JP2018199648A - 新規トランスポーター機能解析用蛍光物質 - Google Patents

新規トランスポーター機能解析用蛍光物質 Download PDF

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浩明 山口
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成康 眞野
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Yutaka Yamagishi
裕 山岸
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Abstract

【課題】高い輸送能を維持しながらも、消光しにくく蛍光強度の強いトランスポーターの蛍光基質の提供。
【解決手段】式（Ｉ）で表される化合物。Ａ−Ｌ−Ｆ（Ｉ）［Ａは、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ウルソコール酸、ウルソデオキシコール酸、αミュリコール酸、βミュリコール酸、ωミュリコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、７−オキソ−デオキシコール酸、７−オキソ−リトコール酸、１−オキソ−リトコール酸、若しくは２−オキソ−リトコール酸、又はそれらの誘導体；Ｌは、リンカー；Ｆは、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ（ＴＧ）、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａ（ＴＭ）、若しくはヒドロキシクマリン（ＨＣ）等、又はそれらの誘導体］
【選択図】なし

Description

本発明は、トランスポーターの機能解析に用いる蛍光基質に関する。
創薬において、開発薬物の細胞内外への輸送を担うトランスポーターを評価することは、薬物の動態特性、有効性（薬効）や安全性を評価する上で重要であり、そのために欧州医薬品庁（ＥＭＡ）についでアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）が薬物相互作用の観点から、開発薬物のトランスポーター検討に関するガイダンスを発表した。トランスポーターは細胞における様々な物質の取り込み・排出を担う重要な膜輸送タンパク質であり、薬物の細胞内外への輸送を支配している。近年のポストゲノム研究の発展により、多くのトランスポーターが同定され、さらにその機能や基質の種類が明らかとなってきた。こうした背景を踏まえ、薬物に対するトランスポーター輸送能の評価をより迅速に、また簡便に行える創薬スクリーニングシステムの開発が望まれている。
現在、トランスポーター基質を用いたスクリーニングシステムにおいては、放射性同位元素（ＲＩ）で標識した基質を用いる方法や、非ＲＩ標識基質をＬＣ／ＭＳ／ＭＳで測定する方法が主流となっている。これらの方法は、基質の特異性を変化させること無くトランスポーターの輸送能を定量化できる点で優れている。しかし、測定操作の煩雑さや高価な測定装置が必要なこと等から、従来法に代わる技術が切望されている。このように、トランスポーター基質の蛍光色素による標識化（蛍光基質）は、測定操作や測定機器の簡易化などの優位性から、次世代の創薬スクリーニングシステムのツールとして位置づけられているにもかかわらず、現状では蛍光標識された基質自体が限られており、有望な創薬スクリーニングシステムの構築には至っていない。
また、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）をニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）で標識した蛍光基質が作製され、報告されている（非特許文献１）が、消光しやすく蛍光が弱いなどの問題があった。また、ハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）等で利用する場合には、高いＳ／Ｎ比が求められているが、これまでＨＴＳで利用可能なＳ／Ｎ比を有する蛍光基質は報告されていなかった。
Ｍａｇｌｏｖａ ｅｔ ａｌ． ， ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９９５；２２：６３７−５７ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． ， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ． Ｒｅｓ． ２００６；４７；１１９６−２０２
よって、本発明は、トランスポーター基質の高い輸送能を維持しながらも、消光しにくく蛍光強度の強い蛍光基質を提供することを目的とする。
本発明者らは、種々の蛍光物質と基質との組み合わせについて輸送活性を評価した結果、蛍光基質の水溶性を付与することにより高いＳ／Ｎ比を示すプローブの創製が可能であることを見出し、種々の胆汁酸と、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ（ＴＧ）、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａ（ＴＭ）、若しくはヒドロキシクマリン（ＨＣ）、又はそれらの誘導体とをリンカーを介して結合した蛍光基質が高い輸送能を維持しながらも、消光しにくく蛍光強度の強いトランスポーターの蛍光基質となることを見出した。例えば、ＣＤＣＡ−ＮＢＤの取込飽和時（１０分後）のＳ／Ｎ比、すなわち、（トランスポーター発現細胞による取込量）／（トランスポーター非発現細胞（ｍｏｃｋ細胞）による取込量）が２．５であるのに対し、ＴＧは５．７、ＨＣは３．６と優れたＳ／Ｎ比を示すことから、ＨＴＳでの利用が可能な蛍光基質を提供することに成功した。
本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、よって、本発明は下記式（Ｉ）で表される化合物に関する：
Ａ−Ｌ−Ｆ （Ｉ）
［式中、Ａは、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ウルソコール酸、ウルソデオキシコール酸、αミュリコール酸、βミュリコール酸、ωミュリコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、７−オキソ−デオキシコール酸、７−オキソ−リトコール酸、１−オキソ−リトコール酸、若しくは２−オキソ−リトコール酸、又はそれらの誘導体を表し、
Ｌは、リンカーを示し、かつ、
Ｆは、下記式で表される化合物の１価の基を示す、
［上記式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ９、及びＲ１１は、同一又は異なって、それぞれ、水素原子、ハロゲン原子、スルホン酸基、スルホン酸基の塩、Ｃ１〜６アルキル基、又はＣ１〜６アルケニル基を表し、
Ｒ２は、酸素原子又は置換されていても良い窒素原子を表し、
Ｒ５は、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、
Ｒ７は、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基、置換されていても良いＣ１〜６アルコキシ基、カルボキシ基、カルボキシ基の塩、スルホン酸基、又はスルホン酸基の塩を表し、
ｎは０〜４の自然数を表し、
Ｒ８及びＲ１２は、それぞれ独立して、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ１〜６アルケニル基、Ｃ１〜６アルキニル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル基、カルボキシ基、カルボキシ基の塩、スルホン酸基、又はスルホン酸基の塩を表し、
Ｒ１０は、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、かつ、
Ｘは、酸素原子であるか、又は置換されていても良い珪素原子を表し、
ここで、置換されていても良い窒素原子、及び置換されていても良い珪素原子の置換基は、同一又は異なって、それぞれ、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基であり、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基の置換基は、同一又は異なって、それぞれ、ハロゲン原子、カルボン酸、カルボン酸の塩、スルホン酸、又はスルホン酸の塩である］。
本明細書における式（Ｉ）で表される化合物においてＡで表される基は、ＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により取り込まれる化合物の１価の基を表し、具体的には、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ウルソコール酸、ウルソデオキシコール酸、αミュリコール酸、βミュリコール酸、ωミュリコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、７−オキソ−デオキシコール酸、７−オキソ−リトコール酸、１−オキソ−リトコール酸、及び２−オキソ−リトコール酸（以下、「コール酸等」という）、又はそれらの誘導体の一価の基を意味する。コール酸等の「誘導体」とは、コール酸等における基本ステロイド骨格を維持しながら、任意の一部の基が別の基に置換され又は任意の基が導入された化合物であって、ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １Ｂ１（ＯＡＴＰ１Ｂ１）及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により取り込まれる能力を維持する化合物を意味する。コール酸等又はそれらの誘導体がＬと結合するための結合基は、コール酸等又はそれらの誘導体の任意の位置であってよいが、好ましくは、カルボン酸残基部分において結合する。結合様式は、結合基の種類に応じて適宜選択することができるが、例えば、結合基がカルボン酸の場合には、エステル結合により結合することができる。本明細書において、「エステル結合」とは、エステル結合の他、アミド結合を含む。
本明細書において、「ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １Ｂ１（ＯＡＴＰ１Ｂ１）」は、ＳＬＣＯ１Ｂ１としても知られる。また、「ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ １Ｂ３（ＯＡＴＰ１Ｂ３）」は、ＳＬＣＯ１Ｂ３としても知られる。ＯＡＴＰ１Ｂ１及びＯＡＴＰ１Ｂ３は、共に肝細胞基底膜側に特異的に発現し、多くのスタチンの肝細胞への取り込みに作用するｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＳＬＣ）トランスポーターである。経口投与されたスタチンはＯＡＴＰ１Ｂ１を介して選択的に肝細胞に取り込まれ、コレステロールの生合成を阻害する。
コール酸等の誘導体がＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により取り込まれるか否かは、以下の方法により調べることができる。適宜コーティングされた２４穴プレートにＯＡＴＰ１Ｂ１を発現させた細胞、ＯＡＴＰ１Ｂ３を発現させた細胞、及びｍｏｃｋ細胞を、それぞれ約２×１０５細胞／ｗｅｌｌで播種し、７２時間生育後、細胞を緩衝液で１〜数回洗浄した後、緩衝液を細胞に加え、１０分間プレインキュベーションを行う。蛍光標識と結合させた被検コール酸等の誘導体を含有する緩衝液を添加し、一定時間インキュベーション後、緩衝液を除去し、ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）１％を含む氷冷した緩衝液を加えて取込みを停止させる。細胞をさらに氷冷した緩衝液で数回洗浄し、乾燥後、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを加えて細胞を溶解させて得られた測定サンプルの蛍光を測定する。測定サンプルの蛍光が確認された場合には、コール酸等の誘導体がＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により取り込まれると判定される。
一態様において、Ａは下記式で表される基である：
［上記式中、Ｒ１３は水素原子又は水酸基を表し、
Ｒ１４及びＲ１５は水素原子、水酸基又は酸素原子を表し、
実線と点線で示した線は、それぞれ、結合するＲ１４又はＲ１５が水素原子又は水酸基のときは単結合を表し、結合するＲ１４又はＲ１５が酸素原子のときは二重結合を表す］。
