JP2018184351A - ヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体、それを構成単位として含むrna誘導体、核酸医薬、及びrna誘導体若しくはrnaの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】式(1)で表すヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体。
(X1及びX2は夫々独立にH、置換/非置換のシリル基、4−メトキシトリチル基、4,4’−ジメトキシトリチル基等;Baは修飾/非修飾の核酸塩基;Rpとしては式(P1)が例示される;Rはメトキシ基等の電子供与性を有する置換基;R1及びR2は夫々独立にH又はアルキル基)
【選択図】図2
Description
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドの誘導体(以下、単にヌクレオシドの誘導体とも呼ぶ。)は、下記一般式(1)で表す化合物である。この化合物は、RNA合成のために好ましく用いられ、特にホスホロアミダイトである場合には、固相合成法による鎖伸長反応において高い反応速度と反応効率を実現できる。
下記一般式(3)で表すリボヌクレオシド誘導体を構成単位として含むRNA誘導体も本発明の一つである。このRNA誘導体は、上記で説明した本発明のヌクレオシド誘導体をもとにRNA合成して得られるものであり、構成単位となるヌクレオチドの少なくとも一部において、2’位の水酸基が上述の保護基で保護されている。本発明のRNA誘導体は、全ての構成単位において2’位に上述の保護基を備えていてもよいし、一部の構成単位においてのみ2’位に上述の保護基を備えていてもよい。なお、RNA誘導体の構成単位とは、RNA誘導体を構成する重合鎖に含まれる一つ一つのヌクレオチドからリン酸部分を取り除いた断片部分(すなわち、下記一般式(3)で表す部分)をいう。
上記本発明のRNA誘導体を含むことを特徴とする核酸医薬もまた、本発明の一つである。これについては上記RNA誘導体で説明した通りであるので、ここでの説明を省略する。
上記本発明のヌクレオチドの誘導体を用いてRNA鎖を伸長させる工程を備えることを特徴とするRNA誘導体の合成方法もまた、本発明の一つである。既に説明したように、本発明のヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体は、2’位の水酸基に特定の保護基Rp(すなわち、上記一般式(P1)〜(P3)で表す基)を備えたRNA誘導体の合成に用いることができる。このとき、RNA鎖を伸長させる工程を行うことになるが、そのような工程としてはホスホロアミダイトを用いた固相合成法を初めとして各種のものが公知なので、目的に合った方法を適宜選択して行えばよい。
上記本発明のRNA誘導体の製造方法で得たRNA誘導体に対して、還元操作を行うことでRNAの2’位水酸基に施した保護基Rpを脱保護する工程を備えることを特徴とするRNAの製造方法もまた、本発明の一つである。既に説明したように、本発明のRNA誘導体は、2’位の水酸基に導入された保護基Rp(すなわち、上記一般式(P1)〜(P3)で表す基)を備え、この保護基Rpは、弱酸性〜中性の水溶液中で還元操作を行うことで容易に脱離させることが可能である。そして、この還元操作を行った水溶液を逆相カラムクロマトグラフィー等で処理することにより、保護基が脱離して生じた化合物と目的物であるRNAとを容易に分離することができる。これらのことについては既に説明した通りであるので、ここでの説明を省略する。
化合物3(0.672g、1.2mmol)及び化合物8(283mg、1.32mmol)を無水ピリジンで3回共沸脱水し、無水トルエンで2回共沸除去した後、反応容器に入れてアルゴン置換し、THF(4mL)に溶解させた。N−ヨードスクシンイミド(NIS、326mg、1.45mmol)、モレキュラーシーブス4A(496mg)、及びトリフルオロメタンスルホン酸(TfOH、120μL、1.36mmol)を順次加え、ドライアイス+アセトニトリル上で3.5時間撹拌した。TLCにより原料消失を確認し、トリエチルアミン(Et3N、1mL)を加え、セライト濾過し、減圧下濃縮した。その後、飽和炭酸ナトリウム水溶液で1回、飽和食塩水で1回洗浄した。有機層を集めて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濾過し、減圧下濃縮した。これを無水ピリジンで3回共沸脱水し、無水トルエンで2回共沸除去した後、反応容器に入れてアルゴン置換し、THF(15mL)に溶解させた。トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(Et3N−3HF、855μL、4.2mmol)を加え、室温で20時間撹拌した。TLCにより原料消失を確認し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム:メタノール=100:0〜94:6で展開、98:2で溶出)で精製し、化合物9を黄色粉末固体(0.332g、0.71mmol、収率59%)として得た。化合物9は本発明のヌクレオシド誘導体に相当し、2’位水酸基の保護基に含まれる芳香環にメトキシ基が2個導入されたものになる。
