JP2018507705A

JP2018507705A - 侵入するｄｎａウイルスに対する植物の抵抗能力を高めるための方法

Info

Publication number: JP2018507705A
Application number: JP2017548173A
Authority: JP
Inventors: ガオツァイシア; ジーシアン; ジャンフアウェイ
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2015-03-12
Filing date: 2016-03-14
Publication date: 2018-03-22
Also published as: EP3309255A1; CN105969792A; WO2016141893A1; CA2979292A1; EP3309255A4; AU2016228599A1; EA201791991A1; AR103927A1; US20180195084A1; KR101994953B1; KR20170126495A; BR112017016423A2

Abstract

本発明は、ＤＮＡウイルスに対する植物の抵抗能力を高めるための方法であって、以下：１）ＤＮＡウイルスのゲノム配列から１つの配列を選択してこれを標的配列とし、ここで該配列は５’−ＮＸ−ＮＧＧ−３’または５’−ＣＣＮ−ＮＸ−３’の配列規則にしたがうものとし、かつ該標的配列に対して逆相補的であるＤＮＡ断片を合成するステップ、２）前記ＤＮＡ断片からＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現用ベクターを構築して、ガイドＲＮＡを転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させることができる組換えベクターを得るステップ、３）前記組換えベクターをレシピエント植物に導入するステップを含む方法を提供する。前記本発明の方法を、ＤＮＡウイルスの配列が既知である２本鎖ＤＮＡウイルスおよび中間体としての２本鎖ＤＮＡを有する１本鎖ＤＮＡウイルスに広く適用することができる。

Description

発明の分野
本発明は、植物遺伝子工学の分野に属し、侵入するＤＮＡウイルスに対する植物の抵抗能力を改善するための方法に関する。

技術的背景
ＤＮＡウイルスは自然界に広く存在し、細菌、動物および植物において多数の宿主を有する。最も知られているＤＮＡウイルスは重度の感染症を引き起こし、結果として実用作物および哺乳類（ヒトを含む）において著しい損失が生じる。例えば、ジェミニウイルスは植物における１本鎖ＤＮＡウイルスの一ファミリーであり、これは双生の粒子を有する唯一のウイルス種である。これは、知られている最大の１本鎖ＤＮＡウイルスファミリーである。ジェミニウイルスのゲノムは単一成分である場合も２成分である場合もあり、約２．５〜３．１ｋｂのサイズを有する。ジェミニウイルスは昆虫により伝染し、そのほとんどは植物の篩部に感染する。現在、ジェミニウイルスによって作物、例えばトマト、キャッサバおよび綿花において莫大な損失が生じたことが報告されている。１９９１年から１９９２年にかけて、このウイルスにより米国フロリダ州におけるトマト生産において１億４０００万ドルの損失が生じた。１９９２年から１９９７年にかけて、コットンリーフカールウイルスによりパキスタンにおいて５０億ドルの損失が生じた。キャッサバに関しては、毎年世界中で１０億ポンドの損失が生じた。１９９９年には、ジェミニウイルスの危険性を明らかにすべく、Ｓｃｉｅｎｃｅにおいて特別報告”ＧｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓＥｍｅｒｇｅａｓＳｅｒｉｏｕｓＣｒｏｐＴｈｒｅａｔ”が発表された。

