JP2018194389A - 尿素の測定方法及び尿素検出キット - Google Patents
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Abstract
Description
また、特許文献1に記載の乾式試験片を用いた測定では、溶液の尿素検出用試薬を用いた測定と比べ、液体試料中の尿素以外の窒素含有成分の影響を受けやすい(尿素に対する特異性が低い)、液体試料のタンパク質濃度、pH及び粘度等の物性の影響を受けやすい等の課題がある。
また、市販の尿素検出用試薬を用いた方法では、当該尿素検出用試薬が水難溶性であり、さらに操作が煩雑であるため、数十サンプルの測定が限界であり、サンプル量及び試薬量を多く必要とする。
本発明の第1態様に係る尿素の測定方法は、反応容器に尿素を含む試料と、アルギニンと、2価のカチオンを含む溶液とを添加して混合する混合工程と、前記混合工程後の試料に、尿素検出試薬を含むpH4.0以下の酸性溶液を添加し、尿素の検出反応を行う検出反応工程と、を備える方法である。
本発明の第2態様に係る尿素検出キットは、アルギニンと、2価のカチオンを含む溶液と、尿素検出試薬を含むpH4.0以下の酸性溶液と、を備える。
本発明の一実施形態に係る尿素の測定方法は、反応容器に尿素を含む試料と、アルギニンと、2価のカチオンを含む溶液とを添加して混合する混合工程と、前記混合工程後の試料に、尿素検出試薬を含むpH4.0以下の酸性溶液を添加し、尿素の検出反応を行う検出反応工程と、を備える方法である。
本実施形態の測定方法について、図を参照しながら以下に詳細を説明する。
まず、反応容器に尿素を含む試料と、アルギニンと、2価のカチオンを含む溶液とを添加し、混合する。
混合する温度及び時間に特別な限定はなく、例えば20℃以上45℃以下程度の温度で、均一になるようにピペッティング等して混合すればよい。
本工程において使用する各成分について、以下に詳細を説明する。
尿素を含む試料としては、特別な限定はないが、例えば血液、唾液、涙液、汗等の体液、尿などの生体試料、動物細胞(例えば、肝臓細胞等)の懸濁液、動物細胞の破砕液等が挙げられる。尿素を含む試料は、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
本実施形態の測定方法に用いられるアルギニンは、L体であっても、D体であってもよく、中でも、L体であることが好ましい。また、アルギニンは、蒸留水等の溶媒に溶解した状態、すなわちアルギニン溶液であってもよい。アルギニン溶液である場合、アルギニンを含む塩又は水和物を蒸留水等の溶媒に溶解することで調製することができる。さらに、アルギニン溶液は、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
アルギニン溶液である場合、測定時の溶液中のアルギニンの濃度としては、例えば10mM以上300mM以下であってよく、20mM以上200mM以下であってよく、30mM以上100mM以下であってよい。
2価のカチオンとしては、例えばCa2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+等が挙げられる。中でも、Mn2+であることが好ましい。2価のカチオンを含む溶液としては、上記2価のカチオンを含む塩又は水和物等が溶解したものであればよく、特別な限定はない。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。アルギナーゼを含む試料に、2価のカチオンを含む溶液を添加することにより、アルギナーゼの酵素活性を高めることができる。
溶液中の2価のカチオンの濃度としては、例えば1mM以上100mM以下であってよく、3mM以上50mM以下であってよく、5mM以上30mM以下であってよい。
反応容器としては、尿素を測定することができるものであれば、特別な限定はなく、例えばガラス、金属、プラスチック等が挙げられる。反応容器の形状には、特に制限はなく、例えばスライドガラス状、マイクロプレート状、円盤状等が挙げられる。
