JP2018138022A - Human igg1 fc region variants and uses thereof - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、補体依存性細胞傷害作用（CDC）が増強されており、かつFcドメインにおける1つまたは複数のアミノ酸改変に起因する他の改変されたエフェクター機能も有し得る、Fcドメインを含有するポリペプチド（例えば抗体）に関する。
The present invention relates to Fc with enhanced complement dependent cytotoxicity (CDC) and may also have other altered effector functions resulting from one or more amino acid modifications in the Fc domain. It relates to polypeptides containing domains (eg antibodies).
発明の背景
抗体のFc領域によって媒介されるエフェクター機能は、病原体の死滅ならびに抗原の排除および分解といった、外来性実体の破壊を可能にする。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）および抗体依存性細胞媒介性食作用（ADCP）は、Fc受容体（FcR）を保有する細胞にFc領域が結合することによって惹起され、一方、補体依存性細胞傷害作用（CDC）は、補体活性化の古典的経路を惹起するC1qにFc領域が結合することによって惹起される。
Background of the Invention Effector functions mediated by the Fc region of antibodies allow the destruction of foreign entities such as pathogen killing and antigen elimination and degradation. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP) are triggered by binding of the Fc region to cells bearing the Fc receptor (FcR), while complementing. Body-dependent cytotoxicity (CDC) is triggered by binding of the Fc region to C1q, which initiates the classical pathway of complement activation.
各IgG抗体はC1qに対する結合部位を2つ含有し、それは各重鎖定常（Fc）領域に1つずつある。しかし、溶液の状態にあるIgGの単分子は、C1qに対するモノマーIgGの親和性が極めて弱いため（Kd ほぼ10-4M）、補体を活性化しない（Sledge et al., 1973 J. Biol. Chem. 248,2818-13（非特許文献1）；Hughes-Jones et al., 1979 Mol. Immunol. 16,697-701（非特許文献2））。抗原が誘因となるIgGの会合は、多価C1q分子のはるかに強固な結合（Kd ほぼ10-8M）および補体活性化を導くことができる（Burton et al., 1990 Mol. Immunol. 22, 161-206（非特許文献3））。対照的に、IgMは自然下では共有結合したペンタマーまたはヘキサマーの状態で存在し、発現または固定化された細胞抗原と結合すると、IgMペンタマーおよびヘキサマーはCDCを効率的に誘発することができる。抗原結合は、C1q結合部位を露出するようにIgMにおけるコンフォメーション変化を誘導するための必要条件である（Feinstein et al., 1986, Immunology Today, 169-174（非特許文献4））。 Each IgG antibody contains two binding sites for C1q, one in each heavy chain constant (Fc) region. However, a single molecule of IgG in solution does not activate complement (Sledge et al., 1973 J. Biol) because the affinity of monomeric IgG for C1q is very weak (K d approximately 10 -4 M). Chem. 248,2818-13 (Non-Patent Document 1); Hughes-Jones et al., 1979 Mol. Immunol. 16,697-701 (Non-Patent Document 2)). Antigen-triggered IgG association can lead to much tighter binding of polyvalent C1q molecules (K d ˜10 −8 M) and complement activation (Burton et al., 1990 Mol. Immunol. 22, 161-206 (Non-Patent Document 3)). In contrast, IgM exists in nature in the form of covalently linked pentamers or hexamers, and IgM pentamers and hexamers can efficiently induce CDC when bound to expressed or immobilized cell antigens. Antigen binding is a prerequisite for inducing conformational changes in IgM to expose the C1q binding site (Feinstein et al., 1986, Immunology Today, 169-174).
また、IgGは、Fc領域のCH2／CH3ドメインの相互作用を通じて、ヘキサマー環構造の形成による補体活性化も達成しうることが示唆されている（Burton et al., 1990 Trends in Biochem. Sci. 15, 64-69（非特許文献5））。そのようなヘキサマーIgG構造の存在を裏づける証拠は、二次元結晶（Reidler et al., 1986 I Handbook of Experimental Immunology 4th edit. (Weir, D. M. ed.), pp17.1-17.5. Blackwell, Edinburgh（非特許文献6）；Pinteric et al., 1971 Immunochem. 8, 1041-5（非特許文献7））および三次元結晶において、ならびに溶液の状態にあるIgG1、IgG2aおよびIgG4およびヒトFcに関して見いだされている（Kuznetsov et al., 2000 J Struct. Biol. 131, 108-115（非特許文献8））。また、ヘキサマー環形成は、HIV-1 gp120を対象とするb12ヒトIgG1κ抗体の結晶構造（PDB中の1HZH）でも観察された（Saphire et al., Science 2001 Aug 10;293(5532),1155-9（非特許文献9））。b12ヘキサマー環では、6個の到達可能なC1q結合部位が6個の抗体のそれぞれから1つずつヘキサマー表面に提示され、残りの6つの結合部位は下方を向いていた。 It has also been suggested that IgG can also achieve complement activation through the formation of a hexamer ring structure through the interaction of the CH2 / CH3 domain of the Fc region (Burton et al., 1990 Trends in Biochem. Sci. 15, 64-69 (Non-Patent Document 5)). Evidence supporting the existence of such hexameric IgG structures is based on two-dimensional crystals (Reidler et al., 1986 I Handbook of Experimental Immunology 4th edit. (Weir, DM ed.), Pp17.1-17.5. Blackwell, Edinburgh (non- 6); Pinic et al., 1971 Immunochem. 8, 1041-5 (Non-Patent Document 7)) and three-dimensional crystals, as well as IgG1, IgG2a and IgG4 and human Fc in solution. (Kuznetsov et al., 2000 J Struct. Biol. 131, 108-115 (non-patent document 8)). Hexamer ring formation was also observed in the crystal structure of b12 human IgG1κ antibody (1HZH in PDB) targeting HIV-1 gp120 (Saphire et al., Science 2001 Aug 10; 293 (5532), 1155- 9 (Non-Patent Document 9)). In the b12 hexamer ring, six reachable C1q binding sites were presented on the hexamer surface, one from each of the six antibodies, with the remaining six binding sites facing down.
C1qは、抗体結合領域を含有する6個の球状頭部が6本のコラーゲン柄につなぎ止められた一束のチューリップに似た形をしている（Perkins et al., 1985 Biochem J. 228, 13-26（非特許文献10）；Poon et al., 1983 J Mol Biol. 168, 563-77（非特許文献11）；Reid et al., 1983 Biochem Soc Trans 11, 1-12（非特許文献12）；Weiss et al., 1986 J. Mol. Biol. 189, 573-81（非特許文献13））。C1qは、1HZH結晶構造のb12ヘキサマー集合体に上から嵌合し、その結果、6個の球状頭部のそれぞれが6つのC1q結合部位の1つと接触することが見いだされている（Parren, FASEB Summer Research Conference, Snowmass, Co., 5-10 July 2010（非特許文献14）；"Crystal Structure of an intact human IgG: implications for HIV-1 neutralization and effector Function", Thesis by Erica Ollmann Saphire, for the Scripps Research Institute, La Jolla, California. November 2000（非特許文献15））。結晶構造内で対称関係にある複数のb12抗体の間で観察されるFc境界面における選択されたアミノ酸の変異は、C1qの結合力を低下させることが観察されており、このことは分子間Fc：Fc相互作用に対するこれらのアミノ酸の寄与を指し示している。 C1q has a shape resembling a bunch of tulips, with six globular heads containing antibody binding regions tied to six collagen stalks (Perkins et al., 1985 Biochem J. 228, 13-26 (Non-patent document 10); Poon et al., 1983 J Mol Biol. 168, 563-77 (Non-patent document 11); Reid et al., 1983 Biochem Soc Trans 11, 1-12 (Non-patent document) 12); Weiss et al., 1986 J. Mol. Biol. 189, 573-81 (Non-patent Document 13)). C1q fits into the 1HZH crystalline b12 hexamer assembly from above, and as a result, each of the six globular heads has been found to contact one of the six C1q binding sites (Parren, FASEB Summer Research Conference, Snowmass, Co., 5-10 July 2010; "Crystal Structure of an intact human IgG: implications for HIV-1 neutralization and effector Function", Thesis by Erica Ollmann Saphire, for the Scripps Research Institute, La Jolla, California. November 2000 (Non-patent Document 15)). Mutations in selected amino acids at the Fc interface observed between multiple b12 antibodies in symmetry within the crystal structure have been observed to reduce C1q binding, indicating that intermolecular Fc : Indicates the contribution of these amino acids to the Fc interaction.
WO 2006/104989号（特許文献1）は、改変された抗体Fc領域およびその使用を記載している。 WO 2006/104989 (Patent Document 1) describes a modified antibody Fc region and its use.
WO 2005/047327号（特許文献2）は、新生児Fc受容体（FcRn）結合ポリペプチド変異体、二量体Fc結合タンパク質、およびそれらに関連する方法を記載している。 WO 2005/047327 describes a neonatal Fc receptor (FcRn) binding polypeptide variant, a dimeric Fc binding protein, and methods related thereto.
WO 2010/106180号（特許文献3）は、新生児Fc受容体（FcRn）に対する結合が増強されたFc変異体を記載している。 WO 2010/106180 (Patent Document 3) describes an Fc variant with enhanced binding to the neonatal Fc receptor (FcRn).
WO 2005/070963号（特許文献4）は、ポリペプチドFc領域変異体およびその使用を記載している。 WO 2005/070963 (Patent Document 4) describes polypeptide Fc region variants and uses thereof.
WO 2006/053301号（特許文献5）は、FcRnに対する結合が改変されたFc変異体を記載している。 WO 2006/053301 (Patent Document 5) describes an Fc variant with a modified binding to FcRn.
US 2011／0123440号（特許文献6）は、改変された抗体Fc領域およびその使用を記載している。改変されたFc領域は、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。 US 2011/0123440 describes a modified antibody Fc region and its use. The modified Fc region has one or more amino acid substitutions.
US 2008／0089892号（特許文献7）は、ポリペプチドFc領域変異体、およびこれらのFc領域変異体を含む組成物を記載している。 US 2008/0089892 describes polypeptide Fc region variants and compositions comprising these Fc region variants.
US 2010／0184959号（特許文献8）は、Fcリガンドの認識および／またはエフェクター機能が改変されたFcポリペプチド変異体を提供する方法を記載している。 US 2010/0184959 describes a method for providing Fc polypeptide variants with altered Fc ligand recognition and / or effector function.
US 2010／015133号（特許文献9）は、ポリペプチドの会合を調節することによってポリペプチドを作製する方法を記載している。 US 2010/015133 (Patent Document 9) describes a method for producing a polypeptide by regulating the association of the polypeptides.
US 2010／105873号（特許文献10）は、多ドメインタンパク質治療薬を作製するための統合的アプローチを記載している。 US 2010/105873 describes an integrated approach to making multidomain protein therapeutics.
US 6,737,056号（特許文献11）は、改変されたエフェクター機能を有するポリペプチド変異体を記載している。 US 6,737,056 (Patent Document 11) describes polypeptide variants with altered effector functions.
従来の取り組みは、増強されたエフェクター機能または他の改変された特性を有する抗体Fc変異体を同定するために行われてきた。そのような研究は、例えば、IgGアイソタイプ間でセグメントを交換して、キメラ性IgG分子（Natsume et al., 2008 Cancer Res 68(10), 3863-72（非特許文献16））、またはヒンジ領域内（Dall'Acqua et al., 2006 J Immunol 177, 1129-1138（非特許文献17））もしくは残基D270、K322、P329およびP331を中心とするCH2ドメイン内のC1q結合部位の内部もしくは近傍（Idusogie et al., 2001 J Immunol 166, 2571-2575（非特許文献18）；Michaelsen et al., 2009 Scand J Immunol 70, 553-564（非特許文献19）およびWO 99/51642号（特許文献12））にアミノ酸置換を生じさせることを狙いとしていた。例えば、Moore et al.（2010 mAbs 2(2), 181-189)（非特許文献20））は、CDCまたはADCCを介したエフェクター機能の増強に関する、S267E、H268F、S324T、S239D、I332E、G236AおよびI332Eのさまざまな組み合わせの検討について記載している。Fc受容体に対する結合（WO 2006/105062号（特許文献13）、WO 00/42072号（特許文献14）、米国特許第6,737,056号（特許文献11）および米国特許第7,083,784号（特許文献15））または抗体の物理的特性（WO 2007/005612 A1号（特許文献16））に影響を及ぼす他のFc変異も示唆されている。 Prior efforts have been made to identify antibody Fc variants with enhanced effector function or other altered properties. Such studies include, for example, exchanging segments between IgG isotypes to produce chimeric IgG molecules (Natsume et al., 2008 Cancer Res 68 (10), 3863-72), or hinge regions (Dall'Acqua et al., 2006 J Immunol 177, 1129-1138 (Non-patent Document 17)) or in or near the C1q binding site in the CH2 domain centered on residues D270, K322, P329 and P331 ( Idusogie et al., 2001 J Immunol 166, 2571-2575 (Non-Patent Document 18); Michaelsen et al., 2009 Scand J Immunol 70, 553-564 (Non-Patent Document 19) and WO 99/51642 (Patent Document 12) The aim was to generate amino acid substitutions in)). For example, Moore et al. (2010 mAbs 2 (2), 181-189) (Non-Patent Document 20) describes S267E, H268F, S324T, S239D, I332E, G236A related to enhancement of effector function via CDC or ADCC. And discusses various combinations of I332E. Binding to Fc receptors (WO 2006/105062 (patent document 13), WO 00/42072 (patent document 14), US Pat. No. 6,737,056 (patent document 11) and US Pat. No. 7,083,784 (patent document 15)) Alternatively, other Fc mutations affecting the physical properties of antibodies (WO 2007/005612 A1 (Patent Document 16)) have also been suggested.
しかし、当技術分野におけるこれらの利点および他の利点にもかかわらず、新たな改良された抗体ベースの治療薬に対しては依然として需要がある。 However, despite these and other advantages in the art, there remains a need for new and improved antibody-based therapeutics.
本発明は、それらの親ポリペプチド／抗体と比較して、補体依存性細胞傷害作用（CDC）が増強されており、かつ他のエフェクター機能も増強されていてもよい、ポリペプチドおよび抗体変異体を提供する。理論に限定されることはないが、これらの変異体は、2つのポリペプチド／抗体分子のFc領域間のより安定した結合相互作用を可能にし、それによって、より増強された、またはより特異的なCDC応答といった増強されたエフェクター機能につながる、より結合力の高い表面をもたらすと考えられる。また、特定の変異体は、向上したADCC応答、ADCP応答、および／または他の増強されたエフェクター機能によっても特徴づけられる。ポリペプチド／抗体の操作というこの巧妙な手順を、例えば、本明細書に記載するように、例えば、抗体ベースの治療薬の活性または特異性を高めるために適用することができる。 The present invention provides polypeptide and antibody variants that have enhanced complement dependent cytotoxicity (CDC) and may have other effector functions compared to their parent polypeptide / antibody. Provide the body. Without being limited to theory, these variants allow for a more stable binding interaction between the Fc regions of two polypeptide / antibody molecules, thereby making them more enhanced or more specific It is thought to result in a more cohesive surface that leads to enhanced effector functions such as a robust CDC response. Certain variants are also characterized by improved ADCC response, ADCP response, and / or other enhanced effector functions. This tricky procedure of polypeptide / antibody manipulation can be applied, for example, to enhance the activity or specificity of antibody-based therapeutics, for example, as described herein.
したがって、1つの局面において、本発明は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの補体依存性細胞傷害作用（CDC）を増強する方法であって、親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345XおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階を含む方法に関する。 Accordingly, in one aspect, the invention provides a method for enhancing complement dependent cytotoxicity (CDC) of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, wherein A method comprising introducing a mutation in one or more amino acid residues selected from the group corresponding to E430X, E345X and S440W in the Fc region of a human IgG1 heavy chain.
1つのさらなる局面において、本発明は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの変異体であって、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含み、ただし、変異体の新生児Fc受容体（FcRn）に対する結合を変更する、Fcドメインにおけるさらなる変異を含まないことを条件とする変異体に関する。 In one further aspect, the invention provides a variant of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, wherein the E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R in the Fc region of a human IgG1 heavy chain. Including one or more mutations selected from the group corresponding to E345Y and S440W, provided that it does not contain additional mutations in the Fc domain that alter the binding of the mutant to the neonatal Fc receptor (FcRn) It is related with the variant.
本発明はまた、ポリペプチドまたは抗体によって、例えば、抗原を発現する細胞、細胞膜またはビリオンの表面上のその抗原と結合したときに媒介される補体依存性細胞傷害作用（CDC）を増強するための、1つまたは複数のそのような変異の利用も提供する。 The present invention also enhances complement-dependent cytotoxicity (CDC) mediated by a polypeptide or antibody, eg, when bound to that antigen on the surface of a cell, cell membrane or virion expressing the antigen. The use of one or more such mutations is also provided.
1つの局面において、本明細書で「単一変異体」と称する場合、該変異体は、親ポリペプチドまたは抗体と比較して、CDCが増強されておりかつ他のエフェクター機能も増強されていてもよい。 In one aspect, when referred to herein as a “single variant”, the variant has enhanced CDC and other effector functions compared to the parent polypeptide or antibody. Also good.
1つの局面において、本明細書で「二重変異体」と称する場合、該変異体は、前記セグメントに少なくとも2つの変異を含み、かつ、当該少なくとも2つの変異のうち1つのみを含む変異体と比較してCDCが向上しておりかつ他のエフェクター機能も向上していてもよい。 In one aspect, when referred to herein as a “double mutant”, the mutant includes at least two mutations in the segment and includes only one of the at least two mutations. Compared with CDC, CDC may be improved and other effector functions may also be improved.
1つの局面において、本明細書で「混合変異体」と称する場合、該変異体は、前記セグメント中の異なるアミノ酸残基に変異を含む同じまたは異なるポリペプチドまたは抗体の第2の変異体と組み合わせて用いた場合に、その変異体、第2の変異体、および親ポリペプチドまたは親抗体単独のうち1つまたは複数と比較して、CDCの増強がもたらされかつ他のエフェクター機能も増強されていてもよい。 In one aspect, when referred to herein as a “mixed variant”, the variant is combined with a second variant of the same or different polypeptide or antibody that contains a mutation at a different amino acid residue in the segment. When used in conjunction with one or more of the mutant, second mutant, and parent polypeptide or parent antibody alone, resulting in enhanced CDC and enhanced other effector functions. It may be.
典型的には、変異は、親アミノ酸残基を、新たな分子間Fc：Fc結合の形成を促進するか、または既存の対の相互作用の強度を増強する、サイズおよび／または物理化学的特性の異なるものと交換する変異のようなアミノ酸置換である。本発明の変異に関する例示的なアミノ酸残基は、表1ならびに表2Aおよび2Bに、例示的なアミノ酸置換とともに示されている。本発明のさまざまな局面の非限定的な説明図が図1に提示されている。 Typically, the mutation causes the parent amino acid residue to promote the formation of a new intermolecular Fc: Fc bond or to enhance the strength of an existing pair of interactions, size and / or physicochemical properties. Amino acid substitutions such as mutations that exchange for different ones. Exemplary amino acid residues for the mutations of the invention are shown in Table 1 and Tables 2A and 2B with exemplary amino acid substitutions. A non-limiting illustration of various aspects of the present invention is presented in FIG.
[本発明1001]
以下の段階を含む、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの補体依存性細胞傷害作用（CDC）を増強する方法：
該親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345XおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階。
[本発明1002]
1つまたは複数のアミノ酸残基における前記変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345YおよびS440Wに対応する群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
1つまたは複数のアミノ酸残基における前記変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E345KおよびE345Qに対応する群から選択される、本発明1001または1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
以下の段階を含む、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドのCDCおよび抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）を増強する方法：
該親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345XおよびS440Wに対応する1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階。
[本発明1005]
1つまたは複数のアミノ酸残基における前記変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345R、E430TおよびE430Fに対応する、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記親ポリペプチドが、免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含む親抗体である、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記親抗体が、単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体である、本発明1006の方法。
[本発明1008]
免疫グロブリンの第1のCH2-CH3領域と第1の抗原結合領域とを含む第1のポリペプチドおよび免疫グロブリンの第2のCH2-CH3領域と第2の抗原結合領域とを含む第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体である親抗体の補体依存性細胞傷害作用（CDC）を増強する方法であって、
該第1および第2の抗原結合領域が、同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、かつ、前記方法が、該第1および／または第2のCH2-CH3領域に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階を含み；かつ
該第1のCH2-CH3領域が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸変異を含み；かつ、該第2のCH2-CH3領域が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸変異を含み；かつ、該第1のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸変異が、該第2のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸変異とは異なる、前記方法。
[本発明1009]
1つまたは複数のアミノ酸残基における前記変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記二重特異性抗体の前記第1および第2のポリペプチドの両方に変異を導入する段階を含む、本発明1008または1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記第1のCH2-CH3領域の前記さらなるアミノ酸変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409に対応する位置にあり、例えばK409Rであり；かつ、前記第2のCH2-CH3領域の前記さらなるアミノ酸変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405に対応する位置にあり、例えばF405Lである、本発明1008〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
1つまたは複数の位置にS440YおよびS440W以外の変異を導入する段階、ならびに
（i）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するアミノ酸残基のそれぞれにおける変異であって、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、変異、
（ii）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447および448に対応するアミノ酸残基のそれぞれにおける変異、例えばヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K／R／Hおよび448E／D、好ましくはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447Kおよび448E、または
（iii）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447、448および449に対応するアミノ酸残基のそれぞれにおける変異、例えばヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D／E、448K／R／Hおよび449P、好ましくはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447E、448Kおよび449P
をさらに導入する段階
を含む、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
1つまたは複数の位置にS440YおよびS440W以外の変異を導入する段階、ならびにヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439および／またはS440に対応するアミノ酸残基のそれぞれに変異をさらに導入する段階を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、本発明1012の方法。
[本発明1014]
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における前記変異がK439D／Eであり、かつ／または、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における前記変異がS440K／Rである、本発明1013の方法。
[本発明1015]
少なくとも第1および第2の親ポリペプチドの組み合わせの補体依存性細胞傷害作用（CDC）を増強する方法であって、該少なくとも第1および第2の親ポリペプチドがそれぞれ免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含み、該少なくとも第1および／または第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階を含む、前記方法。
[本発明1016]
前記少なくとも第1および／または第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階を含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記第1および第2の親ポリペプチドの両方に対して、同じであっても異なってもよい変異を導入する段階を含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
（i）前記第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階、
（ii）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を含まない、前記第2の親ポリペプチドを提供する段階、
を含む、本発明1016の方法。
[本発明1019]
1つまたは複数の位置における前記変異がS440YおよびS440Wとは別のものであり、かつ、前記方法が、
（i）前記第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置K439に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階；および
（ii）前記第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階であって、ただし、該変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、段階
をさらに含み、段階（i）および（ii）が代替的に、
（iii）該第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置S440に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階であって、ただし、該変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、段階；
（iv）該第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置K439に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階
であってもよい、本発明1015〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における前記変異がK439D／Eであり、かつ／またはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における前記変異がS440K／Rである、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記第1および第2の親ポリペプチドが、それぞれが免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含む第1および第2の親抗体である、本発明1015〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記第1および第2の親抗体が、単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体である、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記第1および／または第2の親抗体が、免疫グロブリンの第1のCH2-CH3領域と第1の抗原結合領域とを含む第1のポリペプチドおよび第2のCH2-CH3領域と第2の抗原結合領域とを含む第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体であり、該第1および第2の抗原結合領域が、同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、かつ、該第1のCH2-CH3領域が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸変異を含み、かつ、該第2のCH2-CH3領域が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸変異を含み、かつ、該第1のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸変異が、該第2のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸変異とは異なる、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記第1のCH2-CH3領域が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409に対応する位置にさらなるアミノ酸変異、例えばK409Rを含み、かつ、前記第2のCH2-CH3領域が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405に対応する位置にさらなるアミノ酸変異、例えばF405Lを含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記親ポリペプチドまたは前記親抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）を変更しない、本発明1001〜1003および1006〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
実施例34に開示された方法によって決定される前記親ポリペプチドまたは前記親抗体の新生児Fc受容体（FcRn）に対する結合を変更しない、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
実施例34に開示された方法によって決定される、OD405nmでの吸光度の変化によって測定される前記親ポリペプチドまたは前記親抗体の新生児Fc受容体（FcRn）に対する結合を、30％を上回って、例えば20％、10％または5％を上回って増加させることも減少させることもない、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1028]
実施例34に開示された方法によって決定される前記親ポリペプチドもしくは前記親抗体のマウス新生児Fc受容体（FcRn）に対する見かけの親和性を、0.5倍を上回って増強しない、または前記親ポリペプチドもしくは前記親抗体のマウスFcRnに対する見かけの親和性を、2倍を上回って低下させない、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1029]
実施例37に開示された方法によって決定される前記親ポリペプチドまたは前記親抗体の血漿クリアランス速度を変更しない、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
実施例37に開示された方法によって決定される前記親ポリペプチドまたは前記親抗体の血漿クリアランス速度を、3.0倍を上回って、例えば2.5倍、2.0倍、1.5倍または1.2倍を上回って増強することも低下させることもない、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1031]
実施例36に開示された方法によって決定される前記変異体の標的非依存的な液相中での補体活性化を変更しない、本発明1001〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記親ポリペプチドまたは前記親抗体の血漿中半減期を変更しない、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの変異体であって、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含み、ただし、該変異体の新生児Fc受容体（FcRn）に対する結合を変更するFcドメインにおけるさらなる変異を含まないことを条件とする、前記変異体。
[本発明1034]
免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの変異体であって、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含み、ただし、実施例34に開示された方法によって決定される、OD405nmでの吸光度の変化によって測定される該変異体の新生児Fc受容体（FcRn）に対する結合を、30％を上回って、例えば20％、10％または5％を上回って増加または減少させるFcドメインにおけるさらなる変異を含まないことを条件とする、前記変異体。
[本発明1035]
1つまたは複数の前記変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E345KおよびE345Qに対応する群から選択される、本発明1033または1034のいずれかの変異体。
[本発明1036]
前記変異体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）を変更させるFcドメインにおけるさらなる変異を含まない、本発明1033〜1035のいずれかの変異体。
[本発明1037]
実施例37に開示された方法によって決定される前記変異体の血漿クリアランス速度を変更させるFcドメインにおけるさらなる変異を含まない、本発明1033〜1036のいずれかの変異体。
[本発明1038]
実施例37に開示された方法によって決定される前記変異体の血漿クリアランス速度を、3.0倍を上回って、例えば2.5倍、2.0倍、1.5倍または1.2倍を上回って増加または減少させるFcドメインにおけるさらなる変異を含まない、本発明1033〜1036のいずれかの変異体。
[本発明1039]
前記変異体の血清中半減期を変更させるFcドメインにおけるさらなる変異を含まない、本発明1033〜1036のいずれかの変異体。
[本発明1040]
実施例36に開示された方法によって決定される前記変異体の標的非依存的な液相中での補体活性化を変化させるFcドメインにおけるさらなる変異を含まない、本発明1033〜1039のいずれかの変異体。
[本発明1041]
Fcドメインにおけるさらなる変異を含まない、本発明1033〜1040のいずれかの変異体。
[本発明1042]
1つの変異のみを含む、本発明1033〜1041のいずれかの変異体。
[本発明1043]
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345X／E430X、E345X／S440Y、E345X／S440W、E430X／S440YおよびE430X／S440Wに対応する群から選択されるアミノ酸残基における2つの変異の組み合わせを含む、本発明1033〜1042のいずれかの変異体。
[本発明1044]
免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの変異体であって、
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される第1の変異；ならびに
以下に対応する群から選択される第2の変異を含む、前記変異体：
（i）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するアミノ酸残基、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもなく、かつ、該第1の変異がS440YもしくはS440Wであるならば該第2の変異はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応するアミノ酸残基にある；
（ii）ヒトIgG1重鎖のFc領域における、K447D／Eに対応するか、もしくはK447K／R／Hおよび448Pに対応するアミノ酸残基；または
（iii）ヒトIgG1重鎖のFc領域における、K447D／Eに対応するか、もしくはK447K／R／Hおよび448K／R／Hおよび449Pに対応するアミノ酸残基。
[本発明1045]
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345RおよびE345Yに対応する群から選択される第1の変異、ならびにヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するアミノ酸残基における第2の変異を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、本発明1044の変異体。
[本発明1046]
K439に対応するアミノ酸残基における変異がK439D／Eであり、かつ、S440に対応するアミノ酸残基がS440K／Rである、本発明1045の変異体。
[本発明1047]
前記親ポリペプチドが、免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含む親抗体である、本発明1033〜1046のいずれかの変異体。
[本発明1048]
単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体から選択される、本発明1047の変異体。
[本発明1049]
免疫グロブリンの第1のCH2-CH3領域と第1の抗原結合領域とを含む第1のポリペプチドおよび免疫グロブリンの第2のCH2-CH3領域と第2の抗原結合領域とを含む第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体である親抗体の変異体であって、該第1および第2の抗原結合領域が、同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、かつ、該第1および／または第2のCH2-CH3領域が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含み、かつ
該第1のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択されるアミノ酸残基におけるさらなる変異を含み；かつ
該第2のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択されるアミノ酸残基におけるさらなる変異を含み、かつ、該第1のポリペプチドにおける該さらなる変異が、該第2のポリペプチドにおける該さらなる変異とは異なる、前記変異体。
[本発明1050]
（i）前記第1のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409に対応するアミノ酸残基におけるさらなる変異、例えばK409Rを含み；かつ
（ii）前記第2のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405に対応するアミノ酸残基におけるさらなる変異、例えばF405Lを含むか；または代替的に
（iii）該第1のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405に対応するアミノ酸残基におけるさらなる変異、例えばF405Lを含み；かつ
（iv）該第2のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409に対応するアミノ酸残基におけるさらなる変異、例えばK409Rを含む、
本発明1049の変異体。
[本発明1051]
薬物、毒素または放射性標識とコンジュゲートされており、例えばリンカーを介して毒素とコンジュゲートされている、本発明1033〜1050のいずれかの変異体。
[本発明1052]
融合タンパク質の一部である、本発明1033〜1051のいずれかの変異体。
[本発明1053]
ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgMまたはIgE抗体であり、任意でヒト完全長抗体、例えばヒト完全長IgG1抗体である、本発明1033〜1052のいずれかの変異体。
[本発明1054]
それぞれが免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの第1および第2の変異体を含む組成物であって、該第1および／または第2の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含む、前記組成物。
[本発明1055]
前記第1および／または第2の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含む、本発明1054の組成物。
[本発明1056]
前記第1および第2の変異体の両方が、同じであっても異なってもよい1つまたは複数の変異を含む、本発明1055の組成物。
[本発明1057]
前記第1の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含み、かつ
前記第2の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択されるアミノ酸残基における1つまたは複数の変異を含まない、本発明1055の組成物。
[本発明1058]
（i）前記第1の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における変異をさらに含み、かつ
（ii）前記第2の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における変異をさらに含み、ただし、該変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする；または（i）および（ii）が代替的に、
（iii）該第1の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における変異をさらに含み、ただし、該変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とし；かつ
（iv）該第2の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における変異をさらに含む；
であってもよい、本発明1054〜1057のいずれかの組成物。
[本発明1059]
ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置K439における前記変異がK439D／Eであり、かつ／またはヒトIgG1重鎖のFc領域における位置S440における前記変異がS440K／Rである、本発明1058の組成物。
[本発明1060]
（i）前記第1の変異体がプロドラッグをさらに含み、かつ
（ii）前記第2の変異体が、該第1の変異体上の該プロドラッグに対する活性化因子を含む；または（i）および（ii）が代替的に、
（iii）該第2の変異体がプロドラッグを含み、かつ
（iv）該第1の変異体が、該第2の変異体上の該プロドラッグに対する活性化因子を含む
であってもよい、本発明1054〜1059のいずれかの組成物。
[本発明1061]
前記第1および第2の親ポリペプチドが、それぞれが免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含む第1および第2の親抗体である、本発明1054〜1060のいずれかの組成物。
[本発明1062]
前記第1および第2の抗体がそれぞれ、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgMまたはIgE抗体であり、任意でそれぞれヒト完全長抗体、例えばそれぞれヒト完全長IgG1抗体である、本発明1061の組成物。
[本発明1063]
前記第1および第2の抗体がそれぞれ、単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体から選択される、本発明1062の組成物。
[本発明1064]
前記第1および／または第2の親抗体がそれぞれ、免疫グロブリンの第1のCH2-CH3領域と第1の抗原結合領域とを含む第1のポリペプチドおよび第2のCH2-CH3領域と第2の抗原結合領域とを含む第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体であり、該第1および第2の抗原結合領域が同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、かつ、該第1のCH2-CH3領域が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸変異を含み；かつ、該第2のCH2-CH3領域が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応する位置にさらなるアミノ酸変異を含み、かつ、該第1のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸変異が、該第2のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸変異とは異なる、本発明1063の組成物。
[本発明1065]
前記第1のCH2-CH3領域の前記さらなるアミノ酸変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409に対応する位置にあり、例えばK409Rであり；かつ、前記第2のCH2-CH3領域の前記さらなるアミノ酸変異が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405に対応する位置にあり、例えばF405Lである、本発明1064の組成物。
[本発明1066]
前記組成物の前記第1および第2の変異体が、同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合する、本発明1054〜1063のいずれかの組成物。
[本発明1067]
前記第1および第2の変異体の一方または両方が、薬物、毒素または放射性標識とコンジュゲートされており、例えば、リンカーを介して毒素とコンジュゲートされている、本発明1054〜1066のいずれかの組成物。
[本発明1068]
前記第1および第2の変異体の一方または両方が融合タンパク質の一部である、本発明1054〜1067のいずれかの組成物。
[本発明1069]
前記組成物の前記第1および／または第2の変異体が1つの変異のみを含む、本発明1054〜1063および1066〜1068のいずれかの組成物。
[本発明1070]
本発明1033〜1053のいずれかの変異体または本発明1054〜1069のいずれかの組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
[本発明1071]
治療法において同時に、別々にまたは逐次的に使用するための、本発明1033〜1053のいずれかにおいて定められた第1の変異体および第2の変異体を含むキット・オブ・パーツ。
[本発明1072]
癌などの疾患の治療のための、本発明1033〜1071のいずれかの変異体、組成物またはキット・オブ・パーツ。
[本発明1073]
本発明1033〜1071のいずれかの変異体、組成物またはキット・オブ・パーツを投与する段階を含む、ヒトにおける疾患の治療のための方法。
[本発明1074]
本発明1033〜1071のいずれかの変異体、組成物またはキット・オブ・パーツを投与する段階を含む、ヒトにおける癌の治療のための方法。
[本発明1075]
ヒトまたは他の哺乳動物の身体の少なくとも一部の画像化において用いるための、本発明1033〜1071のいずれかの変異体、組成物またはキット・オブ・パーツ。
[本発明1076]
本発明1033〜1071のいずれかの変異体、組成物またはキット・オブ・パーツを投与する段階を含む、ヒトまたは他の哺乳動物の身体の少なくとも一部を画像化するための方法。
本発明のこれらの局面および他の局面、特にポリペプチド変異体および抗体変異体のさまざまな使用および治療応用について、以下にさらに詳細に説明する。
[Invention 1001]
A method for enhancing complement dependent cytotoxicity (CDC) of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, comprising the following steps:
Introducing into the parent polypeptide a mutation in one or more amino acid residues selected from the group corresponding to E430X, E345X and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain.
