JP2018503632A - 非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害またはがんの治療のためのプロテアソーム阻害剤 - Google Patents
非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害またはがんの治療のためのプロテアソーム阻害剤 Download PDFInfo
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Abstract
Description
− 一方では、MG132は、自食作用およびしたがってタンパク質分解を誘導し、かつ
− 他方では、MG132は、プロジェリンmRNAに繋がるプレラミンA mRNAスプライシングに関与する、SRSF1と呼ばれる転写因子の量を減少する(32)
本明細書で使用する場合、「プロテアソーム阻害剤」と言う語は、プロテアソームの酵素活性をブロックする化合物である。哺乳類の26S細胞質ゾルおよび核のプロテアソームは、1つの20Sタンパク質分解コアおよび2つの19S調節キャップ(regulatory cap)サブユニットでできている(36)。20Sコアは、樽形の空洞を提供しその中でタンパク質が分解される。
本発明は、短縮型および/またはファルネシル化プレラミンAおよび/またはB型ラミン、あるいはLMNB1および/またはLMNB2の重複によって産生されたタンパク質などの、非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害を治療および/または予防するための使用のためのプロテアソーム阻害剤に関する。
− プレラミンAおよび/またはラミンBが、短縮型である、ならびに/あるいは
− プロジェリンおよび/またはプレラミンAおよび/またはラミンBが、ファルネシル化されている、ならびに/あるいは
− LMNA、LMNB1および/またはLMNB2が、重複している。
本発明は、i)細胞核における糸状PML−NBの検出、およびii)第2のパラメーターの検出を含む、対象の生物試料における、非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害、具体的には早期老化障害を診断するための方法にも関する。前記第2のパラメーターは、対象の老化の臨床症状、および/または生物試料におけるDNA切断の検出から選択され得る。
最後に、本発明は、上記で述べたような、かつがんを治療および/または予防するための、SRSF1を下方制御するプロテアソーム阻害剤にも関する。前記用途は、驚いたことに下記の実施例2において示される。
材料および方法
細胞培養
対照対象(8498:1歳男性、8471:60男性、731C:96歳男性)およびHGPS p.Gly608Gly突然変異を保有する患者(5968:5歳男性)からのヒト真皮線維芽細胞(皮膚生検から確立された線維芽細胞)は、マルセイユのティモンヌ病院(Timone Hospital of Marseille)、遺伝医学部門(Department of Medical Genetics)、生物遺伝資源機関(Biological Resource Center)(CRB TAC)による規定(A.Robaglia−SchluppおよびK.Bertaux)に従って調製および保存されていた。HGPS線維芽細胞(AG01972:14歳女性、AG11498:14歳男性)は、Coriell Cell Repositoryから取得した。細胞を、5%CO2を含有する加湿雰囲気中で37℃で15%ウシ胎児血清(Life Technologies)、2mMのL−グルタミン(Life Technologies)および1Xペニシリン−ストレプトマイシン(Life Technologies)を補ったダルベッコ変法イーグル培地(Life Technologies)において培養した。線維芽細胞を、MG132(474790。Merck Chemical LTD)、MG115(SCP0005。Sigma)、MG262(I−120−200。R&D Systems)、ボルテゾミブ(S1013。Euromedex)、カルフィルゾミブ(S2853。Euromedex)、クロロキン二リン酸塩結晶(C6628。Sigma)、バフィロマイシンA1(B1793。Sigma)、カスパーゼ−6阻害剤Z−VEID−FMK(FMK006。R&D Systems)、パン−カスパーゼ阻害剤Z−VAD−FMK(FMK001。R&D Systems)およびレプトマイシンB(L2913。Sigma)の存在下または非存在下で培養した。
SRSF−1のノックダウンのために、HGPS細胞を、INTERFERin(Polyplus Transfection)を用いて10nM siRNAでトランスフェクトした。HGPS細胞を、トランスフェクションの前日に6ウェル培養容器において100000〜200000細胞で播種した。22pmoleのsiRNAを、8μlのINTERFERin試薬と混合した、200μlの無血清DMEM培地に希釈した。管を、10秒ボルテックスして室温で10分間インキュベートした。トランスフェクション混合物を、血清含有DMED培地中の細胞に加えた。培地を4時間後に交換して細胞を37℃、5%CO2で48時間インキュベートした。SRSF−1 siRNA(AM16708)は、Thermo Fisher Scientificから購入した。
調査において用いた抗体には、