ジェミニウイルスに抵抗するための従来の方法は主に、ＤＮＡウイルスの複製の阻止、またはその病原性タンパク質の発現の妨害に重点を置いている。ジェミニウイルスの複製機序は、比較的保存されている。宿主細胞への侵入後、ウイルスのＤＮＡにより、複製に関与するタンパク質が発現される。その後、このタンパク質はウイルスのゲノムにおける複製起点に結合して、このＤＮＡウイルスの複製を開始する。ジェミニウイルスの１本鎖ＤＮＡが宿主細胞に入ると、この１本鎖ＤＮＡにしたがって相補鎖が合成されて、２本鎖中間体（ｄｓＤＮＡ）が形成される。このウイルスは、複製に関与するタンパク質（Ｒｅｐ）および複製エンハンサータンパク質（Ｒｅｎ）のみをコードする。このＲｅｐタンパク質が２本鎖ＤＮＡにおける複製起点に結合し、かつ保存された配列ＴＡＡＴＡＴＴＡＣにニックを生成することにより、ローリングサークル型複製が開始される。したがって、完全長の外来性Ｒｅｐタンパク質またはその一部を導入してこの内因性Ｒｅｐタンパク質と競合させることにより、ジェミニウイルスの複製を阻害することができる。しかしこの技術の使用は、例えば高発現、宿主細胞の成長の妨害および非汎用性といった欠点により制限される。ＲＮＡｉを用いてウイルスの病原性タンパク質の発現を妨害することによりウイルス抵抗性を達成するという、他の報告が存在する。この技術は相同性に依存するため、汎用的ではない。２００５年にはＴａｋａｓｈｉＳｅｒａにより、ジンクフィンガー結合タンパク質が２本鎖ＤＮＡに特異的に結合することに基づきジェミニウイルスの複製を阻害するための方法が開発された。モデルとして、ビートシビアカーリートップウイルス（Ｂｅｅｔｓｅｖｅｒｅｃｕｒｌｙｔｏｐｖｉｒｕｓ、ＢＳＣＴＶ）が使用された。ウイルスの複製を防ぐべく外来性の人工ジンクフィンガータンパク質（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＺＰ）を導入し、これを、２本鎖中間体の複製起点への結合に関して、ウイルスの複製を開始するタンパク質Ｒｅｐと競合させた。しかしこの方法は、複製を開始するタンパク質としてのＲｅｐを有するジェミニウイルスに対してしか機能せず、したがってＤＮＡウイルスに対する広範な抵抗性をもたらしうるものではない。

近年、侵入する２本鎖ＤＮＡ断片、例えばファージおよびプラスミドを特異的に除去しうる適応免疫応答系が細菌において存在することが判明した。そのような免疫系は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文（ＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔ、ＣＲＩＳＰＲ）配列、トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲに関与する遺伝子（Ｃａｓ遺伝子）を構成要素とする。ウイルスのＤＮＡ断片のいくつかがＣＲＩＳＰＲ反復配列内に記録され、その後、このウイルスの配列を含むＣＲＩＳＰＲＲＮＡが発現しうる。再度ウイルスが細胞に侵入すると、このＣＲＩＳＰＲＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡの助けを借りて、Ｃａｓ遺伝子によりコードされるエンドヌクレアーゼが外来性のウイルスの２本鎖ＤＮＡを認識しかつ分解するよう、該エンドヌクレアーゼを誘導（ガイド）する。

Ｃａｓ遺伝子のコアエレメントの配列間の相違により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ免疫系を、Ｉ種、ＩＩ種およびＩＩＩ種の３種類に分類することができる。Ｉ種およびＩＩＩ種では、２本鎖ＤＮＡを切断するための複合体を形成させるには、Ｃａｓ遺伝子によりコードされるタンパク質が複数必要であるのに対して、ＩＩ種ではＣａｓ９タンパク質しか必要とされない。したがって、ＩＩ種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が最も広く使用されている。近年の研究により、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを、人工合成により単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）へと融合させうることが判明した。そのようなｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが標的部位でＤＮＡを切断するよう、該Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを誘導することができる。

類似のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を真核生物に導入することができれば、真核生物のウイルス抵抗性が著しく改善されるであろう。

発明の概要
本発明の一目的は、ＤＮＡウイルスに対する改善された抵抗能力を有する植物の製造方法を提供することである。

本発明のＤＮＡウイルスに対する改善された抵抗能力を有する植物の製造方法は特に、以下：
（１）ＤＮＡウイルスのゲノム配列から多数の標的配列を選択し、それぞれ該標的配列に対して逆相補的であるＤＮＡ断片を設計しかつ合成するステップ、ここで、該標的配列は、５’−Ｎ_Ｘ−ＮＧＧ−３’または５’−ＣＣＮ−Ｎ_Ｘ−３’の配列を有し、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴのうちのいずれか１つを表し、１４≦Ｘ≦３０であってかつＸは整数であり、Ｎ_Ｘは、Ｘ個の連続したデオキシリボヌクレオチドを表す、
（２）ステップ（１）で得た前記複数のＤＮＡ断片からＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現用ベクターを構築することにより、複数の組換えベクターを得るステップ、ここで、該組換えベクターは、ガイドＲＮＡを転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させることができ、該ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成により形成される回文構造を有するＲＮＡであり、該ｃｒＲＮＡは、前記ＤＮＡ断片から転写されたＲＮＡ断片を含む、
（３）前記複数の組換えベクターをそれぞれレシピエント植物に導入し、該レシピエント植物から前記ＤＮＡウイルスに対する改善された抵抗能力を有する植物を得るステップを含むことができ、
ここで、前記ＤＮＡウイルスは、２本鎖ＤＮＡウイルスであるか、または中間体としての２本鎖ＤＮＡを有する１本鎖ＤＮＡウイルスである。