[Invention 1002]
The present invention 1001, wherein the mutation in one or more amino acid residues is selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y and S440W in the Fc region of a human IgG1 heavy chain the method of.
[Invention 1003]
The method of any of claims 1001 or 1002, wherein said mutation in one or more amino acid residues is selected from the group corresponding to E430G, E430S, E345K and E345Q in the Fc region of a human IgG1 heavy chain.
[Invention 1004]
A method for enhancing CDC and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, comprising the following steps:
Introducing a mutation in one or more amino acid residues corresponding to E430X, E345X and S440W in the Fc region of human IgG1 heavy chain into the parent polypeptide.
[Invention 1005]
The method of 1004 of this invention wherein said mutation in one or more amino acid residues corresponds to E345R, E430T and E430F in the Fc region of a human IgG1 heavy chain.
[Invention 1006]
The method according to any one of the inventions 1001 to 1005, wherein the parent polypeptide is a parent antibody comprising an Fc domain of an immunoglobulin and an antigen-binding region.
[Invention 1007]
The method of the present invention 1006, wherein the parent antibody is a monospecific antibody, a bispecific antibody or a multispecific antibody.
[Invention 1008]
A first polypeptide comprising an immunoglobulin first CH2-CH3 region and a first antigen-binding region and a second polypeptide comprising an immunoglobulin second CH2-CH3 region and a second antigen-binding region; A method for enhancing the complement dependent cytotoxicity (CDC) of a parent antibody, which is a bispecific antibody comprising a peptide, comprising:
The first and second antigen binding regions bind to different epitopes on the same antigen or on different antigens, and the method is directed against the first and / or second CH2-CH3 regions, Introducing a mutation in one or more amino acid residues selected from the group corresponding to E430X, E345X, S440Y and S440W in the Fc region of the IgG1 heavy chain; and the first CH2-CH3 region comprises: A further amino acid mutation at a position selected from those corresponding to K409, T366, L368, K370, D399, F405 and Y407 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain; and the second CH2-CH3 region is human An additional amino acid mutation at a position selected from those corresponding to F405, T366, L368, K370, D399, Y407 and K409 in the Fc region of the IgG1 heavy chain; and the additional amino acid in the first CH2-CH3 region Mutations in the second CH2-CH3 region The method, which is different from an amino acid mutation.
[Invention 1009]
Wherein the mutation in one or more amino acid residues is selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain The method of invention 1008.
[Invention 1010]
The method of any of 1008 or 1009 of the invention, comprising introducing mutations into both the first and second polypeptides of the bispecific antibody.
[Invention 1011]
The further amino acid mutation of the first CH2-CH3 region is in a position corresponding to K409 in the Fc region of a human IgG1 heavy chain, for example K409R; and the further amino acid of the second CH2-CH3 region The method of any of the present invention 1008-1010, wherein the mutation is at a position corresponding to F405 in the Fc region of a human IgG1 heavy chain, eg, F405L.
[Invention 1012]
Introducing a mutation other than S440Y and S440W at one or more positions, and (i) a mutation in each of the amino acid residues corresponding to K439 and S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, provided that S440 A mutation, provided that the mutation in is not S440Y or S440W,
(Ii) mutations in each of the amino acid residues corresponding to K447 and 448 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, for example K447K / R / H and 448E / D, preferably human IgG1 heavy chain in the Fc region of the human IgG1 heavy chain (Iii) mutations in each of the amino acid residues corresponding to K447, 448 and 449 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, eg, K447D / E, 448K in the Fc region of the human IgG1 heavy chain / R / H and 449P, preferably K447E, 448K and 449P in the Fc region of the human IgG1 heavy chain
The method according to any one of the inventions 1001 to 1011, further comprising the step of introducing
[Invention 1013]
Introducing a mutation other than S440Y and S440W at one or more positions, and further introducing a mutation into each of the amino acid residues corresponding to K439 and / or S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, However, the method of the present invention 1012 provided that the mutation in S440 is neither S440Y nor S440W.
[Invention 1014]
The mutation at a position corresponding to K439 in the Fc region of human IgG1 heavy chain is K439D / E, and / or the mutation at a position corresponding to S440 in the Fc region of human IgG1 heavy chain is S440K / R, The method of the invention 1013.
[Invention 1015]
A method of enhancing the complement dependent cytotoxicity (CDC) of a combination of at least a first and a second parent polypeptide, wherein the at least first and second parent polypeptides are each an immunoglobulin Fc domain and One or more selected from the group corresponding to E430X, E345X, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain with respect to the at least first and / or second parent polypeptide. The method comprising introducing mutations in the amino acid residues of
[Invention 1016]
For said at least first and / or second parent polypeptide, selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of human IgG1 heavy chain The method of the invention 1015 comprising the step of introducing mutations in one or more of the amino acid residues that are made.
[Invention 1017]
The method of the invention 1016 comprising the step of introducing mutations, which may be the same or different, into both the first and second parent polypeptides.
[Invention 1018]
(I) 1 selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain with respect to the first parent polypeptide Introducing mutations in one or more amino acid residues;
(Ii) including mutations in one or more amino acid residues selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of human IgG1 heavy chain Providing the second parent polypeptide,
The method of the present invention 1016, comprising:
[Invention 1019]
The mutation at one or more positions is different from S440Y and S440W, and the method comprises:
(I) introducing a second mutation into the amino acid residue corresponding to position K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain with respect to the first parent polypeptide; and (ii) the second parent poly A step of introducing a second mutation into the amino acid residue corresponding to S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain with respect to the peptide, provided that the mutation is neither S440Y nor S440W Further comprising steps (i) and (ii)
(Iii) a step of introducing a second mutation into an amino acid residue corresponding to position S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain with respect to the first parent polypeptide, provided that the mutation is S440Y Stage, provided that it is not S440W;
(Iv) The present invention may include a step of introducing a second mutation into an amino acid residue corresponding to position K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain with respect to the second parent polypeptide. Either way.
[Invention 1020]
The mutation in the position corresponding to K439 in the Fc region of human IgG1 heavy chain is K439D / E and / or the mutation in the position corresponding to S440 in the Fc region of human IgG1 heavy chain is S440K / R The method of invention 1019.
[Invention 1021]
The method of any of the inventions 1015-1020, wherein the first and second parent polypeptides are first and second parent antibodies, each comprising an immunoglobulin Fc domain and an antigen binding region.
[Invention 1022]
The method of the present invention 1021, wherein the first and second parent antibodies are monospecific, bispecific or multispecific antibodies.
[Invention 1023]
The first and / or second parent antibody comprises a first polypeptide comprising an immunoglobulin first CH2-CH3 region and a first antigen-binding region and a second CH2-CH3 region and a second A bispecific antibody comprising a second polypeptide comprising an antigen binding region, wherein the first and second antigen binding regions bind to different epitopes on the same antigen or on different antigens, and The first CH2-CH3 region comprises an additional amino acid mutation at a position selected from those corresponding to K409, T366, L368, K370, D399, F405 and Y407 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain; and Two CH2-CH3 regions contain additional amino acid mutations at positions selected from those corresponding to F405, T366, L368, K370, D399, Y407 and K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain; and The additional amino acid mutation in the CH2-CH3 region of the second CH2-CH3 region The method of the present invention 1022, which differs from the amino acid mutation
[Invention 1024]
The first CH2-CH3 region comprises a further amino acid mutation, for example K409R, at a position corresponding to K409 in the Fc region of a human IgG1 heavy chain, and the second CH2-CH3 region is a human IgG1 heavy chain The method of the invention 1023 comprising an additional amino acid mutation, eg F405L, in the position corresponding to F405 in the Fc region.
[Invention 1025]
The method of any one of the inventions 1001-1003 and 1006-1024, wherein the parent polypeptide or the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) of the parent antibody is not altered.
[Invention 1026]
The method of any of 1001 to 1025 of the invention, wherein the binding of the parent polypeptide or the parent antibody to the neonatal Fc receptor (FcRn) determined by the method disclosed in Example 34 is not altered.
[Invention 1027]
More than 30% of the binding of the parent polypeptide or the parent antibody to the neonatal Fc receptor (FcRn) as determined by the change in absorbance at OD405nm, as determined by the method disclosed in Example 34, for example The method of any of the inventions 1001-1025 which does not increase or decrease by more than 20%, 10% or 5%.
[Invention 1028]
Does not enhance the apparent affinity of the parent polypeptide or the parent antibody to the mouse neonatal Fc receptor (FcRn) by more than 0.5-fold, as determined by the method disclosed in Example 34, or the parent polypeptide or The method according to any of 1001 to 1025 of the invention, wherein the apparent affinity of the parent antibody for mouse FcRn is not reduced more than 2-fold.
[Invention 1029]
The method of any of the inventions 1001-1028, wherein the plasma clearance rate of the parent polypeptide or parent antibody determined by the method disclosed in Example 37 is not altered.
[Invention 1030]
Enhancing the plasma clearance rate of the parent polypeptide or antibody determined by the method disclosed in Example 37 by more than 3.0 times, for example, by 2.5 times, 2.0 times, 1.5 times or 1.2 times Or any of the methods of the invention 1001-1028.
[Invention 1031]
The method of any of the inventions 1001-1030, wherein the variant activation of the variant in the target-independent liquid phase determined by the method disclosed in Example 36 is not altered.
[Invention 1032]
The method of any one of 1001 to 1031 of the present invention, wherein the plasma half-life of the parent polypeptide or the parent antibody is not altered.
[Invention 1033]
A variant of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y and S440W in the Fc region of a human IgG1 heavy chain Said variant comprising one or more mutations selected from: provided that the variant does not contain further mutations in the Fc domain that alter binding of the variant to the neonatal Fc receptor (FcRn).
[Invention 1034]
A variant of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y and S440W in the Fc region of a human IgG1 heavy chain To the neonatal Fc receptor (FcRn) of the mutant as measured by the change in absorbance at OD405nm, as determined by the method disclosed in Example 34, comprising one or more mutations selected from Said mutant, provided that it does not contain further mutations in the Fc domain that increase or decrease binding by more than 30%, for example more than 20%, 10% or 5%.
[Invention 1035]
The variant of any of the invention 1033 or 1034, wherein the one or more of said mutations is selected from the group corresponding to E430G, E430S, E345K and E345Q in the Fc region of a human IgG1 heavy chain.
[Invention 1036]
The variant of any of the present invention 1033-1035, wherein the variant does not comprise a further mutation in the Fc domain that alters antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) of said variant.
[Invention 1037]
The variant of any of the present invention 1033-1036, comprising no additional mutations in the Fc domain that alter the plasma clearance rate of the variant as determined by the method disclosed in Example 37.
[Invention 1038]
Further increase in the plasma clearance rate of the mutant as determined by the method disclosed in Example 37 by more than 3.0 fold, for example 2.5 fold, 2.0 fold, 1.5 fold or 1.2 fold or more in the Fc domain The mutant of any one of the present invention 1033-1036, which does not contain a mutation.
[Invention 1039]
The variant of any of the present invention 1033-1036, which does not comprise a further mutation in the Fc domain that alters the serum half-life of the variant.
[Invention 1040]
Any of the invention 1033-1039, comprising no further mutations in the Fc domain that alter complement activation in the target-independent fluid phase of the mutant as determined by the method disclosed in Example 36 Mutants.
[Invention 1041]
The variant of any of the present invention 1033-1040, comprising no further mutations in the Fc domain.
[Invention 1042]
The variant of any of the present invention 1033-1041, comprising only one mutation.
[Invention 1043]
The invention 1033 comprising a combination of two mutations in the amino acid residues selected from the group corresponding to E345X / E430X, E345X / S440Y, E345X / S440W, E430X / S440Y and E430X / S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain A variant of any of ~ 1042.
[Invention 1044]
A variant of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, comprising:
A first mutation selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain; and selected from the group corresponding to Said variant comprising a second mutation:
(I) amino acid residues corresponding to K439 and S440 in the Fc region of human IgG1 heavy chain, provided that the mutation in S440 is neither S440Y nor S440W, and the first mutation is S440Y or
(Ii) amino acid residues corresponding to K447D / E or corresponding to K447K / R / H and 448P in the Fc region of human IgG1 heavy chain; or (iii) K447D / in the Fc region of human IgG1 heavy chain Amino acid residues corresponding to E or corresponding to K447K / R / H and 448K / R / H and 449P.
[Invention 1045]
Corresponds to the first mutation selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R and E345Y in the Fc region of human IgG1 heavy chain, and K439 and S440 in the Fc region of human IgG1 heavy chain The variant of the present invention 1044 comprising a second mutation in the amino acid residue to be obtained provided that the mutation in S440 is not S440Y or S440W.
[Invention 1046]
The variant of the present invention 1045, wherein the mutation in the amino acid residue corresponding to K439 is K439D / E, and the amino acid residue corresponding to S440 is S440K / R.
[Invention 1047]
The variant of any one of the present invention 1033 to 1046, wherein the parent polypeptide is a parent antibody comprising an immunoglobulin Fc domain and an antigen-binding region.
[Invention 1048]
The variant of the present invention 1047, selected from monospecific, bispecific or multispecific antibodies.
[Invention 1049]
A first polypeptide comprising an immunoglobulin first CH2-CH3 region and a first antigen-binding region and a second polypeptide comprising an immunoglobulin second CH2-CH3 region and a second antigen-binding region; A variant of a parent antibody that is a bispecific antibody comprising a peptide, wherein the first and second antigen binding regions bind to different epitopes on the same antigen or on different antigens; and And / or the second CH2-CH3 region is selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain or A further mutation in an amino acid residue comprising a plurality of mutations and wherein the first polypeptide is selected from those corresponding to K409, T366, L368, K370, D399, F405 and Y407 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain And wherein the second polypeptide is a Fc region of a human IgG1 heavy chain Further mutations in amino acid residues selected from those corresponding to F405, T366, L368, K370, D399, Y407 and K409, and wherein the further mutation in the first polypeptide comprises the second poly Said variant different from said further mutation in a peptide.
[Invention 1050]
(I) the first polypeptide comprises a further mutation in the amino acid residue corresponding to K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, for example K409R; and (ii) the second polypeptide comprises human IgG1 heavy A further mutation in an amino acid residue corresponding to F405 in the Fc region of the chain, eg F405L; or alternatively (iii) the first polypeptide is an amino acid corresponding to F405 in the Fc region of a human IgG1 heavy chain A further mutation at a residue, for example F405L; and (iv) the second polypeptide comprises a further mutation at an amino acid residue corresponding to K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, for example K409R;
The variant of the present invention 1049.
[Invention 1051]
A variant of any of the invention 1033-1050 which is conjugated to a drug, toxin or radioactive label, eg conjugated to a toxin via a linker.
[Invention 1052]
The variant of any of the present invention 1033-1051, which is part of a fusion protein.
[Invention 1053]
The variant of any of the present invention 1033-1052, which is a human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM or IgE antibody, optionally a human full length antibody, eg, a human full length IgG1 antibody.
[Invention 1054]
A composition comprising first and second variants of a parent polypeptide each comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, wherein the first and / or second variant comprises a human IgG1 heavy chain The composition comprising one or more mutations selected from the group corresponding to E430X, E345X, S440Y and S440W in the Fc region of:
[Invention 1055]
The first and / or second variant is selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain Or the composition of the present invention 1054 comprising a plurality of mutations.
[Invention 1056]
The composition of the present invention 1055 wherein both the first and second variants comprise one or more mutations which may be the same or different.
[Invention 1057]
Said first variant comprises one or more mutations selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of human IgG1 heavy chain And the second variant is in an amino acid residue selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain The composition of the present invention 1055 which does not contain one or more mutations.
[Invention 1058]
(I) the first mutant further comprises a mutation at a position corresponding to K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain; and (ii) the second mutant is in the Fc region of the human IgG1 heavy chain. Further comprising a mutation at a position corresponding to S440, provided that the mutation is neither S440Y nor S440W; or (i) and (ii) alternatively
(Iii) the first variant further comprises a mutation at a position corresponding to S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, provided that the mutation is not S440Y or S440W; and (iv) the The second variant further comprises a mutation at a position corresponding to K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain;
The composition of any of the present invention 1054-1057.
[Invention 1059]
The composition of the invention 1058 wherein the mutation at position K439 in the Fc region of a human IgG1 heavy chain is K439D / E and / or the mutation at position S440 in the Fc region of a human IgG1 heavy chain is S440K / R.
[Invention 1060]
(I) the first variant further comprises a prodrug, and (ii) the second variant comprises an activator for the prodrug on the first variant; or (i) And (ii) is alternatively
(Iii) the second variant comprises a prodrug, and (iv) the first variant may comprise an activator for the prodrug on the second variant, The composition of any of the present invention 1054-1059.
[Invention 1061]
The composition of any of the present invention 1054-1060, wherein the first and second parent polypeptides are first and second parent antibodies, respectively, comprising an immunoglobulin Fc domain and an antigen binding region.
[Invention 1062]
Said first and second antibodies are each human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM or IgE antibody, optionally each human full length antibody, for example each human full length IgG1 antibody The composition of the present invention 1061.
[Invention 1063]
The composition of the present invention 1062 wherein said first and second antibodies are each selected from monospecific, bispecific or multispecific antibodies.
[Invention 1064]
The first and / or second parent antibody comprises a first polypeptide comprising a first CH2-CH3 region and a first antigen-binding region of an immunoglobulin and a second CH2-CH3 region and a second, respectively. A bispecific antibody comprising a second polypeptide comprising a plurality of antigen-binding regions, wherein the first and second antigen-binding regions bind to different epitopes on the same or different antigens, and The first CH2-CH3 region comprises an additional amino acid mutation at a position selected from those corresponding to K409, T366, L368, K370, D399, F405 and Y407 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain; and Two CH2-CH3 regions contain additional amino acid mutations at positions corresponding to F405, T366, L368, K370, D399, Y407 and K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, and the first CH2-CH3 region Wherein said further amino acid mutation in said second CH2-CH3 region The composition of the present invention 1063 that differs from a mutation.
[Invention 1065]
The further amino acid mutation of the first CH2-CH3 region is in a position corresponding to K409 in the Fc region of a human IgG1 heavy chain, for example K409R; and the further amino acid of the second CH2-CH3 region The composition of the invention 1064 wherein the mutation is in a position corresponding to F405 in the Fc region of a human IgG1 heavy chain, such as F405L.
[Invention 1066]
The composition of any of the present invention 1054-1063, wherein said first and second variants of said composition bind to different epitopes on the same or different antigen.
[Invention 1067]
Any of the present invention 1054-1066, wherein one or both of said first and second variants are conjugated to a drug, toxin or radiolabel, eg, conjugated to a toxin via a linker Composition.
[Invention 1068]
The composition of any of the present invention 1054-1067, wherein one or both of the first and second variants is part of a fusion protein.
[Invention 1069]
The composition of any of the present invention 1054-1063 and 1066-1068, wherein the first and / or second variant of the composition comprises only one mutation.
[Invention 1070]
A composition comprising a variant of any of the inventions 1033-1053 or any of the compositions of the invention 1054-1069 and a pharmaceutically acceptable carrier.
[Invention 1071]
A kit of parts comprising a first variant and a second variant as defined in any of the inventions 1033-1053 for simultaneous, separate or sequential use in therapy.
[Invention 1072]
The variant, composition or kit of parts of any of the invention 1033-1071 for the treatment of diseases such as cancer.
[Invention 1073]
A method for the treatment of a disease in a human comprising administering a variant, composition or kit of parts of any of the invention 1033-1071.
[Invention 1074]
A method for the treatment of cancer in a human comprising administering a variant, composition or kit of parts of any of the invention 1033-1071.
[Invention 1075]
A variant, composition or kit-of-part of any of the invention 1033-1071 for use in imaging at least a portion of a human or other mammalian body.
[Invention 1076]
A method for imaging at least a part of a human or other mammalian body comprising administering a variant, composition or kit of parts of any of the invention 1033-1071.
These and other aspects of the invention, in particular various uses and therapeutic applications of polypeptide variants and antibody variants, are described in further detail below.
発明の詳細な説明
本明細書で説明するように、驚いたことに、Fc：C1q結合に直接的には関与しないアミノ酸における変異は、それにもかかわらず、抗体のCDCを増強することができ、さらに抗体の他のFc媒介性エフェクター機能も向上させることができる。このことは、IgG1抗体などの抗体分子が、後にC1qによる結合を受けるオリゴマー構造を形成しうるという仮説を裏づける。さらに、ある種の変異はCDC誘導を低下させることが見いだされているものの、同一または異なる抗体分子におけるそのような変異のある種の組み合わせはCDC誘導の回復をもたらし、かつ、抗体のオリゴマー形成に対するさらなる特異性を示し、それによって、より特異的なCDC誘導を促進した。CDC応答を増強する具体的な変異についても、実施例に示されているように、ADCC応答の向上、結合力の増強、細胞内移行の増強、およびマウス腫瘍モデル系におけるインビボ活性によって特徴づけた。これらの発見は、増強されたCDC誘導能力、より選択的なCDC誘導性、および／または他の向上したエフェクター機能を有する新規な抗体ベースの治療薬を可能にする。
Detailed Description of the Invention As explained herein, surprisingly, mutations in amino acids that are not directly involved in Fc: C1q binding can nevertheless enhance the CDC of an antibody, Furthermore, other Fc-mediated effector functions of the antibody can be improved. This supports the hypothesis that antibody molecules such as IgG1 antibodies can form oligomeric structures that are later bound by C1q. In addition, while certain mutations have been found to reduce CDC induction, certain combinations of such mutations in the same or different antibody molecules result in recovery of CDC induction and are directed against antibody oligomerization. Showed additional specificity, thereby promoting more specific CDC induction. Specific mutations that enhance the CDC response were also characterized by improved ADCC response, enhanced binding, enhanced intracellular translocation, and in vivo activity in mouse tumor model systems, as demonstrated in the Examples. . These discoveries allow new antibody-based therapeutics with enhanced CDC inducing ability, more selective CDC inducibility, and / or other improved effector functions.
