JP2018177658A - Treatment of castration resistant prostate cancer - Google Patents
Treatment of castration resistant prostate cancer Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018177658A JP2018177658A JP2017075596A JP2017075596A JP2018177658A JP 2018177658 A JP2018177658 A JP 2018177658A JP 2017075596 A JP2017075596 A JP 2017075596A JP 2017075596 A JP2017075596 A JP 2017075596A JP 2018177658 A JP2018177658 A JP 2018177658A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- prostate cancer
- mir
- crpc
- expression
- hsa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
Description
本発明は去勢抵抗性前立腺癌の治療や診断に有用な技術に関する。詳しくは、去勢抵抗性前立腺癌の治療薬、去勢抵抗性前立腺癌の発症又は増悪の予測、及び去勢抵抗性前立腺癌治療薬の候補物質のスクリーニング方法等に関する。 The present invention relates to techniques useful for the treatment and diagnosis of castration resistant prostate cancer. Specifically, the present invention relates to a therapeutic agent for castration-resistant prostate cancer, prediction of the onset or progression of castration-resistant prostate cancer, and a method of screening for a candidate substance for castration-resistant prostate cancer.
本邦の前立腺癌の罹患数は増加の一途をたどり、男性では第1位である（2015年の統計で98,400人）。前立腺癌はアンドロゲン依存性の腫瘍であり、アンドロゲンレセプター(AR)−アンドロゲン軸が中心的役割を果たすため、前立腺癌にはアンドロゲンの血中濃度を下げるホルモン療法が有用である。限局癌および局所進行型癌では、リスク分類により無治療経過観察、手術療法、放射線治療が選択される。局所進行型の超高リスク群や転移癌には、ホルモン療法が第一選択となるが、これらの進行性前立腺癌は数年でホルモン療法に抵抗性を示す去勢抵抗性前立腺癌（castration-resistant prostate cancer; CRPC）に進行し、癌の浸潤や転移が起こり予後不良である（図１）。CRPCの発症メカニズムには、アンドロゲン非依存性経路とアンドロゲン依存性経路が考えられている。前者は癌抑制遺伝子の変異、抗アポトーシス作用の亢進や神経内分泌性分化などが挙げられ、後者では、AR増幅、AR変異、アンドロゲン合成の活性化やアンドロゲン結合部位が欠損し、アンドロゲン非存在下でも活性化しうるAR（AR splice variants）が関与する（図２）。 The number of prostate cancer cases in Japan continues to increase, and is the number one in men (98,400 according to 2015 statistics). Prostate cancer is an androgen dependent tumor, and since the androgen receptor (AR)-androgen axis plays a central role, hormone therapy that lowers the blood concentration of androgen is useful for prostate cancer. For localized cancer and locally advanced cancer, the risk classification selects no treatment follow-up, surgery, and radiation therapy. Hormonal therapy is the first choice for locally advanced ultra-high risk groups and metastatic cancer, but these advanced prostate cancers are resistant to hormonal therapy in several years (castration-resistant prostate cancer (castration-resistant) Progression to prostate cancer (CRPC) occurs, and cancer invasion and metastasis occur, resulting in a poor prognosis (Fig. 1). Androgen independent pathway and androgen dependent pathway are considered as the onset mechanism of CRPC. The former includes mutations in tumor suppressor genes, enhancement of anti-apoptotic activity, neuroendocrine differentiation, etc., and the latter includes defects in AR amplification, AR mutations, activation of androgen synthesis, and androgen binding sites, even in the absence of androgen The activatable AR (AR splice variants) is involved (FIG. 2).
CRPCの治療方法には、抗アンドロゲン剤の休止、交替、エストロゲン剤やタキサン系製剤を用いた化学療法がある。CRPC新規治療薬として、AR受容体拮抗薬エンザルタミドやアンドロゲン合成阻害薬アビラテロンが開発され、本邦においても2014年に認可されている。しかしながら半年〜１年以内の短期間で治療に対する抵抗性を獲得し、予後不良な経過をたどり、現状ではそれに対応できる治療法が確立されていない。ARスプライシングバリアントの一つであるAR-V7はCRPCの増殖やエンザルタミドやアビラテロンの治療抵抗性に関与し、近年CRPCの新しい治療標的として注目されている。CRPCの治療標的としてのAR-V7研究が展開されており、AR-V7阻害剤が開発されている（Galeteroneについて非特許文献１、特許文献１を参照。RORγagonistについて非特許文献２を参照）。
Methods of treating CRPC include cessation and replacement of antiandrogens, and chemotherapy with estrogens and taxanes. An AR receptor antagonist enzalutamide and an androgen synthesis inhibitor abiraterone have been developed as novel therapeutic agents for CRPC and have been approved in Japan in 2014. However, it has acquired resistance to treatment within a short period of half a year to 1 year, has a poor prognosis, and no treatment that can cope with it has been established at present. One of the AR splicing variants, AR-V7, is involved in the growth of CRPC and the treatment resistance of enzalutamide and abiraterone, and has recently attracted attention as a new therapeutic target for CRPC. The AR-V7 research as a therapeutic target for CRPC is being developed, and AR-V7 inhibitors have been developed (see Non-Patent
マイクロRNAは、生体内に存在する22塩基程度の小分子RNAである。マイクロRNAは、3’非翻訳領域（3'UTR）に部分相補的配列を有する標的遺伝子に結合し、mRNAの不安定化や翻訳を抑制することで、タンパク質産生を抑制する。このマイクロRNAの機能は、遺伝子の転写後発現制御として重要な機構であり、遺伝子発現異常が原因の疾患の治療薬や予後マーカーとしての応用が期待される。 The microRNA is a small RNA of about 22 bases present in vivo. The microRNA binds to a target gene having a partially complementary sequence in the 3 'untranslated region (3'UTR), and suppresses protein destabilization and translation, thereby suppressing protein production. The function of this microRNA is an important mechanism for post-transcriptional expression control of genes, and is expected to be applied as a therapeutic drug or a prognostic marker for diseases caused by abnormal gene expression.
CRPCとマイクロRNAに関しては種々の報告がある。たとえばmiR-212は標的遺伝子のhnRNPH1を介してARおよびAR-V7発現を調節し、CRPCの進行を抑制する（非特許文献３）。しかし、AR-V7の3'UTRに相補配列を有し、CRPCのAR-V7発現を調節しうるマイクロRNAはこれまでに見出されていない。 There are various reports on CRPC and microRNA. For example, miR-212 regulates AR and AR-V7 expression via the target gene hnRNPH1 and suppresses CRPC progression (Non-patent Document 3). However, microRNAs that have a complementary sequence in the 3'UTR of AR-V7 and can regulate AR-V7 expression of CRPC have not been found so far.
本発明の目的は、CRPCに対する新規かつ有望な治療戦略を提供することにある。より具体的には、治療効果の増大や予後の改善をもたらす治療薬及びそれを用いた治療法を提供すること、前立腺癌患者のCRPC発症リスク又はCRPC患者の増悪リスクの予測に有用な技術を提供すること、CRPC治療薬の開発に有用な技術を提供することを目的とする。 The object of the present invention is to provide new and promising therapeutic strategies for CRPC. More specifically, the present invention provides a therapeutic agent that leads to an increase in the therapeutic effect or an improvement in the prognosis and a treatment using the same, or a technique useful for predicting the risk of developing CRPC in prostate cancer patients or the risk of developing CRPC patients. It aims to provide useful technology for the development of CRPC therapeutics.
上記目的の下、本発明者らはルテオリンに着目して研究を進めた。尚、ルテオリンについてはモデル動物を用いた実験において前立腺癌を予防する効果が認められているものの（後述の実施例の欄を参照）、CRPCに対する効果は不明である。 Under the above object, the present inventors focused their research on luteolin. In addition, although the effect which prevents prostate cancer is recognized in the experiment using a model animal about luteolin (refer the column of the below-mentioned Example), the effect with respect to CRPC is unknown.
CRPC細胞の増殖や治療抵抗性に関与するAR-V7に対するルテオリンの作用に焦点をあてつつ様々な実験を行った結果（後述の実施例の欄を参照）、ルテオリンがAR-V7の転写を抑制するとともにAR-V7タンパク質の分解を促進するという、驚くべき事実が明らかとなった。即ち、ルテオリンが、従来の薬剤とは異なる上に複合的な作用によって、CRPCに薬効を示すことが判明した。この知見はルテオリンがCRPCに対する治療薬として有望であることを示すとともに、ルテオリンを既存の薬剤と併用すれば治療効果の増大（相加的ないし相乗的効果）を期待できることを意味する。 As a result of conducting various experiments focusing on the action of luteolin on AR-V7 involved in CRPC cell proliferation and treatment resistance (see the example section below), luteolin suppresses AR-V7 transcription The surprising fact is that it promotes the degradation of AR-V7 protein. That is, it has been found that luteolin exerts a beneficial effect on CRPC by a complex action different from conventional drugs. This finding indicates that luteolin is promising as a therapeutic agent for CRPC, and that luteolin can be expected to increase the therapeutic effect (additive or synergistic effect) if it is used in combination with existing drugs.
更なる検討の結果、ルテオリンが、AR-V7遺伝子の3'UTRに相補性を示す特定のマイクロRNAの発現を誘導し、AR-V7の翻訳を抑制することが判明した。言い換えれば、ルテオリンによって発現が誘導され、AR-V7の翻訳を抑制するという、CRPCに対する医薬として有望なマイクロRNA（核酸）を特定することに成功した。 As a result of further examination, it was found that luteolin induces the expression of a specific microRNA that is complementary to the 3'UTR of the AR-V7 gene and suppresses the translation of AR-V7. In other words, we succeeded in identifying a pharmaceutically promising microRNA (nucleic acid) for CRPC, in which expression is induced by luteolin and suppresses the translation of AR-V7.
一方、ルテオリンの類似構造体にも、効果の差はあるものの、同様の作用が認められた。この知見は当該類似構造体が治療薬候補として有望であることを示すとともに、今後のドラッグデザインに有益な情報を提供する。 On the other hand, similar structures of luteolin were found to have the same effect, although the effects were different. This finding shows that the analogous structure is promising as a therapeutic drug candidate and provides useful information for future drug design.
