JP2018169349A - Method for measuring amyloid beta protein and tau protein and/or phosphorylated tau protein - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を同時測定する方法に関する。また、本発明は、鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量の同時測定システムに関する。 The present invention relates to a method for simultaneously measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein in an intranasal specimen. The present invention also relates to a system for simultaneously measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein in a sample in the nasal cavity.
アルツハイマー病は、初老期から老年期に起こる進行性の認知症を特徴とする疾患であり、現在、国内の患者数は460万人以上と言われている。さらに今後、人口の高齢化に伴いその数は確実に増加すると予想される。アルツハイマー病は、これまで根本治療法がなかったが、1999年にワクチン療法がモデルマウスで成功して以来、根本治療法開発への期待が高まっている。これら根本治療法を有効に活用するためには、早期且つ簡便にアルツハイマー病を診断する方法が不可欠である。 Alzheimer's disease is a disease characterized by progressive dementia that occurs from the early age to the old age. Currently, the number of patients in Japan is said to be over 4.6 million. In the future, the number is expected to increase steadily as the population ages. Alzheimer's disease has never had a fundamental treatment, but since 1999, when vaccine therapy was successful in model mice, expectations for development of the fundamental treatment have increased. In order to make effective use of these fundamental treatment methods, an early and simple method for diagnosing Alzheimer's disease is indispensable.
アルツハイマー病の臨床症状は、記憶障害、高次脳機能障害(失語、失行、失認、構成失行)等である。その症状は他の認知症疾患でも共通して見られることが多く、臨床症状だけでアルツハイマー病と確定診断することは極めて困難である。 Clinical symptoms of Alzheimer's disease include memory impairment, higher brain dysfunction (aphasia, aphasia, agnosia, constitutive apraxia) and the like. The symptoms are often seen in other dementia diseases, and it is extremely difficult to make a definitive diagnosis of Alzheimer's disease based on clinical symptoms alone.
一方、アルツハイマー病の特徴的な病理組織所見としては、老人斑と神経原線維変化がある。前者の主構成成分はβシート構造をとったアミロイドβ蛋白であり、後者のそれは過剰リン酸化されたタウ蛋白である。アルツハイマー病においては臨床症状が発症するかなり前から、脳内では凝集したアミロイドβ蛋白の蓄積等の上記病理的組織変化が始まっていることが知られている。また、過剰リン酸化されたタウ蛋白の蓄積は、アミロイドβ蛋白の蓄積よりは遅れて生じてくると考えられているが、神経原線維変化はアミロイドβ蛋白の蓄積と比べて疾患の重症度と密接に関連していると考えられている。そのため、アミロイドβ蛋白とタウ蛋白の両方を検出することで、アルツハイマー病の早期診断と重症度の診断が可能となる。 On the other hand, characteristic pathological findings of Alzheimer's disease include senile plaques and neurofibrillary tangles. The former main component is amyloid β protein having a β sheet structure, and the latter is tau protein that is hyperphosphorylated. In Alzheimer's disease, it is known that pathological tissue changes such as accumulation of aggregated amyloid β protein have started in the brain long before clinical symptoms develop. Accumulation of hyperphosphorylated tau protein is thought to occur later than that of amyloid β protein, but neurofibrillary tangles are associated with disease severity and amyloid β protein accumulation. It is considered closely related. Therefore, by detecting both amyloid β protein and tau protein, early diagnosis and severity diagnosis of Alzheimer's disease are possible.
このような観点から、近年、脳内アミロイドβ蛋白に選択的に結合する造影剤を用いたポジトロン断層撮影法(PET)、シングルフォトン断層撮影法(SPECT)、及び核磁気共鳴イメージング法(MRI)による老人斑の画像化についての研究が進められている。また、タウ蛋白に結合するPETやSPECT用の放射性造影剤の研究も進められている。 From this point of view, in recent years, positron tomography (PET), single photon tomography (SPECT), and nuclear magnetic resonance imaging (MRI) using a contrast agent that selectively binds to amyloid β protein in the brain Research on imaging of senile plaques is underway. Research on radioactive contrast agents for PET and SPECT that bind to tau protein is also underway.
本発明者らは、侵襲性が低いアルツハイマー病の診断方法として、鼻腔から綿棒などにより採取した鼻腔内検体を用いることでアミロイドβ蛋白及びタウ蛋白の濃度を測定できることを報告している(特許文献１、２、非特許文献１)。特許文献１、２、及び非特許文献１で報告されている方法では、アミロイドβ蛋白を検出するために、可溶化剤としてギ酸を添加することが行われている。これは、検体中ではアミロイドβ蛋白が凝集しているため、ギ酸により凝集を解きほぐして、可溶性アミロイドβモノマーとすることで、アミロイドβ蛋白の検出が可能となるためである。 The present inventors have reported that the concentration of amyloid β protein and tau protein can be measured by using an intranasal specimen collected from a nasal cavity with a cotton swab or the like as a method for diagnosing Alzheimer's disease with low invasiveness (Patent Literature). 1, 2, Non-Patent Document 1). In the methods reported in Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1, formic acid is added as a solubilizer to detect amyloid β protein. This is because the amyloid β protein is aggregated in the sample, and the amyloid β protein can be detected by disaggregating it with formic acid to form a soluble amyloid β monomer.
しかしながら、ギ酸は蛋白を分解させてしまうことから、タウ蛋白又はリン酸化タウ蛋白を測定できなくなる。そのため、アミロイドβ蛋白とタウ蛋白又はリン酸化タウ蛋白の両方を測定するためには、2箇所から検体を採取する必要があり、患者の負担となる可能性がある。 However, since formic acid degrades proteins, tau protein or phosphorylated tau protein cannot be measured. Therefore, in order to measure both amyloid β protein and tau protein or phosphorylated tau protein, it is necessary to collect samples from two locations, which may be a burden on the patient.
本発明は、一度の採取により得られた鼻腔内検体を用いた、アミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を同時測定する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、一度の採取により得られた鼻腔内検体を用いた、アミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量の同時測定システムを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for simultaneously measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein using an intranasal specimen obtained by a single collection. Another object of the present invention is to provide a simultaneous measurement system for the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein using an intranasal specimen obtained by a single collection.
