JP2018505210A - タンパク質製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、特に前記タンパク質が別の分子と結合されるべきである場合、特に、例えば治療用の、タンパク質を得るための工業的なタンパク質の製造において、タンパク質を製造するための新規な方法を提供することにより、上記に同定された必要性を解決する。
第1の実施形態では、本発明は、
a)宿主細胞中でタンパク質を発現させる工程、
b)前記宿主細胞および他の夾雑物を含有する混合物から前記タンパク質を精製する工程であって、前記精製は、少なくとも1つのクロマトグラフィー工程を含み、還元剤が前記混合物に添加され、第1のクロマトグラフィー工程から最後のクロマトグラフィー工程まで前記タンパク質は、前記の前記還元剤の存在下で維持される、
前記タンパク質を製造する方法を提供する。
前のセクションで説明したように、第1のクロマトグラフィー工程は、一般に、さらなる不純物、典型的には残留工程及び製品関連不純物を除去するのを助けるための、1つ以上の後続のクロマトグラフィー工程が続く。一般に、このような工程は、ゲル濾過クロマトグラフィー、陽イオンクロマトグラフィー、アニオンクロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよび疎水性電荷誘導クロマトグラフィーを使用するための適切な官能性を有する固相を使用する非親和性クロマトグラフィー工程を用いる。これらは、結合および溶出モードまたは通過画分(フロースルー)モードで操作することができる。通過画分モードでは、不純物は固相に結合するか、固相で移動度が減少し、一方標的タンパク質は、溶出又は通過画分で回収される。
精製方法は、標的タンパク質の物理化学的性質に適合するために、これらのステップのいずれかを様々な組み合わせで含むことができる。本発明の方法に従って使用できる特定の精製方法は、WO2012/013682号に開示されているものである、その全体が本明細書に組み込まれている。
当業者に利用可能な多数の還元剤が存在する。最も好適な還元剤は、例えば、回収されたタンパク質サンプル中の標的チオールの還元状態を決定することによって経験的に決定され得、例えば、Lyons et al. 1990, Protein Engineering 3,703に記載されているような遊離チオールアッセイを用いられる。また、最も好適な還元剤は、回収されたタンパク質サンプルにおける望ましくない分子内及び分子間ジスルフィド結合の量を決定する手段によって選択されてもよく、あるいは、分析サイズ排除または逆相HPLC(高速液体クロマトグラフィー)により、回収された所望の反応タンパク質分子量を測定することにより選択されてもよい。
サイズ排除HPLCは、小分子がカラムを流れる分子量に基づいて粒子をより小さいものよりも早く分離する。一方、逆相HPLCは、疎水性相互作用の原理で作動して、固定相上のリガンドと会合すると、分子の固定相への結合は分子の非極性セグメントの周囲に配置されている接触表面積に比例し;極性が低い分子については、保持時間が長くなる。両方の場合において、ジスルフィド結合の存在または不在は、異なる溶出プロフィールを有する種をもたらす。
疑いを避けるために、本明細書で言及されるグルタチオンの用語は、CAS番号70−18−8で定義される単量体または還元グルタチオン単量体を意味する。
当業者に知られている溶液から還元剤を除去するための異なる方法があり、そのいずれもが現在のプロセスに適していてもよく、透析濾過、ゲル濾過、透析又はさらなるクロマトグラフィー工程が挙げられる。本願方法の別の態様において、還元剤はタンパク質試料から透析濾過で除去される。
一般に、タンパク質を別の分子に結合させるプロセスは、溶媒中で行われ、例えば、リン酸塩、クエン酸塩または酢酸塩などの水性バッファーが用いられる。典型的には、これは、タンパク質が、透析濾過又はゲル濾過によって転送される。反応は、一般に、任意の適切な温度、例えば約5℃〜約70℃で実施することができる、例えば、室温、すなわち20℃、21℃または22℃であるバッファーは、必要に応じて、EDTA、EGTA、CDTAまたはDTPAなどのキレート化剤を含有し得る。あるいはまた、バッファーは、クエン酸、シュウ酸、葉酸、ビシン、トリシン、またはTrisのようなキレート化バッファーであってもよい。分子は、一般に、タンパク質の濃度に対して少なくとも等モル濃度、すなわち少なくとも1:1である。典型的には、タンパク質の濃度に対して過剰な濃度で使用される。典型的には、分子は、1〜100倍モル過剰で使用される、1.1,1.5,2,3,5,10又は50倍モル過剰である。好適な濃度のさらなる例は、1.2,1.25,1.3及び1.4倍モル過剰である。あるいは、2以上のタンパク質が単一分子に結合されている場合には、前記分子は過剰でなくてもよい、例えば、タンパク質に対する分子の比は、0.1〜1であり得、好ましくは0.5であり得る。反応の持続時間は、当業者が経験的に決定することができ、典型的には1〜20時間である。一実施形態では、反応は17時間の期間にわたって行われる。
