JP2018179804A - Protein separation and refinement method and device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、バイオ医薬品の製造技術分野に関する。 The present invention relates to the field of biopharmaceutical manufacturing technology.
米国ＦＤＡは２００４年に医薬品の品質管理をより理想的にするためＧｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ＰＡＴを公表し、リアルタイムな計測により、医薬品の製造工程の設計、分析、管理を行い、最終的に製品の品質を保証するシステムを推奨した。低分子医薬品と比べ製造工程の難易度が高いバイオ医薬品の分野ではとりわけ、生産工程におけるリアルタイムの品質管理が重要だとされている（非特許文献１、非特許文献２）。
The US FDA published the Guidance for Industry PAT in 2004 to make drug quality control more ideal, and by using real-time measurement, it designed, analyzed and managed the manufacturing process of the drug, and finally the product quality Recommended system to guarantee. In the field of biopharmaceuticals in which the manufacturing process is more difficult than low molecular weight drugs, it is considered that real-time quality control in the manufacturing process is particularly important (Non-Patent
より高い純度のバイオ医薬品用タンパク質の精製のため、複数の液体クロマトグラフィーを直列につないで効率的な精製を行う方法や（特許文献１）種々のカラムクロマトグラフィー等を組み合わせたタンパク質の精製方法が技術常識として知られているが、工程中のタンパク質を簡便に検出する方法として、高速液体クロマトグラフィーによるタンパク質等ポリマーの精製工程の過程で特定の溶媒を加えその濁度から精製工程中のタンパク質の濃度を検出する方法も知られている（特許文献２）。 In order to purify proteins for biopharmaceuticals with higher purity, there is a method of performing efficient purification by connecting a plurality of liquid chromatographs in series, and a protein purification method combining various column chromatography etc. (Patent Document 1) As commonly known in the technical common sense, as a method for conveniently detecting proteins in the process, a specific solvent is added in the process of purification of polymers such as proteins by high performance liquid chromatography, and the turbidity of the protein in the purification process A method of detecting concentration is also known (Patent Document 2).
抗体のイムノグロブリン量の測定方法としてモノリスシリカ担体を有するカラムを用いた測定方法が知られている（特許文献３）。 As a method of measuring the amount of immunoglobulin of an antibody, a method of measuring using a column having a monolithic silica support is known (Patent Document 3).
従来の医薬品の定量方法は質量分析法等大型機器と測定技術を要する方法が中心で最終製品の定量には使用できても、工程中の医薬品の定量には不向きであった。また、高速液体クロマトグラフィーを用いたバイオ医薬品の定量方法も測定結果が出るまでに１時間程度を要するため、ＰＡＴのリアルタイムの結果測定には向いていなかった。更に定量目的のタンパク質を溶媒により白濁させる方法は、不要な溶媒を加えるため適用工程に限度がありタンパク質の特異性も低いため定量性に問題があった。 Conventional methods for quantifying pharmaceutical products are mainly methods requiring large equipment such as mass spectrometry and measurement techniques, and although they can be used for quantification of final products, they are unsuitable for quantification of pharmaceutical products in the process. In addition, the method for quantifying biopharmaceuticals using high-performance liquid chromatography is also not suitable for real-time measurement of PAT because it takes about 1 hour to obtain a measurement result. Furthermore, the method of whitening the protein for quantitative purpose with a solvent has a problem in quantitative property because the application process is limited to add unnecessary solvent and the specificity of the protein is low.
発明者らは、鋭意検討を行った結果、モノリスシリカ担体を有するカラムを検出用のカラムとして用いることにより、精製工程中、目的とするタンパク質を迅速かつ精度よく定量できることを確認し、この測定方法を応用すればＰＡＴに準拠したバイオ医薬品の生産
やバイオ医薬品の生産に用いる製造装置ができることを発案した。
As a result of intensive investigations, the inventors confirmed that the target protein can be quantified rapidly and accurately during the purification step by using the column having a monolithic silica support as a detection column, and this measurement method It was devised that there could be a manufacturing device used for the production of biopharmaceuticals according to PAT and the production of biopharmaceuticals by applying.
本発明は、
（１）対象タンパク質の精製工程における対象タンパク質濃度の測定方法において、培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液に含まれる対象タンパク質の濃度の測定を、モノリスシリカ担体を有する検出用カラムを用いて分離精製することで得られる対象タンパク質の濃度測定により行うことを特徴とする測定方法、
（２）精製工程が精製用クロマトグラフィーであることを特徴とする（１）記載の測定方法、
（３）培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液に含まれる対象タンパク質の濃度測定が、１分間以内に行われることを特徴とする（１）または（２）記載の測定方法、
（４）対象タンパク質の濃度測定が低圧条件下で行われることを特徴とする（１）〜（３）いずれかに記載の測定方法、
（５）対象タンパク質が、抗体であることを特徴とする（１）〜（４）いずれかに記載の測定方法、
（６）対象タンパク質の分離精製工程において、各工程の通過液をサンプリングし、各サンプルにおける対象タンパク質の濃度測定を、モノリスシリカ担体を有する検出用カラムを用いて分離精製することで得られる対象タンパク質の濃度を経時的に測定し、モニターすることを特徴とする対象タンパク質の製造方法、
（７）精製用クロマトグラフィーの注入液およびカラム通過液中の対象タンパク質のモニター結果の相違から、精製用クロマトグラフィーに充填された担体への対象タンパク質の吸着量を測定することを特徴とする（６）記載の対象タンパク質の製造方法、
（８）対象タンパク質が抗体であることを特徴とする（６）または（７）記載の製造方法、
（９）対象タンパク質の精製工程における対象タンパク質濃度の測定装置において、培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液に含まれる対象タンパク質の濃度測定を、モノリスシリカ担体を有する検出用カラムを用いて分離精製することで得られる対象タンパク質の濃度測定により行うことを特徴とする測定装置、
（１０）精製工程が精製用クロマトグラフィーを用いる工程であることを特徴とする（９）記載の測定装置
（１１）送液部、サンプル注入部および検出部から構成されることを特徴とする（９）または（１０）記載の測定装置、
（１２）送液部は対象タンパク質の精製プラント上の培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液を移送する主配管上に設けられた分岐バルブにより分岐した配管と、接続可能な形状を持ち、ポンプにより培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液をサンプル注入部に吐出することを特徴とする（１１）記載の測定装置、
（１３）サンプル注入部が注入切り替えバルブを介して検出用カラムまたは排出口に接続する機能を持つことを特徴とする（１１）または（１２）記載の測定装置、
（１４）検出部が、検出用カラムを通過した液を検出セルに導き、光源から導かれた波長２８０ｎｍの光を検出セルに照射し、検出セルを透過した光を検出することにより、吸光度をオンラインでモニターする機能を持つことを特徴とする（１１）〜（１３）いずれかに記載の測定装置、
（１５）検出部がモノリスシリカ担体を有する検出用カラムを含むことを特徴とする（１１）〜（１４）いずれかに記載の測定装置、
（１６）送液部、サンプル検出部および検出部の各構成要素に対して通信を行い、動作の状態に対応する命令の送信、応答を取得する制御部を有することを特徴とする（１１）〜（１５）いずれかに記載の測定装置、および
（１７）精製用クロマトグラフィーを用いた対象タンパク質の分離精製装置において、培養液または精製用クロマトグラフィーで得られる多様な混合溶液の流路に（１０）〜（１６）いずれかに記載のタンパク質濃度の測定装置を接続することにより、精製工程中の対象タンパク質の濃度をモニターすることを特徴とする分離精製装置、に関する。
The present invention
(1) In the method of measuring the concentration of the target protein in the purification step of the target protein, the measurement of the concentration of the target protein contained in the culture solution or various mixed solutions obtained in the purification process is performed using a detection column having a monolithic silica carrier. Measurement method by measuring the concentration of the target protein obtained by
(2) The method according to (1), wherein the purification step is chromatography for purification.
(3) The measurement method according to (1) or (2), wherein the concentration measurement of the target protein contained in the culture solution or various mixed solutions obtained in the purification process is performed within 1 minute.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the concentration of the target protein is measured under low pressure conditions.
(5) The measuring method according to any one of (1) to (4), wherein the target protein is an antibody.
(6) Separation and Purification of Target Protein Target protein obtained by sampling the flow through of each step and measuring the concentration of the target protein in each sample using a detection column having a monolithic silica carrier A method for producing a protein of interest, which comprises measuring and monitoring the concentration of
(7) It is characterized in that the amount of adsorption of the target protein on the carrier packed in the purification chromatography is measured from the difference between the monitoring results of the target protein in the injection liquid of the purification chromatography and the column flow-through liquid ( 6) A method for producing the target protein described in
(8) The method according to (6) or (7), wherein the target protein is an antibody,
(9) The apparatus for measuring the concentration of a protein of interest in the purification step of the protein of interest, wherein the concentration of the protein of interest contained in the culture solution or various mixed solutions obtained in the purification process is measured using a detection column having a monolithic silica carrier. A measuring device characterized by measuring the concentration of a target protein obtained by separation and purification;
(10) The measuring apparatus according to (9), characterized in that the purification step is a step using chromatography for purification, characterized in that it comprises a liquid transfer unit, a sample injection unit, and a detection unit (9). 9) The measuring device according to (10) or (10)
(12) The liquid transfer section has a shape connectable with a pipe branched by a branch valve provided on a main pipe for transporting the culture solution on the purification plant of the target protein or various mixed solutions obtained in the purification process (11) The measuring apparatus according to (11), wherein the pump discharges the culture solution or various mixed solutions obtained in the purification process to the sample injection unit.
(13) The measuring apparatus according to (11) or (12), wherein the sample injection unit has a function of connecting to the detection column or the discharge port via the injection switching valve.
(14) The detection unit guides the liquid that has passed through the detection column to the detection cell, irradiates the light with a wavelength of 280 nm led from the light source to the detection cell, and detects the light transmitted through the detection cell. The measuring apparatus according to any one of (11) to (13), characterized in that it has a function to monitor online.
(15) The measurement apparatus according to any one of (11) to (14), wherein the detection unit includes a detection column having a monolithic silica support.
(16) A control unit is provided, which communicates with each component of the liquid transfer unit, the sample detection unit, and the detection unit, and transmits a command corresponding to the state of operation and acquires a response (11) ~ (15) In the measuring device according to any of the above and (17) separation and purification device of the target protein using chromatography for purification, in the flow path of various mixed solutions obtained by culture solution or chromatography for purification ( 10) A separation / purification device characterized by monitoring the concentration of a target protein in a purification step by connecting the protein concentration measurement device according to any one of (16) to (16).
本発明により、バイオ医薬品の製造工程においてリアルタイムに目的とするバイオ医薬品の計測が可能になり、ＰＡＴに準拠した理想的なバイオ医薬品の品質管理、生産管理が
可能になるとともに、計測データをバイオ医薬品の製造工程の操作に反映させて、より高い生産効率でバイオ医薬品を製造することができる。
According to the present invention, it becomes possible to measure the target biopharmaceutical in real time in the manufacturing process of the biopharmaceutical, and it becomes possible to perform quality control and production control of an ideal biopharmaceutical based on PAT, and to measure data as a biopharmaceutical The biopharmaceutical can be produced with higher production efficiency, reflecting the operation of the production process.
本発明において、対象タンパク質とは、精製操作により高純度が要求されるタンパク質ならどのようなものでも良いが、好ましくは高速、高純度で分離でき結合特性に優れたアフィニティークロマトグラフィーで分離できるタンパク質が好ましい。タンパク質の例としてはアミラーゼ、セルラーゼ、DNAポリメラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、シトクロームｃオキシターゼ、フォスファターゼ、ペプチダーゼ等の酵素タンパク質、各種インターロイキン受容体等の受容体タンパク質、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン等のホルモンタンパク質、フィブリノーゲン、プロトロンビン、アルブミン、プロテアーゼインヒビター、ヘモグロビン等の血漿タンパク質、抗体、サイトカイン等の免疫タンパク質等が挙げられるが、バイオ医薬品に用いられる前記受容体タンパク質、前記ホルモンタンパク質、前記免疫タンパク質であることが好ましく、とりわけ抗体であることが好ましい。 In the present invention, the target protein may be any protein that requires high purity by purification operation, but preferably it is a protein that can be separated at high speed and high purity and can be separated by affinity chromatography with excellent binding characteristics. preferable. Examples of proteins include enzyme proteins such as amylase, cellulase, DNA polymerase, superoxide dismutase, cytochrome c oxidase, phosphatase and peptidase, receptor proteins such as various interleukin receptors, parathyroid hormone, growth hormone, gonadotropin release Hormone proteins such as hormones, fibrinogen, prothrombin, albumin, protease inhibitors, plasma proteins such as hemoglobin, antibodies, immune proteins such as cytokines, etc. may be mentioned, but the receptor protein used in biopharmaceuticals, the hormone protein, the immunity It is preferably a protein, particularly preferably an antibody.