本発明はまた、ＤＮＡウイルスに対する改善された抵抗能力を有する植物の製造方法であって、特に以下：
１）ＤＮＡウイルスのゲノム配列から１つの標的配列を選択するステップ、ここで、該標的配列は、５’−Ｎ_Ｘ−ＮＧＧ−３’または５’−ＣＣＮ−Ｎ_Ｘ−３’の配列を有し、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴのうちのいずれか１つを表し、１４≦Ｘ≦３０であってかつＸは整数であり、Ｎ_Ｘは、Ｘ個の連続したデオキシリボヌクレオチドを表す、
２）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現用組換えベクターを構築するステップ、ここで、該組換えベクターは、ステップ１）の前記標的配列を特異的に狙うガイドＲＮＡを転写し、かつＣａｓ９タンパク質を発現させることができる、
３）前記複数の組換えベクターを植物に導入することにより、ＤＮＡウイルスに対する改善された抵抗能力を有する植物を得るステップ
を含む方法を提供する。

いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡウイルスは、２本鎖ＤＮＡウイルスであるか、または中間体としての２本鎖ＤＮＡを有する１本鎖ＤＮＡウイルスである。前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現用組換えベクターは、ガイドＲＮＡを転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させることができる。前記ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成により形成される回文構造を有するＲＮＡである。

本発明の他の目的は、ＤＮＡウイルスに対する植物の抵抗能力を改善するための方法を提供することである。

本発明のＤＮＡウイルスに対する植物の抵抗能力を改善するための方法は特に、以下（ａ）および（ｂ）：
（ａ）以下（ａ１）〜（ａ３）：
（ａ１）抵抗すべきＤＮＡウイルスのゲノム配列から多数の標的配列を選択し、それぞれ該標的配列に対して逆相補的であるＤＮＡ断片を設計しかつ合成するステップ、ここで、該標的配列は、５’−Ｎ_Ｘ−ＮＧＧ−３’または５’−ＣＣＮ−Ｎ_Ｘ−３’の配列を有し、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴのうちのいずれか１つを表し、１４≦Ｘ≦３０であってかつＸは整数であり、Ｎ_Ｘは、Ｘ個の連続したデオキシリボヌクレオチドを表す、
（ａ２）ステップ（ａ１）で得た前記複数のＤＮＡ断片からＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現用ベクターを構築することにより、複数の組換えベクターを得るステップ、ここで、該組換えベクターは、ガイドＲＮＡを転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させることができ、該ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成により形成される回文構造を有するＲＮＡであり、該ｃｒＲＮＡは、前記ＤＮＡ断片から転写されたＲＮＡ断片を含む、
（ａ３）前記複数の組換えベクターをそれぞれレシピエント植物（１）に導入し、該レシピエント植物（１）から、前記ＤＮＡウイルスに対する改善された抵抗能力を有する植物を得て、ここで該植物を目的植物と命名するものとし、該目的植物に導入された前記組換えベクター中のＤＮＡ断片を目的ＤＮＡ断片と特定するステップ
を含む方法により、目的ＤＮＡ断片を得るステップ、
（ｂ）前記目的ＤＮＡ断片から、ステップ（ａ２）および（ａ３）にしたがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現用ベクターを構築し、かつ得られた該組換えベクターをレシピエント植物（２）に導入し、それにより前記ＤＮＡウイルスに対する該レシピエント植物（２）の抵抗能力を改善するステップ
を含むことができ、
ここで、前記ＤＮＡウイルスは、２本鎖ＤＮＡウイルスであるか、または中間体としての２本鎖ＤＮＡを有する１本鎖ＤＮＡウイルスであり、前記レシピエント植物（１）と前記レシピエント植物（２）とは、同一であっても異なってもよい。