2’位水酸基の保護基にメトキシ基が1個導入された化合物4(10mg、0.0228mmol)をメタノール(1mL)に溶解させ、NH4Cl(3mg、0.0912mmol)及びZn(5mg、0.1596mmol)を順次加え、室温で2時間撹拌した。TLCにより反応の進行を確認したところ、原料のスポットの消失と新たなスポットの出現を確認した。新たなスポットはニトロ基が還元されて生成した中間体と考えられ、遊離の(すなわち、脱保護された)ウリジンのスポットは現れなかった。セライト濾過を行い、濾液を減圧下濃縮した。残渣をメタノール(1mL)に溶解させ、そこから50μLとり、pH6.0の100mMリン酸緩衝液を50μL加え、37℃で静置した。TLCにより、遊離のウリジンと同じRf値のスポットが新たに出現したことが確認された。このことから、2’位水酸基の保護基にメトキシ基が1個導入された化合物4では、還元操作を行った後、緩衝液を加えて弱酸性を維持することで脱保護されることがわかった。なお、2’位水酸基の保護基にメトキシ基が導入されていない化合物(非特許文献1に記載された化合物)では、同様の操作を行っても遊離のウリジンは生成せず、脱保護されなかった。
化合物9(10mg、0.0213mmol)をメタノール(1mL)に溶解させ、NH4Cl(8.4mg、0.256mmol)及びZn(14mg、0.447mmol)を順次加え、室温で撹拌した。TLCにより、ウリジンと同じRf値のスポットが新たに出現したことが確認された。このことから、2’位水酸基の保護基にメトキシ基が2個導入された化合物9では、還元操作を行うだけで脱保護されることがわかった。
2’位水酸基の保護基に導入されたメトキシ基が0個のホスホロアミダイトである化合物11、同じくメトキシ基が1個のホスホロアミダイトである化合物13、及び同じくメトキシ基が2個のホスホロアミダイトである化合物15をそれぞれ用いて、DNA/RNA合成機を用いた固相ホスホロアミダイト法により、表1に示す配列を有するオリゴヌクレオチド(ON1〜ON4)を合成した。なお、表1に示した配列において、Tはチミン、U(MeO)0は2’位水酸基に保護基を持ち、この保護基に導入されたメトキシ基が0個のウラシル、U(MeO)1は同じくメトキシ基が1個のウラシル、U(MeO)2は同じくメトキシ基が2個のウラシルを意味する。
マイクロチューブにON2溶液(5.0μL)を測り取り、内部標準として1mMチミジン溶液(4.8μL)を加え、乾固させた。2Mクエン酸緩衝液(20μL)、純水(179.6μL)、及び1M三塩化チタン(0.2μL)を順次加え、脱保護反応を行った。経時毎に10μLずつサンプリングし、逆相シリカゲルカラムを用いるHPLCで分析した。その結果を図1に示す。図1は、三塩化チタンによるON2の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すHPLCチャートである。
マイクロチューブにON3溶液(4.3μL)を測り取り、内部標準として1mMチミジン溶液(2.4μL)を加え、乾固させた。2Mクエン酸緩衝液(20μL)、純水(172.9μL)、及び1M三塩化チタン(0.4μL)を順次加え、脱保護反応を行った。経時毎に10μLずつサンプリングし、逆相シリカゲルカラムを用いるHPLCで分析した。その結果を図2に示す。図2は、三塩化チタンによるON3の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すHPLCチャートである。
マイクロチューブにON1溶液(10.8μL)を測り取り、内部標準として500μM N6−Benzoyl−2’−dA−Hydrate溶液(7.2μL)、100mMリン酸緩衝液(pH6.0、90μL)、100mM NADH水溶液(30μL)、及び純水(42μL)を順次加え、37℃の恒温槽に20分間静置した。そこから60μLを別のマイクロチューブに取り、100mMリン酸緩衝液(pH6.0、20μL)、及び純水20μLを加え、これを反応前とした。原液に100mMリン酸緩衝液(pH6.0、40μL)、純水30μL、及びニトロレダクターゼ水溶液(10μL)を加え、酵素反応を行った。経時毎に10μLずつ取り、逆相シリカゲルカラムを用いるHPLCで分析した。その結果を図3に示す。図3は、ニトロレダクターゼによるON1の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すHPLCチャートである。