本明細書における式（Ｉ）で表される化合物においてＦで表される基は、蛍光物質を表し、より具体的には、下記式で表される化合物の１価の基である：
［上記式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ９、及びＲ１１は、同一又は異なって、それぞれ、水素原子、ハロゲン原子、スルホン酸基、スルホン酸基の塩、又はＣ１〜６アルキル基を表し、
Ｒ２は、酸素原子又は置換されていても良い窒素原子を表し、
Ｒ５は、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、
Ｒ７は、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基、置換されていても良いＣ１〜６アルコキシ基、カルボキシ基、カルボキシ基の塩、スルホン酸基、又はスルホン酸基の塩を表し、
ｎは０〜４の自然数を表し、
Ｒ８及びＲ１２は、それぞれ独立して、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ２〜６アルケニル基、Ｃ２〜６アルキニル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル基、カルボキシ基、カルボキシ基の塩、スルホン酸基、又はスルホン酸基の塩を表し、
Ｒ１０は、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、かつ、
Ｘは、酸素原子であるか、又は置換されていても良い珪素原子を表し、
ここで、置換されていても良い窒素原子、及び置換されていても良い珪素原子の置換基は、同一又は異なって、それぞれ、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基であり、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基の置換基は、同一又は異なって、それぞれ、ハロゲン原子、カルボン酸、カルボン酸の塩、スルホン酸、又はスルホン酸の塩である］。
本明細書における式（Ｉ）で表される化合物におけるＦとして好ましくは、緑色の蛍光を発する下記式で表されるＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ（登録商標）である。
［式中、ｎは０〜４の自然数を表し、Ｒ１７は、それぞれ独立して、Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ１〜６アルケニル基、Ｃ１〜６アルキニル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホン酸基、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基を表し、Ｒ１８はＣ１〜６アルキル基又はＣ１〜６アルコキシ基を表す。］
ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ（登録商標）として、好ましくは、以下の化合物である。
［式中、Ｒ１７は、Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ１〜６アルケニル基、Ｃ１〜６アルキニル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホン酸基、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基を表し、Ｒ１８はＣ１〜６アルキル基又はＣ１〜６アルコキシ基を表す。］
上述において、Ｒ１７として好ましくは、Ｃ１〜４アルキル基又はＣ１〜４アルコキシ基であり、より好ましくは、メチル基又はメトキシ基である。また、Ｒ１８として好ましくは、Ｃ１〜４アルキル基又はＣ１〜４アルコキシ基であり、より好ましくは、メチル基又はメトキシ基である。
また、本明細書における式（Ｉ）で表される化合物におけるＦとして好ましくは、下記式で表されるＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａである。
［式中、ｎは０〜４の自然数を表し、Ｒ１９は、それぞれ独立して、Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ１〜６アルケニル基、Ｃ１〜６アルキニル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホン酸基、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基を表し、Ｒ２０はＣ１〜６アルキル基又はＣ１〜６アルコキシ基を表す。］
ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａとして、好ましくは、以下の化合物である。
［式中、Ｒ１９は、Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ１〜６アルケニル基、Ｃ１〜６アルキニル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホン酸基、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基を表し、Ｒ２０はＣ１〜６アルキル基又はＣ１〜６アルコキシ基を表す。］
上述において、Ｒ１９として好ましくは、Ｃ１〜４アルキル基又はＣ１〜４アルコキシ基であり、より好ましくは、メチル基又はメトキシ基である。また、Ｒ２０として好ましくは、Ｃ１〜４アルキル基又はＣ１〜４アルコキシ基であり、より好ましくは、メチル基又はメトキシ基である。
また、本明細書における式（Ｉ）で表される化合物におけるＦとして好ましくは、下記式で表されるヒドロキシクマリンである。
本発明の化合物として、好ましくは、下記式（Ｖ）又は式（ＶＩ）で表される化合物である。
［上記式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ９、及びＲ１１は、同一又は異なって、それぞれ、水素原子、ハロゲン原子、スルホン酸基、スルホン酸基の塩、Ｃ１〜６アルキル基、又はＣ１〜６アルケニル基を表し、
Ｒ２は、酸素原子又は置換されていても良い窒素原子を表し、
Ｒ５は、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、
Ｒ７は、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基、置換されていても良いＣ１〜６アルコキシ基、カルボキシ基、カルボキシ基の塩、スルホン酸基、又はスルホン酸基の塩を表し、
ｎは０〜４の自然数を表し、
Ｒ８及びＲ１２は、それぞれ独立して、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ１〜６アルケニル基、Ｃ１〜６アルキニル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル基、カルボキシ基、カルボキシ基の塩、スルホン酸基、又はスルホン酸基の塩を表し、
Ｒ１０は、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、かつ、
Ｘは、酸素原子であるか、又は置換されていても良い珪素原子を表し、
Ｒ１３は水素原子又は水酸基を表し、
Ｒ１４及びＲ１５は水素原子、水酸基又は酸素原子を表し、
実線と点線で示した線は、それぞれ、結合するＲ１４又はＲ１５が水素原子又は水酸基のときは単結合を表し、結合するＲ１４又はＲ１５が酸素原子のときは二重結合を表し、
ここで、置換されていても良い窒素原子、及び置換されていても良い珪素原子の置換基は、同一又は異なって、それぞれ、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基であり、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基の置換基は、同一又は異なって、それぞれ、ハロゲン原子、カルボン酸、カルボン酸の塩、スルホン酸、又はスルホン酸の塩である］。
前記化合物においてＲ１として好ましくは、水素原子又はハロゲン原子である。
Ｒ２として好ましくは、酸素原子である。
Ｒ３として好ましくは、水素原子又はハロゲン原子である。
Ｒ４として好ましくは、水酸基であるか、又はＣ１〜６アルキル基で置換されていても良い窒素原子であり、より好ましくは、水酸基であるか、又はＣ１〜４アルキル基で置換されていても良い窒素原子であり、更に好ましくは、水酸基であるか、又はメチル基で置換されていても良い窒素原子である。
Ｒ５として好ましくは、水素原子又はハロゲン原子である。
Ｒ６として好ましくは、水酸基又は置換されていても良い窒素原子である。
Ｒ７として好ましくは、水酸基又は置換されていても良い窒素原子である。
Ｘとして好ましくは、酸素原子であるか、又は１〜２個のＣ１〜６アルキル基で置換されていても良い珪素原子であり、より好ましくは、酸素原子であるか、又は２個のＣ１〜４アルキル基で置換された珪素原子であり、更に好ましくは、酸素原子であるか、又は２個のメチル基で置換された珪素原子である。
Ｒ９として好ましくは、水素原子である。
Ｒ１０として好ましくは、水酸基、ジ（Ｃ１〜６アルキル）アミノ基（好ましくは、ジメチルアミノ基、又はジエチルアミノ基）である。
Ｒ１１として好ましくは、水素原子である。
Ｒ１３として好ましくは、水素原子又は水酸基である。
Ｒ１４及びＲ１５として好ましくは、水素原子、水酸基又は酸素原子であり、実線と点線で示した線は、それぞれ、結合するＲ１４又はＲ１５が水素原子又は水酸基のときは単結合を表し、結合するＲ１４又はＲ１５が酸素原子のときは二重結合を表す。
よって、一例において、本発明の化合物は、式（Ｖ）で表される化合物であって、
Ｒ１が、水素原子又はハロゲン原子を表し、
Ｒ２が、酸素原子又は置換されていても良い窒素原子を表し、
Ｒ３が、水素原子又はハロゲン原子を表し、
Ｒ４が、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、
Ｒ５が、水素原子又はハロゲン原子を表し、
Ｒ６が、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、
Ｒ７が、メチル基又はメトキシ基を表し、かつ、
Ｘは、酸素原子であるか、又は置換されていても良い珪素原子を表し、
ここで、置換されていても良い窒素原子、及び置換されていても良い珪素原子の置換基は、それぞれ同一又は異なって、Ｃ１〜６アルキル基である、。
Ｒ１３が、水素原子又は水酸基を表し、
Ｒ１４及びＲ１５が、水素原子、水酸基又は酸素原子を表し、
実線と点線で示した線は、それぞれ、結合するＲ１４又はＲ１５が水素原子又は水酸基のときは単結合を表し、結合するＲ１４又はＲ１５が酸素原子のときは二重結合を表す化合物である。
別の態様において、本発明は以下の式（ＶＩＩ）〜（ＩＸ）で表される中間体化合物である。これらの化合物は、式（Ｉ）で表される本発明の化合物を合成するための中間体として使用することができる。
［式中、Ｘ、Ｒ１〜Ｒ７、Ｒ９〜Ｒ１１、及びＲ１３〜Ｒ１５、並びに、実線と点線で表される線の定義は、上述と同様である。］
本明細書における式（Ｉ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、及び（ＩＸ）で表される化合物においてＬで表される基は、リンカーを示す。リンカーは、コール酸等又はそれらの誘導体と、式（Ｉ）においてＦで表される蛍光色素化合物とを結合する基である。リンカーは、本発明の化合物が、Ａで表されるトランスポーター基質の高い輸送能を維持することができ、かつ、Ｆで表される蛍光物質の蛍光強度を維持できる基であればいかなる基であっても良い。好ましくは、リンカー部分は、その両末端において、それぞれＡ及びＦと、エステル結合、アミド結合、又はスルホン酸アミド結合により結合することができる基である。例えば、Ｌは、置換されていても良い、直鎖又は分岐状のＣ２〜１４のアルキレン鎖を有する。Ｌのアルキレン鎖が置換されている場合の置換基としては、水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、オキソ基、Ｃ１〜４アルコキシ基、Ｃ１〜４アルコキシカルボニル基、Ｃ１〜４アルコキシカルボニルオキシ基、Ｃ１〜４アルキルアミノカルボキシ基、カルボン酸基、又は−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｈ基を挙げることができる。Ｌのアルキレン鎖が置換されている場合の置換基の数は、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個であってもよい。好ましくはＬは、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨＲ２１）ｑ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣＯ−（ＣＯ基はＲ８又はＲ１２に由来する基）、又は−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨＲ２１）ｑ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨＳＯ２−（ＳＯ２基はＲ８又はＲ１２に由来する基）で表される基である