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、鼻腔内検体における可溶化剤としてグアニジン塩酸塩を使用することで、アミロイドβ蛋白の凝集体を可溶性アミロイドβモノマーとすることができ、且つタウ蛋白及びリン酸化タウ蛋白が分解されずにこれらを測定可能であるという知見を得た。結果として、一度の採取により得られた鼻腔内検体を用いて、アミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を同時に測定することが可能となる。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have made amyloid β protein aggregates soluble amyloid β monomers by using guanidine hydrochloride as a solubilizer in intranasal specimens. The present inventors have found that tau protein and phosphorylated tau protein can be measured without being degraded. As a result, it becomes possible to simultaneously measure the amounts of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein using an intranasal specimen obtained by a single collection.
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を同時測定する方法及び同時測定システムを提供するものである。 The present invention has been completed based on these findings and has been completed. The present invention provides a method and a simultaneous measurement system for simultaneously measuring the amount of the following amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein. Is.
項１．以下の工程(I)及び(II)を含む、鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を同時測定する方法：
(I) 鼻腔から採取した鼻腔内検体を、可溶化剤及び界面活性剤を含む抽出液中に溶出させる工程、及び
(II) 工程(I)で得られた抽出液から、免疫学的測定法により、鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を測定する工程。
項２．前記可溶化剤が、グアニジン又はその塩である、項１に記載の方法。
項３．前記界面活性剤が、ドデシルマルトシドである、項１又は２に記載の方法。
項４．工程(II)において、更に、総蛋白量の測定を行う、項１〜３のいずれか一項に記載の測定方法。
項５．工程(I)において、鼻腔内検体を溶出させた抽出液に対して、更に、熱処理、フィルター濾過及び脱塩からなる群から選択される少なくとも1種の処理を行う、項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
項６．前記鼻腔内検体が一度の採取により得られたものである、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
項７．鼻腔から採取した鼻腔内検体を、可溶化剤及び界面活性剤を含む抽出液中に溶出させる手段と、
上記手段で得られた抽出液から、免疫学的測定法により、鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を測定する手段
とを備える、鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量の同時測定システム。
Item 1. A method for simultaneously measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein in an intranasal specimen, comprising the following steps (I) and (II):
(I) a step of eluting an intranasal specimen collected from the nasal cavity in an extract containing a solubilizing agent and a surfactant; and
(II) A step of measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein in the intranasal specimen from the extract obtained in step (I) by immunological measurement.
Item 2. Item 2. The method according to Item 1, wherein the solubilizer is guanidine or a salt thereof.
Item 3. Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the surfactant is dodecyl maltoside.
Item 4. Item 4. The measurement method according to any one of Items 1 to 3, wherein the total protein amount is further measured in the step (II).
Item 5. Item 4. The process according to any one of Items 1 to 4, wherein in the step (I), the extract from which the intranasal specimen is eluted is further subjected to at least one treatment selected from the group consisting of heat treatment, filter filtration, and desalting. The method according to one item.
Item 6. Item 6. The method according to any one of Items 1 to 5, wherein the intranasal specimen is obtained by a single collection.
Item 7. Means for eluting an intranasal specimen collected from the nasal cavity in an extract containing a solubilizing agent and a surfactant;
Means for measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein in the nasal specimen from the extract obtained by the above means by immunoassay. A system for simultaneously measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein.
本発明によれば、一度の採取により得られた鼻腔内検体を用いて、アミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を同時に測定することが可能となる。そのため、検体の採取が一度で済むので、アルツハイマー病のようなアミロイドβ蛋白及びタウ蛋白が蓄積する疾患の診断において、患者の負担を軽減することができる。 According to the present invention, it is possible to simultaneously measure the amounts of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein using an intranasal specimen obtained by a single collection. For this reason, since it is only necessary to collect the specimen once, the burden on the patient can be reduced in the diagnosis of a disease in which amyloid β protein and tau protein accumulate such as Alzheimer's disease.
以下、本発明について詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
なお、本明細書において「含む(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。 In the present specification, “comprise” includes the meaning of “essentially consist of” and the meaning of “consist of”.
本発明の鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を同時測定する方法は、以下の工程(I)及び(II)を含むことを特徴とする。
(I) 鼻腔から採取した鼻腔内検体を、可溶化剤及び界面活性剤を含む抽出液中に溶出させる工程
(II) 工程(I)で得られた抽出液から、免疫学的測定法により、鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を測定する工程
The method for simultaneously measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein in the intranasal specimen of the present invention comprises the following steps (I) and (II).
(I) A step of eluting an intranasal specimen collected from the nasal cavity in an extract containing a solubilizer and a surfactant
(II) A step of measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein in an intranasal sample from the extract obtained in step (I) by immunological measurement
本発明における「アミロイドβ蛋白」としては、特に断りが無い限りAβ42とAβ40を示す。アミロイドβモノマーにおいて、特に重要なのが、42個のアミノ酸からなるアミロイドβモノマー(Aβ42)と、40個のアミノ酸からなるアミロイドβモノマー(Aβ40)である。脳組織におけるアルツハイマー病の特徴的な現象として知られる老人班の形成には、Aβ42とAβ40の凝集性及び吸着性が起因していると考えられている。現在、実際の臨床現場では、髄液中のAβ42とAβ40が測定指標とされている。 As used herein, “amyloid β protein” refers to Aβ42 and Aβ40 unless otherwise specified. Of the amyloid β monomers, particularly important are amyloid β monomer (Aβ42) consisting of 42 amino acids and amyloid β monomer (Aβ40) consisting of 40 amino acids. It is believed that the formation of senile plaques, known as a characteristic phenomenon of Alzheimer's disease in brain tissue, is due to the aggregation and adsorption properties of Aβ42 and Aβ40. At present, in clinical practice, Aβ42 and Aβ40 in cerebrospinal fluid are used as measurement indices.