本発明のポリペプチド変異体（抗体変異体を含む）はすべて、結合領域と、IgG1におけるアミノ酸残基E345〜S440に対応するセグメントに1つまたは複数の変異を含む完全長または免疫グロブリンの部分的Fcドメインとを含む。理論に限定されることはないが、同定された変異は、本明細書で「単一変異体」、「二重変異体」および「混合変異体」と称する、図1に模式的に表した3種類の異なる原理に基づいて、より有効な、および／またはより特異的なCDC誘導をもたらすと考えられる。 All of the polypeptide variants (including antibody variants) of the invention are full length or partial immunoglobulins containing one or more mutations in the binding region and the segment corresponding to amino acid residues E345-S440 in IgG1. Including Fc domain. Without being limited to theory, the identified mutations are schematically represented in FIG. 1, referred to herein as “single mutant”, “double mutant” and “mixed mutant”. Based on three different principles, it is believed to result in more effective and / or more specific CDC induction.
本発明の変異体の向上したC1q効果および／またはCDC効果は、主として、抗原が固定されずに流動膜に存在する細胞ベースアッセイのような、抗体オリゴマー形成が可能なアッセイでのみ検出可能である。さらに、これらの効果が、より安定した抗体オリゴマーに起因し、C1qの直接結合部位の改変に起因するのではないことを、図1Cに示した原理にしたがって検証することができる。 The improved C1q and / or CDC effects of the variants of the present invention can only be detected mainly in assays that are capable of forming antibody oligomers, such as cell-based assays in which the antigen is not immobilized and is present in the flow membrane. . Furthermore, it can be verified according to the principle shown in FIG. 1C that these effects are caused by a more stable antibody oligomer and not by modification of the direct binding site of C1q.
定義
「単一変異体」という用語は、親ポリペプチドまたは抗体と比較してCDCが増強されておりかつ他のエフェクター機能も増強されていてもよい本発明の変異体と解釈されるものとする。
Definitions The term "single mutant" shall be construed as variant of a parent polypeptide or antibody have been enhanced CDC is compared to and other effector functions present invention, which may be enhanced .
「二重変異体」という用語は、前記セグメントに少なくとも2つの変異を含み、かつ、当該少なくとも2つの変異のうち1つのみを含む変異体と比較して、CDCが向上しておりかつ他のエフェクター機能も増強されていてもよい変異体と解釈されるものとする。 The term “double mutant” refers to an improved CDC compared to a mutant that contains at least two mutations in the segment and contains only one of the at least two mutations, and other It shall be construed as a variant that may also have an enhanced effector function.
「混合変異体」という用語は、前記セグメント中の異なるアミノ酸残基に変異を含む、同じまたは異なるポリペプチドまたは抗体の第2の変異体と組み合わせて用いた場合に、その変異体、第2の変異体、および親ポリペプチドまたは抗体単体のうち1つまたは複数と比較して、CDCの向上をもたらしかつ任意で他のエフェクター機能の増強をももたらす変異体と解釈されるものとする。 The term “mixed variant” when used in combination with a second variant of the same or different polypeptide or antibody, which contains a mutation at a different amino acid residue in the segment, Variants and variants that result in improved CDC and optionally also enhance other effector functions compared to one or more of the parent polypeptide or antibody alone are to be construed.
「免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含むポリペプチド」という用語は、本発明の文脈において、免疫グロブリンのFcドメインと、例えば細胞、細菌またはビリオンの表面に存在するポリペプチドなどの任意の分子と結合しうる結合領域とを含むポリペプチドを指す。免疫グロブリンのFcドメインは、免疫グロブリンの2つのCH2-CH3領域と、連結領域（例えばヒンジ領域）とを含み、典型的にはパパイン（当業者には公知である）による抗体の消化後に生じると考えられる、抗体の断片と定義される。抗体重鎖の定常ドメインによって抗体アイソタイプ（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、またはIgE）が定義される。Fcドメインは、Fc受容体と呼ばれる細胞表面受容体および補体系のタンパク質とともに抗体のエフェクター機能を媒介する。結合領域は、細胞、細菌、またはビリオンと結合しうるタンパク質、タンパク質リガンド、受容体、抗原結合領域またはリガンド結合領域などのポリペプチド配列であってもよい。結合領域が例えば受容体である場合には、「免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含むポリペプチド」を、免疫グロブリンのFcドメインと前記結合領域との融合タンパク質として調製することができる。結合領域が抗原結合領域である場合には、「免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含むポリペプチド」は、キメラ、ヒト化、もしくはヒト抗体または重鎖のみの抗体、またはScFv-Fc融合物のような抗体であってもよい。免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含むポリペプチドは、典型的には、連結領域（例えばヒンジ領域）と免疫グロブリンの重鎖の2つのCH2-CH3領域とを含み、それ故、「免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含むポリペプチド」は、「免疫グロブリンの少なくとも1つのFcドメインと結合領域とを含むポリペプチド」であってもよい。「免疫グロブリンのFcドメイン」とは、本発明の文脈において、例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgGA2、IgMまたはIgEといった、抗体のサブタイプに応じた連結領域、例えばヒンジ、ならびに免疫グロブリンのCH2およびCH3領域が存在することを意味する。当該ポリペプチドは、ヒト起源のものに限定されず、任意の起源（例えば、マウスまたはカニクイザル起源）のものであってもよい。 The term “polypeptide comprising an Fc domain of an immunoglobulin and a binding region” refers in the context of the present invention to any molecule such as an Fc domain of an immunoglobulin and a polypeptide present on the surface of a cell, bacteria or virion, for example. And a binding region that can bind to the polypeptide. An immunoglobulin Fc domain contains two CH2-CH3 regions of an immunoglobulin and a linking region (eg, a hinge region), typically occurring after digestion of an antibody with papain (known to those skilled in the art). Possible antibody fragments are defined. The antibody isotype (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD, or IgE) is defined by the constant domain of the antibody heavy chain. The Fc domain mediates the effector functions of antibodies along with cell surface receptors called Fc receptors and proteins of the complement system. The binding region may be a polypeptide sequence such as a protein, protein ligand, receptor, antigen binding region or ligand binding region that can bind to cells, bacteria, or virions. When the binding region is, for example, a receptor, a “polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region” can be prepared as a fusion protein of the immunoglobulin Fc domain and the binding region. Where the binding region is an antigen binding region, a “polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and binding region” refers to a chimeric, humanized, or human antibody or heavy chain only antibody, or ScFv-Fc fusion. An antibody such as A polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region typically comprises a linking region (eg, a hinge region) and the two CH2-CH3 regions of an immunoglobulin heavy chain, and thus “immunoglobulin”. The “polypeptide comprising an Fc domain and a binding region” may be “a polypeptide comprising at least one Fc domain of an immunoglobulin and a binding region”. “Immunoglobulin Fc domain” means in the context of the present invention a linking region, eg a hinge, depending on the subtype of the antibody, eg human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgGA2, IgM or IgE. As well as the CH2 and CH3 regions of an immunoglobulin. The polypeptide is not limited to being of human origin and may be of any origin (eg, mouse or cynomolgus monkey origin).
「CH2領域」または「CH2ドメイン」という用語は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリンのCH2領域を指すことを意図している。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH2領域は、EU付番方式によるアミノ酸228〜340に対応する。しかし、CH2領域が、本明細書に記載したような他のサブタイプの任意のものであってもよい。 The term “CH2 region” or “CH2 domain”, as used herein, is intended to refer to the CH2 region of an immunoglobulin. Thus, for example, the CH2 region of human IgG1 antibody corresponds to amino acids 228-340 according to the EU numbering system. However, the CH2 region may be any of the other subtypes as described herein.
「CH3領域」または「CH3ドメイン」という用語は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリンのCH3領域を指すことを意図している。したがって、例えば、ヒトIgG1抗体のCH3領域は、EU付番方式によるアミノ酸341〜447に対応する。しかし、CH3領域が、本明細書に記載したような他のサブタイプの任意のものであってもよい。 The term “CH3 region” or “CH3 domain”, as used herein, is intended to refer to the CH3 region of an immunoglobulin. Thus, for example, the CH3 region of human IgG1 antibody corresponds to amino acids 341 to 447 according to the EU numbering system. However, the CH3 region may be any of the other subtypes as described herein.
「免疫グロブリン」という用語は、1対の軽（L）低分子量鎖および1対の重（H）鎖という2対のポリペプチド鎖からなり、その4つすべてがジスルフィド結合によって相互接続されている可能性のある、構造的に類縁性のある糖タンパク質のクラスを指す。免疫グロブリンの構造は詳細に特徴づけられている。例えば、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)）を参照。手短に述べると、各重鎖は典型的には、重鎖可変領域（本明細書ではVHと略記）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は典型的には、CH1、CH2およびCH3という3つのドメインで構成される。重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」におけるジスルフィド結合を介して相互接続されている。各軽鎖は典型的には、軽鎖可変領域（本明細書ではVLと略記）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は典型的には、CLという1つのドメインで構成される。VH領域およびVL領域を、フレームワーク領域（FR）と称される、より保存された領域の間に散在する、相補性決定領域（CDR）とも称される超可変性の領域（または超可変領域、これらは構造的に画定されたループの配列および／または形態の点で超可変性でありうる）にさらに細分することもできる。各VHおよびVLは典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置された3つのCDRおよび4つのFRで構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)）も参照。別の記述があるか、または文脈と食い違う場合を除き、定常領域配列のアミノ酸は、本明細書において、EUインデックス（Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)に記載）に従って番号付けされている。 The term "immunoglobulin" consists of two pairs of polypeptide chains, a pair of light (L) low molecular weight chains and a pair of heavy (H) chains, all four of which are interconnected by disulfide bonds. Refers to a possible class of structurally related glycoproteins. The structure of the immunoglobulin has been characterized in detail. See, for example, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Briefly, each heavy chain is typically comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region is typically comprised of three domains, CH1, CH2 and CH3. The heavy chains are interconnected via disulfide bonds in so-called “hinge regions”. Each light chain is typically comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region. The light chain constant region is typically comprised of one domain, CL. Hypervariable regions (or hypervariable regions), also called complementarity determining regions (CDRs), interspersed between more conserved regions, called framework regions (FR), and VH and VL regions , Which may be hypervariable in terms of structurally defined loop arrangement and / or morphology). Each VH and VL is typically composed of three CDRs and four FRs arranged in the following order from the amino terminus to the carboxy terminus: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901 917 (1987)). Unless otherwise stated or contradicted by context, the constant region sequence amino acids are referred to herein by the EU index (Kabat, EA et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition-US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)).
「抗体」（Ab）という用語は、本発明の文脈において、典型的な生理的条件下で、意味のある期間、例えば少なくとも約30分、少なくとも約45分、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、少なくとも約8時間、少なくとも約12時間、約24時間もしくはそれより長い、約48時間もしくはそれより長い、約3日、4日、5日、6日、7日もしくはそれより長い日数など、または任意の他の妥当な機能的に定められた期間（例えば、抗原に対する抗体結合に伴う生理的応答を誘導、促進、増強および／もしくは調節するのに十分な時間、ならびに／または抗体がエフェクター活性を動因するのに十分な時間）の半減期で抗原と特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはそれらのいずれかの派生物を指す。本発明の抗体は、免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含む。抗体は一般に、2つのCH2-CH3領域と1つの連結領域（例えばヒンジ領域）とを含み、例えば少なくとも1つのFcドメインを含む。したがって、本発明の抗体は1つのFc領域と1つの抗原結合領域を含みうる。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域または「Fc」領域は、免疫系のさまざまな細胞（例えばエフェクター細胞）および補体系の成分（例えば補体活性化の古典的経路における第一成分であるC1q）を含む、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介しうる。また、抗体が、二重特異性抗体または類似の分子などの多重特異性抗体であってもよい。「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも2つの異なる、典型的には重なり合わないエピトープに対する特異性を有する抗体を指す。そのようなエピトープは、同一の標的にあってもよく、または異なる標的にあってもよい。エピトープが異なる標的にある場合、そのような標的は同一の細胞にあってもよく、または異なる細胞もしくは細胞種にあってもよい。上述の通り、別の記述があるか、または文脈と明らかに食い違う場合を除き、本明細書における抗体という用語は、Fc領域の少なくとも一部分を含み、かつ抗原と特異的に結合する能力を保っている抗体の断片を含む。そのような断片は、公知の任意の手法、例えば酵素的切断、ペプチド合成および組換え発現の手法などによって得ることができる。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片によって果たされうることは示されている。「Ab」または「抗体」という用語の範囲に含まれる結合性断片の例には、一価抗体（GenmabによるWO 007059782号に記載）；2つの重鎖のみからなり、例えばラクダ科動物などにおいて天然に存在する重鎖抗体（例えば、Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446)；ThioMab（Roche、WO2011069104号）、非対称性の二重特異性抗体様分子である鎖交換組換えドメイン（strand-exchange engineered domain）（SEEDまたはSeed-body）（Merck、WO2007110205号）；Triomab（Fresenius、Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219）；FcΔAdp（Regeneron、WO2010151792号）、Azymetric Scaffold（Zymeworks／Merck、WO2012/058768号）、mAb-Fv（Xencor、WO2011/028952号）、二重可変ドメイン免疫グロブリン（Abbott、DVD-Ig、米国特許第7,612,181号）；二重ドメイン双頭抗体（Unilever；Sanofi Aventis、WO20100226923号）、ジ-ダイアボディ（Di-diabody）（ImClone／Eli Lilly）、ノブ・イントゥ・ホール（Knobs-into-holes）抗体フォーマット（Genentech、WO9850431号）；デュオボディ（DuoBody）（Genmab、WO 2011/131746号）；静電ステアリング（Electrostatic steering）抗体フォーマット（Amgen、EP1870459号およびWO 2009089004号；Chugai、US201000155133号；Oncomed、WO 2010129304A2号）；二重特異性IgG1およびIgG2（Rinat neurosciences Corporation、WO11143545号）、CrossMAb（Roche、WO2011117329号）、LUZ-Y（Genentech）、Biclonic（Merus）、二重標的指向性ドメイン抗体（GSK／Domantis）、2つの標的を認識するツー・イン・ワン（Two-in-one）抗体（Genentech、NovImmune）、架橋Mab（Cross-linked Mab）（Karmanos Cancer Center）、CovX-body（CovX／Pfizer）、IgG様二重特異性（ImClone／Eli Lilly、Shen, X, et al. J Immunol Methods, 2007. 318(1-2): p. 65-74）、ならびにDIG-bodyおよびPIG-body（Pharmabcine）、ならびに二重親和性再標的指向性（retargeting）分子（Fc-DARTまたはIg-DART、Macrogenicsによる、WO／2008／157379号、WO／2010／080538号）、Zybody（Zyngenia）、共通の軽鎖（Crucell／Merus、US7262028号）または共通の重鎖（NovImmuneによるκλBody）を用いるアプローチ、さらには、ZymoGenetics／BMSによるBsAbのように、ポリペプチド配列をFcドメインを含有する抗体断片と融合させたものを含む、scFv融合物のような融合タンパク質）、Biogen IdecによるHERCULES（US007951918号）、Emergent BioSolutions／TrubionによるSCORPION、Ts2Ab（MedImmune／AZ（Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009. 393(3): p. 672-92）、NovartisによるscFv融合物、Changzhou Adam Biotech IncによるscFv融合物（CN 102250246号）、RocheによるTvAb（WO 2012025525号、WO 2012025530号）、f-StarによるmAb2（WO2008/003116号）および二重scFv融合物が非限定的に含まれる。また、抗体という用語が、別に指定する場合を除き、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ヒトモノクローナル抗体など）、抗体混合物（組換えポリクローナル体）、例えばSymphogenおよびMerusによって開発された技術によって作製されたもの（Oligoclonics）、ならびに抗体様ポリペプチド、例えばキメラ抗体およびヒト化抗体なども含むことが理解されるべきである。作製される抗体は、可能性として任意のアイソタイプを有しうる。 The term “antibody” (Ab) in the context of the present invention, under typical physiological conditions, has a meaningful period of time, eg at least about 30 minutes, at least about 45 minutes, at least about 1 hour, at least about 2 hours. At least about 4 hours, at least about 8 hours, at least about 12 hours, about 24 hours or longer, about 48 hours or longer, about 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days or more Such as long days, or any other reasonable functionally defined period of time (e.g., sufficient time to induce, promote, enhance and / or modulate a physiological response associated with antibody binding to an antigen, and / or An immunoglobulin molecule, fragment of an immunoglobulin molecule, or any group thereof that has the ability to specifically bind an antigen with a half-life of sufficient time for the antibody to drive effector activity) It refers to things. The antibody of the present invention comprises an Fc domain of an immunoglobulin and an antigen binding region. An antibody generally comprises two CH2-CH3 regions and one linking region (eg, a hinge region), eg, at least one Fc domain. Accordingly, the antibody of the present invention may comprise one Fc region and one antigen binding region. The variable regions of the heavy and light chains of an immunoglobulin molecule contain binding domains that interact with antigens. The constant region or “Fc” region of an antibody contains various cells of the immune system (eg, effector cells) and components of the complement system (eg, C1q, which is the first component in the classical pathway of complement activation). Or it may mediate the binding of an immunoglobulin to a factor. The antibody may also be a multispecific antibody such as a bispecific antibody or similar molecule. The term “bispecific antibody” refers to an antibody having specificity for at least two different, typically non-overlapping epitopes. Such epitopes may be on the same target or on different targets. Where the epitopes are on different targets, such targets may be on the same cell or on different cells or cell types. As noted above, unless otherwise stated or clearly contradicted by context, the term antibody herein includes at least a portion of the Fc region and retains the ability to specifically bind to an antigen. Antibody fragments. Such fragments can be obtained by any known technique such as enzymatic cleavage, peptide synthesis and recombinant expression techniques. It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody. Examples of binding fragments that fall within the scope of the term “Ab” or “antibody” include monovalent antibodies (described in WO 007059782 by Genmab); consisting of only two heavy chains, eg natural in camelids Heavy chain antibodies (eg, Hamers-Casterman (1993) Nature 363: 446); ThioMab (Roche, WO2011069104), an asymmetric bispecific antibody-like molecule, the strand-exchange recombination domain (strand-exchange) engineered domain) (SEED or Seed-body) (Merck, WO2007110205); Triomab (Fresenius, Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155: 219); FcΔAdp (Regeneron, WO2010151792), Azymetric Scaffold (Zymeworks / Merck, WO2012) No. 058768), mAb-Fv (Xencor, WO2011 / 028952), double variable domain immunoglobulin (Abbott, DVD-Ig, US Pat. No. 7,612,181); dual domain double-headed antibody (Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923) ), Di-diabody (ImClone / Eli Lilly, Knobs-into-holes antibody format (Genentech, WO9850431); DuoBody (Genmab, WO 2011/131746); Electrostatic steering antibody format (Amgen) , EP1870459 and WO 2009089004; Chugai, US201000155133; Oncomed, WO 2010129304A2); Bispecific IgG1 and IgG2 (Rinat neurosciences Corporation, WO11143545), CrossMAb (Roche, WO2011117329), LUZ-Y (Genentech) , Biclonic (Merus), dual targeting domain antibodies (GSK / Domantis), two-in-one antibodies that recognize two targets (Genentech, NovImmune), cross-linked Mabs (Cross-linked) Mab) (Karmanos Cancer Center), CovX-body (CovX / Pfizer), IgG-like bispecificity (ImClone / Eli Lilly, Shen, X, et al. J Immunol Methods, 2007. 318 (1-2): p 65-74), and DIG-body and PIG-body (Pharmabcine), and double parents Compatible retargeting molecules (Fc-DART or Ig-DART, by Macrogenics, WO / 2008/157379, WO / 2010/080538), Zybody (Zyngenia), common light chain (Crucell / Merus , US7262028) or an approach that uses a common heavy chain (κλBody by NovImmune), as well as scFv comprising a polypeptide sequence fused to an antibody fragment containing an Fc domain, such as BsAb by ZymoGenetics / BMS Fusion proteins such as fusions), HERCULES by Biogen Idec (US007951918), SCORPION by Emergent BioSolutions / Trubion, Ts2Ab (MedImmune / AZ (Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009. 393 (3)): p. 672-92), scFv fusion by Novartis, scFv fusion by Changzhou Adam Biotech Inc (CN 102250246), TvAb by Roche (WO 2012025525, WO 2012025530), mAb 2 by f-Star (WO2008 / 003116) No.) and double scFv fusions. In addition, unless the term antibody is specified otherwise, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies (human monoclonal antibodies, etc.), antibody mixtures (recombinant polyclonal bodies), such as those produced by techniques developed by Symphonogen and Merus ( Oligoclonics), as well as antibody-like polypeptides, such as chimeric and humanized antibodies, should be understood. The antibody produced can potentially have any isotype.
「完全長抗体」という用語は、本明細書で用いる場合、そのアイソタイプの野生型抗体に通常認められるものに対応する重鎖および軽鎖の定常ドメインおよび可変ドメインのすべてを含む抗体（例えば、親抗体または変異型抗体）を指す。 The term “full-length antibody” as used herein refers to an antibody (eg, a parental antibody) that includes all of the heavy and light chain constant and variable domains corresponding to those commonly found in wild-type antibodies of that isotype. Antibody or mutant antibody).
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で用いる場合、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図している。本発明のヒト抗体が、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってはコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発、またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異、挿入または欠失）を含んでもよい。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で用いる場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に接ぎ合わされた抗体は含まないものとする。 The term “human antibody”, as used herein, is intended to include antibodies having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. A human antibody of the present invention may contain amino acid residues that are not encoded by human germline immunoglobulin sequences (eg, mutations, insertions or insertions introduced by in vitro random or site-directed mutagenesis, or in vivo somatic mutation). Deletion). However, the term “human antibody”, as used herein, does not include antibodies in which CDR sequences derived from the germline of another mammalian species, such as a mouse, are joined to a human framework sequence. .
「モノクローナル抗体」、「モノクローナルAb」、「モノクローナル抗体組成物」、「mAb」などの用語は、本明細書で用いる場合、単分子組成のAb分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を呈する。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一の結合特異性を呈するAbを指す。ヒトmAbは、機能的ヒト抗体を産生するように再編成されたヒト重鎖導入遺伝子レパートリーおよび軽鎖導入遺伝子レパートリーを含むゲノムを有するトランスジェニック性またはトランスクロモソーム非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたB細胞を、不死化細胞と融合させたものを含むハイブリドーマによって作製することができる。 The terms “monoclonal antibody”, “monoclonal Ab”, “monoclonal antibody composition”, “mAb” and the like as used herein refer to a preparation of Ab molecules of single molecular composition. A monoclonal antibody composition exhibits a single binding specificity and affinity for a particular epitope. Thus, the term “human monoclonal antibody” refers to Abs that exhibit a single binding specificity, having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. Human mAbs are obtained from transgenic or transchromosomal non-human animals, such as transgenic mice, having a genome comprising a human heavy chain transgene repertoire and a light chain transgene repertoire rearranged to produce functional human antibodies. The resulting B cells can be produced by hybridomas containing those fused with immortalized cells.
本明細書で用いる場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンのクラス（例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA1、IgGA2、IgEもしくはIgM、またはそれらの任意のアロタイプ、例えばIgG1m（za）およびIgG1m（f）など）を指す。さらに、各重鎖アイソタイプは、カッパ（κ）またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかと組み合わせることができる。 As used herein, an “isotype” is an immunoglobulin class (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA1, IgGA2, IgE or IgM, or any of them) encoded by a heavy chain constant region gene. Allotypes such as IgG1m (za) and IgG1m (f). Furthermore, each heavy chain isotype can be combined with either a kappa (κ) or lambda (λ) light chain.
「一価抗体」という用語は、本発明の文脈において、抗体分子が抗体の結合ドメインのうち1つのみで抗原と結合することができ、例えば、単一の抗原-抗体相互作用を有し、それ故に抗原架橋を行えないことを意味する。 The term “monovalent antibody” in the context of the present invention allows an antibody molecule to bind an antigen in only one of the binding domains of the antibody, eg has a single antigen-antibody interaction, Therefore, it means that antigen crosslinking cannot be performed.
本明細書で用いる場合、「標的」という用語は、本発明の文脈において、Fcドメインと結合領域とを含むポリペプチドの結合領域が、抗体の結合の文脈で用いられる場合に、産生された抗体が向かう任意の抗原を含む分子と理解される必要がある。「抗原」および「標的」という用語は、抗体との関係について互換的に用いることができ、かつ本発明の任意の局面または態様に関して同じ意味および目的を持つ。 As used herein, the term “target” refers to an antibody produced when, in the context of the present invention, the binding region of a polypeptide comprising an Fc domain and a binding region is used in the context of antibody binding. It should be understood as a molecule containing any antigen to which The terms “antigen” and “target” can be used interchangeably with respect to an antibody and have the same meaning and purpose with respect to any aspect or embodiment of the invention.
本明細書で用いる場合、所定の抗原に対する抗体の結合の文脈における「結合」という用語は、典型的には、例えば、抗原をリガンドとして、抗体を分析物として用いてBIAcore 3000計器で表面プラズモン共鳴（SPR）技術によって決定した場合に、KDが約10-6 Mもしくはそれ未満、例えば、10-7 Mもしくはそれ未満、例えば約10-8 Mもしくはそれ未満、例えば約10-9 Mもしくはそれ未満、約10-10 Mもしくはそれ未満、または約10-11 Mもしくはさらにはそれ未満などに対応する親和性での結合であり、所定の抗原または近縁関係にある抗原以外の非特異的抗原（例えば、BSA、カゼイン）に対する結合のその親和性よりも、少なくとも10倍低い、例えば少なくとも100倍低い、例えば少なくとも1,000倍低い、例えば少なくとも10,000倍低い、例えば少なくとも100,000倍低いなどのKDに対応する親和性で、所定の抗原と結合する。親和性がより低くなる量は抗体のKDに依存し、そのため、抗体のKDが極めて低い（すなわち、抗体の特異性が高い）場合には、抗原に対する親和性が非特異的抗原に対する親和性よりも低くなる程度は、少なくとも10,000分の1となることがある。「KD」（M）という用語は、本明細書で用いる場合、特定の抗体-抗原相互作用に関する解離平衡定数を指す。 As used herein, the term “binding” in the context of antibody binding to a given antigen typically refers to surface plasmon resonance on a BIAcore 3000 instrument using, for example, an antigen as a ligand and an antibody as an analyte. as determined by (SPR) technology, K D of about 10 -6 M or less, for example, 10 -7 M or less, for example about 10 -8 M or less, such as about 10 -9 M or greater Less than, about 10 −10 M or less, or binding with an affinity corresponding to about 10 −11 M or less, etc., and non-specific antigens other than a given antigen or closely related antigen (Eg, BSA, casein) at least 10 times lower, eg, at least 100 times lower, eg, at least 1,000 times lower, eg, at least 10,000 times lower, eg, at least 100,000 times lower than its affinity for binding. With an affinity corresponding to a K D of such times lower, it binds to a predetermined antigen. The amount of affinity is lower is dependent on K D of an antibody, therefore, when the extremely low K D of an antibody (i.e., high specificity of the antibody) is affinity affinity for antigen relative to non-specific antigen The degree of lower than gender may be at least 1 / 10,000. The term “K D ” (M), as used herein, refers to the dissociation equilibrium constant for a particular antibody-antigen interaction.
本発明の「変異体」または「抗体変異体」または「親抗体の変異体」とは、「親抗体」と比較して、1つまたは複数の変異を含む抗体分子である。異なる用語が互換的に用いることができ、かつ本発明の任意の局面または態様に関して同じ意味および目的を持つ。例示的な親抗体フォーマットには、野生型抗体、完全長抗体もしくはFcを含有する抗体断片、二重特異性抗体、ヒト抗体、またはそれらの任意の組み合わせが非限定的に含まれる。同様に、本発明の「変異体」または「免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含むポリペプチドの変異体」または「免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの変異体」とは、「免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチド」と比較して1つまたは複数の変異を含む「免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含むポリペプチド」である。これらの異なる用語は、互換的に用いることができ、かつ本発明の任意の局面または態様に関して同じ意味および目的を持つ。例示的な変異には、親アミノ酸配列におけるアミノ酸のアミノ酸欠失、挿入および置換が含まれる。アミノ酸置換は、天然型アミノ酸を、別の天然アミノ酸または非天然アミノ酸誘導体に交換することがある。アミノ酸置換は保存的なこともあれば、非保存的なこともある。本発明の文脈において、保存的置換は、以下の3つの表の1つまたは複数に表されたアミノ酸のクラス内部での置換によって定義しうる：
保存的置換に関するアミノ酸残基のクラス
別の保存的アミノ酸残基置換のクラス
アミノ酸残基の別の物理的および機能的な分類
Amino acid residue class for conservative substitutions
Another class of conservative amino acid residue substitutions
Alternative physical and functional classification of amino acid residues
本発明の文脈において、変異体における置換は以下のように指し示される：
元のアミノ酸‐位置‐置換されたアミノ酸；
三文字コードまたは一文字コードは、コードXaaおよびXを含めて、アミノ酸残基を指し示すために用いられる。したがって、「E345R」または「Glu345Arg」という表記は、変異体が、親抗体での位置345におけるアミノ酸に対応する変異型アミノ酸の位置に、アライメントした場合に、グルタミン酸のアルギニンによる置換を含むことを意味する。
In the context of the present invention, substitutions in the variant are indicated as follows:
Original amino acid-position-substituted amino acid;
The three letter code or the one letter code is used to indicate amino acid residues, including the codes Xaa and X. Thus, the notation "E345R" or "Glu345Arg" means that the variant contains a substitution of glutamic acid for arginine when aligned at the position of the variant amino acid corresponding to the amino acid at position 345 in the parent antibody. To do.