ウサギ 抗ラミンA/Cポリクローナル抗体(SC−20681、ウエスタンブロット解析のために1:1000希釈でおよび免疫蛍光標識のために1:200で用いた。Santa Cruz Biotechnology,Inc.);マウス抗プロジェリンモノクローナル抗体(sc−81611、ウエスタンブロット解析のために1:1000希釈でおよび免疫蛍光標識のために1:200で用いた。Santa Cruz Biotechnology,Inc.);ウサギ抗PMLポリクローナル抗体(sc−9863−R、免疫蛍光標識のために1:200で用いた。Santa Cruz Biotechnology,Inc.);マウス抗PMLモノクローナル抗体(sc−966、免疫蛍光標識のために1:100で用いた。Santa Cruz Biotechnology,Inc.);ヤギ抗SP100ポリクローナル抗体(sc−16328、免疫蛍光標識のために1:50で用いた。Santa Cruz Biotechnology,Inc.);マウス抗HP1モノクローナル抗体(2HP−1H5−AS、免疫蛍光標識のために1:100で用いた。Euromedex);ウサギ抗ATRXポリクローナル抗体(sc−15408、免疫蛍光標識のために1:50で用いた。Santa Cruz Biotechnology,Inc.);抗DAXX(ab32140、免疫蛍光標識のために1:50で用いた。Abcam);ウサギポリクローナル抗CBP抗体(06−297、免疫蛍光標識のために1:200で用いた。Upstate);マウス抗ユビキチン抗体(PW8805、免疫蛍光標識のために1:10で用いた。Enzo);マウス抗モノ−およびポリユビキチン化複合体モノクローナル抗体(FK2、ウエスタンブロット解析のために1:1000で用いた。Enzo);ウサギ抗フィブリラリンポリクローナル抗体(ab5821、免疫蛍光標識のために1:100で用いた。Abcam);ヤギポリクローナル抗ラミンB1/B2抗体(sc6217、免疫蛍光標識のために1:100で用いた。Santa Cruz Biotechnology,Inc.);ヤギ抗エメリンポリクローナル抗体(sc−8086、免疫蛍光標識のために1:100で用いた。Santa Cruz Biotechnology,Inc.);マウス抗26Sモノクローナル抗体(65144、免疫蛍光標識のために1:1で用いた。Progen Biotechnic.);マウス抗Nup153モノクローナル抗体(ab93310、免疫蛍光標識のために1:10で用いた。Abcam);マウス抗p53モノクローナル抗体(ab26、免疫蛍光標識のために1:200で用いた。Abcam);ウサギ抗p62ポリクローナル抗体(ab37024、ウエスタンブロット解析のために1:1000でおよび免疫蛍光標識のために1:100で用いた。Abcam);ウサギ抗LC3Bポリクローナル抗体(#2775、ウエスタンブロット解析のために1:1000でおよび免疫蛍光標識のために1:400で用いた。Cell Signaling);ウサギ抗SQSTM1/p62ポリクローナル抗体(#5114、ウエスタンブロット解析のために1:1000でおよび免疫蛍光標識のために1:100で用いた。Cell Signaling);ウサギ抗ラミンCポリクローナル抗体(BP4505、免疫蛍光標識のために1:200で用いた。Acris Antibodies.GmbH);ウサギ抗SRSF1モノクローナル抗体(ab129108、ウエスタンブロット解析のために1:1000で用いた。Abcam);マウス抗グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼモノクローナル抗体(MAB374、ウエスタンブロット解析のために1:10000で用いた。Merck Millipore);マウス抗α−チューブリンモノクローナル抗体(T6074、ウエスタンブロット解析のために1:10,000で用いた。Sigma)またはマウス抗β−アクチンモノクローナル抗体(AC−40、ウエスタンブロット解析のために1:10,000で用いた。Sigma);ウサギ抗Sumo2/3ポリクローナル抗体(ab−3742、ウエスタンブロット解析のために1:1000で用いた。Abcam)が含まれた。
遠心分離によって集めた細胞を、サイトスピン(Shandon)を用いて遠心分離(300rpmで5分間)によってポリリジンでコートしたスライド上に塗布した。細胞を、次いでPBS pH7.2中2%(w/v)のパラホルムアルデヒドにおいて室温で10分間定着させた。スライドを、使用に先立って−80℃で保管した。細胞を、100μLの透過処理緩衝液(0.5%Triton X−100、50mM NaCl、300mMスクロース、20mM HEPES pH7.5、3mM MGCl2)を用いて室温で3分間透過処理した。非特異的な抗体結合を、PBS中3%のウシ血清アルブミン(w/v)(PBS−BSA)で30分間ブロックした。透過処理した細胞を、一次抗体と共に37℃で3時間インキュベートした。洗浄後、次いで細胞を、二次抗体(A11001、A11058、Life Technologies;1/400)と共に37℃で20分間インキュベートした。核を、Vectashield(Abcys)に希釈したDAPI(50ng/ml)で室温で10分間染色した。試料を、4%パラホルムアルデヒド中で5分間定着させた。染色した細胞を、Axioplan 2イメージング顕微鏡(Carl Zeiss)上で観察またはレーザー共焦点走査システム(Leica)に取り付けたNikon倒立顕微鏡によって検査した。全ての抗体を、それらの特異性および動作について個々の染色反応において試験した。一次抗体がない対照は、全て陰性であった。
