくつかの実施形態において、腸内微生物叢を改変することは、対象の胃腸管などの特定の細菌のレベルを増加または減少させることを含む。いくつかの実施形態において、腸内微生物叢を改変することは、対象の胃腸管において本明細書に記載の細菌のレベルを増加させることを含む。
「増加する」、「増加させる」、「減少する」または「減少させる」とは、対象の胃腸管における特定の細菌のレベルの変化を意味する。増加または減少は、対照と比較した場合に、10%と100%との間の変化、または30%と60%との間の任意の値の変化、または100%を超える変化、例えば、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%もしくはそれ以上の変化を含むことができる。いくつかの実施形態において、増加または減少は、対照と比較した場合に、約1倍、2倍、5倍、10倍、100倍またはそれ以上の変化であってもよい。
「微生物叢」は、真核生物、古細菌、細菌およびウイルス(ファージなどの細菌ウイルスを含む)を含む動物対象、典型的にはヒトなどの哺乳動物の体内および身体の上に(持続的または一時的に)発生する微生物の群集を指す。「ミクロビオーム」とは、真核生物、古細菌、細菌、およびウイルス(ファージなどの細菌ウイルスを含む)を含む、持続的かつ一時的にヒトの体内および身体の上に生息する微生物の群集の遺伝的内容を指し、ここで「遺伝的内容」には、ゲノムDNA、RNA、例えばリボソームRNA、エピゲノム、プラスミド、および他のタイプの遺伝情報が含まれる。
「増加する」、「増加させる」、「減少する」または「減少させる」とは、対象の胃腸管における特定の細菌のレベルの変化を意味する。増加または減少は、対照と比較した場合に、10%と100%との間の変化、または30%と60%との間の任意の値の変化、または100%を超える変化、例えば、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%もしくはそれ以上の変化を含むことができる。いくつかの実施形態において、増加または減少は、対照と比較した場合に、約1倍、2倍、5倍、10倍、100倍またはそれ以上の変化であってもよい。
「微生物叢」は、真核生物、古細菌、細菌およびウイルス(ファージなどの細菌ウイルスを含む)を含む動物対象、典型的にはヒトなどの哺乳動物の体内および身体の上に(持続的または一時的に)発生する微生物の群集を指す。「ミクロビオーム」とは、真核生物、古細菌、細菌、およびウイルス(ファージなどの細菌ウイルスを含む)を含む、持続的かつ一時的にヒトの体内および身体の上に生息する微生物の群集の遺伝的内容を指し、ここで「遺伝的内容」には、ゲノムDNA、RNA、例えばリボソームRNA、エピゲノム、プラスミド、および他のタイプの遺伝情報が含まれる。
用語「治療」、「治療する」または「療法」は、本明細書に記載の細菌組成物の予防的、緩和的、治療的および栄養的な投与様式を包含する。したがって、治療には、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーと診断されるかまたは、それらを有することが知られるかあるいは、腸内微生物叢の改変から恩恵を得られるとみなされた対象における1つまたは複数の症状の改善、緩和、逆転または完全な排除が含まれる。いくつかの実施形態において、治療には、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの1つまたは複数の症状の10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%以上の低減が含まれる。また、治療には、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの1つまたは複数の症状の発症の予防または遅延も含まれる。
本明細書中で使用される場合、対象は、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、サル、ヒヒまたはチンパンジーなど)、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなどの哺乳動物であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は患者である。対象は、1歳未満、または3カ月未満のヒトの乳児のような、乳児であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は、1日、10日、20日、30日、40日、50日、60日、70日、80日、90日、100日、110日、120日、130日、140日、150日、160日、170日、180日、190日、200日、210日、220日、230日、240日、250日、260日、270日、280日、290日、300日、310日、320日、330日、340日、または350日などの1日から350日の任意の年齢のヒト乳児であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は胎児であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は、妊娠女性のような女性であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は、ぜんそく、アトピー、アレルギーまたは腸内ディスバイオシスの家族歴を有する妊娠女性であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は、抗生物質療法を受けていたか、受けているか、または受けようとしているものであってよい。対象は、臨床患者、臨床試験ボランティア、実験動物などであってもよい。対象は、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーに罹患しているか、またはその危険性があると疑われるものであってもよく;腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーと診断されたものであってもよく;あるいは腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーに罹患していないことが確認された対照のための対象であってもよい。腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの診断方法およびそのような診断の臨床的描写は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、対象は、腸内微生物叢の改変によって恩恵を受けると考えられる個体であってもよい。いくつかの実施形態において、対象は、胃腸管の定植によって恩恵を受けると考えられる個体であってもよい。
医薬品および栄養組成物、用量および投与
本明細書に記載の細菌組成物は、本明細書に記載のように、担体の存在下で、対象への投与に適した形態で、単独または他の化合物もしくは組成物と組み合わせて提供することができる。対象が胎児である場合、本明細書に記載の細菌組成物は、その母親に投与されてもよい(すなわち、対象は妊娠女性であってもよい)。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、治療的、予防的、栄養的またはプロバイオティック的な組成物であってもよい。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよび/またはロチア属の細菌を含む治療的、予防的、栄養的またはプロバイオティック的な組成物であってもよい。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラおよび/またはロチア・ムシラギノサを含む治療的、予防的、栄養的またはプロバイオティック的な組成物であってもよい。
本明細書に記載の細菌組成物は、本明細書に記載のように、担体の存在下で、対象への投与に適した形態で、単独または他の化合物もしくは組成物と組み合わせて提供することができる。対象が胎児である場合、本明細書に記載の細菌組成物は、その母親に投与されてもよい(すなわち、対象は妊娠女性であってもよい)。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、治療的、予防的、栄養的またはプロバイオティック的な組成物であってもよい。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよび/またはロチア属の細菌を含む治療的、予防的、栄養的またはプロバイオティック的な組成物であってもよい。
いくつかの実施形態において、細菌組成物は、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラおよび/またはロチア・ムシラギノサを含む治療的、予防的、栄養的またはプロバイオティック的な組成物であってもよい。
望まれる場合には、本明細書に記載の細菌組成物は、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーのより伝統的および既存の療法と組み合わせることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、短時間作用性気管支拡張薬、ベータ2−アゴニスト、吸入ステロイド、長時間作用性気管支拡張薬、抗ロイコトリエン、抗IgE療法、経口コルチコステロイド、またはテオフィリンを制限なく含む、ぜんそくのための1つ以上の療法と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フェノテロール、フォルモテロール、イプラトロピウム、イソプロテレノール、オルシプレナリン、サルブタモール、サルブタモール、テルブタリン、ブデソニド、フルチカゾン、シクレソニド、ベクロメタゾンジプロピオナート、サルメテロール、モンテルカスト、ザフィルルカスト、オマリズマブ、プレドニゾロン、またはプレドニゾンの1つまたは複数と組み合わせることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、短時間作用性気管支拡張薬、ベータ2−アゴニスト、吸入ステロイド、長時間作用性気管支拡張薬、抗ロイコトリエン、抗IgE療法、経口コルチコステロイド、またはテオフィリンを制限なく含む、ぜんそくのための1つ以上の療法と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、フェノテロール、フォルモテロール、イプラトロピウム、イソプロテレノール、オルシプレナリン、サルブタモール、サルブタモール、テルブタリン、ブデソニド、フルチカゾン、シクレソニド、ベクロメタゾンジプロピオナート、サルメテロール、モンテルカスト、ザフィルルカスト、オマリズマブ、プレドニゾロン、またはプレドニゾンの1つまたは複数と組み合わせることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、抗ヒスタミン薬、うっ血除去薬、ステロイド、気管支拡張薬、肥満細胞安定化薬、またはロイコトリエン修飾薬を制限なく含む、アレルギーのための1つまたは複数の療法と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、セチリジン、シクレソニド、ケトチフェン、レボセチリジン、フルチカゾン、フロアート、エピネフリン、クレマスチン、モンテルカスト、ブデソニド、オロパタジン、カルビノキサミンマレアート、モメタゾン、フルニソリド、クロモリン・ナトリウム、トリアムシノロン、オキシメタゾリン、エピナスチン、デキサメタゾン、ロラチジン、デスロラチジン、ジフェンヒドラミン、ベクロメタゾン、アゼラスチン、ロテプレドノール・エタボナート、フェキソフェナジン、またはネオドロクロミル・ナトリウムの1つまたは複数と組み合わせることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、抗生物質での治療の前、治療の間、または治療の後に、対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌組成物は、ストレプトマイシン、アンピシリン、アモキシシリン、イミペネム、ピペラシリン/タゾバクタム、シプロフロキサシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールまたはチカルシリンを制限なく含む、1つまたは複数の抗生物質と組み合わせることができる。