中でも、多数の試料を測定することが可能であることから、マイクロプレート状であることが好ましい。マイクロプレートとしては、任意の数のウェルが配置されているものが挙げられる。ウェルの数としては、プレート1枚当たり、例えば、24、96、384、1,536個等が挙げられる。反応容器は、微細な流路を備えたマイクロ流路デバイスを構成していてもよい。反応容器のサイズは、使用する装置に適用できる範囲であれば構わない。
具体的には、まず、反応容器にアルギナーゼを含む試料と2価のカチオンを含む溶液とを添加し、アルギナーゼを活性化させる。アルギナーゼの活性をより高めるために、酵素が失活しない程度の温度(例えば、55℃以上70℃未満の温度等)で、10分程度インキュベートしてもよい。
次いで、混合工程後の試料に、尿素検出試薬を含むpH4.0以下の酸性溶液を添加し、尿素の検出反応を行う。
尿素検出試薬としては、尿素を検出できるものであれば、特別な限定はない。例えば、α−ジケトン、p−ジメチルアミノベンツアルデヒド、キサントヒドロール等が挙げられる。中でも、α−ジケトンが好ましい。α−ジケトンとしては、例えば、α−イソニトロソプロピオフェノン、ジアセチルモノオキシム等が挙げられる。中でも、α−イソニトロソプロピオフェノンが好ましい。
酸性溶液のpHは、室温(23℃)でのpHが4.0以下であればよく、ガラス電極のpHメーターでは計測することが難しい酸性度の強い溶液を用いてもよい。酸性溶液のpHの上限値として具体的には、pH4.0以下であることが好ましく、pH2.0以下であることがより好ましく、pH1.0以下であることがさらに好ましい。
一方、酸性溶液のpHの下限値としては、pHメーターでは測定することが困難な酸性度であってもよいことから特別な限定はないが、例えば−2.0以上程度であればよい。
酸性溶液は、pHを上記範囲に調整できる酸を含む溶液であればよく、特別な限定はない。使用可能な酸として具体的には、例えば、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、それらの塩又は水和物等が挙げられる。上記酸を2種類以上混合したものでもよい。さらに、酸性溶液は、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
また、混合工程においてアルギナーゼを用いて尿素を含む試料を調製した場合、上記尿素検出試薬及び上記酸性溶液を予め混合しておくことにより、酵素の失活及び尿素の検出を1回の作業で行えるため、作業を効率化することができる。
紫外線の照射方法については特に限定されず、例えば、白色灯、日光、紫外線照射装置等、紫外線が存在する環境下にさらすことで、反応は促進される。
本発明の一実施形態に係る尿素検出キットは、アルギニンと、2価のカチオンを含む溶液と、尿素検出試薬を含むpH4.0以下の酸性溶液と、を備える。
本実施形態の検出キットに含まれるアルギニンは、L体であっても、D体であってもよく、中でも、L体であることが好ましい。また、アルギニンは、蒸留水等の溶媒に溶解した状態、すなわちアルギニン溶液であってもよい。アルギニン溶液である場合、アルギニンを含む塩又は水和物を蒸留水等の溶媒に溶解することで調製することができる。さらに、アルギニン溶液は、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
アルギニン溶液である場合、溶液中のアルギニンの濃度としては、例えば10mM以上1000mM以下であってよく、20mM以上800mM以下であってよく、30mM以上600mM以下であってよい。
本実施形態の検出キットに含まれる2価のカチオンとしては、上述の尿素の測定方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態の検出キットに含まれる2価のカチオンとしては、Mn2+であることが好ましい。2価のカチオンを含む溶液としては、上記2価のカチオンを含む塩又は水和物等が溶解したものであればよく、特別な限定はない。さらに、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。尿素を含む試料に、アルギニン及び2価のカチオンを含む溶液を添加することにより、尿素検出試薬の発色能を高めることができる。