前記カップリングは、1つ以上のシステインを介して行うことができる。当業者は、カップリングに利用可能なタンパク質中のシステインの数を経験的に立証することができる、例えば、タンパク質が還元剤で処理された後に生成される遊離チオールの数を決定することによって達成される。遊離チオールの数を決定する方法は、当該技術分野で周知である、例えば、Lyons et al.,1990,Protein Engineering,3,703を参照されたい。あるいは、当業者は、上記反応から得られた種を、例えば、分析逆相またはサイズ排除HPLCによって分析することができる。あるいは、種々の遺伝子工学又はタンパク質工学技術を用いてタンパク質を修飾して、結合部位として使用するためにタンパク質にシステインを導入してもよい。したがって、カップリングに使用されるシステインは、タンパク質中に自然に発生し得るか、および/または組換えDNA技術によってタンパク質に設計され得る。したがって、結合に利用可能なシステインの数および位置は、たんぱく質の用途と必要とされる共役分子の数とに依拠して、具体的に制御することができる。
本発明の方法の別の実施形態では、タンパク質はシステイン残基を介して2以上の分子に結合される。
さらに別の実施形態では、前記Fab’は、TNFαに特異的に結合する。さらなるより具体的な実施形態では、TNFαに特異的に結合するFab’は、WO01/094585号に開示されているようにCDP870であり、その全体が本明細書に組み込まれる。
当業者は知っているように、所望の効果に応じて、前記抗体または抗原結合断片を異なる分子に結合させることができる。このような抗体または抗原結合断片は、例えば、抗腫瘍剤、薬物、毒素または生物学的に活性なペプチドに結合することができる。一方、前記抗体または抗原結合断片は循環中の半減期を増加させるように不活性体、例えばアルブミンのような天然に存在するタンパク質、またはポリエチレングリコール(PEG)などの合成ポリマーと結合していてもよい。
PEG分子は、エチレンオキシドの重合から得られ、300Da〜10,000,000Daの広い範囲の分子量で市販されている。本発明の特定の実施形態によるPEG分子は、市販又は公知の方法で化学的に合成された直鎖状又は分岐状であってもよい。異なる分子量を有するPEG分子は、異なる用途において使用され、鎖長効果による粘度等の物性が異なる一方、それらの化学的性質は大きく変化しない。ポリマーの大きさは、特に、腫瘍のような特定の組織に局在化したり、循環半減期を延長させたりする能力などの製品の意図された用途に基づいて選択することができる(Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545を参照されたい)。例えば、製品が循環から離れ、組織を貫通することが意図され、例えば腫瘍の治療に使用する場合、低分子量、例えば約5000Daの分子量のポリマーを使用することが有利であり得る。製品が循環中に残る場合、より高い分子量、例えば25,000Da〜40,000Daの分子量のポリマーを使用することが有利であり得る。
PEG分子は市販されているか、またはポリアルキレングリコール化合物またはその誘導体として合成することができ、その際カップリング剤またはカップリングまたは活性化基を有する誘導体(例えば、チオール、トリフレート、トレシレート(tresylate)、アザジン、オキシラン、または好ましくはマレイミド基例えば、PEG−マレイミド)を用いて又は用いないで合成できる。他の適切なポリアルキレングリコール化合物としては、マレイミドモノメトキシPEG、活性化されたPEGポリプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されるものではない、それ以外にも、以下のタイプの荷電または中性のポリマーも含む:デキストラン、コリン酸、または他の炭水化物系ポリマー、アミノ酸のポリマー、およびビオチンおよび他の親和性試薬誘導体。PEG部分を結合することは、しばしば、PEG化と呼ばれ、タンパク質をPEG分子と反応させるプロセスをいい、このような反応の結果として、PEG分子は、前記タンパク質に共有結合される。