本明細書におけるプロバイオティックという用語は、摂取された際に健康上の有益性をもたらす微生物の1つもしくは複数、またはその混合物を意味することを意図している。
本明細書におけるプロバイオティックという用語は、摂取された際に健康上の有益性をもたらす微生物の1つもしくは複数、またはその混合物を意味することを意図している。
細菌組成物は、慢性的にまたは断続的に提供することができる。「慢性的な」投与とは、初期の治療効果(活性)を長期間維持するために、急性モードとは反対に、連続モードで薬剤を投与することを指す。「断続的な」投与とは、中断することなく連続的に行われるのではなく、むしろ本質的に周期的である治療である。
腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーに罹患しているかまたはその前駆症状性の対象に、本明細書に記載の細菌組成物を投与するのに適した製剤または組成物を提供するために、従来の薬学的または栄養補助的プラクティスを用いることができる。任意の適切な投与経路、例えば、真皮、鼻腔内、吸入エアロゾル、局所、強制経口、直腸または経口投与を用いることができる。
細菌組成物は、様々な形態であり得る。これらの形態には、例えば、液体溶液(例えば、注射可能および注入可能な溶液)、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび坐剤などの液体、半固体および固体剤形が含まれる。好ましい形態は、部分的に、意図された投与様式および適用様式に依存する。製剤は、液体溶液もしくは懸濁液の形態であってもよく;経口投与としては、製剤は、錠剤もしくはカプセル剤の形態であってもよく:小児用経口投与としては、製剤は、液体もしくは懸濁液の形態であってもよく;または、鼻腔内製剤としては、粉末、点鼻薬、もしくはエアロゾルの形態であってもよい。製剤は徐放性製剤であってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌は、液体懸濁液のような小児用製剤として製剤化することができる。
腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーに罹患しているかまたはその前駆症状性の対象に、本明細書に記載の細菌組成物を投与するのに適した製剤または組成物を提供するために、従来の薬学的または栄養補助的プラクティスを用いることができる。任意の適切な投与経路、例えば、真皮、鼻腔内、吸入エアロゾル、局所、強制経口、直腸または経口投与を用いることができる。
細菌組成物は、様々な形態であり得る。これらの形態には、例えば、液体溶液(例えば、注射可能および注入可能な溶液)、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび坐剤などの液体、半固体および固体剤形が含まれる。好ましい形態は、部分的に、意図された投与様式および適用様式に依存する。製剤は、液体溶液もしくは懸濁液の形態であってもよく;経口投与としては、製剤は、錠剤もしくはカプセル剤の形態であってもよく:小児用経口投与としては、製剤は、液体もしくは懸濁液の形態であってもよく;または、鼻腔内製剤としては、粉末、点鼻薬、もしくはエアロゾルの形態であってもよい。製剤は徐放性製剤であってもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の細菌は、液体懸濁液のような小児用製剤として製剤化することができる。
本明細書に記載の細菌組成物は、医療用食品、栄養補助食品または健康補助食品、食用製品または飲料製品などの栄養補助食品組成物として製剤化することができ、栄養補助食品として許容される担体を含むことができる。本明細書で使用される場合、「栄養補助食品として許容される担体」とは、生理学的に適合する任意のならびに全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指し、ならびにそれらを含む。組成物は、栄養補助食品として許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含むことができる。いくつかの実施形態において、栄養補助食品として許容される担体は、小児科使用に適している。
本明細書に記載の細菌組成物は、医薬組成物として製剤化することができ、医薬的に許容される担体を含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、生理学的に適合する任意のならびに全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指し、ならびにそれらを含む。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩、を含むことができる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、小児科使用に適している。
本明細書に記載の細菌組成物は、医薬組成物として製剤化することができ、医薬的に許容される担体を含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、生理学的に適合する任意のならびに全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指し、ならびにそれらを含む。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩、を含むことができる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、小児科使用に適している。
製剤を製造するための当該分野で周知の方法は、例えば、Gennaroの文献35に見出される。非経口的投与のための製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水もしくは生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物起源の油、または水素化したナフタレンを含むことができる。化合物の放出を制御するために、生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド/グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを使用することができる。他の潜在的に有用な非経口的送達システムには、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、およびリポソームが含まれる。吸入用製剤は、賦形剤、例えばラクトースを含むことができ、または例えばポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩を含む水溶液であってもよく、または点鼻薬の形態で投与するための油性溶液であってもよいし、ゲルとしてでもよい。治療的または予防的組成物については、化合物は、障害に依存して、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーを停止または遅延させるための十分な量で対象に投与される。
本発明に記載の細菌組成物の「有効な量」には、例えば、投与後の特定の期間における対象からの、糞便サンプルのようなサンプル中のフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよび/またはロチア属の1つまたは複数の細菌の存在を検出することによって決定される適切な期間、対象の腸に定着するために十分な量が含まれる。
いくつかの実施形態において、有効な量は、治療的に有効な量または予防的に有効な量を含む。「治療的に有効な量」とは、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの治療、予防または改善のような、所望の治療結果を達成するために必要な用量および期間における有効な量のことを指す。治療的に有効な量の細菌組成物は、病状、対象の年齢、性別、および体重、ならびに細菌組成物が個体において所望の応答を誘発するための能力などの因子に応じて変化し得る。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調節することができる。また、治療的に有効な量は、治療上有益な効果が、細菌組成物の毒性または有害な効果を上回る量である。
「予防的に有効な量」とは、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの治療、予防または改善のような、所望の予防結果を達成するために必要な用量および期間における有効な量のことを指す。典型的には、予防的に有効な量が治療的に有効な量よりも下回るように、予防的用量が疾患に先んじて、またはその初期に対象において使用される。
いくつかの実施形態において、有効な量は、治療的に有効な量または予防的に有効な量を含む。「治療的に有効な量」とは、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの治療、予防または改善のような、所望の治療結果を達成するために必要な用量および期間における有効な量のことを指す。治療的に有効な量の細菌組成物は、病状、対象の年齢、性別、および体重、ならびに細菌組成物が個体において所望の応答を誘発するための能力などの因子に応じて変化し得る。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調節することができる。また、治療的に有効な量は、治療上有益な効果が、細菌組成物の毒性または有害な効果を上回る量である。
「予防的に有効な量」とは、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの治療、予防または改善のような、所望の予防結果を達成するために必要な用量および期間における有効な量のことを指す。典型的には、予防的に有効な量が治療的に有効な量よりも下回るように、予防的用量が疾患に先んじて、またはその初期に対象において使用される。
「プロバイオティック」な量とは、例えば抗生物質治療後の対象の胃腸管の正常なレベルへの定植のような所望の結果を達成するのに必要な、用量および期間について、有効な量のことを指す。典型的には、プロバイオティックな用量は、大過剰で投与され、予防的に有効な量または治療的に有効な量よりも有意に高くなり得る。
本明細書に記載の細菌組成物の治療的または予防的に有効な量、またはプロバイオティックな量、に適した範囲は、1単位用量について、少なくとも約106、107、108、109、1010、1011、1012、1013または1014個の細菌のコロニー形成単位(cfus)を制限なく含むことができる。
本明細書に記載の細菌組成物の治療的または予防的に有効な量、またはプロバイオティックな量、に適した範囲は、1単位用量について、少なくとも約106、107、108、109、1010、1011、1012、1013または1014個の細菌のコロニー形成単位(cfus)を制限なく含むことができる。