そのような位置が抗体に存在しない場合、変異体はアミノ酸の挿入を含み、例えば：
位置‐置換されたアミノ酸；例えば、「448E」のような表記を用いる。
If such a position is not present in the antibody, the variant contains an amino acid insertion, eg:
Position-substituted amino acids; for example, the designation “448E” is used.
そのような表記は、一連の相同なポリペプチドまたは抗体における改変に関して特に該当する。 Such notation is particularly relevant for modifications in a series of homologous polypeptides or antibodies.
同様に、置換アミノ酸残基の実体が重要でない場合には：
元のアミノ酸‐位置；または「E345」。
Similarly, if the identity of the substituted amino acid residue is not important:
Original amino acid-position; or “E345”.
元のアミノ酸および／または置換されたアミノ酸が、複数の、ただしすべてではないアミノ酸を含む修飾については、位置345におけるグルタミン酸のアルギニン、リジンまたはトリプトファンへの置換について：
「Glu345Arg,Lys,Trp」または「E345R,K,W」または「E345R／K／W」または「E345をR、KまたはWに（E345 to R, K or W）」を、本発明の文脈において互換的に用いることができる。
For modifications where the original amino acid and / or substituted amino acid includes multiple, but not all, amino acids, for the substitution of glutamic acid at position 345 with arginine, lysine or tryptophan:
"Glu345Arg, Lys, Trp" or "E345R, K, W" or "E345R / K / W" or "E345 to R, K or W (E345 to R, K or W)" in the context of the present invention Can be used interchangeably.
その上、「置換」という用語は、他の19種の天然アミノ酸のいずれか1つへの置換、または非天然アミノ酸などの他のアミノ酸への置換も包含する。例えば、位置345におけるアミノ酸Eの置換には、以下の置換のそれぞれが含まれる：345A、345C、345D、345G、345H、345F、345I、345K、345L、345M、345N、345Q、345R、345S、345T、345V、345W、および345Y。ところで、これは345Xとの表記と等価であり、ここでXは任意のアミノ酸を表している。また、これらの置換を、E345A、E345C、その他、またはE345A、C、その他、またはE345A／C／その他と表すこともできる。同じことが、本明細書で言及する各位置およびあらゆる位置についても同様に成り立ち、そのような置換の任意のものが本明細書に具体的に含まれる。 Moreover, the term “substitution” encompasses substitution of any one of the other 19 natural amino acids, or substitution with other amino acids, such as unnatural amino acids. For example, the substitution of amino acid E at position 345 includes each of the following substitutions: 345A, 345C, 345D, 345G, 345H, 345F, 345I, 345K, 345L, 345M, 345N, 345Q, 345R, 345S, 345T , 345V, 345W, and 345Y. By the way, this is equivalent to the notation of 345X, where X represents any amino acid. These substitutions can also be expressed as E345A, E345C, other, or E345A, C, other, or E345A / C / other. The same is true for each and every position referred to herein, and any such substitutions are specifically included herein.
別の配列におけるアミノ酸またはセグメント「に対応する」1つの配列におけるアミノ酸またはセグメントとは、（i）ALIGN、ClustalWまたは類似のものなどの標準的な配列アライメントプログラムを、典型的にはデフォルトの設定で用いて、他のアミノ酸またはセグメントとアライメントされ、かつ（ii）SEQ ID NO：1に対して少なくとも50％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性を有するものである。例えば、図2および3に示された配列アライメントを用いて、IgG1 Fc配列における特定のアミノ酸に対応するIgG2、IgG3またはIgG4 Fc配列における任意のアミノ酸を同定することができる。 An amino acid or segment in one sequence “corresponds” to an amino acid or segment in another sequence is (i) a standard sequence alignment program such as ALIGN, ClustalW or the like, typically with default settings. Used, aligned with other amino acids or segments, and (ii) having at least 50%, at least 80%, at least 90% or at least 95% sequence identity to SEQ ID NO: 1. For example, the sequence alignments shown in FIGS. 2 and 3 can be used to identify any amino acid in the IgG2, IgG3, or IgG4 Fc sequence that corresponds to a particular amino acid in the IgG1 Fc sequence.
本発明は、SEQ ID No：1、2、3、4および5のアミノ酸P247〜K447に対してある程度の同一性を有する、変異体、すなわち親ポリペプチドおよび親抗体ならびに／または変異型ポリペプチドおよび変異型抗体について言及し、そのような親抗体および／または変異型抗体を、本明細書では以下、「相同な抗体」と称する。 The present invention relates to variants, i.e. parent polypeptides and parent antibodies and / or variant polypeptides having some degree of identity to amino acids P247-K447 of SEQ ID No: 1, 2, 3, 4 and 5. Reference is made to variant antibodies, and such parental and / or variant antibodies are hereinafter referred to as “homologous antibodies”.
本発明の目的において、2つのアミノ酸配列の間の同一性の程度、ならびに2つのヌクレオチド配列の間の同一性の程度は、Needleman-Wunschアライメント（すなわち、グローバルアライメント）であるプログラム「align」によって決定される。このプログラムは、ポリペプチド配列ならびにヌクレオチド配列のアライメントのために用いられる。ポリペプチドのアライメントのためにはデフォルトのスコアリング行列BLOSUM50が用いられ、ヌクレオチドのアライメントのためにはデフォルトの同一性行列が用いられ、ギャップの第1の残基のペナルティはポリペプチドについては-12とし、ヌクレオチドについては-16とする。ギャップのさらなる残基に対するペナルティはポリペプチドについては-2とし、ヌクレオチドについては-4とする。 For purposes of the present invention, the degree of identity between two amino acid sequences, as well as the degree of identity between two nucleotide sequences, is determined by the program “align”, a Needleman-Wunsch alignment (ie, global alignment). Is done. This program is used for alignment of polypeptide sequences as well as nucleotide sequences. The default scoring matrix BLOSUM50 is used for polypeptide alignment, the default identity matrix is used for nucleotide alignment, and the first residue penalty in the gap is -12 for the polypeptide. And -16 for nucleotides. The penalty for additional residues in the gap is -2 for polypeptides and -4 for nucleotides.
「align」は、FASTAパッケージ・バージョンv20u6の一部である（W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448、およびW. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparaison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98を参照）。FASTAタンパク質アライメントは、Smith-Watermanアルゴリズムをギャップサイズに関して限定せずに用いる（"Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith and M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biolo. 147:195-197を参照）。 "Align" is part of FASTA package version v20u6 (WR Pearson and DJ Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444-2448, and WR Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparaison with FASTP and FASTA ", Methods in Enzymology 183: 63-98). FASTA protein alignment uses the Smith-Waterman algorithm without limitation on gap size (see “Smith-Waterman algorithm”, T. F. Smith and M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biolo. 147: 195-197).
本明細書で用いる場合、「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識段階および活性化段階ではなく、免疫応答のエフェクター段階に関与する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞には、骨髄系またはリンパ系起源の細胞、例えばリンパ球（B細胞、および細胞溶解性T細胞（CTL）を含むT細胞など）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞、例えば好中球、顆粒球、マスト細胞および好塩基球などが含まれる。ある種のエフェクター細胞は、Fc受容体（FcR）または補体受容体を発現し、特異的な免疫機能を遂行する。いくつかの態様において、例えばナチュラルキラー細胞などのエフェクター細胞は、ADCCを誘導することができる。例えば、FcRを発現する単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞およびクッパー細胞は、標的細胞を特異的に死滅させること、および抗原を免疫系の他の成分に対して提示すること、または抗原を提示する細胞と結合することに関与する。いくつかの態様において、ADCCは、標的細胞表面への活性化C3断片の沈着をもたらす、抗体が誘因となる古典的補体活性化をさらに増強することができる。C3切断産物は、骨髄系細胞上に発現される、CR3などの補体受容体（CR）に対するリガンドである。エフェクター細胞上のCRによる補体断片の認識は、Fc受容体を介したADCCの増強を促進しうる。いくつかの態様において、抗体を誘因とする古典的補体活性化は、標的細胞上のC3断片をもたらす。これらのC3切断産物は、直接的な補体依存性細胞傷害作用（CDCC）を促進しうる。いくつかの態様において、エフェクター細胞は、標的抗原、標的粒子または標的細胞を貪食しうる。エフェクター細胞上での特定のFcRまたは補体受容体の発現は、サイトカインなどの体液性因子によって調節されうる。例えば、FcγRIの発現は、インターフェロンγ（IFNγ）および／またはG-CSFによってアップレギュレートされることが見いだされている。この発現増強は、標的に対するFcγRI保有細胞の細胞傷害活性を増強する。エフェクター細胞は、標的抗原を貪食すること、または標的細胞を貪食もしくは溶解することができる。いくつかの態様において、抗体を誘因とする古典的補体活性化は、標的細胞上のC3断片をもたらす。これらのC3切断産物は、エフェクター細胞による直接的な食作用を促進するか、または抗体媒介性食作用を増強することによって間接的に促進する。 As used herein, the term “effector cells” refers to immune cells that are involved in the effector phase of the immune response, rather than the recognition and activation phases of the immune response. Exemplary immune cells include cells of myeloid or lymphoid origin, such as lymphocytes (such as B cells and T cells including cytolytic T cells (CTL)), killer cells, natural killer cells, macrophages, single cells. Spheres, eosinophils, polymorphonuclear cells such as neutrophils, granulocytes, mast cells and basophils are included. Certain effector cells express Fc receptors (FcR) or complement receptors and perform specific immune functions. In some embodiments, effector cells such as natural killer cells can induce ADCC. For example, monocytes, macrophages, neutrophils, dendritic cells and Kupffer cells that express FcR specifically kill target cells and present antigens to other components of the immune system, or Involved in binding to cells presenting antigen. In some embodiments, ADCC can further enhance classical complement activation triggered by antibodies that results in the deposition of activated C3 fragments on the target cell surface. C3 cleavage products are ligands for complement receptors (CR) such as CR3 that are expressed on myeloid cells. Recognition of complement fragments by CR on effector cells may facilitate enhancement of ADCC via Fc receptors. In some embodiments, antibody-triggered classical complement activation results in a C3 fragment on the target cell. These C3 cleavage products can promote direct complement dependent cytotoxicity (CDCC). In some embodiments, the effector cell can phagocytose the target antigen, target particle or target cell. Expression of specific FcR or complement receptors on effector cells can be regulated by humoral factors such as cytokines. For example, FcγRI expression has been found to be upregulated by interferon γ (IFNγ) and / or G-CSF. This enhanced expression enhances the cytotoxic activity of FcγRI-bearing cells against the target. Effector cells can phagocytose target antigens or phagocytose or lyse target cells. In some embodiments, antibody-triggered classical complement activation results in a C3 fragment on the target cell. These C3 cleavage products promote direct phagocytosis by effector cells or indirectly by enhancing antibody-mediated phagocytosis.
「ベクター」という用語は、本明細書で用いる場合、ベクター中に連結された核酸セグメントの転写を誘導しうる核酸分子を指す。ベクターの1つの型は、環状二本鎖DNAループの形態にある「プラスミド」である。ベクターの別の型はウイルスベクターであり、この場合には核酸セグメントをウイルスゲノム中に連結することができる。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律複製を行うことができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（非エピソーム性哺乳動物ベクターなど）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが機能的に連結している遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えDNA手法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に用いうるが、それはプラスミドがベクターの最も一般的に用いられる形態であるためである。しかし、本発明は、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなど）のような他の形態の発現ベクターも含むことを意図している。 The term “vector” as used herein refers to a nucleic acid molecule capable of inducing transcription of a nucleic acid segment linked into a vector. One type of vector is a “plasmid” in the form of a circular double stranded DNA loop. Another type of vector is a viral vector, in which a nucleic acid segment can be ligated into the viral genome. Certain vectors are capable of autonomous replication in a host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors having a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors). Other vectors (such as non-episomal mammalian vectors), when introduced into a host cell, integrate into the host cell's genome and are thereby replicated along with the host genome. In addition, certain vectors can direct the expression of genes to which they are operably linked. Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” (or simply “expression vectors”). In general, expression vectors useful in recombinant DNA techniques are often in the form of plasmids. In the present specification, “plasmid” and “vector” may be used interchangeably as the plasmid is the most commonly used form of vector. However, the present invention is intended to include other forms of expression vectors, such as viral vectors (such as replication-defective retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses) that perform equivalent functions.
「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、本明細書で用いる場合、発現ベクターが導入された細胞を指すことを意図している。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことを意図していることが理解されるべきである。変異または環境的影響のいずれかに起因してある種の修飾が後続世代で起こりうるため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるものの、それでもなお、本明細書で用いる「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。組換え宿主細胞には、例えば、トランスフェクトーマ、CHO細胞、HEK-293細胞、PER.C6、NS0細胞およびリンパ球細胞、ならびに原核細胞、例えば大腸菌（E. coli）など、ならびに植物細胞および真菌といった他の真核生物宿主が含まれる。 The term “recombinant host cell” (or simply “host cell”), as used herein, is intended to refer to a cell into which an expression vector has been introduced. It should be understood that such terms are intended to refer not only to the particular subject cell, but also to the progeny of such a cell. Even though such progeny may not actually be identical to the parental cell because certain modifications may occur in subsequent generations, either due to mutations or environmental influences, the present specification In the term “host cell”. Recombinant host cells include, for example, transfectomas, CHO cells, HEK-293 cells, PER.C6, NS0 cells and lymphocyte cells, and prokaryotic cells such as E. coli, and plant cells and Other eukaryotic hosts such as fungi are included.
「トランスフェクトーマ」という用語は、本明細書で用いる場合、Abまたは標的抗原を発現する組換え真核宿主細胞、例えば、CHO細胞、PER.C6、NS0細胞、HEK-293細胞、植物細胞、または酵母細胞を含む真菌などを含む。 The term “transfectoma” as used herein refers to a recombinant eukaryotic host cell that expresses an Ab or target antigen, eg, CHO cells, PER.C6, NS0 cells, HEK-293 cells, plant cells. Or a fungus containing yeast cells.
「調製物」という用語は、細胞に結合している抗原（例えば、細胞の表面上に発現された抗原）、細胞膜、ビリオンまたは他の構造と相互作用した場合にオリゴマーを形成する能力を増強することができ、それによって、C1q結合、補体活性化、CDC、ADCC、ADCP、他のFc媒介性エフェクター機能、細胞内移行、ダウンモジュレーション、アポトーシス、抗体-薬物コンジュゲート（ADC）の取り込み、結合力、またはそれらの任意のものの組み合わせを増強することを可能にする、抗体変異体および複数の異なる抗体変異体の混合物の調製物を指す。例示的なアッセイは、例えば、C1q結合力（実施例4）、CDC（実施例5、6および10、16、19、22、23、24、25、および35）；ADCC（実施例12）、インビボ活性（実施例20、21）、血漿クリアランス速度（実施例37）、FcRn結合（実施例34）、および標的非依存的な液相中での補体活性化（実施例36）などに関して、実施例に提示されている。「単一変異体」、「二重変異体」および「混合変異体」と称する、本明細書における諸局面の変異体について、例示的なそれらの調製のための工程および使用方法とともに、以下にさらに詳細に説明する。 The term “preparation” enhances the ability to form oligomers when interacting with antigens bound to cells (eg, antigens expressed on the surface of cells), cell membranes, virions or other structures C1q binding, complement activation, CDC, ADCC, ADCP, other Fc-mediated effector functions, intracellular translocation, down-modulation, apoptosis, antibody-drug conjugate (ADC) uptake, binding Refers to a preparation of antibody variants and a mixture of different antibody variants that make it possible to enhance force, or any combination thereof. Exemplary assays include, for example, C1q binding strength (Example 4), CDC (Examples 5, 6 and 10, 16, 19, 22, 23, 24, 25, and 35); ADCC (Example 12), Regarding in vivo activity (Examples 20, 21), plasma clearance rate (Example 37), FcRn binding (Example 34), complement activation in a target-independent liquid phase (Example 36), etc. Presented in the examples. The variants of aspects herein, referred to as “single variants,” “double variants,” and “mixed variants,” along with exemplary processes for their preparation and methods of use, are described below. Further details will be described.
本明細書で用いる場合、「親和性」という用語は、抗体の個々の抗原結合部位と抗原との一価結合のように単一部位における、ある分子（例えば抗体）と別の分子（例えば標的または抗原）との結合の強度である。 As used herein, the term “affinity” refers to one molecule (eg, an antibody) and another molecule (eg, a target) at a single site, such as monovalent binding between an individual antigen binding site and an antigen of an antibody. Or the strength of binding to the antigen).
本明細書で用いる場合、「結合力」という用語は、2つの構造物の間、例えば、ある標的と同時に相互作用する抗体の複数の抗原結合部位の間、または抗体とC1qとの間などでの、複数の結合部位についての複合強度を指す。複数の結合相互作用が存在する場合、2つの構造物は結合部位がすべて解離した際にのみ解離すると考えられ、それ故、解離速度は個々の結合部位に関してよりも低く、その結果、個々の結合部位の結合の強度（親和性）と比較して、より大きな有効な総結合強度（結合力）をもたらすと考えられる。 As used herein, the term “binding force” is used between two structures, such as between multiple antigen binding sites of an antibody that interact with a target simultaneously, or between an antibody and C1q. Of composite strength for multiple binding sites. In the presence of multiple binding interactions, the two structures are considered to dissociate only when all of the binding sites are dissociated, and therefore the dissociation rate is lower than for individual binding sites, resulting in individual binding. It is believed to provide a greater effective total binding strength (binding force) compared to the strength of binding (affinity) at the site.
本明細書で用いる場合、「オリゴマー」という用語は、少なくとも原理的には無限の数のモノマーからなるポリマーとは対照的に、複数の、しかし限られた数のモノマー単位（例えば、抗体）からなる分子を指す。例示的なオリゴマーには、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマーおよびヘキサマーがある。オリゴマーにおけるモノマー単位の数を表すためにはギリシャ文字の接頭語がしばしば用いられ、例えばテトラマーは4個の単位で、ヘキサマーは6個の単位で構成される。 As used herein, the term “oligomer” refers to a plurality, but a limited number of monomer units (eg, antibodies), as opposed to a polymer consisting at least in principle an infinite number of monomers. Refers to the molecule. Exemplary oligomers include dimers, trimers, tetramers, pentamers and hexamers. The Greek letter prefix is often used to represent the number of monomer units in the oligomer, eg tetramer is composed of 4 units and hexamer is composed of 6 units.
「オリゴマー形成」という用語は、本明細書で用いる場合、モノマーを有限な程度の重合に変換させる工程を指す。本明細書においては、Fcドメインを含有するポリペプチド、例えば抗体などによる標的結合後に、Fcドメインのオリゴマー形成が、好ましくは、ただし限定はされないが細胞表面で起こることが観察されている。抗体のオリゴマー形成は、例えば、細胞表面C1q結合アッセイ（実施例4および9に記載したように）、C1q活性アッセイ（実施例5に記載したように）、ならびに実施例6、10および19に記載した補体依存性細胞傷害作用を用いて評価することができる。 The term “oligomerization” as used herein refers to the process of converting a monomer to a finite degree of polymerization. In the present specification, it has been observed that, after target binding by a polypeptide containing an Fc domain, such as an antibody, oligomerization of the Fc domain preferably occurs on the cell surface, but not limited thereto. Antibody oligomerization is described, for example, in cell surface C1q binding assays (as described in Examples 4 and 9), C1q activity assays (as described in Example 5), and in Examples 6, 10 and 19. The complement-dependent cytotoxicity can be evaluated.
「C1q結合」という用語は、本明細書で用いる場合、その抗原と結合した抗体に対するC1qの結合という文脈における、C1qの結合を指すことを意図している。その抗原と結合した抗体とは、本明細書に記載した文脈においてインビボおよびインビトロの両方で生じるものと解釈されるものとする。C1q結合は、例えば、人工的表面（例えば、実施例3に記載するように、ELISA用のプレートにおけるプラスチック）上の固定化された抗体を用いることによって、または細胞もしくはビリオンの表面（実施例4および9に記載するように）上の所定の抗原と結合させて用いることによって、評価することができる。抗体オリゴマーに対するC1qの結合は、本明細書において、高結合力での結合をもたらす多価相互作用と解釈されるものとする。 The term “C1q binding”, as used herein, is intended to refer to C1q binding in the context of C1q binding to an antibody bound to its antigen. An antibody bound to its antigen is to be interpreted as occurring both in vivo and in vitro in the context described herein. C1q binding can be achieved, for example, by using immobilized antibodies on an artificial surface (eg, plastic in an ELISA plate, as described in Example 3), or on the surface of a cell or virion (Example 4). And can be evaluated by use in combination with the predetermined antigen (as described in and 9). The binding of C1q to antibody oligomer is to be interpreted herein as a multivalent interaction that results in binding with high binding force.
本明細書で用いる場合、「補体活性化」という用語は、その抗原と結合した抗体に対する補体成分C1qの結合が引き金となって起こる、古典的補体経路の活性化を指す。C1qは、古典的補体カスケードの初期イベントにおける第1のタンパク質であり、補体成分C3をC3bとC3aに切断するC3コンベルターゼと呼ばれる酵素活性の形成を結果的にもたらす一連の切断反応に関与する。C3bは膜上のC5と共有結合してC5bを形成し、次にはそれが、終末補体成分C5b、C6、C7、C8およびC9が集合して膜傷害性複合体（MAC）となる補体活性化の後期イベントの引き金となる。補体カスケードは孔の生成を結果的にもたらし、そのことが補体依存性細胞傷害作用（CDC）としても知られる細胞溶解の原因となる。補体活性化は、C1q活性（実施例5に記載するように）、CDC動態（実施例28、29および30に記載するように）、CDCアッセイ（実施例6、10、19、25、27、33および35に記載するように）を用いることによって、またはBeurskens et al April 1, 2012vol. 188 no. 7 3532-3541に記載された、C3bおよびC4bの細胞沈着方法によって評価することができる。 As used herein, the term “complement activation” refers to the activation of the classical complement pathway triggered by binding of complement component C1q to an antibody bound to its antigen. C1q is the first protein in the early events of the classical complement cascade and is involved in a series of cleavage reactions that result in the formation of an enzymatic activity called C3 convertase that cleaves complement component C3 into C3b and C3a . C3b covalently binds to C5 on the membrane to form C5b, which in turn complements the terminal complement components C5b, C6, C7, C8 and C9 into a membrane-damaging complex (MAC). Triggers late events for physical activation. The complement cascade results in pore formation, which causes cell lysis, also known as complement dependent cytotoxicity (CDC). Complement activation includes C1q activity (as described in Example 5), CDC kinetics (as described in Examples 28, 29 and 30), CDC assay (Examples 6, 10, 19, 25, 27 , 33 and 35) or by the cell deposition method of C3b and C4b as described in Beurskens et al April 1, 2012 vol. 188 no. 7 3532-3541.
「補体依存性細胞傷害作用」（「CDC」）という用語は、本明細書で用いる場合、MAC集合体によって生み出された膜内の孔の結果として、細胞またはビリオン上のその標的と結合した抗体の溶解を招く抗体媒介性補体活性化の過程を指すことを意図している。CDCは、実施例6、10、19、25、27、33および35に記載するような、正常ヒト血清を補体供給源として用いるCDCアッセイなどのインビトロアッセイによって、または正常ヒト血清がC1qに限定されている、実施例5に記載するようなC1q活性アッセイで、評価することができる。 The term “complement dependent cytotoxicity” (“CDC”), as used herein, bound to its target on a cell or virion as a result of a pore in the membrane created by the MAC assembly. It is intended to refer to the process of antibody-mediated complement activation leading to antibody lysis. CDC is determined by in vitro assays such as the CDC assay using normal human serum as a complement source, as described in Examples 6, 10, 19, 25, 27, 33 and 35, or normal human serum limited to C1q. The C1q activity assay as described in Example 5 can be evaluated.
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用」（「ADCC」）という用語は、本明細書で用いる場合、結合した抗体の定常領域を認識するFc受容体を発現する細胞による、抗体で覆われた標的細胞またはビリオンの死滅の機序を指すことを意図している。ADCCは、例えば、実施例12に記載するADCCアッセイなどの方法を用いて決定することができる。 The term “antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity” (“ADCC”) as used herein is covered by an antibody by a cell expressing an Fc receptor that recognizes the constant region of the bound antibody. It is intended to refer to the mechanism of target cell or virion death. ADCC can be determined using methods such as, for example, the ADCC assay described in Example 12.
「抗体依存性細胞食作用」（「ADCP」）という用語は、本明細書で用いる場合、食細胞による細胞内移行による、抗体で覆われた標的細胞またはビリオンの排除の機序を指すことを意図している。細胞内移行した、抗体で覆われた標的細胞またはビリオンは、ファゴソームと呼ばれる小胞内に収容され、それが続いて1つまたは複数のリソソームと融合して、ファゴリソソームを形成する。ADCPは、van Bij et al.によってJournal of Hepatology Volume 53, Issue 4, October 2010, Pages 677-685に記載されたように、エフェクター細胞としてのマクロファージおよびビデオ顕微鏡法を用いるインビトロ細胞傷害作用アッセイを用いることによって評価しうる。または、例えば、PMNによる黄色ブドウ球菌（S. aureus）の食作用について実施例14に記載するように評価しうる。
The term “antibody-dependent cell phagocytosis” (“ADCP”), as used herein, refers to the mechanism of elimination of antibody-covered target cells or virions by intracellular translocation by phagocytic cells. Intended. The antibody-covered target cells or virions that have migrated intracellularly are housed in vesicles called phagosomes, which are subsequently fused with one or more lysosomes to form phagolysosomes. ADCP uses an in vitro cytotoxicity assay using macrophages as effector cells and video microscopy as described by van Bij et al. In Journal of Hepatology Volume 53,
「補体依存性細胞傷害作用」（「CDCC」）という用語は、本明細書で用いる場合、抗体媒介性補体活性化の結果として標的細胞またはビリオンと共有結合した補体第3成分（C3）切断産物を認識する補体受容体を発現する細胞による、標的細胞またはビリオンの死滅の機序を指すことを意図している。CDCCは、ADCCに関して記載したものと類似の様式で評価することができる。 The term “complement dependent cytotoxicity” (“CDCC”), as used herein, refers to a complement third component (C3 that is covalently bound to a target cell or virion as a result of antibody-mediated complement activation. It is intended to refer to the mechanism of death of a target cell or virion by a cell expressing a complement receptor that recognizes the cleavage product. CDCC can be assessed in a manner similar to that described for ADCC.
「血漿中半減期」という用語は、本明細書で用いる場合、血漿中のポリペプチドの濃度が、（分布相の後の）消失中に、その初期濃度の2分の1に低下するまでにかかる時間を指し示している。抗体の場合、分布相は典型的には1〜3日であり、この相の間に、血漿と組織との間の再分布が原因となって血漿中濃度は約50％低下する。血漿中半減期は、当技術分野において周知の方法によって測定することができる。 The term “plasma half-life”, as used herein, means that the concentration of a polypeptide in plasma is reduced to half its initial concentration during elimination (after the distribution phase). It points to this time. For antibodies, the distribution phase is typically 1-3 days, during which the plasma concentration is reduced by about 50% due to redistribution between plasma and tissue. Plasma half-life can be measured by methods well known in the art.
「血漿クリアランス速度」という用語は、本明細書で用いる場合、生体への投与後にポリペプチドが血液から除去される速度の定量的尺度のことである。血漿クリアランス速度は、用量／AUC（mL／日／kg）として算出することができ、ここでAUC値（曲線下面積）は、実施例37の通りに濃度-時間曲線から求められる。 The term “plasma clearance rate” as used herein refers to a quantitative measure of the rate at which a polypeptide is removed from the blood after administration to a living organism. The plasma clearance rate can be calculated as dose / AUC (mL / day / kg), where the AUC value (area under the curve) is determined from the concentration-time curve as in Example 37.
「ダウンモジュレーション」という用語は、本明細書で用いる場合、例えば、受容体に対する抗体の結合によって、細胞表面上の抗原または受容体などの分子の数を減少させる過程を指すことを意図している。 The term “down-modulation” as used herein is intended to refer to a process that reduces the number of molecules such as antigens or receptors on the cell surface, eg, by binding of an antibody to the receptor. .
「細胞内移行」という用語は、本明細書で用いる場合、抗体またはFc含有ポリペプチドが、細胞表面および／または周囲の媒質から、例えばエンドサイトーシスを介して、標的を発現する細胞への細胞内移行を受ける任意の機序を指すことを意図している。抗体の細胞内移行は、細胞内移行を受けた抗体の量を測定する直接的アッセイ（例えば、実施例26に記載するリソソーム共局在アッセイなど）を用いて評価することができる。 The term “intracellular” as used herein refers to cells in which an antibody or Fc-containing polypeptide is transferred from the cell surface and / or surrounding medium, eg, via endocytosis, to a cell that expresses the target. It is intended to refer to any mechanism that undergoes inward migration. Antibody internalization can be assessed using a direct assay that measures the amount of antibody that has undergone internalization (eg, the lysosomal colocalization assay described in Example 26).