以上の通り、鋭意検討の末、CRPCに対する新たな治療戦略の確立に有益な知見がもたらされた。ここで、CRPC細胞の増殖や治療抵抗性に関与する分子、即ち、AR-V7の発現調節に重要なマイクロRNAの特定に成功したことは別の観点からも重要である。即ち、当該マイクロRNAはCRPCの発症・増悪（進展）の指標（バイオマーカー）になり、それを利用すれば、CRPCの発症リスクや増悪リスクを評価できる。また、当該マイクロRNAはCRPC細胞の状態を表すことから、その発現変動は薬効評価のための指標となる。従って、当該マイクロRNAをバイオマーカーとしてCRPC治療薬候補をスクリーニングするためのアッセイ系を構築することができる。
以下の発明は上記の成果及び考察に基づく。
［１］以下の（ａ）又は（ｂ）を含む、去勢抵抗性前立腺癌治療薬：
（ａ）アンドロゲンレセプターバリアントAR-V7の3'非翻訳領域に存在する塩基配列UUGACACCAGUUUCUUUC（配列番号１）に対して80％以上の相補性を示す配列を含むRNA；
（ｂ）（ａ）のRNAの発現を誘導する化合物。
［２］前記RNAが塩基配列GAAGGACACUGGUGUCAA（配列番号２）を含むマイクロRNAである、［１］に記載の治療薬。
［３］前記マイクロRNAがhsa-miR-8080又は塩基配列GAAGGACACUGGUGUCAA（配列番号２）を含むその断片である、［２］に記載の治療薬。
［４］前記化合物がルテオリン、アピゲニン又はケルセチンである、［１］に記載の治療薬。
［５］去勢抵抗性前立腺癌細胞の増殖を抑制することで治療効果を発揮する、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の治療薬。
［６］アンドロゲンレセプター拮抗薬及び／又はアンドロゲン合成阻害薬と併用される、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の治療薬。
［７］前立腺癌患者由来の検体中のhsa-miR-8080のレベルを指標にすることを特徴とする、去勢抵抗性前立腺癌の発症又は増悪のリスクを予測する方法。
［８］以下のステップ（１）及び（２）を含む、［７］に記載のリスク予測方法：
（１）前立腺癌患者から採取された検体中のhsa-miR-8080を検出するステップ；
（２）検出値に基づき、去勢抵抗性前立腺癌の発症又は増悪のリスクを判定するステップであって、hsa-miR-8080の低発現がリスクの高いことを示すステップ。
［９］前立腺癌患者が去勢抵抗性前立腺癌を発症しておらず、ステップ（２）では去勢抵抗性前立腺癌の発症のリスクが判定される、［８］に記載のリスク予測方法。
［１０］前立腺癌患者が去勢抵抗性前立腺癌の患者であり、ステップ（２）では去勢抵抗性前立腺癌の増悪のリスクが判定される、［８］に記載のリスク予測方法。
［１１］ステップ（１）で得られた検出値と、同一の前立腺癌患者から過去に採取された検体中の検出値との比較に基づきステップ（２）の判定を行う、［８］〜［１０］のいずれか一項に記載のリスク予測方法。
［１２］検体が、前立腺癌生検組織若しくは細胞、血清、血漿又は尿である、［７］〜［１１］のいずれか一項に記載のリスク予測方法。
［１３］以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、被検物質の去勢抵抗性前立腺癌に対する有効性を評価する方法：
（ｉ）去勢抵抗性前立腺癌細胞、又はアンドロゲンレセプターバリアントAR-V7を強制発現させた細胞に被験物質を接触させるステップ；
（ｉｉ）前記細胞におけるhsa-miR-8080の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の去勢抵抗性前立腺癌に対する有効性を判定するステップであって、hsa-miR-8080の発現上昇が被検物質の有効性の指標となるステップ。
As described above, after intensive investigation, useful findings were brought about in establishing a new therapeutic strategy for CRPC. Here, the success in identifying a molecule involved in CRPC cell proliferation and treatment resistance, that is, a microRNA important for the regulation of AR-V7 expression, is important from another viewpoint. That is, the microRNA is an indicator (biomarker) of the onset / progression (progression) of CRPC, and it can be used to evaluate the onset risk or the exacerbation risk of CRPC. Moreover, since the said microRNA represents the state of CRPC cell, the expression fluctuation becomes an index for drug efficacy evaluation. Therefore, an assay system for screening CRPC therapeutic drug candidates can be constructed using the microRNA as a biomarker.
The following invention is based on the above results and considerations.
[1] A castration resistant prostate cancer therapeutic drug comprising the following (a) or (b):
(A) RNA comprising a sequence showing 80% or more complementarity to the nucleotide sequence UUGACACCAGUUUCUUUC (SEQ ID NO: 1) present in the 3 'untranslated region of the androgen receptor variant AR-V7;
(B) a compound which induces the expression of the RNA of (a).
[2] The therapeutic agent according to [1], wherein the RNA is a microRNA comprising the nucleotide sequence GAAGGACACUGGUGUCAA (SEQ ID NO: 2).
[3] The therapeutic agent according to [2], wherein the microRNA is hsa-miR-8080 or a fragment thereof containing the nucleotide sequence GAAGGACACUGGUGUCAA (SEQ ID NO: 2).
[4] The therapeutic agent according to [1], wherein the compound is luteolin, apigenin or quercetin.
[5] The therapeutic agent according to any one of [1] to [4], which exerts a therapeutic effect by suppressing the growth of castration resistant prostate cancer cells.
[6] The therapeutic agent according to any one of [1] to [5], which is used in combination with an androgen receptor antagonist and / or an androgen synthesis inhibitor.
[7] A method of predicting the risk of developing or exacerbating castration-resistant prostate cancer, which is characterized by using the level of hsa-miR-8080 in a sample derived from prostate cancer patients.
[8] The risk prediction method according to [7], including the following steps (1) and (2):
(1) detecting hsa-miR-8080 in a sample collected from prostate cancer patients;
(2) A step of determining the risk of onset or exacerbation of castration-resistant prostate cancer based on the detected value, wherein low expression of hsa-miR-8080 indicates high risk.
[9] The risk prediction method according to [8], wherein the prostate cancer patient does not develop castration resistant prostate cancer, and the risk of developing castration resistant prostate cancer is determined in step (2).
[10] The risk prediction method according to [8], wherein the prostate cancer patient is a castration resistant prostate cancer patient, and the risk of exacerbation of castration resistant prostate cancer is determined in step (2).
[11] The determination in step (2) is performed based on comparison between the detected value obtained in step (1) and the detected value in a sample collected in the past from the same prostate cancer patient, [8] The risk prediction method as described in any one of 10].
[12] The risk prediction method according to any one of [7] to [11], wherein the sample is prostate cancer biopsy tissue or cells, serum, plasma or urine.
[13] A method for evaluating the efficacy of a test substance against castration-resistant prostate cancer, comprising the following steps (i) and (ii):
(I) contacting a test substance with castration resistant prostate cancer cells or cells in which the androgen receptor variant AR-V7 is forcibly expressed;
(Ii) detecting the expression of hsa-miR-8080 in the cells and determining the effectiveness of the test substance against castration-resistant prostate cancer based on the detection result, wherein the expression of hsa-miR-8080 is elevated A step that is an indicator of the effectiveness of the test substance.
１．去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）の治療薬
本発明の第１の局面は、去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）の治療薬及びその用途に関する。「治療薬」とは、標的の疾病ないし病態（即ちCRPC）に対する治療的又は予防的効果を示す医薬のことをいう。治療的効果には、標的疾患／病態に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。後者については、重症化を予防するという点において予防的効果の一つと捉えることができる。このように、治療的効果と予防的効果は一部において重複する概念であり、明確に区別して捉えることは困難であり、またそうすることの実益は少ない。尚、予防的効果の典型的なものは、標的疾患／病態に特徴的な症状の再発を阻止ないし遅延することである。標的疾患／病態に対して何らかの治療的効果又は予防的効果、或いはこの両者を示す限り、標的疾患／病態に対する治療薬に該当する。
1. Therapeutic Agent for Castration-Resistant Prostate Cancer (CRPC) The first aspect of the present invention relates to a therapeutic agent for castration-resistant prostate cancer (CRPC) and its use. "Therapeutic agent" refers to a drug that exhibits a therapeutic or prophylactic effect on a target disease or condition (ie, CRPC). Therapeutic effects include alleviation of symptoms or concomitant symptoms characteristic of the target disease / pathology (reduction of symptoms), prevention or delay of deterioration of symptoms, and the like. The latter can be regarded as one of the preventive effects in terms of preventing the aggravation. Thus, therapeutic effects and preventive effects are partially overlapping concepts, so it is difficult to distinguish them clearly, and there are few benefits to doing so. A typical preventive effect is to prevent or delay the recurrence of symptoms characteristic of the target disease / pathology. As long as it exhibits some therapeutic effect or preventive effect or both for the target disease / pathology, it is a therapeutic agent for the target disease / pathology.
去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）とは、去勢状態（例えば薬物による去勢や外科的去勢）にも関わらず、病状が進行している前立腺癌である。前立腺癌の治療には抗アンドロゲン療法が有効とされているが、抗アンドロゲン療法に抵抗性を示すようになると（即ちCRPCに進行すると）、有効な治療法がなく予後不良である。本発明の医薬は、このような治療困難な疾患に対する新規且つ有効な治療戦略を提供するものであり、その臨床的意義は大きい。 Castration resistant prostate cancer (CRPC) is prostate cancer whose disease state is progressing despite castration status (eg, drug castration or surgical castration). Antiandrogen therapy is considered effective for the treatment of prostate cancer, but when it becomes resistant to antiandrogen therapy (ie, progresses to CRPC), there is no effective treatment and the prognosis is poor. The medicament of the present invention provides a novel and effective therapeutic strategy for such difficult-to-treat diseases, and its clinical significance is great.
本発明は、(i)ルテオリンが従来の薬剤とは異なる、複数の作用によってCRPCに薬効を示すという知見、(ii)ルテオリンによって発現が誘導され、AR-V7の翻訳を抑制するマイクロRNA（即ち、CRPCに対する核酸医薬として有望なマイクロRNA）を特定したという成果、(iii)ルテオリンの構造類似体にも同様の作用効果を認めたという事実、に基づく。 The present invention is based on the findings that (i) luteolin exerts a beneficial effect on CRPC by multiple actions different from conventional drugs, and (ii) expression is induced by luteolin, which is a microRNA that suppresses the translation of AR-V7 (ie, Based on the result of having identified a promising microRNA as a nucleic acid drug for CRPC, and (iii) the fact that a similar structural effect of luteolin was also recognized.
本発明の治療薬は以下の（ａ）又は（ｂ）を有効成分として含有する。
（ａ）アンドロゲンレセプターバリアントAR-V7の3’UTRに存在する塩基配列（UUGACACCAGUUUCUUUC：配列番号１）に対して80％以上の相補性を示す配列を含むRNA
（ｂ）（ａ）のRNAの発現を誘導する化合物
The therapeutic agent of the present invention contains the following (a) or (b) as an active ingredient.
(A) RNA containing a sequence showing 80% or more complementarity to the nucleotide sequence (UUGACACCAGUUUCUUUC: SEQ ID NO: 1) present in the 3'UTR of the androgen receptor variant AR-V7
(B) a compound which induces the expression of the RNA of (a)
（ａ）のRNAを有効成分とした場合、当該RNAによってAR-V7の翻訳が抑制され、所望の薬効が発揮される。（ｂ）の化合物を有効成分とした場合には、（ａ）のRNAの発現誘導を介して、同様の薬効が発揮される。このような薬効によって、CRPC細胞の増殖を抑制することができる。 When the RNA of (a) is used as an active ingredient, translation of AR-V7 is suppressed by the RNA, and a desired medicinal effect is exerted. When the compound (b) is used as an active ingredient, the same medicinal effect is exerted via induction of the expression of RNA (a). Such medicinal effects can suppress the growth of CRPC cells.