本発明における対象タンパク質の精製工程とは、対象タンパク質を夾雑物のある状態から純度を高めるための操作手法であればどのようなものでも良いが、例えば対象タンパク質を生産する細胞の培養液等原料からの対象タンパク質の精製、採取に用いる除細胞後、清澄化終了後の溶液から対象タンパク質を回収する回収工程、中間または最終精製工程等が挙げられる。また、精製工程は培養液原料からの対象タンパク質の精製に限られず粗精製物からの精製工程も含まれる。 The purification process of the target protein in the present invention may be any operation method for increasing the purity of the target protein from the presence of contaminants, for example, a raw material for a culture solution of cells producing the target protein, etc. After the purification of the target protein from and removal of cells used for collection, a recovery step of recovering the target protein from the solution after completion of clarification, an intermediate or final purification step and the like can be mentioned. In addition, the purification step is not limited to the purification of the target protein from the culture solution raw material but includes the purification step from the crudely purified product.
清澄化工程に用いる手段としては、硫安沈殿、TCA沈殿、アセトン沈殿、TCA/アセトン沈殿、硫酸アンモニウム含有メタノール沈殿等各種方法により生じた対象タンパク質の沈殿を遠心分離機等により分離採取し、再度緩衝液等に溶解して濃縮する工程、限外ろ過膜等、フィルター用の膜を用いて不純物と分離する限外ろ過工程等が挙げられる。 As a means to be used in the clarification step, precipitates of the target protein formed by various methods such as ammonium sulfate precipitation, TCA precipitation, acetone precipitation, TCA / acetone precipitation, ammonium sulfate containing methanol precipitation, etc. are separated and collected by a centrifuge etc. The process of dissolving and concentrating in an etc., the ultrafiltration process etc. which isolate | separate from an impurity using a membrane for filters, such as an ultrafiltration membrane, etc. are mentioned.
対象タンパク質を回収する回収工程に用いる手段としては、対象タンパク質を特異的に補足できる手段であればどのようなものでも良いが、対象タンパク質と特異的に結合する
リガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いることが好ましい。具体的にはイムノグロブリンとの結合を利用したプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、レクチン等をリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィー、ヘパリンをリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィー、グルタチオンをリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられるが、これらのリガンドを改変したアフィニティークロマトグラフィーでもよい。
Any means may be used as a means for recovering the target protein as long as it can specifically capture the target protein, but affinity chromatography using a ligand that specifically binds to the target protein is used Is preferred. Specifically, affinity chromatography using protein A, protein G, protein L, lectin or the like as a ligand utilizing binding to immunoglobulin, affinity chromatography using heparin as a ligand, affinity chromatography using glutathione as a ligand There may be mentioned chromatography, but these ligands may be modified by affinity chromatography.
対象タンパク質の中間または最終精製工程に用いられる手段としては、タンパク質の精製手段であればどのような手段でも良いが前記アフィニティークロマトグラフィーのほかにイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。イオン交換クロマトグラフィーとして具体的には、官能基にクオタナリーアンモニウム（Ｑ）、
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ），ジエチルアミノプロピル（ＡＮＸ）等を持つ陰イオン交換クロマトグラフィー、官能基にスルフォプロピル（ＳＰ）、メチルスルフォネート（Ｓ），カルボキシメチル（ＣＭ）を持つ陽イオン交換クロマトグラフィー等があげられる。ゲルろ過クロマトグラフィーとしては具体的にはスーパーデックス、セファクリル、セファデックス等の樹脂を用いたクロマトグラフィーが挙げられる。
As a means used for the intermediate or final purification step of the target protein, any means may be used as long as it is a purification means of protein, but ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, etc. can be mentioned besides the affinity chromatography. Specifically as ion exchange chromatography, quaternary ammonium (Q) is used as a functional group.
Anion exchange chromatography with diethylaminoethyl (DEAE), diethylaminopropyl (ANX) etc., cation exchange chromatography with sulphopropyl (SP), methyl sulfonate (S), carboxymethyl (CM) as functional groups Etc. Specific examples of gel filtration chromatography include chromatography using a resin such as Superdex, Sephacryl, or Sephadex.
なお本発明が分析対象とする精製工程においては、通常用いるカラムクロマトグラフィーだけではなく、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速、高分離能精製システム（ＦＰＬＣ）を用いるシステムでも良く、その担体はＨＰＬＣを用いた分離精製に適合できるものであればよい。 In the purification process to be analyzed by the present invention, a system using high performance liquid chromatography (HPLC), high speed, high resolution purification system (FPLC) as well as commonly used column chromatography may be used, and the carrier is HPLC What is necessary is to be compatible with separation and purification using.
本発明において、対象タンパク質の濃度を検出する段階は、使用可能であれば前記のように各工程中どのような段階でも良いが、各工程の制御に工程終了後の対象タンパク質の濃度情報が必要な工程としては精製用クロマトグラフィーを用いる工程であることが好ましい。 In the present invention, the step of detecting the concentration of the target protein may be any step in each step as described above if it can be used, but control of each step requires concentration information of the target protein after the end of the step. The preferred step is a step using purification chromatography.
本発明におけるタンパク質濃度の測定方法としては、対象タンパク質の精製工程で用いる対象タンパク質の測定方法であるため、迅速かつ簡便に行える方法が好ましく、通常タンパク質の定量に用いられる分光光度法を用いることが好ましいが、とりわけ好ましくは２８０ｎｍ付近に吸収のあるトリプトファン、チロシン、フェニルアラニンの吸光度を分光光度計により測定し、定量を行う紫外（ＵＶ）吸収法を用いることが好ましい。 As a method of measuring the protein concentration in the present invention, since it is a method of measuring a target protein used in the purification step of a target protein, a method that can be performed quickly and easily is preferable, and using a spectrophotometric method usually used for protein quantification Although it is preferable, it is particularly preferable to use an ultraviolet (UV) absorption method in which the absorbance of tryptophan, tyrosine and phenylalanine having an absorption at around 280 nm is measured by a spectrophotometer and quantified.
本発明における培養液とは、対象タンパク質を細胞を用いて液体培地中で生産した際に生じる培養液であればどのようなものでも良く、通常細胞培養に用いられる培地に、必要により添加物や、培養液中の対象タンパク質の品質が保たれる範囲で溶媒等が含有されていても良い。本発明に用いる対象タンパク質を生産する細胞は、対象タンパク質を生産する細胞であれば、動物細胞、微生物細胞、植物細胞等どのような細胞でも良い。動物細胞としては、ＣＨＯ細胞等のハムスター由来の細胞、マウスハイブリドーマ、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２/０細胞等マウス由来の細胞、ラットーマウス ハイブリドーマ細胞等が挙げられ、微生物細胞としては大腸菌細胞、枯草菌細胞、酵母等が挙げられ、植物細胞としては、トウモロコシ由来の細胞、イネ由来の細胞、タバコ由来の細胞等が挙げられる。これらの細胞は野生株、変異株、遺伝子組換え細胞等どのようなものであっても良い。 The culture solution in the present invention may be any culture solution as long as it is a culture solution produced when a target protein is produced in a liquid medium using cells. A solvent or the like may be contained as long as the quality of the target protein in the culture solution is maintained. The cells producing the target protein used in the present invention may be any cells such as animal cells, microbial cells and plant cells, as long as they produce the target protein. Examples of animal cells include cells derived from hamsters such as CHO cells, cells derived from mice such as mouse hybridomas, NS0 cells and Sp2 / 0 cells, and rat-mouse hybridoma cells. Examples of microbial cells include E. coli cells, Bacillus subtilis cells, yeast And the like, and examples of plant cells include cells derived from corn, cells derived from rice, cells derived from tobacco, and the like. These cells may be of any type such as wild type, mutant and recombinant cells.
本発明における、モノリスシリカ担体を有する検出用カラムとは、精製工程中の対象タンパク質の濃度を測定するために、精製工程にてタンパク質精製のために用いられるカラムとは別に、上記精製工程を接続する主配管から分岐した配管と結合する接続されるカラムであって、精製工程中の対象タンパク質の濃度の測定を目的とするカラムであればどのようなものでも良いが、より迅速かつ正確な対象タンパク質の定量を行うためには、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣという）をシステムとして用いることが好ましく、このためカラム自体も市販のＨＰＬＣ装置に装着できるＨＰＬＣ用カラムであれば用いることができるが、特に測定装置としての小型化が必要なため、容量が２０〜５００μＬ，好ましくは１００〜３００μＬ，とりわけ好ましくは１５０〜２５０μＬのものが用いられる。なお、このような小型カラムであってもＨＰＬＣに使用するため５ＭＰａ程度の耐圧性が必要とされる。 In the present invention, the detection column having a monolithic silica support is connected to the above purification step separately from the column used for protein purification in the purification step in order to measure the concentration of the target protein in the purification step. Any column may be used as long as it is a column connected to the main piping to be connected to the branched piping and for which the concentration of the target protein in the purification step is to be measured, but the target is more rapid and accurate In order to quantify proteins, it is preferable to use high performance liquid chromatography (hereinafter referred to as HPLC) as a system, and therefore the column itself can also be used as long as it is an HPLC column that can be attached to a commercially available HPLC apparatus. In particular, because of the need for miniaturization as a measuring device, the volume is 20 to 500 μL, preferably 100 to 300 μ L, particularly preferably 150 to 250 μL is used. In addition, even if it is such a small column, in order to use for HPLC, the pressure resistance of about 5 Mpa is required.
本発明に用いるモノリスシリカ担体は、直径１００ｎｍ〜１００００ｎｍのマクロ孔と三次元ネットワーク状骨格の共連続構造を有するシリカゲルであり、その骨格には直径２ｎｍ〜２００ｎｍのメソ孔が存在する。このモノリスシリカ担体は、反応溶液について相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせることにより製造することができる。水ガラスやケイ酸塩水溶液のｐＨを変化させることによるゾル−ゲル転移を利用して無機系多孔質担体を製造することもできる。 The monolithic silica support used in the present invention is a silica gel having a co-continuous structure of macropores with a diameter of 100 nm to 10000 nm and a three-dimensional network skeleton, and mesopores with a diameter of 2 nm to 200 nm exist in its skeleton. This monolithic silica support can be produced by causing a sol-gel transition with phase separation for the reaction solution. An inorganic porous carrier can also be produced using sol-gel transition by changing the pH of water glass or an aqueous solution of silicate.
より具体的には、モノリスシリカ担体は、水溶性有機高分子、及び熱分解性低分子化合物を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を加えて加水分解反応を起こさせ、続いて生成物が固化した後に湿潤状態のゲルを加熱して熱分解性低分子化合物を熱分解させ、それを乾燥し加熱して製造することができる。ここで用いる水溶性有機高分子としては、適当な濃度の水溶液を構成できる水溶性有機高分子であって、加水分解性の官能基を有する金属化合物によって生成するアルコールを含む反応系中に均一に溶解し得るものであればよい。好ましい水溶性有機高分子の例としては、高分子金属塩であるポリスチレンスルホン酸のナトリウム塩又はカリウム塩、高分子酸であって解離してポリアニオンとなるポリアクリル酸、高分子塩基であって水溶液中でポリカチオンを生ずるポリアリルアミン及びポリエチレンイミン、並びに中性高分子であって主鎖にエーテル結合を有するポリエチレンオキシド、側鎖にカルボニル基を有するポリビニルピロリドン等が挙げられる。水溶性有機高分子の添加量は、限定するものではないが、反応溶液１０ｇ当たり０．２〜１．４ｇが好ましい。なお、水溶性有機高分子に代えてホルムアミド、多価アルコール、及び／又は界面活性剤を用いてもよい。その場合多価アルコールとしてはグリセリンが、界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類がより好ましい。 More specifically, the monolithic silica support is prepared by dissolving a water-soluble organic polymer and a low-molecular weight thermally decomposable compound in an acidic aqueous solution and adding a metal compound having a hydrolyzable functional group to cause a hydrolysis reaction. Subsequently, after the product is solidified, the gel in the wet state can be heated to pyrolyze the low molecular weight compound, which can then be dried and heated. The water-soluble organic polymer used herein is a water-soluble organic polymer capable of forming an aqueous solution of an appropriate concentration, and is uniformly contained in a reaction system containing an alcohol produced by a metal compound having a hydrolyzable functional group. It is sufficient that it can be dissolved. Examples of preferred water-soluble organic polymers are sodium or potassium salts of polystyrene sulfonic acid which is a high molecular weight metal salt, high molecular acids which are dissociated to form polyanions, polyacrylic acids which become polyanions, high molecular bases and aqueous solutions And polyarylamines and polyethylenimines which give rise to polycations among them, polyethyleneglycol having a neutral polymer having an ether bond in the main chain, polyvinylpyrrolidone having a carbonyl group in the side chain and the like. Although the addition amount of the water-soluble organic polymer is not limited, it is preferably 0.2 to 1.4 g per 10 g of the reaction solution. In addition, it may replace with a water-soluble organic polymer, and you may use formamide, a polyhydric alcohol, and / or surfactant. In that case, glycerin is more preferable as the polyhydric alcohol, and polyoxyethylene alkyl ethers are more preferable as the surfactant.
