JP2018188375A - ペントシジン生成阻害剤 - Google Patents

Abstract

【課題】蛋白質の糖化反応最終生成物は、老化現象、認知症、癌、高血圧、動脈硬化症などに関与しているといわれている。そのなかで、ペントシジン（Ｐｅｎｔｏｓｉｄｉｎｅ）は糖尿病性腎症や骨粗しょう症のマーカーとして近年注目されている。本発明はペントシジンの生成阻害剤を提供することを課題とする。【解決手段】上記課題を解決するために、ルテオリン−７−Ｏ−グルコシド、トリシン、カテキン、アストラガリン、イソクエルシトリン、ルチン、没食子酸及びエラグ酸より選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有するペントシジン生成阻害剤を提供する。また、係るペントシジン生成阻害剤を含有する飲食品、健康食品、食品添加物、医薬品、化粧品、医薬部外品を提供する。【選択図】図２

Description

本発明は、蛋白質の糖化反応による最終生成物であるペントシジンの生成を阻害するペントシジン生成阻害剤などに関する。

近年、蛋白質の糖化反応が老化現象、認知症、癌、高血圧、動脈硬化症などにも関与していることが明らかになっている。例えば、糖化反応により蛋白質は褐変化するが、これにより、肌などにくすみが生じることになる。また、糖化反応により皮膚や骨のコラーゲンが硬化することにより、皮膚や骨の弾力及びしなやかさが損なわれてしまう。そこで、生体に様々な影響を及ぼす糖化反応を阻害するための研究が種々行われている。

図１に蛋白質糖化反応の態様を示す。糖化反応の反応経路についてはすべてが解明されているものではないが、まず、グルコースなどの還元糖と蛋白質やアミノ酸のアミノ基との反応によりシッフ塩基が形成され、引き続きエナミノールを経て、アマドリ転位によって安定なアマドリ化合物となる。ここまでの反応を、糖化反応系における前期段階と呼んでいる。

前期段階に続く後期段階において、アマドリ化合物は脱水、加水分解、炭素間の開裂により、グリオキサール（ＧＯ）、メチルグリオキサール（ＭＧ）、３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）など、分子内に２つのカルボニル基（Ｃ＝０）を有するα−ジカルボニル化合物を生成する。これらの生成物を糖化反応中間体と呼んでいる。その後、生体内ではα−ジカルボニル化合物、シッフ塩基やアマドリ化合物の分解、脂質過酸化反応由来のアルデヒド、糖の自動酸化や分解などにより糖化反応最終生成物であるＡＧＥｓ（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄｐｒｐｄｕｃｔｓ）が生成する。

ＡＧＥｓという名称は、あくまでも糖化反応による最終生成物の総称であり、一定の構造を示す化合物ではない。ＡＧＥｓには蛍光性物質と非蛍光性物質がある。クロスリン、アルグピリミジン、ピロピリジン、ペントシジンなどは蛍光性ＡＧＥｓである。クロスリン、ピロピリジン、ＤＯＬＤなど蛍光性ＡＧＥｓの多くは３７０ｎｍ付近の励起波長で４４０ｎｍ付近の蛍光を発する。このため一般的なＡＧＥｓ測定には３７０ｎｍ付近の励起波長で４４０ｎｍ付近の蛍光を測定する方法が使用される。しかしペントシジンは３３５ｎｍ付近の励起波長で３８５ｎｍ付近の蛍光を発するため、３７０ｎｍ付近の励起波長で４４０ｎｍ付近の蛍光を測定する方法で測定できない。一方、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、アルグピリミジンなどは非蛍光性ＡＧＥｓであり蛍光による測定ができない。

本発明者らは、このような糖化反応最終生成物のうちで、糖化反応の後期段階において生成するペントシジン（Ｐｅｎｔｏｓｉｄｉｎｅ）に着目した。ペントシジンは、糖尿病性腎症や骨粗しょう症のマーカーとして近年注目されている。そして、ある種の植物抽出物にペントシジンの生成阻害作用があることが報告されている。