3人のHGPS患者(AG01972、AG11498、5968)および2人の正常な個人(8471、8498)からの線維芽細胞を、10μM MG132、または同体積のビヒクル(DMSO、0.025%v/v)を含有するDMEM培地で48時間培養した。ラミンA/CまたはDAPIに関して染色した細胞を、Axioplan 2イメージング顕微鏡(Carl Zeiss)を用いて蛍光顕微鏡検査法によって検査した。異常核の形態学の定量化のために、正常核(滑らかな楕円形状を有する核)および異常核(小疱、不規則形状、または複数の折りたたみを有する核)の割合を、手動ブラインド計数によって計算した。それぞれの細胞株について少なくとも200個の線維芽細胞核を、無作為に選択して2つの独立した実験において検査した。結果を、計数した全核の平均割合として図示で示す。
全RNAを、RNeasy plus extraction kit(Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア)を用いて単離した。1μgのRNAを、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)を用いて逆転写した。リアルタイムPCR増幅を、プログラム:50℃で2分間のUNGインキュベーション、95℃で10分間の初期変性、40サイクルの増幅:95℃で15秒間の変性および60℃で1分間のアニーリングを用いてGAPDH(Hs00266705_g1)、プロジェリン(F:ACTGCAGCAGCTCGGGG(配列番号3)R:TCTGGGGGCTCTGGGC(配列番号4)およびプローブ:CGCTGAGTACAACCT(配列番号5))、ラミンA(F:TCTTCTGCCTCCAGTGTCACG(配列番号6)R:AGTTCTGGGGGCTCTGGGT(配列番号7)およびプローブ:ACTCGCAGCTACCG(配列番号8))ならびにラミンC(F:CAACTCCACTGGGGAAGAAGTG(配列番号9)R:CGGCGGCTACCACTCAC(配列番号10)およびプローブ:ATGCGCAAGCTGGTG(配列番号11))(Applied Biosystems)のために予め設計したプライマーを用いてLightCycler 480(Roche、独国)上でTaqMan(登録商標)Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems)で実行した。全てのPCR反応を、三重に実施した。しきい値サイクル(Ct)値を、GAPDH発現に対する正規化を用いる2−ΔΔCT相対定量法によって相対的なmRNA発現を計算するために用いた。
全線維芽細胞タンパク質を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル(Thermo Scientific)を含有する200μLのNP40細胞溶解緩衝液(Invitrogen、カリフォルニア州、カールスバッド)において抽出した。あるいは、細胞を、尿素(8M尿素、5mMジチオスレイトール、150mM NaCl、50mM Tris−Cl pH7.5、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル(Thermo Scientific))で溶解した。細胞を、2回超音波処理し(それぞれ30秒)、4℃で30分間インキュベートし次いで10,000gで10分間遠心分離した。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸法(Pierce BCA Protein Assay Kit)で評価し、nanodrop 1000(Thermo Fisher Scientific Inc.)を用いて562nmにおける吸光度を測定した。等量のタンパク質(40μg)を、XT Tricine running Buffer(Biorad、米国)を用いて10%トリス−グリシンゲル(Tis−Glycine gel)(Criterion(商標)XT precast gel)上に充填した。電気泳動後、ゲルを、ニトロセルロース膜またはImmobilon−FLポリフッ化ビニリデン膜(Millipore)上に電気泳動転写させ、PBSに1:1希釈したODYSSEYブロッキングバッファー内に室温で1時間ブロックして、種々の一次抗体と共に4℃で一晩または室温で2時間インキュベートした。ブロットを、TBS−Tバッファー[20mMトリス(pH7.4)、150mM NaCl、および0.05%Tween 20]で洗ってOdysseyブロッキングバッファー(LI−COR Biosciences)中1:10,000のIR−Dye 800結合二次ロバ抗ヤギまたはIR−Dye 700結合二次抗マウス抗体(LI−COR Biosciences)と共にインキュベートした。IR−Dye 800およびIR−Dye 700検出のために、Odyssey Infrared Imaging System(LI−COR Biosciences)を使用した。GAPDH、α−チューブリンまたはβ−アクチンを、全細胞タンパク質充填対照として使用した。
Dynabeads Protein G Immunoprecipitation kit(Invitrogen)を用いて免疫沈降を行った。5μgのマウスモノクローナル抗プロジェリン抗体(Abcam)を、50μl(1.5mg)のDynabeadsに加えて室温で10分間回転させた。上清を除去してビーズ−抗体複合体を、5mMのN−エチルマレイミド(NEM、Thermoscientific)を含有するTween−20を含む200μLのPBSにおいて洗った。上清を除去してDynabeadsを、プロテアーゼ、ホスファターゼ阻害剤カクテル(Thermo Scientific)および5mMのNEMを含有するNP40細胞溶解緩衝液(Invitrogen)を用いて抽出した200μl細胞溶解物(200μgのタンパク質)と共にインキュベートし、管を室温で30分間回転させた。ビーズを、製造者の手順に従って3回洗った。タンパク質を、5mMのNEMを含有する20μlの溶出緩衝液で溶出した。SDS/PAGEおよび免疫ブロット法を上述の通りに実行した。