上記方法において、「該レシピエント植物（レシピエント植物（１））から、前記ＤＮＡウイルスに対する改善された抵抗能力を有する植物を得る」ことは、以下を含む方法により達成される：
（Ｉ）ステップ（３）において、レシピエント植物（またはレシピエント植物（１））に対照として空ベクターを導入するステップ、ここで、該空ベクターは、前記ＤＮＡ断片が挿入されていないＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現用ベクターである、
（ＩＩ）前記組換えベクターを保有する多数のレシピエント植物（またはレシピエント植物（１））に前記ＤＮＡウイルス発現用ベクターを導入することにより多数の植物（Ａ）を得て、前記空ベクターを保有するレシピエント植物に前記ＤＮＡウイルス発現用発現ベクターを導入することにより植物（Ｂ）を得て、そして該植物（Ａ）および該植物（Ｂ）におけるＤＮＡウイルス含有量を検出し、該植物（Ｂ）よりも著しく（Ｐ＜０．０５）低いＤＮＡウイルス含有量を有する植物を該植物（Ａ）から選択することにより、植物Ａ’を得るステップ、ここで、該植物Ａ’に対応する組換えベクターを保有するレシピエント植物（またはレシピエント植物（１））が、ＤＮＡウイルスに対する改善された抵抗能力を有する植物である。

前記「該植物（Ｂ）よりも著しく低いＤＮＡウイルス含有量を有する植物を該植物（Ａ）から選択する」ステップは好ましくは、植物（Ｂ）よりも著しく（Ｐ＜０．０１）低いＤＮＡウイルス含有量を有する植物を植物（Ａ）から選択することを含むか、または好ましくは、いかなる病害の表現型をも有しない植物を植物（Ａ）から選択することを含む。

前記方法のステップ（２）および（ａ２）において、ＲＮＡ断片は、標的断片に相補的に結合しうる。標的断片とは、２本鎖ＤＮＡウイルスのゲノム内の配列であるかまたは１本鎖ＤＮＡウイルスの２本鎖ＤＮＡ中間体内の配列であって、ステップ（１）における配列「Ｎ_Ｘ」に相当する配列である。

前記方法のステップ（ｂ）において、レシピエント植物（２）内の組換えベクターによって、転写によりガイドＲＮＡが合成されかつＣａｓ９タンパク質が発現される。このガイドＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とにより形成されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼにより、レシピエント植物（２）においてＤＮＡウイルスの複製を阻害することができ、それによりＤＮＡウイルスに対するレシピエント植物（２）の抵抗能力を改善することができる。特に、ガイドＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とにより形成されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼにより標的断片が切断され、それによりレシピエント植物（２）におけるＤＮＡウイルスの複製が阻害される。

本発明の特定の一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現用ベクターは、ｐＨＳＮ４０１ベクターである。それに応じて、組換えベクターは、ｐＨＳＮ４０１ベクターの２つのＢｓａＩ部位にＤＮＡ断片を順方向に挿入することにより得られる組換えプラスミドである。

本発明の特定の一実施形態において、前記Ｘは、２０である。

本発明の特定の一実施形態において、前記植物は、双子葉植物である。

本発明の特定の一実施形態において、前記植物はタバコであり、例えばニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）である。

本発明の一実施形態において、前記ＤＮＡウイルスはジェミニウイルスであり、特にビートシビアカーリートップウイルス（Ｂｅｅｔｓｅｖｅｒｅｃｕｒｌｙｔｏｐｖｉｒｕｓ、ＢＳＣＴＶ）である。それに応じて、標的配列（表１）にしたがって設計されたＤＮＡ断片は、表２に挙げた配列のうちのいずれか１つである。前記目的ＤＮＡ断片は、表２に挙げた配列のうちのいずれか１つ（すなわち、配列番号１〜１５のうちのいずれか１つの相補的配列）である。好ましくは前記目的ＤＮＡ断片は、表２に挙げた配列のうちのいずれか１つから、Ｖ４およびＶ９を除いたもの（すなわち、配列番号１〜３、４〜８および１０〜１５のうちのいずれか１つの逆相補的配列）である。より好ましくは前記目的断片は、Ｖ４またはＶ９（すなわち、配列番号７または８の逆相補的配列）である。前記発現ベクター（すなわち、上記「前記ＤＮＡウイルス発現用発現ベクター」）は、プラスミドｐＣａｍｂｉａＢＳＣＴＶ１．８である。プラスミドｐＣａｍｂｉａＢＳＣＴＶ１．８は、以下を含む方法により得られる：（ａ１）ｐＣａｍｂｉａ１３００ベクターのＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとの間に配列番号１６のＤＮＡ断片を順方向に挿入することにより、中間体ベクターを得るステップ、（ａ２）前記中間体ベクターのＥｃｏＲＩ部位に配列番号１７のＤＮＡ断片を挿入することにより、プラスミドｐＣａｍｂｉａＢＳＣＴＶ１．８を得るステップ。