（ａ）のRNA（以下、「本発明のRNA」と呼ぶ）はその特有の作用を示すために、AR-V7の3’UTRに存在する塩基配列（UUGACACCAGUUUCUUUC：配列番号１）に対して80％以上の相補性を示す配列を含む。従って、塩基配列（配列番号１）に対して80%以上の相補性を示す部分（説明の便宜上、「相補的配列」配列と呼ぶ）が含まれている限りにおいて、（ａ）のRNAに該当する。塩基配列（配列番号１）と相補的配列の間の相補性は以下の通り計算することができる。尚、AR-V7遺伝子の全長配列を配列番号１０（GenBank Accession No. FJ235916.1, DEFINITION: Homo sapiens androgen receptor splice variant 3 (AR) mRNA, complete cds, alternatively spliced.）に示す。
（相補的である位置の数）／（配列の長さ（即ち18））×１００ （％）
The RNA of (a) (hereinafter referred to as “the RNA of the present invention”) is 80 relative to the nucleotide sequence (UUGACACCAGUUUUCUUC: SEQ ID NO: 1) present in the 3 ′ UTR of AR-V7 in order to show its unique action. Contain sequences showing% or more complementarity. Therefore, as long as it contains a portion showing 80% or more complementarity to the base sequence (SEQ ID NO: 1) (for convenience of explanation, referred to as “complementary sequence” sequence), it corresponds to the RNA of (a) Do. The complementarity between the base sequence (SEQ ID NO: 1) and the complementary sequence can be calculated as follows. The full-length sequence of the AR-V7 gene is shown in SEQ ID NO: 10 (GenBank Accession No. FJ235916.1, DEFINITION: Homo sapiens androgen receptor splice variant 3 (AR) mRNA, complete cds, alternatively spliced.).
(Number of positions which are complementary) / (length of sequence (ie 18)) × 100 (%)
相補的配列を含み、且つ所望の効果（即ちCRPCに対する治療的又は予防的効果）を発揮し得る限りにおいて、本発明のRNAの長さ特に限定されない。但し、本発明のRNAの長さは、例えば19〜28、好ましくは21〜25である。 The length of the RNA of the present invention is not particularly limited as long as it contains complementary sequences and can exert the desired effect (ie, therapeutic or prophylactic effect on CRPC). However, the length of the RNA of the present invention is, for example, 19 to 28, preferably 21 to 25.
好ましくは、本発明のRNAは、上記塩基配列（配列番号１）に対して高い相補性を示す塩基配列（GAAGGACACUGGUGUCAA：配列番号２）を含む、全長が21〜25のマイクロRNAである。当該マイクロRNAに該当するものの一例はhsa-miR-8080であるが、hsa-miR-8080の断片（但し、塩基配列（GAAGGACACUGGUGUCAA：配列番号２）を含む）を用いることにしてもよい。尚、hsa-miR-8080の配列を配列番号３に示す。 Preferably, the RNA of the present invention is a full-length 21-25 microRNA comprising a base sequence (GAAGGACACUGGGUGUCAA: SEQ ID NO: 2) exhibiting high complementarity to the above base sequence (SEQ ID NO: 1). One example corresponding to the microRNA is hsa-miR-8080, but a fragment of hsa-miR-8080 (with the base sequence (GAAGGACACUGGUGUCAA: SEQ ID NO: 2) may be used). The sequence of hsa-miR-8080 is shown in SEQ ID NO: 3.
本発明のRNAに代えて、生体内で本発明のRNAを生成するように設計された核酸（Pre-miRNA、Pri-miRNA等）を用いることにしてもよい。 Instead of the RNA of the present invention, a nucleic acid (Pre-miRNA, Pri-miRNA, etc.) designed to produce the RNA of the present invention in vivo may be used.
（ｂ）の化合物、即ち、本発明のRNAの発現を誘導する化合物の例はルテオリン、アピゲニン又はケルセチンである。これらの化合物は共通する骨格を有する（図１２を参照）。この中でも、最も強い活性が認められたルテオリンは特に好ましい化合物である。（ｂ）の化合物として、ルテオリン、アピゲニン又はケルセチンを採用すると、上記の作用効果（即ち、本発明のRNAの発現誘導を介してAR-V7の翻訳を抑制する）に加え、それ自体によるAR-V7の転写抑制及びAR-V7タンパク質の分解促進が生ずる。即ち、複合的な作用効果が発揮されることになる。 Examples of compounds of (b), ie compounds which induce the expression of the RNA of the invention are luteolin, apigenin or quercetin. These compounds have a common backbone (see Figure 12). Among these, luteolin having the strongest activity is a particularly preferred compound. When luteolin, apigenin or quercetin is employed as the compound (b), in addition to the above-mentioned effects (that is, suppression of translation of AR-V7 via induction of the expression of the RNA of the present invention) Transcriptional repression of V7 and accelerated degradation of AR-V7 protein occur. That is, a combined effect is exhibited.
本発明の治療薬の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、緩衝剤、賦形剤、崩壊剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水、担体など）を含有させることができる。緩衝剤としてはリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などを用いることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。 Formulation of the therapeutic agent of the present invention can be carried out according to a conventional method. When formulated, other pharmaceutically acceptable ingredients (eg, buffer, excipient, disintegrant, emulsifying agent, suspending agent, soothing agent, stabilizer, preservative, preservative, physiological saline) , Carriers, etc.). As a buffer, phosphate buffer, citrate buffer and the like can be used. As the excipient, lactose, starch, sorbitol, D-mannitol, sucrose or the like can be used. As the disintegrant, starch, carboxymethylcellulose, calcium carbonate and the like can be used. As a buffer, phosphate, citrate, acetate and the like can be used. As an emulsifier, gum arabic, sodium alginate, tragacanth etc. can be used. As a suspending agent, glycerin monostearate, aluminum monostearate, methylcellulose, carboxymethylcellulose, hydroxymethylcellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used. As a soothing agent, benzyl alcohol, chlorobutanol, sorbitol or the like can be used. As a stabilizer, propylene glycol, ascorbic acid and the like can be used. As preservatives, phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methyl paraben and the like can be used. As the preservative, benzalkonium chloride, p-hydroxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
製剤化する場合の剤型も特に限定されない。剤型の例は注射剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤及びシロップ剤である。 The dosage form for formulation is also not particularly limited. Examples of dosage forms are injections, tablets, powders, fine granules, granules, capsules and syrups.
本発明のRNAを有効成分とした場合には、当該RNAを単独で、或いは適当なベクター（例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター）に当該RNA又はその前駆体を発現するコンストラクトを組み込んだ後、製剤化することができる。標的化（DDS）、効果の維持、細胞内への取り込み効率等の改善・向上を目的として、リポソーム、高分子材料、アテロコラーゲン等の担体とともに製剤化することにしてもよい。 When the RNA of the present invention is used as an active ingredient, the RNA alone or in a suitable vector (eg, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, retrovirus vector, lentivirus vector) or the precursor thereof is used. After incorporation of the expressing construct, it can be formulated. It may be formulated with a carrier such as liposome, polymer material, atelocollagen and the like for the purpose of improvement (improvement) of targeting (DDS), maintenance of effect, uptake efficiency into cells, etc.
本発明の治療薬はその剤型に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜など）によって対象に適用される。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、経口投与と同時に又は所定時間経過後に静脈注射等を行う等）。ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好ましい一態様では、本発明の治療薬はヒトに対して適用される。 The therapeutic agent of the present invention can be administered to a subject by oral administration or parenteral administration (intravenous, intraarterial, subcutaneous, intradermal, intramuscular or intraperitoneal injection, percutaneous, transnasal, transmucosal etc.) according to the dosage form. Applied. These administration routes are not mutually exclusive, and two or more optionally selected can be used in combination (for example, intravenous injection or the like simultaneously with oral administration or after a predetermined time has elapsed). The “subject” here is not particularly limited, and includes humans and non-human mammals (including pet animals, livestock, and experimental animals. Specifically, for example, mice, rats, guinea pigs, hamsters, monkeys, cattle, pigs, goats Sheep, dogs, cats, chickens, quail etc.). In a preferred aspect, the therapeutic agent of the present invention is applied to humans.
本発明の治療薬の投与量は、期待される治療効果が得られるように設定される。治療上有効な投与量の設定においては一般に患者の症状、年齢、性別、及び体重などが考慮される。尚、当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。投与スケジュールとしては例えば１日１回〜数回、２日に１回、或いは３日に１回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の症状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。 The dose of the therapeutic agent of the present invention is set so as to obtain the expected therapeutic effect. In setting a therapeutically effective dose, the patient's condition, age, sex, and weight etc. are generally considered. Those skilled in the art can set appropriate dosages in consideration of these matters. As a dosing schedule, for example, once to several times a day, once every two days, or once every three days can be adopted. In preparation of the administration schedule, the patient's symptoms and the duration of the effect of the active ingredient can be taken into consideration.
本発明の治療薬を他の治療薬と併用することにしてよい。「併用」とは、同一の患者に対して本発明の治療薬と他の治療薬が投与されることを意味する。両者の投与のタイミング／時期は特に限定されず、即ち、いずれを先に投与してもよい。また、片方の治療薬による治療開始後のある時点において他方の治療薬による治療を開始したり、片方の治療薬による治療と他方の治療薬による治療を同時に開始したり、片方の治療薬による治療を一旦終了した段階で他方の治療薬による治療を開始するなど、様々な併用態様を採用し得る。 The therapeutic agents of the invention may be used in combination with other therapeutic agents. By "in combination" is meant that the therapeutic agent of the present invention and another therapeutic agent are administered to the same patient. The timing / timing of administration of both is not particularly limited, that is, either may be administered first. In addition, treatment with one therapeutic agent can be started at a time after initiation of treatment with one therapeutic agent, treatment with one therapeutic agent and treatment with the other therapeutic agent can be started simultaneously, or treatment with one therapeutic agent Once the treatment is finished, various combinations may be employed, such as starting treatment with the other therapeutic agent.