プロテアソーム活性を、培養細胞におけるプロテアソーム複合体と関連したキモトリプシン様、トリプシン様またはカスパーゼ様プロテアーゼ活性の測定を可能にするProteasome−Glo(商標)3−Substrate Cell−Based Assay System(Promega)を用いることによってHGPSおよび対照細胞において判定した。Proteasome−Glo(商標)Cell−Based Reagentは、それぞれ特異的な発光プロテアソーム基質を含有する。これらのペプチド基質は、それぞれ、キモトリプシン様、トリプシン様およびカスパーゼ様活性のためのSuc−LLVYアミノルシフェリン(スクシニル−ロイシン−ロイシン−バリン−チロシン−アミノルシフェリン)、Z−LRR−アミノルシフェリン(Z−ロイシン−アルギニン−アルギニン−アミノルシフェリン)およびZ−nLPnLD−アミノルシフェリン(Z−ノルロイシン−プロリン−ノルロイシン−アスパルテート−アミノルシフェリン)である。細胞(10,000細胞/ウェル)を、96−ウェルプレートにおいて100μl/ウェルで37℃、5%CO2で培養した。プレートを、22℃に平衡させてから100μl/ウェルの基質およびルシフェリン検出試薬を加えた。ウェルの内容物を、プレート振とう機を用いて700rpmで2分間混合して室温で10分間インキュベートした。プロテアソームによる切断後、ルシフェラーゼの基質(アミノルシフェリン)が放出され、ルシフェラーゼ反応の進行および光の生成を可能にする。発光を、GloMax−Multi Detection System:Luminometer(Promega、米国)を用いて相対発光量(RLU)として判定する。
老化を、Beta−Glo Assayキット(Promega)で、製造業者の説明に従って測定した。発光強度を、GloMax−Multi Detection System:Luminometer(Promega、米国)を用いて相対発光量(RLU)として判定した。
生存度および細胞毒性を、MultiTox−Fluor Multiplex Cytotoxicity Assay(Promega)で、製造業者の説明に従って測定した。MultiTox−Fluor Assayは、同時に2つのプロテアーゼ活性(1つは、蛍光発生性、細胞浸透性ペプチド基質(グリシル−フェニルアラニルアミノフルオロクマリン、GF−AFC)を用いる細胞生存度のマーカーであり、かつ他方は、細胞毒性のマーカー(ビスアラニル−アラニル−フェニルアラニル−ローダミン110、bis−AAF−R110)である)を測定する。生細胞および死細胞のプロテアーゼは、異なる励起および放出スペクトルを有し、それらを同時に検出することを可能にする、異なる産生物、AFCおよびR110を産生する。結果を、GloMax−Multi Detection System:Luminometer(Promega、米国)を用いて測定した相対蛍光単位(RFU)で示す。データは、3重に行った少なくとも3つの独立した実験の代表である。
細胞増殖率を、CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)で、製造業者の説明に従って測定した。吸光度を、GloMax−Multi Detection System:Luminometer(Promega、米国)で観察した。
リプログラミングによる誘導多能性幹細胞(iPS)の発生を、マルセイユ公立病院機構(Assistance Publique Hopitaux de Marseille)において実施されたHGPS患者生検から単離した線維芽細胞(13−8243)またはコーリエル医学研究所(Coriell Institute)(カムデン、米国)によって提供された(AG01972)線維芽細胞を用いて実行した。細胞株を、4つの転写因子、すなわちOct3/4、Sox2、c−Myc、およびKlf4のレトロウイルス介在トランスフェクションに基づいた山中の原法を用いてiPSCにリプログラミングした(41)。iPSC株を、分化前に最大で15代継代まで増幅した。
HGPS iPSCを、STOマウス線維芽細胞上で成長させて、10mg/mlのマイトマイシンCで不活性化し、30,000/cm2で播種して先述の通りに成長させた(42)。分化については、iPSCを、既刊の分化のために指導された手順を用いて間葉系幹細胞(MSC−iPSC)に分化した(43〜45)。CD31+細胞の蛍光活性化細胞分類(FACS)分離によってiPSCからVSMCを取得した(46)。
ヒトHGPS突然変異c.1824C>T(p.Gly609Gly)に相当する、内在性Lmna遺伝子内のc.1827C>T(p.Gly609Gly)突然変異を保有するノックインマウスモデル(LmnaG609G/G609G)は、これまでに記述されている(31)。MG132(1または10μg/体重Kg)を、8月齢の同型接合ノックインマウス(LmnaG609G/G609G)の右腓腹筋内に週3回2週間イソフルラン麻酔下で注射した。反対側の筋肉は、対照(DMSO)としての役割を果たした。MG132を、筋肉内注射のためにジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し次いで100μl滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に希釈した。ビヒクル単独もMG132処置も、マウスにおいていかなる明白な損傷もストレス反応も生じなかった。動物実験は、実験動物の管理と使用のための欧州ガイドライン(EU指令2010/63/EU)に準拠してかつフランス国立保健医学研究所(French national Institute for Health and Medical Research)(INSERM)およびエクスマルセイユ大学の倫理委員会の実験動物の管理と使用のためのガイドによって提供された勧告に従って実施した。