「抗体-薬物コンジュゲート」という用語は、本明細書で用いる場合、少なくとも1つの型の悪性細胞に対する特異性を有する抗体またはFc含有ポリペプチドと、薬物と、薬物を例えば抗体に連結させるリンカーとを指す。リンカーは悪性細胞の存在下において切断可能または切断不可能であり；抗体-薬物コンジュゲートによって悪性細胞が死滅する。 The term “antibody-drug conjugate” as used herein refers to an antibody or Fc-containing polypeptide having specificity for at least one type of malignant cell, a drug, and a linker that links the drug to, for example, an antibody. Point to. The linker is cleavable or non-cleavable in the presence of malignant cells; antibody-drug conjugates kill malignant cells.
「抗体-薬物コンジュゲートの取り込み」という用語は、本明細書で用いる場合、抗体-薬物コンジュゲートが細胞上の標的と結合し、その後に細胞膜による取り込み／抱き込みを受けて、その結果、細胞内に引き込まれる過程を指す。抗体-薬物コンジュゲートの取り込みは、WO 2011/157741号に記載されたような「インビトロ致死アッセイにおける抗TF ADCによる抗体媒介性細胞内移行および細胞致死」として評価することができる。 The term “antibody-drug conjugate uptake” as used herein refers to antibody-drug conjugate binding to a target on a cell followed by uptake / embracing by the cell membrane, resulting in cellular It refers to the process of being drawn in. Incorporation of antibody-drug conjugates can be assessed as “antibody-mediated intracellular translocation and cell killing by anti-TF ADC in an in vitro lethal assay” as described in WO 2011/157741.
「アポトーシス」という用語は、本明細書で用いる場合、細胞で起こりうるプログラム細胞死（PCD）の過程を指す。生化学的イベントにより、特徴的な細胞変化（形態）および細胞死が招かれる。これらの変化には、小疱形成、細胞縮小、核断片化、クロマチン凝縮および染色体DNA断片化が含まれる。ある種の受容体に対する抗体の結合は、アポトーシスを誘導しうる。 The term “apoptosis” as used herein refers to the process of programmed cell death (PCD) that can occur in a cell. Biochemical events lead to characteristic cell changes (morphology) and cell death. These changes include blebbing, cell shrinkage, nuclear fragmentation, chromatin condensation and chromosomal DNA fragmentation. Binding of antibodies to certain receptors can induce apoptosis.
Fc受容体結合を、実施例12に記載するように間接的に測定することもできる。 Fc receptor binding can also be measured indirectly as described in Example 12.
「FcRn」という用語は、本明細書で用いる場合、Fc受容体である新生児Fc受容体を指すことを意図している。これは、齧歯動物において、母体の乳から、新生齧歯動物の腸管の上皮を通して新生仔の血流内にIgGを輸送することのできる独特な受容体として最初に発見された。さらなる研究により、ヒトにおける類似の受容体が明らかになった。しかし、ヒトでは、胎盤において、成長中の胎児への母体のIgGの輸送を助長する一助になることが見いだされ、さらにIgGの代謝回転をモニターする役割も果たすことが示されている。FcRnは6.0〜6.5の酸性pHではIgGと結合するが、中性またはさらに高いpHでは結合しない。そのため、FcRnは、幾分酸性pHにある腸管腔（腸管の内側）からのIgGと結合することができ、pHが中性ないし塩基性（pH 7.0〜7.5）である基底外側（身体の内側）への効率的な一方向輸送を確実に行うことができる。この受容体はまた、内皮細胞におけるエンドサイトーシスの経路にそれが存在することを通じて、成人でのIgG再利用にも役割を果たす。酸性エンドソーム内のFcRn受容体は、飲作用により細胞内移行したIgGと結合し、それを細胞表面までリサイクルさせ、それを血液の塩基性pHで放出させ、それによって、それがリソソーム分解を受けるのを防ぐ。この機序は、血液中でのIgGの半減期が他のアイソタイプと比較して長いことの説明になる可能性がある。実施例13および34は、ELISAにおけるpH 6.0でのFcRnに対するIgG結合を示すアッセイについて記載している。 The term “FcRn” as used herein is intended to refer to the neonatal Fc receptor, which is an Fc receptor. It was first discovered in rodents as a unique receptor capable of transporting IgG from maternal milk through the intestinal epithelium of the new rodent into the neonatal bloodstream. Further research has revealed similar receptors in humans. However, in humans, it has been found to help facilitate the transport of maternal IgG to the developing fetus in the placenta and has also been shown to play a role in monitoring IgG turnover. FcRn binds IgG at an acidic pH of 6.0-6.5 but does not bind at neutral or higher pH. Therefore, FcRn can bind to IgG from the intestinal lumen (inside the intestine) at a somewhat acidic pH, and the basolateral side (inside the body) where the pH is neutral to basic (pH 7.0-7.5) Efficient one-way transportation to can be ensured. This receptor also plays a role in IgG recycling in adults through its presence in the endocytic pathway in endothelial cells. The FcRn receptor in acidic endosomes binds to IgG that has been intracellularly moved by phagocytosis and recycles it to the cell surface, releasing it at the basic pH of blood, thereby undergoing lysosomal degradation prevent. This mechanism may explain the longer IgG half-life in blood compared to other isotypes. Examples 13 and 34 describe assays showing IgG binding to FcRn at pH 6.0 in an ELISA.
「プロテインA」という用語は、本明細書で用いる場合、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）という細菌の細胞壁で最初に見いだされた56kDaのMSCRAMM表面タンパク質を指すことを意図している。これはspa遺伝子によってコードされ、その調節はDNAトポロジー、細胞浸透圧、およびArIS-ArIRと呼ばれる二成分系によって制御される。免疫グロブリンと結合するその能力が理由で、これは生化学的研究において用途が見いだされている。これは、フォールディングして3ヘリックスバンドルとなる5つの相同なIg結合ドメインで構成される。各ドメインは、哺乳動物種の多くに由来するタンパク質、最も注目されることにIgGと結合することができる。これはほとんどの免疫グロブリンの重鎖Fc領域（FcRn受容体の保存的な結合部位と重なり合う）と結合し、さらにヒトVH3ファミリーのFab領域とも相互作用する。血清中でのこれらの相互作用を通じて、IgG分子は、単にそれらのFab領域のみを介してではなく、それらのFc領域を介しても細菌と結合し、それにより、細菌はオプソニン作用、補体活性化および食作用を破綻させる。 The term “Protein A” as used herein is intended to refer to the 56 kDa MSCRAMM surface protein that was first found in the cell wall of the bacterium Staphylococcus aureus. It is encoded by the spa gene and its regulation is controlled by DNA topology, cell osmotic pressure, and a binary system called ArIS-ArIR. Because of its ability to bind immunoglobulins, it finds use in biochemical research. It is composed of five homologous Ig binding domains that fold into a three-helix bundle. Each domain can bind to a protein from many mammalian species, most notably IgG. It binds to the heavy chain Fc region of most immunoglobulins (which overlaps with the conserved binding site of the FcRn receptor) and also interacts with the Fab region of the human VH3 family. Through these interactions in serum, IgG molecules bind to bacteria not just through their Fab region, but also through their Fc region, which allows the bacteria to opsonize, complement activity Disruption and phagocytosis.
「プロテインG」という用語は、本明細書で用いる場合、特異性が異なる点を除いてプロテインAに非常に類似している、C群およびG群の連鎖球菌で発現される免疫グロブリン結合タンパク質を指すことを意図している。これは、Fc領域に対するその結合を通じて抗体を精製するのに応用されている65kDa（G148プロテインG）および58kDa（C40プロテインG）細胞表面タンパク質である。 The term “protein G” as used herein refers to an immunoglobulin-binding protein expressed in group C and group G streptococci that is very similar to protein A, except that it differs in specificity. Intended to point. This is a 65 kDa (G148 protein G) and 58 kDa (C40 protein G) cell surface protein that has been applied to purify antibodies through its binding to the Fc region.
ポリペプチドのCDCに影響を及ぼす方法
本明細書において親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して記載されている態様はすべて、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む他の親ペプチド、第1の親ペプチドまたは第2の親ポリペプチドに対しても適用しうることが理解されるべきである。
Methods of Affecting CDC of Polypeptides All embodiments described herein with reference to a parent antibody, a first parent antibody or a second parent antibody all comprise an immunoglobulin Fc domain and a binding region. It should be understood that this may also apply to other parent peptides, first parent peptides or second parent polypeptides.
1つの局面において、本発明は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの補体依存性細胞傷害作用（CDC）を増強する方法であって、親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345XおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階を含む方法に関する。 In one aspect, the invention relates to a method of enhancing complement dependent cytotoxicity (CDC) of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, wherein It relates to a method comprising introducing mutations in one or more amino acid residues selected from the group corresponding to E430X, E345X and S440W in the Fc region of IgG1 heavy chain.
1つの態様において、親ポリペプチドは、免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含む親抗体であってよい。 In one embodiment, the parent polypeptide may be a parent antibody comprising an immunoglobulin Fc domain and an antigen binding region.
本発明の方法または使用による親ポリペプチドへの変異の導入は、変異型ポリペプチド（本明細書において「変異体」とも呼ばれ得る）をもたらす。したがって、本発明の方法は、本明細書に記載されたような任意の変異体または変異型ポリペプチドを得るために行うことができる。 Introduction of mutations into a parent polypeptide by the methods or uses of the present invention results in mutant polypeptides (which may also be referred to herein as “variants”). Thus, the methods of the invention can be performed to obtain any variant or variant polypeptide as described herein.
本発明の方法または使用によって得られた変異型ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して増強されたCDCを有する。典型的には、エフェクター機能に対するポリペプチドの効果は、最大溶解の半分の値を得るために必要なポリペプチドの濃度であるEC50値によって決定することができる。 Variant polypeptides obtained by the methods or uses of the invention have enhanced CDC compared to the parent polypeptide. Typically, the effect of a polypeptide on effector function can be determined by the EC50 value, which is the concentration of polypeptide required to obtain half the value of maximum lysis.
最大溶解とは、飽和量のポリペプチドを用いた場合に得られる溶解であり、ここで飽和とは、ポリペプチドに対する標的がすべて、ポリペプチドによる結合を受けているポリペプチドの量を指すことを意図している。 Maximum lysis is the lysis obtained when a saturating amount of polypeptide is used, where saturation refers to the amount of polypeptide that all targets for the polypeptide are bound by the polypeptide. Intended.
「CDCを増強すること」、「CDCを向上させること」、「エフェクター機能を増強すること」または「エフェクター機能を向上させること」という用語は、本発明の文脈において、親ポリペプチドと比較して変異型ポリペプチドのEC50値の低下がみられることを指す。EC50値の低下は、例えば、少なくとももしくは約2分の1、例えば少なくとももしくは約3分の1、または少なくとももしくは約5分の1、または少なくとももしくは約10分の1であってもよい。または、「CDCを増強すること」、「CDCを向上させること」、「エフェクター機能を増強すること」または「エフェクター機能を向上させること」は、親ポリペプチドが全細胞の100％未満を溶解させる条件下で、溶解される細胞の最大量（細胞の総量を100％に設定した場合）の、例えば、全細胞の10％から100％までの、例えば約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％および約100％の増加がみられることも意味する。 The terms “enhancing CDC”, “enhancing CDC”, “enhancing effector function” or “improving effector function” are used in the context of the present invention as compared to the parent polypeptide. It means that the EC50 value of the mutant polypeptide is decreased. The decrease in EC50 value may be, for example, at least or about one half, such as at least or about one third, or at least or about one fifth, or at least or about one tenth. Or “enhancing CDC”, “enhancing CDC”, “enhancing effector function” or “improving effector function” causes the parent polypeptide to lyse less than 100% of all cells. Under the conditions, the maximum amount of cells to be lysed (when the total amount of cells is set to 100%), for example from 10% to 100% of the total cells, for example about 10%, about 20%, about 30% , About 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90% and about 100%.
変異体は、Daudi（実施例6）およびWien（実施例10）に関して記載するように、該変異体にIgG1-005またはIgG1-7D8重鎖の可変ドメインをクローニングして、その活性をCDCアッセイにおいて試験することによって、増強または向上したエフェクター機能に関して試験することができる。IgG1-7D8 HC可変ドメインおよびDaudi細胞を用いる場合、増強は、試験条件下でのIgG1-7D8のEC50よりも2分の1を下回る低いEC50、例えば約2分の1、約3分の1、約5分の1、約10分の1、または10分の1を下回る低いEC50値（50％溶解が観察される濃度）によって定義される。IgG1-005 HC可変ドメインおよびDaudi細胞を用いる場合、増強は、試験条件下でのIgG1-005のEC50よりも2分の1を下回る低いEC50、例えば約2分の1、約3分の1、約5分の1、約10分の1、または10分の1を下回る低いEC50値（50％溶解が観察される濃度）によって定義される。IgG1-7D8 HC可変ドメインおよびWien133細胞を用いる場合、増強は、試験条件下でのIgG1-7D8のEC50よりも2分の1を下回る低いEC50、例えば約2分の1、約3分の1、約5分の1、約10分の1、または10分の1を下回る低いEC50値（50％溶解が観察される濃度）によって定義される。IgG1-005 HC可変ドメインおよびWien133細胞を用いる場合、増強は、最大溶解の、全細胞の10％から100％までの範囲にわたる、例えば約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％および約100％の増加によって定義される。また、CDCの活性の増強を、試験条件下でのIgG1-005のEC50よりも2分の1を下回る低いEC50、例えば約2分の1、約3分の1、約5分の1、約10分の1または10分の1を下回る低いEC50値（Wien133細胞の溶解が検出可能である条件下で50％溶解が観察される濃度）によって定義することも可能である。 Mutants were cloned into IgG1-005 or IgG1-7D8 heavy chain variable domains as described for Daudi (Example 6) and Wien (Example 10), and their activity was measured in a CDC assay. By testing, one can test for enhanced or improved effector function. When using IgG1-7D8 HC variable domains and Daudi cells, the enhancement is less than one-half lower than the EC50 of IgG1-7D8 under the test conditions, for example about one-half, about one-third, Defined by low EC50 values (concentration at which 50% lysis is observed) below about 1/5, about 1/10, or 1/10. When using IgG1-005 HC variable domains and Daudi cells, the enhancement is a lower EC50 that is less than one-half that of IgG1-005 under the test conditions, such as about one-half, about one-third, Defined by low EC50 values (concentration at which 50% lysis is observed) below about 1/5, about 1/10, or 1/10. When using IgG1-7D8 HC variable domains and Wien133 cells, the enhancement is a lower EC50 that is less than one-half that of IgG1-7D8 under the test conditions, e.g. about one-half, about one-third, Defined by low EC50 values (concentration at which 50% lysis is observed) below about 1/5, about 1/10, or 1/10. When using IgG1-005 HC variable domains and Wien133 cells, the enhancement ranges from 10% to 100% of total cells, eg, about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, Defined by increases of about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90% and about 100%. It also enhances the activity of CDC with a low EC50 that is less than one-half that of IgG1-005 under the test conditions, e.g. about one-half, about one-third, about one-fifth, about It can also be defined by a low EC50 value below 1/10 or 1/10 (the concentration at which 50% lysis is observed under conditions where lysis of Wien133 cells is detectable).
本発明の発明者らは、驚いたことに、これらの特定の位置での変異が、本発明の方法（例えば、実施例19に示すような）に従って親抗体に1つまたは複数の変異を導入することによって得られる変異型抗体のCDCについて向上した効果を及ぼすことを見いだした。理論に拘束されるわけではないが、上述した位置の群からの1つまたは複数のアミノ酸を置換することによってオリゴマー形成が刺激されると考えられる。抗体は、より高い結合力で結合し（実施例2によって例示されている；IgG-7D8-E345Rの直接標識は、IgG-7D8-WTと比較して、Daudi細胞に対する結合の増強をもたらした）、そのことは抗体をより長い時間にわたって細胞と結合させ、それにより、例えば、C1q結合、C1q活性 CDC、ADCC、細胞内移行、ADCPおよび／またはインビボ活性の増強といったさまざまなエフェクター機能が可能になる。これらの効果は、実施例4（細胞におけるC1q結合）、実施例5（CDCアッセイにおけるC1q活性）、実施例6、7、27、28、29および35（CDCアッセイ）、実施例12（ADCC）、実施例26（細胞内移行）ならびに実施例21および22（インビボ活性）、血漿クリアランス速度（実施例37）、FcRn結合（実施例34）、および標的非依存性の液相中での補体活性化（実施例36）によって例示されている。 The inventors of the present invention surprisingly found that mutations at these specific positions introduced one or more mutations into the parent antibody according to the methods of the invention (eg, as shown in Example 19). It was found that the CDC of the mutant antibody obtained by doing so has an improved effect. Without being bound by theory, it is believed that substitution of one or more amino acids from the group of positions described above stimulates oligomerization. The antibody binds with higher avidity (illustrated by Example 2; direct labeling of IgG-7D8-E345R resulted in enhanced binding to Daudi cells compared to IgG-7D8-WT) , Which allows the antibody to bind to the cell for a longer period of time, thereby enabling various effector functions such as, for example, C1q binding, C1q activity CDC, ADCC, intracellular translocation, ADCP and / or enhanced in vivo activity . These effects are shown in Example 4 (C1q binding in cells), Example 5 (C1q activity in CDC assay), Examples 6, 7, 27, 28, 29 and 35 (CDC assay), Example 12 (ADCC) , Example 26 (intracellular translocation) and Examples 21 and 22 (in vivo activity), plasma clearance rate (Example 37), FcRn binding (Example 34), and complement in target-independent liquid phase Illustrated by activation (Example 36).
したがって、ヒトIgG1重鎖のFc領域における、E430X（例えばE430G、E430S、E430FまたはE430Tなど）、E345X（例えばE345K、E345Q、E345RまたはE345Yなど）、S440YおよびS440Wに対応するものから選択されるアミノ酸残基の変異を、本発明の文脈において「単一変異体」局面または「CDC増強性変異」と称することもできる。 Therefore, amino acid residues selected from those corresponding to E430X (eg, E430G, E430S, E430F or E430T), E345X (eg, E345K, E345Q, E345R or E345Y), S440Y and S440W in the Fc region of human IgG1 heavy chain Group mutations may also be referred to as “single variant” aspects or “CDC enhancing mutations” in the context of the present invention.
したがって、1つの態様においては、CDCを増強する方法において、1つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345YおよびS440Wに対応する群から選択される。 Thus, in one embodiment, in the method of enhancing CDC, mutations in one or more amino acid residues are E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y in the Fc region of the human IgG1 heavy chain. And selected from the group corresponding to S440W.
1つの好ましい態様においては、CDCを増強する方法において、1つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E345KおよびE345Qに対応する群から選択される。 In one preferred embodiment, in the method of enhancing CDC, the mutation at one or more amino acid residues is selected from the group corresponding to E430G, E430S, E345K and E345Q in the Fc region of the human IgG1 heavy chain.
1つの態様において、親ポリペプチドは、免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含む親抗体である。 In one embodiment, the parent polypeptide is a parent antibody comprising an immunoglobulin Fc domain and an antigen binding region.
別の局面において、本発明はまた、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドのCDCおよび抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）を増強する方法であって、親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345XおよびS440Wに対応する1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階を含み、ここでXが任意のアミノ酸、例えば天然型アミノ酸などである方法にも関する。 In another aspect, the present invention also provides a method for enhancing CDC and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region comprising the parent polypeptide In contrast, the method includes introducing a mutation in one or more amino acid residues corresponding to E430X, E345X and S440W in the Fc region of human IgG1 heavy chain, wherein X is any amino acid, such as a natural amino acid It also relates to the method.
1つの態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345YおよびS440Wに対応する群から選択される。 In one embodiment, the mutation at one or more amino acid residues is selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain .
1つの好ましい態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置E345R、E430TおよびE430Fに対応する群から選択される。 In one preferred embodiment, the mutation at one or more amino acid residues is selected from the group corresponding to positions E345R, E430T and E430F in the Fc region of the human IgG1 heavy chain.
1つの態様においては、抗体の少なくとも1つの他のエフェクター機能、例えばC1q結合、補体活性化、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）、Fc-γ受容体結合、プロテインA結合、プロテインG結合、ADCP、補体依存性細胞傷害作用（CDCC）、補体増強性細胞傷害作用、抗体によって媒介されるオプソニン化抗体の補体受容体に対する結合、抗体媒介性食作用（ADCP）、細胞内移行、アポトーシス、および／またはオプソニン化抗体の補体受容体に対する結合など、例えばADCCなども増強される。 In one embodiment, at least one other effector function of the antibody, such as C1q binding, complement activation, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), Fc-γ receptor binding, protein A binding, protein G-binding, ADCP, complement-dependent cytotoxicity (CDCC), complement-enhanced cytotoxicity, antibody-mediated opsonized antibody binding to complement receptors, antibody-mediated phagocytosis (ADCP), cells Also enhanced are internalization, apoptosis, and / or binding of opsonized antibodies to complement receptors, such as ADCC.
1つの態様において、親ポリペプチドは、免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含む親抗体である。 In one embodiment, the parent polypeptide is a parent antibody comprising an immunoglobulin Fc domain and an antigen binding region.
1つの態様において、親抗体のCDCは、親抗体が抗原発現細胞上、細胞膜上またはビリオン上のその抗原と結合したときに増強される。 In one embodiment, the CDC of the parent antibody is enhanced when the parent antibody binds to its antigen on an antigen-expressing cell, cell membrane or virion.
1つの態様において、親抗体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体である。 In one embodiment, the parent antibody is a monospecific antibody, bispecific antibody or multispecific antibody.
1つのさらなる局面において、本発明は、免疫グロブリンの第1のCH2-CH3領域と第1の抗原結合領域とを含む第1のポリペプチドおよび免疫グロブリンの第2のCH2-CH3領域と第2の抗原結合領域とを含む第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体である親抗体の補体依存性細胞傷害作用（CDC）を増強する方法であって、第1および第2の抗原結合領域が同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、第1および／または第2のCH2-CH3領域に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階を含み；かつ
第1のCH2-CH3領域が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸変異を含み；第2のCH2-CH3領域が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸変異を含み、かつ、第1のCH2-CH3領域におけるさらなるアミノ酸変異が、第2のCH2-CH3領域におけるさらなるアミノ酸変異とは異なる、方法に関する。
In one further aspect, the invention provides a first polypeptide comprising an immunoglobulin first CH2-CH3 region and a first antigen-binding region and an immunoglobulin second CH2-CH3 region and a second A method for enhancing complement-dependent cytotoxicity (CDC) of a parent antibody, which is a bispecific antibody comprising a second polypeptide comprising an antigen-binding region, wherein the first and second antigen-binding regions Binds to different epitopes on the same or different antigens and corresponds to E430X, E345X, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain relative to the first and / or second CH2-CH3 region Introducing a mutation in one or more amino acid residues selected from: and wherein the first CH2-CH3 region is K409, T366, L368, K370, D399, F405 in the Fc region of a human IgG1 heavy chain And additional amino acids at positions selected from those corresponding to Y407 The second CH2-CH3 region comprises a further amino acid mutation at a position selected from those corresponding to F405, T366, L368, K370, D399, Y407 and K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain; And the invention relates to a method wherein the further amino acid mutation in the first CH2-CH3 region is different from the further amino acid mutation in the second CH2-CH3 region.
1つの態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される。 In one embodiment, the mutation at one or more amino acid residues is selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain Is done.
1つの好ましい態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E345KおよびE345Qに対応する群から選択される。 In one preferred embodiment, the mutation at one or more amino acid residues is selected from the group corresponding to E430G, E430S, E345K and E345Q in the Fc region of the human IgG1 heavy chain.
1つの態様において、本方法は、二重特異性抗体の第1または第2のポリペプチドの一方のみに変異を導入する段階を含む。 In one embodiment, the method includes introducing a mutation into only one of the first or second polypeptide of the bispecific antibody.
1つの態様において、本方法は、二重特異性抗体の第1および第2のポリペプチドの両方に変異を導入する段階を含む。 In one embodiment, the method includes introducing mutations into both the first and second polypeptides of the bispecific antibody.
1つの好ましい態様において、第1のCH2-CH3領域のさらなるアミノ酸変異は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409に対応する位置にあり、例えばK409Rであり；かつ、第2のCH2-CH3領域のさらなるアミノ酸変異は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405に対応する位置にあり、例えばF405Lである。 In one preferred embodiment, the additional amino acid mutation of the first CH2-CH3 region is at a position corresponding to K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, such as K409R; and of the second CH2-CH3 region A further amino acid mutation is at a position corresponding to F405 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, for example F405L.
本発明の発明者らはまた、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439またはS440のいずれかに対応するアミノ酸残基における親抗体に対する変異の導入が、親抗体のエフェクター機能を低下させることも示している（実施例5、6および10）。 The inventors of the present invention have also shown that introduction of mutations to the parent antibody in amino acid residues corresponding to either K439 or S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain reduces the effector function of the parent antibody. (Examples 5, 6 and 10).
実施例6に示しているように、「単一変異体」としての位置K439EまたはS440Kのアミノ酸置換は、本発明の方法による第1の変異のうちの任意のものと比較して、CDCを低下させた。 As shown in Example 6, an amino acid substitution at position K439E or S440K as a “single variant” reduces CDC compared to any of the first mutations according to the method of the invention. I let you.
エフェクター機能を低下させる前記方法によって得られた変異型抗体は、親抗体と比較して低下したエフェクター機能を有する。典型的には、エフェクター機能に対する抗体の効果は、最大溶解の半値を得るために必要な抗体の濃度であるEC50値によって測定しうる。 The mutant antibody obtained by the above method for reducing the effector function has a reduced effector function compared to the parent antibody. Typically, the effect of an antibody on effector function can be measured by the EC50 value, which is the concentration of antibody required to obtain half maximal lysis.
最大溶解とは、飽和量の抗体を用いた場合に得られる溶解であり、ここで飽和とは、抗体に対する抗原がすべて、抗体による結合を受けている抗体の量を指すことを意図している。 Maximum lysis is the lysis obtained when using a saturating amount of antibody, where saturating is intended to refer to the amount of antibody that all antigens to the antibody are bound by the antibody. .
「エフェクター機能を低下させること」という用語は、本発明の文脈において、親抗体と比較して変異型抗体のEC50値の増大がみられることを指す。EC50値の増大は、例えば、少なくとももしくは約2倍、例えば少なくとももしくは約3倍、または少なくとももしくは約5倍、または少なくとももしくは約10倍であってもよい。または、「エフェクター機能を低下させること」は、親抗体が全細胞の100％未満を溶解させる条件下で、溶解される細胞の最大量の、例えば、全細胞の10％から100％までの、例えば約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％および約100％の低下がみられることも意味する。 The term “reducing effector function” refers in the context of the present invention to an increase in the EC50 value of a variant antibody compared to the parent antibody. The increase in EC50 value may be, for example, at least or about 2-fold, such as at least or about 3-fold, or at least or about 5-fold, or at least or about 10-fold. Alternatively, “decreasing effector function” refers to the maximum amount of cells that are lysed under conditions where the parent antibody lyses less than 100% of all cells, eg, from 10% to 100% of all cells, For example, it also means that there is a decrease of about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90% and about 100%.