［式中、ｐ及びｒは、それぞれ、同一又は異なって、２〜１０の自然数であり、
ｑは０又は１であり、かつ、
Ｒ２１は、カルボン酸基、又は−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｈ基である］。
本明細書において、「Ｃ１〜６アルキル基」とは、炭素数が１〜６個の直鎖又は分岐状の飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、２，３−ジメチルプロピル基、ヘキシル基、及びシクロヘキシル基などが挙げられ、好ましくは、Ｃ１〜４アルキル基であり、より好ましくは、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、及びイソブチル基である。更に好ましくは、Ｃ１〜３アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、及びｉ−プロピル基、であり、最も好ましくは、メチル基又はエチル基である。
本明細書において、「Ｃ１〜６アルコキシ基」とは、前記Ｃ１〜６アルキル基と酸素原子を介して結合する基（（Ｃ１〜６アルキル基）−Ｏ−基）のことであり、該アルキル基部分は直鎖状であっても分岐状であってもよい。Ｃ１〜６アルコキシ基とは、該アルキル基部分の炭素原子数が１〜６個であることを意味する。アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、１−プロピルオキシ基、２−プロピルオキシ基、２−メチル−１−プロピルオキシ基、２−メチル−２−プロピルオキシ基、２，２−ジメチル−１−プロピルオキシ基、１−ブチルオキシ基、２−ブチルオキシ基、２−メチル−１−ブチルオキシ基、３−メチル−１−ブチルオキシ基、２−メチル−２−ブチルオキシ基、３−メチル−２−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基、２−ペンチルオキシ基、３−ペンチルオキシ基、２−メチル−１−ペンチルオキシ基、３−メチル−１−ペンチルオキシ基、２−メチル−２−ペンチルオキシ基、３−メチル−２−ペンチルオキシ基、１−ヘキシルオキシ基、２−ヘキシルオキシ基、３−ヘキシルオキシ基などが挙げられる。Ｃ１〜６アルコキシ基として、好ましくはＣ１〜４アルコキシ基であり、より好ましくは、Ｃ１〜３アルコキシ基であり、より更に好ましくは、メトキシ基又はエトキシ基である。
本明細書において、「Ｃ１〜６アルコキシカルボニル基」とは、前記Ｃ１〜６アルコキシ基とオキソ基（＞Ｃ＝Ｏ）を介して結合する基（（Ｃ１〜６アルキル基）−Ｃ（＝Ｏ）−基）のことであり、該アルキル基部分は直鎖状であっても分岐状であってもよい。Ｃ１〜６アルコキシカルボニル基とは、該アルキル基部分の炭素原子数が１〜６個であることを意味する。アルコキシ基としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、１−プロピルオキシカルボニル基、２−プロピルオキシカルボニル基、２−メチル−１−プロピルオキシカルボニル基、２−メチル−２−プロピルオキシカルボニル基、２，２−ジメチル−１−プロピルオキシカルボニル基、１−ブチルオキシカルボニル基、２−ブチルオキシカルボニル基、２−メチル−１−ブチルオキシカルボニル基、３−メチル−１−ブチルオキシカルボニル基、２−メチル−２−ブチルオキシカルボニル基、３−メチル−２−ブチルオキシカルボニル基、１−ペンチルオキシカルボニル基、２−ペンチルオキシカルボニル基、３−ペンチルオキシカルボニル基、２−メチル−１−ペンチルオキシカルボニル基、３−メチル−１−ペンチルオキシカルボニル基、２−メチル−２−ペンチルオキシカルボニル基、３−メチル−２−ペンチルオキシカルボニル基、１−ヘキシルオキシカルボニル基、２−ヘキシルオキシカルボニル基、３−ヘキシルオキシカルボニル基などが挙げられる。Ｃ１〜６アルコキシカルボニル基として、好ましくはＣ１〜４アルコキシカルボニル基であり、より好ましくは、Ｃ１〜３アルコキシカルボニル基であり、より更に好ましくは、メトキシカルボニル基又はエトキシカルボニル基である。
「Ｃ２〜６アルケニル基」とは、１以上の炭素−炭素間の二重結合を有する直鎖又は分岐状の不飽和炭化水素の任意の炭素原子から一個の水素原子を除去してなる炭素原子数が２〜６個の一価の基を意味する。Ｃ２〜６アルケニル基としては、例えば、ビニル基、プロペニル基、イソプロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、１−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−メチリデン−１−プロパン基、１−ペンテニル基、１−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−メチル−１−ブテニル基、１−メチル−２−ブテニル基、１−メチル−３−ブテニル基、１−メチリデンブチル基、２−メチル−１−ブテニル基、２−メチル−２−ブテニル基、２−メチル−３−ブテニル基、２−メチリデンブチル基、３−メチル−１−ブテニル基、３−メチル−２−ブテニル基、３−メチル−３−ブテニル基、１−エチル−１−プロペニル基、１−エチル−２−プロペニル基、１−ヘキセニル基、２−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、４−ヘキセニル基、５−ヘキセニル基、１−メチル−１−ペンテニル基、１−メチル−２−ペンテニル基、１−メチル−３−ペンテニル基、１−メチル−４−ペンテニル基、１−メチリデンペンチル基、２−メチル−１−ペンテニル基、２−メチル−２−ペンテニル基、２−メチル−３−ペンテニル基、２−メチル−４−ペンテニル基、２−メチリデンペンチル基、３−メチル−１−ペンテニル基、３−メチル−２−ペンテニル基、３−メチル−３−ペンテニル基、３−メチル−４−ペンテニル基、３−メチリデンペンチル基、４−メチル−１−ペンテニル基、４−メチル−２−ペンテニル基、４−メチル−３−ペンテニル基、４−メチル−４−ペンテニル基、１−エチル−１−ブテニル基、１−エチル−２−ブテニル基、１−エチル−３−ブテニル基、２−エチル−１−ブテニル基、２−エチル−２−ブテニル基、２−エチル−３−ブテニル基、１−（１−メチルエチル）−１−プロペニル基、１−（１−メチルエチル）−２−プロペニル基、１−エチル−２−メチル−１−プロペニル基、又は、１−エチル−２−メチル−２−プロペニル基を挙げることができる。好ましくは、Ｃ２〜４アルケニル基であり、より好ましくは、ビニル基である。
「Ｃ２〜６アルキニル基」とは、１以上の炭素−炭素間の三重重結合を有する直鎖又は分岐状の不飽和炭化水素の任意の炭素原子から一個の水素原子を除去してなる炭素原子数が２〜６個の一価の基を意味する。Ｃ２〜６アルキニル基としては、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、フェニルエチニル基等を挙げることができる。好ましくは、Ｃ２〜４アルキニル基であり、より好ましくは、エチニル基である。
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、及びヨウ素原子を意味し、好ましくは、フッ素原子、塩素原子、及び臭素原子であり、より好ましくは、フッ素原子、又は塩素原子である。
本明細書において、スルホン酸基の塩及びカルボキシ基の塩における「塩」とは、本発明の化合物が、スルホン酸基又はカルボキシ基において無機又は有機の塩基と結合して形成した塩を意味する。塩としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩；アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｌ−グルカミン等のアミンの塩；又はリジン、δ−ヒドロキシリジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸との塩を形成することができる。
別の態様において、本発明は、前記化合物を含むトランスポーター機能測定用キットに関する。トランスポーターとしては、ＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３が含まれる。本発明のキットは、前記化合物の他、化合物を収納するための容器、取扱い説明書、及びキ紙箱又はプラスチックケース等のキットの構成物を格納するパッケージからなっていてもよい。
本発明の蛍光基質は、高いトランスポーター輸送能を維持しながらも、消光しにくく蛍光強度が強いことから、実用化可能なトランスポーターの蛍光基質を提供することが可能である。
ＯＡＴＰ１Ｂ１及びＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＧ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ、及びＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−Ｅｔ２ＡＣの取り込みの時間依存性を表すグラフである。各蛍光基質濃度をＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＧ ０．０２５μＭ（Ａ）、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣ ０．１μＭ（Ｂ）、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ ０．０１μＭ（Ｃ）、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−Ｅｔ２ＡＣ ０．１μＭ（Ｄ）に設定した。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３）を表す。各グラフの縦軸は、タンパク質１ｍｇ当りの取り込み量（ｕｐｔａｋｅ）（ｐｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を表し、横軸は経過時間（分）を表す。白丸はエンプティベクターが導入された細胞（コントロール）を表し、黒三角はＯＡＴＰ１Ｂ１が導入された細胞を表し、黒四角はＯＡＴＰ１Ｂ３が導入された細胞を表す。 ＯＡＴＰ１Ｂ１発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＧの取り込みの濃度依存性を表すグラフである。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３）を示し、縦軸はタンパク質１ｍｇ当りの３０秒後の取り込み量（ｐｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／３０ｓｅｃ）を表し、横軸は蛍光基質の濃度（μＭ）を表す（図２Ｂ〜Ｄ及び図３Ａ〜Ｄにおいて同じ）。小さいグラフの縦軸は、タンパク質１ｍｇ当りの３０秒後の取り込み量（ｐｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／３０ｓｅｃ）を表し、横軸はタンパク質１ｍｇ当りの３０秒後の取り込み量を、蛍光基質の濃度で割った値（ｍｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／３０ｓｅｃ）を表す（図２Ｂ〜Ｄ及び図３Ａ〜Ｄにおいて同じ）。 ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣの取り込みの濃度依存性を表すグラフである。 ＯＡＴＰ１Ｂ１発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭの取り込みの濃度依存性を表すグラフである。 ＯＡＴＰ１Ｂ１発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−Ｅｔ２ＡＣの取り込みの濃度依存性を表すグラフである。 ＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＧの取り込みの濃度依存性を表すグラフである。 ＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣの取り込みの濃度依存性を表すグラフである。 ＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭの取り込みの濃度依存性を表すグラフである。 ＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−Ｅｔ２ＡＣの取り込みの濃度依存性を表すグラフである。 ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞のＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＧ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−Ｅｔ２ＡＣ取り込みに対するｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ、ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ、Ｔ４、Ｔ３、ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ、ＢＳＰ、Ｅ３Ｓ、ＰＡＨ（コントロール）、及びＣＤＣＡによる阻害効果を表すグラフである。データは平均±標準誤差（ｎ＝３〜６）で示す。縦軸は、各蛍光基質の取り込み割合（％ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ）を表し、横軸は蛍光基質の種類を表す。黒いバーはＯＡＴＰ１Ｂ１発現ＨＥＫ２９３細胞を表し、白いバーはＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞を表す。 ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＭ，ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＦＴＧ，及びＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＳｉＲ取り込みの時間依存性試験の結果を表すグラフである。各グラフの縦軸は、タンパク質１ｍｇ当りの取り込み量（ｕｐｔａｋｅ）（ｐｍｏｌ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を表し、横軸は経過時間（分）を表し、白丸はエンプティベクターが導入された細胞（コントロール）を表し、黒三角はＯＡＴＰ１Ｂ１が導入された細胞を表し、黒四角はＯＡＴＰ１Ｂ３が導入された細胞を表す（図５Ｂ及びＣ、及び図６についても同様）。 ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｃ２−ＤＣＴＭ，ＣＤＣＡ−Ｃ５−ＤＣＴＭ，及びＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ取り込みの時間依存性試験の結果を表すグラフである。 ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｔａｕｒｏ−ｎｏｒ−ＨＣ，及びＣＡ−Ｔａｕｒｏ−ｎｏｒ−ＴＧ取り込みの時間依存性試験の結果を表すグラフである。 ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＭ，及びＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＦＴＧ取り込みの時間依存性試験の結果を表すグラフである。
１．製造方法
本発明の化合物は、本願実施例を参照しながら、コール酸等又はそれらの誘導体と、蛍光色素Ｆをリンカーを介して結合させることにより得ることができる。例えば、コール酸等又はそれらの誘導体にリンカーを結合させ、その後、リンカーの残りの末端に蛍光色素を結合させることにより得ることができる。あるいは、蛍光色素にリンカーを結合させた後、、リンカーの残りの末端にコール酸等又はそれらの誘導体を結合させることにより得ることができる。
コール酸等又はそれらの誘導体は、文献記載の方法により合成することができ、又は市販の試薬として入手することができる。また、コール酸等又はそれらの誘導体とリンカーとの結合は、コール酸のカルボキシ基にリンカーをアミド結合させる等して、文献記載の方法に準じて行うことができる。
蛍光色素Ｆは、ＷＯ２０１２／０９９２１８及びＹａｓｕｔｅｒｕ Ｕｒａｎｏら、Ｊ．ａｍ．Ｃｈｅｍ．ｓｏｃ（２００５）１２７：４８８８ー４８９４等を参照して合成することができる。蛍光色素とリンカーとの結合は、例えば、蛍光色素のカルボキシ基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いてＮ−スクシンイミド基を導入し、次いで、このＮ−スクシンイミド蛍光色素とコール酸等又はそれらの誘導体が結合したリンカーとを結合させることにより得ることができる。
２．スクリーニング方法
本発明の蛍光基質はＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送されることから、ＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送される物質のスクリーニングに用いることができる。よって、一態様において本発明は、被検物質がＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送されるか否かを決定する方法であって、以下のステップを備える方法：
該被検物質及び本発明の化合物をＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞培養物に接触させるステップ、
前記細胞内に取り込まれなかった、該被検物質及び本発明の化合物を除去するステップ、
細胞内に取り込まれた本発明の化合物の蛍光強度を測定するステップ、及び
得られた蛍光強度が該被検物質の非存在下で同様にしてＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞に接触させることにより細胞内に取り込まれた本発明の化合物の蛍光強度と比較して、小さい場合には該被検物質がＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送されると決定するステップ、に関する。
該被検物質及び本発明の化合物をＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞培養物に接触させるステップは、ディッシュ上でＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞を培養した後、培地を該被検物質及び本発明の化合物を含有する緩衝液と置換することにより行うことができる。前記細胞内に取り込まれなかった、該被検物質及び本発明の化合物の除去は、例えば、前記緩衝液を除去した後、ＢＳＡを含む緩衝液を添加することにより行うことができる。細胞内に取り込まれた本発明の化合物の蛍光強度の測定は、細胞を乾燥させた後、細胞溶解緩衝液を加えて細胞を溶解させて得られた細胞溶解液の蛍光を測定することにより行うことができる。蛍光の測定は、使用した本発明の化合物に結合する蛍光物質に適した励起波長と蛍光波長を選択して市販の測定機器により行うことができる（表１参照）。
被検物質がＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送されるか否かの決定は、該被検物質を接触させずに本発明の化合物のみをＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞培養物に接触させたコントロールについて得られた蛍光強度と比較することにより行う。蛍光強度がコントロールと同程度であれば、ＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送されないと決定され、蛍光強度がコントロールよりも小さければ、ＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送されると決定することができる。コントロールの蛍光強度は、本発明の化合物のみをＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞培養物に接触させ、前記細胞内に取り込まれなかった本発明の化合物を除去し、細胞内に取り込まれた本発明の化合物の蛍光強度を測定することにより得られる。
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、該被検物質及び本発明の化合物を除去することなく、クエンチャーを用いて消光することにより行うこともできる。すなわち、一態様において、本発明は、被検物質がＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送されるか否かを決定する方法であって、以下のステップを備える方法：
該被検物質及び本発明の化合物をＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞培養物に接触させるステップ、
前記細胞培養物にクエンチャーを添加して、細胞内に取り込まれなかった本発明の化合物を消光させるステップ、
細胞内に取り込まれた本発明の化合物の蛍光強度を測定するステップ、及び
得られた蛍光強度が該被検物質の非存在下で同様にしてＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞に接触させることにより細胞内に取り込まれた本発明の化合物の蛍光強度と比較して、小さい場合には該被検物質がＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送されると決定するステップ、に関する。
クエンチャーとして用いられる化合物は、本発明の化合物を消光することができ、かつ、細胞に取り込まれない化合物であれば特に制限されるものではなく、用いる蛍光色素に応じて選択することができる。例えば、クエンチャーとして、ブリリアントブラック（４−アセチルアミノ−５−ヒドロキシ−６−［７−ソジオスルホ−４−［４−（ソジオスルホ）フェニルアゾ］−１−ナフチルアゾ］ナフタレン−１，７−ジスルホン酸二ナトリウム；ＣＡＳ番号２５１９−３０−４）を用いることができる。
本発明のスクリーニング方法において、タンパク質の単位重量当りの蛍光強度を前記蛍光強度として使用することもできる。よって、本発明は、被検物質がＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送されるか否かを決定する方法であって、以下のステップを備える方法：
該被検物質及び本発明の化合物をＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞培養物に接触させるステップ、
前記細胞内に取り込まれなかった、該被検物質及び本発明の化合物を除去するステップ、若しくは、前記細胞培養物にクエンチャーを添加して、細胞内に取り込まれなかった本発明の化合物を消光させるステップ、
細胞内に取り込まれた本発明の化合物の蛍光強度を測定するステップ、
細胞溶解物中のタンパク質濃度を測定するステップ、及び
得られた（蛍光強度／タンパク質濃度）が、該被検物質の非存在下で同様にしてＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞に接触させることにより細胞内に取り込まれた本発明の化合物の（蛍光強度／タンパク質濃度）と比較して、小さい場合には該被検物質がＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送されると決定するステップ、に関する。
タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｌｄなどにより測定することができる。例えば、蛍光基質を取り込ませた細胞を乾燥させた後、ＮａＯＨ等を加えて細胞を溶解させて得られた細胞溶解液の蛍光を測定することにより行うことができる。タンパク質濃度の決定は、ＢＳＡを標準物質として検量線を作成し、サンプルにおいて得られた吸光度が該当する検量線上の濃度として決定することができる。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
（実施例１）化合物１〜１０の合成
トランスポーター輸送能を評価するため、以下に示す化合物１−１０を合成した。
（１）蛍光基質の合成
最初に、下記の化合物１１−１７を合成した。化合物１１−１４、及び１７に関しては文献を参考に合成した。
化合物１５及び１６は、以下の方法で合成した。
（ａ）化合物１５の合成
５０ｍＬナスフラスコ中のＴＭ−ＣＯＯＨ（４３．０ｍｇ，０．１１１ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（２５．５ｍｇ，０．２２２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３．００ｍＬ）で溶解させた。そこにＤＩＣ（４３．０μＬ，０．２７８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２．５時間攪拌した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて粗精製した。得られた化合物１５の粗精製物はそのまま次の反応に用いた。