熱分解性低分子化合物は、熱分解後に溶媒を塩基性にする化合物であればよい。熱分解性低分子化合物の具体例としては、尿素、ヘキサメチレンテトラミン、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等の有機アミド類（アミド系化合物）等が挙げられる。無機系多孔質担体の製造においては加熱後の溶媒のｐＨ値が重要であり、この熱分解により反応溶液が塩基性になることが必要である。反応溶液中に共存させるこのような熱分解性低分子化合物の量は、化合物の種類にもよるが、例えば尿素の場合には、反応溶液１０ｇに対し、０．０５〜０．８ｇ、好ましくは０．１〜０．７ｇが好ましい。 The thermally decomposable low molecular weight compound may be any compound that makes the solvent basic after pyrolysis. Specific examples of the thermally decomposable low molecular weight compounds include organic amides such as urea, hexamethylenetetramine, formamide, N-methylformamide, N, N-dimethylformamide, acetamide, N-methylacetamide, and N, N-dimethylacetamide. And the like (amide compounds) and the like. In the production of the inorganic porous carrier, the pH value of the solvent after heating is important, and it is necessary for the reaction solution to be basic by this thermal decomposition. The amount of such a low molecular weight thermally decomposable low molecular weight compound to be coexistent in the reaction solution depends on the kind of the compound, but in the case of urea, for example, 0.05 to 0.8 g, preferably 0.1 to 0.7 g is preferable.
また、熱分解によって、フッ化水素酸のようにシリカを溶解する性質のある化合物を生じる化合物も、同様に利用できる。 In addition, a compound which produces a compound having the property of dissolving silica, such as hydrofluoric acid, by thermal decomposition can also be used as well.
加水分解性の官能基を有する金属化合物としては、金属アルコキシド、錯体、金属塩、有機修飾金属アルコキシド、有機架橋金属アルコキシド、及びこれらの部分加水分解生成物、並びにそれらのオリゴマーを用いることができる。加水分解性の官能基は例えば、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基等の炭素数の少ないものが好ましい。その金属としては、例えばＳｉ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ａｌ等を使用できる。オリゴマーについてはアルコールに均一に溶解分散できるものであればよく、具体的には例えば１０量体程度まで使用できる。加水分解性の官能基を有する金属化合物の具体例としては、限定するものではないが、例えばテトラメトキシシラン等のアルコキシシラン化合物が挙げられる。シリカを主成分とした無機系多孔質担体を製造するためには、加水分解性の官能基を有する金属化合物として、Ｓｉ（ケイ素）を含む化合物を使用することが好ましい。そのようなＳｉ（ケイ素）を含む化合物としては、ゾル−ゲル反応においてゲル形成を起こす、シリカの前駆体化合物が好ましい。酸性水溶液としては、任意の酸希釈水溶液、例えば塩酸、硝酸等の鉱酸（好ましくは０．００１モル濃度以上の水溶液）や、酢酸、ギ酸等の有機酸（好ましくは０．０１モル濃度以上の水溶液）を好適に使用することができる。 As the metal compound having a hydrolyzable functional group, metal alkoxides, complexes, metal salts, organic modified metal alkoxides, organic crosslinked metal alkoxides, partial hydrolysis products thereof, and oligomers thereof can be used. The hydrolyzable functional group is preferably one having a small number of carbon atoms such as, for example, a methoxy group, an ethoxy group, or a propoxy group. As the metal, for example, Si, Ti, Zr, Al or the like can be used. The oligomer may be any one as long as it can be uniformly dissolved and dispersed in an alcohol, and specifically, for example, it can be used up to about 10-mer. Although it does not limit as a specific example of a metal compound which has a hydrolysable functional group, For example, alkoxysilane compounds, such as tetramethoxysilane, are mentioned. In order to produce an inorganic porous carrier containing silica as a main component, it is preferable to use a compound containing Si (silicon) as a metal compound having a hydrolyzable functional group. As such a compound containing Si (silicon), a precursor compound of silica which causes gel formation in a sol-gel reaction is preferable. The acidic aqueous solution may be any acid diluted aqueous solution, for example, a mineral acid such as hydrochloric acid or nitric acid (preferably an aqueous solution of 0.001 molar or more), or an organic acid such as acetic acid or formic acid (preferably 0.01 molar or more) Aqueous solution can be used suitably.
本発明で用いるモノリスシリカ担体の製造においては、例えば、水溶性有機高分子及び熱分解性低分子化合物を酸性水溶液に溶かし、さらに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行うことにより、溶媒リッチ相と骨格相とに分離したゲルを生成させることができる。相分離及びゲル化は、通常は、溶液を室温４０〜８０℃で０．５〜５時間保存することにより生じさせることができる。相分離及びゲル化工程においては、当初透明な溶液が白濁してシリカ相等の無機相と水相との相分離を生じついにゲル化する過程を経る。この相分離及びゲル化工程では水溶性有機高分子は分散状態にありその沈殿は実質的に生じない。このようにして生成したゲルが固化したら、適当な熟成時間を経た後、湿潤状態のゲルを加熱する。ゲルの加熱により、反応溶液に予め溶解させておいたアミド系化合物等の熱分解性低分子化合物が熱分解し、骨格相の内壁面に接触している溶媒のｐＨが上昇する。加熱温度は、例えば尿素の場合には４０〜２００℃であってよく、その結果、加熱後の反応溶液のｐＨ値が６．０〜１２．０となることが好ましい。ｐＨ値が上昇した結果、反応溶液がその内壁面を浸食し、内壁面の凹凸状態を変化させることによって細孔径が徐々に拡大することになる。シリカを主成分とするゲルの場合には、酸性又は中性領域においては変化の度合は非常に小さいが、熱分解が盛んになり水溶液の塩基性が増すにつれて、細孔を構成する部分が溶解し、より平坦な部分に再析出することによって、平均細孔径を拡張する反応が顕著に起こるようになる。巨大空孔を持たず３次元的に束縛された細孔のみを持つゲルでは、平衡条件としては溶解し得る部分でも、溶出物質が外部の溶液にまで拡散できないために、元の細孔構造が相当な割合で残る。これに対して巨大空孔となる溶媒リッチ相を持つゲルにおいては、２次元的にしか束縛されていない細孔が多く、外部の水溶液との物質のやり取りが十分頻繁に起こるため、大きい細孔の発達に並行して小さい細孔は消滅し、全体の細孔径分布は顕著に広がることがない。なお、加熱過程においては、ゲルを密閉条件下に置き、熱分解生成物の蒸気圧が飽和して溶媒のｐＨが速やかに定常値をとるようにすることが好ましい。溶解・再析出反応が定常状態に達し、これに対応した細孔構造を生成させるために要する上記の加熱処理時間は、巨大空孔の大きさや試料の体積によって変化する。従って、それぞれの処理条件において実質的に細孔構造が変化しなくなる最短処理時間を決定して用いることが好ましい。 In the production of the monolithic silica support used in the present invention, for example, a water-soluble organic polymer and a low-molecular weight thermally decomposable compound are dissolved in an acidic aqueous solution, and a metal compound having a hydrolyzable functional group is further added to cause a hydrolysis reaction. To form a separated gel in the solvent rich phase and the skeletal phase. Phase separation and gelation can usually be caused by storing the solution at room temperature 40-80 ° C. for 0.5 to 5 hours. In the phase separation and gelation step, the initially clear solution becomes turbid to cause phase separation between an inorganic phase such as a silica phase and the aqueous phase, and finally undergoes gelation. In this phase separation and gelation step, the water-soluble organic polymer is in a dispersed state and substantially no precipitation occurs. Once the gel thus formed has solidified, after an appropriate aging time, the wet gel is heated. By heating the gel, the thermally decomposable low molecular weight compound such as an amide compound dissolved in advance in the reaction solution is thermally decomposed, and the pH of the solvent in contact with the inner wall surface of the skeletal phase is increased. The heating temperature may be, for example, 40 to 200 ° C. in the case of urea, and as a result, the pH value of the reaction solution after heating is preferably 6.0 to 12.0. As a result of the increase in pH value, the reaction solution corrodes the inner wall surface, and the pore diameter is gradually expanded by changing the unevenness of the inner wall surface. In the case of a gel containing silica as the main component, the degree of change is very small in the acidic or neutral region, but as the thermal decomposition becomes active and the basicity of the aqueous solution increases, the portion constituting the pore dissolves By re-depositing on a flatter part, the reaction to expand the average pore size will be remarkable. In a gel that does not have large pores and has only three-dimensionally confined pores, even in the part that can be dissolved as an equilibrium condition, the original pore structure is the same because the eluted substance can not diffuse to the external solution. It remains in a considerable proportion. On the other hand, in a gel having a solvent-rich phase that becomes large pores, many pores are confined only in two dimensions, and exchange of substances with the external aqueous solution occurs frequently enough, so large pores Parallel to the development of the small pores disappear and the overall pore size distribution does not spread significantly. In the heating process, it is preferable to place the gel under closed conditions so that the vapor pressure of the thermal decomposition product is saturated and the pH of the solvent quickly takes a steady value. The above-mentioned heat treatment time required for the dissolution and reprecipitation reaction to reach a steady state and to generate a pore structure corresponding to this changes depending on the size of the giant vacancy and the volume of the sample. Therefore, it is preferable to determine and use the shortest processing time at which the pore structure does not substantially change under each processing condition.
加熱処理後のゲルは、反応溶液である溶媒を乾燥処理により気化（揮発）させることによって乾燥ゲルとなる。この乾燥ゲル中には、出発溶液中の共存物質（水溶性有機高分子及び熱分解性低分子化合物等）が残存する可能性がある。そこで、適当な温度でさらに熱処理を行い、有機物等を熱分解することによって目的の無機系多孔質担体をより高純度で得ることができる。なお、乾燥処理は、３０〜８０℃で数時間〜数十時間放置することにより行えばよい。また熱処理は、２００〜８００℃程度でゲルを加熱することによって行うことができる。 The gel after the heat treatment becomes a dry gel by evaporating (volatilizing) the solvent that is the reaction solution by the drying treatment. In the dried gel, coexistent substances (water-soluble organic polymer and low-molecular weight thermally decomposable compound, etc.) in the starting solution may remain. Therefore, the target inorganic porous carrier can be obtained with higher purity by further performing heat treatment at an appropriate temperature and thermally decomposing the organic matter and the like. The drying treatment may be performed by leaving it at 30 to 80 ° C. for several hours to several tens of hours. The heat treatment can be performed by heating the gel at about 200 to 800 ° C.
以上のようにして、マイクロメーターサイズの連続細孔とナノメーターサイズのメゾ孔を有する棒状のモノリス型シリカ（モノリスシリカ）である。モノリスシリカを検出用カラムの担体として使用した場合、装置内に接続する濃度分析用カラム従来のもの樹脂ビーズ等の担体に比べて動的結合特性に優れるため、従来の担体を用いたカラムよりも大流量で試料溶液を流して吸着させることができる。その結果として、適切に液交換を行うことができれば、より短時間で１つの分析を完了することができることになる。例えば、滞留時間１分で３０ｍｇの動的結合容量を持つ従来カラムと、滞留時間１２秒で３０ｍｇの動的結合容量を持つ同じ形状のモノリスシリカカラムで考えると、３０ｍｇの試料が入った液をカラムに吸着させて分析するには、従来カラムの流速を１とした場合、モノリスシリカは５倍の流速で試料溶液を流して処理することができ、適切に液交換を行うことで、分析時間を５分の１に短縮することができる。このため、モノリスシリカカラムを用いた場合、培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液に含まれる対象タンパク質の濃度の測定を２分〜１５秒、好ましくは１分以内に行うことができる。 As described above, it is a rod-like monolithic silica (monolithic silica) having continuous pores of micrometer size and mesopores of nanometer size. When monolithic silica is used as a carrier for a detection column, it has superior dynamic binding properties as compared with carriers such as conventional resin beads for concentration analysis connected in the device, and therefore it is superior to columns using conventional carriers. The sample solution can be flowed and adsorbed at a high flow rate. As a result, if the liquid exchange can be properly performed, one analysis can be completed in a shorter time. For example, considering a conventional column with a dynamic binding capacity of 30 mg at a retention time of 1 minute and a monolithic silica column of the same shape with a dynamic binding capacity of 30 mg at a residence time of 12 seconds, a liquid containing 30 mg of sample In order to adsorb and analyze the column, assuming that the flow rate of the conventional column is 1, the monolithic silica can be processed by flowing the sample solution at a flow rate of 5 times, and the analysis time can be appropriately performed by liquid exchange. Can be reduced by a factor of five. Therefore, when a monolithic silica column is used, the concentration of the target protein contained in the culture solution or various mixed solutions obtained in the purification process can be measured within 2 minutes to 15 seconds, preferably within 1 minute.
本発明では、溶液中の対象タンパク質を担体に吸着させるため、前記アフィニティークロマトグラフィーの原理に従い加工した担体の表面に対象タンパク質と結合するリガンドを固定化させる。使用するリガンドの種類は前記と同義である。シリカモノリスに対するリガンドの結合方法は、溶液中の抗体を担体に吸着させるため、無機系多孔質担体、好ましくは円盤状または円柱状等に加工した無機系多孔質担体の表面に抗体結合性タンパク質又は抗体結合性ペプチドを固定化することにより行う。この固定化のためには、無機系多孔質担体の表面にまずアミノ基を導入する修飾を施し、次いでこのアミノ基に抗体結合性タンパク質をアミド結合により結合することが好ましい。なお２〜１０個のアミノ酸がペプチド結合したものを「ペプチド」と呼び、１１個以上のアミノ酸がペプチド結合したものを「タンパク質」と呼ぶ。該結合方法の詳細は、本発明者らの発明を記載した特許文献３に詳細に記載されている。 In the present invention, in order to adsorb a target protein in solution to a carrier, a ligand that binds to the target protein is immobilized on the surface of the carrier that has been processed according to the principle of affinity chromatography. The type of ligand used is as defined above. The method for binding a ligand to a silica monolith is to bind an antibody in a solution to an antibody-binding protein or protein on the surface of an inorganic porous carrier, preferably an inorganic porous carrier processed preferably in the form of a disc or column, in order to adsorb the antibody in solution. It is carried out by immobilizing the antibody binding peptide. For this immobilization, it is preferable that the surface of the inorganic porous carrier is first modified to introduce an amino group, and then the antibody-binding protein is bound to the amino group by an amide bond. A peptide bond of 2 to 10 amino acids is referred to as a "peptide", and a peptide bond of 11 or more amino acids is referred to as a "protein". The details of the coupling method are described in detail in US Pat.