他の治療薬の例として、アンドロゲンレセプター拮抗薬、アンドロゲン合成阻害薬、抗癌剤（化学療法剤）を挙げることができる。アンドロゲンレセプター拮抗薬はアンドロゲンレセプターへのアンドロゲンの結合を競合的に阻害し、その治療効果を発揮する。アンドロゲン合成阻害薬はアンドロゲンの合成に関与する酵素を阻害することでその治療効果を発揮する。また、抗癌剤（化学療法剤）は核酸合成の阻害や細胞***の阻害などによってその治療効果を発揮する。このように、これらの治療薬は本発明の治療薬とは異なる作用機序に基づき薬効を示す。従って、本発明の治療薬をこれらの薬剤（いずれか又は両方）と併用した場合には、相加的又は相乗的な効果によって、治療効果の増大や予後の改善などを期待できる。尚、アンドロゲンレセプター拮抗薬の具体例はエンザルタミドであり、アンドロゲン合成阻害薬の具体例はアビラテロンであり、抗癌剤（化学療法剤）の具体例はドセタキセル、カバジタキセルである。 Examples of other therapeutic agents include androgen receptor antagonists, inhibitors of androgen synthesis, and anticancer agents (chemotherapeutic agents). Androgen receptor antagonists competitively inhibit androgen binding to androgen receptor and exert its therapeutic effect. Androgen synthesis inhibitors exert their therapeutic effects by inhibiting enzymes involved in androgen synthesis. In addition, anticancer agents (chemotherapeutic agents) exert their therapeutic effects by inhibition of nucleic acid synthesis, inhibition of cell division, and the like. Thus, these therapeutic agents exhibit efficacy based on a mechanism of action different from that of the therapeutic agent of the present invention. Therefore, when the therapeutic agent of the present invention is used in combination with these agents (either or both), the additive effect or the synergistic effect can be expected to increase the therapeutic effect, improve the prognosis, and the like. A specific example of an androgen receptor antagonist is enzalutamide, a specific example of an androgen synthesis inhibitor is abiraterone, and a specific example of an anticancer agent (a chemotherapeutic agent) is docetaxel and cabazitaxel.
以上の記述から明らかな通り、本出願は、CRPCの患者に対して上記（ａ）のRNA又はその発現を誘導する化合物を治療上有効量投与することを特徴とする、CRPCの治療方法も提供する。 As apparent from the above description, the present application also provides a method for treating CRPC, which comprises administering a therapeutically effective amount of the RNA of (a) above or a compound that induces the expression thereof to a patient with CRPC. Do.
２．去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）の発症・増悪リスクの予測
本発明の第２の局面は、去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）の発症又は増悪のリスクの予測に関する。後述の実施例に示す通り、本発明者らの検討によって、hsa-miR-8080がAR-V7の翻訳を抑制し、CRPC細胞の増殖抑制や治療抵抗性改善をもたらすことが判明した。この知見に基づき、本発明は、hsa-miR-8080をバイオマーカーとして用いた、CRPCの発症又は増悪のリスクを予測する方法（以下、「本発明のリスク予測方法」）を提供する。本発明のリスク予測方法によれば、CRPCの発症リスク又は増悪リスクを簡便且つ客観的に判定することが可能となる。尚、「バイオマーカー」とは、疾患の存在や状態等の指標となる生体分子のことをいう。「生体分子」は生体中に見出される分子（化合物）であるが、生体分子であるバイオマーカーの利用に際しては、生体から分離された試料／検体中の生体分子が用いられることになる。
2. 2. Prediction of the Onset / Exacerbation Risk of Castration-Resistant Prostate Cancer (CRPC) The second aspect of the present invention relates to the prediction of the risk of development or progression of castration-resistant prostate cancer (CRPC). As shown in the examples below, according to the study of the present inventors, it was found that hsa-miR-8080 suppresses the translation of AR-V7, resulting in the suppression of CRPC cell proliferation and the improvement of treatment resistance. Based on this finding, the present invention provides a method for predicting the risk of onset or exacerbation of CRPC (henceforth, the "risk prediction method of the present invention") using hsa-miR-8080 as a biomarker. According to the risk prediction method of the present invention, it is possible to simply and objectively determine the onset risk or the exacerbation risk of CRPC. In addition, a "biomarker" means the biomolecule used as the parameter | index, such as presence and a state of disease. A "biomolecule" is a molecule (compound) found in a living body, but when using a biomarker that is a biomolecule, a biomolecule in a sample / specimen separated from a living body will be used.
本発明のリスク予測方法では、前立腺癌患者由来の検体中におけるhsa-miR-8080のレベルが指標として用いられる。ここでの「レベル」は、典型的には「量」ないし「濃度」を意味する。但し、慣例及び技術常識に従い、検出対象であるhsa-miR-8080を検出できるか否か（即ち見かけ上の存在の有無）を表す場合にも用語「レベル」が用いられる。 In the risk prediction method of the present invention, the level of hsa-miR-8080 in a specimen derived from a prostate cancer patient is used as an index. The term "level" as used herein typically means "amount" to "concentration". However, the term "level" is also used to indicate whether or not hsa-miR-8080 to be detected can be detected (that is, the presence or absence of an apparent presence) according to common practice and technical common sense.
典型的には、本発明のリスク予測方法では、以下のステップ（１）及び（２）を行う。
（１）前立腺癌患者から採取された検体中のhsa-miR-8080を検出するステップ
（２）検出値に基づき、CRPCの発症又は増悪のリスクを判定するステップであって、hsa-miR-8080の低発現がリスクの高いことを示すステップ
Typically, in the risk prediction method of the present invention, the following steps (1) and (2) are performed.
(1) detecting hsa-miR-8080 in a sample collected from a patient with prostate cancer (2) determining the risk of onset or exacerbation of CRPC based on the detected value, which is hsa-miR-8080 Show that low expression of is high risk
ステップ（１）では、前立腺癌患者から採取された検体中のhsa-miR-8080を検出する。検体は、本発明の実施に先立って採取しておく。検体としては前立腺癌生検試料（組織、細胞）、血液（血清、血漿）、尿等が用いられる。被検者である前立腺癌患者の病状／病態は特に限定されない。CRPCを発症していない患者を被検者とした場合は、CRPCの発症リスクの予測に本発明を利用することができる。他方、CRPCを発症している患者（即ちCRPCの患者）を被検者とすれば、CRPCの増悪リスクの予測に本発明を利用することができる。本発明のリスク予測方法によれば、バイオマーカーであるhsa-miR-8080のレベルという客観的な指標に基づいてCRPCの発症リスク又は増悪リスク（以下、これら二つをまとめて「CRPCリスク」と呼称する）を判定できる。判定結果は、前立腺癌の診断に有用な情報となり、より適切な治療方針の決定（効果的な治療法の選択など）に役立つ。従って、本発明は、治療効果の向上や患者のQOL（Quality of Life、生活の質）の向上に貢献する。 In step (1), hsa-miR-8080 is detected in a sample collected from prostate cancer patients. Samples are collected prior to the practice of the present invention. As a sample, a prostate cancer biopsy sample (tissue, cells), blood (serum, plasma), urine or the like is used. There are no particular limitations on the medical condition / pathology of the prostate cancer patient who is the subject. When a patient who does not develop CRPC is a subject, the present invention can be used to predict the risk of developing CRPC. On the other hand, if a patient who develops CRPC (ie, a patient with CRPC) is a subject, the present invention can be used to predict the risk of developing CRPC. According to the risk prediction method of the present invention, the risk of developing or exacerbating CRPC based on an objective indicator of the level of the biomarker hsa-miR-8080 (hereinafter, these two are collectively referred to as “CRPC risk” Can be determined. The determination result is useful information for diagnosis of prostate cancer, and helps to determine a more appropriate treatment strategy (such as selection of an effective treatment). Therefore, the present invention contributes to the improvement of the therapeutic effect and the improvement of the quality of life (QOL) of the patient.
このステップでは、検体中のhsa-miR-8080を検出するが、hsa-miR-8080のレベルを厳密に定量することは必須でない。即ち、後続のステップ（２）においてCRPCリスクが判定可能となる程度にhsa-miR-8080のレベルを検出すればよい。例えば、検体中のhsa-miR-8080のレベルが所定の基準値を超えるか否かが判別可能なように検出を行うこともできる。 In this step, hsa-miR-8080 is detected in the sample, but it is not essential to quantify the level of hsa-miR-8080 exactly. That is, the level of hsa-miR-8080 may be detected to such an extent that the CRPC risk can be determined in the subsequent step (2). For example, detection can be performed such that it can be determined whether the level of hsa-miR-8080 in a sample exceeds a predetermined reference value.
hsa-miR-8080の検出方法は特に限定されない。例えば、RT-PCR等、核酸増幅反応を利用した方法によって検出可能である。核酸増幅反応としては、PCR（Polymerase chain reaction）法若しくはその変法の他、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法（Tsugunori Notomi et al. Nucleic Acids Research, Vol.28, No.12, e63, 2000; Kentaro Nagamine, Keiko Watanabe et al. Clinical Chemistry, Vol.47, No.9, 1742-1743, 2001）、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法（特許第３４３３９２９号、特許第３８８３４７６号）、NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)法、LCR(Ligase Chain Reaction)法、3SR（Self-sustained Sequence Replication）法、SDA（Standard Displacement Amplification）法、TMA（Transcription Mediated Amplification）法、RCA（Rolling Circle Amplification）等を採用することができる。 The detection method of hsa-miR-8080 is not particularly limited. For example, it can be detected by a method using a nucleic acid amplification reaction such as RT-PCR. As the nucleic acid amplification reaction, in addition to PCR (Polymerase chain reaction) method or its modification, LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method (Tsugunori Notomi et al. Nucleic Acids Research, Vol. 28, No. 12, e63, 2000 Kentaro Nagamine, Keiko Watanabe et al. Clinical Chemistry, Vol. 47, No. 9, 1742-1743 (2001), ICAN (Isothermal and Chimeric primer-Initiated Amplification of Nucleic acids) method (Patent No. 3433929, Patent No. 3883476) No., NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) method, LCR (Ligase Chain Reaction) method, 3SR (Self-sustained Sequence Replication) method, SDA (Standard Displacement Amplification) method, TMA (Transcriptionion Mediated Amplification) method, RCA (RCA) Rolling Circle Amplification) etc. can be adopted.
ステップ（１）に続くステップ（２）では、検出結果に基づいてCRPCリスクを判定する。通常は、ステップ（１）で得られた検出値をコントロール（対照検体）の検出値と比較しつつ、或いは、コントロールの検出値等に基づき設定された基準値に照らして判定を行う。コントロールには、例えば、CRPCを発症していない前立腺癌患者のhsa-miR-8080レベル（陰性コントロール）、健常者のhsa-miR-8080レベル（陰性コントロール）、CRPCを発症した前立腺癌患者のhsa-miR-8080レベル（陽性コンコロール）を用いることができる。好ましくは、複数名（好ましくは50名以上、更に好ましくは100名以上）のコントロール対象者から取得した検出値に基づき、基準値を設定する。 In step (2) following step (1), the CRPC risk is determined based on the detection result. In general, the determination is performed while comparing the detection value obtained in step (1) with the detection value of a control (control sample) or in light of a reference value set based on the detection value of the control or the like. Controls include, for example, hsa-miR-8080 levels in prostate cancer patients not developing CRPC (negative control), hsa-miR-8080 levels in healthy individuals (negative control), hsa in prostate cancer patients who developed CRPC -miR-8080 levels (positive concorol) can be used. Preferably, the reference value is set based on detection values obtained from a plurality of (preferably 50 or more, more preferably 100 or more) control subjects.
CRPCリスクの判定は定性的、定量的のいずれであってもよい。尚、ここでの判定は、その判定基準から明らかな通り、医師や検査技師など専門知識を有する者の判断によらずとも自動的／機械的に行うことができる。 The determination of CRPC risk may be either qualitative or quantitative. In addition, the determination here can be performed automatically / mechanically, without being based on judgment of those who have expert knowledge, such as a doctor and a laboratory technician, as it is clear from the determination criteria.