本発明の方法は、細菌の免疫系を模擬する。ウイルス中の標的部位を特異的に認識するｓｇＲＮＡが植物中で発現されることにより、該植物においてＣａｓ９が媒介するウイルスの２本鎖ＤＮＡの消失が誘発される。本発明は、ビートシビアカーリートップウイルス（Ｂｅｅｔｓｅｖｅｒｅｃｕｒｌｙｔｏｐｖｉｒｕｓ、ＢＳＣＴＶ）をモデルとして使用して、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系を用いた植物におけるＢＳＣＴＶの複製の効率的な阻害を初めて示す。本発明の方法は、ウイルスのゲノム配列にほとんど依存せず、またウイルスの遺伝子の既知の特定の機能を必要としない。したがって本方法を、様々な既知の２本鎖ＤＮＡウイルスまたは中間体としての２本鎖ＤＮＡを有する１本鎖ウイルスに対する抵抗に広く使用することができる。

図１は、タバコ植物の様々な群におけるＢＳＣＴＶの相対含有量を示す。ｐＨＳＮ４０１空ベクター対照におけるＢＳＣＴＶの相対含有量を１と表す。他の群におけるＢＳＣＴＶの相対含有量を、ｐＨＳＮ４０１空ベクター対照に対する割合として表す。図２は、様々な群におけるタバコ植物の表現型を示す。ＡはｐＨＳＮ４０１空ベクター対照であり、ＢはＶ７群であり、ＣはＶ８群であり、ＤはＶ４群である。

詳細な実施形態
以下の実施例において用いた実験方法は、別段の記載がない限りいずれも従来の方法である。

以下の実施例において使用した材料、試薬は、別段の記載がない限りいずれも市販されている。

ｐＨＳＮ４０１ベクターは「Ｈｕｉ−ＬｉＸｉｎｇｅｔａｌ．，ＡＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｔｏｏｌｋｉｔｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｘｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓ．ＢＭＣｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ２０１４」に記載されており、中国科学院遺伝学発生生物学研究所（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ）より入手可能である。

ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）は「Ｈａｉ−ｔａｏＣｕｉｅｔａｌ．，ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｆｏｒＮｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ，ＳｃｉｅｎｃｅＩｎＳｈａｎｄｏｎｇ，２００６，Ｖｏｌｕｍｅ０１」に記載されており、中国科学院遺伝学発生生物学研究所（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ）より入手可能である。

ｐＣａｍｂｉａ１３００ベクターは、ＹｏｕｂｉｏＣｏ．Ｌｔｄ．（ＣＡＴ．Ｎｏ．：ＶＴ１３７５）より入手される。

アグロバクテリウム株ＥＨＡ１０５は、ＹｏｕｂｉｏＬｔｄ．（ＣＡＴ．Ｎｏ．：ＳＴ１１４０）より入手される。

実施例１ＤＮＡウイルスに対する植物の抵抗能力を改善するための方法の確立
ＤＮＡウイルスに対する植物の抵抗能力を改善するための方法を確立すべく、本実施例において、抵抗すべきＤＮＡウイルスとしてビートシビアカーリートップウイルス（Ｂｅｅｔｓｅｖｅｒｅｃｕｒｌｙｔｏｐｖｉｒｕｓ、ＢＳＣＴＶ）を選択し、ＢＳＣＴＶの標的となる植物としてタバコ（ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ））を使用した。

ＢＳＣＴＶは、１本鎖ＤＮＡウイルスである。しかし、その増幅にはローリングサークル型複製を要する。まず、このウイルスの１本鎖ＤＮＡをテンプレートとして用いて相補鎖を合成して、環状の２本鎖中間体を作製する。次いで、この２本鎖中間体上にニックを生成させ、この相補鎖をテンプレートとして用いてウイルスの多量の１本鎖ＤＮＡを生成させる。したがってこの２本鎖中間体は、ウイルスゲノムＤＮＡの増幅において重要な役割を果たす。本発明者らは、Ｃａｓ９をＢＳＣＴＶの２本鎖中間体の除去へと導くための、ウイルスの２本鎖中間体に対して特異的である複数のｓｇＲＮＡを設計した。