特開２０１３−２５３０７２号公報

本発明は、糖化反応最終生成物であるペントシジンの生成を阻害するペントシジン生成阻害剤を提供することを課題とする。

上記課題を解決するための手段として、以下の発明などを提供する。すなわち、ルテオリン−７−Ｏ−グルコシド、トリシン、カテキン、アストラガリン、イソクエルシトリン、ルチン、没食子酸及びエラグ酸より選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有するペントシジン生成阻害剤を提供する。

また、上記ペントシジン生成阻害剤を含有する飲食品、健康食品、食品添加物、医薬品、化粧品、医薬部外品を提供する。

本発明により、糖化反応最終生成物であるペントシジンの生成を阻害するペントシジン生成阻害剤を提供することが可能となる。

蛋白質糖化反応の反応経路を示す概念図 試験におけるペントシジン生成阻害作用の測定結果

以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、本発明は、これらの実施形態に何ら限定されるべきものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得る。
＜実施例＞
＜構成＞

「ルテオリン−７−Ｏ−グルコシド（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ−７−Ｏ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）（Ｃ_２１Ｈ_２０Ｏ_１１）」は、フラボンの一種であるルテオリンの配糖体である。天然にはホオズキ、アーティチョーク、クマザサなどに含まれている。

「トリシン（４'，５，７−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−３'，５'−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ Ｔｒｉｃｉｎ）（Ｃ_１７Ｈ_１４Ｏ_７）」は、メトキシフラボンの一種である。天然にはクマザサ、オオムギなどに含まれている。

「（＋）カテキン（Ｃａｔｅｃｈｉｎ）（Ｃ_１５Ｈ_１４Ｏ_６）」は、フラボノイドの一種である。天然には、カキノキ、ソラマメ、ブドウ、アンズなどに含まれている。

「アストラガリン（Ａｓｔｒａｇａｌｉｎ）（Ｃ_２１Ｈ_２０Ｏ_１１）」は、フラボノイドの一種で、ケンフェロールの３−Ｏ−グルコシドである。天然には、カキノキ、ヨウシュヤマゴボウ、ビワ、ハトムギなどに含まれている。

「イソクエルシトリン（Ｉｓｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）（Ｃ_２１Ｈ_２０Ｏ_１２）」は、フラボノイドの一種で、ケルセチンの３−Ｏ−グルコシドである。天然には、タンポポ、カキノキ、スイカなどに含まれている。

「ルチン（Ｒｕｔｉｎ）（Ｃ_２７Ｈ_３０Ｏ_１６）」は、フラボノイドの一種で、ケルセチンの３−ルチノシドである。天然には、ソバ、アスパラガス、カキノキ、柑橘類の果皮などに含まれている。

「没食子酸（Ｇａｌｌｉｃ Ａｃｉｄ）（Ｃ_７Ｈ_６Ｏ_５）」は、芳香族カルボン酸で没食子五倍子、カキノキ、チャノキなどに含まれている。

「エラグ酸（Ｅｌｌａｇｉｃ Ａｃｉｄ（Ｃ_１４Ｈ_６Ｏ_８）」は、ポリフェノールの一種で、天然には、ベリー類、ナッツ類、テンヨウケンコウシ、ゲンノショウコなどに含まれている。

本実施例におけるペントシジン生成阻害剤は、さらに既知の方法を用いることにより、当該ペントシジン生成阻害剤を含有する食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧品などとして提供することが可能である。これらの各態様にて摂取することで、糖尿病性腎症、骨粗しょう症、心筋梗塞、アルツハイマー型認知症、肌の老化などの予防に用いることができる。

例えば、医薬品とする場合には、本実施例のペントシジン生成阻害剤を粉体や粒体としカプセルに充填したり、あるいは、賦形剤、結合剤、崩壊剤などを添加して打錠機等を用いて製造することができる。また、食品とする場合には、各植物を適宜乾燥や破砕等を湯で煮出すことで提供できる。また、医薬品のようにカプセルや錠剤のような形態で提供してもよいし、他の飲料、調味料、菓子等の各種の食品にペントシジン生成阻害剤を添加した態様で提供することもできる。