本実施形態の検出キットに含まれる尿素検出試薬としては、尿素を検出できるものであれば、特別な限定はなく、上述の尿素の測定方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態の検出キットに含まれる尿素検出試薬としては、α−イソニトロソプロピオフェノンが好ましい。
本実施形態の検出キットに含まれる酸性溶液は、室温(23℃)でのpHが4.0以下であればよく、ガラス電極のpHメーターでは計測することが難しい酸性度の強い溶液を用いてもよい。酸性溶液のpHの上限値として具体的には、pH4.0以下であることが好ましく、pH2.0以下であることがより好ましく、pH1.0以下であることがさらに好ましい。
一方、酸性溶液のpHの下限値としては、pHメーターでは測定することが困難な酸性度であってもよいことから特別な限定はないが、例えば−2.0以上程度であればよい。
酸性溶液は、pHを上記範囲に調整できる酸を含む溶液であればよく、特別な限定はない。使用可能な酸として具体的には、上述の尿素の測定方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。また、上記酸を2種類以上混合したものでもよい。さらに、酸性溶液は、生理食塩水等の緩衝液又は蒸留水等で希釈されたものであってもよい。
また、アルギナーゼにより調製された尿素を含む試料を用いて検出を行う場合、上記尿素検出試薬及び上記酸性溶液を予め混合しておくことにより、酵素の失活及び尿素の検出を1回の作業で行えるため、作業を効率化することができる。
また、本実施形態の検出キットは、尿素を合成するアルギナーゼの活性を測定するために用いることもできる。すなわち、本実施形態の検出キットは、「アルギナーゼ活性の検出キット」としても用いることができる。
また、本実施形態の検出キットを用いて、アルギナーゼの活性を検出できることから、アルギナーゼ関連疾患を検出するために用いることもできる。すなわち、本実施形態の検出キットは、「アルギナーゼ関連疾患検出キット」としても用いることができる。
(1)尿素溶液の調製
尿素(ナカライテスク社製)を用いて、0、5、10、20、40、80、160μg/mLとなるように尿素溶液を調製した。
酸混合液(リン酸:濃硫酸:水=1:3:7(体積比))に、1/10量のα−イソニトロソプロピオフェノン(9質量%、100%エタノールに溶解)(約pH−1.0)を添加して、95℃で30分以上加熱溶解し、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製した。
1枚のマイクロプレートに、(1)で調製した異なる濃度の尿素溶液を各20μLずつ、10mMのマンガン溶液20μLずつ、500mMのアルギニン溶液40μLずつ、各8ウェルずつ(合計56ウェル×1枚)、マルチピペッターで添加した。続いて、マイクロプレートに、(2)で調製した尿素検出試薬を含む酸性溶液を各180μLずつマルチピペッターで添加した。続いて、95℃で2、3、4、5、6、8時間加熱した。続いて、マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、540nmでの吸光度を測定した。結果を表1に示す。
表1において、「mean」はまず0、5、10、20、40、80、160μg/mLの尿素濃度それぞれにおける8ウェルの平均値を算出後、該平均値を標準偏差で割った値(平均値/標準偏差)を算出し、さらに算出された7つの平均値/標準偏差を平均した値を示している。また、「SD」は前記7つの平均値/標準偏差の標準偏差を示す。
また、8時間加熱したマイクロプレート中の溶液の液色を撮影した画像を図2Aに示す。
(1)尿素溶液の調製
尿素(ナカライテスク社製)を用いて、実施例1の(1)と同様の方法により、0、5、10、20、40、80、160μg/mLとなるように尿素溶液を調製した。