いくつかの実施形態において、栄養型または胞子形態の生きている細菌のための用量は、1用量または組成物につき、約1ugから約1000mgであってよく、例えば約0.5mgから約5mg、約1mgから約1000mg、約2mgから約200mg、約2mgから約100mg、約2mgから約50mg、約4mgから約25mg、約5mgから約20mg、約10mgから約15mg、約50mgから約200mg、約200mgから約1000mg、または約1、2、3、4、5もしくは5gを超えるような;あるいは、1用量または組成物につき、0.001mgから1mg、0.5mgから5mg、1mgから1000mg、2mgから200mg、または2mgから100mg、または2mgから50mg、または4mgから25mg、または5mgから20mg、または10mgから15mg、または50mgから200mg、または200mgから1000mg、または1、2、3、4、5、もしくは5gを超えるようであることができる。
用量の値は、緩和すべき状態の重症度によって変化し得ることに留意されたい。任意の特定の対象について、個人的な必要性および組成物の投与を管理または監督する者の専門的判断に従って、特定の用量レジメンを長い期間をかけて調整することができる。本明細書に明記されている用量範囲は、例示的なものに過ぎず、医療従事者によって選択され得る用量範囲を限定するものではない。組成物中の活性化合物の量は、疾患状態、年齢、性別、および個人の体重などの因子によって変化し得る。したがって、いくつかの実施形態において、適切な用量には、妊娠女性への投与に適した小児用量または用量が含まれる。いくつかの実施形態において、適切な用量には、プロバイオティック用量、例えば小児プロバイオティック用量が含まれる。用量レジメンは、最適な所望の応答を提供するように調節されてもよい。例えば、単一のボーラスを投与することができ、いくつかの分割用量を長い期間にわたって投与することができ、または状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少または増加させることができる。投与の簡便性および用量の均一性のために、用量単位形態で非経口組成物を製剤化することが有利であり得る。
細菌組成物は、毎日またはより頻繁に、例えば、1日2回以上、投与されてもよい。
細菌組成物は、食物または飲料の摂取の前、間または後に投与されてもよい。
検出方法
また、対象におけるフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の一つまたは複数の細菌のレベルを決定し、その決定されたレベルを、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーと診断されていない個体のような、参照個体または健常個体に対して比較することにより、対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの発症の可能性を決定する方法であって、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の一つまたは複数の細菌のレベルの低減または減少が、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの発症の可能性の増加を示す方法が、本明細書において提供される。一般的に、対象と参照個体または健康な個体との間の統計的に有意な差異は、対象が腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、対象と参照個体または健康な個体との間の対数スケールでの1または2の差は、対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの発症の可能性を示し得る。
細菌組成物は、食物または飲料の摂取の前、間または後に投与されてもよい。
検出方法
また、対象におけるフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の一つまたは複数の細菌のレベルを決定し、その決定されたレベルを、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーと診断されていない個体のような、参照個体または健常個体に対して比較することにより、対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの発症の可能性を決定する方法であって、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の一つまたは複数の細菌のレベルの低減または減少が、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの発症の可能性の増加を示す方法が、本明細書において提供される。一般的に、対象と参照個体または健康な個体との間の統計的に有意な差異は、対象が腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーを発症する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、対象と参照個体または健康な個体との間の対数スケールでの1または2の差は、対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの発症の可能性を示し得る。
いくつかの実施形態において、対象からのサンプル中の、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の2種以上の細菌のレベルを決定することができる。いくつかの実施形態において、対象からのサンプル中の、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の3種以上の細菌のレベルを決定することができる。いくつかの実施形態において、対象からのサンプル中の、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア属の細菌のレベルを決定することができる。
いくつかの実施形態において、対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの発症の可能性を決定することには、糞便アセテート、尿中ウロビリノーゲンまたは脱共役した胆汁酸のような胆汁酸のような1つまたは複数の代謝産物のレベルを決定することが含まれ、糞便アセテートのレベルの低減または減少、または尿中ウロビリノーゲンもしくは脱共役した胆汁酸のような胆汁酸の増加が、対象が腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーを発症する可能性が高いことを示す。
いくつかの実施形態において、対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの発症の可能性を決定することには、糞便アセテート、尿中ウロビリノーゲンまたは脱共役した胆汁酸のような胆汁酸のような1つまたは複数の代謝産物のレベルを決定することが含まれ、糞便アセテートのレベルの低減または減少、または尿中ウロビリノーゲンもしくは脱共役した胆汁酸のような胆汁酸の増加が、対象が腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーを発症する可能性が高いことを示す。
「決定する」または「検出する」とは、物質の存在もしくは非存在を決定すること、または本明細書に記載の1つもしくは複数の細菌、または本明細書に記載の代謝産物などの物質の量を定量することを含むことを意図する。したがって、この用語は、本明細書に記載されるか、または定性的および定量的決定のための当該技術分野で公知の材料、組成物および方法の使用を指す。増加または減少は、対照と比較した場合、10%と100%の間の任意の値の変化、または30%と60%の間の任意の値の変化、または100%を超える変化、例えば約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%以上の変化を含むことができる。いくつかの実施形態において、増加または減少は、対照と比較した場合、約1倍、2倍、5倍、10倍、100倍またはそれ以上の変化であってもよい。
腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーを発症する可能性があると決定された対象は、本明細書に記載の細菌組成物で治療されてもよい。
いくつかの実施形態において、治療の有効性は、対象からのサンプル中の、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の1つまたは複数の細菌または代謝産物のレベルを決定し、決定されたレベルを対象からの以前の決定と比較することにより、モニターされてもよい。
いくつかの実施形態において、治療の有効性は、対象からのサンプル中の、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の1つまたは複数の細菌または代謝産物のレベルを決定し、決定されたレベルを対象からの以前の決定と比較することにより、モニターされてもよい。
「サンプル」は、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーを有するか、有することが疑われるかまたは、それらに対する素因を有する哺乳動物から単離されたサンプルのような、対象から単離された任意の器官、組織、細胞、または細胞抽出物であることができる。例えば、サンプルは、患者(ヒトまたは動物)、試験対象、または実験動物から得られた血液、尿、糞便、唾液、または任意の他の試料、またはそれらの任意の抽出物を含むが、これらに限定されない。「対照」は、ベースラインの発現または活性を決定する際に使用するために得られたサンプルを含む。したがって、対照サンプルは、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーと診断されない個体などの健康な個体から得ることができる。対照には、以前に確立された標準または参照も含まれる。したがって、任意の試験またはアッセイを確立された標準と比較することができ、毎回比較のための対照サンプルを得る必要はないかもしれない。フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチアの遺伝子、ゲノム、ポリペプチド、例えばフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア16S rRNA分子のような核酸分子の存在またはレベルを検出するために、定量的PCRのような当該技術分野で公知である方法を用いて、サンプルを解析することができる。サンプルを解析して、代謝産物、例えば糞便アセテート、尿中ウロビリノーゲンまたは脱共役した胆汁酸のような胆汁酸の存在またはレベルを検出することができる。
本発明は、以下の例において、さらに説明されるであろう。
本発明は、以下の例において、さらに説明されるであろう。
物質と方法
方法
研究デザイン、皮膚プリック試験およびサンプル選択:
CHILD研究は、カナダの4つの拠点(バンクーバー、エドモントン、マニトバ、トロント)で合計3624名の妊娠母親を採用することによる妊娠から年齢5歳までの乳児を追従した、多施設長期縦断、プロスペクティブ、一般集団出生コホート研究である。CHILD研究の詳細な特徴は、以前、記載されている1。簡単に述べると、アンケートは、採用時、36週の妊娠期間、3、6、12、18、24、30カ月、および3、4、5年に施された。このようにして、環境的曝露、心理社会的ストレス、栄養および一般健康に関するデータを得た。さらに、年齢1、3、5歳で、小児ぜんそくおよびアレルギー国際研究(International Study of Asthma and Allergies in Childhood;ISAAC)2において認証されたアンケートは、親によって全ての項目が記入された。年齢1、3、5歳で、各々の子供は、アトピー性皮膚炎、鼻炎またはぜんそくの証拠が検査された。訓練を受けたスタッフは、1、3、5年で、標準化された吸入アレルゲンおよび一般的な食物アレルゲンの皮膚試験を行った。この全体コホートについては提出日に利用できなかったため、5年のデータはこの研究には含まれていなかった。ブリティッシュ・コロンビア大学/ブリティッシュ・コロンビア研究倫理委員会の児童・女性保健センターは、ヒトのサンプルに関する研究のための研究プロトコールを承認し、参加した各々の親は、インフォームドコンセントに署名した。