マイクロチューブにON2溶液(3.75μL)を測り取り、内部標準として500μM N6−Benzoyl−2’−dA−Hydrate溶液(7.2μL)、100mMリン酸緩衝液(pH6.0、90μL)、100mM NADH水溶液(30μL)、及び純水(49.05μL)を順次加え、37℃の恒温槽に20分間静置した。そこから60μLを別のマイクロチューブに取り、100mMリン酸緩衝液(pH6.0、20μL)、及び純水20μLを加え、これを反応前とした。原液に100mMリン酸緩衝液(pH6.0、40μL)、純水30μL、及びニトロレダクターゼ水溶液(10μL)を加え、酵素反応を行った。経時毎に10μLずつ取り、逆相シリカゲルカラムを用いるHPLCで分析した。その結果を図4に示す。図4は、ニトロレダクターゼによるON2の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すHPLCチャートである。
マイクロチューブにON3溶液(6.5μL)を測り取り、内部標準として500μM N6−Benzoyl−2’−dA−Hydrate溶液(7.2μL)、100mMリン酸緩衝液(pH6.0、90μL)、100mM NADH水溶液(30μL)、及び純水(46.3μL)を順次加え、37℃の恒温槽に20分間静置した。そこから60μLを別のマイクロチューブに取り、100mMリン酸緩衝液(pH6.0、20μL)、及び純水20μLを加え、これを反応前とした。原液に100mMリン酸緩衝液(pH6.0、40μL)、純水30μL、及びニトロレダクターゼ水溶液(10μL)を加え、酵素反応を行った。経時毎に10μLずつ取り、逆相シリカゲルカラムを用いるHPLCで分析した。その結果を図5に示す。図5は、ニトロレダクターゼによるON3の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すHPLCチャートである。
マイクロチューブにON4溶液(4.0μL)を測り取り、内部標準として500μM N6−Benzoyl−2’−dA−Hydrate溶液(7.2μL)、100mMリン酸緩衝液(pH6.0、90μL)、100mM NADH水溶液(30μL)、及び純水(48.8μL)を順次加え、37℃の恒温槽に20分間静置した。そこから60μLを別のマイクロチューブに取り、100mMリン酸緩衝液(pH6.0、20μL)、及び純水20μLを加え、これを反応前とした。原液に100mMリン酸緩衝液(pH6.0、40μL)、純水30μL、及びニトロレダクターゼ水溶液(10μL)を加え、酵素反応を行った。経時毎に10μLずつ取り、逆相シリカゲルカラムを用いるHPLCで分析した。その結果を図6に示す。図6は、ニトロレダクターゼによるON4の脱保護反応を行ったときの経時変化を示すHPLCチャートである。
Claims (7)
- 下記一般式(1)で表すヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体。
- 下記一般式(1a)で表す請求項1記載のヌクレオシド又はそのヌクレオチドの誘導体。
- 下記一般式(3)で表すヌクレオシド誘導体を構成単位として含むRNA誘導体。
- 下記一般式(3a)で表すリボヌクレオシド誘導体を構成単位として含む請求項3記載のRNA誘導体。
- 請求項3又は4記載のRNA誘導体を含むことを特徴とする核酸医薬。
- 請求項1又は2記載のヌクレオチドの誘導体を用いてRNA鎖を伸長させる工程を備えることを特徴とする、RNA誘導体の製造方法。
- 請求項6記載のRNA誘導体製造方法で得たRNA誘導体に対して、還元操作を行うことでRNAの2’位水酸基に施した保護基Rpを脱保護する工程を備えることを特徴とするRNAの製造方法。
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JP2017085377A JP6950904B2 (ja) | 2017-04-24 | 2017-04-24 | ヌクレオチドの誘導体、及びrna誘導体若しくはrnaの製造方法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2022147223A3 (en) * | 2020-12-31 | 2022-09-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified nucleoside based oligonucleotide prodrugs |
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WO2022147223A3 (en) * | 2020-12-31 | 2022-09-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified nucleoside based oligonucleotide prodrugs |
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