1枚のマイクロプレートに、(1)で調製した異なる濃度の尿素溶液を各20μLずつ、10mMのマンガン溶液20μLずつ、500mMのアルギニン溶液40μLずつ、各8ウェルずつ(合計56ウェル×1枚)、マルチピペッターで添加した。続いて、マイクロプレートに、酸混合液(リン酸:濃硫酸:水=1:3:7(体積比))を各162μLずつマルチピペッターで添加した。続いて、尿素検出試薬としてα−イソニトロソプロピオフェノン(9質量%、100%エタノールに溶解)を18μLずつマルチピペッターで添加した。95℃で2、3、4、5、6、8時間加熱した。続いて、マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、540nmでの吸光度を測定した。結果を表1に示す。
また、8時間加熱したマイクロプレート中の溶液の液色を撮影した画像を図2Bに示す。
表1から、実施例1は比較例1に対して、meanの値が小さい傾向であった。一方、比較例1はmeanの値が、加熱時間を通してばらついていた。また、実施例1は比較例1に対して、8時間加熱したものを除いて、SDの値も小さい傾向であった。
以上のことから、本発明の測定方法では、測定値のばらつきを低減できることが明らかとなった。
よって、従来の測定方法である比較例1ではバックグラウンドが高いのに対し、本実施形態の測定方法では、バックグラウンドが低く、尿素をより正確に検出できることが明らかとなった。
(1)尿素溶液の調製
尿素(ナカライテスク社製)を用いて、実施例1の(1)と同様の方法により、0、5、10、20、40、80、160μg/mLとなるように尿素溶液を調製した。
実施例1の(2)と同様の方法を用いて、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製した。
1枚のマイクロプレートに、(1)で調製した異なる濃度の尿素溶液を各20μLずつ、10mMのマンガン溶液20μLずつ、500mMのアルギニン溶液40μLずつ、各8ウェルずつ(合計56ウェル×1枚)、マルチピペッターで添加した。続いて、マイクロプレートに、(2)で調製した尿素検出試薬を含む酸性溶液を各180μLずつマルチピペッターで添加した。続いて、遮光条件下又は蛍光灯下で、95℃で2時間加熱した。続いて、加熱時に遮光条件下であったサンプルを蛍光灯下に移し、マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、540nmでの吸光度を測定した。結果を図3に示す。図3において、「蛍光灯」とは加熱時に遮光せずに蛍光灯下であったサンプルを示し、「遮光」とは加熱時に遮光条件であったサンプルを示す。
よって、加熱時に遮光することで、尿素の濃度に依存した吸光度の上昇率が高くなり、より高感度で尿素を測定できることが確かめられた。
(1)尿素溶液の調製
尿素(ナカライテスク社製)を用いて、実施例1の(1)と同様の方法により、0、5、10、20、40、80、160μg/mLとなるように尿素溶液を調製した。
実施例1の(2)と同様の方法を用いて、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製した。
1枚のマイクロプレートに、(1)で調製した異なる濃度の尿素溶液を各20μLずつ、10mMのマンガン溶液20μLずつ、500mMのアルギニン溶液40μLずつ、各8ウェルずつ(合計56ウェル×1枚)、マルチピペッターで添加した。続いて、マイクロプレートに、(2)で調製した尿素検出試薬を含む酸性溶液を各180μLずつマルチピペッターで添加した。続いて、遮光条件下で、95℃で2時間加熱した。続いて、加熱時に遮光条件下であったサンプルに紫外線を0分、15分、30分、1時間又は2時間照射した。なお、紫外線光源としては殺菌灯(照射エネルギー:0.5mJ/cm2/min)を用いた。また、サンプルと殺菌灯との距離は、約70cmであった。続いて、マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、540nmでの吸光度を測定した。結果を図4に示す。図4において、「UV 0h」とは紫外線照射が0分、「UV 0.25h」とは紫外線照射が15分、「UV 0.5h」とは紫外線照射が30分、「UV 1h」とは紫外線照射が1時間、「UV 2h」とは紫外線照射が2時間であるサンプルを示す。
一方、加熱後の紫外線照射時間が15分から1時間までは、尿素の濃度に依存した吸光度値の上昇率が高くなる傾向であったが、加熱後の紫外線照射時間が2時間では、吸光度値の上昇率がやや低くなっていた。