本発明のモノリスシリカ担体を有する検出用カラムからの溶出液中の対象タンパク質の濃度の測定は以下のように行うことができる。モノリスシリカ担体を有する検出用カラムに吸着洗浄溶液をアプライ（添加）して通液させ（初期化工程）、その後当該カラムに培養液または精製工程中の対象タンパク質を含む溶液をアプライして通液させて、目的の対象タンパク質分子を担体に吸着結合させる（吸着工程）。予め担体表面には対象タンパク質との結合活性を持つリガンドが固定されており、この吸着工程において、対象タンパク質はリガンドと結合することで担体表面に捕捉される。次いで、そのカラムに吸着洗浄溶液をアプライし通液させることで非特異的に結合した分子を洗い出し（洗浄工程）、次いで溶出溶液をアプライし通液させることで対象タンパク質を溶出する（溶出工程）。さらに再生溶液をカラムにアプライし通液させることによりカラムの再生を行うと共に残存付着物を除去する（再生工程）。 The measurement of the concentration of the target protein in the eluate from the detection column having the monolithic silica support of the present invention can be performed as follows. Apply adsorption wash solution to detection column with monolithic silica support to allow it to flow (initialization step), then apply the solution containing the target protein in culture solution or purification step to the column to flow it The target protein molecule of interest is adsorbed and bound to a carrier (adsorption step). A ligand having binding activity to a target protein is immobilized on the carrier surface in advance, and in this adsorption step, the target protein is captured on the carrier surface by binding to the ligand. Next, the adsorption washing solution is applied to the column and allowed to flow to wash out nonspecifically bound molecules (washing step), and then the target solution is eluted by applying the elution solution to flow (eluting step) . Further, the regeneration solution is applied to the column and allowed to flow to regenerate the column and to remove residual deposits (regeneration step).
初期化工程および洗浄工程に用いる吸着洗浄溶液としては、ｐＨ６〜ｐＨ８、好ましくはｐＨ７．０〜ｐＨ７.４，濃度１０〜５００ｍＭ、好ましくは濃度３０ｍＭ〜１００ｍＭの塩化ナトリウム含有リン酸塩緩衝液、塩化ナトリウム含有リン酸ナトリウム緩衝液、塩化ナトリウム含有リン酸カリウム緩衝液、塩化ナトリウム含有トリス−塩酸緩衝液、塩化ナトリウム含有ホウ酸ナトリウム緩衝液等の塩化ナトリウム含有緩衝液を用いることが好ましく、これらは０．３Ｍ〜１．５Ｍ 好ましくは０．５〜１ＭのＮａＣｌを含有していてもよい。例えば０．５Ｍ〜１．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
As an adsorption washing solution used for an initialization process and a washing process,
溶出工程に用いる溶出溶液としては、ｐＨ３．５付近に調製された緩衝液を用いることが好ましく、その濃度は０．０５Ｍ〜１．０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜０．５Ｍであることが好ましい。具体的には酢酸緩衝液（ｐＨ３．５〜５）、ギ酸緩衝液（ｐＨ３〜４．５）、グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．５〜４）等が挙げられるが、とりわけ０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．３〜３．８）を用いることが好ましい。
As an elution solution used in the elution step, it is preferable to use a buffer solution adjusted to around pH 3.5, and the concentration thereof is preferably 0.05 M to 1.0 M, preferably 0.05 M to 0.5 M. . Specific examples include acetate buffer (pH 3.5 to 5), formate buffer (
再生工程に用いる再生溶液としては、ｐＨ２．０〜２．８，濃度０．０５Ｍ〜１．０Ｍの溶液を用いることが好ましい。再生溶液のとりわけ好ましい例として、０．０２Ｍ クエン酸溶液（ｐＨ２．２５）もしくは０．１Ｍ グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）が挙げられる。 As a regeneration solution used in the regeneration step, it is preferable to use a solution having a pH of 2.0 to 2.8 and a concentration of 0.05 M to 1.0 M. Particularly preferred examples of the regeneration solution include 0.02 M citric acid solution (pH 2.25) or 0.1 M glycine-hydrochloric acid buffer (pH 2.5).
好ましい一実施形態では、吸着洗浄溶液としてリン酸塩緩衝液（例えばリン酸ナトリウム緩衝液）を、再生溶液としてグリシン−塩酸緩衝液を用いることができる。カラムより溶出された溶出液中の対象タンパク質の濃度は、溶出液の流路上に位置し、溶出液中の対象タンパク質の濃度を２８０ｎｍ付近の紫外線吸収により測定するＵＶモニターにより測定する。対象タンパク質はトリプトファン、チロシンに代表される構成アミノ酸の特性により２８０ｎｍ付近の紫外線吸収にピークを持ち、濃度依存性の特有の吸光度を持つため、溶出画分のピーク面積から対象タンパク質の濃度を算出することができる。 In a preferred embodiment, a phosphate buffer (eg, sodium phosphate buffer) can be used as the adsorption wash solution and a glycine-hydrochloride buffer can be used as the regeneration solution. The concentration of the target protein in the eluate eluted from the column is measured by a UV monitor located on the flow channel of the eluate and measuring the concentration of the target protein in the eluate by ultraviolet absorption near 280 nm. The target protein has a peak in the ultraviolet absorption near 280 nm due to the characteristics of the constituent amino acids represented by tryptophan and tyrosine, and has a concentration-dependent characteristic absorbance, so the concentration of the target protein is calculated from the peak area of the eluted fraction be able to.
前記対象タンパク質の精製工程における対象タンパク質濃度の測定方法において、培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液に含まれる対象タンパク質の濃度の測定を、モノリスシリカ担体を有する検出用カラムを用いて分離精製することで得られる対象タンパク質の濃度測定により行うことを特徴とする測定方法を適用し、対象タンパク質の精製工程のモニターとして用いると、対象タンパク質の各精製工程における所在が明確に把握されるため、対象タンパク質の製造方法の合理的な管理が可能になる。 In the method for measuring the target protein concentration in the purification step of the target protein, the measurement of the concentration of the target protein contained in the culture solution or various mixed solutions obtained in the purification process is separated using a detection column having a monolithic silica carrier Applying a measurement method characterized by measuring the concentration of the target protein obtained by purification, and using it as a monitor of the purification step of the target protein, because where in the respective purification steps of the target protein is clearly understood , Rational management of the production method of the protein of interest.
抗体医薬品等バイオ医薬品の製造プロセスでは１L以上の大きなカラムを使用して対象タンパク質の精製が行われる。一般に用いられる吸着タイプのクロマトグラフィーでは、溶液中の対象タンパク質を精製用クロマトグラフィーのカラムに注入してゆき、精製用クロマトグラフィーのカラムに結合した対象タンパク質の量がカラムの結合容量を超えて漏出してくる直前まで添加することが行われる。即ち、精製用クロマトグラフィーのカラムを効率よく使用することで生産コストを最適化している。具体的には、分離条件におけるプロセス用カラムの結合容量を、スケールダウンした系で予め明らかにしておき、実際に試料溶液を注入する際には、試料溶液の対象タンパク質濃度から推定される試料溶液の量に任意の安全係数を掛けた量の対象タンパク質を注入することが行われる。このような注入工程において本装置は、試料注入過程の精製用クロマトグラフィーカラムから得られる通過液を間欠的にサンプリングし、対象タンパク質の濃度を分析し、当該カラム通過液中に対象タンパク質の不在や漏出を確認することができる。精製用クロマトグラフィーカラムの通過液中の対象タンパク質の濃度と、精製用クロマトグラフィーカラムへ対象タンパク質を注入する前の濃度との比較をもって、精製用クロマトグラフィーカラムへの対象タンパク質の吸着をタイムリーに確認できる。仮に何らかの障害により対象タンパク質が想定よりも早い段階で漏出するような事態が発生した場合には、本装置により対象タンパク質濃度の上昇としてモニターされる。つまりモニター結果の相違により、適当なプログラムと組み合わせることで、検出濃度に閾値を設けて通報することや、自動で送液を停止したり、次の工程に移行するような適用形態も容易に考えられる。また、試料注入後の非特異的吸着物の除去工程においても同様に対象タンパク質の漏出を確認できる。対象タンパク質の精製を連続精製プロセスにおいて行う場合は、連続的に注入された試料溶液が、連続的、或いは、間欠的に繰り返し分離された後、溶出画分として抽出される。このような手法を適用する場合は精製プロセス全体を通して安定して分離されていることが重要である。本発明はこのような連続プロセスにおいても間欠的にサンプリングした試料に含まれる対象タンパク質濃度を継時的にモニターすることで、濃度の均一性をタイムリーに評価することができる。 In the process of producing biopharmaceuticals such as antibody pharmaceuticals, purification of a target protein is carried out using a large column of 1 L or more. In a commonly used adsorption type chromatography, the target protein in solution is injected onto a purification chromatography column, and the amount of target protein bound to the purification chromatography column exceeds the binding capacity of the column and leaks Addition is carried out until just before coming. That is, the production cost is optimized by efficiently using the purification chromatography column. Specifically, the binding capacity of the process column under the separation conditions is clarified in advance by the downscaled system, and when actually injecting the sample solution, the sample solution estimated from the target protein concentration of the sample solution It is performed to inject the target protein in an amount obtained by multiplying the amount of the target by an arbitrary safety factor. In such an injection process, the present device intermittently samples the passage liquid obtained from the chromatography column for purification in the sample injection process, analyzes the concentration of the target protein, and detects the absence of the target protein in the column passage liquid. You can check for leaks. By comparing the concentration of the target protein in the flow through of the purification chromatography column with the concentration before injecting the target protein into the purification chromatography column, timely adsorption of the target protein onto the purification chromatography column It can confirm. If a failure occurs that causes the target protein to leak earlier than expected, the apparatus monitors the target protein concentration as rising. In other words, depending on the difference in monitoring results, combining with a suitable program makes it possible to set a threshold for the detected concentration and report, or to automatically stop the liquid transfer, or easily consider the application form to shift to the next step. Be In addition, the leakage of the target protein can be similarly confirmed also in the nonspecific adsorbate removal step after sample injection. When purification of the target protein is carried out in a continuous purification process, the continuously injected sample solution is separated continuously or intermittently repeatedly and then extracted as an elution fraction. When applying such an approach, it is important that the separation be stable throughout the purification process. The present invention can timely evaluate the uniformity of concentration by monitoring the concentration of a target protein contained in a sample intermittently sampled even in such a continuous process over time.
以上、対象タンパク質の分離精製工程において、各工程の通過液をサンプリングし、各サンプルにおける対象タンパク質の濃度測定を、モノリスシリカ担体を有する検出用カラム溶出液の濃度測定により経時的に測定し、モニターすることを採りいれることにより、生産能率、生産管理、品質管理の点で優れた対象タンパク質の製造方法が提供される。 As described above, in the separation and purification step of the target protein, the flow through liquid of each step is sampled, and the concentration measurement of the target protein in each sample is measured over time by the concentration measurement of the detection column eluate having a monolithic silica carrier, and monitoring In addition, it is possible to provide a method for producing a target protein which is excellent in terms of production efficiency, production control, and quality control.
本発明の対象タンパク質の精製工程における対象タンパク質濃度の測定装置において、培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液に含まれる対象タンパク質の濃度の測定を、モノリスシリカ担体を有する検出用カラムを用いて分離精製することで得られる対象タンパク質濃度の測定により行うことを特徴とするタンパク質濃度の測定装置を図１に示す。 In the apparatus for measuring the concentration of a protein of interest in the purification process of a protein of the present invention, the concentration of the protein of interest contained in a culture solution or various mixed solutions obtained in the purification process is measured using a detection column having a monolithic silica carrier. FIG. 1 shows a protein concentration measuring apparatus characterized in that it is carried out by measuring the target protein concentration obtained by separation and purification.
本発明の測定装置は、送液部、サンプル注入部および検出部から構成されるが、送液部は対象タンパク質の精製プラントにおいて培養物または精製工程の溶出物（a）を移送する主配管（ｂ）上に設けられた分岐バルブ（ｃ）により分岐した配管と、接続可能な形状を持ち、ポンプ（１）により、培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液（a）をサンプル注入部に吐出する。使用するポンプはＨＰＬＣのインジェクションポンプとして用いられるものであればどのようなものでも良いが、好ましくはポンプにシリンジが設置されており、シリンジにはチェックバルブ付き丁字継手が接続されているポンプを用いることが好ましい。インジェクションポンプの往復運動はシリンジのプランジャーを動かし、注射筒内に液体を吸引、または、吐出する。シリンジ出口における液体の流れは、丁字に分岐された吸引側から吐出側へ一方向に制限されている。 The measurement apparatus of the present invention is composed of a liquid delivery part, a sample injection part and a detection part, but the liquid delivery part is a main pipe for transferring the culture or the eluate (a) of the purification process in the target protein purification plant b) A pipe which is branched by a branch valve (c) provided on the top and a connectable shape, and a sample injection part of various mixed solutions (a) obtained in culture medium or purification process by a pump (1) Discharge. Any pump may be used as long as it can be used as an injection pump for HPLC, but preferably the pump is provided with a syringe and the syringe is connected with a check valve-equipped hinged joint Is preferred. The reciprocating motion of the injection pump moves the plunger of the syringe to aspirate or discharge the liquid into the syringe. The flow of liquid at the syringe outlet is restricted in one direction from the suction side to the discharge side branched into two letter.