本発明では、「hsa-miR-8080の低発現がリスクの高いことを示す」との判定基準を採用する。換言すれば、hsa-miR-8080のレベル（測定値）が低いとリスクが高いと判定され、hsa-miR-8080のレベル（測定値）が高いとリスクが低いと判定される。より詳細には、例えば、被検者の病状／病態に応じて以下の様に判定することができる。 In the present invention, the criterion "low expression of hsa-miR-8080 indicates high risk" is employed. In other words, when the level of hsa-miR-8080 (measured value) is low, it is determined that the risk is high, and when the level of hsa-miR-8080 (measured value) is high, it is determined that the risk is low. More specifically, for example, it can be determined as follows according to the condition / pathology of the subject.
＜CRPCを発症していない被検者の場合＞
（判定例１）
陰性コントロールの検出値と陽性コントールの検出値に基づき設定した基準値よりもhsa-miR-8080の検出値（検体中レベル）が低いときに「CRPCを発症する」又は「CRPCを発症する可能性が高い」と判定し、基準値よりもhsa-miR-8080の検出値（検体中レベル）が高いときに「CRPCを発症しない」又は「CRPCを発症する可能性が低い」と判定する。
（判定例２）
発症リスクを分ける複数の基準値を設定し、以下の通り判定する。この例では、４つの基準値（ａ＜ｂ＜ｃ＜ｄ）を設定することにしているが、基準値の数及びそれに伴うリスクのレベルの数はこれに限られるものではない。
hsa-miR-8080の検出値＜ａの場合： 発症する可能性８０％以上
ａ≦hsa-miR-8080の検出値＜ｂの場合： 発症する可能性６０％〜７０％
ｂ≦hsa-miR-8080の検出値＜ｃの場合： 発症する可能性４０％〜５０％
ｃ≦hsa-miR-8080の検出値＜ｄの場合： 発症する可能性２０％〜３０％
ｄ≦hsa-miR-8080の検出値の場合： 発症する可能性１０％以下
<In the case of a subject who has not developed CRPC>
(Example 1 of judgment)
Possibility of developing "CRPC" or "CRPC" when the detection value (level in sample) of hsa-miR-8080 is lower than the reference value set based on the detection value of negative control and the detection value of positive control Is high, and when the detection value (level in the sample) of hsa-miR-8080 is higher than the reference value, it is determined that “does not develop CRPC” or “less likely to develop CRPC”.
(Example 2 of judgment)
Set a plurality of reference values to separate the onset risk, and determine as follows. In this example, four reference values (a <b <c <d) are set, but the number of reference values and the number of levels of risk associated therewith are not limited thereto.
Detection value of hsa-miR-8080 <a: Probability of
b ≦ hsa-miR-8080 detection value <c: possibility of
c ≦ hsa-miR-8080 detection value <d: Probability of
In the case of the detection value of d ≦ hsa-miR-8080: 10% or less possibility of onset
＜CRPCを発症した被検者の場合＞
（判定例１）
陽性コントールの検出値に基づき設定した基準値（CRPC患者の標準的なレベル）よりもhsa-miR-8080の検出値（検体中レベル）が低いときに「増悪する」又は「増悪する可能性が高い」と判定し、基準値よりもhsa-miR-8080の検出値（検体中レベル）が高いときに「増悪しない」又は「増悪する可能性が低い」と判定する。
（判定例２）
増悪リスクを分ける複数の基準値を設定し、以下の通り判定する。この例では、４つの基準値（ａ＜ｂ＜ｃ＜ｄ）を設定することにしているが、基準値の数及びそれに伴うリスクのレベルの数はこれに限られるものではない。
hsa-miR-8080の検出値＜ａの場合： 増悪する可能性８０％以上
ａ≦hsa-miR-8080の検出値＜ｂの場合： 増悪する可能性６０％〜７０％
ｂ≦hsa-miR-8080の検出値＜ｃの場合： 増悪する可能性４０％〜５０％
ｃ≦hsa-miR-8080の検出値＜ｄの場合： 増悪する可能性２０％〜３０％
ｄ≦hsa-miR-8080の検出値の場合： 増悪する可能性１０％以下
<In the case of a subject who developed CRPC>
(Example 1 of judgment)
May be 'exacerbated' or 'exacerbated when the hsa-miR-8080's detection value (in-sample level) is lower than the reference value (standard level for CRPC patients) set based on the positive control's detection value It is judged as “high”, and when the detection value (level in sample) of hsa-miR-8080 is higher than the reference value, it is judged as “does not aggravate” or “less likely to aggravate”.
(Example 2 of judgment)
Set a plurality of reference values to separate the exacerbation risk, and determine as follows. In this example, four reference values (a <b <c <d) are set, but the number of reference values and the number of levels of risk associated therewith are not limited thereto.
Detection value of hsa-miR-8080 <a: possibility of
b ≦ hsa-miR-8080 detection value <c: possibility of
c ≦ hsa-miR-8080 detection value <d: possibility of
In the case of the detection value of d ≦ hsa-miR-8080: 10% or less possibility of worsening
本発明の一態様では、同一の被検者について、現在の検出値と、過去のある時点での検出値とを比較し、検出値の変動、即ち、hsa-miR-8080のレベルの増減の有無及び／又は増減の程度を調べる。その結果得られる、hsa-miR-8080レベルの変動に関するデータは、CRPCリスクをモニターするため、治療効果を把握するため、或いは予後推定に有用な情報となる。具体的には例えば、hsa-miR-8080レベルの変動を根拠として、前回の検査から今回の検査までの間に発症リスクが高くなった又は低くなった或いは変化がないとの判定を行うことができる。このような評価を前立腺癌の治療と並行して行えば、治療効果の確認が行えることはもとより、CRPCへの進行の兆候を事前に把握することができる。これによって、より適切な治療方針の決定が可能となる。このように本発明は、治療効果の最大化及び患者のQOL向上に多大な貢献をし得る。 In one aspect of the present invention, for the same subject, the current detection value is compared with the detection value at a certain point in the past, and the fluctuation of the detection value, that is, the increase or decrease of the level of hsa-miR-8080 Investigate the presence or absence and / or the degree of increase or decrease. The resulting data on fluctuations in hsa-miR-8080 levels provide useful information for monitoring CRPC risk, for understanding treatment effects, or for prognostication. Specifically, for example, based on the fluctuation of the hsa-miR-8080 level, it may be judged that the onset risk has become high, low or no change from the previous examination to the current examination. it can. If such an evaluation is performed in parallel with the treatment of prostate cancer, it is possible not only to confirm the treatment effect but also to grasp in advance the signs of progression to CRPC. This makes it possible to determine a more appropriate course of treatment. Thus, the present invention can greatly contribute to the maximization of the therapeutic effect and the improvement of the patient's QOL.
以上の説明から明らかなように、ステップ（２）における判定結果は、今後の治療方針を検討する上で有用な情報を提供する。そこで本発明の一態様では、判定結果に基づき、被検者である前立腺癌患者の治療方針を決定又は変更するステップ（ステップ（３））を行う。治療方針は、判定結果（CRPCリスク）に応じて設計ないし選択される。例えば、CRPCを発症するリスクが低いと予測された前立腺癌患者には、前立腺癌に対する標準的な治療方針を推奨することができる。一方、CRPCを発症するリスクが高いと予測された前立腺癌患者には、CRPCの発症を前提とした治療（例えばアンドロゲン受容体拮抗薬、アンドロゲン合成阻害薬等の早期の使用）が推奨される。併せて、高頻度且つ定期的な受診、経過観察が望まれる。 As apparent from the above description, the determination result in step (2) provides information useful for considering the future treatment plan. Therefore, in one aspect of the present invention, a step (step (3)) of determining or changing the treatment plan of a subject who is a prostate cancer patient is performed based on the determination result. The treatment plan is designed or selected according to the determination result (CRPC risk). For example, for prostate cancer patients predicted to have a low risk of developing CRPC, a standard treatment regimen for prostate cancer can be recommended. On the other hand, for prostate cancer patients predicted to have a high risk of developing CRPC, treatment based on the onset of CRPC (eg, early use of an androgen receptor antagonist, androgen synthesis inhibitor, etc.) is recommended. At the same time, frequent and regular visits and follow-up are desired.
３．去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）治療薬候補の評価（スクリーニング方法）
上記の通り、本発明者らの検討によって、hsa-miR-8080がAR-V7の翻訳を抑制し、CRPC細胞の増殖抑制や治療抵抗性改善をもたらすことが判明した。この知見は、hsa-miR-8080の発現を上昇させる物質がCRPC治療薬の候補として有望であることを示唆する。そこで本発明の第３の局面は、hsa-miR-8080の発現を指標とした、被験物質のCRPCに対する有効性を評価する方法（以下、「本発明の評価方法」と呼ぶ）を提供する。本発明の評価方法は、例えば、CRPC治療薬の候補の探索（即ちスクリーニング）に有用である。
3. Evaluation of castration resistant prostate cancer (CRPC) drug candidates (screening method)
As described above, according to the studies of the present inventors, it was found that hsa-miR-8080 suppresses the translation of AR-V7, resulting in the suppression of CRPC cell proliferation and the improvement of treatment resistance. This finding suggests that substances that elevate the expression of hsa-miR-8080 are promising candidates for CRPC therapeutics. Thus, a third aspect of the present invention provides a method for evaluating the efficacy of a test substance against CRPC (hereinafter referred to as "the evaluation method of the present invention") using hsa-miR-8080 expression as an indicator. The evaluation method of the present invention is useful, for example, for searching (i.e., screening) candidates for CRPC therapeutic agents.
本発明の評価方法では、以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を行う。
（ｉ）CRPC細胞、又はアンドロゲンレセプターバリアントAR-V7を強制発現させた細胞に被験物質を接触させるステップ
（ｉｉ）前記細胞におけるhsa-miR-8080の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質のCRPCに対する有効性を判定するステップであって、hsa-miR-8080の発現上昇が被検物質の有効性の指標となるステップ
In the evaluation method of the present invention, the following steps (i) and (ii) are performed.