本発明の方法のさらなる実施形態では、PEG分子は、マレイミド基を介してタンパク質上の単一のシステインに共有結合する。
本発明の方法の第12の実施形態では、前記PEG分子は、40,000PEG−マレイミドである。
特定の実施形態では、前記PEG分子は、分岐40,000PEG−マレイミドである。特に、前記PEG分子は2分枝を有する。
さらなる特定の実施形態では、前記PEG分子に結合されたタンパク質は抗体またはその抗原結合断片であり、特に前記タンパク質はFab’である。
本発明の方法の特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片を2つ以上のPEG分子に結合させる。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、1つまたは両方の重鎖上にPEG化される、または1つまたは両方の軽鎖上または重鎖および軽鎖の両方にPEG化されてもよい。
a)抗体またはその抗原結合断片を発現するような条件下で宿主細胞を培養する工程、そして
b)宿主細胞および他の不純物を含む混合物から、その抗体またはその抗原結合断片を精製する工程であって、ここで前記精製は、少なくとも1つのクロマトグラフィー工程を含み、還元剤を前記混合物に添加し、前記抗体またはその抗原結合断片を、前記第1のクロマトグラフィー工程から最後のクロマトグラフィー工程までの前記還元剤の存在下で維持する、工程
c)抗体またはその抗原結合断片にPEGを添加する工程、そして
d)PEGに結合された抗体またはその抗原結合断片を回収する工程
を含む。
あるいは、本発明は、タンパク質を精製する方法に関し、前記タンパク質は、前記タンパク質を発現するような条件下、宿主細胞中で発現され、前記宿主細胞と他の不純物を含む混合物から前記タンパク質を精製することを含み、前記精製は、少なくとも1つのクロマトグラフィー工程を含み、還元剤が前記混合物に添加され、前記タンパク質は、前記第1のクロマトグラフィー工程から最後のクロマトグラフィー工程までの前記還元剤の存在下で維持される、精製方法に関する。
哺乳動物細胞は、組換えタンパク質の増殖および発現を支持する任意の培地中で培養することができ、好ましくは、培地は、動物由来の製品、例えば動物血清およびペプトンを含まない化学的に規定された培地である。ビタミン、アミノ酸、ホルモン、成長因子、イオン、バッファー、ヌクレオシド、グルコースまたは等価エネルギー源の異なる組み合わせを含む細胞培養培地、は当業者には利用可能であり、適切な濃度で存在させて、細胞の増殖およびタンパク質の産生を可能にする。さらなる細胞培養培地成分は、当業者に知られている細胞培養サイクル中に、異なる時期に適切な濃度で細胞培養培地に含まれ得る。
哺乳動物細胞培養は、振とうフラスコまたはバイオリアクターなどの任意の適切な容器中で行うことができ、必要とされる生産規模に応じて、流加培養(fed−batch)方式で動作させても、させなくてもよい。これらのバイオリアクターは、攪拌タンクまたはエアリフト反応器のいずれであってもよい。様々な大規模なバイオリアクターは、1,000L〜50,000Lの容量より大きく、好ましくは5,000L〜20,000L、又は〜10,000Lの容量で利用可能である。あるいは、2Lと100Lの間のようなより小さなスケールのバイオリアクターを、本発明の方法に従って抗体または抗体断片を製造するためにも使用することができる。
したがって、本発明の特定の実施形態では、この方法は、タンパク質精製前に遠心分離および上清回収のステップを含む。さらに特定の実施形態では、前記遠心分離は連続的な遠心分離である。疑いを避けるために、上清は、細胞培養物の遠心分離に起因する沈降細胞の上に位置する液体を意味する。
自然分泌経路に依存することにより、または外膜の限定された漏出を誘発することによってタンパク質分泌を引き起こして、タンパク質を上清に向かわせる。その例は、pelBリーダー、タンパク質Aリーダー、バクテリオシン放出タンパク質の共発現、培地へのグリシンの添加に伴うマイトマイシン誘発性バクテリオシン放出タンパク質、及び膜透過化のためのkil遺伝子の共発現の使用である。最も好ましくは、本発明の方法において、組換えタンパク質は、宿主大腸菌のペリプラズム中で発現される。