サンプル注入部は注入切り替えバルブ（２）を介して検出用カラム（３）または排出口（４）に接続している。切り替えバルブ（２）は、ＨＰＬＣで用いられる六方バルブであればどのようなものでも良いが、六方バルブには測定試料を保持するためのサンプルループ（５）が接続されていることが好ましい。六方バルブは、分岐バルブ（ｂ）との接続を目的とした配管（６）、検出用カラムと繋ぐ配管（７）、排出口（４）と繋ぐ配管（８）およびサンプルループ（５）以外に、吸着洗浄溶液、溶出溶液および再生溶液の流路となる配管（９）とも接続可能な状態である。前記配管（９）はプランジャーポンプとも呼ばれるポンプ（１０）を介して切り替えバルブ（１１）と連結される。（１０）のプランジャーポンプは通常ＨＰＬＣに用いるものであれば良く、切り替えバルブ（１１）も通常ＨＰＬＣに用いる四方バルブであればどのようなものでも良い。切り替えバルブ（１１）は吸着洗浄溶液を入れる供給容器（１２）、溶出溶液を入れる供給容器（１３）、再生溶液を入れた供給容器（１４）を結ぶ各配管と接続可能である。 The sample injection unit is connected to the detection column (3) or the discharge port (4) via the injection switching valve (2). The switching valve (2) may be any hexagonal valve used in HPLC, but it is preferable that a sample loop (5) for holding a measurement sample is connected to the hexagonal valve. The six-way valve is connected to the branch valve (b), piping (6), piping (7) connecting to the detection column, piping (8) connecting to the discharge port (4), and sample loop (5) Also, it is in a state where it can be connected to the pipe (9) which is a flow path of the adsorption cleaning solution, the elution solution and the regeneration solution. The pipe (9) is connected to the switching valve (11) via a pump (10) also called a plunger pump. The plunger pump of (10) may be any one that is normally used for HPLC, and the switching valve (11) may be any four-way valve that is usually used for HPLC. The switching valve (11) can be connected to each of the pipes connecting the supply container (12) for containing the adsorption cleaning solution, the supply container (13) for containing the elution solution, and the supply container (14) containing the regenerated solution.
検出部は、配管を介して切り替えバルブと繋がる検出用カラム（３）と、検出用カラムから流出する溶液中の対象タンパク質を測定するため当該カラムと配管により繋がるＵＶ検出器（１５）から構成されるが、当該検出器はフローセルとＵＶモニターから構成される。 The detection unit includes a detection column (3) connected to the switching valve through a pipe, and a UV detector (15) connected by the column and the pipe to measure a target protein in a solution flowing out of the detection column. However, the detector consists of a flow cell and a UV monitor.
本発明における検出用カラム（３）はモノリスシリカ担体が充填されていることを特徴とするカラムであって、市販のＨＰＬＣ装置に装着できるＨＰＬＣ用カラムであれることが好ましい。特に測定装置としての小型化が必要なため、容量が２０〜５００μＬ，好ましくは１００〜３００μＬ，とりわけ好ましくは１５０〜２５０μＬのものが用いられる。なお、このような小型カラムであってもＨＰＬＣに使用するため５ＭＰａ程度の耐圧性が必要とされる。本発明のカラムに充填されるモノリスシリカ担体は、直径１００ｎｍ〜１００００ｎｍのマクロ孔と三次元ネットワーク状骨格の共連続構造を有するシリカゲルであり、その骨格には直径２ｎｍ〜２００ｎｍのメソ孔が存在する。 The detection column (3) in the present invention is preferably a column characterized by being packed with a monolithic silica carrier, and can be attached to a commercially available HPLC apparatus. In particular, since it is necessary to miniaturize the measuring apparatus, a volume of 20 to 500 μL, preferably 100 to 300 μL, particularly preferably 150 to 250 μL is used. In addition, even if it is such a small column, in order to use for HPLC, the pressure resistance of about 5 Mpa is required. The monolithic silica support packed in the column of the present invention is a silica gel having a co-continuous structure of macropores with a diameter of 100 nm to 10000 nm and a three-dimensional network skeleton, and mesopores of 2 nm to 200 nm in diameter are present in its skeleton .
本発明におけるＵＶモニター（１５）は、検出用カラムを通過した液をＵＶモニターの検出セルに導く配管と結合され、光源から導かれたタンパク質の特異的な吸収波長、好ましくは２８０ｎｍ付近の波長、とりわけ好ましくは波長２８０ｎｍの光を検出セルに照射し、検出セルを透過した光を検出する機能を有するＵＶモニターから構成される。なお、ＵＶモニターは、吸光度をオンラインでモニターする機能を持つ。 The UV monitor (15) in the present invention is connected to a pipe that leads the liquid that has passed through the detection column to the detection cell of the UV monitor, and a specific absorption wavelength of the protein led from the light source, preferably a wavelength around 280 nm Particularly preferably, it comprises a UV monitor having a function of irradiating the detection cell with light of wavelength 280 nm and detecting the light transmitted through the detection cell. The UV monitor has a function to monitor absorbance online.
本発明の測定装置は、送液部、サンプル検出部および検出部の各構成要素に対して通信を行い、動作の状態に対応する命令の送信、応答を取得する制御部を有していてもよい。
また、上記装置はインジェクションポンプを取り外せば、配管（６）にサンプル注入口を設けることにより手動でのサンプルの注入が可能になり、インジェクションポンプを主配管部分に取り付けることにより、培養物または精製工程上の溶出物中の対象タンパク質の測定を行うこともできる。
The measurement apparatus according to the present invention communicates with each component of the liquid transfer unit, the sample detection unit, and the detection unit, and has a control unit that transmits a command corresponding to the state of operation and obtains a response. Good.
In addition, when the above-mentioned device removes the injection pump, manual injection of the sample becomes possible by providing the sample inlet in the pipe (6), and by attaching the injection pump to the main pipe portion, the culture or purification step It is also possible to measure the protein of interest in the above eluate.
本発明の測定装置は次のように動作して、培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液の対象タンパク質の濃度を測定することができる。 The measuring device of the present invention operates as follows to measure the concentration of the target protein in the culture solution or various mixed solutions obtained in the purification process.
精製プラント中の主配管（ｂ）に設けられた分岐バルブ（ｃ）を分枝方向に切り替え、インジェクションポンプ（１）によりサンプルループ（５）に培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液（以下、試料溶液という）を充填する。四方バルブ（１１）を吸着洗浄溶液の供給容器（１２）との接続に切り替え、プランジャーポンプ（１０）で検出用カラム（３）に吸着洗浄溶液を送液し、検出用カラム（３）を平衡化する。六方バルブ（２）をインジェクトに切り替え、プランジャーポンプ（１０）でサンプルループ（５）を介して試料溶液をカラムに注入し、目的タンパク質をカラムに吸着させる。六方バルブ（２）をロードに切り替え、サンプルループ（５）の流路を切り離す。プランジャーポンプ（１０）で検出用カラム（３）に吸着洗浄溶液を送液し、非特異的吸着物を除去する。四方バルブ（１１）を溶出溶液の供給容器（１３）と接続するように切り替え、プランジャーポンプ（１０）で検出用カラム（３）に溶出溶液を送液し、対象タンパク質を溶出する。更に四方バルブ（１１）を再生溶液の供給容器（１４）との接続に切り替え、プランジャーポンプ（１０）でカラムに再生溶液を送液し、残存付着物を除去する。検出用カラム（３）から溶出された溶出液中の対象タンパク質の吸光度はＵＶモニター（１５）により測定され、分析プログラムにより、溶出画分のピーク面積を目的タンパク質濃度に換算される。 The branch valve (c) provided in the main pipe (b) in the purification plant is switched in the branch direction, and the injection pump (1) is used to mix the various mixed solutions (in the culture solution or purification process) into the sample loop (5). Hereinafter, it is called a sample solution). Switch the four-way valve (11) to the connection with the adsorption cleaning solution supply container (12), send the adsorption cleaning solution to the detection column (3) with the plunger pump (10), and change the detection column (3) Equilibrate. The hexagonal valve (2) is switched to inject, and the sample solution is injected into the column via the sample loop (5) by the plunger pump (10) to adsorb the target protein onto the column. Switch the six-way valve (2) to load and disconnect the flow path of the sample loop (5). The adsorption washing solution is sent to the detection column (3) by a plunger pump (10) to remove nonspecific adsorbate. The four-way valve (11) is switched so as to connect to the elution solution supply container (13), and the elution solution is sent to the detection column (3) by the plunger pump (10) to elute the target protein. Further, the four-way valve (11) is switched to the connection with the regeneration solution supply container (14), and the regeneration solution is fed to the column by the plunger pump (10) to remove the remaining deposits. The absorbance of the target protein in the eluate eluted from the detection column (3) is measured by the UV monitor (15), and the peak area of the eluted fraction is converted to the target protein concentration by the analysis program.
本発明は、精製用クロマトグラフィーを用いた対象タンパク質の分離精製装置において、培養液または精製用クロマトグラフィーで得られる多様な混合溶液の流路にモノリスシリカ担体を有する検出用カラムを用いて分離精製することで得られる対象タンパク質濃度を測定することを特徴とする測定装置を接続することにより、精製工程中の対象タンパク質の濃度をモニターすることを特徴とする分離精製装置に関する。 The present invention is an apparatus for separating and purifying a target protein using chromatography for purification, using a detection column having a monolithic silica carrier in the flow path of a culture solution or various mixed solutions obtained by chromatography for purification. The present invention relates to a separation / purification device characterized by monitoring the concentration of a target protein in a purification step by connecting a measurement device characterized by measuring the target protein concentration obtained by
分離精製装置とは、培養液から対象タンパク質を分離精製するためにタンパク質の各種精製装置を単独または組合せた精製プラントを言う。精製プラントを構成する各種精製装置とは、対象タンパク質を夾雑物のある状態から純度を高めるための装置であればどのようなものでも良いが、少なくとも一つのクロマトグラフィー装置を用いることを特徴とする。 The separation and purification apparatus refers to a purification plant in which various protein purification apparatuses are used alone or in combination to separate and purify a target protein from a culture solution. The various purification devices that constitute the purification plant may be any device for increasing the purity of the target protein from the presence of contaminants, but it is characterized by using at least one chromatography device. .
クロマトグラフィー装置としては、アフィニティークロマトグラフィー装置、イオン交換クロマトグラフィー装置、ゲルろ過クロマトグラフィー装置等が挙げられる。 The chromatography apparatus may, for example, be an affinity chromatography apparatus, an ion exchange chromatography apparatus, or a gel filtration chromatography apparatus.
アフィニティークロマトグラフィー装置としては、イムノグロブリンとの結合を利用したプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、レクチン等をリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィー装置、ヘパリンをリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィー、グルタチオンをリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィー装置、またはこれらのリガンドの改変体を用いたアフィニティークロマトグラフィー装置が挙げられる。 As an affinity chromatography apparatus, an affinity chromatography apparatus using protein A, protein G, protein L, lectin or the like as a ligand utilizing binding to an immunoglobulin, an affinity chromatography using heparin as a ligand, glutathione as a ligand The affinity chromatography apparatus used or an affinity chromatography apparatus using a variant of these ligands may be mentioned.
イオン交換クロマトグラフィー装置としては、官能基にクオタナリーアンモニウム（Ｑ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ジエチルアミノプロピル（ＡＮＸ）等を持つ陰イオン交換クロマトグラフィー装置、官能基にスルフォプロピル（ＳＰ）、メチルスルフォネート（Ｓ）、カルボキシメチル（ＣＭ）を持つ陽イオン交換クロマトグラフィー装置等があげられる。 As an ion exchange chromatography apparatus, an anion exchange chromatography apparatus having quaternary ammonium (Q), diethylaminoethyl (DEAE), diethylaminopropyl (ANX) or the like as a functional group, sulfopropyl (SP) as a functional group, The cation exchange chromatography apparatus etc. which have methyl sulfonate (S), carboxymethyl (CM) etc. are mention | raise | lifted.
ゲルろ過クロマトグラフィー装置としては具体的にはスーパーデックス、セファクリル、セファデックス等の樹脂を用いたクロマトグラフィー装置が挙げられる。 Specific examples of the gel filtration chromatography apparatus include chromatography apparatuses using resins such as Superdex, Sephacryl and Sephadex.
なお本発明が濃度分析の対象とする精製装置は、通常用いるカラムクロマトグラフィーだけではなく、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置、高速、高分離能精製システム（ＦＰＬＣ）装置でも良い。 The purification apparatus targeted by the present invention for concentration analysis may be a high performance liquid chromatography (HPLC) apparatus, a high speed, high resolution purification system (FPLC) apparatus, as well as column chromatography which is usually used.