方法
研究デザイン、皮膚プリック試験およびサンプル選択:
CHILD研究は、カナダの4つの拠点(バンクーバー、エドモントン、マニトバ、トロント)で合計3624名の妊娠母親を採用することによる妊娠から年齢5歳までの乳児を追従した、多施設長期縦断、プロスペクティブ、一般集団出生コホート研究である。CHILD研究の詳細な特徴は、以前、記載されている1。簡単に述べると、アンケートは、採用時、36週の妊娠期間、3、6、12、18、24、30カ月、および3、4、5年に施された。このようにして、環境的曝露、心理社会的ストレス、栄養および一般健康に関するデータを得た。さらに、年齢1、3、5歳で、小児ぜんそくおよびアレルギー国際研究(International Study of Asthma and Allergies in Childhood;ISAAC)2において認証されたアンケートは、親によって全ての項目が記入された。年齢1、3、5歳で、各々の子供は、アトピー性皮膚炎、鼻炎またはぜんそくの証拠が検査された。訓練を受けたスタッフは、1、3、5年で、標準化された吸入アレルゲンおよび一般的な食物アレルゲンの皮膚試験を行った。この全体コホートについては提出日に利用できなかったため、5年のデータはこの研究には含まれていなかった。ブリティッシュ・コロンビア大学/ブリティッシュ・コロンビア研究倫理委員会の児童・女性保健センターは、ヒトのサンプルに関する研究のための研究プロトコールを承認し、参加した各々の親は、インフォームドコンセントに署名した。
包含/除外基準:
皮膚穿刺試験の結果:年齢1歳で、CHILD研究に参加した子供を10種のアレルゲンで試験した(アルテルナリア・テュニス、猫の毛、犬の上皮、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)、チャバネゴキブリ、ピーナッツ、ダイズ、卵白、および牛乳)。試験した10種類のアレルゲンのいずれかに≧2mmの膨疹を発生した場合、子供は「アトピー性」と分類された。ヒスタミンを陽性対照として使用し、グリセリンを陰性対照として使用した。ヒスタミンに対して陰性であった対象は、上記の10種類のアレルゲンの1つに対して陽性(≧2mmの膨疹を有する)が検査されない限り、このコホートに含ませなかった。対象がグリセリンに対して陽性の試験結果であった場合、グリセリンの膨疹のサイズは、任意の陽性のアレルゲン応答の膨疹のサイズから差し引かれた。
皮膚穿刺試験の結果:年齢1歳で、CHILD研究に参加した子供を10種のアレルゲンで試験した(アルテルナリア・テュニス、猫の毛、犬の上皮、ヤケヒョウヒダニ(Dermatophagoides pteronyssinus)、コナヒョウヒダニ(Dermatophagoides farinae)、チャバネゴキブリ、ピーナッツ、ダイズ、卵白、および牛乳)。試験した10種類のアレルゲンのいずれかに≧2mmの膨疹を発生した場合、子供は「アトピー性」と分類された。ヒスタミンを陽性対照として使用し、グリセリンを陰性対照として使用した。ヒスタミンに対して陰性であった対象は、上記の10種類のアレルゲンの1つに対して陽性(≧2mmの膨疹を有する)が検査されない限り、このコホートに含ませなかった。対象がグリセリンに対して陽性の試験結果であった場合、グリセリンの膨疹のサイズは、任意の陽性のアレルゲン応答の膨疹のサイズから差し引かれた。
喘鳴アンケート:生後1年の間に子供が寒さの有無にかかわらず喘鳴を起こした場合(3カ月、6カ月、12カ月の両親のアンケート回答で記録した)、その子供は喘鳴群に含ませた。CHILDの臨床医が1年間の臨床評価中に喘鳴を記録した場合もまた、子供を喘鳴群に含ませた。
生物学的サンプル:このコホートに含まれるためには、各々の子供について3カ月および1年の糞便サンプルが必要であった。対照群については、(血液サンプルのような)追加のサンプルがCHILD研究によって採取された対象を、これらのサンプルのいずれかを欠いている対象よりも選択した。
生物学的サンプル:このコホートに含まれるためには、各々の子供について3カ月および1年の糞便サンプルが必要であった。対照群については、(血液サンプルのような)追加のサンプルがCHILD研究によって採取された対象を、これらのサンプルのいずれかを欠いている対象よりも選択した。
出生時の適格基準を満たしている3542人の子供のうち、1427人の子供が、選択時のCHILD研究1年間臨床評価を完結した。不完全な皮膚穿刺試験データまたはグリセリンに対する陽性反応、またはヒスタミンおよび他の全てのアレルゲンに対する陰性反応のために、163人の対象が除外された。残りの1264人の対象を、アトピー+喘鳴(AW)(n=35)、アトピーのみ(n=150)、喘鳴のみ(n=216)、および対照(n=863)の4つの臨床表現型にグループ分けし、3カ月および1年の糞便サンプルの利用可能性について査定した(利用可能な3カ月および1年の糞便サンプルを有する子供のN数値、AW(n=25)、アトピーのみ(n=112)、喘鳴のみ(n=179)および対照(n=106))。次いで、16S DNAの調製および配列決定の後、配列結果が不十分である場合(すなわち、糞便サンプルあたり十分な配列読み取りがない場合)、研究から対象を除外した(最終N数値、AW(n=22)、アトピーのみ(n=87)、喘鳴のみ(n=136)、および対照(n=74))。
qPCR、SCFA、尿メタボロミクス、およびPICRUSt解析のサンプルのサブセットには、利用可能な全てのAWサンプルおよび20以下のランダムに選択された対照サンプルが含まれていた。選択されたサンプルの数は、ヒト乳児のこの研究において非常に限定される傾向にあった糞便または尿サンプルの利用可能性に依存した。
ぜんそく予測指標(Asthma Predictive Index;API):
我々のサンプルコホート(n=319)の対象もまた、ぜんそく予測指数3に従って分類された。陽性の厳密なAPIは、下記の基準により定義される:2歳から3歳の年齢の間の再発性喘鳴、ならびに2つのメジャー基準の1つ、または3つのマイナー基準のうちの2つ。さらに、子供が3年間の臨床評価でぜんそくと診断された場合、API基準に合致するか否かにかかわらず、陽性API群にも含ませた。
再発性喘鳴:再発性喘鳴は、2歳と3歳の年齢の間における喘鳴の≧3回の発症として定義される。2歳と3歳の年齢の間における喘鳴発症の数を定量するために、年齢24および30カ月および3歳でのアンケートを使用した。
ぜんそく予測指標(Asthma Predictive Index;API):
我々のサンプルコホート(n=319)の対象もまた、ぜんそく予測指数3に従って分類された。陽性の厳密なAPIは、下記の基準により定義される:2歳から3歳の年齢の間の再発性喘鳴、ならびに2つのメジャー基準の1つ、または3つのマイナー基準のうちの2つ。さらに、子供が3年間の臨床評価でぜんそくと診断された場合、API基準に合致するか否かにかかわらず、陽性API群にも含ませた。
再発性喘鳴:再発性喘鳴は、2歳と3歳の年齢の間における喘鳴の≧3回の発症として定義される。2歳と3歳の年齢の間における喘鳴発症の数を定量するために、年齢24および30カ月および3歳でのアンケートを使用した。
メジャー基準:ぜんそくの親の履歴(親のいずれか)または2歳から3歳までの年齢のM.D.診断による小児アトピー性皮膚炎。
マイナー基準:≧4%の好酸球増多症、2歳以降の風邪とは別の喘鳴の発症、年齢3歳時のM.D.診断によるアレルギー性鼻炎。
16S微生物群集解析
約50mgの糞便からDNAを抽出したか、または約50mgの糞便被覆スワブを全スワブから切断した。QIAGEN DNA糞便ミニキットでDNAを抽出する前に、Mo−bio乾燥ビーズチューブ(Mo Bio Laboratories、Carlsbad、CA)およびFastprepホモジナイザー(FastPrep Instrument、MP Biochemicals、Solon、OH)を用いてサンプルを機械的に溶解した。
マイナー基準:≧4%の好酸球増多症、2歳以降の風邪とは別の喘鳴の発症、年齢3歳時のM.D.診断によるアレルギー性鼻炎。
16S微生物群集解析
約50mgの糞便からDNAを抽出したか、または約50mgの糞便被覆スワブを全スワブから切断した。QIAGEN DNA糞便ミニキットでDNAを抽出する前に、Mo−bio乾燥ビーズチューブ(Mo Bio Laboratories、Carlsbad、CA)およびFastprepホモジナイザー(FastPrep Instrument、MP Biochemicals、Solon、OH)を用いてサンプルを機械的に溶解した。
以前に記載のように4、全てのサンプルは16S遺伝子(表7)のV3領域に隣接するバーコードプライマー対を用いて三重にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。
各50μLのPCR反応物は、22uLの水、25uLのTop Taq Master Mix、0.5uLの順方向および逆方向バーコードプライマー、および2μLの鋳型DNAを含んでいた。PCRプログラムは、95℃(5分)での初期DNA変性工程、25サイクルの95℃(1分)でのDNA変性、50℃(1分)でのアニール工程、および72℃(1分)での伸長工程、ならびに72℃(7分)の最終伸長工程からなる。汚染が起きていないことを確証するために、鋳型DNAを含まない対照を含めた。適切な増幅を確証するために、2%アガロースゲル上でアンプリコンを流した。約160kbのバンドを示すアンプリコンを、Illustra GX PCR DNA精製キットを用いて精製した。精製したサンプルを1:50に希釈し、PICOGreen(Invitrogen)を用いて、TECAN M200(励起480nm、発光520nm)中で定量した。
イルミナシーケンシング:
プールされたPCRアンプリコンを20ng/μLに希釈し、Hi−Seq 2000双方向イルミナシーケンシングおよびCluster Kit v4(Macrogen Inc.、ソウル、韓国)を用いて、V3超可変領域を配列決定した。ライブラリー調製は、100ngのDNAサンプル(Illumina)およびBioanalyzer DNA 1000chip(Agilent)によるQCライブラリーを用い、TruSeq DNA Sample Prep V2キットを使用して行った。
プールされたPCRアンプリコンを20ng/μLに希釈し、Hi−Seq 2000双方向イルミナシーケンシングおよびCluster Kit v4(Macrogen Inc.、ソウル、韓国)を用いて、V3超可変領域を配列決定した。ライブラリー調製は、100ngのDNAサンプル(Illumina)およびBioanalyzer DNA 1000chip(Agilent)によるQCライブラリーを用い、TruSeq DNA Sample Prep V2キットを使用して行った。
バイオインフォマティクス:
サンプルは、前処理し、ノイズを除去し、Mothur5を使用して、サイズにより品質フィルターした(quality filtered)。代表的な配列を、CrunchClust6を用いて操作的分類単位(OTU)にクラスター化し、97%の類似性に従ってGreengenes Database7に対して分類した。全てのサンプルのうち5倍未満を示すOTUが解析から除外された。
定量的ポリメラーゼ連鎖反応:
以下の属について群特異的16S rRNA遺伝子プライマーを用い、上記の16S rDNA V3アンプリコンで特定の腸内細菌属の存在量を測定した;ラクノスピラ、ベイロネラ、ロチア、フィーカリバクテリウム、およびビフィドバクテリウム属(表8)。