Ｉ．双子葉類のためのＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９系バイナリーベクターの構築
１．次世代シーケンシングの結果に基づき、ビートシビアカーリートップウイルス（Ｂｅｅｔｓｅｖｅｒｅｃｕｒｌｙｔｏｐｖｉｒｕｓ、ＢＳＣＴＶ）の構造マップを得た（配列番号１６および１７）。

２．この構造マップにおけるある領域をランダムに選択し、これをＶ領域と命名した。このＶ領域は３００ｂｐの長さであり、標的断片（表１）がこのＶ領域を包含するように該標的断片（表１）の設計を行った。さらに、非ウイルス配列の標的断片を対照として使用する。

表１Ｖ領域標的断片の設計

表１中の下線を付したヌクレオチドは、ＰＡＭ配列を表す。

３．ステップ２で設計した標的断片にしたがって、粘着末端を有する１本鎖オリゴヌクレオチド（表２）を合成した。このオリゴヌクレオチドのアニーリングにより粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成させ、これをｐＨＳＮ４０１ベクターの２つのＢｓａＩ制限部位の間に順方向に挿入して、組換えプラスミドを得た。このｐＨＳＮ４０１ベクターの２つのＢｓａＩ制限部位の間に挿入した表１の標的配列の逆相補的配列を有する陽性組換えプラスミドをシーケンシングにより確認し、これをｐＨＳＮ４０１−ｓｇＲＮＡと命名した。この陽性組換えプラスミドは、対応する標的断片に対して特異的であるガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を転写し、かつＣａｓ９タンパク質を発現することができる。

表２Ｖ領域標的断片に対応するオリゴヌクレオチド

ＩＩ．タバコの一過性系を用いた活性化型ｓｇＲＮＡに関するスクリーニング
本発明者らは、ＢＳＣＴＶに対する抵抗性を有する活性化型ｓｇＲＮＡをスクリーニングするためのタバコの一過性系を初めて確立する。

１．タバコ植物の準備
タバコ（ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ））種子を栄養土に直接播種した。２週間後に実生を移植し、その際に９×９ｃｍ^２当たり１本の実生を移植した。これらの実生を、葉が８〜９枚となるまで２週間生育させた。大きさが類似した２枚の側葉を、注入用に選択した。温室内の生育条件：明所１６時間および暗所８時間、温度は２４℃である。

２．抵抗性ベクターおよびウイルス接種
ＢＳＣＴＶを含むｐＣＦＨベクターを、米国タイプカルチャーコレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｇｃｓｔａｎｄａｒｄｓａｔｃｃ．ｏｒｇ／、ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＰＶＭＣ−６（登録商標））より入手した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いたｐＣＦＨベクターの二重消化により０．８コピーＢＳＣＴＶ断片（配列番号１６）を得て、これをｐＣａｍｂｉａ１３００ベクターのＥｃｏＲＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位との間に挿入した。得られた組換えプラスミドを、ｐＣａｍｂｉａＢＳＣＴＶ０．８と命名した。その後、ＥｃｏＲＩを用いた消化により１コピーＢＳＣＴＶ断片（配列番号１７）を得て、これからＥｃｏＲＩ部位で順方向にｐＣａｍｂｉａＢＳＣＴＶ０．８を構築した。生じた組換えベクターを、ｐＣａｍｂｉａＢＳＣＴＶ１．８と命名した。この組換えベクターの構築方法は、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，ＢＳＣＴＶＣ２ＡｔｔｅｎｕａｔｅｓｔｈｅＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＳＡＭＤＣ１ｔｏＳｕｐｐｒｅｓｓＤＮＡＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ＭｅｄｉａｔｅｄＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．２０１１に開示されていた。

ｐＣａｍｂｉａ１３００の骨格を有するバイナリーベクターに、ウイルスの１．８コピーを組み込んだ（１．８コピーとは、バイナリーベクターに組み込まれるウイルスが植物において環状の個体を形成するには、ウイルス配列の０．８コピーの追加が必要であることを意味する）ため、アグロバクテリウム注入法によりニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のゲノムに組み込んだ際に、ウイルスの自己複製を達成することができる。