なおクロマトグラフィー装置以外に、例えば対象タンパク質を生産する細胞の培養液等原料からの対象タンパク質の精製、採取に用いる遠心分離装置、限外ろ過装置等も精製プラントを構成する精製装置である。 In addition to the chromatography apparatus, for example, a centrifugal separation apparatus used for purification and collection of a target protein from a raw material such as a culture solution of cells producing the target protein, and an ultrafiltration apparatus are purification apparatuses constituting a purification plant.
精製プラントの規模はその大きさを問わず、バイオ医薬品製造のための工場プラント、製造試験のための中間プラント、研究室用の小型精製装置等どのようなものでも良い。 The scale of the purification plant may be any plant plant for biopharmaceutical production, an intermediate plant for production testing, a small purification apparatus for laboratory, etc. regardless of the size.
また、培養液からの精製を目的とするものだけではなく、精製の中間工程に用いる装置も含まれる。 Moreover, not only those intended for purification from a culture solution, but also devices used in intermediate steps of purification are included.
本件発明の測定装置は図１に示したように精製プラント中の培養物または精製工程の溶出物を移送する配管に設けられた分岐バルブと直接接続することができるが、抗体等を精製するプラントでは抗体の劣化を防ぐために溶出液の中和等が行われている。このような
特殊な精製プラントに本発明のタンパク質濃度測定装置（２１）が装着された例を図２に示した。
The measuring apparatus of the present invention can be directly connected to a branch valve provided on a pipe for transferring the culture in the purification plant or the eluate of the purification step as shown in FIG. 1, but a plant for purifying antibodies etc. In order to prevent the deterioration of the antibody, neutralization of the eluate is carried out. An example in which the protein concentration measuring apparatus (21) of the present invention is attached to such a special purification plant is shown in FIG.
図２は細胞培養液（ｄ）を、連続精製装置（２２）を直列的に接続した精製プラントで、精製し、対象タンパク質の最終精製品（ｅ）を得るまでの装置配列を示したものである。 Fig. 2 shows the device arrangement for purifying the cell culture solution (d) in a purification plant in which continuous purification devices (22) are connected in series to obtain the final purified product (e) of the target protein. is there.
精製プラントへ流入した細胞培養液（ｄ）は、分岐バルブ（２３）に接続したタンパク質濃度測定装置（２１）により、その培養液中の対象タンパク質の濃度が計測される。更に細胞培養液は第一の連続精製装置（２２）を通り精製されるが、その溶出液は分岐バルブ（２３）を通って回収プール（２５）で貯留される。分岐バルブ（２３）は中和溶液または希釈溶液の供給容器（２４）と連結しており、同バルブを介して中和溶液または希釈溶液が吐出され回収プール（２５）の溶出液と混合される。回収プール（２５）は、タンパク質濃度測定装置（２１）と接続されており、溶出溶液中の対象タンパク質の濃度はリアルタイムで測定される。回収プールで希釈又は中和等の操作がなされた対象タンパク質を含む溶液は前記第一の連続精製装置（２２）と同様の操作を第二連続精製装置（２２）、第三連続精製装置（２２）で行うことにより、高度に精製され、最後にウイルス除去操作（２６）を受けて医薬品に使用し得る高純度の精製標品となる。 The concentration of the target protein in the culture solution of the cell culture solution (d) flowing into the purification plant is measured by the protein concentration measuring device (21) connected to the branching valve (23). Furthermore, the cell culture solution is purified through the first continuous purification apparatus (22), and the eluate is stored in the recovery pool (25) through the branch valve (23). The branch valve (23) is connected to a supply solution (24) for the neutralization solution or dilution solution, through which the neutralization solution or dilution solution is discharged and mixed with the eluate of the recovery pool (25) . The recovery pool (25) is connected to a protein concentration measuring device (21), and the concentration of the target protein in the elution solution is measured in real time. The solution containing the protein of interest subjected to operations such as dilution or neutralization in the recovery pool is subjected to the same operation as the first continuous purification device (22) as the second continuous purification device (22), the third continuous purification device (22) The product is highly purified and finally subjected to a virus removal operation (26) to give a highly pure product which can be used for medicine.
このようにタンパク質濃度測定装置を精製プラントに組み込んだ結果、精製プラントにおける各精製工程の対象タンパク質の濃度を測定することができる。 Thus, as a result of incorporating the protein concentration measuring device into the purification plant, the concentration of the target protein of each purification step in the purification plant can be measured.
図３は本発明のタンパク質濃度測定装置（ｆ）を用いて対象タンパク質の精製を行う精製用ＨＰＬＣ装置（ｇ）のモニター制御を行う場合の配置図である。精製用ＨＰＬＣ装置（ｇ）において、精製の対象となる細胞培養液あるいは前工程からの溶出液は、試料注入口（３１）からサンプルポンプ（３２）により分岐バルブ（３３）を介して精製用カラム（３４）に充填される。精製用カラム（３４）に関しては、吸着液の供給容器（３６）、洗浄液の供給容器（３７）、溶出液の供給容器（３８）、再生溶液の供給容器（３９）と切り替えバルブ（３５）、分岐バルブ（３３）を介して接続されており、必要により吸着溶液、洗浄溶液、溶出溶液、再生溶液がシステムポンプ（４０）により精製用カラム（３４）に充填される。このシステムにおいて精製工程中のカラムを通過した液体は精製用ＨＰＬＣ装置（ｇ）のフローセル（４１）に送られ、その液体の吸光度がＵＶモニター（４２）により測定される。フローセルを通過した液体は、必要に応じてフラクションコレクター（４３）により採取することもできるが、更に別の精製工程で精製を行う場合は、当該工程に接続させればよい。精製用ＨＰＬＣ装置（ｇ）における精製工程中のカラム通過液に含まれる対象タンパク質の濃度をモニターする場合は、ＵＶフローセル（４１）の通過液を配管でタンパク質濃度測定装置（ｆ）の切り替えバルブ（５１）と接続して間欠的に切り替え、必要によりサンプルループ（５２）を介して検出用カラム（５３）に充填する。検出用カラムは切り替えバルブ（５１）と切り替えバルブ（５４）を介して、洗浄液の供給容器（５５）および溶出液の供給容器（５６）、また、必要に応じて再生溶液（６１）と接続されており、ポンプ（５７）により検出用カラム（５３）の洗浄、溶出等を行うことができる。検出用カラム（５３）からの溶出液はフローセル（５８）を通り、ＵＶモニター（５９）により対象タンパク質の濃度が測定される。 FIG. 3 is a layout diagram in the case of performing monitor control of a purification HPLC apparatus (g) for purifying a target protein using the protein concentration measurement apparatus (f) of the present invention. In the HPLC apparatus for purification (g), the cell culture solution to be purified or the eluate from the previous step is a column for purification through a branch valve (33) by a sample pump (32) from a sample inlet (31). Fill in (34). Regarding the purification column (34), the adsorption solution supply container (36), the washing solution supply container (37), the elution solution supply container (38), the regeneration solution supply container (39) and the switching valve (35), It is connected via a branch valve (33), and if necessary, an adsorption solution, a washing solution, an elution solution and a regeneration solution are packed into a purification column (34) by a system pump (40). In this system, the liquid passed through the column in the purification step is sent to the flow cell (41) of the HPLC apparatus for purification (g), and the absorbance of the liquid is measured by a UV monitor (42). The liquid that has passed through the flow cell can also be collected by a fraction collector (43) if necessary, but if purification is to be performed in a further purification step, it may be connected to the step. When monitoring the concentration of the target protein contained in the column passage liquid in the purification step in the HPLC apparatus for purification (g), the passage liquid of the UV flow cell (41) is piped to the switching valve of the protein concentration measuring device (f) Connect to 51) and intermittently switch, and if necessary, fill the detection column (53) through the sample loop (52). The detection column is connected to the cleaning solution supply container (55) and the elution solution supply container (56) via the switching valve (51) and the switching valve (54) and, if necessary, to the regeneration solution (61). The detection column (53) can be washed, eluted, etc. by the pump (57). The eluate from the detection column (53) passes through the flow cell (58), and the concentration of the target protein is measured by the UV monitor (59).
以下に、本発明の実施例を記載する。 Below, the Example of this invention is described.
実施例１（検出用カラムの作製）
検出用カラムは次のようにして製造した。まず、水溶性高分子であるポリエチレンオキシド（アルドリッチ製 商品番号８５，６４５−２）０．９０ｇ及び尿素０．９０ｇを０．０１規定酢酸水溶液１０ｇに溶解し、この溶液にテトラメトキシシラン４ｍｌを攪拌下で加えて、加水分解反応を行った。数分間攪拌した後、得られた透明溶液を内径６ｍｍのガラスチューブ内に注入し３０℃の恒温漕中に保持したところ約３０分後に固化した。
Example 1 (preparation of detection column)
The detection column was manufactured as follows. First, 0.90 g of polyethylene oxide (product number 85, 645-2 manufactured by Aldrich) and 0.90 g of urea which are water-soluble polymers are dissolved in 10 g of 0.01 N aqueous acetic acid solution, and 4 ml of tetramethoxysilane is stirred in this solution. The hydrolysis reaction was carried out by adding below. After stirring for several minutes, the obtained clear solution was poured into a glass tube with an inner diameter of 6 mm and kept in a thermostat at 30 ° C., and solidified after about 30 minutes.
固化した試料をさらに数時間熟成させ、密閉条件下で１４０℃に２０時間保った。この処理の後、ゲルを４０℃で３日間乾燥し、１００℃／ｈの昇温速度で６００℃まで加熱し、直径４．８ｍｍの棒状の無機系多孔質担体を得た。 The solidified sample was further aged for several hours and kept at 140 ° C. for 20 hours under closed conditions. After this treatment, the gel was dried at 40 ° C. for 3 days and heated to 600 ° C. at a temperature rising rate of 100 ° C./h to obtain a rod-like inorganic porous carrier having a diameter of 4.8 mm.
得られた無機系多孔質担体中には中心孔径２μｍ程度の揃った貫通孔が３次元網目状（三次元ネットワーク状）に絡み合った構造で存在していることが確かめられた。そして、その貫通孔の内壁に直径６０ｎｍ程度の細孔が多数存在していることが、窒素吸着測定によって確かめられた。このような棒状の無機系多孔質担体として得られるモノリス型（連続多孔質体である一体型）シリカゲル（モノリスシリカ又はモノリス型シリカとも呼ぶ）を厚さ１１．０ｍｍに切断することにより、体積２００μLの円柱状の無機系多孔質担体を得た。 It was confirmed that in the obtained inorganic porous carrier, uniform through holes having a central pore diameter of about 2 μm were present in a three-dimensional network (three-dimensional network) entangled structure. Then, it was confirmed by nitrogen adsorption measurement that a large number of pores having a diameter of about 60 nm were present on the inner wall of the through hole. By cutting a monolithic silica gel (also referred to as monolithic silica or monolithic silica), which is obtained as such a rod-like inorganic porous carrier, into a thickness of 11.0 mm, the volume is 200 μL. A columnar inorganic porous carrier of
この円柱状の無機系多孔質担体に以下の方法でプロテインＡ変異体を固定化した。まず、アミノプロピルトリエトキシシランをトルエン溶媒で２０％の濃度に希釈した溶液に円柱状の無機系多孔質担体を浸漬し、６時間加熱還流して反応させることにより円柱状の無機系多孔質担体の表面にアミノ基を導入した。次に、この無機系多孔質担体を、収縮前の内径５．５ｍｍのＴＥＦＬＯＮ製熱収縮チューブの中に入れ、その両端の開口部にＰＥＥＫ製カラムエンドを差し込み、カラムエンドの端面と無機系多孔質担体の端面を密着させた状態で１５０℃で３０分間処理して熱収縮チューブを収縮させることにより、無機系多孔質担体の円筒外周をシールした。更に、カラムエンドと熱収縮チューブを包み込む形で外周をエポキシ樹脂で固めることにより、ＨＰＬＣで使用できるカラムを作製した。このようにしてアミノ基修飾カラムを複数作製し、そのうち３本を抜き取り、加圧送液による破壊検査によって１０ＭＰａまでの耐圧性を確認した。次に、公知の方法（特許文献３）により、予めアミノ基と結合するように活性化されたプロテインA変異体２．４ｍｇを含む２０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）１．６ｍＬを調製し、これをアミノ基修飾カラムに通液することにより、担体表面のアミノ基とプロテインA変異体を共有結合させた。その後、カラムを洗浄し、残存アミノ基のエンドキャッピングを行った後、２０％エタノール溶液に置換した。 The protein A variant was immobilized on this columnar inorganic porous carrier by the following method. First, a columnar inorganic porous carrier is immersed in a solution in which aminopropyltriethoxysilane is diluted to a concentration of 20% with a toluene solvent, and heated and refluxed for 6 hours to cause a reaction. The amino group was introduced on the surface of Next, the inorganic porous carrier is placed in a TEFLON heat-shrink tube having an inner diameter of 5.5 mm before shrinkage, and the PEEK column end is inserted into the opening at both ends, and the end face of the column end and the inorganic porous The cylindrical outer periphery of the inorganic porous carrier was sealed by contracting the heat-shrinkable tube for 30 minutes at 150 ° C. in a state where the end face of the quality carrier is in close contact. Furthermore, the column usable for HPLC was made by setting the outer periphery with an epoxy resin so as to enclose the column end and the heat-shrinkable tube. In this manner, a plurality of amino group-modified columns were prepared, three of them were taken out, and pressure resistance up to 10 MPa was confirmed by a destructive inspection by pressurized liquid feed. Next, 1.6 mL of 20 mM borate buffer (pH 8.5) containing 2.4 mg of the protein A variant previously activated to bind to an amino group is prepared by a known method (Patent Document 3) By passing this through an amino group-modified column, the amino group on the carrier surface was covalently linked to the protein A variant. After that, the column was washed, end-capping of the remaining amino groups was performed, and then it was replaced with a 20% ethanol solution.