宿主細胞のペリプラズム空間に抗体断片などの目的のタンパク質が見出される大腸菌発酵プロセスにおいて、宿主細胞からタンパク質を放出させることが必要である。放出は、機械的または圧力処理による細胞溶解、凍結融解処理、浸透性ショック、抽出剤または熱処理などの任意の適切な方法によって達成することができる。タンパク質放出のためのこのような抽出方法は、当該技術分野で周知である。特定の実施形態では、本発明の方法は、タンパク質精製の前に追加のタンパク質抽出ステップを含む。より特定の実施形態では、前記タンパク質抽出ステップは、還元剤の存在下で行われる。
好ましい実施形態では、抽出バッファーを試料に添加し、次いで、試料を熱処理工程にかける。熱処理工程は、米国特許第5,655,866号明細書に詳細に記載されているようなものであることが好ましく、この熱処理工程により、他の抗体関連物質の除去を容易にすることにより、正確に折り畳まれ、組み立てられた抗体断片の可溶な試料を得ることができる。
熱処理工程は、長期間行われることが好ましい。熱処理の長さは1〜24時間であることが好ましい、より好ましくは4〜18時間であり、さらに好ましくは6〜16時間であり、10〜14時間または10〜12時間、例えば12時間の間であることが最も好ましい。これにより、最小限の熱処理時間が1,2又は3時間であり、最大は20時間、22時間又は24時間である。
特定の実施形態では、熱処理は、50℃〜60℃で10〜16時間行われる、より好ましくは59℃で10〜12時間である。当業者は、問題のサンプルおよび生成される抗体の特性に適合するように、温度および時間を選択することができることを理解するであろう。
さらなる特定の実施形態では、本発明の方法は、抽出工程に続いてそして前記混合物から前記タンパク質を精製する前に、目的のタンパク質を含有する混合物のpHを調整するステップを含むことができる。
本発明の方法のさらなる特定の実施形態では、熱処理工程中に存在する還元剤はグルタチオン、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンシステインおよびこれらの組み合わせから選択される。
本発明の方法のさらなる特定の実施形態では、熱処理工程中に存在する還元剤は、0.1mM〜100mMグルタチオンである。還元剤の量は、製造するタンパク質に応じて調節することができる。本発明のさらなる特定の実施形態では、前記グルタチオンは0.5mM〜80mM、1mM〜50mM、1mM〜25mM、好ましくは1mM〜10mMの量で存在する。
本明細書で使用される“抗体(単数)”または“抗体(複数)”という用語は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体をいう。本明細書で使用される“抗体(単数)”または“抗体(複数)”という用語は、当該技術分野で知られているように、組換え技術によって生成される組換え抗体を含むが、これらに限定されない。“抗体”または“抗体”は、任意の種、特に哺乳動物種の抗体;IgA1、IgA2、IgD、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE及びIgM及びその改変変異体を含む任意のアイソタイプのヒト抗体などのヒト抗体;非ヒト霊長類抗体(例えばチンパンジー、ヒヒ、アカゲザルまたはカニクイザル);非ヒト霊長類抗体(例えばマウス、ラットまたはウサギからの齧歯類抗体;ヤギまたはウマ抗体;およびラクダ抗体(例えば、ナノボディ(商標)などのラクダまたはリャマ)およびそれらの誘導体;ニワトリ抗体のような鳥種またはサメ抗体のような魚種のいずれかである。
用語“抗体”または“抗体”はまた、少なくとも1つの重鎖及び/又は軽鎖抗体配列の第一の部分が第一の種由来であり、重鎖及び/又は軽鎖抗体配列の第二部分が第二の種からのものであるキメラ抗体を指す。本明細書中の目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、アカゲザル、カニクイザルなど)由来の可変ドメインの抗原結合配列及びヒト定常領域列を含む“霊長類化された”抗体を含む。“ヒト化”抗体は、非ヒト抗体由来の配列を含むキメラ抗体である。大部分は、ヒト化抗体は、その超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性および活性を有する、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域(または相補性決定領域(CDR))の残基で置換されているヒト抗体(レシピエント抗体)である。