鼻腔内検体としては、綿棒やスワブ等の採取具を被験対象の鼻粘膜に擦過することによって鼻粘液を採取することで得られる鼻汁や鼻腔内粘膜擦過物である。擦過する部分は、鼻粘液を採取できる限り特に制限されず、例えば、嗅裂、上鼻甲介、中鼻甲介、下鼻甲介、鼻中隔などが挙げられる。 Examples of intranasal specimens are nasal discharge and intranasal mucosal scrapings obtained by collecting nasal mucus by rubbing a collection tool such as a cotton swab or swab on the nasal mucosa of the test subject. The part to be abraded is not particularly limited as long as nasal mucus can be collected, and examples include olfactory cleft, upper turbinate, middle turbinate, lower turbinate, and nasal septum.
本発明における被験対象としては、哺乳動物(ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、ラット等)であり、特にヒトである。 The test subject in the present invention is a mammal (human, monkey, dog, cat, horse, cow, mouse, rat, etc.), particularly a human.
本発明では、鼻腔内検体は一度の採取により得られたものであることを特徴とする。このように一度の採取で済むため、患者の負担を軽減することができる。 In the present invention, the intranasal specimen is obtained by a single collection. As described above, since the collection is performed once, the burden on the patient can be reduced.
本発明の工程(I)は、鼻腔から採取した鼻腔内検体を、可溶化剤及び界面活性剤を含む抽出液中に溶出させる工程である。 Step (I) of the present invention is a step of eluting an intranasal specimen collected from the nasal cavity into an extract containing a solubilizing agent and a surfactant.
工程(I)では、例えば、鼻粘液を採取した綿棒やスワブ等を抽出液に浸漬させることにより、鼻腔内検体を抽出液中に溶出させる。具体的には、抽出液が入ったマイクロチューブ等の容器に鼻粘液を採取した綿棒やスワブ自体を入れ、攪拌することにより行う。 In the step (I), for example, the sample in the nasal cavity is eluted in the extract by immersing a swab or swab from which the nasal mucus is collected in the extract. Specifically, a cotton swab or swab obtained by collecting nasal mucus is placed in a container such as a microtube containing the extract and stirred.
可溶化剤は、鼻腔内検体から抽出液に溶出したアミロイドβ蛋白の凝集体を解きほぐして、可溶性アミロイドβモノマーにするために用いられる。可溶性アミロイドβモノマーにすることで、アミロイドβ蛋白の量を正確に測定することが可能となる。 The solubilizer is used to unravel the aggregates of amyloid β protein eluted from the intranasal specimen into the extract to form soluble amyloid β monomers. By using soluble amyloid β monomer, the amount of amyloid β protein can be accurately measured.
可溶化剤としては、アミロイドβ蛋白の凝集体を解きほぐして、可溶性アミロイドβモノマーにすることができるものであれば特に制限なく使用することができる。中でも、グアニジン又はその塩が好ましく、グアニジン塩酸塩が特に好ましい。グアニジン又はその塩を可溶化剤として使用することで、タウ蛋白及びリン酸化タウ蛋白の分解を防ぐことができる。可溶化剤は、1種単独で又は2種以上を組み合わせて使用することができる。抽出液中の可溶化剤の濃度は、通常0.1〜20M程度、好ましくは1〜10M程度である。 As the solubilizer, any solubilizing agent can be used without particular limitation as long as it can dissolve aggregates of amyloid β protein to form soluble amyloid β monomer. Of these, guanidine or a salt thereof is preferable, and guanidine hydrochloride is particularly preferable. By using guanidine or a salt thereof as a solubilizer, degradation of tau protein and phosphorylated tau protein can be prevented. A solubilizer can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types. The concentration of the solubilizer in the extract is usually about 0.1 to 20M, preferably about 1 to 10M.
界面活性剤は、容器内壁等に対する蛋白質の吸着や鼻粘液への蛋白質の吸着を抑制するために用いられる。界面活性剤を使用することで、アミロイドβ蛋白、タウ蛋白、リン酸化タウ蛋白の量をより正確に測定することが可能となる。 The surfactant is used for suppressing the adsorption of the protein to the inner wall of the container and the like and the adsorption of the protein to the nasal mucus. By using a surfactant, the amount of amyloid β protein, tau protein, and phosphorylated tau protein can be measured more accurately.
界面活性剤としては、容器内壁等に対する蛋白質の吸着や鼻粘液への蛋白質の吸着を抑制することができるものであれば特に制限なく使用でき、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤、及び非イオン界面活性剤のいずれも使用することができる。中でも、非イオン界面活性剤が好ましく、アルキルグリコシド、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Tween (登録商標) 20など)、及びオクチルフェノールエトキシレート(Triton X-100など)がより好ましく、ドデシルマルトシド(n-ドデシル-β-マルトシド)が特に好ましい。界面活性剤は、1種単独で又は2種以上を組み合わせて使用することができる。抽出液中の界面活性剤の濃度は、通常0.001〜10容量%程度、好ましくは0.01〜5容量%程度である。 As the surfactant, any surfactant can be used without particular limitation as long as it can suppress protein adsorption to the inner wall of the container or the like, and protein adsorption to nasal mucus. Cationic surfactant, anionic surfactant, amphoteric Either a surfactant or a nonionic surfactant can be used. Among these, nonionic surfactants are preferable, alkylglycosides, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters (such as Tween (registered trademark) 20), and octylphenol ethoxylate (such as Triton X-100) are more preferable, and dodecyl maltoside (n- Dodecyl-β-maltoside) is particularly preferred. The surfactants can be used alone or in combination of two or more. The concentration of the surfactant in the extract is usually about 0.001 to 10% by volume, preferably about 0.01 to 5% by volume.
抽出液には、アミロイドβ蛋白、タウ蛋白及びリン酸化タウ蛋白の溶出を阻害しない限り、可溶化剤及び界面活性剤以外の添加剤を含ませることができる。そのような添加剤として、緩衝剤、金属塩等が挙げられる。緩衝剤としては、例えば、トリス塩酸緩衝剤、リン酸カリウム緩衝剤、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、グリシン塩酸緩衝剤、HEPES緩衝剤、MES緩衝剤等が挙げられる。金属塩としては、例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。溶出液のpHは、通常5〜9程度である。溶出液の溶媒としては、通常、水である。 The extract may contain additives other than solubilizers and surfactants as long as they do not inhibit elution of amyloid β protein, tau protein, and phosphorylated tau protein. Examples of such additives include buffers and metal salts. Examples of the buffer include Tris hydrochloride buffer, potassium phosphate buffer, acetate buffer, citrate buffer, glycine hydrochloride buffer, HEPES buffer, MES buffer, and the like. Examples of the metal salt include potassium salt, sodium salt, magnesium salt and the like. The pH of the eluate is usually about 5-9. The solvent for the eluate is usually water.