このことから、加熱後の紫外線照射時間を0分より長く1時間以下とすることで、尿素の濃度に依存した吸光度の上昇率が高くなり、より高感度で尿素を測定できることが確かめられた。
(1)尿素溶液の調製
尿素(ナカライテスク社製)を用いて、実施例1の(1)と同様の方法により、0、5、10、20、40、80、160μg/mLとなるように尿素溶液を調製した。
実施例1の(2)と同様の方法を用いて、尿素検出試薬を含む酸性溶液を調製した。
1枚のマイクロプレートに、(1)で調製した異なる濃度の尿素溶液を各20μLずつ、10mMのマンガン溶液20μLずつ、500mMのアルギニン溶液40μLずつ、それぞれマルチピペッターで添加した。このとき、各濃度の尿素溶液を含むサンプルにおいて、尿素溶液のみを含むサンプル(2ウェル)、尿素溶液とマンガン溶液とを含むサンプル(2ウェル)、尿素溶液とアルギニン溶液とを含むサンプル(2ウェル)、及び、尿素溶液とマンガン溶液とアルギニン溶液とを含むサンプル(2ウェル)、合計56ウェル(=各8ウェル×7種類の濃度)を準備した。続いて、マイクロプレートに、(2)で調製した尿素検出試薬を含む酸性溶液を各180μLずつマルチピペッターで添加した。続いて、95℃で2時間加熱した。続いて、マイクロプレートリーダー(モレキュラーデバイス(Molecular Devices)社製、Spectra Max i3)を用いて、540nmでの吸光度を測定した。結果を図5に示す。図5において、「尿素+Mn+アルギニン」とは尿素溶液とマンガン溶液とアルギニン溶液とを含むサンプル、「尿素」とは尿素溶液のみを含むサンプル、「尿素+Mn」とは尿素溶液とMn溶液とを含むサンプル、「尿素+アルギニン」とは尿素溶液とアルギニン溶液とを含むサンプルを示す。
一方、尿素溶液とアルギニン溶液とを含むサンプルでは、尿素濃度が20mg/mLまでは、吸光度値が尿素濃度をほとんど反映しなかったが、尿素濃度が40mg/mL以上において、尿素濃度の変化に伴い、吸光度値が上昇していた。
さらに、尿素溶液とマンガン溶液とアルギニン溶液とを含むサンプルでは、吸光度値が尿素濃度を反映していた。
以上のことから、尿素を含む試料に、マンガン溶液とアルギニン溶液とを添加することで、高感度に尿素を測定できることが明らかとなった。
Claims (7)
- 反応容器に尿素を含む試料と、アルギニンと、2価のカチオンを含む溶液とを添加して混合する混合工程と、
前記混合工程後の試料に、尿素検出試薬を含むpH4.0以下の酸性溶液を添加し、尿素の検出反応を行う検出反応工程と、
を備えることを特徴とする尿素の測定方法。 - 前記検出反応工程において、前記酸性溶液を添加した前記試料を室温以上100℃以下で30分以上加熱し、尿素の検出反応を促進する請求項1に記載の尿素の測定方法。
- 前記加熱を遮光下で行う請求項2に記載の尿素の測定方法。
- 前記加熱後の前記試料に紫外線を照射する請求項3に記載の尿素の測定方法。
- 前記反応容器がマイクロプレートである請求項1〜4のいずれか一項に記載の尿素の測定方法。
- アルギニンと、
2価のカチオンを含む溶液と、
尿素検出試薬を含むpH4.0以下の酸性溶液と、
を備えることを特徴とする尿素検出キット。 - 前記2価のカチオンがマンガンである請求項6に記載の尿素検出キット。
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JPS6359899A (ja) * | 1986-09-01 | 1988-03-15 | Advance Co Ltd | 癌診断方法及びキツト |
JP2010500973A (ja) * | 2006-07-21 | 2010-01-14 | マース インコーポレーテッド | アルギナーゼ濃度/活性の改善 |
JP2015516397A (ja) * | 2012-04-18 | 2015-06-11 | マーズ インコーポレイテッド | アルギナーゼ阻害剤としての環拘束性類似体 |
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