サンプルは、前処理し、ノイズを除去し、Mothur5を使用して、サイズにより品質フィルターした(quality filtered)。代表的な配列を、CrunchClust6を用いて操作的分類単位(OTU)にクラスター化し、97%の類似性に従ってGreengenes Database7に対して分類した。全てのサンプルのうち5倍未満を示すOTUが解析から除外された。
定量的ポリメラーゼ連鎖反応:
以下の属について群特異的16S rRNA遺伝子プライマーを用い、上記の16S rDNA V3アンプリコンで特定の腸内細菌属の存在量を測定した;ラクノスピラ、ベイロネラ、ロチア、フィーカリバクテリウム、およびビフィドバクテリウム属(表8)。
全てのAWサンプルおよび無作為に選択された同数の対照サンプルを定量的PCR(qPCR)によって解析した。全ての反応は、7500 Fast Real−Time System(Applied Biosystems、Foster City、CA)またはViiA 7 Real−Time PCR System(Life Technologies Inc.、Burlington、ON)で行った。各々の10μL反応物には、5μLのIQ SYBR緑色スーパーミックス(Bio−Rad、5μL)、0.1μLの各フォワードおよびリバースプライマー、0.8μLのヌクレアーゼフリー水、および4μLのV3アンプリコンが含まれていた。qPCRプログラムは、95℃(15分)での初期工程、94℃で15秒、60℃で30秒、および72℃で30秒の40サイクル、ならびに15秒での95℃、1分での60℃、15秒での95℃および15秒での60℃の最終サイクルからなる。プライマーのセットごとに、少なくとも2回の希釈をサンプルごとに行い、全ての希釈は重複して行った。サンプルは、参照遺伝子として全16S rDNAを用いてΔCT法に従って標準化した。
PICRUSt:
我々は、16S rRNA OTUデータから(メタゲノム予測を介して)推定機能のプロファイルを生成するためにPICRUSt8を使用した。qPCRによって解析された同じサンプルからの予測されたメタゲノムは、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)Orthologyレベル3の機能によって分類された。AWと対照サンプルの間の機能的カテゴリー存在量における有意差を試験するために、我々はSTAMPのウェルチのt検定導入を使用した9。我々はまた、DEseq210を用いて、差次的に豊富なメタゲノムについて、デフォルト設定で試験した。試験の統計のp値は、BenjaminiおよびHochberg11の手順を用いて、複数の試験について調整した(誤発見率閾値=5%)。
我々は、16S rRNA OTUデータから(メタゲノム予測を介して)推定機能のプロファイルを生成するためにPICRUSt8を使用した。qPCRによって解析された同じサンプルからの予測されたメタゲノムは、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)Orthologyレベル3の機能によって分類された。AWと対照サンプルの間の機能的カテゴリー存在量における有意差を試験するために、我々はSTAMPのウェルチのt検定導入を使用した9。我々はまた、DEseq210を用いて、差次的に豊富なメタゲノムについて、デフォルト設定で試験した。試験の統計のp値は、BenjaminiおよびHochberg11の手順を用いて、複数の試験について調整した(誤発見率閾値=5%)。
短鎖脂肪酸解析:
糞便サンプルを25%リン酸と混合し、ボルテックスし、透明な上清が得られるまで遠心分離した。上清をGC解析のために、アルバータ大学(the University of Alberta)の農業、食品および栄養学科に提出した。13のAWサンプルのみが解析として十分な物質が含まれており、この解析のために13の追加対照サンプルが無作為に選択された。サンプルを、改訂を伴い以前に記載されたように解析した12。簡単に述べると、サンプルを内部標準として4−メチル吉草酸と混合し、0.2mlをStabilwax−DA 30m×0.53mm×0.5umカラム(Restek、Bellefonte、PA)を用いたBruker Scion 456ガスクロマトグラフに注入した。内部標準と組み合わせて、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸、およびカプロン酸を含む標準溶液を毎回の施行に注入した。
PTVインジェクタおよびFID検出器の温度は、全体の施行について250℃に保持された。オーブンを80℃で開始し、直ちに210℃まで45℃/分で上昇させ、5.11分保持した。全施行時間は8.00分であった。ヘリウムを20.00ml/分の一定流量で使用した。
糞便サンプルを25%リン酸と混合し、ボルテックスし、透明な上清が得られるまで遠心分離した。上清をGC解析のために、アルバータ大学(the University of Alberta)の農業、食品および栄養学科に提出した。13のAWサンプルのみが解析として十分な物質が含まれており、この解析のために13の追加対照サンプルが無作為に選択された。サンプルを、改訂を伴い以前に記載されたように解析した12。簡単に述べると、サンプルを内部標準として4−メチル吉草酸と混合し、0.2mlをStabilwax−DA 30m×0.53mm×0.5umカラム(Restek、Bellefonte、PA)を用いたBruker Scion 456ガスクロマトグラフに注入した。内部標準と組み合わせて、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸、およびカプロン酸を含む標準溶液を毎回の施行に注入した。
PTVインジェクタおよびFID検出器の温度は、全体の施行について250℃に保持された。オーブンを80℃で開始し、直ちに210℃まで45℃/分で上昇させ、5.11分保持した。全施行時間は8.00分であった。ヘリウムを20.00ml/分の一定流量で使用した。
尿メタボロミクス:
対象1人あたり250μLの尿を、メタボロミクス解析のためにMetabolon Inc.(ダーラム、ノースカロライナ州)に提出した。qPCR解析のために選択されたサンプルのサブセットから、16−18AWおよび対照尿サンプルがメタボロミクス解析に利用可能であった。サンプル調製は、以前に記載したように行った13。簡単に述べると、品質管理プロセスのための抽出プロセスの最初の工程の前に、回収基準が追加された。メタノールで2分間激しく振盪しながら除去し(Glen Mills Genogrinder 2000)、タンパク質を沈殿させ、続いて遠心分離させた。得られた抽出液を5つの画分に分けた:超高速液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析(UPLC−MS/MS;陽イオン化)による解析のために1つ、UPLC−MS/MS(陰イオン化)による解析のために1つ、UPLC−MS/MS極性プラットフォーム(陰イオン化)による解析のために1つ、ガスクロマトグラフィー−質量分析(GC−MS)のために1つ、および1つのサンプルはバックアップのために保持された。
以下の対照を実験サンプルで解析した:Metabolon,Inc.によって広範に特徴付けられたヒト尿のプールから生成されたサンプル、および装置性能モニタリングを可能にした解析された各サンプルに添加された標準のカクテル。実験のサンプルおよび対照は、プラットフォームの実行にわたって無作為化された。
対象1人あたり250μLの尿を、メタボロミクス解析のためにMetabolon Inc.(ダーラム、ノースカロライナ州)に提出した。qPCR解析のために選択されたサンプルのサブセットから、16−18AWおよび対照尿サンプルがメタボロミクス解析に利用可能であった。サンプル調製は、以前に記載したように行った13。簡単に述べると、品質管理プロセスのための抽出プロセスの最初の工程の前に、回収基準が追加された。メタノールで2分間激しく振盪しながら除去し(Glen Mills Genogrinder 2000)、タンパク質を沈殿させ、続いて遠心分離させた。得られた抽出液を5つの画分に分けた:超高速液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析(UPLC−MS/MS;陽イオン化)による解析のために1つ、UPLC−MS/MS(陰イオン化)による解析のために1つ、UPLC−MS/MS極性プラットフォーム(陰イオン化)による解析のために1つ、ガスクロマトグラフィー−質量分析(GC−MS)のために1つ、および1つのサンプルはバックアップのために保持された。
以下の対照を実験サンプルで解析した:Metabolon,Inc.によって広範に特徴付けられたヒト尿のプールから生成されたサンプル、および装置性能モニタリングを可能にした解析された各サンプルに添加された標準のカクテル。実験のサンプルおよび対照は、プラットフォームの実行にわたって無作為化された。
質量分析法の解析
抽出物をGC−MSまたはUPLC−MS/MSのいずれかに供した。UPLC−MS/MSプラットフォームは、Waters UPLC BEH C18−2.1×100mm、1.7μmカラムを備えたWaters Acquity UPLCおよび加熱エレクトロスプレーイオン化(HESI−II)源でインターフェースしたThermo Scientific Q−Exactive高分解能/精密質量分析計および35000質量分解能で操作されたOrbitrap質量分析計を用いた。サンプル抽出物を乾燥させ、酸性または塩基性のLC適合性溶媒中で再構成し、その各々は、注入およびクロマトグラフィーの一貫性を確証するために8つ以上の注入標準を固定濃度で含ませた。酸性条件で再構成された抽出物は、0.1%ギ酸を含む水およびメタノールを用いて勾配溶出したが、水/メタノールを使用した塩基性抽出物は6.5mM重炭酸アンモニウムを含んでいた。第3のアリコートは、10mMギ酸アンモニウムを含む水およびアセトニトリルからなる勾配を用いて、HILICカラム(Waters UPLC BEH Amide 2.1x150mm、1.7μm)からの溶出後の陰イオン化を介して解析した。MS解析は、動的排除を使用してMSとデータ依存MS2スキャンとの間を交互に行い、スキャン範囲は80〜1000m/zからであった。
抽出物をGC−MSまたはUPLC−MS/MSのいずれかに供した。UPLC−MS/MSプラットフォームは、Waters UPLC BEH C18−2.1×100mm、1.7μmカラムを備えたWaters Acquity UPLCおよび加熱エレクトロスプレーイオン化(HESI−II)源でインターフェースしたThermo Scientific Q−Exactive高分解能/精密質量分析計および35000質量分解能で操作されたOrbitrap質量分析計を用いた。サンプル抽出物を乾燥させ、酸性または塩基性のLC適合性溶媒中で再構成し、その各々は、注入およびクロマトグラフィーの一貫性を確証するために8つ以上の注入標準を固定濃度で含ませた。酸性条件で再構成された抽出物は、0.1%ギ酸を含む水およびメタノールを用いて勾配溶出したが、水/メタノールを使用した塩基性抽出物は6.5mM重炭酸アンモニウムを含んでいた。第3のアリコートは、10mMギ酸アンモニウムを含む水およびアセトニトリルからなる勾配を用いて、HILICカラム(Waters UPLC BEH Amide 2.1x150mm、1.7μm)からの溶出後の陰イオン化を介して解析した。MS解析は、動的排除を使用してMSとデータ依存MS2スキャンとの間を交互に行い、スキャン範囲は80〜1000m/zからであった。
GC−MSによる解析を目的としたサンプルを、乾燥窒素下でビストリメチル−シリルトリフルオロアセトアミドを用いて誘導体化させる前に、真空乾燥下で最低18時間乾燥させた。誘導体化されたサンプルを、担体ガスとしてヘリウムを用い、17.5分の時間で60〜340℃の温度上昇にて、5%ジフェニル/95%ジメチルポリシロキサン溶融シリカカラム(20m×0.18mm ID;0.18um膜厚)で分離した。全てのサンプルを、電子衝撃イオン化(EI)を用い、単位質量分解能で操作したThermo−Finnigan Trace DSQ高速スキャニング単一四重極MSで解析した。走査範囲は50〜750m/zからであった。