工程(I)では、鼻腔内検体を溶出させた抽出液に対して、更に、熱処理、フィルター濾過、脱塩、濃縮などの処理を行うことができる。 In step (I), the extract from which the intranasal specimen is eluted can be further subjected to treatment such as heat treatment, filter filtration, desalting, and concentration.
熱処理の条件は、溶出液に含まれる蛋白質を可溶化させることができる条件であれば特に制限されず、加熱温度は通常50〜100℃であり、加熱時間は通常1〜60分間である。 The heat treatment conditions are not particularly limited as long as the protein contained in the eluate can be solubilized, and the heating temperature is usually 50 to 100 ° C. and the heating time is usually 1 to 60 minutes.
フィルター濾過では、カラムの目詰まり等を防止するため、溶出液に含まれる夾雑物の除去を行う。このようなフィルターとしては、例えば、粒子径が0.2μm以上あるいは分画分子量が100,000〜1,000,000であるものが挙げられる。 In filter filtration, impurities contained in the eluate are removed to prevent clogging of the column. Examples of such a filter include those having a particle size of 0.2 μm or more or a molecular weight cut-off of 100,000 to 1,000,000.
脱塩では、可溶化剤の除去やバッファーの交換を行う。脱塩は、公知の手法により行うことができ、そのような手法としては、例えば、脱塩カラム、透析、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、沈殿／再懸濁などが挙げられ、好ましくは脱塩カラムである。 In desalting, the solubilizer is removed and the buffer is exchanged. Desalting can be performed by a known method, and examples of such a method include a desalting column, dialysis, ultrafiltration, gel filtration chromatography, precipitation / resuspension, and preferably desalting. It is a salt column.
工程(I)のいずれかの時点で、抽出液をアミロイドβ蛋白の測定用と、タウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の測定用の2つに分けることが望ましい。 It is desirable to divide the extract into two for measuring amyloid β protein and measuring tau protein and / or phosphorylated tau protein at any point in step (I).
本発明の工程(II)は、工程(I)で得られた抽出液から、免疫学的測定法により、鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を測定する工程である。 In the step (II) of the present invention, the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein in the intranasal specimen is measured from the extract obtained in step (I) by an immunological measurement method. It is a process to do.
免疫学的測定法は、測定するペプチド又は蛋白質に特異的に結合する抗体などの結合物質を使用する手法であり、各種公知の手法を用いて実施できる。免疫学的測定法としては、例えば、ELISA法、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ、タンパク質マイクロアレイ等が挙げられる。ELISA法で測定を行う場合には、Aβ42、Aβ40、リン酸化タウ蛋白、タウ蛋白などの測定用の市販のELISAキットを利用することができる。 The immunological measurement method is a method using a binding substance such as an antibody that specifically binds to the peptide or protein to be measured, and can be performed using various known methods. Examples of the immunological measurement method include ELISA method, Western blot method, radioimmunoassay, protein microarray and the like. When measurement is performed by ELISA, commercially available ELISA kits for measuring Aβ42, Aβ40, phosphorylated tau protein, tau protein and the like can be used.
工程(II)において、上記に加えて、更に、総蛋白量の測定を行うこともできる。総蛋白量の測定は、例えば、BCA法、Bradford法、Lowry法、紫外線吸収法、ピロガロールレッド-モリブデン錯体発色法などにより行うことができる。 In the step (II), in addition to the above, the total protein amount can also be measured. The total protein amount can be measured by, for example, the BCA method, Bradford method, Lowry method, ultraviolet absorption method, pyrogallol red-molybdenum complex coloring method, and the like.
本発明の測定方法により得られた、アミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量の値は、アミロイドβ蛋白及びタウ蛋白が蓄積する疾患の診断に利用することができる。例えば、アミロイドβ蛋白、タウ蛋白及びリン酸化タウ蛋白の量の値を、又はこれらの値を用いて各種演算を行って求めた値を、予め定められた量と比較することにより、疾患のリスクの判定を行い得る。また、特許文献２に記載されているように、タウ蛋白の量の2乗と、アミロイドβ蛋白の量の2乗との和の平方根を求め、これを予め定められた閾値と比較することにより、疾患のリスクの判定を行い得る。 The value of the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein obtained by the measurement method of the present invention can be used for diagnosis of diseases in which amyloid β protein and tau protein accumulate. For example, by comparing the values of the amounts of amyloid β protein, tau protein, and phosphorylated tau protein, or values obtained by performing various calculations using these values, with a predetermined amount, the risk of disease Can be determined. Further, as described in Patent Document 2, the square root of the sum of the square of the amount of tau protein and the square of the amount of amyloid β protein is obtained and compared with a predetermined threshold value. The risk of disease can be determined.
アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患としては、アルツハイマー病の他、ダウン症候群が挙げられ、タウ蛋白が蓄積する疾患としては、アルツハイマー病の他、進行性核上性麻痺(PSP)、大脳皮質変性症、前頭側頭型認知症、ピック病等が挙げられる。 Diseases in which amyloid β protein accumulates include Alzheimer's disease, Down's syndrome, and diseases in which tau protein accumulates include Alzheimer's disease, progressive supranuclear palsy (PSP), cortical degeneration, Examples include frontotemporal dementia and Pick's disease.
本発明の鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量の同時測定システムは、
鼻腔から採取した鼻腔内検体を、可溶化剤及び界面活性剤を含む抽出液中に溶出させる手段と、
上記手段で得られた抽出液から、免疫学的測定法により、鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を測定する手段
とを備えることを特徴とする。
A system for simultaneously measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein in the intranasal specimen of the present invention,
Means for eluting an intranasal specimen collected from the nasal cavity in an extract containing a solubilizing agent and a surfactant;
And means for measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein in the intranasal specimen from the extract obtained by the above means by an immunological measurement method.