（ｂ）化合物１６の合成
３０ｍＬナスフラスコ中のＤＣＴＭ−ＣＯＯＨ（３０．９ｍｇ，０．０６７６ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（９．３３ｍｇ，０．０８１１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１．５０ｍＬ）で溶解させた。そこにＤＩＣ（１２．５μＬ，０．０８１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物１６を１８．４ｍｇ（０．０３３２ｍｍｏｌ）、収率４９％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ （Ａｃｅｔｏｎｅ−ｄ６，４００ＭＨｚ）
δ ８．１４（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），６．７２−６．６３（ｍ，２Ｈ），３．００（ｓ，４Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），０．８８（ｓ，６Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ）
ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ ［Ｍ−Ｈ］− ５５２．０４，ｆｏｕｎｄ ５５２．０３
（２）ケノデオキシコール酸誘導体の合成
次に、化合物１１−１７とのカップリングに必要なケノデオキシコール酸誘導体１８、２０、及び２１とコール酸誘導体１９を文献を参考に合成した。
（３）化合物１〜１０の合成
以下記載のルートに従い、化合物１−１０を合成した。
ｃ）−１．化合物１の合成
２０ｍＬナスフラスコ中の化合物１１（１９．９ｍｇ，０．０６５７ｍｍｏｌ）及び化合物１８（４６．９ｍｇ，０．０７３９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．００ｍＬ）で溶解させた。そこにＥｔ３Ｎ（３１．０μＬ，０．２２４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間攪拌した。反応液に０．１Ｎ ＨＣｌを加え、酢酸エチルで有機層を抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、乾燥、濃縮、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物１を１４．４ｍｇ（０．０２０３ｍｍｏｌ）、収率３１％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）
δ ８．６３（ｓ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７０（ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．５２（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ１Ｈ），４．２８（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，１Ｈ），３．４５−３．３３（ｍ，３Ｈ），２．３８−２．０５（ｍ，３Ｈ），１．９８−０．８５（ｍ，３５Ｈ），０．６３（ｓ，３Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ）
ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ ［Ｍ−２Ｈ］２− ３５３．１９， ｆｏｕｎｄ ３５３．１７
ｃ）−２．化合物２の合成
び化合物１８（４１．９ｍｇ，０．０６６０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．３０ｍＬ）で溶解させた。そこにＥｔ３Ｎ（２８．０μＬ，０．２０２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応液に０．１Ｎ ＨＣｌを加え、酢酸エチルで有機層を抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、乾燥、濃縮、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物２を２７．５ｍｇ（０．０３６０ｍｍｏｌ）、収率５５％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ， ４００ ＭＨｚ）
δ ９．０５（ｍ，１Ｈ），８．６１（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），６．５５（ｓ，１Ｈ），４．３７（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｓ，１Ｈ），３．５３（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，４Ｈ），３．４５−３．３３（ｍ，３Ｈ），２．３５−２．０７（ｍ，３Ｈ），２．０２−０．８０（ｍ，４１Ｈ），０．６１（ｓ，３Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ）
ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ ［Ｍ−Ｈ］− ７６２．４７， ｆｏｕｎｄ ７６２．４３
ｃ）−３．化合物３の合成
２０ｍＬナスフラスコ中の化合物１３（１０．０ｍｇ，０．０２２６ｍｍｏｌ）及び化合物１８（１２．７ｍｇ，０．０２００ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．６００ｍＬ）で溶解させた。そこにＥｔ３Ｎ（９．００μＬ，０．０６５０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間攪拌した。反応液に０．１Ｎ ＨＣｌを加え、酢酸エチルで有機層を抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、乾燥、濃縮、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物３を７．１０ｍｇ（０．００８３６ｍｍｏｌ）、収率４２％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）
δ ７．９３（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），６．８１−６．６８（ｍ，４Ｈ），４．３７（ｍ，１Ｈ），３．７７（ｓ，１Ｈ），３．４５（ｍ，１Ｈ），３．２１（ｍ，２Ｈ），２．３５−２．１０（ｍ，６Ｈ），２．００−０．８５（ｍ，３５Ｈ），０．６７（ｓ，３Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ）
ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ ［Ｍ−２Ｈ］２− ４２３．２２， ｆｏｕｎｄ ４２３．２０
ｃ）−４．化合物４の合成
３０ｍＬナスフラスコ中の化合物１４（５．００ｍｇ，０．０１０４ｍｍｏｌ）及び化合物１８（７．０３ｍｇ，０．０１３５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．５０ｍＬ）及びＤＭＦ（１．００ｍＬ）で溶解させた。そこにｉＰｒ２ＮＥｔ（１０．０μＬ，０．０５７５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで有機層を抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、乾燥、濃縮、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物４を４．５０ｍｇ（０．００５０８ｍｍｏｌ）、収率４９％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）
δ ７．９４（ｓ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），６．５８（ｄｄ，Ｊ＝１．３，１１．４Ｈｚ，２Ｈ），４．３１（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，１Ｈ），３．４４（ｍ，２Ｈ），３．３８−３．３１（ｍ，１Ｈ），２．３７−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．９９−０．８５（ｍ，３５Ｈ），０．６６（ｓ，３Ｈ）
ｃ）−５．化合物５の合成
３０ｍＬナスフラスコ中の粗精製した化合物１５（１４．５ｍｇ）及び化合物１８（７．７１ｍｇ，０．０１４８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３．００ｍＬ）で溶解させた。そこにｉＰｒ２ＮＥｔ（７．７２μＬ，０．０４４４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで有機層を抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、乾燥、濃縮、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物５を４．３０ｍｇ（０．００４８３ｍｍｏｌ）、収率３３％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）
δ ７．８５（ｓ，１Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，２Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ），６．４４（ｍ，２Ｈ），４．３１（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，１Ｈ），３．４３（ｍ，２Ｈ），３．３７−３．３２（ｍ，１Ｈ），２．３７−２．１０（ｍ，６Ｈ），２．００−０．８５（ｍ，３５Ｈ），０．６６（ｓ，３Ｈ），０．５１（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，６Ｈ）
ｃ）−６．化合物６の合成
２０ｍＬナスフラスコ中の化合物１６（４．００ｍｇ，０．００７２２ｍｍｏｌ）及び化合物１８（２０．８ｍｇ，０．０３２７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．００ｍＬ）で溶解させた。そこにＥｔ３Ｎ（１４．０μＬ，０．１０１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間攪拌した。反応液に０．１Ｎ ＨＣｌを加え、酢酸エチルで有機層を抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、乾燥、濃縮、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し化合物６を３．２０ｍｇ（０．００３３３ｍｍｏｌ）、収率４６％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）
δ ７．８１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７３（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），
６．４２（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），４．１９（ｍ，１Ｈ），３．６８（ｓ，１Ｈ），３．４３−３．２５（ｍ，３Ｈ），２．２５−０．６５（ｍ，５０Ｈ）
ＭＳ（ＥＳＩ）
ｃａｌｃｄ． ｆｏｒ ［Ｍ−２Ｈ］２− ４７８．２０， ｆｏｕｎｄ ４７８．２０
ｅ）化合物７の合成
５０ｍＬナスフラスコ中の化合物１６（５．００ｍｇ，０．００９０３ｍｍｏｌ）及び化合物２０（９．２２ｍｇ，０．０２１２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３．００ｍＬ）で溶解させた。そこにｉＰｒ２ＮＥｔ（２０．０μＬ，０．１１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで有機層を抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、乾燥、濃縮、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物７を４．５０ｍｇ（０．００５１５ｍｍｏｌ）、収率５７％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）