化合物の同定、定量化、およびデータのキュレーション
代謝産物は、保持時間、分子量(m/z)、好ましい付加物、およびインソースフラグメント(in−source fragments)ならびに関連するMSスペクトルを含む化学標準品の参照ライブラリーに対して、実験サンプル中のイオン特徴を自動比較することによって同定され、Metabolon14で開発されたソフトウェアを使用した、品質管理のため目視検査によってキュレーションされた。既知の化学物質の同定は、精製された標準物質のメタボロームライブラリエントリとの比較に基づいている。検出可能な特徴の決定のために、商業的に入手可能な精製された標準化合物は取得され、UPLC−MS/MSおよびGC−MSの両方のプラットフォームの両方に配布のためにLIMSに登録されている。ピークは、曲線下の領域を用いて定量した。各々のサンプル中の各々の代謝産物の未加工の領域数を正規化して、各々の施行日の中央値による器具の日中の調整の差異に起因する変動を補正し、したがって、各々の施行について中央値を1.0に設定した。欠落値は、正規化後に観察された最小値に帰属させた。全ての値を各々のサンプルの浸透圧でさらに正規化した。
代謝産物は、保持時間、分子量(m/z)、好ましい付加物、およびインソースフラグメント(in−source fragments)ならびに関連するMSスペクトルを含む化学標準品の参照ライブラリーに対して、実験サンプル中のイオン特徴を自動比較することによって同定され、Metabolon14で開発されたソフトウェアを使用した、品質管理のため目視検査によってキュレーションされた。既知の化学物質の同定は、精製された標準物質のメタボロームライブラリエントリとの比較に基づいている。検出可能な特徴の決定のために、商業的に入手可能な精製された標準化合物は取得され、UPLC−MS/MSおよびGC−MSの両方のプラットフォームの両方に配布のためにLIMSに登録されている。ピークは、曲線下の領域を用いて定量した。各々のサンプル中の各々の代謝産物の未加工の領域数を正規化して、各々の施行日の中央値による器具の日中の調整の差異に起因する変動を補正し、したがって、各々の施行について中央値を1.0に設定した。欠落値は、正規化後に観察された最小値に帰属させた。全ての値を各々のサンプルの浸透圧でさらに正規化した。
実験的マウスアレルギー性ぜんそくのヒト微生物叢モデル:
細菌接種物の調製および接種:
3カ月齢で採取された1人のぜんそく小児の凍結した糞便を使用して、無菌マウスに経口接種した。糞便材料の凍結片を滅菌メスでこすり落とし、0.05%システイン−HClで還元したPBS1mlと混合して嫌気性種を保護することによって糞便スラリーを調製した。このタイプの養子移植は、ヒト微生物叢をマウスに移入することに有効であることが示されている15。サンプルをボルテックスし、3000gで遠心分離して残渣を除去した。フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ(ATCC 27766)、ベイロネラ・パルブラ(ATCC 10790)、ロチア・ムシラギノサ(ATCC 49040)とラクノスピラ・マルチパラ(DSM−3073)の固体培養物を嫌気的条件下、37℃で偏好性嫌気性菌(ファスティデアス・アナエローベ(Fastidious Anaerobe;FA))寒天上で増殖させた。各々の培養物の1コロニーを2ml液体FA培地に添加し、24時間増殖させた。糞便スラリーおよびFLVR培養液の細胞濃度を、600nmの濁度測定によって計算し、還元PBSでOD=0.3に正規化した。
細菌接種物の調製および接種:
3カ月齢で採取された1人のぜんそく小児の凍結した糞便を使用して、無菌マウスに経口接種した。糞便材料の凍結片を滅菌メスでこすり落とし、0.05%システイン−HClで還元したPBS1mlと混合して嫌気性種を保護することによって糞便スラリーを調製した。このタイプの養子移植は、ヒト微生物叢をマウスに移入することに有効であることが示されている15。サンプルをボルテックスし、3000gで遠心分離して残渣を除去した。フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ(ATCC 27766)、ベイロネラ・パルブラ(ATCC 10790)、ロチア・ムシラギノサ(ATCC 49040)とラクノスピラ・マルチパラ(DSM−3073)の固体培養物を嫌気的条件下、37℃で偏好性嫌気性菌(ファスティデアス・アナエローベ(Fastidious Anaerobe;FA))寒天上で増殖させた。各々の培養物の1コロニーを2ml液体FA培地に添加し、24時間増殖させた。糞便スラリーおよびFLVR培養液の細胞濃度を、600nmの濁度測定によって計算し、還元PBSでOD=0.3に正規化した。
4匹の雌および4匹の雄の6週齢の無菌マウス(Swiss Webster)をTaconic(Hudson、NY)から購入した。到着直後に、2匹の雌マウスおよび2匹の雄マウスを無作為に選択し、50μlの糞便スラリー(AW)で経口強制飼養し、残りのマウスには10μlのFLVR培養物と組み合わせた40μlの同じ糞便スラリーを接種した。微生物処理での経口強制飼養を、到着後3、7および14日目に繰り返した。2回目の接種後、交配のためにマウスをペアにした。実験用接種物でのF1マウスの微生物コロニー形成をさらに増加させるために、母親の腹部および乳頭領域を、出生後3日目および7日目に対応する細菌製剤で塗布した。
実験的アレルギー性ぜんそくモデル:
軽微な改訂を施して以前に記載されるように16、7〜8週齢で、各々の繁殖ペアに対して2つの引き続きの同腹仔からの全てのF1マウスにおいて、実験マウスのアレルギー性ぜんそくが誘導された。このモデルはヒトアレルギー性ぜんそくの表現型を完全に要約しているわけではないが、この肺炎症の多くの側面を評価するための有用なモデルである。動物実験におけるサンプルサイズを推定するために統計的方法は用いられなかった。合計8匹の対照、18匹のAWおよび28匹のAW+FLVRマウスを、2つの組み合わせた実験において使用した。マウスを0日目および7日目に10μgのグレードV OVAおよび1.3mgの水酸化アルミニウム(両方ともSigmaから)で腹腔内に感作させた。21日目、22日目、23日目および24日目に、PBS中に50μgのLPSを含まないOVAを、25日目および26日目に100μgのグレードV OVA(Sigma)を鼻腔内にチャレンジした。27日目に、200mg kg−1のケタミン(ketamine)および10mg kg−1のキシラジン(xylazine)でマウスを麻酔し、血液を心臓穿刺によって収集した。屠殺後、BALをPBSで1ml洗浄を、3回行った。血球計数器で細胞を計数することにより、全BALカウントを盲目的に評価した。好酸球、好中球、マクロファージおよびリンパ球を、標準的な形態学的基準に基づいてHemaStain(Fisher Scientific)で染色したサイトスピン(Thermo Shandon、Pittsburg、PA)から定量した。これらの実験で使用された全てのプロトコールは、ブリティッシュ・コロンビア大学の動物ケア委員会によって承認された。
軽微な改訂を施して以前に記載されるように16、7〜8週齢で、各々の繁殖ペアに対して2つの引き続きの同腹仔からの全てのF1マウスにおいて、実験マウスのアレルギー性ぜんそくが誘導された。このモデルはヒトアレルギー性ぜんそくの表現型を完全に要約しているわけではないが、この肺炎症の多くの側面を評価するための有用なモデルである。動物実験におけるサンプルサイズを推定するために統計的方法は用いられなかった。合計8匹の対照、18匹のAWおよび28匹のAW+FLVRマウスを、2つの組み合わせた実験において使用した。マウスを0日目および7日目に10μgのグレードV OVAおよび1.3mgの水酸化アルミニウム(両方ともSigmaから)で腹腔内に感作させた。21日目、22日目、23日目および24日目に、PBS中に50μgのLPSを含まないOVAを、25日目および26日目に100μgのグレードV OVA(Sigma)を鼻腔内にチャレンジした。27日目に、200mg kg−1のケタミン(ketamine)および10mg kg−1のキシラジン(xylazine)でマウスを麻酔し、血液を心臓穿刺によって収集した。屠殺後、BALをPBSで1ml洗浄を、3回行った。血球計数器で細胞を計数することにより、全BALカウントを盲目的に評価した。好酸球、好中球、マクロファージおよびリンパ球を、標準的な形態学的基準に基づいてHemaStain(Fisher Scientific)で染色したサイトスピン(Thermo Shandon、Pittsburg、PA)から定量した。これらの実験で使用された全てのプロトコールは、ブリティッシュ・コロンビア大学の動物ケア委員会によって承認された。
血清OVA特異的Igの決定:
血清中のOVA特異的IgE、IgG1、およびIgG2aを、酵素連結免疫吸着アッセイ(enzyme−linked immunosorbent assay;Chondrex,Redmond,WA)によって測定した。
血清中のOVA特異的IgE、IgG1、およびIgG2aを、酵素連結免疫吸着アッセイ(enzyme−linked immunosorbent assay;Chondrex,Redmond,WA)によって測定した。
組織学:
肺を収集し、10%ホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋し、長軸方向に5μmの切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した 。1つの切片につき5つの分野から炎症を盲目的に評価し、各々は下記のパラメーターについて、各々1から5の尺度で段階付けされた(1=疾病の徴候なし、5=深刻な疾病):最大スコア25について(1)気管支周囲の浸潤、(2)血管周囲浸潤、(3)実質性の浸潤、および(4)上皮損傷。
肺を収集し、10%ホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋し、長軸方向に5μmの切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した 。1つの切片につき5つの分野から炎症を盲目的に評価し、各々は下記のパラメーターについて、各々1から5の尺度で段階付けされた(1=疾病の徴候なし、5=深刻な疾病):最大スコア25について(1)気管支周囲の浸潤、(2)血管周囲浸潤、(3)実質性の浸潤、および(4)上皮損傷。
サイトカイン:
肺組織ホモジェネートを16000gで2回遠心分離し、上清を−80℃で保存した。IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、TNF、IFN−γ、およびIL−17Aのレベルは、サイトメトリックビーズアレイ(Cytometric Bead Array;CBA)アッセイTh1/Th2/Th17キット(カタログ番号560485 BD Biosciences、Ontario、Canada)を用いて決定した。IL−5、IL−9およびIL−13のレベルは、製造者の取扱説明書に従って、CBAフレックスセット(カタログ番号558302、558348および558349、BD Biosciences、Ontario、Canada)によって決定した。サイトカイン濃度は、ブラッドフォードアッセイ法(Sigma)によって計算されたタンパク質濃度に対して標準化された。IL−9およびIL−13解析は、アッセイの感度限界を超える結果をもたらさなかった。