本発明のシステムは、上述した方法を実現するためのシステムであり、鼻腔内検体、可溶化剤、界面活性剤、抽出液、免疫学的測定法などは前述するものと同様である。 The system of the present invention is a system for realizing the above-described method, and the intranasal specimen, solubilizer, surfactant, extract, immunoassay and the like are the same as those described above.
上記の鼻腔内検体を可溶化剤及び界面活性剤を含む抽出液中に溶出させる手段としては、例えば、鼻粘液を採取した綿棒やスワブ等を抽出液に浸漬する手段が挙げられ、具体的には、抽出液が入ったマイクロチューブ等の容器に鼻粘液を採取した綿棒やスワブ自体を投入し、攪拌する手段が挙げられる。 Examples of the means for eluting the intranasal specimen into the extract containing the solubilizer and the surfactant include, for example, a means for immersing a swab or swab obtained by collecting nasal mucus in the extract. May be a means of putting a cotton swab or swab from which nasal mucus was collected into a container such as a microtube containing the extract and stirring.
上記の免疫学的測定法により、鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を測定する手段としては、例えば、ELISAを実施する分析装置などを挙げることができる。 Examples of means for measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein in an intranasal sample by the above-described immunological measurement method include an analyzer that performs ELISA, and the like. .
本発明のシステムは、更に、鼻腔内検体を溶出させた抽出液に対して、熱処理、フィルター濾過、脱塩、濃縮などを行う手段、総蛋白量の測定手段などを備え得る。 The system of the present invention may further comprise means for performing heat treatment, filter filtration, desalting, concentration, etc. on the extract from which the intranasal specimen has been eluted, means for measuring the total protein amount, and the like.
本発明の方法及びシステムによれば、患者から一度の採取により得られた鼻腔内検体を用いて、アミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を同時に測定することが可能となる。そのため、従来では2箇所から検体を採取する必要があったが、検体の採取が一度で済むことになるので、アルツハイマー病のようなアミロイドβ蛋白及びタウ蛋白が蓄積する疾患の診断を行う場合に、患者の負担を軽減することができる。 According to the method and system of the present invention, it is possible to simultaneously measure the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein using an intranasal specimen obtained by sampling once from a patient. . Therefore, in the past, it was necessary to collect specimens from two locations, but the specimens need only be collected once, so when diagnosing diseases in which amyloid β protein and tau protein accumulate such as Alzheimer's disease , Can reduce the burden on the patient.
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。 Examples are given below to illustrate the present invention in more detail. However, the present invention is not limited to these examples.
なお、以下の試験例における界面活性剤の濃度(%)は容量%を示す。 In the following test examples, the surfactant concentration (%) represents% by volume.
試験例１
倫理委員会の承認のもと、アルツハイマー(AD)例14名、健常者17名を対象とした。滋賀医科大学医学部附属病院脳神経センターの受診者及び患者の介護者の中から、インフォームドコンセントにより、書面による承諾を得られた症例について実施した。年齢、性別ともに、AD例と老年正常者群で有意な差を認めなかった。血液一般検査では、両群に有意な差は見られなかった。
Test example 1
Under the approval of the Ethics Committee, 14 Alzheimer (AD) cases and 17 healthy subjects were included. We conducted a case in which written consent was obtained from informed consent among the examinees of the Neurological Center of Shiga Medical University Hospital and the caregivers of patients. There were no significant differences in age and gender between the AD cases and the elderly normal group. General blood tests showed no significant differences between the two groups.
＜方法＞
１）鼻腔(嗅裂、下鼻甲介)を綿棒で擦過した。
２）200 mMのNaCl、8Mの塩酸グアニジン、2 mM EDTA、及び0.05%のドデシルマルトシドを加えた50 mMのトリス塩酸バッファー(pH 8.0)(本試験例においてグアニジン溶液と略する) 100μl中に綿棒を入れて、よく洗った。
３）70℃で10分間加熱した。
４）0.2μmのPTFEフィルターで濾過した。
<Method>
1) The nasal cavity (olfactory cleft, lower turbinate) was scraped with a cotton swab.
2) 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 200 mM NaCl, 8 M guanidine hydrochloride, 2 mM EDTA, and 0.05% dodecyl maltoside (abbreviated as guanidine solution in this test example) in 100 μl Put a cotton swab and wash well.
3) Heated at 70 ° C. for 10 minutes.
4) Filtration through a 0.2 μm PTFE filter.
当該濾液約100μlを以下のAとBの２つのステップに分けて測定を行った。 About 100 μl of the filtrate was divided into the following two steps A and B for measurement.
(Aステップ)
A-1．濾液の45μlを300Kオメガフィルターで限外濾過し、更にグアニジンを除いたバッファー(以下、置換バッファーと略する)90μlを入れて300Kオメガフィルターを洗浄して、総量で135μlの濾液を得た。
A-2．置換バッファーで膨潤したG-10カラム1 mlをカラムに充填した後、膨潤溶液を遠心除去した。
A-3．濾液120μl、置換バッファー 40μlの順にカラムに添加し、遠心(800 x g, 2 min)によりゲル濾過液を回収することで、サンプル中のグアニジン塩酸塩の除去を行った。
A-4. この溶液をサンプルとし、市販のELISA kit (Aβ42、Aβ40)及び総タンパク測定キットを用いて、Aβ42、Aβ40の測定、及び総タンパク測定を行った。用いた試薬は、下記の通りである。
・Human/Rat βAmyloid(42) ELISA Kit, High Sensitive (和光純薬工業(株)、292-64501)
・Human/Rat βAmyloid(40) ELISA Kit II (和光純薬工業(株)、294-64701)
・プロテインアッセイラピッドキットワコー(和光純薬工業(株)、293-56101)
(A step)
A-1. 45 μl of the filtrate was ultrafiltered with a 300K omega filter, and 90 μl of a buffer from which guanidine had been removed (hereinafter abbreviated as a replacement buffer) was added to wash the 300K omega filter to obtain a total volume of 135 μl of filtrate.
A-2. After 1 ml of G-10 column swollen with a substitution buffer was packed in the column, the swollen solution was removed by centrifugation.