統計的解析を、GraphPad Prism Softwareで実行した。群間の相違を、GraphPad Prismを使用して両側のスチューデントのt検定を用いてアッセイした。全てのケースで実験データを、t検定要件(正規分布および同様の分散)を満たすと仮定し、t検定の仮定が有効ではなかったケースにおいては、ノンパラメトリック統計法(マンホイットニー検定)を用いた。.05未満のP値は、有意とみなした。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
HGPS細胞株における新規バイオマーカーとしての糸状PML−NBの特定
HGPS細胞の旧知の特質は、プロジェリンの蓄積であり、発明者はしたがってHGPSに罹患した3人の患者の線維芽細胞におけるプロジェリンの細胞内局在性を調査した(AG11498、AG01972、5968)。免疫染色は、培養における後期の継代での核質内プロジェリン断続点(intranucleoplasmic purogerin punctuate dots)および線維状凝集体の広範な蓄積を明らかにした(データは示さず)。
糸状PML構造の存在とプロジェリンの存在との間の可能性がある相関関係を評価するために、発明者は、HGPS線維芽細胞の抗PMLおよび抗プロジェリン抗体での二重免疫染色を実施した。興味深いことに、プロジェリンは、PMLと共存する。共焦点顕微鏡法を用いて、発明者は、PML−NBが、プロジェリンを含有することを示した(データは示さず)。
3つの主要な相補的なタンパク質分解系、すなわち自食作用、ユビキチンプロテアソーム系(UPS)およびカスパーゼがタンパク質分解を仲介する、細胞質ゾルと異なり、真核細胞核においてはUPSおよびカスパーゼのみ機能する。核のプロテアソーム介在タンパク質分解は、異なる核質病巣内で発生すると考えられている(47)。これらのタンパク質分解性の核サブドメインは、ユビキチン、プロテアソームおよびSUMO結合体が濃縮されるPML−NBのサブセットに相当する(49〜52)。糸状PML構造内へのプロジェリンと一緒のユビキチンおよび26Sプロテアソームの存在は、それらがUPSによるタンパク質および具体的にはプロジェリンの分解に関与し得ることを強く支持する。
プロジェリンクリアランスにおけるプロテアソーム阻害の関与を立証または除外するために、発明者は、同条件においていくつかのプロテアソーム阻害剤を試験した。当初MG132よりも効き目が弱いと考えられていた、別のアルデヒドプロテアソーム阻害剤、MG115(Z−Leu−Leu−nVal−al)は、プロジェリン蓄積の抑制において同一の有効性を有することが分かった(図1C)。ボロナート類似物MG262(Z−Leu−Leu−Leu−boronate)は、プロテアソームの活性部位へのより大きいその親和性にもかかわらず効果が少なかった。MG262はアルデヒドMG132よりも強力であり(55)、したがって発明者は、MG262が同一の効果を達成するためにMG132より低い濃度において有効であろうことを予想した。しかしながら、発明者は、MG262が、MG132の投与量と等しい投与量においてのみHGPS細胞におけるプロジェリンクリアランスを誘導したことを発見した(データは示さず)。これらの発見は、カスパーゼおよびプロテアソーム酵素活性へのMG132およびMG262の既知の特異な作用と一致する(56)。
ユビキチン−プロテアソーム系に加えて、細胞内タンパク質分解の別の主要経路は、自食作用−リソソーム経路である。プロテアソーム阻害で観察されたプロジェリン減少は、このクリアランスがどのように発生し得るかの疑問を提起しかつ特にプロテアソーム阻害が自食作用の代償性の増大をもたらしたことが示されているので、プロジェリンが自食性分解のための基質であり得ることをさらに示唆する(57〜59)。マクロオートファジープロセスがMG132によって強化されたプロジェリンクリアランスに関与したかどうかを評価するために、発明者は、リソソームの酸性のpHを直接変更するリソソーム作用剤クロロキン、またはリソソームプロトンポンプの阻害剤、バフィロマイシンA1のいずれかを用いることによって自食作用を阻害した。高投与量のクロロキンまたはバフィロマイシンA1でのMG132暴露HGPS線維芽細胞の処置は、MG132の効果を部分的に阻害しかつ部分的プロジェリン再発現を誘導し(図2)、MG132処置で観察された増加したプロジェリンのクリアランスが、自食作用−リソソーム経路によってある程度仲介されることを示唆する。高用量のクロロキンまたはバフィロマイシンA1単独での処置も、著しく、プロジェリンの発現レベルの低下を引き起こした(図2)。実際に、自食作用の阻害は、プロテアソーム活性の増加および培養ヒト結腸がんにおけるプロテアソームサブユニットの上方制御に繋がることが報告されている(60)。しかしながら3つのプロテアソーム活性は、これらの2種の阻害剤でのHGPS細胞の処置で変更されない。したがってこれらの発見は、プロテアソーム活性化が、クロロキンまたはバフィロマイシンA1によって誘導されたプロジェリンレベルの低下に関与しないことを示唆する。LC3Bを、自食作用活性の指標を提供する脂質化によるLC3−IからLC3−IIへの変換としての自食作用レベルを評価するために用いた。予想したように、LC3B−IIレベルは、プロジェリンレベルの減少に伴って、MG132処置後に増加する(図2A)。UPSおよび自食作用同時遮断後の不完全なプロジェリン再発現は、プロジェリンクリアランスへのMG132有効性が、自食作用に加えて、別のタンパク質分解性付随活性によって仲介されることを示唆する。