また、美容液、クリーム、ローションなどの化粧品とすることもできる。例えば、美容液とする場合には、本実施例のペントシジン生成阻害剤の他、水、コメヌカ油、ペンチレングリコール、グリセリン、スクワラン、パルミチン酸セチル、ダイマージリノール酸などを主成分とし、ヒアルロン酸Ｎａ、水添ナタネ油アルコール、カルボマー、キサンタンガム、水酸化カリウム、ジメチコン、ポリソルベート−６０、ステアリン酸グリセリル、水添ヒマシ油、フェノキシエタノール、尿素、アルギニン、アルブチン、クエン酸などを添加剤とする。そして、各成分を水溶性原料・油溶性原料に分けて溶解してから、それらを加熱して混合・乳化する。これを冷却しながらエキスなどの添加物を配合し、さらに低温になったところで精油や香料などの揮発性の高いものを添加する。その後、所定の安全性の検査（菌、ｐＨ、温度安定性、粘度等）を行い、瓶などに充填して製品として提供することができる。
＜試験１＞

（１）サンプル調製
本試験では、サンプルとしてルテオリン−７−Ｏ−グルコシド、トリシン、ルブソシドを用い、ポジティブコントロールとしてエピガロカテキンガレート（没食子酸エピガロカテキン）を用いた。なお、溶解溶媒は、ルブソシド及びＥＧＣｇには蒸留水を用い、ルテオリン−７−Ｏ−グルコシドにはエタノールを用い、トリシンにはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いた。ルブソシド（Ｒｕｂｕｓｏｓｉｄｅ）」（Ｃ_３２Ｈ_５０Ｏ_１３）は、甜茶の原料であるテンヨウケンコウシに含まれる物質であり、甘味成分として知られている。また、は上記の各サンプルの水溶液を３つの濃度（１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ）に調製した。エピガロカテキンガレートについては、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０３ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬの３つの濃度に調製した。

（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ 糖化反応
０．０５ ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、８ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ＨＳＡ）、０．２ｍｏｌ／Ｌグルコース反応液中に、調製した各濃度の試料溶液を１／１０濃度になるように添加し、６０℃で４０時間インキュベートした。ペントシジンの測定にはインキュベート後の各反応液を使用した。

（３）ペントシジン生成阻害作用の測定
反応液中に生成したペントシジンは、所定の方法（Scheijen JL , Waarenburg MP, Stehouwer CD, Schalkwijk CG. Measurement of pentosidine in human plasma protein by a single-column high-performance liquid chromatography method with fluorescence detection. Journal of Chromatography B. 2009; 877: 610-614）を参考にＨＰＬＣ法で定量した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ 糖化反応（ＨＳＡ−グルコース）後の反応液５０μＬに２００ｍｍｏｌ／Ｌ水素化ホウ素ナトリウム水溶液２５０μＬを加えて、３０分間室温で静置した。その後２０％トリクロロ酢酸溶液（ＴＣＡ）１ｍＬを加えて１５分間氷冷後、４５００ｇで１０分間遠心分離し、蛋白を沈殿させた後、上清を除去した。沈殿した蛋白に１００μＬの蒸留水と６Ｎ 塩酸１００μＬを加えて密閉し、１０５℃に設定したアルミブロックヒーターで、１８時間加熱した。その後、反応液を遠心エバポレーターで蒸発乾固させた後、ＨＰＬＣ溶離液４００μＬ添加して溶解後、下記ＨＰＬＣ分析条件でペントシジンを定量した。

（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：Unison US-C18（５μｍ，１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ）（インタクト製）
溶離液：１００ ｍｍｏｌ／Ｌ クエン酸 ／ アセトニトリル =９９．５／０．５
流量：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：２０℃
検出条件：蛍光（励起波長 ３２５ｎｍ，検出波長 ３８５ｎｍ）
注入量：２０μＬ