変異体は、Daudi細胞（実施例6）およびWien133細胞（実施例10）に関して記載するように、該変異体にIgG1-005またはIgG1-7D8重鎖の可変ドメインをクローニングして、その活性をCDCアッセイにおいて試験することによって、低下したエフェクター機能に関して試験することができる。IgG1-7D8 HC可変ドメインおよびDaudi細胞を用いる場合、低下は、試験条件下でのIgG1-7D8のEC50よりも2分の1を下回る低いEC50、例えば約2分の1、約3分の1、約5分の1、約10分の1、または10分の1を下回る低いEC50値（50％溶解が観察される濃度）によって定義される。IgG1-005 HC可変ドメインおよびDaudi細胞を用いる場合、低下は、試験条件下でのIgG1-005のEC50よりも2分の1を下回る低いEC50、例えば約2分の1、約3分の1、約5分の1、約10分の1、または10分の1を下回る低いEC50値（50％溶解が観察される濃度）によって定義される。IgG1-7D8 HC可変ドメインおよびWien133細胞を用いる場合、低下は、試験条件下でのIgG1-7D8のEC50よりも2分の1を下回る低いEC50、例えば約2分の1、約3分の1、約5分の1、約10分の1、または10分の1を下回る低いEC50値（50％溶解が観察される濃度）によって定義される。IgG1-005 HC可変ドメインおよびWien133細胞を用いる場合、低下は、最大溶解の、全細胞の10％から100％までの範囲にわたる、例えば約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％および約100％の増加によって定義される。また、CDCの活性の低下を、試験条件下でのIgG1-005のEC50よりも2分の1を下回る低いEC50、例えば約2分の1、約3分の1、約5分の1、約10分の1または10分の1を下回る低いEC50値（Wien133細胞の溶解が検出可能である条件下で50％溶解が観察される濃度）によって定義することも可能である。 Mutants were cloned as described for Daudi cells (Example 6) and Wien133 cells (Example 10) by cloning IgG1-005 or IgG1-7D8 heavy chain variable domains into their CDC activity. By testing in an assay, one can test for reduced effector function. When using IgG1-7D8 HC variable domains and Daudi cells, the decrease is less than one-half lower than the EC50 of IgG1-7D8 under the test conditions, for example about one-half, about one-third, Defined by low EC50 values (concentration at which 50% lysis is observed) below about 1/5, about 1/10, or 1/10. When using IgG1-005 HC variable domains and Daudi cells, the decrease is less than one-half lower than the EC50 of IgG1-005 under the test conditions, for example about one-half, about one-third, Defined by low EC50 values (concentration at which 50% lysis is observed) below about 1/5, about 1/10, or 1/10. When using IgG1-7D8 HC variable domains and Wien133 cells, the decrease is less than one-half lower than the EC50 of IgG1-7D8 under the test conditions, for example about one-half, about one-third, Defined by low EC50 values (concentration at which 50% lysis is observed) below about 1/5, about 1/10, or 1/10. When using IgG1-005 HC variable domains and Wien133 cells, the reduction ranges from 10% to 100% of total cells, eg, about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, Defined by increases of about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90% and about 100%. Also, the decrease in CDC activity is lower than the EC50 of IgG1-005 under the test conditions by a lower EC50, such as about 1/2, about 1/3, about 1/5, about It can also be defined by a low EC50 value below 1/10 or 1/10 (the concentration at which 50% lysis is observed under conditions where lysis of Wien133 cells is detectable).
1つのさらなる局面において、本発明は、本発明による、本明細書に開示された態様のような方法であって、S440YおよびS440W以外の1つまたは複数の位置に変異を導入する段階、ならびに
（i）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するアミノ酸残基のそれぞれにおける変異であって、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、変異、
（ii）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447および448に対応するアミノ酸残基のそれぞれにおける変異、例えばヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K／R／Hおよび448E／D、好ましくはK447Kおよび448E、または
（iii）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447、448および449に対応するアミノ酸残基のそれぞれにおける変異、例えばヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D／E、448K／R／Hおよび449P、好ましくはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447E、448Kおよび449P
をさらに導入する段階を含む方法に関する。
In one further aspect, the present invention is a method according to the present invention, as in the embodiments disclosed herein, comprising introducing mutations at one or more positions other than S440Y and S440W, and i) a mutation in each of the amino acid residues corresponding to K439 and S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, provided that the mutation in S440 is neither S440Y nor S440W,
(Ii) mutations in each of the amino acid residues corresponding to K447 and 448 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, such as K447K / R / H and 448E / D, preferably K447K and 448E in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, Or (iii) mutations in each of the amino acid residues corresponding to K447, 448 and 449 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, for example K447D / E, 448K / R / H and 449P in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, preferably Are K447E, 448K and 449P in the Fc region of human IgG1 heavy chain
The method further includes the step of introducing.
上記の段階（ii）または（iii）に記載されたようにさらなる変異が導入される態様に関して、通常の状況下では細胞における抗体産生の際に位置K447のリジンが切断されることに留意される必要がある。これは、1つまたは複数のさらなるアミノ酸残基（448または448／449など）を追加することにより、位置K447を保護することによって防ぐことができる。このことは、WO 2013／004841号（Genmab A／S）にさらに記載されている。 Regarding embodiments in which further mutations are introduced as described in steps (ii) or (iii) above, it is noted that the lysine at position K447 is cleaved during antibody production in cells under normal circumstances There is a need. This can be prevented by protecting position K447 by adding one or more additional amino acid residues (such as 448 or 448/449). This is further described in WO 2013/004841 (Genmab A / S).
1つの態様において、本方法は、1つまたは複数の位置にS440YおよびS440W以外の変異を導入する段階、ならびにヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439および／またはS440に対応するアミノ酸残基のそれぞれに変異をさらに導入する段階であって、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、段階を含む。 In one embodiment, the method includes introducing mutations other than S440Y and S440W at one or more positions, and each of the amino acid residues corresponding to K439 and / or S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain. Further introducing a mutation, provided that the mutation at S440 is not S440Y or S440W.
1つの好ましい態様において、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における変異はK439D／Eであり、かつ／またはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における変異はS440K／Rである。 In one preferred embodiment, the mutation at the position corresponding to K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain is K439D / E and / or the mutation at the position corresponding to S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain is S440K / R It is.
1つの態様において、親ポリペプチドは、免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含む親抗体である。 In one embodiment, the parent polypeptide is a parent antibody comprising an immunoglobulin Fc domain and an antigen binding region.
1つの態様において、親抗体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体である。二重特異性抗体は、本明細書に記載された態様のいずれか1つであってよい。 In one embodiment, the parent antibody is a monospecific antibody, bispecific antibody or multispecific antibody. Bispecific antibodies can be any one of the embodiments described herein.
さらに、表1に列記された変異の任意のものが、二重特異性抗体に導入されうる。実施例24は、二重特異性CD20×EGFR抗体に対するE345R変異の導入がCDCの活性を増強することを示している。実施例23、29および30も、本発明の変異を含む種々の二重特異性抗体のいくつかを記載している。 In addition, any of the mutations listed in Table 1 can be introduced into the bispecific antibody. Example 24 shows that the introduction of the E345R mutation to the bispecific CD20 × EGFR antibody enhances the activity of CDC. Examples 23, 29 and 30 also describe some of the various bispecific antibodies containing the mutations of the invention.
S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、親抗体におけるヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応する両方のアミノ酸残基への変異の導入を、本明細書では「二重変異体」局面とも称する。S440YおよびS440W変異は、他所で説明しているように、親ポリペプチドに導入された場合にCDCを増強することが見いだされた。 Introduction of mutations to both amino acid residues corresponding to K439 and S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain in the parent antibody, provided that the mutation in S440 is neither S440Y nor S440W Also referred to as the “heavy mutant” aspect. S440Y and S440W mutations were found to enhance CDC when introduced into the parent polypeptide, as described elsewhere.
同じく他所で説明しているように、本発明の発明者らは、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439またはS440のいずれかに対応するアミノ酸残基への同定された変異の導入が、エフェクター機能の低下をもたらすことを見いだした（実施例5、6、10）。しかし、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するアミノ酸残基の両方に阻害性変異を導入すると、エフェクター機能の低下が元に戻り、その結果、K439およびS440変異の箇所に変異を有しない親抗体のエフェクター機能に類似したものになる。しかし、K439およびS440変異の存在は、いかなる理論にも拘束されないものの、K439およびS440変異の両方を含む抗体のみに対応するオリゴマー複合体に対するエフェクター機能の誘導を制限すると考えられる。したがって、K439およびS440変異を治療用抗体に含める場合には、いかなる理論にも拘束されないものの、そのような治療用抗体を患者に投与する場合には、エフェクター機能の誘導は、K439／S440変異を含む治療用抗体を含有するが、K439およびS440変異を含まない患者自身の抗体は含有しないオリゴマー抗体複合体に限定され、それにより、治療用抗体と患者自身の抗体との相互作用によって引き起こされる恐れのある副作用が制限されると考えられる。 As also described elsewhere, the inventors of the present invention have shown that the introduction of the identified mutation into an amino acid residue corresponding to either K439 or S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain is an effector function. (Examples 5, 6, and 10). However, when inhibitory mutations were introduced into both the amino acid residues corresponding to K439 and S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, the effector function was restored, resulting in mutations at the K439 and S440 mutations. It is similar to the effector function of the parent antibody that does not have it. However, the presence of K439 and S440 mutations, although not bound by any theory, is thought to limit the induction of effector function on oligomeric complexes that correspond only to antibodies containing both K439 and S440 mutations. Thus, while the K439 and S440 mutations are included in therapeutic antibodies, and not bound by any theory, when such therapeutic antibodies are administered to a patient, induction of effector function is caused by the K439 / S440 mutation. Limited to oligomeric antibody conjugates that contain therapeutic antibodies, but not the K439 and S440 mutations, and do not contain the K439 and S440 mutations, which may be caused by the interaction of the therapeutic antibody with the patient's own antibody Certain side effects may be limited.
位置K439および／またはS440の変異を第1の変異と組み合わせると、CDCの増強が得られ、かつCDCの特異性が増強される。同様に、CDCの増強および特異性の増強を、上記の態様（ii）および（iii）に開示された変異を導入することによって得ることもできる。 Combining the mutation at position K439 and / or S440 with the first mutation results in enhanced CDC and increased CDC specificity. Similarly, CDC enhancement and specificity enhancement can also be obtained by introducing the mutations disclosed in embodiments (ii) and (iii) above.
別の局面において、本発明は、少なくとも第1および第2の親ポリペプチドの組み合わせの補体依存性細胞傷害作用（CDC）を増強する方法であって、少なくとも第1および第2の親ポリペプチドがそれぞれ免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含み、少なくとも第1および／または第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階を含む方法に関する。 In another aspect, the present invention provides a method for enhancing complement dependent cytotoxicity (CDC) of a combination of at least a first and a second parent polypeptide, comprising at least a first and a second parent polypeptide. Each comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, at least for the first and / or second parent polypeptide, from a group corresponding to E430X, E345X, S440Y and S440W in the Fc region of a human IgG1 heavy chain It relates to a method comprising introducing mutations in one or more selected amino acid residues.
1つの態様において、本方法は、少なくとも第1および／または第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階を含む。 In one embodiment, the method comprises at least the first and / or second parent polypeptide E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y in the Fc region of the human IgG1 heavy chain. And introducing mutations in one or more amino acid residues selected from the group corresponding to S440W.
1つの好ましい態様において、本方法は、少なくとも第1および／または第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E345KおよびE345Qに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階を含む。
In one preferred embodiment, the method is selected from the group corresponding to E430G, E430S, E345K and E345Q in the Fc region of the human IgG1 heavy chain at least for the first and / or
1つの態様において、本方法は、第1および第2の親ポリペプチドの両方に対して、同じであっても異なってもよい変異を導入する段階を含む。 In one embodiment, the method comprises introducing a mutation that may be the same or different for both the first and second parent polypeptides.
1つのさらなる態様において、本方法は、
（i）第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階、
（ii）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を含まない、第2の親ポリペプチドを提供する段階、を含む。
In one further embodiment, the method comprises:
(I) one selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain relative to the first parent polypeptide Or introducing mutations in multiple amino acid residues,
(Ii) including mutations in one or more amino acid residues selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of human IgG1 heavy chain Providing a second parent polypeptide.
1つの態様において、本方法は、第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E345KまたはE345Qに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階を含む。 In one embodiment, the method comprises, relative to the first parent polypeptide, one or more amino acid residues selected from the group corresponding to E430G, E430S, E345K or E345Q in the Fc region of a human IgG1 heavy chain Introducing a mutation in
1つのさらなる態様において、1つまたは複数の位置における変異はS440YおよびS440Wとは別のものであり、かつ本方法は、
（i）第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置K439に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階；および
（ii）第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階であって、ただし、当該変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする段階；をさらに含むか、または代替的に（i）および（ii）が、
（iii）第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置S440に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階であって、ただし、変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする段階；
（iv）第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置K439に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階、をさらに含む。
In one further embodiment, the mutation at one or more positions is separate from S440Y and S440W, and the method comprises:
(I) introducing a second mutation into the amino acid residue corresponding to position K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain relative to the first parent polypeptide; and (ii) into the second parent polypeptide In contrast, a step of introducing a second mutation into an amino acid residue corresponding to S440 in the Fc region of human IgG1 heavy chain, provided that the mutation is not S440Y or S440W; Or alternatively (i) and (ii)
(Iii) a step of introducing a second mutation into the amino acid residue corresponding to position S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain with respect to the first parent polypeptide, provided that the mutation is S440Y or S440W A stage subject to absence;
(Iv) introducing a second mutation into the amino acid residue corresponding to position K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain with respect to the second parent polypeptide.
第2の親ポリペプチドは、それ単独では標的細胞に対する結合後に十分なCDC応答をもたらさない任意の親ポリペプチドであってよい。 The second parent polypeptide can be any parent polypeptide that by itself does not result in a sufficient CDC response after binding to the target cell.
このため、理論に拘束されるわけではないが、上記のリストによる1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を含み、それ故にCDC応答の増強を有する第1の変異型ポリペプチドを提供し、かつそのような変異を含まない第2の変異型ポリペプチドを提供する前記方法により、第2の親ポリペプチドのCDC応答が得られると考えられる。 Thus, without being bound by theory, providing a first variant polypeptide comprising a mutation in one or more amino acid residues according to the above list and thus having an enhanced CDC response, and It is believed that the above method of providing a second mutant polypeptide that does not contain such a mutation will result in a CDC response of the second parent polypeptide.
CDCを増強することのできる前記変異の1つを含む第1の抗体を、本発明による改変を受けていない第2の抗体と組み合わせる方法は、実施例31に示されているように、組み合わせたものによるCDCの増強をもたらす。したがって、この方法は、1つの態様において、安全ではあるが十分に効率的ではないことが立証されている（または効率の増大が望ましい）第2の抗体としての治療用抗体を、変異を含み、その結果、有効である組み合わせをもたらす第1の抗体と組み合わせるために用いることができる。 A method of combining a first antibody comprising one of the aforementioned mutations capable of enhancing CDC with a second antibody that has not undergone modification according to the present invention was combined as shown in Example 31. Brings the enhancement of CDC by things. Thus, the method comprises, in one embodiment, a therapeutic antibody as a second antibody that has been demonstrated to be safe but not sufficiently efficient (or where increased efficiency is desirable) comprising a mutation, As a result, it can be used to combine with a first antibody that results in a combination that is effective.
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応するものから選択されるアミノ酸残基における変異を含まない、適した第2の抗体の例には、以下の任意のものが非限定的に含まれる；（90Y）クリバツズマブテトラキセタン；（90Y）タカツズマブテトラキセタン；（99mTc）ファノレソマブ；（99mTc）ノフェツモマブメルペンタン；（99mTc）ピンツモマブ；3F8；8H9；アバゴボマブ；アバタセプト；アブシキシマブ；アクトクスマブ；アダリムマブ；アデカツムマブ；アフェリモマブ；アフリベルセプト；アフツズマブ；アラシズマブペゴール；アルビグルチド；ALD518；アレファセプト；アレムツズマブ；アリロクマブ；アルツモマブ；アルツモマブペンテテート；アルビルセプトスドトクス；アマツキシマブ；AMG714／HuMax-IL15；アナツモマブマフェナトクス；アンルキンズマブ（＝IMA-638）；アポリズマブ；アルシツモマブ；アセリズマブ；アタシセプト；アチヌマブ；アトリズマブ（＝トシリズマブ）；アトロリムマブ；バミネルセプト；バピネオズマブ；バシリキシマブ；バビツキシマブ；ベクツモマブ；ベラタセプト；ベリムマブ；ベンラリズマブ；ベルチリムマブ；ベシレソマブ；ベカシズマブ；ベズロトクスマブ；ビシロマブ；ビファルセプト；ビバツズマブ；ビバツズマブメルタンシン；ブリナツモマブ；ブロソズマブ；ブレンツキシマブベドチン；ブリアキヌマブ；ブリオバセプト；ブロダルマブ；カナキヌマブ；カンツズマブメルタンシン；カンツズマブラブタンシン；カプラシズマブズマブ；カプロマブ；カプロマブペンデチド；カルルマブ；カツマクソマブ；CC49；セデリズマブ；セルトリズマブペゴール；セツキシマブ；Ch.14.18；シタツズマブボガトクス；シクスツムマブ；クラザキズマブ；クレノリキシマブ；クリバツズマブテトラキセタン；コナツムマブ；コンベルセプト；CR6261；クレネズマブ；ダセツズマブ；ダクリズマブ；ダランテルセプト；ダロツズマブ；ダラツムマブ；デムシズマブ；デノスマブ；デツモマブ；ドルリモマブアリトクス；ドロジツマブ；デュラグルチド；エクロメキシマブ；エクリズマブ；エドバコマブ；エドレコロマブ；エファリズマブ；エフングマブ；エロツズマブ；エルシリモマブ；エナバツズマブ；エンリモマブ；エンリモマブペゴール；エノキズマブ；エンシツキシマブ；エピツモマブ；エピツモマブシツキセタン；エラプズマブ；エルリズマブ；エルツマクソマブ；エタネルセプト；エタラシズマブ；エトロリズマブ；エキシビビルマブ；ファノレソマブ；ファラリモマブ；ファレツズマブ；ファシヌマブ；FBTA05；フェルビズマブ；フェザキヌマブ；フィクラツズマブ；フィジツムマブ；フランボルマブ；フォントリズマブ；フォラルマブ；フォラビルマブ；フレソリムマブ；フルラヌマブ；ガリキシマブ；ガニツマブ；ガンテネルマブ；ガビリモマブ；ゲムツズマブ；ゲムツズマブオゾガミシン；ゲボキズマブ；ギレンツキシマブ；グレムバツムマブ；グレムバツムマブベドチン；ゴリムマブ；ゴミリキシマブ；GS6624；抗CD74抗体；WO 2011/110642号に開示されているような抗cMet抗体；WO 2011/147986号またはWO 2011/147982号に開示されているような抗Her2抗体；WO 2004/058797号に開示されているような抗IL8抗体；WO 2004/045512号に開示されているような抗TAC抗体；WO 2010/066803号またはWO 2011/157741号に開示されているような抗組織因子（TF）抗体；イバリズマブ；イブリツモマブチウキセタン；イクルクマブ；イゴボマブ；イムシロマブ；インクラクマブ；インダツキシマブラブタンシン；インフリキシマブ；イノリモマブ；イノツズマブオゾガミシン；インテツムマブ；ヨード（124I）ギレンツキシマブ；イピリムマブ；イラツムマブ；イトリズマブ；イクセキズマブ；ケリキシマブ；ラベツズマブ；レブリキズマブ；レマレソマブ；レネルセプト；レルデリムマブ；レキサツムマブ；リビビルマブ；リンツズマブ；ロルボツズマブメルタンシン；ルカツムマブ；ルミリキシマブ；マパツムマブ；マスリモマブ；マツズマブ；マブリリムマブ；メポリズマブ；メテリムマブ；ミラツズマブ；ミンレツモマブ；ミロコセプト；ミツモマブ；モガムリズマブ；モロリムマブ；モタビズマブ；モキセツモマブ；パスドトクス；ムロモナブ-CD3；ナコロマブタフェナトクス；ナミルマブ；ナプツモマブエスタフェナトクス；ナルナツマブ；ナタリズマブ；ネバクマブ；ネシツムマブ；ネレリモマブ；ニモツズマブ；ニボルマブ；ノフェツモマブ；メルペンタン；オビニツズマブ；オカラツズマブ；オクレリズマブ；オヅリモマブ；オファツムマブ；オララツマブ；オロキズマブ；オマリズマブ；オナルツズマブ；オネルセプト；オポルツズマブモナトクス；オレゴボマブ；オテリキシズマブ；オキセルマブ；オゾラリズマブ；パギバキシマブ；パリビズマブ；パニツムマブ；パノバクマブ；パスコリズマブ；パテクリズマブ；パトリツマブ；ペグスネルセプト；ペムツモマブ；ペルツズマブ；ペキセリズマブ；ピンツモマブ；プラクルマブ；ポネズマブ；プリリキシマブ；プリツムマブ；PRO 140；キリズマブ；ラコツモマブ；ラドレツマブ；ラフィビルマブ；ラムシルマブ；ラニビズマブ；ラキシバクマブ；レガビルマブ；レスリズマブ；RG1507／HuMax-IGF1R；RG1512／HuMax-pセレクチン；リロナセプト；リロツムマブ；リツキシマブ；ロバツムマブ；ロレヅマブ；ロモソズマブ；ロンタリズマブ；ロベリズマブ；ルプリズマブ；サマリズマブ；サリルマブ；サツモマブ；サツモマブペンデチド；セクキヌマブ；セビルマブ；シブロツズマブ；シファリムマブ；シルツキシマブ；シプリズマブ；シルクマブ；ソラネズマブ；ソリトマブ；ソネプシズマブ；ソンツズマブ；ソタテルセプト；スタムルマブ；スレソマブ；スビズマブ；タバルマブ；タカツズマブテトラキセタン；タドシズマブ；タリズマブ；タネズマブ；タプリツモマブパプトクス；テフィバズマブ；テリモマブアリトクス；テナツモマブ；テネリキシマブ；テプリズマブ；テプロツムマブ；TGN1412；チシリムマブ（＝トレメリムマブ）；チガツズマブ；TNX-650；トシリズマブ（＝アトリズマブ）；トラリズマブ；トラプセル；トシツモマブ；トラロキヌマブ；トラスツズマブ；トラスツズマブエムタンシン；TRBS07；トレバナニブ；トレガリズマブ；トレメリムマブ；ツコツズマブセルモロイキン；ツビルマブ；ウブリツキシマブ；ウレルマブ；ウルトキサズマブ；ウステキニマブ；バパリキシマブ；バテリズマブ；ベドリズマブ；ベルツズマブ；ベパリモマブ；ベセンクマブ；ビシリズマブ；ボロシキシマブ；ボルセツズマブマフォドチン；ボツムマブ；ザルツムマブ；ザノリムマブ；ジラリムマブ；およびゾリモマブアリトクス。 A suitable second antibody that does not contain mutations in amino acid residues selected from those corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain Examples of include, but are not limited to, any of the following: (90Y) crivutuzumab tetraxetane; (90Y) Takatuzumab tetraxetane; (99mTc) fanoresomab; (99mTc) nofetumo (99mTc) Pintumomab; 3F8; 8H9; Avagobomab; Abatacept; Absuximab; Actuxumab; Adalimumab; Adektumumab; Aferimomab; Alzumomab pentetate; Albirceptos dotox; Amatsu Shimabumab; AMG714 / HuMax-IL15; Anatumomabumafenatox; Anlucinzumab (= IMA-638); Apolizumab; Arcitsumumab; Acetizumab; Belatizumab; benlizumab betinumab; benlizumab betinumab; benlizumab Tanshin; Kantzuzumab tanshin; Caprazizumab zumab; Capromab; Capromabu pende Chid; Carlumumab; Katumaxomab; CC49; Cedelizumab; Sertolizumab Pegor; Cetuximab; Ch.14.18; Citazumab Bogatox; Dacetuzumab; daclizumab; darurizumab; edremomab; Rimomab Pegor; Enokizumab; Encituximab; Epitumomab; Epitumomab Shixetane; Fuzutumab; felitzumab; fetizumab; fetizumab; Ganitumab; gantenerumab; gabilimomab; gemtuzumab; gemtuzumab ozogamicin; geboxizumab; girentuximab; Anti-cMet antibodies as described above; anti-Her2 antibodies as disclosed in WO 2011/147986 or WO 2011/147982; WO 2004/058 Anti-IL8 antibody as disclosed in 797; anti-TAC antibody as disclosed in WO 2004/045512; anti-tissue factor as disclosed in WO 2010/066803 or WO 2011/157741 (TF) antibody; ivalizumab; ibritumomab tiuxetane; iculumab; Irituzumab; ixekizumab; keliximab; levetizumab; lebrikizumab; remaresomab; renercept; Muburisumumab; Metolisumumab; Metolizumab; Metolizumab; Neshitsumumabu; Nererimomabu; nimotuzumab; nivolumab; Nofetsumomabu; Merupentan; Obinitsuzumabu; Okaratsuzumabu; ocrelizumab; Odzurimomabu; ofatumumab; Oraratsumabu; Orokizumabu; omalizumab; Onarutsuzumabu; onercept; opportunistic Ruth's Mabu Mona Tok scan; oregovomab; Oterikishizumabu; Okiserumabu; Ozorarizumabu; Pagibakishimabu; palivizumab Panitumuma Panovazumab; paclizumab; paclitumumab; paclitumumab; patrizumab; petizumab; petizumab; petuzumab; HuMax-IGF1R; RG1512 / HuMax-p selectin; rilonacept; rirotumumab; rituximab; lovatumumab; loretuzumab; romozumab; Siplizumab; silk mab; solanezumab Sonetizumab; Sontuzumab; Sontuzumab; Sotatercept; Stamtelumab; TGN1412; ticilimumab (= tremelimumab); tigatuzumab; tretanizumab; tretanizumab; Ubrutuximab; Ulerumab; Urtoxazumab; Ustekinimab; Vapariximab; Tetlizumab; vedolizumab; veltuzumab; bepalimomab; besencumab; bicilizumab; borociximab;
第1および第2の変異型抗体は、実施例10に示したように、あらゆる野生型または天然型の抗体と比較して、相互でのオリゴマー形成への選好性を有すると考えられる。 As shown in Example 10, the first and second variant antibodies are believed to have a preference for mutual oligomerization compared to any wild-type or native antibody.
1つの態様において、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における変異はK439D/Eであり、かつ／またはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における変異はS440K/Rである。 In one embodiment, the mutation at the position corresponding to K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain is K439D / E and / or the mutation at the position corresponding to S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain is S440K / R. is there.
そのため、特異性の増強は、「CDCの誘導」に関するものである。したがって、前記方法は、1つの態様において、少なくとも第1および第2の親ポリペプチドの組み合わせによってエフェクター機能の誘導の特異性を高める方法である。 Therefore, the enhancement of specificity relates to “induction of CDC”. Accordingly, the method is, in one embodiment, a method for increasing the specificity of induction of effector function by a combination of at least a first and a second parent polypeptide.
エフェクター機能の特異性またはエフェクター機能の誘導の特異性を高める方法を行うことによって、少なくとも第1および第2の親ポリペプチドの組み合わせにより、第1の変異体および第2の変異型ポリペプチドの組み合わせが得られる。 A combination of the first variant and the second variant polypeptide by at least a combination of the first and second parent polypeptides by performing a method of increasing the specificity of the effector function or the induction of the effector function Is obtained.
親ポリペプチドのK439またはS440のいずれかに変異を導入することによって、それによって得られた変異型ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して低下したエフェクター機能を有する。しかし、同じく本明細書中の他所で説明しているように、K439およびS440における変異は互いに補完すること、または両方の変異を含むポリペプチドのエフェクター機能を回復させることができる。K439およびS440における変異が互いに補完するというこの能力は、2つのポリペプチドにおいても同様に利用することができる。したがって、K439における変異を第1の親ポリペプチドに導入して、かつS440における変異を第2の親ポリペプチドに導入すると、またはその反対を行うと、第1および第2の変異型ポリペプチドを組み合わせて用いる場合にはエフェクター機能の低下ははもはや認められない。「特異性を高めること」または「特異性を向上させること」という用語は、この文脈において、K439における変異を含む第1の変異型ポリペプチドとS440における変異を含む第2の変異型ポリペプチドとの組み合わせによって誘導されるエフェクター応答が、K439における第1の変異を含む変異型ポリペプチドまたはS440における変異を含む第2の変異型ポリペプチドのいずれかによって誘導されるエフェクター応答よりも高度であることを指す。 By introducing mutations into either the parent polypeptide, K439 or S440, the resulting mutant polypeptide has reduced effector function compared to the parent polypeptide. However, as also described elsewhere herein, mutations in K439 and S440 can complement each other or restore the effector function of a polypeptide containing both mutations. This ability of mutations in K439 and S440 to complement each other can be exploited in the two polypeptides as well. Thus, when the mutation at K439 is introduced into the first parent polypeptide and the mutation at S440 is introduced into the second parent polypeptide, or vice versa, the first and second mutant polypeptides are When used in combination, a decrease in effector function is no longer observed. The terms “enhancing specificity” or “enhancing specificity” in this context refer to a first mutant polypeptide comprising a mutation at K439 and a second mutant polypeptide comprising a mutation at S440. The effector response induced by the combination of is higher than the effector response induced by either the mutant polypeptide containing the first mutation at K439 or the second mutant polypeptide containing the mutation at S440 Point to.
K439およびS440における両方のアミノ酸置換の導入によって、オリゴマー形成の特異性が高くなる。 The introduction of both amino acid substitutions at K439 and S440 increases the specificity of oligomer formation.
位置K439および／またはS440の変異を第1の変異と組み合わせると、CDCの増強が得られ、かつCDCの特異性が増強される。 Combining the mutation at position K439 and / or S440 with the first mutation results in enhanced CDC and increased CDC specificity.
1つの態様において、少なくとも第1および第2の親ポリペプチドは同じ結合部位と結合し、または、抗体に関しては同一のエピトープと結合する。 In one embodiment, at least the first and second parent polypeptides bind to the same binding site or, for antibodies, bind to the same epitope.