以上のようにして得られたカラムが、モノリスシリカ担体にプロテインＡ変異体を固定化した検出用カラムである。 The column obtained as described above is a detection column in which the protein A variant is immobilized on a monolithic silica carrier.
実施例２（タンパク質濃度測定装置の作製）
図１に示したように、前記検出用カラム（３）の先端を六方バルブ（Ｃ７５Ｈ−１６９６ＥＭＨ、Ｖａｌｃｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ． Ｉｎｃ．）（２）および後端をＵＶモニター（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス株式会社）（１５）と結ぶ形で配管を接続し、六方バルブ（２）は他に試料を保持するためのサンプルループ（５）を接続し、また、プランジャーポンプ（ＭＵ７７１０、ジーエルサイエンス株式会社）（１０）、精製プラント等外部と接続するための配管（６）と接続した。更にプランジャーポンプ（１０）にはポンプ製造元からオプションとして販売されている低圧グラジエントユニット（低圧グラジエントユニット、ジーエルサイエンス株式会社）、即ち、四液切り替えバルブ（１１）と接続し、四液切り替えバルブ（１１）は吸着洗浄溶液を入れる供給容器（１２）、溶出溶液を入れる供給容器（１３）、再生溶液を入れる供給容器（１４）と接続し、タンパク質濃度測定装置を完成した。
Example 2 (preparation of a protein concentration measuring device)
As shown in FIG. 1, the tip of the detection column (3) is a hexagonal valve (C75H-1696EMH, Valco Instruments Co. Inc.) (2) and the rear end is a UV monitor (MU701, GL Science Inc.) 15) Connect the piping in the form of connection with it, connect the sample loop (5) for holding the sample to the other with the six-way valve (2), and also connect the plunger pump (MU7710, GL Science Inc.) (10) , It connected with piping (6) for connecting with the outside such as purification plant. Furthermore, the plunger pump (10) is connected to a low pressure gradient unit (low pressure gradient unit, GL Science Co., Ltd.) sold as an option from the pump manufacturer, ie, connected to the four liquid switching valve (11). 11) was connected to a supply container (12) for containing the adsorption washing solution, a supply container (13) for containing the elution solution, and a supply container (14) for containing the regeneration solution to complete a protein concentration measuring apparatus.
実施例３（測定方法）
抗体サンプル溶液として、ヒトイムノグロブリンとして販売されているポリクローナル抗体（「ＩｇＧ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｇｒａｄｅ」、Ｓｉｇｍａ社）を、吸着洗浄溶液として用いる１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、１倍、１．５倍、３倍、５倍、７．５倍、１０倍、１５倍、２５倍、５０倍の各倍率に調製した。次に、分光光度計（Ｕ−２９００、株式会社日立ハイテクサイエンス）を用いてこれら希釈系列の抗体濃度を決定した。抗体濃度の定量にあたっては２８０ｎｍの吸光度を測定し、光路長１ｃｍ、濃度１ｇ／Ｌにおける抗体の吸光係数を１４として用いた。その結果、前記希釈系列の濃度は、１０．９ｇ／Ｌ、７．２５ｇ／Ｌ、３．５９ｇ／Ｌ、２．２１ｇ／Ｌ、１．４４ｇ／Ｌ、１．０９ｇ／Ｌ、０．７１ｇ／Ｌ、０．４３ｇ／Ｌ、０．２１ｇ／Ｌであり、これら各濃度の抗体溶液を注入試料として用いた。
Example 3 (measurement method)
50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 M NaCl, using polyclonal antibody (“IgG from human serum Technical grade”, Sigma) sold as human immunoglobulin as an antibody sample solution, as an adsorption washing solution And diluted to 1 ×, 1.5 ×, 3 ×, 5 ×, 7.5 ×, 10 ×, 15 ×, 25 ×, 50 ×. Next, the antibody concentration of these dilution series was determined using a spectrophotometer (U-2900, Hitachi High-Tech Science, Inc.). In quantifying the antibody concentration, the absorbance at 280 nm was measured, and the absorbance coefficient of the antibody at an optical path length of 1 cm and a concentration of 1 g / L was used as 14. As a result, the concentration of the dilution series is 10.9 g / L, 7.25 g / L, 3.59 g / L, 2.21 g / L, 1.44 g / L, 1.09 g / L, 0.71 g / L. The antibody solutions of L, 0.43 g / L, 0.21 g / L, and these concentrations were used as injection samples.
検出用カラムにおける分析は６ｍＬ／ｍｉｎの送液条件で実施され、カラムに注入する試料、または、溶液を順次切り替えることにより、試料中の抗体を担体上のプロテインＡに捕捉させ、洗浄し、溶出させた。即ち、予め吸着洗浄溶液で平衡化されたカラムに対して、５０μＬのサンプルループ内に充填された試料を２．４ｍＬの吸着洗浄溶液を通液して押し流すことにより、抗体を吸着させると共に、吸着しない成分を洗い落とし（吸着洗浄工程）、続いて１．８ｍＬの溶出溶液を通液することにより、リガンドに結合した抗体を遊離させ（溶出工程）、次に１．２ｍＬの再生溶液を通液することにより、検出用カラムへの残存吸着物を遊離させ（再生工程）、更に、０．６ｍＬの吸着洗浄溶液を通液することにより、抗体と結合できる状態へとカラムを再平衡化すること（再平衡化工程）により実施され、試料注入から再平衡化までの一連の分析は１分間で実施された。また、一連の分析工程を各濃度の抗体試料溶液について順次実施した。 The analysis in the detection column is carried out at a flow condition of 6 mL / min, and by sequentially switching the sample or solution injected into the column, the antibody in the sample is captured on protein A on the carrier, washed, and eluted I did. That is, for a column previously equilibrated with the adsorption washing solution, the antibody packed in the 50 μL sample loop is allowed to adsorb the antibody by passing it through the 2.4 mL adsorption washing solution. The antibody bound to the ligand is released (elution step) by washing out the components not adsorbed (adsorption washing step) and then passing 1.8 mL of elution solution (elution step), and then passing 1.2 mL of regeneration solution. To release the remaining adsorbate to the detection column (regeneration step), and then re-equilibrate the column to a state in which it can be bound to the antibody by passing 0.6 mL of the adsorption washing solution. A series of analysis from sample injection to re-equilibration was carried out in 1 minute. In addition, a series of analysis steps were sequentially performed on each concentration of antibody sample solution.
このようにして一連の分析工程を実施することによりタンパク質濃度測定装置のＵＶモニターで得られた吸光度の推移を示すデータ（クロマトグラム）のうち、試料溶液から分離され検出用カラムに吸着した抗体が、検出用カラムから遊離する溶出工程に対応して出現するクロマトグラムのピークについて、数値積分を演算することにより、精製されて遊離した抗体量の指標となるピーク面積値を得た。また、各濃度の抗体試料溶液について順次実施した。 Among the data (chromatogram) showing the transition of the absorbance obtained by the UV monitor of the protein concentration measuring apparatus by carrying out a series of analysis steps in this manner, the antibody separated from the sample solution and adsorbed on the detection column is The peak area value which is an index of the amount of antibody which has been purified and released is obtained by calculating the numerical integration of the peak of the chromatogram which appears corresponding to the elution step liberated from the detection column. Moreover, it implemented sequentially about the antibody sample solution of each density | concentration.
これらの手順により得られた結果をまとめ、横軸に分光光度計から明らかにした抗体試料溶液の抗体濃度と量、縦軸に本装置で分析したピーク面積値として図４および図５にその応答特性を示した。なお、図の上部の横軸には使用したサンプルループ容量５０μＬで注入抗体濃度を乗じ、注入抗体量（重量）として示した。ここで図中の凡例について、ＥＬは溶出画分のピーク面積を示し、ＦＴは試料注入時の素通り画分のピーク面積を示す。また、ＦＴ＋ＥＬはそれらピーク面積の和を示す。この図により、注入抗体濃度４ｇ／Ｌ、即ち、注入抗体量にして２００μｇを超えた領域では溶出ピーク面積の線形性が崩れ始めていることが示された。一方で、これ以下の濃度領域では線形性が成り立つことが示唆され、図５に４ｇ／Ｌ以下の領域を拡大すると、決定係数Ｒ二乗が０．９９９９であり、非常に良好な線形相関であることが示され、２００μｇまでの注入抗体量に対して定量法として信頼できることを示した。本試験においては操作の迅速性を確保するために、容量２００μＬのカラムに対して６ｍＬ／ｍｉｎの流量で送液したが、圧力は１〜２ＭＰａと低かった。測定に要した時間は僅か１分であり、これは従来のプロテインＡ結合アガロースを使用したＨＰＬＣに比べて格段に短い時間で目的タンパク質を定量できることが示された。 The results obtained by these procedures are summarized, with the horizontal axis representing the antibody concentration and amount of the antibody sample solution revealed from the spectrophotometer, and the vertical axis representing the peak area value analyzed with this device. The characteristics are shown. The horizontal axis at the top of the figure is 50 μL of the sample loop volume used, multiplied by the concentration of antibody injected, and shown as the amount (weight) of antibody injected. Here, for the legend in the figure, EL indicates the peak area of the eluted fraction, and FT indicates the peak area of the flow-through fraction at the time of sample injection. Moreover, FT + EL shows the sum of those peak areas. From this figure, it is shown that the linearity of the elution peak area is beginning to break in the region where the injected antibody concentration is 4 g / L, ie, the amount of injected antibody exceeds 200 μg. On the other hand, it is suggested that in the concentration region below this, it is suggested that linearity holds, and when the region below 4 g / L is expanded in FIG. 5, the determination coefficient R square is 0.9999, which is a very good linear correlation It was shown to be reliable as a quantitative method for up to 200 μg of injected antibody. In this test, in order to ensure the quickness of the operation, the liquid was sent at a flow rate of 6 mL / min to a 200 μL column, but the pressure was as low as 1 to 2 MPa. The time required for the measurement was only 1 minute, which indicated that the target protein can be quantified in a much shorter time as compared to HPLC using conventional protein A-conjugated agarose.
実施例４（精製工程モニタリングのための装置構成）
図３に示したように、精製工程をモニターするために本発明のタンパク質濃度測定装置を精製用ＨＰＬＣ装置に接続した。具体的には本装置で抗体濃度を測定する対象として、市販の精製用ＨＰＬＣ（ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５ Ｍ２、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）（ｇ）を用いた。精製用ＨＰＬＣで精製対象とする試料注入口（３１）から注入した精製用試料を分離精製するために、精製用ＨＰＬＣ（ｇ）で精製対象とする試料注入口（３１）から注入した精製用試料を送液するためのサンプルポンプ（３２）と、吸着液（３６）、洗浄液（３７）、溶出液（３８）、再生液（３９）の各溶液を送液するためのシステムポンプ（４０）を、分岐バルブ（３３）を介して精製用カラム（３４）の先端と接続した。また、精製用カラム（３４）の後端を、精製用カラム（３４）から流れ出てくる液体の吸光度を検出するためのＵＶモニター（４２）に電気的に接続されたフローセル（４１）と接続した。このように構成された精製用ＨＰＬＣ（ｇ）に対して、精製用ＨＰＬＣ（ｇ）のフローセルを通過した液体をタンパク質濃度測定装置（ｆ）の切り替えバルブ（５１）に接続することにより、実施例２で作製したタンパク質濃度測定装置{図３、（５１）〜（６１）}（ｆ）と接続した。サンプルループ（５２）への液体の充填は精製用ＨＰＬＣ（ｇ）の液体の流れを利用し、切り替えバルブ（５１）で流路を切り替えることにより行った。
Example 4 (Device configuration for purification process monitoring)
As shown in FIG. 3, the protein concentration measurement device of the present invention was connected to a purification HPLC device to monitor the purification process. Specifically, commercially available HPLC for purification (AKTA pure 25 M2, GE Healthcare Japan Co., Ltd.) (g) was used as a target for measuring the antibody concentration with this device. In order to separate and purify the sample for purification injected from the sample inlet (31) to be purified by HPLC for purification, the sample for purification injected from the sample inlet (31) to be purified by HPLC (g) for purification Sample pump (32) for feeding the solution, and system pump (40) for feeding each solution of the adsorption solution (36), washing solution (37), elution solution (38), and regeneration solution (39) , Connected to the tip of the purification column (34) via a branch valve (33). In addition, the rear end of the purification column (34) was connected to a flow cell (41) electrically connected to a UV monitor (42) for detecting the absorbance of the liquid flowing out of the purification column (34). . In contrast to the HPLC for purification (g) configured as described above, the liquid passing through the flow cell for HPLC for purification (g) is connected to the switching valve (51) of the protein concentration measuring apparatus (f) to obtain an example. It connected with the protein concentration measuring apparatus {FIG. 3, (51)-(61)} (f) produced by 2. The liquid was filled into the sample loop (52) by using the liquid flow of HPLC for purification (g) and switching the flow path with the switching valve (51).