(I) contacting the test substance with CRPC cells or cells in which the androgen receptor variant AR-V7 is forcibly expressed (ii) detecting the expression of hsa-miR-8080 in the cells and detecting the test substance based on the detection result For determining the efficacy of CPCR for CRPC, wherein the elevated expression of hsa-miR-8080 is an indicator of the efficacy of the test substance
本発明の評価方法は、AR-V7を発現する細胞を用いる点と、当該細胞における特定のマイクロRNA（即ち、hsa-miR-8080）の発現を指標にする点で特徴付けられる。ステップ（ｉ）ではAR-V7を発現する細胞に被験物質を接触させる。AR-V7を発現する細胞として、CRPC細胞又はAR-V7を強制発現させた細胞が用いられる。CRPC細胞としては、22Rv1、VCaP等の細胞株が好適であるが、CRPC患者から単離した細胞、それを培養した細胞（継代培養後の細胞であってもよい）を用いることにしてもよい。一方、AR-V7を強制発現させた細胞は、例えば、CHO細胞、COS7細胞、293細胞、前立腺癌細胞株（例えばDU-145、LNCaP、PC-3）等の標的（宿主細胞）にAR-V7遺伝子を導入して作製することができる。遺伝子導入は常法で行うことができ、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどを利用すればよい。 The evaluation method of the present invention is characterized in that it uses cells expressing AR-V7 and in that the expression of a specific microRNA (ie, hsa-miR-8080) in the cells is used as an index. In step (i), a test substance is brought into contact with cells expressing AR-V7. As cells expressing AR-V7, CRPC cells or cells in which AR-V7 is forcibly expressed are used. As CRPC cells, cell lines such as 22Rv1 and VCaP are preferable, but cells isolated from CRPC patients and cells obtained by culturing them (cells after passage may be used) may also be used. Good. On the other hand, cells in which AR-V7 is forcibly expressed can be AR-targeted (host cells) such as CHO cells, COS7 cells, 293 cells, prostate cancer cell lines (eg, DU-145, LNCaP, PC-3), etc. It can be produced by introducing the V7 gene. Gene transfer can be carried out by a conventional method, and for example, retrovirus vector, lentivirus vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector and the like may be used.
ステップ（ｉ）での「接触」は、典型的には、上記細胞を培養中の培養液（培地）に被検物質を添加することによって行われる。被検物質の添加のタイミングは特に限定されない。従って、被検物質を含まない培地で細胞の培養を開始した後、ある時点で被検物質を添加することにしても、予め被検物質を含む培地で細胞の培養を開始することにしてもよい。 The “contact” in step (i) is typically performed by adding a test substance to a medium (medium) in culture of the cells. The timing of the addition of the test substance is not particularly limited. Therefore, even if the test substance is added at a certain time after culture of the cells is started in the medium not containing the test substance, or the culture of the cells is started in advance in the medium containing the test substance. Good.
被検物質には様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等）を例示できる。医薬品、栄養食品、食品添加物、農薬、香粧品（化粧品）等の既存成分或いは候補成分も好ましい被検物質の一つである。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被検物質として用いてもよい。２種類以上の被検物質を同時に添加することにより、被検物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。被検物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なアッセイ系を構築することができる。 As the test substance, organic compounds or inorganic compounds of various molecular sizes can be used. Examples of organic compounds include nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphoglycerides, sphingolipids, glycosylglycerides, cerebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, polyphenols, catechins, vitamins (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E etc. Existing ingredients or candidate ingredients such as pharmaceuticals, nutritional foods, food additives, pesticides, cosmetics (cosmetics) etc. A plant extract, a cell extract, a culture supernatant, etc. may be used as a test substance, and the test substance can be obtained by simultaneously adding two or more test substances. The interaction, synergy, etc. may be examined, and the test substance may be derived from natural products or may be synthetic. It is possible to build an efficient assay systems using techniques of combinatorial synthesis.
被検物質を接触させる期間は任意に設定可能である。接触期間は例えば１０分間〜１週間、好ましくは１時間〜３日間である。接触を複数回に分けて行うことにしてもよい。 The period of time in which the test substance is in contact can be set arbitrarily. The contact period is, for example, 10 minutes to 1 week, preferably 1 hour to 3 days. The contact may be divided into multiple times.
ステップ（ｉ）に続くステップ（ｉｉ）では、被検物質を接触させた細胞におけるhsa-miR-8080の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質のCRPCに対する有効性を判定する。即ち、本発明ではhsa-miR-8080の発現を利用して被検物質の有効性が判定される。より具体的には、hsa-miR-8080の発現上昇が認められることを、被検物質の有効性の指標に用いる。従って、hsa-miR-8080の発現が上昇する場合に被検物質は有効であると判定し、hsa-miR-8080の発現が上昇しない場合（発現量に変化がない又は発現量が低下する場合）に被検物質は有効でないと判定する。hsa-miR-8080の発現を上昇させた程度（レベル）に基づき、被検物質の作用・効果の強さ（程度）を決定することにしてもよい。また、複数の被検物質を用いた場合には、hsa-miR-8080の発現を上昇させた程度に基づき、各被検物質の作用・効果の強さを比較評価することにしてもよい。尚、miR-8080の発現の検出は、上記本発明のリスク予測方法（第２の局面）の場合と同様に行えばよい。 In step (ii) following step (i), the expression of hsa-miR-8080 in the cells contacted with the test substance is detected, and the effectiveness of the test substance against CRPC is determined based on the detection result. That is, in the present invention, the expression of hsa-miR-8080 is used to determine the efficacy of the test substance. More specifically, the fact that expression of hsa-miR-8080 is elevated is used as an indicator of the efficacy of the test substance. Therefore, the test substance is judged to be effective when the expression of hsa-miR-8080 is increased, and the expression of hsa-miR-8080 is not increased (when the expression level is not changed or the expression level is decreased) ) Determine that the test substance is not valid. Based on the degree (level) of increased expression of hsa-miR-8080, the action (effect) of the test substance may be determined. When a plurality of test substances are used, the strength of the action and effect of each test substance may be compared and evaluated based on the degree to which the expression of hsa-miR-8080 is increased. The expression of miR-8080 may be detected in the same manner as in the risk prediction method (second aspect) of the present invention.
通常は、比較対照として、被検物質を接触させない細胞（その他の条件は同一とする）（以下、「コントロール細胞」と呼ぶ）を用意し、そのhsa-miR-8080の発現も検出する。そして、当該コントロール細胞の発現レベルと比較することによって、被検物質がhsa-miR-8080の発現を上昇させたか判断する（好ましくは、発現上昇の程度についても判断する）。このようにコントロールとの比較によって被検物質の作用を判定すれば、より信頼性の高い判定結果が得られる。 Usually, as a comparison control, cells not contacted with the test substance (other conditions are the same) (hereinafter referred to as "control cells") are prepared, and the expression of hsa-miR-8080 is also detected. Then, by comparing with the expression level of the control cells, it is judged whether the test substance has increased the expression of hsa-miR-8080 (preferably, the degree of the expression increase is also judged). Thus, if the action of the test substance is determined by comparison with the control, a more reliable determination result can be obtained.
上でも言及したように、本発明の評価方法は、CRPCの治療薬候補の探索、即ちスクリーニングに有用である。本発明の評価方法をスクリーニングに利用する場合には、ステップ（ｉｉ）での判定結果に基づき有効な被検物質を選抜する。選択した物質が十分な薬効を有する場合には、当該物質をそのままCRPC治療薬の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合には化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で、CRPC治療薬の有効成分として使用することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。 As mentioned above, the evaluation method of the present invention is useful for searching for, or screening for, a therapeutic drug candidate for CRPC. When the evaluation method of the present invention is used for screening, effective test substances are selected based on the determination result in step (ii). If the selected substance has sufficient efficacy, the substance can be used as it is as an active ingredient of the CRPC therapeutic agent. On the other hand, when the drug does not have sufficient efficacy, it can be used as an active ingredient of a CRPC therapeutic agent after modification such as chemical modification to enhance its efficacy. Of course, even in the case of having sufficient efficacy, similar modifications may be made for the purpose of further enhancing the efficacy.
CRPCの治療には、抗アンドロゲン療法や化学療法が用いられるが、短期間で治療耐性が生じる。CRPCに対する新規な治療戦略を見出すべく、以下の検討を行った。 Anti-androgen therapy and chemotherapy are used to treat CRPC, but treatment resistance develops in a short period of time. The following study was conducted in order to find new therapeutic strategies for CRPC.
１．ヒトCRPC細胞株22Rv1におけるAR-V7高発現とエンザルタミド（enzaltamide）耐性
ヒトCRPC細胞株におけるAR-V7の発現を定量的RT-PCR法（qRT-PCR）で調べた。その結果、ヒトCRPC細胞株である22Rv1およびVCaPでは、定量的RT-PCR（qRT-PCR）によりAR-V7 mRNAの高発現を認めた（図３）。22Rv1にアンドロゲン受容体拮抗薬エンザルタミドを投与してもARやAR-V7のタンパク質発現は変化せず、癌細胞の増殖抑制作用は乏しかった（図４）。
1. AR-V7 high expression in human CRPC cell line 22Rv1 and AR-V7 expression in enzaltamide resistant human CRPC cell line were examined by quantitative RT-PCR (qRT-PCR). As a result, in the human CRPC cell lines 22Rv1 and VCaP, high expression of AR-V7 mRNA was observed by quantitative RT-PCR (qRT-PCR) (FIG. 3). Administration of the androgen receptor antagonist enzalutamide to 22Rv1 did not alter the protein expression of AR and AR-V7, and the growth inhibitory effect of cancer cells was poor (Fig. 4).
２．CRPC細胞に対するルテオリン（luteolin）の細胞増殖およびAR-V7発現の抑制とカスパーゼ依存性アポトーシス誘導
発明者のこれまでの研究から、フラボノイドの一種であるルテオリン（図５）が、ラット前立腺発がんやラットCRPC腫瘍の増殖を抑制することが明らかになっている（第22回日本がん予防学会（平成27年6月6日開催）、演題 ラット前立腺の発がんおよび去勢抵抗性細胞増殖に対するluteolinの予防・治療効果、第31回前立腺シンポジウム（平成28年12月12日開催）、演題 前立腺発がんおよび去勢抵抗性細胞増殖に対するluteolinの抑制効果、で発表）。詳細には、ラットを使った実験で、エゴマなどのシソ科種子に豊富に含有されるルテオリンの経口摂取は前立腺のがん化を抑制することが明らかとなり、ルテオリンによる酸化ストレス抑制、細胞死（アポトーシス）誘導や酸化ストレス制御遺伝子GPX2の抑制が予防効果につながる、との知見が得られている。
2. From suppression of cell proliferation of luteolin (luteolin) and expression of AR-V7 on CRPC cells and caspase-dependent induction of apoptosis, we have studied flavonoid luteolin (Fig. 5), which causes rat prostate carcinogenesis and rat CRPC. Prevention of tumor growth has been shown (The 22nd Japan Society for the Prevention of Cancer (June 6, 2015 held), Title: Prevention and treatment of luteolin for rat prostate carcinogenesis and castration-resistant cell growth Effects, 31st Prostate Symposium (December 12, 2016), Title: Inhibitory effect of luteolin on prostate carcinogenesis and castration-resistant cell growth. In detail, in an experiment using rats, oral intake of luteolin, which is abundantly contained in seeds of Sesameaceae, such as sesame, has been shown to suppress canceration of the prostate, and oxidative stress suppression by luteolin, cell death ( It has been found that induction of apoptosis) and suppression of the oxidative stress control gene GPX2 lead to a preventive effect.