多くの場合、CDRの外側のヒト(レシピエント)抗体の残基、ようするにフレームワーク領域(FR)は、対応する非ヒト残基にさらに置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに改善するためになされる。ヒト化は、ヒトにおける非ヒト抗体の免疫原性を減少させ、従って、ヒト疾患の治療に対する抗体の適用を容易にする。ヒト化抗体およびそれらを生成するためのいくつかの異なる技術が当該技術分野で周知である。“抗体(単数)”または“抗体(複数)”という用語は、ヒト化の代替として生成することができるヒト抗体も指す。
このような生殖系列突然変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の移植は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニック動物を特定抗原で免疫する際に、特定抗原に対する特異性を有するヒト抗体の産生をもたらす。このようなトランスジェニック動物を製造するための技術およびそのようなトランスジェニック動物からヒト抗体を単離および産生するための技術は、当該技術分野で知られている。
前記トランスジェニック動物、例えば、マウスにおいて、マウス抗体の可変領域をコードする免疫グロブリン遺伝子のみを、対応するヒト可変免疫グロブリン遺伝子配列に置換する。抗体定常領域をコードするマウス生殖系列免疫グロブリン遺伝子は変化しないままである。このようにして、抗体エフェクターは、本発明の免疫系において機能し、その結果、B細胞の発現は本質的に変化せず、生体内での抗原刺激に対する抗体応答の改善につながる可能性がある。対象の特定の抗体をコードする遺伝子がこのようなトランスジェニック動物から単離されると、定常領域をコードする遺伝子を、完全なヒト抗体を得るためにヒト定常領域遺伝子に置換することができる。インビトロでヒト抗体/抗体フラグメントを得るための他の方法は、ファージディスプレイ技術またはリボソームディスプレイ技術のようなディスプレイ技術に基づき、少なくとも部分的に人為的にまたはドナーの免疫グロブリン可変(V)ドメイン遺伝子レパートリーから生成される組換えDNAライブラリーが使用される。ヒト抗体を生成するためのファージおよびリボソームディスプレイ技術は、当該技術分野で周知である。ヒト抗体はまた、対象の抗原でex vivo免疫化され、続いて融合されてハイブリドーマを生成する単離されたヒトB細胞からも生成され得、次いでハイブリドーマは最適なヒト抗体についてスクリーニングされ得る。
あるいは、実験規模に応じて、元のバッファーを新たなバッファーに置き換える手段としてゲル濾過(重力下で操作されるセファデックスG−25脱塩カラムなど)を使用してもよい。この場合、樹脂細孔よりも大きい分子が樹脂細孔から排除され、固相を速く移動する一方、小さい分子は樹脂細孔内に拡散し、それ故よりゆっくりと保持され、よりゆっくりと固相を移動する場合に、バッファー置換が起こる。所望のタンパク質のようなより大きな分子は、樹脂平衡化バッファー中に溶出した画分に回収される。
Fab’1(部位特異的なPEG化を目的とする単一のヒンジチオールを含むFab’抗体断片)が大腸菌W3110宿主細胞において異種タンパク質として発現され;pH7.4に調整した100mM Tris/10mM−EDTAバッファーを添加し、57.5℃で加熱処理することにより、異種タンパク質が宿主細胞のペリプラズム空間から放出された。細胞物質を遠心分離により除去し、pH4.5の酢酸を添加して異種タンパク質を含む細胞抽出物を調整した。遠心分離と0.2μm濾過の組み合わせを用いてpH調整した細胞抽出液を清澄化した。次いで、清澄化された抽出物(供給流)を約6.0mS/cmの導電率を目標にして、水で希釈した。
得られたFab’1含有溶出液を、10kDaの公称分子量カットオフを有するポリエーテルサルフォン系限外濾過膜(Tシリーズ膜(Pall社製))を用いて限外濾過し、約5倍に濃縮し、pH8.2に調整された20mMTrisバッファーの約8容量に対して透析濾過した。Fab’1プールを、GEヘルスケア社のCatqo(商標)アニオン交換クロマトグラフィーカラム[デキストランリンカーを介して結合された四級アミンアニオン交換リガンド(イオン性容量0.16〜0.22mmolCl−/ml)を含む高度に架橋された剛性アガロースゲルビーズ(平均粒径90μm)]にロードした。カラムはタンパク質ロードの前に、pH8.2に調整された20mMTrisバッファーで平衡化されていた。