1つの態様において、少なくとも第1および第2の親ポリペプチドは同一の標的上の異なる結合部位と結合し、または、抗体に関しては同一の抗原上の異なるエピトープと結合する。 In one embodiment, at least the first and second parent polypeptides bind to different binding sites on the same target or, for antibodies, bind to different epitopes on the same antigen.
1つの態様において、少なくとも第1および第2の親ポリペプチドは異なる標的上の異なるエピトープと結合する。 In one embodiment, at least the first and second parent polypeptides bind to different epitopes on different targets.
1つの態様において、第1および第2の親ポリペプチドは第1および第2の親抗体であり、同じまたは異なるVL配列およびVH配列を有する。 In one embodiment, the first and second parent polypeptides are first and second parent antibodies and have the same or different VL and VH sequences.
1つの態様において、少なくとも第1および第2の親ポリペプチドの組み合わせは、1つの第1の親ポリペプチドおよび1つの第2のポリペプチドを含む。 In one embodiment, the combination of at least the first and second parent polypeptides comprises one first parent polypeptide and one second polypeptide.
1つの態様において、特異性は、第1および第2の親ポリペプチドの組み合わせが抗原発現細胞上、細胞膜上またはビリオン上のその結合部位または抗原と結合したときに高くなる。 In one embodiment, the specificity is increased when the combination of the first and second parent polypeptides binds to its binding site or antigen on an antigen-expressing cell, cell membrane or virion.
それ故に、別の局面において、本発明はまた、1つのポリペプチドの2つ以上のアミノ酸残基における変異の使用であって、抗原発現細胞上、細胞膜上またはビリオン上のその抗原と結合したときの該ポリペプチドの特異性（例えば該ポリペプチドによって誘導されるCDCの特異性）を高めるための使用にも関し、ここで
第1の変異はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応するアミノ酸残基にあり；
第2の変異はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応するアミノ酸残基にある。
Therefore, in another aspect, the invention also provides for the use of a mutation in two or more amino acid residues of a polypeptide when bound to that antigen on an antigen-expressing cell, cell membrane or virion. Of the polypeptide (eg, the specificity of CDC induced by the polypeptide), wherein the first mutation is an amino acid corresponding to K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain In the residue;
The second mutation is in the amino acid residue corresponding to S440 in the Fc region of human IgG1 heavy chain.
1つの態様において、第1および第2の親ポリペプチドは、免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とをそれぞれが含む、第1および第2の親抗体である。 In one embodiment, the first and second parent polypeptides are first and second parent antibodies, each comprising an immunoglobulin Fc domain and an antigen binding region.
1つの態様において、第1および第2の親抗体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体である。 In one embodiment, the first and second parent antibodies are monospecific antibodies, bispecific antibodies or multispecific antibodies.
1つの態様において、第1および／または第2の親抗体は、免疫グロブリンの第1のCH2-CH3領域と第1の抗原結合領域とを含む第1のポリペプチドおよび第2のCH2-CH3領域と第2の抗原結合領域とを含む第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体であり、第1および第2の抗原結合領域は同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、前記第1のCH2-CH3領域は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸変異を含み；第2のCH2-CH3領域は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸変異を含み、かつ、第1のCH2-CH3領域におけるさらなるアミノ酸変異は、第2のCH2-CH3領域におけるさらなるアミノ酸変異とは異なる。 In one embodiment, the first and / or second parent antibody comprises a first polypeptide comprising a first CH2-CH3 region and a first antigen-binding region of an immunoglobulin and a second CH2-CH3 region. A bispecific antibody comprising a second polypeptide comprising a second antigen-binding region, wherein the first and second antigen-binding regions bind to different epitopes on the same antigen or on different antigens, The first CH2-CH3 region comprises an additional amino acid mutation at a position selected from those corresponding to K409, T366, L368, K370, D399, F405 and Y407 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain; The -CH3 region comprises an additional amino acid mutation at a position selected from those corresponding to F405, T366, L368, K370, D399, Y407 and K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, and the first CH2-CH3 Additional amino acid mutations in the region may result in additional amino acids in the second CH2-CH3 region. Different from the acid mutations.
1つの好ましい態様において、第1のCH2-CH3領域は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409に対応する位置にさらなるアミノ酸変異（例えばK409R）を含み；かつ、第2のCH2-CH3領域は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405に対応する位置にさらなるアミノ酸変異、例えばF405Lを含む。 In one preferred embodiment, the first CH2-CH3 region comprises an additional amino acid mutation (eg, K409R) at a position corresponding to K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain; and the second CH2-CH3 region is Additional amino acid mutations, such as F405L, are included at positions corresponding to F405 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain.
この方法を実施することによって、少なくとも第1および第2の変異型抗体の組み合わせが得られる。この方法によって得られる少なくとも第1および第2の変異型抗体は、組み合わされた場合に、第1および第2の親抗体の組み合わせと比較して増強されたCDCを有する。 By performing this method, a combination of at least the first and second mutant antibodies is obtained. At least the first and second variant antibodies obtained by this method have enhanced CDC when combined as compared to the combination of the first and second parent antibodies.
「増強されたCDC」という用語は、以下に記載するように解釈されるものとする。 The term “enhanced CDC” shall be construed as described below.
第1および／または第2の親抗体は、本明細書に記載されるような任意の親抗体であってもよい。 The first and / or second parent antibody may be any parent antibody as described herein.
第1および第2の抗体の組み合わせのCDCを増強する方法は、特に、本明細書に記載されるような変異型抗体の特徴のいずれかを有する第1および／または第2の変異型抗体を得るために行うことができる。 A method of enhancing the CDC of a combination of a first and second antibody specifically includes first and / or second variant antibodies having any of the features of variant antibodies as described herein. Can be done to get.
1つの態様において、少なくとも第1および第2の親抗体は同一のエピトープと結合する。 In one embodiment, at least the first and second parent antibody bind to the same epitope.
1つの態様において、少なくとも第1および第2の親抗体は同一の抗原上の異なるエピトープと結合する。 In one embodiment, at least the first and second parent antibody bind to different epitopes on the same antigen.
1つの態様において、少なくとも第1および第2の親抗体は異なる標的上の異なるエピトープと結合する。 In one embodiment, at least the first and second parent antibodies bind to different epitopes on different targets.
1つの態様において、第1および第2の親抗体は同じまたは異なるVL配列およびVH配列を有する。 In one embodiment, the first and second parent antibodies have the same or different VL and VH sequences.
1つの態様において、少なくとも第1および第2の親抗体の組み合わせは、1つの第1の親抗体および1つの第2の抗体を含む。 In one embodiment, the combination of at least the first and second parent antibodies comprises one first parent antibody and one second antibody.
1つの態様において、少なくとも第1および第2の親抗体の組み合わせは、第3、第4または第5の親抗体などのさらなる親抗体を含む。 In one embodiment, the combination of at least a first and second parent antibody comprises an additional parent antibody, such as a third, fourth or fifth parent antibody.
1つの態様において、第1および第2の二重特異性または多重特異性の親抗体は、同じ抗体であるかまたは異なる抗体である。1つの態様において、第1および第2の二重特異性または多重特異性の親抗体は、同じまたは異なる抗原上の異なるエピトープと結合する。したがって、1つの態様において、前記少なくとも第1および第2の親抗体は、同一の抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合する二重特異性または多重特異性抗体である。 In one embodiment, the first and second bispecific or multispecific parent antibodies are the same antibody or different antibodies. In one embodiment, the first and second bispecific or multispecific parent antibodies bind to different epitopes on the same or different antigens. Thus, in one embodiment, the at least first and second parent antibodies are bispecific or multispecific antibodies that bind to different epitopes on the same antigen or on different antigens.
本発明の方法および／または使用の1つの態様において、親抗体は、それが親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体のいずれであるかにかかわらず、エフェクター機能に影響を及ぼすことが見いだされた本発明の変異以外の他の変異を含有してもよい。そのような他の変異は、エフェクター機能に影響を及ぼす本発明の変異と同時に導入されてもよく、またはそれらが逐次的に導入されてもよく、本発明の方法または使用は、変異の同時導入または逐次導入のいずれかに限定されない。さまざまな方式を用いうることが予見されることから、二重特異性抗体は任意の二重特異性抗体であってもよく、本発明の方法および使用はいかなる特定の二重特異性フォーマットにも限定されない。 In one embodiment of the methods and / or uses of the present invention, the parent antibody affects effector function, whether it is a parent antibody, a first parent antibody or a second parent antibody. May contain other mutations other than the mutation of the present invention. Such other mutations may be introduced at the same time as the mutations of the invention that affect effector function, or they may be introduced sequentially, and the method or use of the invention may involve simultaneous introduction of mutations. It is not limited to any one of sequential introduction. The bispecific antibody can be any bispecific antibody since it is envisaged that various formats can be used, and the methods and uses of the present invention can be applied to any specific bispecific format. It is not limited.
1つの態様において、本方法は、親ポリペプチドまたは親抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）を変更しない。 In one embodiment, the method does not alter the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) of the parent polypeptide or antibody.
1つの態様において、本方法は、実施例34に開示された方法によって決定される親ポリペプチドまたは親抗体の新生児Fc受容体（FcRn）に対する結合を変更しない。 In one embodiment, the method does not alter the binding of the parent polypeptide or antibody to the neonatal Fc receptor (FcRn) as determined by the method disclosed in Example 34.
1つの態様において、本方法は、実施例34に開示された方法によって決定される、OD405nmでの吸光度の変化によって測定される親ポリペプチドまたは親抗体の新生児Fc受容体（FcRn）に対する結合を、30％を上回って、例えば20％、10％または5％を上回って増加させることも減少させることもない。 In one embodiment, the method comprises binding of the parent polypeptide or parent antibody to the neonatal Fc receptor (FcRn) as measured by the change in absorbance at OD405 nm as determined by the method disclosed in Example 34. It does not increase or decrease more than 30%, for example more than 20%, 10% or 5%.
1つの態様において、本方法は、実施例34に開示された方法によって決定される親ポリペプチドもしくは親抗体のマウス新生児Fc受容体（FcRn）に対する見かけの親和性を0.5倍を上回って増強しない、または親ポリペプチドもしくは親抗体のマウスFcRnに対する見かけの親和性を2倍を上回って低下させない。 In one embodiment, the method does not enhance the apparent affinity of the parent polypeptide or antibody to the mouse neonatal Fc receptor (FcRn) as determined by the method disclosed in Example 34 by more than 0.5 fold. Or does not reduce the apparent affinity of the parent polypeptide or antibody to mouse FcRn by more than 2-fold.
1つの態様において、本方法は、実施例37に開示された方法によって決定される親ポリペプチドまたは親抗体の血漿クリアランス速度を変更しない。 In one embodiment, the method does not alter the plasma clearance rate of the parent polypeptide or antibody as determined by the method disclosed in Example 37.
1つの態様において、本方法は、実施例37に開示された方法によって決定される親ポリペプチドまたは親抗体の血漿クリアランス速度を、3.0倍を上回って、例えば2.5倍、2.0倍、1.5倍または1.2倍を上回って増強することも低下させることもない。 In one embodiment, the method provides a plasma clearance rate of the parent polypeptide or antibody determined by the method disclosed in Example 37 that is greater than 3.0 times, such as 2.5 times, 2.0 times, 1.5 times or 1.2 times. It does not increase or decrease more than twice.
1つの態様において、本方法は、実施例36に開示された方法によって決定される変異体の標的非依存的な液相中での補体活性化を変更しない。 In one embodiment, the method does not alter complement activation in the target-independent fluid phase of the mutant as determined by the method disclosed in Example 36.
1つの態様において、本方法は、親ポリペプチドまたは親抗体の血漿中半減期を変更しない。 In one embodiment, the method does not alter the plasma half-life of the parent polypeptide or antibody.
本明細書に記載された変異またはそれらの組み合わせの任意のものを、本発明の方法に従って導入することができる。 Any of the mutations described herein or combinations thereof can be introduced according to the methods of the invention.
例示的な、または好ましいアミノ酸置換から選択された変異を、実施例に記載されたもののような、抗原が結合した抗体のオリゴマー形成、ならびにC1q結合、補体活性化、CDC、ADCCおよび／または細胞内移行の増強を検出することを可能にする、適したアッセイにおいて試験することができる。例えば、C1q結合力は、抗体変異体に対する抗原を発現する細胞を用いて、実施例4に記載されたものに類似したアッセイに従って決定することができる。例示的なCDCアッセイは、実施例5、6、10、16、19、22、23、24、25および35に提示されている。例示的なADCCアッセイは実施例12に提示されている。例示的な細胞内移行アッセイは実施例26に提示されている。さらに、C1q結合に直接関与するアミノ酸残基における変異を、オリゴマー形成に影響を及ぼす変異と区別するためには、例えば、実施例3に従ったELISAアッセイにおけるC1q結合を、例えば、実施例4に従った細胞ベースアッセイにおけるC1q結合と比較するとよく、実施例37に記載されたアッセイに従って血漿クリアランス速度と比較するとよく、実施例34に従ってFcRn結合と比較するとよく、標的非依存性の液相中での補体活性化を実施例36におけるアッセイに従って評価してもよい。 Mutations selected from exemplary or preferred amino acid substitutions include oligomerization of antigen-bound antibodies, such as those described in the Examples, and C1q binding, complement activation, CDC, ADCC and / or cells It can be tested in a suitable assay that makes it possible to detect enhanced internalization. For example, C1q binding ability can be determined according to an assay similar to that described in Example 4 using cells expressing an antigen against the antibody variant. Exemplary CDC assays are presented in Examples 5, 6, 10, 16, 19, 22, 23, 24, 25, and 35. An exemplary ADCC assay is presented in Example 12. An exemplary intracellular translocation assay is presented in Example 26. Furthermore, in order to distinguish mutations in amino acid residues directly involved in C1q binding from mutations affecting oligomer formation, for example, C1q binding in an ELISA assay according to Example 3 is described in Example 4, for example. Compared to C1q binding in the cell-based assay followed, compared to plasma clearance rate according to the assay described in Example 37, compared to FcRn binding according to Example 34, and in a target-independent liquid phase Complement activation may be assessed according to the assay in Example 36.
1つの態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失またはアミノ酸挿入であってもよい。 In one embodiment, the mutation at one or more amino acid residues may be an amino acid substitution, amino acid deletion or amino acid insertion.
1つの態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基における変異はアミノ酸欠失である。 In one embodiment, the mutation at one or more amino acid residues is an amino acid deletion.
1つの態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基における変異はアミノ酸挿入である。 In one embodiment, the mutation at one or more amino acid residues is an amino acid insertion.
1つの特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基における変異はアミノ酸置換である。 In one particular embodiment, the mutation at one or more amino acid residues is an amino acid substitution.
1つの態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、表1に列記されたアミノ酸置換、アミノ酸欠失の任意のものから選択されうる。 In one embodiment, the mutation at one or more amino acid residues can be selected from any of the amino acid substitutions, amino acid deletions listed in Table 1.
したがって、1つの態様において、E345Xは、E345R、Q、N、K、Y、A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、S、T、V、WもしくはY；特にE345A、D、G、H、K、N、Q、R、S、T、YもしくはW；またはより詳細にはE345D、K、N、Q、RもしくはW；またはさらにより詳細にはE345R、Q、N、KもしくはYでありうる。さらに好ましい態様において、E345XはE345KまたはE345Qである。 Thus, in one embodiment, E345X is E345R, Q, N, K, Y, A, C, D, F, G, H, I, L, M, P, S, T, V, W or Y; In particular E345A, D, G, H, K, N, Q, R, S, T, Y or W; or more particularly E345D, K, N, Q, R or W; or even more particularly E345R, Can be Q, N, K or Y. In a further preferred embodiment, E345X is E345K or E345Q.
別のさらなる態様において、E430Xは、E430T、S、G、F、H、A、C、D、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、WまたはY；特にE430T、S、G、FまたはHでありうる。さらに好ましい態様において、E430XはE430GまたはE430Sである。別の態様において、変異は、任意で、実施例3に従ったELISAアッセイにおけるC1q結合を、実施例4に従った細胞ベースアッセイにおけるC1q結合と比較することによって決定されるような、C1q結合に直接関与するアミノ酸残基にはない。 In another further embodiment, E430X is E430T, S, G, F, H, A, C, D, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W or Y; in particular E430T, It can be S, G, F or H. In a further preferred embodiment, E430X is E430G or E430S. In another embodiment, the mutation is optionally in C1q binding, as determined by comparing C1q binding in the ELISA assay according to Example 3 to C1q binding in the cell-based assay according to Example 4. There are no amino acid residues directly involved.
1つの態様において、1つまたは複数の変異は1つの変異であり、すなわち、複数の変異が親抗体に導入されることはない。 In one embodiment, the one or more mutations are one mutation, i.e., no more than one mutation is introduced into the parent antibody.
別の態様において、本発明の方法または使用は、表1におけるアミノ酸残基のうち少なくとも2つ、例えば2つ、3つ、4つ、5つまたはそれより多いアミノ酸残基に変異を導入する段階を含む。 In another embodiment, the method or use of the invention introduces mutations into at least two of the amino acid residues in Table 1, such as 2, 3, 4, 5 or more amino acid residues. including.
本明細書に記載された変異の組み合わせのうち任意のものを、本発明の方法に従って導入することができる。 Any of the combinations of mutations described herein can be introduced according to the methods of the present invention.
1つの態様において、本方法は、親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345X、E430X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択されるアミノ酸残基における複数の変異、例えば2つ、3つ、4つまたは5つ、特に2つまたは3つの変異を導入する段階を含む。例えば、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345X、E430X、S440YおよびS440Wに対応するアミノ酸残基のうち少なくとも2つ以上、例えば、E345X、E430X、S440YおよびS440Wのうち2つまたはすべてを、任意で、表1に列記された1つまたは複数の他のアミノ酸における変異と組み合わせて、変異させることができる。少なくとも2つの変異は、位置E345の任意のアミノ酸残基置換を位置E430もしくはS440YもしくはS440Wの任意のアミノ酸残基置換と組み合わせたものであってよく、または位置E430の任意のアミノ酸置換を位置S440YもしくはS440Wの任意のアミノ酸残基と組み合わせたものであってもよい。1つのさらなる態様においては、2つまたは3つの変異が、親抗体に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E345KおよびE345Qに対応する群から選択されるアミノ酸残基に導入される。 In one embodiment, the method comprises a plurality of mutations in an amino acid residue selected from the group corresponding to E345X, E430X, S440Y and S440W in the Fc region of a human IgG1 heavy chain relative to the parent polypeptide, for example two Introducing three, four or five, especially two or three mutations. For example, at least two or more amino acid residues corresponding to E345X, E430X, S440Y and S440W in the Fc region of human IgG1 heavy chain, for example, two or all of E345X, E430X, S440Y and S440W, optionally, Mutations can be combined with mutations in one or more other amino acids listed in Table 1. The at least two mutations may combine any amino acid residue substitution at position E345 with any amino acid residue substitution at position E430 or S440Y or S440W, or any amino acid substitution at position E430 at position S440Y or It may be combined with any amino acid residue of S440W. In one further embodiment, two or three mutations are introduced into the amino acid residues selected from the group corresponding to E430G, E430S, E345K and E345Q in the Fc region of the human IgG1 heavy chain relative to the parent antibody. The
アミノ酸残基における2つの変異のそのような組み合わせは、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE345X／E430X、E345X／S440Y、E345X／S440W、E430X／S440YおよびE430X／S440Wに対応する群から選択される。 Such a combination of two mutations at amino acid residues is selected from the group corresponding to E345X / E430X, E345X / S440Y, E345X / S440W, E430X / S440Y and E430X / S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain.
本発明による方法または用途において、CDCは、抗体がその抗原と結合したときに増強される。 In the method or application according to the invention, CDC is enhanced when the antibody binds to its antigen.
いかなる理論にも拘束されないものの、CDCは、抗体がその抗原と結合したときに増強されると考えられ、ここで抗原は抗原発現細胞上、細胞膜上またはビリオン上にある。1つの態様において、IgG1重鎖のFc領域は、SEQ ID NO：1の残基130〜330の配列を含む。 While not being bound by any theory, CDC is believed to be enhanced when an antibody binds its antigen, where the antigen is on an antigen-expressing cell, on the cell membrane, or on a virion. In one embodiment, the Fc region of an IgG1 heavy chain comprises the sequence of residues 130-330 of SEQ ID NO: 1.
親ポリペプチドまたは親抗体は、本明細書に記載されたような任意の親ポリペプチドまたは任意の親抗体であってよい。この文脈における親ポリペプチドおよび親抗体は、第1の親ペプチドおよび第2の親ポリペプチドならびに第1の親抗体および第2の親抗体であることも意図している。 The parent polypeptide or parent antibody may be any parent polypeptide or any parent antibody as described herein. Parent polypeptide and parent antibody in this context are also intended to be a first parent peptide and a second parent polypeptide and a first parent antibody and a second parent antibody.
1つの態様において、親抗体は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgMまたはIgE抗体である。 In one embodiment, the parent antibody is a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM or IgE antibody.
1つの態様において、親抗体はヒト完全長抗体、例えばヒト完全長IgG1抗体である。 In one embodiment, the parent antibody is a human full length antibody, such as a human full length IgG1 antibody.
1つの態様において、親抗体、第1の親抗体および第2の親抗体は、ヒトIgG1抗体、例えばIgG1m（za）またはIgG1m（f）アロタイプであって、任意でSEQ ID NO：1または5を含むFc領域を含む。 In one embodiment, the parent antibody, the first parent antibody and the second parent antibody are human IgG1 antibodies, such as IgG1m (za) or IgG1m (f) allotypes, optionally comprising SEQ ID NO: 1 or 5 Includes Fc region.
1つの態様において、親抗体はヒトIgG2抗体であって、任意でSEQ ID NO：2を含むFc領域を含む。 In one embodiment, the parent antibody is a human IgG2 antibody and optionally comprises an Fc region comprising SEQ ID NO: 2.
1つの態様において、親抗体はヒトIgG3抗体であって、任意でSEQ ID NO：3を含むFc領域を含む。 In one embodiment, the parent antibody is a human IgG3 antibody and optionally comprises an Fc region comprising SEQ ID NO: 3.
1つの態様において、親抗体はヒトIgG4抗体であって、任意でSEQ ID NO：4を含むFc領域を含む。 In one embodiment, the parent antibody is a human IgG4 antibody and optionally comprises an Fc region comprising SEQ ID NO: 4.
1つの態様において、親抗体は二重特異性抗体である。 In one embodiment, the parent antibody is a bispecific antibody.
1つの態様において、親抗体は本明細書に記載されたような任意の抗体であり、これには例えば、Fc領域の少なくとも一部を含む抗体断片、一価抗体（GenmabによるWO007059782号に記載）；2つの重鎖のみからなり、例えばラクダ科動物などにおいて天然に存在する重鎖抗体（例えば、Hamers-Casterman (1993) Nature 363:446)；ThioMab（Roche、WO2011069104号）、非対称性の二重特異性抗体様分子である鎖交換組換えドメイン（SEEDまたはSeed-body）（Merck、WO2007110205号）；Triomab（Fresenius、Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155:219）；FcΔAdp（Regeneron、WO2010151792号）、Azymetric Scaffold（Zymeworks／Merck、WO2012/058768号）、mAb-Fv（Xencor、WO2011/028952号）、二重可変ドメイン免疫グロブリン（Abbott、DVD-Ig、米国特許第7,612,181号）；二重ドメイン双頭抗体（Unilever；Sanofi Aventis、WO20100226923号）、ジ-ダイアボディ（ImClone／Eli Lilly）、ノブ・イントゥ・ホール抗体フォーマット（Genentech、WO9850431号）；デュオボディ（Genmab、WO 2011/131746号）；静電ステアリング抗体フォーマット（Amgen、EP1870459号およびWO 2009089004号；Chugai、US201000155133号；Oncomed、WO 2010129304A2号）；二重特異性IgG1およびIgG2（Rinat neurosciences Corporation、WO11143545号）、CrossMAb（Roche、WO2011117329号）、LUZ-Y（Genentech）、Biclonic（Merus）、二重標的指向性ドメイン抗体（GSK／Domantis）、2つの標的を認識するツー・イン・ワン抗体（Genentech、NovImmune）、架橋Mab（Karmanos Cancer Center）、CovX-body（CovX／Pfizer）、IgG様二重特異性（ImClone／Eli Lilly、Shen, X, et al. J Immunol Methods, 2007. 318(1-2): p. 65-74）、ならびにDIG-bodyおよびPIG-body（Pharmabcine）、ならびに二重親和性再標的指向性分子（Fc-DARTまたはIg-DART、Macrogenicsによる、WO/2008/157379号、WO/2010/080538号）、Zybody（Zyngenia）、共通の軽鎖（Crucell／Merus、US7262028号）または共通の重鎖（NovImmuneによるκλbody）を用いるアプローチ、さらには、ZymoGenetics／BMSによるBsAbのように、ポリペプチド配列をFcドメインを含有する抗体断片と融合させたものを含む、scFv融合物のような融合タンパク質）、Biogen IdecによるHERCULES（US007951918号）、Emergent BioSolutions／TrubionによるSCORPION、Ts2Ab（MedImmune／AZ（Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009. 393(3): p. 672-92）、NovartisによるscFv融合物、Changzhou Adam Biotech IncによるscFv融合物（CN 102250246号）、RocheによるTvAb（WO 2012025525号、WO 2012025530号）、f-StarによるmAb2（WO2008/003116号）および二重scFv融合物がある。また、抗体という用語が、別に指定する場合を除き、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ヒトモノクローナル抗体など）、抗体混合物（組換えポリクローナル体）、例えばSymphogenおよびMerusによって開発された技術（Oligoclonics）によって作製されたもの、ならびに抗体様ポリペプチド、例えばキメラ抗体およびヒト化抗体なども含むことが理解されるべきである。作製される抗体は、可能性として任意のアイソタイプを有しうる。 In one embodiment, the parent antibody is any antibody as described herein, for example, an antibody fragment comprising at least a portion of the Fc region, a monovalent antibody (described in WO007059782 by Genmab) A heavy chain antibody consisting only of two heavy chains, eg naturally occurring in camelids (eg Hamers-Casterman (1993) Nature 363: 446); ThioMab (Roche, WO2011069104), asymmetric duplex Specific antibody-like molecules, chain exchange recombination domains (SEED or Seed-body) (Merck, WO2007110205); Triomab (Fresenius, Lindhofer et al. (1995 J Immunol 155: 219); FcΔAdp (Regeneron, WO2010151792) , Azymetric Scaffold (Zymeworks / Merck, WO2012 / 058768), mAb-Fv (Xencor, WO2011 / 028952), dual variable domain immunoglobulin (Abbott, DVD-Ig, US Pat. No. 7,612,181); Antibody (Unilever; Sanofi Aventis, WO20100226923), Jida Iabody (ImClone / Eli Lilly), Knob into hall antibody format (Genentech, WO9850431); Duobody (Genmab, WO 2011/131746); Electrostatic steering antibody format (Amgen, EP1870459 and WO 2009089004; Chugai , US201000155133; Oncomed, WO 2010129304A2); bispecific IgG1 and IgG2 (Rinat neurosciences Corporation, WO11143545), CrossMAb (Roche, WO2011117329), LUZ-Y (Genentech), Biclonic (Merus), dual target Directed domain antibody (GSK / Domantis), two-in-one antibody that recognizes two targets (Genentech, NovImmune), cross-linked Mab (Karmanos Cancer Center), CovX-body (CovX / Pfizer), IgG-like bispecific Sex (ImClone / Eli Lilly, Shen, X, et al. J Immunol Methods, 2007. 318 (1-2): p. 65-74), as well as DIG-body and PIG-body (Pharmabcine), and dual affinity Retargeting molecules (Fc-DART or Ig-DART, Macrogenic s approach using WO / 2008/157379, WO / 2010/080538), Zybody (Zyngenia), common light chain (Crucell / Merus, US7262028) or common heavy chain (κλbody according to NovImmune), Is a fusion protein such as a scFv fusion containing a polypeptide sequence fused to an antibody fragment containing an Fc domain, such as BsAb by ZymoGenetics / BMS), HERCULES by Biogen Idec (US007951918), Emergent SCORPION by BioSolutions / Trubion, Ts2Ab (MedImmune / AZ (Dimasi, N., et al. J Mol Biol, 2009. 393 (3): p. 672-92), scFv fusion by Novartis, scFv by Changzhou Adam Biotech Inc There are fusions (CN 102250246), TvAbs by Roche (WO 2012025525, WO 2012025530), mAb 2 by f-Star (WO2008 / 003116) and double scFv fusions. Unless otherwise specified, the term antibody is produced by polyclonal antibodies, monoclonal antibodies (such as human monoclonal antibodies), antibody mixtures (recombinant polyclonal bodies), for example, techniques developed by Symphonogen and Merus (Oligoclonics). As well as antibody-like polypeptides, such as chimeric antibodies and humanized antibodies. The antibody produced can potentially have any isotype.
別の態様において、抗原は細胞の表面上で発現される。 In another embodiment, the antigen is expressed on the surface of the cell.
別の態様において、細胞はヒト腫瘍細胞である。 In another embodiment, the cell is a human tumor cell.