実施例５（アフィニティー精製のモニタリング試験）
前記実施例４で図３に示した装置系を使用し、精製用ＨＰＬＣ（ｇ）を用いて試料溶液に含まれる抗体をプロテインＡカラムによって分離精製し、その過程でカラム通過液を間欠的にタンパク質濃度測定装置（ｆ）でサンプリングし、その抗体濃度の推移をモニターした。具体的には、精製用ＨＰＬＣ（ｇ）で精製対象となる精製用試料（３１）としてモノクローナル抗体を発現させたＣＨＯ細胞培養上清を用いた。また、精製用ＨＰＬＣ（ｇ）に接続する精製用カラム（３４）として市販のプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ １ｍＬ、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いた。精製用ＨＰＬＣ（ｇ）における分離精製は０．５ｍＬ／ｍｉｎの流量で行い、吸着液（３６）として１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、洗浄液（３７）として１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、溶出液（３８）として０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）、再生液（３９）として０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）を使用し、１０ｍＬの吸着液（３６）で精製用カラム（３４）を平衡化した後、６０ｍＬの精製用試料（３１）を通液し、次に１５ｍＬの吸着液（３６）を通液し、次に５ｍＬの洗浄液（３７）を通液し、次に５ｍＬの溶出液（３８）を通液し、最後に５ｍＬの再生液（３９）を通液することにより分離精製を行った。精製用カラム（３４）を流れ出た液体は精製用ＨＰＬＣ（ｇ）のＵＶモニター（４２）で吸光度を測定されるとともに、タンパク質濃度測定装置（ｆ）の切り替えバルブ（５１）により、サンプルループ（５２）を介して間欠的に検出用カラム（５３）に注入され、実施例３に示した検出用カラムにおける分析手順により１分間で分離精製され、溶出画分の吸光度に対応するクロマトグラムを分析して試料の抗体濃度を測定した。
Example 5 (monitoring test of affinity purification)
The antibody contained in the sample solution is separated and purified by a protein A column using HPLC (g) for purification using the apparatus system shown in FIG. 3 in Example 4 above, and in the process, the column passage liquid is intermittently used. It sampled with the protein concentration measurement apparatus (f), and monitored the transition of the antibody concentration. Specifically, a CHO cell culture supernatant in which a monoclonal antibody was expressed was used as a purification sample (31) to be purified by HPLC (g) for purification. In addition, a commercially available protein A column (HiTrap
その結果を図６に示した。図中ｈで示された実線は精製用ＨＰＬＣ（ｇ）のＵＶモニター（４２）で検出した精製用カラム（３４）出口での吸光度、ｉはタンパク質濃度測定装置（ｆ）で断続的に検出用カラム（５３）を用いて測定した分析対象の抗体の濃度である。図６によれば、過剰量のサンプルアプライにより既に大量の抗体が漏出していること、溶出段階では吸着した全ての抗体が吸着されず、再生処理液の中に抗体が存在することが確認され、実生産段階での精製カラムに対するアプライ量の限界と溶出条件に更に検討が必要なことが、モニタリング結果から示された。また、精製用ＨＰＬＣ（ｇ）の流量を１ｍＬ／ｍｉｎおよび０．５ｍＬ／ｍｉｎの条件で比較検討し、試料注入時における抗体の漏出挙動を比較した。図７では流量１ｍＬ／ｍｉｎの条件における吸光度をｊ、流量０．５ｍＬ／ｍｉｎの条件における吸光度をｋ、流量１ｍＬ／ｍｉｎの条件における分析対象の抗体濃度をＬ、流量０．５ｍＬ／ｍｉｎの条件における分析対象の抗体濃度をｍで表す。図７に示すように、試料を注入する際の流量によって精製カラムから抗体が漏出し始める位置に違いがあること（動的結合容量）が確認することができ、精製カラムに抗体を効率よく捕捉させるための条件を決定する工程開発において活用できることが示された。 The results are shown in FIG. The solid line indicated by h in the figure is the absorbance at the outlet of the purification column (34) detected by the UV monitor (42) of the purification HPLC (g), and i is intermittently detected by the protein concentration measuring device (f) It is the concentration of the antibody to be analyzed measured using the column (53). According to FIG. 6, it is confirmed that a large amount of antibody has already leaked out due to an excessive amount of sample application, and that all adsorbed antibodies are not adsorbed in the elution step, and the antibody is present in the regeneration treatment solution. From the monitoring results, it was shown that the limitation of the applied amount to the purification column at the actual production stage and the elution condition should be further studied. In addition, the flow rates of HPLC for purification (g) were compared under the conditions of 1 mL / min and 0.5 mL / min, and the leakage behavior of the antibody at the time of sample injection was compared. In FIG. 7, the absorbance at a flow rate of 1 mL / min is j, the absorbance at a flow rate of 0.5 mL / min is k, the antibody concentration at the flow rate of 1 mL / min is L, and the flow rate of 0.5 mL / min The antibody concentration to be analyzed in is represented by m. As shown in FIG. 7, it can be confirmed that there is a difference in the position where the antibody starts to leak from the purification column (dynamic binding capacity) depending on the flow rate when injecting the sample, and the antibody is efficiently captured on the purification column It has been shown that it can be used in process development to determine the conditions for
実施例６（イオン交換クロマトグラフィーのモニタリング試験）
前記実施例４で図３に示した装置系を使用し、精製用ＨＰＬＣ（ｇ）を用いて試料溶液に含まれる抗体をカチオン交換カラムによって分離精製し、その過程でカラム通過液を間欠的にタンパク質濃度測定装置（ｆ）でサンプリングし、その抗体濃度の推移をモニターした。具体的には、精製用ＨＰＬＣ（ｇ）で精製対象となる精製用試料（３１）としてモノクローナル抗体を発現させたＣＨＯ細胞培養上清を吸着液（３６）で５倍希釈した後、少量の塩酸を加えて吸着液（３６）と同じｐＨに調製し、０．２μｍのフィルターで濾過して用いた。また、精製用ＨＰＬＣ（ｇ）に接続する精製用カラム（３４）として市販のカチオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦ １ｍＬ、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いた。精製用ＨＰＬＣ（ｇ）における分離精製は１．０ｍＬ／ｍｉｎの流量で行い、吸着液（３６）として２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）、洗浄液（３７）として２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、溶出液（３８）として１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を使用した。なお、再生液（３９）は使用しなかった。１０ｍＬの吸着液（３６）で精製用カラム（３４）を平衡化した後、３００ｍＬの精製用試料（３１）を通液し、次に１５ｍＬの吸着液（３６）を通液し、次に５ｍＬの洗浄液（３７）を通液し、次に洗浄液（３７）と溶出液（３８）を混合しながら３０ｍＬかけて通液することにより溶出液（３８）の濃度を０％から３０％までリニアに増加させた。更に、その濃度を維持したまま５ｍＬ通液し、最後に溶出液（３８）の濃度１００％で１２ｍＬを通液することにより分離精製を行った。実施例５と同様に、精製用カラム（３４）を流れ出た液体は精製用ＨＰＬＣ（ｇ）のＵＶモニター（４２）で吸光度を測定されるとともに、タンパク質濃度測定装置（ｆ）の切り替えバルブ（５１）により、サンプルループ（５２）を介して間欠的に検出用カラム（５３）に注入され、実施例３に示した検出用カラムにおける分析手順により１分間で分離精製され、溶出画分の吸光度に対応するクロマトグラムを分析して試料の抗体濃度を測定した。
Example 6 (monitoring test of ion exchange chromatography)
The antibody contained in the sample solution is separated and purified by a cation exchange column using HPLC (g) for purification using the apparatus system shown in FIG. 3 in Example 4 above, and in the process, the column passing solution is intermittently used. It sampled with the protein concentration measurement apparatus (f), and monitored the transition of the antibody concentration. Specifically, a CHO cell culture supernatant expressing a monoclonal antibody as a purification sample (31) to be purified by HPLC for purification (g) is diluted 5-fold with an adsorption solution (36), and then a small amount of hydrochloric acid is used. The solution was adjusted to the same pH as the adsorption solution (36) and filtered through a 0.2 μm filter. In addition, a commercially available cation exchange column (
その結果を図８に示した。図中ｈで示された実線は精製用ＨＰＬＣ（ｇ）のＵＶモニター（４２）で検出した精製用カラム（３４）出口での吸光度、ｉはタンパク質濃度測定装置（ｆ）で断続的に検出用カラム（５３）を用いて測定した分析対象の抗体の濃度である。図８によれば、累積通液量４０ｍＬ付近から樹脂に結合せずに漏出してくる抗体の存在を確認できることがわかり、その結果、予め分析した注入試料中の抗体濃度が０．２５ｇ／Ｌであったことから、動的結合容量（ＤＢＣ）は担体１ｍＬあたり１０ｍｇであることが確認された。また、精製用ＨＰＬＣ（ｇ）の吸着液（３６）のｐＨを５．０および６．０に変更し、精製試料（３１）のｐＨを同様に変更して分離精製を行い、その過程をタンパク質濃度測定装置（ｆ）でモニターしたところ、ＤＢＣはｐＨを５．０では担体１ｍＬあたり５０ｍｇ、ｐＨを６．０では担体１ｍＬあたり０ｍｇであった（図９、および図１０）。このようにモノリスシリカ担体を充填した検出用カラムをタンパク質濃度測定装置を用いて精製工程のモニタリングを行うと、容易にカチオン交換カラムのＤＢＣのｐＨ依存性が確認され、精製条件の検討にも有用であることが理解された。 The results are shown in FIG. The solid line indicated by h in the figure is the absorbance at the outlet of the purification column (34) detected by the UV monitor (42) of the purification HPLC (g), and i is intermittently detected by the protein concentration measuring device (f) It is the concentration of the antibody to be analyzed measured using the column (53). According to FIG. 8, it can be seen that the presence of the antibody leaking without binding to the resin can be confirmed from around 40 mL of cumulative liquid flow, and as a result, the antibody concentration in the injection sample analyzed in advance is 0.25 g / L It was confirmed that the dynamic binding capacity (DBC) was 10 mg per mL of the carrier. In addition, the pH of the adsorption solution (36) of HPLC for purification (g) is changed to 5.0 and 6.0, the pH of the purified sample (31) is similarly changed to perform separation and purification, and the process is The DBC was 50 mg / mL of the carrier at pH 5.0 and 0 mg / mL of the carrier at pH 6.0 as monitored by the concentration measuring device (f) (FIGS. 9 and 10). When the purification step is monitored using a protein concentration measuring device with the detection column packed with monolithic silica carrier in this way, the pH dependency of DBC of the cation exchange column is easily confirmed, which is useful for the study of purification conditions. It was understood that.
本発明は、バイオ医薬品の製造技術として利用可能である。 The present invention can be used as a biopharmaceutical manufacturing technology.
ａ：精製プラントにおける培養物または精製工程の溶出物、ｂ：培養物または精製工程の溶出物を移送する主配管、ｃ：主配管上の分岐バルブ、ｄ：細胞培養液、ｅ：対象タンパク質の最終精製品、ｆ：タンパク質濃度測定装置、ｇ：精製用ＨＰＬＣ装置、ｈ：精製用ＨＰＬＣ装置内のＵＶモニターで検出した精製用カラム出口での吸光度、ｉ：検出用カラムを用いて測定した分析対象の抗体の濃度、ｊ：流量１ｍＬ／ｍｉｎの条件における吸光度、ｋ：流量 ０．５ｍＬ／ｍｉｎの条件における吸光度、Ｌ：流量１ｍＬ／ｍｉｎの条件における分析対象の抗体濃度、ｍ：流量０．５ｍＬ／ｍｉｎの条件における分析対象の抗体濃度、ＥＬ：溶出画分のピーク面積、ＦＴ：試料注入時の素通り画分のピーク面積、ＥＬ＋ＦＴ：ピーク面積の和、x ：濃度、ｙ： 測定値に対する回帰式、Ｒ：決定係数、１：ポンプ、２：切り替えバルブ、３：検出用カラム、４：排出口、５：サンプルループ、６：配管、７：配管、8：配管、９：配管、１０：ポンプ、１１：切り替えバルブ、１２：供給容器、１３：供給容器、１４：供給容器、１５：ＵＶモニター、２１：タンパク質濃度測定装置、２２：連続精製装置、２３：分岐バルブ、２４：供給容器、２５：回収プール、２６：ウイルス除去装置、３１：試料注入口、３２：ポンプ、３３：分岐バルブ、３４：精製用カラム、３５：切り替えバルブ、３６：供給容器、３７：供給容器、３８：供給容器、３９：供給容器、４０：ポンプ、４１：フローセル、４２：ＵＶモニター、４３：フラクションコレクター、４４：排出口、５１：切り替えバルブ、５２：サンプルループ、５３：検出用カラム、５４：切り替えバルブ、５５：供給容器、５６：供給容器、５７：ポンプ、５８：フローセル、５９：ＵＶモニター、６０：排出口、６１：供給容器
a: a culture in a purification plant or an eluate of a purification step, b: a main pipe for transferring a culture or an eluate of the purification step, c: a branch valve on the main pipe, d: a cell culture medium, e: a target protein Final purified product f: Protein concentration measurement device g: HPLC device for purification h: Absorbance at the outlet of purification column detected by UV monitor in HPLC device for purification i: Analysis measured using detection column Concentration of target antibody, j: Absorbance under conditions of
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