δ ８．１３（ｍ，１Ｈ），７．８５（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄｄ，Ｊ＝１．７，９．３Ｈｚ，２Ｈ），６．５５（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），３．７７−３．６９（ｍ，２Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），３．４９−３．４２（ｍ，２Ｈ），３．２６−３．２０（ｍ，１Ｈ），２．３２−２．０９（ｍ，６Ｈ），２．０１−０．８５（ｍ，３５Ｈ），０．６５（ｓ，３Ｈ）
ｆ）化合物８の合成
５０ｍＬナスフラスコ中の化合物１６（８．９２ｍｇ，０．０１６１ｍｍｏｌ）及び化合物２１（９．３０ｍｇ，０．０１９５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３．００ｍＬ）で溶解させた。そこにｉＰｒ２ＮＥｔ（１７．０μＬ，０．０９７５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで有機層を抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、乾燥、濃縮、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物８を１０．０ｍｇ（０．０１０９ｍｍｏｌ）、収率６８％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）
δ ８．５８（ｍ，１Ｈ），７．９８（ｍ，１Ｈ），７．８５（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ），６．５７（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ），３．７８（ｓ，１Ｈ），３．４８−３．３３（ｍ，３Ｈ），３．２６−３．１２（ｍ，２Ｈ），２．３２−２．１８（ｍ，２Ｈ），２．１４−２．０４（ｍ，４Ｈ），２．００−０．８６（ｍ，４１Ｈ），０．６６（ｓ，３Ｈ）
ｃ）−９．化合物９の合成
３０ｍＬナスフラスコ中の化合物１７（５．００ｍｇ，０．００７６５ｍｍｏｌ）及び化合物１８（６．９８ｍｇ，０．０１３４ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３．００ｍＬ）で溶解させた。そこにｉＰｒ２ＮＥｔ（６．９９μＬ，０．０４０２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで有機層を抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、乾燥、濃縮、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物９を３．６０ｍｇ（０．００３４０ｍｍｏｌ）、収率４４％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）
δ ７．８８（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，２Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），６．７８（ｄｄ，Ｊ＝２．８，９．６Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｓ，１Ｈ），３．５０−３．４３（ｍ，２Ｈ），３．３９−３．３０（ｍ，１３Ｈ），２．３７−２．０９（ｍ，６Ｈ），２．０５−０．８９（ｍ，３５Ｈ），０．６７（ｓ，３Ｈ），０．６１（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，６Ｈ）
（ｄ）化合物１０の合成
５０ｍＬナスフラスコ中の化合物１６（８．９２ｍｇ，０．０１６１ｍｍｏｌ）及び化合物１９（９．４０ｍｇ，０．０１７５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３．００ｍＬ）で溶解させた。そこにｉＰｒ２ＮＥｔ（１７．４μＬ，０．１００ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで有機層を抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、乾燥、濃縮、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、化合物１０を４．３ｍｇ（０．００４４１ｍｍｏｌ）、収率２７％で得た
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）
δ ７．８２（ｓ，１Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．７７（ｄｄ，Ｊ＝０．８０，９．３Ｈｚ，２Ｈ），６．３９（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），４．２９（ｍ，１Ｈ），３．９３（ｓ，１Ｈ），３．７７（ｍ，１Ｈ），３．４５−３．３３（ｍ，３Ｈ），２．３７−２．１０（ｍ，６Ｈ），２．０３−０．８３（ｍ，３９Ｈ），０．６８（ｓ，３Ｈ）
（実施例２）ＯＡＴＰ１Ｂ１及びＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞による取り込み評価
（１）ＯＡＴＰ１Ｂ１及びＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞の培養
ＯＡＴＰ１Ｂ１及びＯＡＴＰ１Ｂ３安定発現ＨＥＫ２９３細胞はすでに樹立されたもの（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． ， Ｃａｎｃｅｒ． Ｌｅｔｔ． ２００８；２６０；１６３−１６９；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． ， Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ． ２０１１；３４；３８９−３９５）を用いた。コントロールとして、エンプティベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞（ｍｏｃｋ細胞）を使用した。ＯＡＴＰ１Ｂ１／ＨＥＫ２９３、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ＨＥＫ２９３細胞及びｍｏｃｋ細胞は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍに１０％ＦＢＳ及びＧ−４１８（０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加した培地を用いて、５％ＣＯ２環境下３７℃で培養した。これらの細胞はｐｌａｓｔｉｃ ｄｉｓｈを用いて、３、４日ごとに継代培養を行い維持した。
（２）蛍光基質
蛍光基質として、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＧ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−Ｅｔ２ＡＣ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＭ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＦＴＧ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＳｉＲ、ＣＤＣＡ−Ｃ２−ＤＣＴＭ、ＣＤＣＡ−Ｃ５−ＤＣＴＭ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ、ＣＡ−Ｔａｕｒｏ−ｎｏｒ−ＨＣ、及びＣＡ−Ｔａｕｒｏ−ｎｏｒ−ＴＧを用いた。各蛍光基質の測定励起波長と（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）（ｎｍ）と、蛍光波長（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）（ｎｍ）を表１に示す。
（３）取り込み試験方法
Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ ｃｏａｔｉｎｇした２４−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓにＯＡＴＰ１Ｂ１／ＨＥＫ２９３、ＯＡＴＰ１Ｂ３／ＨＥＫ２９３細胞及びｍｏｃｋ細胞（Ｖｅｃ／ＨＥＫ２９３）を約２０万ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、７２時間生育させた。また、取り込み実験２４時間前には培地交換を行った。細胞をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（ＫＨ）ｂｕｆｆｅｒ（１１８ｍＭ ＮａＣｌ、２３．８ｍＭ ＮａＨＣＯ３、４．８３ｍＭ ＫＣｌ、０．９６ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２０ｍＭ ＭｇＳＯ４、１２．５ｍＭ Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）、５．０ｍＭ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、及び１．５３ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で１回洗浄した後、ＫＨ ｂｕｆｆｅｒを細胞に加え、１０分間ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎを行った。
取り込みは各蛍光標識化合物（または各蛍光標識化合物と阻害剤）を含むＫＨ ｂｕｆｆｅｒと置換することにより開始した。取り込み反応は、規定時間のｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ後、ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを取り除き、ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）１％を含む氷冷したＫＨ ｂｕｆｆｅｒを加えることにより停止した。細胞をさらに氷冷したＫＨ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、乾燥後、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを加えて溶解させたものを蛍光測定サンプルとした。蛍光測定にはマイクロプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ Ｊａｐａｎ，神奈川，日本）を用いた。氷冷したＫＨ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、乾燥後、０．５規定のＮａＯＨを加え溶解させたものをタンパク定量用サンプルとし、ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）をスタンダードとしたＢｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質濃度を決定した。
（４）タンパク質定量方法
タンパク定量用サンプルはＢｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク定量を行った。９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの各ウェルにタンパク定量用サンプル５μＬ及び５倍希釈したＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，米国）２００μＬを加え、５分後に、吸収波長５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。標準タンパクとしてＢＳＡを用い検量線を作製した。
（５）統計解析