A-3. 120 μl of the filtrate and 40 μl of the substitution buffer were added to the column in this order, and the gel filtrate was collected by centrifugation (800 × g, 2 min) to remove guanidine hydrochloride in the sample.
A-4. Using this solution as a sample, Aβ42 and Aβ40 and total protein were measured using a commercially available ELISA kit (Aβ42, Aβ40) and a total protein measurement kit. The reagents used are as follows.
・ Human / Rat βAmyloid (42) ELISA Kit, High Sensitive (Wako Pure Chemical Industries, 292-64501)
・ Human / Rat βAmyloid (40) ELISA Kit II (Wako Pure Chemical Industries, 294-64701)
・ Protein Assay Rapid Kit Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 293-56101)
(Bステップ)
B-1．置換バッファーで膨潤したG-10カラム0.7 mLをカラムに充填した後、膨潤溶液を遠心除去した。
B-2．濾液40μl、置換バッファー 10μlの順にカラムに添加し、遠心(800 x g, 2 min)によりゲル濾過液を回収することで、サンプル中のグアニジン塩酸塩の除去を行った。
B-3．この溶液をサンプルとし、市販のELISA kit (tTau・pTau)及び総タンパク測定キットを用いて、総タウ・リン酸化タウの測定、及び総タンパク測定を行った。用いた試薬は、下記の通りである。
・TAU (Total) Human ELISA Kit (Invitrogen，KHB0041)
・TAU [pT181] Human ELISA Kit (Invitrogen，KHO0631)
・プロテインアッセイラピッドキットワコー(和光純薬工業(株)、293-56101)
(Step B)
B-1. After filling the column with 0.7 mL of G-10 column swollen with a substitution buffer, the swelling solution was removed by centrifugation.
B-2. Guanidine hydrochloride in the sample was removed by adding 40 μl of the filtrate and 10 μl of the substitution buffer to the column in this order, and collecting the gel filtrate by centrifugation (800 × g, 2 min).
B-3. Using this solution as a sample, total tau / phosphorylated tau and total protein were measured using a commercially available ELISA kit (tTau · pTau) and a total protein measurement kit. The reagents used are as follows.
・ TAU (Total) Human ELISA Kit (Invitrogen, KHB0041)
・ TAU [pT181] Human ELISA Kit (Invitrogen, KHO0631)
・ Protein Assay Rapid Kit Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 293-56101)
＜結果＞
結果を表１及び２に示す。嗅裂においては、AD例の92.9%、健常例の94.1%で蛋白量、Aβ42、Aβ40、タウ蛋白、及びリン酸化タウ蛋白の同時測定が可能であった。下鼻甲介においては、AD例の100%、健常例の94.1%で同時測定が可能であった(表１)。従来法では、
Aβ42とタウ蛋白の同時測定も(試験例３)、タウ蛋白とリン酸化タウ蛋白の同測定もできなかったが(試験例４)、本発明により、Aβ42、Aβ40、タウ蛋白、及びリン酸化タウ蛋白の同時測定がすべて可能になった。
<Result>
The results are shown in Tables 1 and 2. In olfactory cleft, 92.9% of AD cases and 94.1% of healthy cases allowed simultaneous measurement of protein amount, Aβ42, Aβ40, tau protein, and phosphorylated tau protein. In the inferior turbinates, simultaneous measurement was possible in 100% of AD cases and 94.1% of healthy cases (Table 1). In the conventional method,
Although simultaneous measurement of Aβ42 and tau protein (Test Example 3) and tau protein and phosphorylated tau protein could not be measured (Test Example 4), according to the present invention, Aβ42, Aβ40, tau protein, and phosphorylated tau All simultaneous protein measurements are now possible.
このように同時測定が可能になったことで、バイオマーカー間の比較ができるようになった。例えば、リン酸化タウ蛋白量をタウ蛋白量で割ることで補正すると、嗅裂方向において、AD群で高い傾向を示した(p=0.062, 表２)。 Since simultaneous measurement was possible in this way, comparison between biomarkers became possible. For example, when corrected by dividing the phosphorylated tau protein amount by the tau protein amount, the AD group showed a high tendency in the olfactory cleft direction (p = 0.062, Table 2).
試験例２
インフォームドコンセントにより、書面による承諾を得られた症例について実施した。
Test example 2
We conducted the case for which written consent was obtained through informed consent.
＜方法＞
１）鼻腔を綿棒で擦過した。
２）色々な界面活性化剤を入れたバッファーに綿棒を入れて、よく洗った。そこに一定量のタウ蛋白を加えて処理し、どのくらいの量を回収できるか検討した。
バッファーは、200 mMのNaCl、8Mの塩酸グアニジン、2 mM EDTAを加えた50 mMのトリス塩酸バッファー(pH 8.0)を基本とし、界面活性剤を加えないか、又は以下の(A)〜(E)のいずれかの界面活性剤を加えた(本試験例において、これらの溶液をグアニジン溶液とし、それぞれの溶液からグアニン塩酸塩を除いた溶液を置換バッファーと略する)。
(A) 0.05% Tween-20
(B) 0.5% Tween-20
(C) 0.05% ドデシルマルトシド
(D) 0.5% デオキシコール酸ナトリウム
(E) 0.1% SDS
３）それぞれの溶液100μlに一定量のタウ蛋白を入れたチューブを70℃で10分加熱した。
４）0.2μmのPTFEフィルターで濾過をした。
５）濾液の45μlを300Kオメガフィルターで限外濾過し、更にグアニジンを除いた置換バッファー90μlを入れて300Kオメガフィルターを洗浄し、総量で135μlの濾液を得た。
６）置換バッファーで膨潤したG-10カラム1 mlをカラムに充填した後、膨潤溶液を遠心除去した。
７）濾液120μl、置換バッファー40μlの順にカラムに添加し、遠心(800 x g, 2 min)によりゲル濾過液を回収することで、サンプル中のグアニジン塩酸塩の除去を行った。
８）脱塩した溶液から10μl取り総蛋白量を測定し、残り150μlで総タウ蛋白を測定した。総タウ蛋白の測定にはTAU (Total) Human ELISA Kitを、総蛋白量の測定にはプロテインアッセイラピッドキットワコーを用いた。
<Method>
1) The nasal cavity was scraped with a cotton swab.