MG132が、PML−NB構成要素タンパク質が核小体内に転座されることに繋がり得ることが報告されている[35、36]。他の最近の発見は、核小体とPML−NBとの間の動的関係を例示した[37〜39]。MG132処置後の細胞下のプロジェリン局在性を調査するために、発明者は、MG132(10μM)で6時間および24時間処置したHGPS細胞株にプロジェリンおよびPML抗体を用いて経時変化間接免疫蛍光法を実行した。MG132での24時間処置は、大きいプロジェリンおよびPML核内病巣の形成を誘導する(データは示さず)。健常対照からの線維芽細胞においてであろうとHGPS患者の線維芽細胞においてであろうと、核小体の高密度繊維状部に局在化する、フィブリラリンに対する抗体を用いる分析は、PMLおよびエメリンとの部分的一致を示した(データは示さず)。p53は、細胞をMG132で処置した場合に不活性プロテアソームと共にリボソーム産生区画と異なる核小体内領域に局在化することが報告されている(67)。これらの観察は、我々も核小体に局在化するp53を観察したので我々の結果と一致する。同条件下で、発明者は、ラミンB1/B2、26Sプロテアソームサブユニットおよびユビキチンが、核小体におけるPMLと共存することを示した。したがって、発明者は24時間MG132処置後にPMLおよびLC3B細胞質ゾル共存を検出したので、核小体は、プロテアソーム依存性分解がブロックされた場合に蓄積したプロジェリンを固定および一時的に貯蔵する代替隔離部位として作用し得る(データは示さず)。本治療期間中、プロジェリンは主として核小体内に局在化したままであるが(データは示さず)、一方、48時間後、プロジェリン凝集体が、発明者がそのLC3Bとの共局在性を実証した細胞質ゾル内に検出された(データは示さず)。細胞質ゾルプロジェリン含有凝集体の種類をさらに調査するために、発明者は、既知の自食作用基質、p62、およびリソソーム膜タンパク質、LAMP−2などの自食作用胞の他のマーカーを調査した。プロジェリンおよびp62またはLAMP−2抗体での二重免疫蛍光標識法は、細胞質ゾルプロジェリンが、HGPS細胞株の48時間MG132暴露後のp62およびLAMP−2陽性小胞において蓄積したことを裏づけた。総合すれば、これらの結果は、プロジェリンが、MG132処置後に自食作用胞内に蓄積しかつしたがって細胞質において自食分解を受けることを示す。
全ての主要な分解経路の遮断は、HGPS対照細胞と比較してプロジェリンレベルを回復できなかったので、発明者は、MG132がラミンおよびプロジェリンでの転写レベルにおいて影響を有し得るかどうかをさらに評価した。したがって、発明者は、MG132処置HGPSおよび対照細胞におけるプロジェリン転写レベルを定量化するために定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)アッセイを実施した。図3Aに示すように、MG132処置は、時間依存的様式でプロジェリンmRNA発現をほとんど消し、タンパク質および転写レベルの両方におけるプロジェリンへのその二重効果を示した。
MG132が他の細胞系統におけるプロジェリンのレベルにも影響を及ぼすかどうかを判定するために、発明者は、HGPS患者の線維芽細胞からiPSCを生成した。HGPS iPSC由来の間葉系幹細胞(MSC)および血管平滑筋細胞(VSMC)は、一般に述べられているHGPS線維芽細胞の異常、すなわち、増殖能の喪失、成熟前老化および核の小疱形成を提示した(69、70)。発明者は、プロジェリン抗体でのMG132処置VSMCの免疫染色を実施した。
MG132は、種々の細胞株においてほとんど完全なプロジェリンのクリアランスを誘導するので、in vivoでのその効果を調査することは興味深いことであった。発明者は、したがってMG132の筋肉内注射が、ヒトHGPS突然変異c.1824C>T(p.Gly608Gly)に相当する、内在性Lmna遺伝子におけるc.1827C>T(p.Gly609Gly)突然変異を保有する我々のノックインマウスモデル(LmnaG609G/G609G)においてプロジェリンクリアランスも向上し得るかどうかを試験した(31)。図7に示したように、MG132での1μg/Kg処置は、未処置の付帯する筋肉と比較して処置した筋肉におけるプロジェリンレベルの有意の減少を誘導する。これらの条件下でラミンAの少しの増加およびラミンCの減少が観察された一方でこれらの変化は有意ではない。10μg/kg体重での、MG132注射もプロジェリンレベルの有意の減少を生じたが、ラミンCの減少が伴った。しかしながら、ラミンAのレベルは、一定に留まるかまたはわずかに増加しこれはラミンCの完全欠損にもかかわらず健常であったLmnaLAO/LAOマウスにおいて以前示されたようにラミンC減少を相殺するはずである(71)。
材料および方法
細胞培養