実験結果は、平均±標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥ）で示した。トランスポーター特異的な取り込み量はＯＡＴＰ１Ｂ１／ＨＥＫ細胞及びＯＡＴＰ１Ｂ３／ＨＥＫ細胞の取り込み量からｍｏｃｋ細胞（Ｖｅｃ／ＨＥＫ細胞）によるトランスポーター非特異的取り込み量を差し引くことで算出した。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ ｗａｖｅ、Ｅａｄｉｅ Ｈｏｆｓｔｅｅ Ｐｌｏｔは、データ解析ソフトＫａｌｅｉｄａ Ｇｒａｐｈ（ＨｕＬｉｎｋｓ Ｉｎｃ，東京，日本）を用いて作成した。阻害試験では、阻害剤非存在下のトランスポーター特異的な取り込み量を１００％とし、Ｕｐｔａｋｅ ％ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌを算出した。Ｃｏｎｔｒｏｌ群と阻害剤（またはＰＡＨ）群間における有意差の検定は、統計解析ソフトＪＭＰ Ｐｒｏ １２（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｄｔｅ Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，米国）を用いてＤａｎｎｅｔｔ ｔｅｓｔにより行った（＊ｐ＜０．０５）。
（６）時間依存性試験
ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＧ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ、及びＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−Ｅｔ２ＡＣのＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞への取り込みの時間依存性を試験した（ｎ＝３）。結果を図１に示す。各蛍光基質濃度をＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＧ ０．０２５μＭ（Ａ）、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣ ０．１μＭ（Ｂ）、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ ０．０１μＭ （Ｃ）、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−Ｅｔ２ＡＣ ０．１μＭ（Ｄ）に設定した。４つの蛍光基質全てについて、ｍｏｃｋ細胞に比べてＯＡＴＰ１Ｂ１及びＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞における取り込み量の有意な上昇が認められた。データは、平均±標準誤差を表す。
（７）濃度依存性試験
ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＧ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−Ｅｔ２ＡＣの取り込みの濃度依存性を２回試験した（ｎ＝３）。それぞれの結果を図２Ａ〜Ｄ及び図３Ａ〜Ｄに示す。４つの蛍光基質の取り込みは濃度依存的に増加し、高濃度域で飽和が認められた。上述の時間依存性試験の結果より、４つの蛍光基質すべての取り込み時間を、ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３を介する取り込みの初速度が評価可能である３０秒とした。データは、平均±標準誤差で示した。また、みかけのミカエリス定数（Ｋｍ値）はＥａｄｉｅ Ｈｏｆｓｔｅｅ Ｐｌｏｔより算出して動態パラメーターを算出した。結果を以下の表２に示す。
（７）ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞のＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＧ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−Ｅｔ２ＡＣ取り込みに対する典型基質・典型阻害剤による阻害効果
各蛍光基質濃度をＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＧ ０．０２μＭ（Ａ）、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣ ０．１μＭ（Ｂ）、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ ０．０１μＭ（Ｃ）、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−Ｅｔ２ＡＣ ０．１μＭ（Ｄ）に設定し、ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３の典型的な基質および阻害剤としてｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ、ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ、Ｔ４、Ｔ３、ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ、ＢＳＰ、及びＥ３Ｓを、競合物質として非標識胆汁酸であるＣＤＣＡを、ネガティブコントロールとしてＰＡＨを用いて、ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３を介した取り込みに対する阻害効果を評価した。結果を図４に示す。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３〜６）で示した。４つ全ての蛍光基質についてＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３の典型的な基質および阻害剤による取り込み量の減少が認められた。これらの阻害感受性は、既知の輸送基質と同様の傾向を示すことが明らかとなった。一方、ＰＡＨ添加時には取り込み量がコントロールとほぼ変わらない値を示した。
（７）ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＧ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−Ｅｔ２ＡＣを用いたＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３典型基質・典型阻害剤の阻害定数（Ｋｉ値）の算出
各蛍光基質濃度をＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＧ ０．０２５μＭ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣ ０．１μＭ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ ０．０１μＭ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−Ｅｔ２ＡＣ ０．１μＭに設定し、ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３典型阻害剤であるＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ、Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ、Ｒｉｔｏｎａｖｉｒ、Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ、Ｖｅｒａｐａｍｉｌ、Ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄの阻害定数を算出した。ＯＡＴＰ１Ｂ１を介した輸送における各阻害剤の阻害定数を表３に、ＯＡＴＰ１Ｂ３を介した輸送における各阻害剤の阻害定数を表４に示す（表中、［１］Ｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ． ２０１３ Ｏｃｔ；４１（１０）：１８５９−６６；［２］ Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ． ２００８ Ａｐｒ；３６（４）：６６３−９；［３］ Ｔａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ３４：７４３−７４７， ２００６）。ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３を介した輸送における阻害定数は、蛍光基質を用いた場合と、既知基質であるＥｓｔｒａｄｉｏｌ−１７β―ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅやＦｅｘｏｆｅｎａｄｉｎｅを用いた場合と比較したところ、ほとんどの阻害剤の値が０．１−１０倍以内の相関を示した。このことから、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＧ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＨＣ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ、ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−Ｅｔ２ＡＣは、ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３の既知基質と同等の阻害感受性を示すことが示唆された。
（８）ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＭ，ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＦＴＧ，ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＳｉＲ，ＣＤＣＡ−Ｃ２−ＤＣＴＭ，ＣＤＣＡ−Ｃ５−ＤＣＴＭ，ＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ，ＣＡ−Ｔａｕｒｏ−ｎｏｒ−ＨＣ，及びＣＡ−Ｔａｕｒｏ−ｎｏｒ−ＴＧの取り込みの時間依存性試験
各蛍光基質濃度を０．１μＭに設定し、取り込み実験を行った。結果を図５Ａ〜Ｃに示す。全ての蛍光基質がｍｏｃｋ細胞に比べてＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞において有意な取り込み量の上昇が認められた。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３）で示した。
（９）ＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３発現ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＴＭ，ＣＤＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＦＴＧ，及びＣＡ−Ｌｙｓ−ＤＣＴＭ取り込みの時間依存性試験
各蛍光基質濃度を０．００５μＭに設定し取り込み実験を行った。結果を図６に示す。全ての蛍光基質がｍｏｃｋ細胞に比べてＯＡＴＰ１Ｂ１およびＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞において有意な取り込み量の上昇が認められた。データは、平均±標準誤差（ｎ＝３）で示した。

Claims (10)

  1. 下記式（Ｉ）で表される化合物：
    Ａ−Ｌ−Ｆ （Ｉ）
    ［式中、Ａは、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ウルソコール酸、ウルソデオキシコール酸、αミュリコール酸、βミュリコール酸、ωミュリコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、７−オキソ−デオキシコール酸、７−オキソ−リトコール酸、１−オキソ−リトコール酸、若しくは２−オキソ−リトコール酸、又はそれらの誘導体を表し、
    Ｌは、リンカーを示し、かつ、
    Ｆは、下記式で表される化合物の１価の基を示す、
    ［上記式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ９、及びＲ１１は、同一又は異なって、それぞれ、水素原子、ハロゲン原子、スルホン酸基、スルホン酸基の塩、Ｃ１〜６アルキル基、又はＣ１〜６アルケニル基を表し、
    Ｒ２は、酸素原子又は置換されていても良い窒素原子を表し、
    Ｒ５は、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、
    Ｒ７は、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基、置換されていても良いＣ１〜６アルコキシ基、カルボキシ基、カルボキシ基の塩、スルホン酸基、又はスルホン酸基の塩を表し、