ペントシジン生成阻害率は、糖化反応系においてサンプルを添加した反応液（Ａ）、グルコース水溶液の代わりに蒸留水を添加したもの（Ｂ）、サンプルを添加しない溶液のみを添加してインキュベーションしたもの（Ｃ）、ブランクとしてグルコースの代わりに蒸留水を添加したもの（Ｄ）として下記の式に従って算出した。ポジティブコントロールのペントシジン生成阻害活性はＩＣ_５０（５０％阻害濃度）を算出し、有効数字２桁で表示した。

ペントシジン生成阻害率（％）=｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００

サンプルの代わりにそれぞれの溶解溶媒（蒸留水、ＤＭＳＯ、エタノール）を添加したものをリファレンス（Ｒｅｆ）とし、ポジティブコントロールには３、１、０．０１ｍｇ/ｍＬのエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）を用いた。

（４）結果
ペントシジン生成阻害作用の測定結果を下記の表１に示す。なお、ルテオリン−７−Ｏ−グルコシドのＩＣ_５０は、試料濃度０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬにおける生成阻害率から算出した。

また、図１は、各試料のペントシジン生成阻害率をグラフとして示した図である。

ルテオリン−７−Ｏ−グルコシド、トリシンにはペントシジン生成阻害作用がみられた。一方、ルブソシドにはその作用がみられなかった。ルテオリン−７−Ｏ−グルコシドのＩＣ_５０値は０．０１ｍｇ／ｍＬであった。トリシンは本試験における試料濃度範囲において阻害率が５０％を超えなかったため、ＩＣ_５０値を算出することができなかった（ＩＣ_５０＞１．０ｍｇ／ｍＬ）。
＜試験２＞

（１）サンプル調製、糖化反応液
本試験では、カテキン、アストラガリン、イソクエルシトリン、ルチン、没食子酸及びエラグ酸をサンプルとした。なお、溶解溶媒は、カテキン、没食子酸及びＥＧＣｇには蒸留水を用い、アストラガリン及びルチンにはエタノールを用い、イソクエルシトリン及びエラグ酸にはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いた。

抗ペントシジン活性の測定にはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）−グルコース反応液を使用した。０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２ＨＰＯ_４リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、８ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、０．２ｍｏＬ／Ｌグルコース糖化反応液中に、１ｍｇ／ｍＬに調製した各成分物質を１／１０濃度になるように添加し、６０℃で４０時間インキュベートした。

サンプルの代わりにそれぞれの溶解溶媒（蒸留水、ＤＭＳＯ、エタノール）を添加したものをリファレンス（Ｒｅｆ）とし、ポジティブコントロールには３、１、０．０１ｍｇ／ｍＬのエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）を用いた。

（２）ペントシジン量の測定
試験１と同じ方法で定量した。

（３）結果
下記の表２に示すように、今回評価した成分類すべてにペントシジン生成阻害作用がみられた。ペントシジン生成阻害率が８０％を超えたのは没食子酸のみであり、（＋）カテキン、イソクエルシトリン、ルチン及びエラグ酸は29〜57％程度、アストラガリン（カキノキ含有成分）は0.3%と低い阻害率であった。エラグ酸のペントシジン生成阻害率は低濃度（０．０１％）サンプルが高値であった。エラグ酸のペントシジン生成阻害作用は濃度依存しないか、高濃度でペントシジン生成を促進する可能性が推定された。

＜効果＞

本発明により、糖化反応最終生成物であるペントシジンの生成を阻害するペントシジン生成阻害剤を提供することが可能となる。

Claims (7)

1. ルテオリン−７−Ｏ−グルコシド、トリシン、カテキン、アストラガリン、イソクエルシトリン、ルチン、没食子酸及びエラグ酸より選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有するペントシジン生成阻害剤。
2. 請求項１に記載のペントシジン生成阻害剤を含有する飲食品。
3. 請求項１に記載のペントシジン生成阻害剤を含有する健康食品。
4. 請求項１に記載のペントシジン生成阻害剤を含有する食品添加物。
5. 請求項１に記載のペントシジン生成阻害剤を含有する医薬品。
6. 請求項１に記載のペントシジン生成阻害剤を含有する化粧品。
7. 請求項１に記載のペントシジン生成阻害剤を含有する医薬部外品。

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