6種の腺がんヒト細胞株(肺:A549、HCC827;結腸:HCT116、HT−29;膵臓:PANC−1、Mis PaCa−2)を、ATCCから取得し、5×105から106細胞/バイアルを含有するバイアルを得るために必要に応じて培養して増幅し(継代50から60)さらなる使用の前にDMSO中で凍結して−80℃で貯蔵した。細胞生存度を、上述の通りに確認した。
MG132(474790。Merck Chemical LTD)、MG262(I−120−200。R&D Systems)およびボルテゾミブ(S1013。Euromedex)を、DMSO中0.1、1および10μMの3濃度で24時間インキュベートした。対照細胞を、DMSOビヒクルのみにおいてインキュベートした。
SRSF1、ラミンA/C、プロジェリン、アクチンおよびGAPDH(充填対照として使用)に対する抗体は、実施例1に記載されている。
結果
全ての調査した腺がん細胞株は、(その強度を測定した)ASF2アイソフォームに相当する約32kDaの大きいバンドおよびSRSF−1のASF1アイソフォームである約28kDaの2つの小さいバンド、ならびにおそらく二量体である約60kDaのバンドを伴って、SRSF−1を発現した。40μgのタンパク質が析出した場合、SRSF−1バンド強度は、20μgの析出したタンパク質を含有するレーンにおいて測定された強度の2倍であった。
概論
眼球咽頭型筋ジストロフィー(OPMD)は、通常50または60歳代において発生する常染色体優性、晩期発症型の、筋ジストロフィーであり、かつ進行性の眼瞼下垂(眼瞼下垂症)、嚥下困難(嚥下障害)および四肢近位部衰弱によって特徴付けられる。OPMDは、世界的に分布している、稀な疾患(欧州においては1/100000)であり、ブハラ・ユダヤ人(1/600)およびケベック(1/1000)において最も一般的な筋ジストロフィーである(Reviews:(72、73))。この疾患の薬理学的治療は現在のところなく、外科手術が嚥下を改善するためおよび下垂眼瞼を持ち上げるために実施され得る。
薬物補給食品を、以下のように調製した。インスタントショウジョウバエ培地(Carolina Biological Supply Company)を、DMSO(ジメチルスルホキシド)に可溶化した濃度を増大した薬物、またはDMSO単独のいずれかを補って、1%酵母水溶液でそれぞれのバイアルにおいて再構成した。MG132は、Santa Cruz Biotechnology(SC−201270)から購入した。それぞれのバイアルは、5mlまたは2.5mlの再構成した培地は含有し、それぞれ、幼虫または成虫まで育てた。個体は、幼虫期から薬物を給餌した。1つのバイアル当り70から80の一齢幼虫を移して同バイアルにおいて成虫まで成長させ、成虫を、同一濃度の薬物を含む新たなバイアルに移した。薬物毒性を判定するために、80の一齢幼虫を、薬物またはDMSO単独で補った培地を含有するバイアルに移した。成虫に達した個体を記録した。
トランスクリプトームの分析は、ショウジョウバエおよびOPMDのマウスモデルならびに患者生検において保存されているユビキチン−プロテアソーム系の全体的な調節解除を示した(20)。さらに、プロテアソーム活性は、OPMDのマウスモデルにおいて、筋肉内で上方制御されかつこれは筋萎縮と相互に関連する(93)。これらの結果は、UPS調節解除が、筋萎縮に繋がるであろう増加したタンパク質分解を通してOPMDに関係し得ることを発明者が提案することに繋がった。発明者は、したがってMG132を用いてプロテアソーム活性を低下させることがショウジョウバエモデルにおけるOPMDに有益であり得るかどうかを試験した。発明者は、PABPN1−17alaがAct88F−PABPN1−17ala導入遺伝子からの成虫間節飛翔筋において恒常的に発現されるショウジョウバエモデルを使用して(90)、in vivoでのMG132効果をアッセイした。MG132を、幼虫期から400、500および600μMの3種の濃度で食物において経口投与した。生存試験は、ハエ培地において600μMのMG132(0.2%DMSO中)は、生存度のために有害ではないことを示した(図9A)。間節飛翔筋におけるPABPN1−17ala発現は、影響を受けた筋肉機能および筋肉退化から生じる異常な羽根の配置に繋がる(89)。羽根の配置の欠陥を、成虫の第3日から第11日まで記録した。MG132の効果を、異常な羽根の配置を有するAct88F−PABPN1−17alaを発現しているハエの数を記録することによって定量化した。3種全てのMG132濃度が、それらがDMSO単独と比較して異常な羽根の配置を有するハエの数の有意の減少をもたらしたので、有益な効果を示した(図9B)。
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Claims (15)
- 非分解性異常タンパク質の蓄積に関連した障害またはがんを治療および/または予防するための使用のためのプロテアソーム阻害剤。
- SRSF1を下方制御することによる、請求項1に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
- 前記非分解性異常タンパク質が、短縮型および/またはファルネシル化プレラミンA、短縮型および/またはファルネシル化B型ラミン、ならびにLMNB1および/またはLMNB2の重複によって産生されたタンパク質から選択される、請求項1または2に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
- 前記障害が、早期老化障害、横紋筋障害および神経変性疾患から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