    ｎは０〜４の自然数を表し、
    Ｒ８及びＲ１２は、それぞれ独立して、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ１〜６アルケニル基、Ｃ１〜６アルキニル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル基、カルボキシ基、カルボキシ基の塩、スルホン酸基、又はスルホン酸基の塩を表し、
    Ｒ１０は、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、かつ、
    Ｘは、酸素原子であるか、又は置換されていても良い珪素原子を表し、
    ここで、置換されていても良い窒素原子、及び置換されていても良い珪素原子の置換基は、同一又は異なって、それぞれ、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基であり、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基の置換基は、同一又は異なって、それぞれ、ハロゲン原子、カルボン酸、カルボン酸の塩、スルホン酸、又はスルホン酸の塩である］。
  2. Ａが下記式（ＩＶ）で表される、請求項１に記載の化合物：
    ［上記式中、Ｒ１３は水素原子又は水酸基を表し、
    Ｒ１４及びＲ１５は水素原子、水酸基又は酸素原子を表し、
    実線と点線で示した線は、それぞれ、結合するＲ１４又はＲ１５が水素原子又は水酸基のときは単結合を表し、結合するＲ１４又はＲ１５が酸素原子のときは二重結合を表す］。
  3. 下記式（Ｖ）又は式（ＶＩ）で表される、請求項１に記載の化合物：
    ［上記式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ９、及びＲ１１は、同一又は異なって、それぞれ、水素原子、ハロゲン原子、スルホン酸基、スルホン酸基の塩、Ｃ１〜６アルキル基、又はＣ１〜６アルケニル基を表し、
    Ｒ２は、酸素原子又は置換されていても良い窒素原子を表し、
    Ｒ５は、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、
    Ｒ７は、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基、置換されていても良いＣ１〜６アルコキシ基、カルボキシ基、カルボキシ基の塩、スルホン酸基、又はスルホン酸基の塩を表し、
    ｎは０〜４の自然数を表し、
    Ｒ８及びＲ１２は、それぞれ独立して、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ１〜６アルケニル基、Ｃ１〜６アルキニル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル基、カルボキシ基、カルボキシ基の塩、スルホン酸基、又はスルホン酸基の塩を表し、
    Ｒ１０は、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、かつ、
    Ｘは、酸素原子であるか、又は置換されていても良い珪素原子を表し、
    Ｒ１３は水素原子又は水酸基を表し、
    Ｒ１４及びＲ１５は水素原子、水酸基又は酸素原子を表し、
    実線と点線で示した線は、それぞれ、結合するＲ１４又はＲ１５が水素原子又は水酸基のときは単結合を表し、結合するＲ１４又はＲ１５が酸素原子のときは二重結合を表し、
    ここで、置換されていても良い窒素原子、及び置換されていても良い珪素原子の置換基は、同一又は異なって、それぞれ、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基であり、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基の置換基は、同一又は異なって、それぞれ、ハロゲン原子、カルボン酸、カルボン酸の塩、スルホン酸、又はスルホン酸の塩である］。
  4. 請求項３に記載の式（Ｖ）で表される化合物であって、
    Ｒ１が、水素原子又はハロゲン原子を表し、
    Ｒ２が、酸素原子又は置換されていても良い窒素原子を表し、
    Ｒ３が、水素原子又はハロゲン原子を表し、
    Ｒ４が、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、
    Ｒ５が、水素原子又はハロゲン原子を表し、
    Ｒ６が、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、
    Ｒ７が、メチル基又はメトキシ基を表し、かつ、
    Ｘは、酸素原子であるか、又は置換されていても良い珪素原子を表し、
    ここで、置換されていても良い窒素原子、及び置換されていても良い珪素原子の置換基は、それぞれ同一又は異なって、Ｃ１〜６アルキル基である、。
    Ｒ１３が、水素原子又は水酸基を表し、
    Ｒ１４及びＲ１５が、水素原子、水酸基又は酸素原子を表し、
    実線と点線で示した線は、それぞれ、結合するＲ１４又はＲ１５が水素原子又は水酸基のときは単結合を表し、結合するＲ１４又はＲ１５が酸素原子のときは二重結合を表す化合物。
  5. Ｌが、エステル結合、アミド結合、又はスルホンアミド結合により、Ａ及びＦと結合し、置換されていても良い、直鎖又は分岐状のＣ２〜１４のアルキレン鎖を有する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の化合物。
  6. 請求項５に記載の化合物化合物であって、Ｌが、
    −ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨＲ２１）ｑ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣＯ−、又は
    −ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ−（ＣＨＲ２１）ｑ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨＳＯ２−
    で表される基である化合物
    ［式中、ｐ及びｒは、それぞれ、同一又は異なって、２〜１０の自然数であり、
    ｑは０又は１であり、かつ、
    Ｒ２１は、カルボン酸基、又は−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）２−ＳＯ３Ｈ基である］。
  7. 下記式（ＶＩＩ）〜（ＩＸ）のいずれか１つで表される化合物：
    ［上記式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ９、及びＲ１１は、同一又は異なって、それぞれ、水素原子、ハロゲン原子、スルホン酸基、スルホン酸基の塩、Ｃ１〜６アルキル基、又はＣ１〜６アルケニル基を表し、
    Ｒ２は、酸素原子又は置換されていても良い窒素原子を表し、
    Ｒ５は、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、
    Ｒ７は、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基、置換されていても良いＣ１〜６アルコキシ基、カルボキシ基、カルボキシ基の塩、スルホン酸基、又はスルホン酸基の塩を表し、
    ｎは０〜４の自然数を表し、
    Ｒ８及びＲ１２は、それぞれ独立して、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、Ｃ１〜６アルキル基、Ｃ１〜６アルケニル基、Ｃ１〜６アルキニル基、Ｃ１〜６アルコキシ基、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル基、カルボキシ基、カルボキシ基の塩、スルホン酸基、又はスルホン酸基の塩を表し、
    Ｒ１０は、水酸基又は置換されていても良い窒素原子を表し、かつ、
    Ｘは、酸素原子であるか、又は置換されていても良い珪素原子を表し、
    Ｒ１３は水素原子又は水酸基を表し、
    Ｒ１４及びＲ１５は水素原子、水酸基又は酸素原子を表し、
    実線と点線で示した線は、それぞれ、結合するＲ１４又はＲ１５が水素原子又は水酸基のときは単結合を表し、結合するＲ１４又はＲ１５が酸素原子のときは二重結合を表し、
    ここで、置換されていても良い窒素原子、及び置換されていても良い珪素原子の置換基は、同一又は異なって、それぞれ、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基であり、置換されていても良いＣ１〜６アルキル基の置換基は、同一又は異なって、それぞれ、ハロゲン原子、カルボン酸、カルボン酸の塩、スルホン酸、又はスルホン酸の塩である］。
  8. 請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物を含む、トランスポーター機能測定用キット。
  9. 被検物質がＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送されるか否かを決定する方法であって、以下のステップを備える方法：
    該被検物質及び請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物をＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞に接触させるステップ、
    前記細胞内に取り込まれなかった、該被検物質及び請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物を除去するステップ、若しくは、前記細胞培養物にクエンチャーを添加して、細胞内に取り込まれなかった請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物を消光させるステップ、
    細胞内に取り込まれた請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物の蛍光強度を測定するステップ、及び
    得られた蛍光強度が該被検物質の非存在下で請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物を同様にしてＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞に接触させた細胞内に取り込まれた請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物の蛍光強度と比較して、小さい場合には該被検物質がＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送されると決定するステップ。
  10. 被検物質がＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送されるか否かを決定する方法であって、以下のステップを備える方法：
    該被検物質及び請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物をＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞培養物に接触させるステップ、
    前記細胞内に取り込まれなかった、該被検物質及び請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物を除去するステップ、若しくは、前記細胞培養物にクエンチャーを添加して、細胞内に取り込まれなかった請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物を消光させるステップ、
    細胞内に取り込まれた請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物の蛍光強度を測定するステップ、及び
    得られた蛍光強度が該被検物質の非存在下で請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物を同様にしてＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３発現細胞に接触させた細胞内に取り込まれた請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の化合物の蛍光強度と比較して、小さい場合には該被検物質がＯＡＴＰ１Ｂ１及び／又はＯＡＴＰ１Ｂ３により輸送されると決定するステップ。
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