肺組織ホモジェネートを16000gで2回遠心分離し、上清を−80℃で保存した。IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、TNF、IFN−γ、およびIL−17Aのレベルは、サイトメトリックビーズアレイ(Cytometric Bead Array;CBA)アッセイTh1/Th2/Th17キット(カタログ番号560485 BD Biosciences、Ontario、Canada)を用いて決定した。IL−5、IL−9およびIL−13のレベルは、製造者の取扱説明書に従って、CBAフレックスセット(カタログ番号558302、558348および558349、BD Biosciences、Ontario、Canada)によって決定した。サイトカイン濃度は、ブラッドフォードアッセイ法(Sigma)によって計算されたタンパク質濃度に対して標準化された。IL−9およびIL−13解析は、アッセイの感度限界を超える結果をもたらさなかった。
統計分析:
マルコフ鎖モンテカルロ(Markov Chain Monte Carlo;MCMC)サンプリング17-19に基づく正確なロジスティック回帰モデルが開発され、オッズ比(OR)が、特定の臨床データに従ってAW群と関連したリスクを評価するために使用された。ORならびに補正した下側および上側信頼区間は、それぞれ、下記の式e(ln(OR))およびe(ln(CI)に従って計算した。ln(CI)は、拡張データ表1の正確な上側および下側信頼区間に等しい。全てのデータが利用可能な対象のみがモデルに含まれた(nAW=21、n対照=74)。Phyloseq20と共にRスタジオ(R−Studio、Boston、MA)における追加のRベースのコンピュータ計算ツール21-26を使用して、糞便の微生物多様性と細菌分類群の相対存在量を評価した。MetaboAnalyst27,28を使用して、主成分解析(Principal components analysis;PCA)を行い、パーマノバ(permanova)20によって統計的に確認された。シャノン多様性指数はPhyloseq20を用いて計算し、マン−ホイットニー(GraphPad Prismソフトウェア、バージョン5c、San Diego、CA)によって統計的に確認した。Phylsoeq20の’mt’機能を使用して、3カ月目と1年目のサンプルとの間および4つの表現型:AW、アトピーのみ、喘鳴のみ、および対照、の間に差次的に大量なOTUを同定するために多重推論補正P値を計算した。対照群とAW群との差は、qPCRについてマン−ホイットニーにより決定された。全てのSCFAおよび尿代謝産物は、正常性についてのシャピローウィルク試験(Shapiro−Wilk test)に供せられ、対照群とAW群との間の差は、t検定(硫酸グリココーレナートおよびグリコヒヨコラート;glycocholenate sulfate and glycohyocholate)またはマンホイットニーウィルコクソンによって決定された。ヒトのサンプルは統計的試験から除外しなかった。ヒトのサンプルを用いた解析では、F検定は群の変動間に有意差がないことがわかった。マウス実験におけるAW、AW+FLVRおよびナイーブ群の間の差を、BALカウント、BAL細胞差、組織学的スコアリング、肺サイトカインおよび血清免疫グロブリン濃度についてANOVAによって決定した。グラフ中の全てのデータポイントは生物学的複製物を表す。異常値は、Graph Pad PrismのROUT法(Q=1%)を用いて、マウス実験データのみから検出され、除外された。統計的有意性は、P≦0.05として定義された。
マルコフ鎖モンテカルロ(Markov Chain Monte Carlo;MCMC)サンプリング17-19に基づく正確なロジスティック回帰モデルが開発され、オッズ比(OR)が、特定の臨床データに従ってAW群と関連したリスクを評価するために使用された。ORならびに補正した下側および上側信頼区間は、それぞれ、下記の式e(ln(OR))およびe(ln(CI)に従って計算した。ln(CI)は、拡張データ表1の正確な上側および下側信頼区間に等しい。全てのデータが利用可能な対象のみがモデルに含まれた(nAW=21、n対照=74)。Phyloseq20と共にRスタジオ(R−Studio、Boston、MA)における追加のRベースのコンピュータ計算ツール21-26を使用して、糞便の微生物多様性と細菌分類群の相対存在量を評価した。MetaboAnalyst27,28を使用して、主成分解析(Principal components analysis;PCA)を行い、パーマノバ(permanova)20によって統計的に確認された。シャノン多様性指数はPhyloseq20を用いて計算し、マン−ホイットニー(GraphPad Prismソフトウェア、バージョン5c、San Diego、CA)によって統計的に確認した。Phylsoeq20の’mt’機能を使用して、3カ月目と1年目のサンプルとの間および4つの表現型:AW、アトピーのみ、喘鳴のみ、および対照、の間に差次的に大量なOTUを同定するために多重推論補正P値を計算した。対照群とAW群との差は、qPCRについてマン−ホイットニーにより決定された。全てのSCFAおよび尿代謝産物は、正常性についてのシャピローウィルク試験(Shapiro−Wilk test)に供せられ、対照群とAW群との間の差は、t検定(硫酸グリココーレナートおよびグリコヒヨコラート;glycocholenate sulfate and glycohyocholate)またはマンホイットニーウィルコクソンによって決定された。ヒトのサンプルは統計的試験から除外しなかった。ヒトのサンプルを用いた解析では、F検定は群の変動間に有意差がないことがわかった。マウス実験におけるAW、AW+FLVRおよびナイーブ群の間の差を、BALカウント、BAL細胞差、組織学的スコアリング、肺サイトカインおよび血清免疫グロブリン濃度についてANOVAによって決定した。グラフ中の全てのデータポイントは生物学的複製物を表す。異常値は、Graph Pad PrismのROUT法(Q=1%)を用いて、マウス実験データのみから検出され、除外された。統計的有意性は、P≦0.05として定義された。
結果
我々は腸ミクロビオーム解析のために、このコホートから319人の子供を選択し、本明細書に記載のように、アレルギー皮膚プリック試験(すなわち、アトピー)と年齢1歳での臨床データ(すなわち、喘鳴)に基づいて、4つの臨床的に明確な表現型に分類した:アトピー+喘鳴(AW、n=22)アトピーのみ(n=87)、喘鳴のみ(n=136)および対照(n=74)(図1)。さらに、2歳および3歳の臨床データを使用して、厳密なぜんそく予測指標(Asthma Predictive Index;API)、学童期での活動性ぜんそくの存在についての臨床的に有効な予測指標である表現型を適用し7、これらの1年間の臨床的意義を確認した。年齢3歳における陽性の厳格なAPIは、年齢6歳から13歳の間の活動性ぜんそくの77%の確率と関連している8。年齢1歳でのAW群のCHILD研究対象は、対照群(95%CI:3.2から57.4)よりも13.5倍、陽性の厳格なAPIを有する可能性が高かった(図1)。アトピーのみと喘鳴のみの表現型と比較して、AWグループはまた、陽性APIカテゴリーにおいて有意に豊富であり、これらの子供を学童期における活動性ぜんそくのリスクが最も高いと同定した。
我々は腸ミクロビオーム解析のために、このコホートから319人の子供を選択し、本明細書に記載のように、アレルギー皮膚プリック試験(すなわち、アトピー)と年齢1歳での臨床データ(すなわち、喘鳴)に基づいて、4つの臨床的に明確な表現型に分類した:アトピー+喘鳴(AW、n=22)アトピーのみ(n=87)、喘鳴のみ(n=136)および対照(n=74)(図1)。さらに、2歳および3歳の臨床データを使用して、厳密なぜんそく予測指標(Asthma Predictive Index;API)、学童期での活動性ぜんそくの存在についての臨床的に有効な予測指標である表現型を適用し7、これらの1年間の臨床的意義を確認した。年齢3歳における陽性の厳格なAPIは、年齢6歳から13歳の間の活動性ぜんそくの77%の確率と関連している8。年齢1歳でのAW群のCHILD研究対象は、対照群(95%CI:3.2から57.4)よりも13.5倍、陽性の厳格なAPIを有する可能性が高かった(図1)。アトピーのみと喘鳴のみの表現型と比較して、AWグループはまた、陽性APIカテゴリーにおいて有意に豊富であり、これらの子供を学童期における活動性ぜんそくのリスクが最も高いと同定した。
他のぜんそく疫学研究9と一致して、正確なロジスティック回帰解析により、対照群と比較して、AW群に分類される対象のリスクを増加させる因子として、生後1年での抗生物質曝露[OR:5.6、p=0.009]および1年でのアトピー性皮膚炎[OR:6.4、p=0.005]が同定された(表1)。
帝王切開出産10、排他的な人工栄養10、および幼児期における抗生物質の曝露11もまた、腸内の微生物のディスバイオシスに関連付けられた一般的な要因であり、3カ月と1年の糞便微生物叢の我々の評価にそれらを含ませることを促したが、これらはこのサブ集団において重要な要因ではなかった。
他の若い子供のコホートにおけるミクロビオーム研究と一致して12、主成分解析(principal component analysis;PCA)により、このコホートにおいて微生物および代謝変化の主要な推進力として年齢が同定された(図5および6ならびに表2)。
3カ月および1歳のサンプルのPCAによって示されるように(図2A、図7A)、全体的な腸内群集成分は臨床表現型の間で実質的に異なっていなかった。3カ月および1歳の対照と比較して、AW群における多様性の有意でない減少が観察された(図2B、図7B)。それにもかかわらず、臨床表現型に従った相対的な分類群の比較(図2C)により、3カ月の糞便サンプル中のいくつかの大量ではない細菌分類群(すなわち、マイクロコッカス属およびベイロネラ属)の有病率における差異が同定された。その差異は1歳では存在しなかった(図7C)。これらの差異は、排他的に3カ月でAW群がフィーカリバクテリウム属、ラクノスピラ属、ロチア属、ベイロネラ属の低存在量を示す、属レベル(図8および9)においてさらに顕著であった。表現型にわたる上位50のOTUの統計的解析は、3カ月で8個の差次的に大量なOTUをもたらし、1歳で1個のみであった(表3;mt検定、未加工のp<0.05)。
ぜんそくのリスクが最も高い乳児におけるこの生後初期のディスバイオシスの重要性を判定するために、マーカー遺伝子データおよび参照細菌ゲノムに基づいて微生物群集の機能的メタゲノムを推測するアルゴリズムであるPICRUStを用いて、糞便微生物叢の機能的可能性を予測した。qPCRのために選択されたサンプルの同一サブセット内の糞便微生物叢の推論遺伝的組成を比較した(図2E〜F)。AW表現型に関連した多数の遺伝子が観察された。調査した全6911の遺伝子(KEGGオルソログ;KOと定義される)のうち、3カ月において2364個の遺伝子が顕著に異なり、1歳では125のみであった(ワルド試験(Wald test)およびFDR、p<0.05)。上位30個の差次的な遺伝子(最も低いp値に基づく;表4)は、3カ月(図2E)ではAW群と対照とを区別する能力が目立つが、年齢1歳においてはそれが無い(図2F)。
3カ月での糞便サンプルのこの機能的差異は、群集がぜんそく発症に影響を及ぼす可能性を示唆している。AW群集における機能的な差異は、多様な代謝機能を有する遺伝子を含んでいた(遺伝子複製、炭素代謝、輸送体、アミノ酸生合成など;表5)。
これらの遺伝子が特定の代謝経路に組織化されると、リポ多糖(LPS)の生合成が、AW群と対照群の間で最も異なっている経路であった(ウェルチのt検定、図10)。再び、臨床群間の特定の代謝経路における有意な差異は、1歳のサンプルにおいて見られなかった。3カ月で検出された腸内細菌の大部分がグラム陽性(腸内細菌科およびベイロネラ属以外の全て)であることを考慮すると、ベイロネラ種の違いがAW群におけるLPS生合成遺伝子の違いを説明することができる可能性がある。