- ペプチド、場合によっては修飾ペプチドから選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
- トリペプチド、場合によっては修飾トリペプチドから選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
- 少なくとも2つのロイシンを含む、トリペプチド、場合によっては修飾トリペプチドから選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
- MG132、MG115、MG262およびMG110から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
- MG115、MG262およびMG110から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
- 前記障害が、早老症候群、横紋筋障害および神経変性疾患から選択される、またはがんを治療および/または予防するためである、請求項1から9のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
- 前記障害が、早老症候群および眼球咽頭型筋ジストロフィーから選択される、またはがんを治療および/または予防するためである、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
- 前記障害が、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、非定型プロジェリア症候群、拘束性皮膚障害、ネスター・ギレルモ(Nestor−Guillermo)プロジェリア症候群、ウェルナー症候群、ブルーム症候群、ロートムンド−トムソン症候群、コケイン症候群、色素性乾皮症および硫黄欠乏性毛髪発育異常症から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の使用のためのプロテアソーム阻害剤。
- 皮膚老化、具体的にはヒト皮膚老化を予防するおよび/または弱めるためのプロテアソーム阻害剤の皮膚科学的使用、皮膚美容的使用または化粧品使用。
- 生理的老化を弱めるためのプロテアソーム阻害剤の使用。
- 加齢性障害およびそれらの代謝結果を治療および/または予防するための使用のためのプロテアソーム阻害剤であって、前記加齢性障害が、好ましくは骨粗鬆症、2型糖尿病およびアテローム性動脈硬化症から選択される、プロテアソーム阻害剤。
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A521 | Request for written amendment filed |
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C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
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C11 | Written invitation by the commissioner to file amendments |
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A521 | Request for written amendment filed |
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A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
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C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
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C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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C13 | Notice of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13 Effective date: 20220628 |
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C28A | Non-patent document cited |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C2838 Effective date: 20220628 |
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C23 | Notice of termination of proceedings |
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C03 | Trial/appeal decision taken |
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C30A | Notification sent |
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