CDP870Fab’を、大腸菌w3110宿主細胞において異種タンパク質として発現させ、pH7.4に調整した100mM Tris/10mM−EDTAバッファーを添加し、59℃の熱処理を行うことにより、宿主細胞のペリプラズム空間から異種タンパク質を放出させた。
遠心分離により細胞材料を除去し、酢酸を添加して、異種タンパク質を含む細胞抽出物をpH4.5に調整した。次いで、pH調整された細胞抽出物を、遠心分離と0.2μm濾過との組み合わせを用いて清澄化した。カラムは、供給流をロードする前、酢酸でpH4.5に調整された6カラム容量の50mM酢酸ナトリウムバッファーで平衡化されていた。
清澄化された抽出物(供給流)を水で約4mS/cmの目標導電率まで希釈し、1mMグルタチオンを補充した。
得られたFab’1含有溶出液を、10kDaの公称分子量カットオフを有するポリエーテルサルフォン系限外濾過膜(Tシリーズ膜(Pall社製))を用いて限外濾過し、容積が約半分になるよう濃縮し、pH8.5に調整された1mMグルタチオンを含有する20mM Trisバッファーに対して透析濾過した。バッファーの7倍量が透析濾過に用いられた。
CDP870Fab’を、大腸菌w3110宿主細胞において異種タンパク質として発現させ、pH7.4に調整し、1mMグルタチオンを含有した100mMTris/10mM−EDTAバッファーを添加し、59℃で熱処理を行い、宿主細胞のペリプラズム空間から異種タンパク質を放出させた。遠心分離により細胞材料を除去し、酢酸を添加することにより、異種タンパク質を含む細胞抽出物をpH4.5に調整した。次いで、pH調整された細胞抽出物を0.2μM濾過により、清澄化した。
清澄化された抽出物(供給流)を水で4mS/cmの目標導電率まで希釈し、1mMグルタチオンを補充した。
20kDaの2分枝を有する40kDaPEG−マレイミド(ビス(メトキシポリ(エチレングリコール)のマレイミドプロピオンアミド、修飾リシン、Nektar Therapeutics株式会社、カリフォルニア、US)を回収されたタンパク質に、CDP870Fab’:PEGモル比で1:1.4及び1:2で添加し、そして18−22℃で17時間反応させた。
逆相HPLCクロマトグラフィーによって決定されるようなPEG化効率は、CDP870Fab’:PEGモル比1:1.4及び1:2でそれぞれ、74%および74.4%のCDP870Fab’−PEGモノマーの生成を明らかにした。
Fab’1(部位特異的なPEG化を目的とする単一のヒンジチオールを含むFab’抗体断片)が大腸菌W3110宿主細胞において異種タンパク質として発現され;pH7.4に調整した1mMグルタチオンを含有する100mMTris/10mM−EDTAバッファーを添加し、57.5℃で加熱処理することにより、異種タンパク質が宿主細胞のペリプラズム空間から放出された。細胞物質を遠心分離により除去し、pH4.5の酢酸を添加して異種タンパク質を含む細胞抽出物を調整した。遠心分離と0.2μm濾過の組み合わせを用いてpH調整した細胞抽出液を清澄化した。次いで、清澄化された抽出物(供給流)を約6.0mS/cmの導電率を目標にして、水で希釈した(希釈率約4)。
得られたFab’1含有溶出液を、10kDaの公称分子量カットオフを有するポリエーテルサルフォン系限外濾過膜を用いて限外濾過し、容積が約四分の1になるよう濃縮し、8倍量のpH8.2に調整された1mMグルタチオンを含有する20mMTrisバッファーに対して透析濾過した。
カラムにローディング後、pH8.2に調整した1mMグルタチオンを含有する20mMTrisバッファーを用いてカラムを洗浄した。Fab’1は、ローディングおよび洗浄工程に起因する通過画分中に回収された。
Fab’1溶出液を回収し、20kDaの2分枝を有する40kDaPEG−マレイミド((3−ビス(メチルポリオキシエチレン−オキシ)−1−(3−(6−マレイミド−1−オキソヘキシル)]−1−(3−(6−マレイミド−1−オキソヘキシル))アミノ]プロピルオキシ)プロパン、NOF株式会社、東京、日本)をFab’1−PEGモル比1:2になるよう加え、20℃で17時間反応させた。
Fab’1(部位特異的なPEG化を目的とする単一のヒンジチオールを含むFab’抗体断片)が大腸菌W3110宿主細胞において異種タンパク質として発現され;pH7.4に調整した100mM Tris/10mM−EDTAバッファーを添加し、57.5℃で加熱処理することにより、異種タンパク質が宿主細胞のペリプラズム空間から放出された。細胞物質を遠心分離により除去し、pH4.5の酢酸を添加して異種タンパク質を含む細胞抽出物を調整した。遠心分離と0.2μm濾過の組み合わせを用いてpH調整した細胞抽出液を清澄化した。次いで、清澄化された抽出物(供給流)を水で希釈して、6.0mS/cmの導電率にした。