2) A cotton swab was placed in a buffer containing various surfactants and washed thoroughly. A certain amount of tau protein was added and processed to examine how much could be recovered.
The buffer is based on 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) supplemented with 200 mM NaCl, 8 M guanidine hydrochloride, 2 mM EDTA, and no surfactant is added, or the following (A) to (E (In this test example, these solutions are referred to as guanidine solutions, and solutions obtained by removing guanine hydrochloride from the respective solutions are abbreviated as substitution buffers).
(A) 0.05% Tween-20
(B) 0.5% Tween-20
(C) 0.05% dodecyl maltoside
(D) 0.5% sodium deoxycholate
(E) 0.1% SDS
3) A tube containing a fixed amount of tau protein in 100 μl of each solution was heated at 70 ° C. for 10 minutes.
4) Filtration through a 0.2 μm PTFE filter.
5) 45 μl of the filtrate was ultrafiltered with a 300K omega filter, and further, 90 μl of a substitution buffer excluding guanidine was added to wash the 300K omega filter to obtain a total amount of 135 μl of filtrate.
6) After 1 ml of G-10 column swollen with a substitution buffer was packed in the column, the swollen solution was removed by centrifugation.
7) 120 μl of the filtrate and 40 μl of the substitution buffer were added to the column in this order, and the gel filtrate was collected by centrifugation (800 × g, 2 min) to remove guanidine hydrochloride in the sample.
8) 10 μl was taken from the desalted solution, the total protein amount was measured, and the total tau protein was measured with the remaining 150 μl. TAU (Total) Human ELISA Kit was used to measure total tau protein, and Protein Assay Rapid Kit Wako was used to measure total protein.
＜結果＞
結果を図１に示す。加えたタウ蛋白をすべて回収できたのは、0.05% ドデシルマルトシドであった。添加物なし、0.5% Tween-20の場合は約90%、0.05% Tween-20は約80%タウ蛋白を回収できたが、0.5% デオキシコール酸ナトリウムと0.1% SDSはタウ蛋白を回収できなかった。
<Result>
The results are shown in FIG. It was 0.05% dodecyl maltoside that recovered all the added tau protein. No additives, about 90% with 0.5% Tween-20, about 80% tau protein with 0.05% Tween-20, but 0.5% sodium deoxycholate and 0.1% SDS cannot collect tau protein It was.
試験例３
従来法により、アミロイドβ蛋白とリン酸化タウ蛋白の同時測定を試みた。健常者5名に対して実施した。
Test example 3
An attempt was made to simultaneously measure amyloid β protein and phosphorylated tau protein by a conventional method. The test was conducted on 5 healthy subjects.
本試験例では綿棒を用いて下鼻甲介の鼻粘膜組織を擦過し、鼻粘膜組織が付着した綿球を、超純水270μlを予め添加したマイクロチューブに投入した。そして、綿球の先から3.0 cmの位置で切断し、攪拌して綿棒に付着した鼻粘膜組織検体を溶出させた。本試験例では、市販されているプラ軸綿棒(医療補助用綿棒HUBY-COTIX EM3-50S((株)山洋))を使用した。 In this test example, the nasal mucosa tissue of the lower turbinate was rubbed with a cotton swab, and the cotton ball with the nasal mucosa tissue adhered thereto was put into a microtube to which 270 μl of ultrapure water had been added in advance. And it cut | disconnected in the position of 3.0 cm from the tip of the cotton ball, and stirred, and the nasal mucosa tissue sample adhering to the cotton swab was eluted. In this test example, a commercially available plastic swab (medical auxiliary swab HUBY-COTIX EM3-50S (Sanyo Co., Ltd.)) was used.
次に、綿棒を引き上げて綿球を超純水から浮かした状態にし、蓋をすることでマイクロチューブに固定し、14000gで遠心することで綿球を脱水した。その後、マイクロチューブから綿棒を取り出し、マイクロチューブ内の溶液を27Gニードル装着のシリンジで30回吸込及び吐出を繰り返し懸濁した。このうち、10μlを総蛋白量の測定に用い、60μlをタウ蛋白の定量に用いた。総タウ蛋白質の測定にはTAU (Total) Human ELISA Kitを、総蛋白量の測定にはプロテインアッセイラピッドキットワコーを用いた。 Next, the cotton swab was pulled up so that the cotton ball floated from the ultrapure water, and the cotton ball was fixed to the microtube by a lid and centrifuged at 14000 g to dehydrate the cotton ball. Thereafter, a cotton swab was taken out from the microtube, and the solution in the microtube was repeatedly suspended by suction and discharge 30 times with a syringe equipped with a 27G needle. Of these, 10 μl was used for measuring the total protein amount and 60 μl was used for tau protein quantification. TAU (Total) Human ELISA Kit was used to measure total tau protein, and Protein Assay Rapid Kit Wako was used to measure total protein.
残りの懸濁液200μlは以下のようにしてAβ42の測定に用いた。 The remaining 200 μl of suspension was used for the measurement of Aβ42 as follows.
懸濁後の溶液のうち200μlを試験管に移し、抽出液として100%ギ酸を500μl添加、攪拌し、70℃に保たれた恒温層で1時間静置した。1時間後に恒温層から試験管を取り出し、溶液をフィルター(NANOSEP 100K OMEGA(PALL)：100 kDa以上のタンパク質を排除し、100 kDa以下の分子量のタンパク質のみを通過させるフィルター)で分画ろ過した。ろ液を試験管に移し、溶液量が20μlになるまで遠心エバポレーターで減圧濃縮した。濃縮した溶液を攪拌した後、1 mol/l Tris(pH未調整)を480μl加え、500μl溶液に調製した。なお、各溶液のpHを測定し中和の成否を記録用紙へ記録し、pH7.0〜8.6程度の範囲であることを確認した。これら溶液をアミロイドβ蛋白の測定用試料とした。 200 μl of the suspended solution was transferred to a test tube, 500 μl of 100% formic acid was added as an extract, stirred, and allowed to stand for 1 hour in a thermostatic layer kept at 70 ° C. One hour later, the test tube was taken out from the thermostatic layer, and the solution was subjected to fractional filtration with a filter (NANOSEP 100K OMEGA (PALL): a filter that excludes proteins of 100 kDa or more and allows only proteins with a molecular weight of 100 kDa or less to pass through). The filtrate was transferred to a test tube and concentrated under reduced pressure using a centrifugal evaporator until the solution volume reached 20 μl. After stirring the concentrated solution, 480 μl of 1 mol / l Tris (pH unadjusted) was added to prepare a 500 μl solution. The pH of each solution was measured, and the success or failure of neutralization was recorded on a recording sheet. It was confirmed that the pH was in the range of about 7.0 to 8.6. These solutions were used as samples for measuring amyloid β protein.