ルテオリンを22Rv1に投与すると、通常血清培養下およびチャコール処理血清培養下いずれにおいても濃度依存性に細胞増殖が抑制された（図６）。その要因として、AR-V7のmRNAおよびタンパク質発現の低下、並びにカスパーゼ（caspase） 3,7の活性化を介したアポトーシスの誘導が考えられた（図７、８）。AR-V7発現がCRPC細胞の細胞増殖に関与することは、RNAiによるAR-V7発現抑制実験からも示された（図９）。
When luteolin was administered to 22Rv1, cell proliferation was suppressed in a concentration-dependent manner both in normal serum culture and in charcoal-treated serum culture (FIG. 6). As the factors, it was considered that AR-V7 mRNA and protein expression decrease, and induction of apoptosis via activation of
３．ルテオリンによるエンザルタミドのCRPC治療効果の向上
ルテオリンのAR-V7発現抑制作用から、CRPCに対するエンザルタミドの治療効率を改善する可能性が予測された。22Rv1に対するエンザルタミドの細胞増殖抑制効果は、ルテオリンを併用投与することにより有意に高まった（図１０）。
3. Improvement of CRPC treatment effect of enzalutamide by luteolin From the inhibitory effect of luteolin on AR-V7 expression, the possibility of improving the treatment efficiency of enzalutamide against CRPC was predicted. The cytostatic effect of enzalutamide on 22Rv1 was significantly enhanced by coadministration of luteolin (FIG. 10).
４．CRPC細胞のAR-V7に対するルテオリンによるタンパク質分解促進
ルテオリンによるAR-V7タンパク質発現の抑制には、転写活性の抑制が関与していた（図７）が、AR-V7のmRNAとタンパク質の発現変化の程度に乖離があったため、転写後修飾の関与も示唆された。そこで、ルテオリンにプロテアソーム阻害剤を併用投与した検証を実施した。その結果、ルテオリンによるAR-V7タンパク質発現の抑制は、プロテアソーム阻害剤の存在により解除され、ルテオリンのAR-V7発現抑制には、ユビキチン−プロテアソーム系を介したタンパク質分解の促進が関与することがわかった（図１１）。
4. Proteolysis by luteolin against AR-V7 in CRPC cells The suppression of AR-V7 protein expression by luteolin was associated with the suppression of transcriptional activity (Figure 7), but the expression changes of AR-V7 mRNA and protein The degree of divergence also suggested the involvement of post-transcriptional modification. Therefore, verification was conducted in which luteolin was coadministered with a proteasome inhibitor. As a result, it was found that the suppression of AR-V7 protein expression by luteolin is abolished by the presence of a proteasome inhibitor, and the suppression of AR-V7 expression of luteolin involves promotion of protein degradation via the ubiquitin-proteasome system. (Figure 11).
５．CRPC細胞に対するルテオリン構造類似物質のAR-V7発現抑制効果
ルテオリンにはフラバン骨格を有する類似構造体が存在する。そのうち、アピゲニン（apigenin）、ケルセチン（quercetin）、ケンフェロール（kaenpherol）とナリンゲニン（naringenin）の22Rv1におけるAR-V7発現への影響をルテオリンと比較したところ、ルテオリンより弱いAR-V7タンパク発現減少効果をアピゲニン、ケルセチンでは認めた（図１２）。従って、フラバン骨格あるいはその一部がAR-V7発現抑制に影響し、側鎖により抑制能力が決定されうる可能性が示唆された。
5. The AR-V7 expression inhibitory effect of luteolin structural analogues on CRPC cells There is an analogous structure having a flavan skeleton in luteolin. Among them, when the effect of apigenin (apigenin), quercetin (quercetin), kaempferol (kaenpherol) and naringenin (naringenin) on AR-V7 expression in 22Rv1 is compared with luteolin, AR-V7 protein expression reduction effect weaker than luteolin It was recognized for apigenin and quercetin (FIG. 12). Therefore, it has been suggested that the flavan skeleton or a part thereof affects the suppression of AR-V7 expression, and the side chain may determine the suppression ability.
６．CRPC腫瘍に対するルテオリンの治療効果およびAR-V7発現の抑制
CRPCの細胞増殖やAR-V7発現に対するルテオリンの抑制効果を、生体においても検証した。ルテオリンの経口摂取により、毒性変化を生じることなく、去勢ヌードマウスの22Rv1 皮下腫瘍の体積は抑制された（図１３）。腫瘍組織内のAR-V7タンパク質の発現はルテオリンにより減少し、培養状態だけでなく、経口摂取し生体で代謝された状態でも同様の効果を示すことが明らかになった（図１４）。
6. Therapeutic effect of luteolin on CRPC tumor and suppression of AR-V7 expression
The inhibitory effect of luteolin on CRPC cell proliferation and AR-V7 expression was also examined in vivo. Oral intake of luteolin suppressed the volume of the 22Rv1 subcutaneous tumor in castrated nude mice (FIG. 13) without causing toxicological changes. It was revealed that the expression of AR-V7 protein in tumor tissue was decreased by luteolin, and showed similar effects not only in the culture state but also in the orally ingested and metabolized state (FIG. 14).
７．CRPC腫瘍に対するルテオリンのアポトーシス誘導と血管新生の抑制
22Rv1腫瘍の免疫学的解析により、ルテオリン投与群の腫瘍組織ではアポトーシス細胞の増加を認め、in vitro条件と同様の結果が得られた。またルテオリンによる腫瘍組織内の血管数減少が見られ、ルテオリンの腫瘍組織縮小作用には、血管新生の抑制が関わることが見出された（図１５）。
7. Induction of apoptosis and suppression of angiogenesis of luteolin for CRPC tumors
Immunological analysis of the 22Rv1 tumor revealed that apoptotic cells were increased in the tumor tissue of the luteolin administration group, with similar results to the in vitro conditions. In addition, it was found that the number of blood vessels in the tumor tissue was reduced by luteolin, and the tumor tissue reducing action of luteolin was associated with suppression of angiogenesis (FIG. 15).
８．CRPC細胞におけるルテオリンによるmiR-8080発現の上昇
ルテオリンによるAR-V7発現抑制において、転写後修飾のうちタンパク質分解の他に、マイクロRNAによる翻訳抑制が関与するかを検討した。マイクロRNAアレイ解析により、ルテオリンにより発現誘導されるマイクロRNAを網羅的に解析し、miRBaseを用いてAR-V7の3’UTRに相補配列を有する候補遺伝子をスクリーニングした。ルテオリンにより発現上昇するマイクロRNA群には、AR-FLやIGF1といった前立腺癌の増殖やCRPCに深い関連が指摘されている遺伝子の3’UTRに標的配列をもつものが多く含まれている（図１６、１７）。AR-V7に対しては、既知のマイクロRNAの中ではmiR-8080のみが相同配列を有するマイクロRNAとして該当した（図１８）。22Rv1におけるmiR-8080の発現は、ルテオリンにより4倍程度に増加し、アピゲニンやケルセチンにおいても約2倍に増加することが、定量的RT-PCRにおいて確認された（図１９）。これらのフラボノイドによるmiR-8080の発現変動は、各々のAR-V7発現抑制効果と逆相関しており（図１２）、miR-8080によるAR-V7翻訳調節の可能性が見出された。
8. Upregulation of miR-8080 expression by luteolin in CRPC cells We examined whether post-translational modification of AR-V7 expression involves translational suppression by microRNA in addition to proteolysis during post-transcriptional modification. The microRNA expressed by luteolin was comprehensively analyzed by microRNA array analysis, and miRBase was used to screen candidate genes having a complementary sequence to the 3'UTR of AR-V7. The microRNAs that are upregulated by luteolin include many with a target sequence in the 3'UTR of genes such as AR-FL and IGF1 that are closely related to prostate cancer growth and CRPC (Figure 16, 17). Among AR-V7, among the known microRNAs, only miR-8080 corresponds as a microRNA having a homologous sequence (FIG. 18). It was confirmed in quantitative RT-PCR that expression of miR-8080 in 22Rv1 was increased about 4 times by luteolin and about 2 times also in apigenin and quercetin (FIG. 19). The expression fluctuation of miR-8080 by these flavonoids was inversely correlated with each AR-V7 expression suppression effect (FIG. 12), and the possibility of AR-V7 translational regulation by miR-8080 was found.
９．miR-8080発現誘導によるCRPC細胞のAR-V7翻訳抑制とアポトーシス誘導
次に、AR-V7がmiR-8080による翻訳修飾を受ける標的遺伝子であるかを確認するため、22Rv1にmiR-8080発現ベクターを導入した。その結果、AR-V7タンパク発現は抑制され、細胞増殖の有意な抑制が見られた。ウエスタンブロットによるタンパク質発現解析では、miR-8080の発現誘導によりカスパーゼ3,7の活性化が見られ、アポトーシスの関与が示唆された（図２０）。
9. miR-8080 expression induction suppresses AR-V7 translation in CRPC cells and induces apoptosis Next, to confirm that AR-V7 is a target gene that is subject to miR-8080 translational modification, we use miR-8080 expression vector in 22Rv1 Introduced. As a result, AR-V7 protein expression was suppressed, and significant suppression of cell proliferation was observed. Protein expression analysis by Western blot showed activation of
１０．miR-8080阻害によるルテオリンのAR-V7発現および細胞増殖に対する抑制効果の減弱
一方、22Rv1に対してmiR-8080の阻害剤を処理すると、AR-V7タンパク質の発現は増加した。さらにルテオリン による22Rv1のAR-V7発現抑制作用は、miR-8080阻害剤存在下では減弱し、ルテオリンの細胞増殖抑制効果も同様に減少した（図２１）。以上のmiR-8080発現誘導および阻害実験の結果から、miR-8080がAR-V7に結合し翻訳を阻害していることが明らかとなった。
10. While miR-8080 inhibition attenuates the suppressive effect on AR-V7 expression and cell proliferation of luteolin , treatment with the miR-8080 inhibitor for 22Rv1 increased the expression of AR-V7 protein. Furthermore, the suppressive action of 22Rv1 on AR-V7 expression by luteolin was attenuated in the presence of miR-8080 inhibitor, and the cell growth suppressive effect of luteolin was also reduced (FIG. 21). From the results of the above miR-8080 expression induction and inhibition experiments, it became clear that miR-8080 binds to AR-V7 and inhibits translation.
＜まとめ＞
・ヒトCRPC細胞22Rv1では、AR（正常）およびAR-V7（変異）が高発現し、ARと比較してAR-V7がより細胞増殖に関与した（in vitro実験）。
・ルテオリンは22Rv1のAR-V7発現を著明に抑制した（in vitro実験）。
・去勢免疫不全マウスに22Rv1を移植し、ルテオリンをマウスに経口投与すると、22Rv1腫瘍組織内のAR-V7発現は低下した（ex vivo実験）。
・ルテオリンの構造類似物質であるフラボノイドであるアピゲニンやケルセチンも22Rv1のAR-V7発現を抑制した（in vitro実験）。
・ルテオリンはユビキチン・プロテアソーム系を介してAR-V7タンパクを分解した（in vitro実験）。
・マイクロRNA アレイにより、ルテオリンにより発現上昇しAR-V7の3’UTR（非翻訳領域）に部分相同配列をもつマイクロRNAとしてhsa-miR-8080を同定した（in vitro実験）。
・22Rv1にhsa-miR-8080を遺伝子導入するとAR-V7の発現が低下し細胞増殖の抑制とアポトーシスの誘導がおきた（in vitro実験）。
・22Rv1にhsa-miR-8080特異的阻害剤を導入すると、ルテオリン投与にかかわらずAR-V7発現は増加し、ルテオリンによる細胞増殖抑制効果が減弱した（in vitro実験）。
<Summary>
In human CRPC cells 22Rv1, AR (normal) and AR-V7 (mutant) were highly expressed, and AR-V7 was more involved in cell proliferation compared to AR (in vitro experiment).