糞便および尿中のSCFAレベルならびに尿メタボロミクスを測定することにより、AW小児における腸内群集の機能的影響をさらに調査した。年齢3カ月で、AW小児の糞便サンプルは酢酸塩の濃度が有意に低かった(図3Aおよび表6)。
糞便および尿中のSCFAレベルならびに尿メタボロミクスを測定することにより、AW小児における腸内群集の機能的影響をさらに調査した。年齢3カ月で、AW小児の糞便サンプルは酢酸塩の濃度が有意に低かった(図3Aおよび表6)。
尿メタボロミクス解析を用いて、宿主および微生物起源の両方の代謝の差異を同定した16。この技術は、ヒト17およびモルモット18のぜんそく患者および対照患者を区別するために高精度で使用されてきた。AWと対照の対象からの尿を比較することにより、2つの表現型の間に、微妙ではあるが有意な代謝シグナルが検出された(同定された580代謝物のうち、3カ月では39が有意に異なり、1歳では28が異なっていた)。この論文の目的として、我々は微生物起源または寄与の代謝産物に焦点を当てた。年齢3カ月では、対照と比較して、細菌の代謝に影響を受ける8種類の代謝産物がAW小児の尿中に差次的に***されたが、1歳では2つのみが差次的に検出され、初期の乳児期の微生物のディスバイオシスの影響を再び反映していた。3カ月では、硫酸化胆汁酸グリコリトコラート(sulphated bile acids glycolithocholate)、グリココーレナート(glycocholenate)およびグリコヒヨコラート(glycohyocholate)の***がAWの小児において高かったが、タウロウルソデオキシコール酸(tauroursodeoxycholate)の***は低下した(図3B)。この***物の変化は、胆汁酸の宿主産生の増加および/または一次胆汁酸における微生物酵素活性の変化から起こりうる。AW小児の腸内微生物群集のいくつかの種の差異を考慮すると、胆汁酸***物の差異の少なくとも一部は微生物のディスバイオシスに起因する可能性が高い19。おそらく、AW小児の尿中で観察された最も顕著な代謝の差異は、ウロビリノーゲン、腸内微生物叢の特定産物、の14倍の増加であった。ウロビリノーゲンは、ヘム異化の分解産物であるビリルビンの減少によって形成される。クロストリジウム種(Clostridial species)は、ビリルビン変換が可能である唯一の既知の細菌であり20,21、この研究においては、クロストリジウムspp.は3カ月でのAW群で存在量(NS)を減少させた(図8)。これは、ウロビリノーゲン***の大きな上昇が、むしろ宿主のビリルビン代謝の変化に起因し得ることを示唆している。赤血球は胆汁酸の膜損傷作用の影響を特に受けやすいので、AW群の胆汁酸濃度が高いほどビリルビンの増加をもたらす可能性がある22。興味深いことに、他の胆汁酸とは異なり、タウロウルソデオキシコール酸塩は、対照群での高いレベルと一致する他の胆汁酸の存在下で赤血球および肝細胞に対して細胞保護効果を有することが示されている23,24(図3B)。胆汁酸代謝に観察される差異は、3カ月でのAW小児の尿中のウロビリノーゲン***の増加と相関する。これらの代謝変化がぜんそくの病因に関連しているか否か、そしてどのように関連しているかは不明である。それにもかかわらず、それらは尿中で検出することができ、ぜんそくの危険性と関連する初期の幼児期における腸内ディスバイオシスのマーカーとなる。
ぜんそく感受性におけるフィーカリバクテリウムsp.、ラクノスピラsp.、ベイロネラsp.およびロチアsp.(総じてFLVRと略記される)の役割は、ヒト化された微生物叢を有する気道炎症のネズミモデルにおいて調査された。成人無菌(GF)マウス(n=4)に、3カ月で採取した1人のAW対象からの糞便、または生きたFLVRを意図的に補填した同じヒト接種物を接種した。このAW対象は、3カ月の糞便におけるこれらの4つの分類群の非常に低い存在量、陽性の厳格なAPI、および年齢3歳までのぜんそくの正式な診断に基づいて選ばれた。FLVRを有する両親から生まれたマウスは、これらの株を保持することに成功した。ラクノスピラsp.は、他の3株よりも非常に高い存在量でコロニー形成していた(図4A、B)。F1世代を、7−8週齢でオボアルブミン(OVA)により免疫化し、気道炎症反応を誘導した。AW微生物叢を接種したマウスは、好中球、好酸球、マクロファージおよびリンパ球からなる混合肺浸潤を特徴とする、OVAに対する重度の肺炎症応答を示した。しかし、AW微生物叢をFLVRで補填することにより、気管支肺胞洗浄における全肺細胞浸潤が有意に減少した(BAL;p<0.05)(図4C、D)。病理組織学的スコアリングにより、FLVRを補填すると気道炎症が減少することが確認された(図4E;p<0.01)。さらに、FLVR補填は、主要な前炎症性サイトカインIFN−γ、TNF、IL−17AおよびIL−6およびOVA特異的IgG2aの濃度を有意に減少させた(図4F、G;p<0.01−0.0001)。このサイトカインパターンは、好中球レベルの増加を伴う重度のヒトぜんそくに関連するTNF、IL−17AおよびIL−6の上昇を連想させる25-27。まとめると、これらのデータは、AWサンプルからの微生物叢が混合Th1/Th2/Th17肺炎症応答を誘導し、計画的で治療的なFLVRでのコロニー形成が免疫応答のTh1/Th17成分を有意に減少させたことを示す。
本発明は、1つまたは複数の実施形態に関して記載されてきた。しかしながら、特許請求の範囲に規定された本発明の範囲から逸脱することなく、多くの改変および修正を行うことができることは、当業者には明らかであろう。
全ての引用は、参照により本明細書に組み込まれる。
全ての引用は、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (24)
- フィーカリバクテリウム(Faecalibacterium)、ラクノスピラ(Lachnospira)、ベイロネラ(Veillonella)またはロチア(Rothia)属の2種以上の細菌を含む有効な量の細菌組成物を、対象に投与することを含む、それを必要とする対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの1つまたは複数を治療する方法。
- フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の2種以上の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における腸内微生物叢を改変する方法。
- フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の2種以上の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の胃腸管に定植させる方法。
- 前記対象が抗生物質療法を受けているか、受けるか、または受けたかのいずれかである、請求項2または3に記載の方法。
- 前記対象がヒト胎児、ヒト乳児、または妊娠女性である、請求項1から4までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒト乳児が1歳未満である、請求項5に記載の方法。
- 前記細菌組成物が予防的に投与される、請求項1から6までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌組成物が経口または直腸投与される、請求項1から7までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌組成物が液体懸濁液として製剤化される、請求項8に記載の方法。
- 前記細菌組成物がフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ(Faecalibacterium prausnitzii)、ラクノスピラ・マルチパラ(Lachnospira multipara)、ベイロネラ・パルブラ(Veillonella parvula)およびロチア・ムシラギノサ(Rothia mucilaginosa)の2種以上を含む、請求項1から9までのいずれか1項に記載の方法。
- フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の3種以上の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することを含む、請求項1から9までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌組成物がフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサの3種以上を含む、請求項11に記載の方法。
- フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア属の細菌を含む有効な量の細菌組成物を対象に投与することを含む、請求項1から9までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌組成物がフィーカリバクテリウム・プラウスニッツィイ、ラクノスピラ・マルチパラ、ベイロネラ・パルブラおよびロチア・ムシラギノサを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記投与が対象におけるフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の細菌の少なくとも1種または複数種の個体群の増加をもたらす、請求項1から14までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記増加が定量的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定される、請求項15に記載の方法。
- 前記増加が前記対象からのサンプル中に存在する代謝産物の検出によってモニターされる、請求項15に記載の方法。
- 担体と組み合わせた、フィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラおよびロチア属の2種以上の細菌を含む細菌組成物。
- 前記細菌が、それを必要とする対象において、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーを治療するため、または腸内微生物叢を改変するため、または胃腸管に定植させるために有効な量で存在する、請求項18に記載の細菌組成物。
- それを必要とする対象における、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、もしくはアトピーの治療、または腸内微生物叢の改変、または胃腸管への定植に使用するためのものである、請求項18または19に記載の細菌組成物。
- 前記細菌が実質的に純粋である、請求項18から20までのいずれか1項に記載の細菌組成物。
- 対象における腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギー、またはアトピーの発症の可能性を決定する方法であって、前記対象からのサンプル中のフィーカリバクテリウム、ラクノスピラ、ベイロネラまたはロチア属の2種以上の細菌のレベルを決定すること、および前記レベルを比較対象または健康な対象と比較することを含み、ここで、細菌のレベルの減少が腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの発症の可能性を示す、方法。
- 前記対象からのサンプル中に存在する代謝産物のレベルを決定することをさらに含む、請求項22に記載の方法。
- 請求項18または19に記載の組成物の有効な量を、腸内ディスバイオシス、ぜんそく、アレルギーまたはアトピーの発症の可能性が高いと決定された対象に投与することをさらに含む、請求項22または23に記載の方法。
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