アミロイドβ蛋白の測定は、アミロイドβ蛋白を測定するELISAの測定キットを用いて実施した(Human/Rat βAmyloid(42) ELISA Kit、High-Sensitive)。測定に先立って、検量線を作成するための溶液を、Aβ42のスタンダード溶液を用いて、0.05、0.1、0.2、0.25、1、2、2.5、5、10、又は20 pMに調製した。調製後は、検量線を作成するための溶液と測定用試料1 mlをそれぞれ、測定キットのマイクロタイタープレートに100μl添加した。 The amyloid β protein was measured using an ELISA measurement kit for measuring amyloid β protein (Human / Rat βAmyloid (42) ELISA Kit, High-Sensitive). Prior to the measurement, a solution for preparing a calibration curve was prepared at 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 1, 2, 2.5, 5, 10, or 20 pM using a standard solution of Aβ42. After the preparation, 100 μl each of a solution for preparing a calibration curve and 1 ml of a measurement sample were added to the microtiter plate of the measurement kit.
Aβ42と総タウ蛋白の測定結果を表３に示す。Aβ42は測定できたが、総タウ蛋白は測定できなかった。総蛋白量は測定可能であった。 Table 3 shows the measurement results of Aβ42 and total tau protein. Aβ42 could be measured, but total tau protein could not be measured. Total protein was measurable.
従来法により、総タウ蛋白とリン酸化タウ蛋白の同時測定を試みた。 Attempts were made to simultaneously measure total tau protein and phosphorylated tau protein by conventional methods.
倫理委員会の承認を得て、アルツハイマー病患者6例(71-84歳、男性3例、女性3例)と健常者1例(72歳、男性)で実施した。 With the approval of the Ethics Committee, it was conducted in 6 Alzheimer's disease patients (71-84 years, 3 men, 3 women) and 1 healthy subject (72 years, male).
鼻腔の嗅裂、中鼻道、下鼻甲介、総鼻道から、綿棒を用いて鼻粘膜組織を擦過し、鼻粘膜組織が付着した綿球を、超純水270μlを予め添加したマイクロチューブに投入した。そして綿球の先から3.0 cmの位置で切断し、攪拌して綿棒に付着した鼻粘膜組織検体を溶出させた。 Use a cotton swab to scrape the nasal mucosal tissue from the nasal olfactory cleft, middle nasal passage, lower turbinate and common nasal passage, and place the cotton ball with the nasal mucosal tissue on it into a microtube pre-added with 270 μl of ultrapure water. I put it in. And it cut | disconnected in the position of 3.0 cm from the tip of the cotton ball, and stirred, the nasal mucosa tissue sample adhering to the cotton swab was eluted.
次に、綿棒を引き上げて綿球を超純水から浮かした状態にし、蓋をすることでマイクロチューブに固定し、14000gで遠心することで綿球を脱水した。その後、マイクロチューブから綿棒を取り出し、マイクロチューブ内の溶液を27Gニードル装着のシリンジで30回吸込及び吐出を繰り返し懸濁した。この懸濁後を半分に分けて、総タウ蛋白とリン酸化タウ蛋白の測定を行った。総タウ蛋白の測定はTAU (Total) Human ELISA Kitを、リン酸化タウの測定はTau [pT181] Human ELISA Kitを用いた。 Next, the cotton swab was pulled up so that the cotton ball floated from the ultrapure water, and the cotton ball was fixed to the microtube by a lid and centrifuged at 14000 g to dehydrate the cotton ball. Thereafter, a cotton swab was taken out from the microtube, and the solution in the microtube was repeatedly suspended by suction and discharge 30 times with a syringe equipped with a 27G needle. After the suspension, the total tau protein and phosphorylated tau protein were measured in half. TAU (Total) Human ELISA Kit was used to measure total tau protein, and Tau [pT181] Human ELISA Kit was used to measure phosphorylated tau.
その結果、総タウ蛋白は測定できたが、リン酸化タウ蛋白は全例で検出できなかった。すなわち、従来法では、同一の鼻サンプルを用いた総タウ蛋白とリン酸化タウ蛋白の同時測定はできなかった。 As a result, total tau protein could be measured, but phosphorylated tau protein could not be detected in all cases. That is, in the conventional method, total tau protein and phosphorylated tau protein could not be measured simultaneously using the same nasal sample.
Claims (7)
(I) 鼻腔から採取した鼻腔内検体を、可溶化剤及び界面活性剤を含む抽出液中に溶出させる工程、及び
(II) 工程(I)で得られた抽出液から、免疫学的測定法により、鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を測定する工程。 A method for simultaneously measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein in an intranasal specimen, comprising the following steps (I) and (II):
(I) a step of eluting an intranasal specimen collected from the nasal cavity in an extract containing a solubilizing agent and a surfactant; and
(II) A step of measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein in the intranasal specimen from the extract obtained in step (I) by immunological measurement.
上記手段で得られた抽出液から、免疫学的測定法により、鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量を測定する手段
とを備える、鼻腔内検体中のアミロイドβ蛋白並びにタウ蛋白及び／又はリン酸化タウ蛋白の量の同時測定システム。 Means for eluting an intranasal specimen collected from the nasal cavity in an extract containing a solubilizing agent and a surfactant;
Means for measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein in the nasal specimen from the extract obtained by the above means by immunoassay. A system for simultaneously measuring the amount of amyloid β protein and tau protein and / or phosphorylated tau protein.
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