・ Luteolin markedly suppressed AR-V7 expression of 22Rv1 (in vitro experiment).
When castrate immunodeficient mice were transplanted with 22Rv1 and orally administered with luteolin, AR-V7 expression in 22Rv1 tumor tissue was reduced (ex vivo experiment).
-The structural analogues of luteolin, the flavonoids apigenin and quercetin, also suppressed the expression of 22Rv1 AR-V7 (in vitro experiments).
・ Luteolin degraded AR-V7 protein via ubiquitin / proteasome system (in vitro experiment).
-Using a microRNA array, hsa-miR-8080 was identified as a microRNA that is upregulated by luteolin and has partial homology to the 3'UTR (non-translated region) of AR-V7 (in vitro experiment).
-Gene transfer of hsa-miR-8080 to 22Rv1 reduced the expression of AR-V7, resulting in suppression of cell proliferation and induction of apoptosis (in vitro experiment).
-When hsa-miR-8080 specific inhibitor was introduced into 22Rv1, AR-V7 expression increased regardless of luteolin administration and the cytostatic effect of luteolin was attenuated (in vitro experiment).
以上の知見から、前立腺癌予防効果との共通機構として、酸化ストレス抑制、アポトーシス誘導や酸化ストレス制御遺伝子GPX2の抑制がCRPCの治療効果に関わるとともに、これらに加えて血管新生抑制もCRPC治療効果に関与するといえる（図２２）。 From the above findings, oxidative stress suppression, induction of apoptosis and suppression of the oxidative stress control gene GPX2 are involved in the therapeutic effect of CRPC as a common mechanism with prostate cancer preventive effects, and in addition to these, angiogenesis suppression is also CRPC therapeutic effect It can be said that they are involved (Figure 22).
CRPCに対する新規治療薬としてAR受容体拮抗薬エンザルタミドやアンドロゲン合成阻害薬アビラテロンが使用されているが、短期間で治療抵抗性が生じ、予後不良になることが問題となっている。本発明の治療薬はこのような現状を打破する、新たな治療戦略を提供するものであり、その臨床上の意義は大きい。また、本発明の評価法（スクリーニング方法）は新薬の開発に有用であり、新たな治療薬及び治療法の確立に貢献する。一方、本発明のリスク予測方法がもたらす情報（検査結果）は、早期の治療介入の要否判断や治療経過（予後）の予測等に利用できる。従って、本発明はCRPCの治療方針の決定に有用であることはもとより、予防医療的見地からも利用価値が高い。 The AR receptor antagonist enzalutamide and the androgen synthesis inhibitor abiraterone have been used as novel therapeutic agents for CRPC, but there is a problem that treatment resistance occurs in a short period and the prognosis becomes poor. The therapeutic agent of the present invention provides a novel therapeutic strategy that overcomes the current situation, and its clinical significance is great. In addition, the evaluation method (screening method) of the present invention is useful for the development of new drugs, and contributes to the establishment of new therapeutic agents and therapeutic methods. On the other hand, the information (test results) provided by the risk prediction method of the present invention can be used to determine the necessity of early treatment intervention and to predict the treatment progress (prognosis). Therefore, the present invention is useful not only for determining the treatment plan of CRPC but also for preventing medical treatment.
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。 The present invention is not limited to the description of the embodiments and examples of the above-mentioned invention. Various modifications are also included in the present invention as long as those skilled in the art can easily conceive of the claims without departing from the scope of the claims. The contents of articles, published patent publications, patent publications, etc. specified in the present specification are incorporated by reference in their entirety.
配列番号１：人工配列の説明：AR-V7の3'UTRの部分配列
配列番号２：人工配列の説明：hsa-miR-8080の部分配列
配列番号４：人工配列の説明：AR-FL用フォワードプライマー
配列番号５：人工配列の説明：AR-FL用リバースプライマー
配列番号６：人工配列の説明：AR-V7用フォワードプライマー
配列番号７：人工配列の説明：AR-V7用リバースプライマー
配列番号８：人工配列の説明：AR-FLを標的にしたsiRNA
配列番号９：人工配列の説明：AR-V7を標的にしたsiRNA
配列番号１１：人工配列の説明：AR-V7のC末端アミノ酸配列
Sequence No. 1: Description of artificial sequence: Partial sequence of AR-V7 3'UTR Sequence No. 2: Description of artificial sequence: Partial sequence of hsa-miR-8080 Sequence No. 4: Description of artificial sequence: Forward for AR-FL Primer SEQ ID NO: 5: Description of artificial sequence: Reverse primer for AR-FL SEQ ID NO: 6: Description of artificial sequence: Forward primer for AR-V7 SEQ ID NO: 7: Description of artificial sequence: Reverse primer for AR-V7 SEQ ID NO: 8 Description of artificial sequence: siRNA targeting AR-FL
SEQ ID NO: 9: Description of artificial sequences: siRNA targeting AR-V7
SEQ ID NO: 11: Description of artificial sequence: C-terminal amino acid sequence of AR-V7
Claims (13)
（ａ）アンドロゲンレセプターバリアントAR-V7の3'非翻訳領域に存在する塩基配列UUGACACCAGUUUCUUUC（配列番号１）に対して80％以上の相補性を示す配列を含むRNA；
（ｂ）（ａ）のRNAの発現を誘導する化合物。 Castration resistant prostate cancer therapeutic agent comprising the following (a) or (b):
(A) RNA comprising a sequence showing 80% or more complementarity to the nucleotide sequence UUGACACCAGUUUCUUUC (SEQ ID NO: 1) present in the 3 'untranslated region of the androgen receptor variant AR-V7;
(B) a compound which induces the expression of the RNA of (a).
（１）前立腺癌患者から採取された検体中のhsa-miR-8080を検出するステップ；
（２）検出値に基づき、去勢抵抗性前立腺癌の発症又は増悪のリスクを判定するステップであって、hsa-miR-8080の低発現がリスクの高いことを示すステップ。 The risk prediction method according to claim 7, comprising the following steps (1) and (2):
(1) detecting hsa-miR-8080 in a sample collected from prostate cancer patients;
(2) A step of determining the risk of onset or exacerbation of castration-resistant prostate cancer based on the detected value, wherein low expression of hsa-miR-8080 indicates high risk.
（ｉ）去勢抵抗性前立腺癌細胞、又はアンドロゲンレセプターバリアントAR-V7を強制発現させた細胞に被験物質を接触させるステップ；
（ｉｉ）前記細胞におけるhsa-miR-8080の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の去勢抵抗性前立腺癌に対する有効性を判定するステップであって、hsa-miR-8080の発現上昇が被検物質の有効性の指標となるステップ。 A method of evaluating the efficacy of a test substance against castration resistant prostate cancer comprising the following steps (i) and (ii):
(I) contacting a test substance with castration resistant prostate cancer cells or cells in which the androgen receptor variant AR-V7 is forcibly expressed;
(Ii) detecting the expression of hsa-miR-8080 in the cells and determining the effectiveness of the test substance against castration-resistant prostate cancer based on the detection result, wherein the expression of hsa-miR-8080 is elevated A step that is an indicator of the effectiveness of the test substance.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017075596A JP2018177658A (en) | 2017-04-05 | 2017-04-05 | Treatment of castration resistant prostate cancer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017075596A JP2018177658A (en) | 2017-04-05 | 2017-04-05 | Treatment of castration resistant prostate cancer |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018177658A true JP2018177658A (en) | 2018-11-15 |
Family
ID=64281087
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017075596A Pending JP2018177658A (en) | 2017-04-05 | 2017-04-05 | Treatment of castration resistant prostate cancer |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2018177658A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020138370A1 (en) * | 2018-12-27 | 2020-07-02 | 大日本住友製薬株式会社 | Cancer treatment pharmaceutical composition containing cdk inhibitor |
-
2017
- 2017-04-05 JP JP2017075596A patent/JP2018177658A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020138370A1 (en) * | 2018-12-27 | 2020-07-02 | 大日本住友製薬株式会社 | Cancer treatment pharmaceutical composition containing cdk inhibitor |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cantelmo et al. | Inhibition of the glycolytic activator PFKFB3 in endothelium induces tumor vessel normalization, impairs metastasis, and improves chemotherapy | |
| ES2705237T3 (en) | Method for diagnosis and prognosis of lung cancer metastasis | |
| ES2765483T3 (en) | Modulation of the spherocytosis pathways for the treatment of an atherosclerotic disease | |
| CN105324491A (en) | Method for the prognosis and treatment of cancer metastasis | |
| JP2015520606A (en) | Methods for prognosis and treatment of cancer metastasis | |
| US20220125920A1 (en) | Combination therapy for treatment of coronary artery disease | |
| US9802994B2 (en) | Composition for preventing or treating fracture or osteoporosis using slit-robo system | |
| KR20150004416A (en) | Modulating immune responses | |
| He et al. | The browning of white adipose tissue and body weight loss in primary hyperparathyroidism | |
| AU2014296288B2 (en) | Compositions and methods for modulating thermogenesis using PTH-related and EGF-related molecules | |
| US20210113687A1 (en) | Methods for treating inflammation | |
| D’Haese et al. | The impact of MFG-E8 in chronic pancreatitis: potential for future immunotherapy? | |
| Wang et al. | linc00174 deteriorates the pathogenesis of diabetic retinopathy via miR-26a-5p/PTEN/Akt signalling cascade-mediated pyroptosis | |
| WO2016187486A1 (en) | Biomarkers and uses thereof for selecting pancreas cancer intervention | |
| Liu et al. | POLR2A blocks osteoclastic bone resorption and protects against osteoporosis by interacting with CREB1 | |
| Verreault et al. | Identification of growth hormone receptor as a relevant target for precision medicine in low‐EGFR expressing glioblastoma | |
| US20070208074A1 (en) | Methods and compositions for treating and preventing tumors | |
| US20100260718A1 (en) | Irf-4 as a tumor suppressor and uses thereof | |
| JP2018177658A (en) | Treatment of castration resistant prostate cancer | |
| TWI359271B (en) | Pharmaceutical composition for insulin resistance | |
| US20200149042A1 (en) | Modulating biomarkers to increase tumor immunity and improve the efficacy of cancer immunotherapy | |
| US11326168B2 (en) | Use of potassium channel inhibitor for treating depression | |
| US20220211848A1 (en) | Modulating gabarap to modulate immunogenic cell death | |
| US20220403030A1 (en) | Composition, comprising cotl1 as active ingredient, for diagnosis of bone disease or obesity | |
| US20230323463A1 (en) | Compositions and methods for detecting bcl2l14 and etv6 gene fusions for determining increased drug resistance |