液体窒素凍結融解法により、ｐＨＳＮ４０１−ｓｇＲＮＡプラスミドをアグロバクテリウム株ＥＨＡ１０５に形質転換した。カナマイシンおよびリファンピシンを補填した１ｍｌのＬＢに単一のコロニーを取り、一晩振盪しながらインキュベートした。次いで、カナマイシンおよびリファンピシンを補填した５ｍｌのＬＢに細菌を接種し、一晩振盪しながらインキュベートした。培養物を３６００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１０ｍＭＭｇＣｌ_２で再懸濁させ、ＯＤ６００＝１．５となるように希釈した。０．１％（ｖ／ｖ）２００ｍＭアセトシリンゴン（Ａｓ）を加えた。この溶液を２時間静置し、上記の通り準備した２枚のタバコ葉に注入した。

２日後、同一の方法を用いて、ｐＣａｍｂｉａＢＳＣＴＶ１．８プラスミドを、アグロバクテリウム株ＥＨＡ１０５に形質転換した。スケールアップした培養物を１０ｍＭＭｇＣｌ_２で再懸濁させ、ＯＤ６００＝０．５となるように希釈し、そして既にｐＨＳＮ４０１−ｓｇＲＮＡプラスミドを注入してある２枚の葉に注入した。

この実験において、ｐＨＳＮ４０１プラスミドを対照として使用した。各実験において、少なくとも１つのタバコ植物を使用した。

１０日後、タバコ植物の様々な群の表現型を記録した。注入した葉を採取し、液体窒素中で粉砕して粉末にした。ＴＩＡＮＧＥＮＤＮＡｑｕｉｃｋＰｌａｎｔＳｙｓｔｅｍ（遠心分離カラムなし）を用いたＤＮＡ抽出のために、各サンプル１００ｍｇを採取した。ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）のＰＰＲ（ペンタトリコペプチドリピート）を含むタンパク質遺伝子（アクセッション番号：ＧＯ６０２７３４）を内部標準として選択し、以下のプライマーを用いた増幅のために１３３ｂｐの適切な断片を選択した：
ＰＰＲ−Ｆ：５’−ＣＴＣＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＣＣＡＴＡＣ−３’；
ＰＰＲ−Ｒ：５’−ＧＧＴＧＣＴＴＴＡＴＧＴＧＧＴＴＧＴＡＧＴＴＡＴＧＣ−３’。

増幅すべきＢＳＣＴＶ断片は７６ｂｐであり、プライマーは、
ＢＳＣＴＶ−Ｆ：５’−ＣＡＧＧＧＡＴＴＴＴＣＧＣＡＣＡＧＡＧＧＡＡＣ−３’；
ＢＳＣＴＶ−Ｒ：５’−ＧＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＴＣＣＡＣＧＧＧ−３’
である。

ｑＰＣＲ用の試薬は、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ＠４８０ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＭａｓｔｅｒである。ｑＰＣＲの反応系：２×ミックス１０μｌ；プライマー（各）１μｌ；ｄｄＨ_２Ｏ４μｌ；ＤＮＡテンプレート４μｌ。

空ベクター対照に対する実験群のタバコ植物におけるＢＳＣＴＶ含有量を、２^{（−ΔΔＣＴ）}法により算出した：
（１）各群のＢＳＣＴＶ含有量を正規化した：
ウイルス含有量＝２^{（ＣＴ（内部ＰＰＲ）−ＣＴ（ＢＳＣＴＶ））}
（２）対照群に対する実験群のウイルス含有量は、ウイルス含有量_実験／ウイルス含有量_対照であった。結果を、エクセルで統計的に解析した。

タバコ植物の各群におけるＢＳＣＴＶの相対含有量を、図１に示した。ｐＨＳＮ４０１対照と比較して、実験群におけるＢＳＣＴＶの相対含有量が低いことが分かる。統計的な解析の際に、Ｐ＜０．０５の有意水準を示すＶ４およびＶ９を除くすべての実験群が、空ベクター対照と比較してＰ＜０．０１の水準での有意差を有する。ｐＨＳＮ４０１対照群におけるタバコ植物は、明らかなＢＳＣＴＣ感染症状を示した。Ｖ４およびＶ９の植物も明らかなＢＳＣＴＣ感染症状を示したが、この症状は対照植物よりも良好であった。最も有意な差を有するＶ７およびＶ８の植物は、ウイルスに対する強い抵抗能力を示す正常な表現型を示した。植物におけるＢＳＣＴＶの相対含有量は、病害の表現型と整合することが判明した（代表的な表現型を有するタバコ植物を、図２に示した）。