カラムをロードした後、酢酸でpH4.5に調整した50mM酢酸ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄して、全ての未結合物質が洗浄除去した。Fab’1含有画分は、酢酸でpH4.5に調整された50mM酢酸ナトリウムおよび190mM NaClで溶出された。
Fab’1プールを、GEヘルスケア社のCatqo(商標)アニオン交換クロマトグラフィーカラム[デキストランリンカーを介して結合された四級アミンアニオン交換リガンド(イオン性容量0.16〜0.22mmolCl−/ml)を含む高度に架橋された剛性アガロースゲルビーズ(平均粒径90μm)]にロードした。カラムはタンパク質ロードの前に、pH8.2に調整された20mMTrisバッファーで平衡化されていた。
回収されたFab’1を含有するアニオン交換クロマトグラフィー溶出液を、10kDaの公称分子量カットオフを有するポリエーテルサルフォン系限外濾過膜を用いて限外濾過し、20mg/mlになるよう濃縮し、2mM EDTAを含む0.1Mリン酸バッファーpH6.8に透析濾過した。
さらに、pH4.5に調整された20mM酢酸ナトリウムバッファーへの限外濾過/透析濾過を同じ膜上で行い、PEG化のための調製のために還元剤を除去した。
20kDaの2分枝を有する40kDaPEG−マレイミド((3−ビス(メチルポリオキシエチレン−オキシ)−1−(3−(6−マレイミド−1−オキソヘキシル)]−1−(3−(6−マレイミド−1−オキソヘキシル))アミノ]プロピルオキシ)プロパン、NOF株式会社、東京、日本)を回収したFab’1タンパク質にFab’:PEG重量対重量比で1:1.25になるよう加え、20℃で17時間反応させた。
Claims (13)
- タンパク質の製造方法であって;
a)該タンパク質を発現するような条件下で宿主細胞を培養する工程、および
b)宿主細胞および他の夾雑物を含有する混合物から該タンパク質を精製する工程であって;ここで精製工程は、少なくとも1つのクロマトグラフィー工程を含み、還元剤が該混合物に添加され、第1のクロマトグラフィー工程から最後のクロマトグラフィー工程まで該タンパク質は、還元剤の存在下で維持される、工程を含む、
上記製造方法。 - 還元剤が、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン、システイン及びそれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載の方法。
- 還元剤が0.1mM〜100mMグルタチオンである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記還元剤は、前記回収されたタンパク質から除去される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が別の分子に結合されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質は、タンパク質のシステイン残基に対する共有結合を介して別の分子に結合される、請求項5に記載の方法。
- 前記方法は、別の分子に結合された前記タンパク質を回収することをさらに含む、請求項5又は6に記載の方法。
- 前記タンパク質が抗体またはその抗原結合断片である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原結合断片がFab'である、請求項8に記載の方法。
- 前記抗体又は抗原結合断片の前記システイン残基が、抗体ヒンジにある、請求項8又は9に記載の方法。
- 前記分子はポリエチレングリコール(PEG)分子である、請求項5〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PEG分子が40,000PEG−マレイミドである、請求項11に記載の方法。
- 前記PEG分子に前記システインを介して結合している前記タンパク質を回収することをさらに含む、請求項11また12に記載の方法。
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