Claims

ＤＮＡウイルスに対する改善された抵抗能力を有する植物の製造方法であって、以下：
（１）抵抗すべきＤＮＡウイルスのゲノム配列から多数の標的配列を選択し、それぞれ該標的配列に対して逆相補的であるＤＮＡ断片を設計しかつ合成するステップ、ここで、該標的配列は、５’−Ｎ_Ｘ−ＮＧＧ−３’または５’−ＣＣＮ−Ｎ_Ｘ−３’の配列を有し、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴのうちのいずれか１つを表し、１４≦Ｘ≦３０であってかつＸは整数であり、Ｎ_Ｘは、Ｘ個の連続したデオキシリボヌクレオチドを表す、
（２）ステップ（１）で得た前記ＤＮＡ断片からＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現用ベクターを構築することにより、多数の組換えベクターを得るステップ、ここで、該組換えベクターは、ガイドＲＮＡを転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させることができ、該ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成により形成される回文構造を有するＲＮＡであり、該ｃｒＲＮＡは、前記ＤＮＡ断片から転写されたＲＮＡ断片を含む、
（３）前記組換えベクターをそれぞれレシピエント植物に導入し、該レシピエント植物から、前記ＤＮＡウイルスに対する改善された抵抗能力を有する植物を得るステップ
を含み、
前記ＤＮＡウイルスは、２本鎖ＤＮＡウイルスであるか、または中間体としての２本鎖ＤＮＡを有する１本鎖ＤＮＡウイルスである方法。
ＤＮＡウイルスに対する植物の抵抗能力を改善するための方法であって、以下（ａ）および（ｂ）：
（ａ）以下（ａ１）〜（ａ３）：
（ａ１）抵抗すべきＤＮＡウイルスのゲノム配列から多数の標的配列を選択し、それぞれ該標的配列に対して逆相補的であるＤＮＡ断片を設計しかつ合成するステップ、ここで、該標的配列は、５’−Ｎ_Ｘ−ＮＧＧ−３’または５’−ＣＣＮ−Ｎ_Ｘ−３’の配列を有し、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴのうちのいずれか１つを表し、１４≦Ｘ≦３０であってかつＸは整数であり、Ｎ_Ｘは、Ｘ個の連続したデオキシリボヌクレオチドを表す、
（ａ２）ステップ（ａ１）で得た前記ＤＮＡ断片からＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現用ベクターを構築することにより、多数の組換えベクターを得るステップ、ここで、該組換えベクターは、ガイドＲＮＡを転写しかつＣａｓ９タンパク質を発現させることができ、該ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成により形成される回文構造を有するＲＮＡであり、該ｃｒＲＮＡは、前記ＤＮＡ断片から転写されたＲＮＡ断片を含む、
（ａ３）前記組換えベクターをそれぞれレシピエント植物（１）に導入し、該レシピエント植物（１）から、前記ＤＮＡウイルスに対する改善された抵抗能力を有する植物を得て、ここで該植物を目的植物と命名するものとし、該目的植物に導入された前記組換えベクター中のＤＮＡ断片を目的ＤＮＡ断片と特定するステップ
を含む方法により、目的ＤＮＡ断片を得るステップ、
（ｂ）前記目的ＤＮＡ断片から、ステップ（ａ２）および（ａ３）にしたがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現用ベクターを構築し、かつ得られた該組換えベクターをレシピエント植物（２）に導入し、それにより前記ＤＮＡウイルスに対する該レシピエント植物（２）の抵抗能力を改善するステップ
を含み、
前記ＤＮＡウイルスは、２本鎖ＤＮＡウイルスであるか、または中間体としての２本鎖ＤＮＡを有する１本鎖ＤＮＡウイルスであり、前記レシピエント植物（１）と前記レシピエント植物（２）とは、同一であっても異なってもよい方法。
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現用ベクターが、ｐＨＳＮ４０１ベクターである、請求項１または２記載の方法。
前記組換えベクターが、前記ｐＨＳＮ４０１ベクターの２つのＢｓａＩ部位の間に前記ＤＮＡ断片を挿入することにより得られる組換えプラスミドである、請求項３記載の方法。
Ｘが２０である、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
前記植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
前記双子葉植物がタバコである、請求項６記載の方法。
前記ＤＮＡウイルスがジェミニウイルスである、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
前記ジェミニウイルスがビートシビアカーリートップウイルス（Ｂｅｅｔｓｅｖｅｒｅｃｕｒｌｙｔｏｐｖｉｒｕｓ）である、請求項８記載の方法。