1つのさらなる態様において、抗原は、erbB1（EGFR）、erbB2（HER2）、erbB3、erbB4、MUC-1、CD4、CD19、CD20、CD38、CD138、CXCR5、c-Met、HERV-エンベロープタンパク質、ペリオスチン、Bigh3、SPARC、BCR、CD79、CD37、EGFrvIII、IGFr、L1-CAM、AXL、組織因子（TF）、CD74、EpCAMおよびMRP3からなる群より選択される。 In one further embodiment, the antigen is erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD38, CD138, CXCR5, c-Met, HERV-envelope protein, periostin, It is selected from the group consisting of Bigh3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFrvIII, IGFr, L1-CAM, AXL, tissue factor (TF), CD74, EpCAM and MRP3.
別の態様において、抗原は細胞膜に結合している。 In another embodiment, the antigen is bound to the cell membrane.
別の態様において、抗原はビリオンに結合しており、任意で、抗原はビリオンのタンパク質外被または脂質エンベロープの中に含まれる。 In another embodiment, the antigen is bound to a virion, and optionally the antigen is contained within the protein coat or lipid envelope of the virion.
別の態様において、抗体はヒト抗体であり、任意で、CD20およびCD38から選択される少なくとも1つの抗原と結合する。 In another embodiment, the antibody is a human antibody and optionally binds to at least one antigen selected from CD20 and CD38.
別の態様において、抗体は7D8および005のうち少なくとも1つと同じエピトープと結合し、任意で、7D8および005のうち少なくとも1つの可変重鎖および／または可変軽鎖領域を含む。 In another embodiment, the antibody binds to the same epitope as at least one of 7D8 and 005, and optionally comprises at least one variable heavy and / or variable light chain region of 7D8 and 005.
開示された本発明の任意の使用において、本発明のいかなる変異も有しない抗体が任意の親抗体であってもよい。したがって、本明細書における使用は、そのような親抗体の任意の変異体をもたらす。 In any use of the disclosed invention, the antibody without any mutation of the invention may be any parent antibody. Accordingly, use herein results in any variant of such parent antibody.
1つの態様において、エフェクター機能は、例えばFc-γ受容体結合を含む、Fc受容体結合である。 In one embodiment, the effector function is Fc receptor binding, including for example Fc-γ receptor binding.
1つの態様において、エフェクター機能はFc含有ポリペプチドの細胞内移行である。 In one embodiment, the effector function is intracellular translocation of the Fc-containing polypeptide.
1つの態様において、エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害作用（CDC）および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）の組み合わせである。 In one embodiment, the effector function is a combination of complement dependent cytotoxicity (CDC) and antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC).
本明細書で用いる場合、「C1q結合」という用語は、親抗体の変異体または抗体の文脈で用いられる場合、免疫系のさまざまな細胞（エフェクター細胞など）を含む、宿主組織または因子に対する変異体または抗体の結合によって媒介される補体活性化の古典的経路に対する第一成分のあらゆる機序を含む。抗体のC1q結合は、ELISA（例えば、実施例3および4で用いているC1q結合ELISAなど）を用いて評価することができ、またはC1q活性をCDCアッセイ（例えば、実施例5で用いているCDCアッセイなど）によって評価することもできる。1つのさらなる態様において、抗体のC1q結合力は、実施例4に記載されたアッセイに従って決定される。 As used herein, the term “C1q binding” refers to variants to a host tissue or factor, including various cells of the immune system (such as effector cells) when used in the context of a parent antibody variant or antibody. Or includes any mechanism of the first component to the classical pathway of complement activation mediated by antibody binding. C1q binding of the antibody can be assessed using an ELISA (eg, the C1q binding ELISA used in Examples 3 and 4), or C1q activity is assessed using a CDC assay (eg, the CDC used in Example 5). Assay). In one further embodiment, the C1q binding strength of the antibody is determined according to the assay described in Example 4.
開示された本発明のすべての方法において、本発明のいかなる変異も有しない抗体が任意の親抗体であってもよい。したがって、本明細書における方法は、そのような親抗体の任意の変異体をもたらす。 In all disclosed methods of the invention, the antibody without any mutation of the invention may be any parent antibody. Accordingly, the methods herein result in any variant of such parent antibody.
本発明の方法および／または使用によって得られる親抗体、第1の親抗体、第2の親抗体またはそれらの変異体は、本明細書に記載されたような任意の標的と結合しうる。 The parent antibody, first parent antibody, second parent antibody or variant thereof obtained by the methods and / or uses of the present invention may bind to any target as described herein.
本発明が対象としうる抗原または標的の例には、以下のものがある；5T4；ADAM-10；ADAM-12；ADAM17；AFP；AXL；ANGPT2炭疽抗原；BSG；CAIX；CAXII；CA 72-4；癌関連抗原CTAA16.88；CCL11；CCL2；CCR4；CCR5；CCR6；CD2；CD3E；CD4；CD5；CD6；CD15；CD18；CD19；CD20；CD22；CD24；CD25；CD29；CD30；CD32B；CD33；CD37；CD38；CD40；CD40LG；CD44；CD47；CD52；CD56；CD66E；CD72；CD74；CD79a；CD79b；CD80；CD86；CD98；CD137；CD147；CD138；CD168；CD200；CD248；CD254；CD257；CDH3；CEA；CEACAM5；CEACAM6；CEACAM8；クローディン4；CS-1；CSF2RA；CSPG-4；CTLA4；Cripto；DLL4；ED-B；EFNA2；EGFR；エンドセリンB受容体；ENPP3；EPCAM；ERBB2；ERBB3；FAPα；FcγRI；FCER2；FGFR3；フィブリンIIβ鎖；FLT1；FOLH1；FOLR1；FRP-1；GD3ガングリオシド；GDF2；GLP1R；グリピカン-3；GPNMB；HBV（B型肝炎ウイルス）；HCMV（ヒトサイトメガロウイルス）；熱ショックタンパク質90ホモログ［カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）］；単純ヘルペスウイルスgD糖タンパク質；HGF；HIV-1；HIV-1 IIIB gp120 V3ループ；HLA-DRB（HLA-DRβ）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス、糖タンパク質F；ICAM1；IFNA1；IFNA1；IFNB1 bispecific；IgE Fc；IGF1R；IGHE連結領域；IL12B；IL13；IL15；IL17A；IL1A；IL1B；IL2RA；IL4；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL9；インターロイキン-2受容体βサブユニット；ITGA2；ITGA2B ITGB3；ITGA4 ITGB7；ITGA5；ITGAL；ITGAV_ITGB3；ITGB2；KDR；L1CAM；Lewis-y；リピドA、リポ多糖LPSのドメイン；LTA；MET；MMP14；MMp15；MST1R；MSTN；MUC1；MUC4；MUC16；MUC5AC；NCA-90顆粒球細胞抗原；ネクチン4；NGF；NRP；NY-ESO-1；OX40L；PLAC-1；PLGF；PDGFRA；PD1；PDL1；PSCA；ホスファチジルセリン；PTK-7；緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）血清型IATS O11；RSV（ヒト呼吸器合胞体ウイルス、糖タンパク質F）；ROR1；RTN4；SELL；SELP；STEAP1；志賀毒素様毒素II Bサブユニット［大腸菌（Escherichia coli）］；SLAM7；SLC44A4；SOST；表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）リポテイコ酸；T細胞受容体α_β；TF；TGFB1；TGFB2；TMEFF2；TNC；TNF；TNFRSF10A；TNFRSF10B；TNFRSF12A；TNFSF13；TNFSF14；TNFSF2；TNFSF7；TRAILR2；TROP2；TYRP1；VAP-1；およびビメンチン。 Examples of antigens or targets that can be addressed by the present invention include: 5T4; ADAM-10; ADAM-12; ADAM17; AFP; AXL; ANGPT2 anthrax antigen; BSG; CAIX; CAXII; CCR11; CCL2; CCR4; CCR5; CCR6; CD2; CD3E; CD4; CD5; CD6; CD15; CD18; CD19; CD20; CD22; CD25; CD29; CD37; CD38; CD40; CD40LG; CD44; CD47; CD52; CD56; CD66E; CD72; CD74; CD79a; CD79b; CD80; CD86; CD98; CD137; CD147; CD138; CD168; CD200; CD248; CD254; CD257; CDH3; CEA; CEACAM5; CEACAM6; CEACAM8; claudin 4; CS-1; CSF2RA; CSPG-4; CTLA4; Cripto; DLL4; ED-B; EFNA2; EGFR; endothelin B receptor; ENPP3; EPCAM; ERBB2; ERBB3; FcγRI; FCER2; FGFR3; fibrin II β chain; FLT1; FOLH1; FOLR1; FRP-1; GD3 ganglioside; GDF2; GLP1R; glypican-3; GPNMB; HBV (hepatitis B virus); HCMV (human cytomegalovirus); Heat shock Protein 90 homolog [Candida albicans]; herpes simplex virus gD glycoprotein; HGF; HIV-1; HIV-1 IIIB gp120 V3 loop; HLA-DRB (HLA-DRβ); human respiratory syncytial virus; ICAM1; IFNA1; IFNA1; IFNB1 bispecific; IgE Fc; IGF1R; IGHE junction region; IL12B; IL13; IL15; IL17A; IL1A; IL1RA; IL4; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; ITGA2; ITGA2B ITGB3; ITGA4 ITGB7; ITGA5; ITGAL; ITGAV_ITGB3; ITGB2; KDR; L1CAM; Lewis-y; lipid A, lipopolysaccharide LPS domain; LTA; MET; MMP14; MMp15; MST1R MSTN; MUC1; MUC4; MUC16; MUC5AC; NCA-90 granulocyte cell antigen; Nectin 4; NGF; NRP; NY-ESO-1; OX40L; PLAC-1; PLGF; PDGFRA; PD1; PDL1; PSCA; phosphatidylserine PTK-7; Pseudomonas aeruginosa serotype IATS O11; RSV (human respiratory syncytial virus, sugar tongue) ROR1; RTN4; SELL; SELP; STEAP1; Shiga toxin-like toxin II B subunit [Escherichia coli]; SLAM7; SLC44A4; SOST; Staphylococcus epidermidis lipoteichoic acid; T cell reception TF; TGFB1; TGFB2; TMEFF2; TNC; TNF; TNFRSF10A; TNFRSF10B; TNFRSF12A; TNFSF13; TNFSF14; TNFSF2; TNFSF7; TRAILR2; TROP2; TYRP1; VAP-1; and vimentin.
主要な局面において、本発明は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドが結合する対象となる標的を発現する細胞、細胞膜またはビリオンに対するCDCを誘導する方法であって、
（i）本明細書に開示している態様のいずれか1つに従って変異させた1つの親ポリペプチドまたは少なくとも第1の親ポリペプチドと第2の親ポリペプチドの組み合わせを用意する段階；および
（ii）段階（i）の変異させた親ポリペプチドまたは段階（i）の変異させた少なくとも第1の親ポリペプチドと第2の親ポリペプチドの組み合わせの調製物を、ヒト補体またはエフェクター細胞の存在下で、抗原を発現する細胞、細胞膜またはビリオンと接触させる段階
を含む方法に関する。
In a principal aspect, the present invention is a method for inducing CDC on a cell, cell membrane or virion expressing a target to which a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region binds, comprising:
(I) providing one parent polypeptide or a combination of at least a first parent polypeptide and a second parent polypeptide mutated according to any one of the embodiments disclosed herein; ii) preparing a mutated parent polypeptide of step (i) or a combination of at least a first parent polypeptide and a second parent polypeptide mutated of step (i) of human complement or effector cells; In the presence, it relates to a method comprising the step of contacting with an antigen-expressing cell, cell membrane or virion.
1つの態様において、親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドおよび第2の親ポリペプチドのいずれかまたはすべては、抗体であってもよい。 In one embodiment, any or all of the parent polypeptide, the first parent polypeptide and the second parent polypeptide may be an antibody.
別の態様において、本方法は、ADCC、Fc-γ受容体結合、プロテインA結合、プロテインG結合、ADCP、補体依存性細胞傷害作用（CDCC）、補体増強性細胞傷害作用、抗体によって媒介されるオプソニン化抗体の補体受容体に対する結合、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、1つのさらなるエフェクター機能を増強する。 In another embodiment, the method is mediated by ADCC, Fc-γ receptor binding, protein A binding, protein G binding, ADCP, complement dependent cytotoxicity (CDCC), complement enhanced cytotoxicity, antibody Enhances one additional effector function selected from the binding of the opsonized antibody to the complement receptor and any combination thereof.
さらなる態様において、本発明はまた、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）を誘導する。 In further embodiments, the present invention also induces antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC).
なおさらなる態様において、本発明はまた、Fc含有ポリペプチドの細胞内移行を誘導する。 In still further embodiments, the present invention also induces intracellular translocation of Fc-containing polypeptides.
1つの態様において、細胞はヒト腫瘍細胞または細菌細胞である。 In one embodiment, the cell is a human tumor cell or a bacterial cell.
別の態様において、IgG1親抗体はヒトIgG1抗体である。 In another embodiment, the IgG1 parent antibody is a human IgG1 antibody.
別の態様において、第1および第2の抗原は、erbB1（EGFR）、erbB2（HER2）、erbB3、erbB4、MUC-1、CD4、CD19、CD20、CD25、CD32、CD37、CD38、CD74、CD138、CXCR5、c-Met、HERV-エンベロープタンパク質、ペリオスチン、Bigh3、SPARC、BCR、CD79、EGFrvIII、IGFr、L1-CAM、AXL、組織因子（TF）、EpCAMおよびMRP3からなる群より別個に選択される。 In another embodiment, the first and second antigens are erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD25, CD32, CD37, CD38, CD74, CD138, It is independently selected from the group consisting of CXCR5, c-Met, HERV-envelope protein, periostin, Big3, SPARC, BCR, CD79, EGFrvIII, IGFr, L1-CAM, AXL, tissue factor (TF), EpCAM and MRP3.
別の態様において、第1および第2の親抗体は完全ヒト抗体であり、任意で、第1および第2の親抗体は、CD20およびCD38から別個に選択される抗原と結合する。 In another embodiment, the first and second parent antibodies are fully human antibodies, and optionally the first and second parent antibodies bind to an antigen that is separately selected from CD20 and CD38.
1つのさらなる態様において、第1および第2の親抗体は、7D8および005から別個に選択される。 In one further embodiment, the first and second parent antibodies are separately selected from 7D8 and 005.
1つのさらに別の態様において、細胞は細菌細胞である。 In one further embodiment, the cell is a bacterial cell.
別の態様において、細菌細胞は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、表皮ブドウ球菌（S. Epidermidis）、肺炎連鎖球菌（S. pneumonia）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、クラミジア（Chlamydia）、大腸菌（E. coli）、サルモネラ菌（Salmonella）、赤痢菌（Shigella）、エルシニア（Yersinia）、ネズミチフス菌（S. typhimurium）、髄膜炎菌（Neisseria meningitides）および結核菌（Mycobacterium tuberculosis）からなる群より選択される。 In another embodiment, the bacterial cell is S. aureus, S. Epidermidis, S. pneumonia, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa , Chlamydia, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, S. typhimurium, Neisseria meningitides and Mycobacterium tuberculosis).
別の態様において、第1および／または第2の抗原はリポテイコ酸（LTA）であり、任意で、第1および第2の親抗体のうち少なくとも1つはパギバキシマブである。 In another embodiment, the first and / or second antigen is lipoteichoic acid (LTA), and optionally at least one of the first and second parent antibodies is pagibaximab.
別の態様において、抗原はビリオン上で発現される。 In another embodiment, the antigen is expressed on virions.
別の態様において、第1および第2の抗体は同一の抗原と結合する。 In another embodiment, the first and second antibodies bind to the same antigen.
別の態様において、第1および第2の抗体は、同じVH配列、VL配列、またはVH配列とVL配列の両方を含む。 In another embodiment, the first and second antibodies comprise the same VH sequence, VL sequence, or both VH and VL sequences.
本発明の目的に関して、抗原を発現するかまたは別の様式で伴う標的細胞は、任意の原核細胞または真核細胞でありうる。例示的な抗原発現細胞には、哺乳動物細胞、特にヒト細胞、例えばヒト癌細胞など；ならびに単細胞生物、例えば細菌、原生動物および単細胞真菌、例えば酵母細胞などが非限定的に含まれる。抗原を含むかまたは別の様式で伴う細胞膜には、抗原発現細胞に由来する部分的なおよび／または破壊された細胞膜が含まれる。ビリオン粒子またはウイルス粒子に結合する抗原は、ビリオンのタンパク質外被および／または脂質エンベロープの中に含まれるか、または別の様式で結合しうる。 For the purposes of the present invention, a target cell that expresses or otherwise entails an antigen can be any prokaryotic or eukaryotic cell. Exemplary antigen-expressing cells include, but are not limited to, mammalian cells, particularly human cells such as human cancer cells; and unicellular organisms such as bacteria, protozoa and unicellular fungi such as yeast cells. Cell membranes that contain or otherwise accompany antigens include partially and / or disrupted cell membranes derived from antigen-expressing cells. Antigens that bind to virion particles or virus particles may be contained within or otherwise bound within the virion protein coat and / or lipid envelope.
標的細胞は、例えば、ヒト腫瘍細胞でありうる。適した腫瘍抗原には、本明細書に記載された任意の標的または抗原が含まれるが、erbB1（EGFR）、erbB2（HER2）、erbB3、erbB4、MUC-1、CD4、CD19、CD20、CD25、CD32、CD37、CD38、CD74、CD138、CXCR5、c-Met、HERV-エンベロープタンパク質、ペリオスチン、Bigh3、SPARC、BCR、CD79、EGFrvIII、IGFR、L1-CAM、AXL、組織因子（TF）、EpCAMおよびMRP3には限定されない。好ましい抗原には、CD20、CD38、HER2、EGFR、IGFR、CD25、CD74およびCD32が含まれる。例示的な抗体には、WO 2004/035607号に開示されているような抗CD20抗体7D8、WO 06/099875号に開示されているような抗CD38抗体005、WO 2004/035607号に開示されているような抗CD20抗体11B8、WO 06/099875号に開示されているような抗CD38抗体003、WO 02/100348号に開示されているような抗EGFr抗体2F8が含まれる。他の詳細な抗体の例は、本明細書に提示されている。
The target cell can be, for example, a human tumor cell. Suitable tumor antigens include any target or antigen described herein, but erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD25, CD32, CD37, CD38, CD74, CD138, CXCR5, c-Met, HERV-envelope protein, periostin, Big3, SPARC, BCR, CD79, EGFrvIII, IGFR, L1-CAM, AXL, tissue factor (TF), EpCAM and MRP3 It is not limited to. Preferred antigens include CD20, CD38, HER2, EGFR, IGFR, CD25, CD74 and CD32. Exemplary antibodies include anti-CD20 antibody 7D8 as disclosed in WO 2004/035607,
または、標的細胞は細菌細胞、例えば、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、炭疽菌、緑膿菌、クラミジア、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、エルシニア、ネズミチフス菌、髄膜炎菌および結核菌などであってもよい。例示的な抗原にはリポテイコ酸（LTA）が含まれ、例示的な抗体にはパギバキシマブが含まれる。 Or target cells are bacterial cells such as Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia, Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, Salmonella typhimurium, Meningococcus It may be. An exemplary antigen includes lipoteichoic acid (LTA), and an exemplary antibody includes pagibaximab.
または、標的が、西ナイルウイルス、デングウイルス、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヒトパピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、トリインフルエンザウイルス、RVS、アスペルギルス（Aspergillus）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリプトコッカス（Cryptococcus）およびヒストプラスマ（Histoplasma）などのウイルス、真菌細胞または他の粒子の表面上に存在してもよい。 Or the target is West Nile virus, dengue virus, hepatitis C virus (HCV), human immunodeficiency virus (HIV), human papilloma virus, Epstein-Barr virus, herpes virus, pox virus, avian influenza virus, RVS, Aspergillus ), Viruses such as Candida albicans, Cryptococcus and Histoplasma, or on the surface of fungal cells or other particles.
1つの態様において、接触させる段階（ii）はインビトロで行われる。 In one embodiment, the contacting step (ii) is performed in vitro.
1つの態様において、接触させる段階（ii）はインビボで行われる。 In one embodiment, the contacting step (ii) is performed in vivo.
別の態様において、段階（ii）は、対象に変異体を投与する段階を含む。 In another embodiment, step (ii) comprises administering the variant to the subject.
1つのさらなる態様において、対象は、癌、細菌感染症またはウイルス感染症に罹患している。上述した態様の接触させる段階（ii）は、インビトロまたはインビボで行われうる。後者のケースでは、段階（ii）は、1つまたは複数の調製物を、対象に、任意で癌または細菌感染症に罹患している対象に投与する段階をさらに含みうる。治療応用に関するそれ以上の詳細は以下に提示している。 In one further embodiment, the subject is suffering from a cancer, bacterial infection or viral infection. The contacting step (ii) of the embodiment described above can be performed in vitro or in vivo. In the latter case, step (ii) may further comprise administering one or more preparations to the subject, optionally to a subject suffering from a cancer or bacterial infection. Further details regarding therapeutic applications are presented below.
第1および第2の抗体は、同一のエピトープと結合しうるか、または異なるエピトープと結合しうる抗原結合領域を含む。そのようなエピトープは同一の標的上にあってもよく、または異なる標的上にあってもよい。 The first and second antibodies comprise an antigen binding region that can bind to the same epitope or can bind to different epitopes. Such epitopes may be on the same target or on different targets.
1つの態様において、第1および第2の抗体は異なる標的上の異なるエピトープと結合する。そのような標的は同一の細胞もしくは細胞種上で発現されてもよく、または異なる細胞もしくは細胞種上で発現されてもよい。そのような1つの態様において、エフェクター機能の増強は両方の標的を発現する細胞または細胞種のみを対象とし、その結果、治療しようとする疾患の原因でない細胞または細胞種の付帯的損害のリスクを低下させる。 In one embodiment, the first and second antibodies bind to different epitopes on different targets. Such targets may be expressed on the same cell or cell type, or may be expressed on different cells or cell types. In one such embodiment, the enhanced effector function is directed only to cells or cell types that express both targets, thereby reducing the risk of incidental damage to cells or cell types that are not the cause of the disease being treated. Reduce.
いかなる理論にも拘束されないものの、第1および第2の抗体が同一の細胞上に見いだされるエピトープと結合し、それにより、増強されるCDC誘導の選択性を向上させるために標的の複合発現を利用しうるのであれば、CDCの増強を、2つの特異的な標的／抗原を同時に発現する標的細胞に限定することができると考えられる。 Without being bound by any theory, the first and second antibodies bind to an epitope found on the same cell, thereby utilizing the complex expression of the target to improve enhanced selectivity of CDC induction If possible, enhancement of CDC could be limited to target cells that simultaneously express two specific targets / antigens.
標的が異なる細胞上または細胞種上で発現される場合には、理論に拘束されるわけではないが、第1および第2の抗体の任意の順序での投与が、CDC増強を向上させ、かつ、第2の標的を発現する第2の細胞または細胞種の「動員」によって、おそらく他のエフェクター機能も向上させると考えられる。 If the target is expressed on different cells or cell types, but not bound by theory, administration of the first and second antibodies in any order improves CDC enhancement, and The “mobilization” of the second cell or cell type that expresses the second target will probably also improve other effector functions.
第1および第2の抗体の組み合わせを用いる1つの態様において、段階（ii）は、ヒト補体および／またはエフェクター細胞の存在下で、細胞を、変異させた第1および第2の親抗体に同時に、別々にまたは逐次的に接触させることによって行ってもよい。 In one embodiment using a combination of the first and second antibodies, step (ii) comprises in the presence of human complement and / or effector cells, the cells are mutated to the first and second parent antibodies. It may be done by contacting them separately or sequentially.
本発明はまた、IgG1またはIgG3抗体が結合する抗原が結合する標的細胞、細胞膜、ビリオンまたは他の粒子に対するCDCまたは他のエフェクター応答（例えばADCC）を誘導する方法であって、（i）抗体のFc領域におけるK439EであるK439における変異、およびS440KまたはS440RであるS440における変異を含む抗体の変異体を用意する段階；ならびに（ii）変異体の調製物を、ヒト補体および／またはエフェクター細胞の存在下で細胞と接触させる段階、を含む方法も提供する。 The present invention also provides a method of inducing CDC or other effector responses (eg ADCC) to target cells, cell membranes, virions or other particles to which an antigen to which an IgG1 or IgG3 antibody binds binds, comprising: Providing a variant of an antibody comprising a mutation in K439, which is K439E in the Fc region, and a mutation in S440, which is S440K or S440R; and (ii) a preparation of the variant is prepared for human complement and / or effector cells. Contacting with a cell in the presence is also provided.
本発明はまた、第1のIgG1抗体が結合する第1の抗原および第2の抗体が結合する第2の抗原を発現する標的細胞、細胞膜またはビリオンに対するCDCまたは他のエフェクター応答（例えばADCC）を誘導する方法であって、（i）K439E変異を含む第1の抗体である第1の変異体およびS440KまたはS440R変異を含む第2の抗体である第2の変異体を用意する段階；ならびに（ii）細胞を、ヒト補体またはエフェクター細胞の存在下で、第1および第2の変異体の調製物に同時に、別々にまたは逐次的に接触させる段階、を含む方法も提供する。 The present invention also provides a CDC or other effector response (eg, ADCC) to a target cell, cell membrane or virion that expresses a first antigen to which the first IgG1 antibody binds and a second antigen to which the second antibody binds. (I) providing a first variant that is a first antibody comprising a K439E mutation and a second variant that is a second antibody comprising a S440K or S440R mutation; and ii) contacting the cell with the first and second variant preparations simultaneously, separately or sequentially in the presence of human complement or effector cells.
別個および具体的な態様において、第1および第2の抗体は、（i）異なる抗原；（ii）同じ抗原上の異なるエピトープ、（iii）1つの抗原上の同一のエピトープ、および（iv）1つの抗原上の同一のエピトープと結合し、かつ同じVH配列および／またはVL配列を含む。 In separate and specific embodiments, the first and second antibodies comprise (i) different antigens; (ii) different epitopes on the same antigen, (iii) the same epitope on one antigen, and (iv) 1 It binds to the same epitope on two antigens and contains the same VH and / or VL sequences.
その他の方法
別の主要な局面において、本発明は、C1qと結合する抗体のエフェクター機能を増強する、抗体における変異を同定する方法であって、
（i）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸における変異を含む少なくとも1つの抗体を調製する段階；
（ii）抗原発現細胞の表面と結合したときの抗体のC1q活性を、親抗体と比較して評価する段階；ならびに
（iii）C1q結合力が増強された任意の変異体の変異を選択する段階、
を含む方法に関する。
In another major aspect of another method , the present invention is a method for identifying a mutation in an antibody that enhances the effector function of the antibody that binds C1q, comprising:
(I) preparing at least one antibody comprising a mutation in one or more amino acids selected from the group corresponding to E430X, E345X, S440Y and S440W in the Fc region of a human IgG1 heavy chain;
(Ii) evaluating the C1q activity of the antibody when bound to the surface of an antigen-expressing cell compared to the parent antibody; and (iii) selecting a mutation of any mutant with enhanced C1q binding ability. ,
Relates to a method comprising:
1つの態様において、少なくとも1つの抗体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸置換、例えばE430G、E430S、E345KおよびE345Qなどを含む。 In one embodiment, the at least one antibody is one or more selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain. Amino acid substitutions such as E430G, E430S, E345K and E345Q.
なお別の主要な局面において、本発明は、CDC応答を誘導する抗体の能力を増強する、親抗体における変異を同定する方法であって、
（i）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YまたはS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸における変異を含む、親抗体の少なくとも1つの変異体を調製する段階；
（ii）エフェクター細胞または補体の存在下で抗原発現細胞の表面と結合したときに変異体によって誘導されるCDC応答を、親抗体と比較して評価する段階；ならびに
（iii）CDC応答が増強された任意の変異体の変異を選択する段階、
を含む方法に関する。
In yet another major aspect, the present invention is a method for identifying a mutation in a parent antibody that enhances the antibody's ability to induce a CDC response, comprising:
(I) preparing at least one variant of a parent antibody comprising a mutation in one or more amino acids selected from the group corresponding to E430X, E345X, S440Y or S440W in the Fc region of a human IgG1 heavy chain;
(Ii) assessing the CDC response induced by the variant when bound to the surface of an antigen-expressing cell in the presence of effector cells or complement compared to the parent antibody; and (iii) enhancing the CDC response. Selecting a mutation of any given mutant,
Relates to a method comprising:
1つの態様において、少なくとも1つの抗体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸置換、例えばヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E345KおよびE345Qなどを含む。 In one embodiment, the at least one antibody is one or more selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain. Amino acid substitutions such as E430G, E430S, E345K and E345Q in the Fc region of human IgG1 heavy chain.
本発明のポリペプチド
親ポリペプチド
本明細書で記載しているように、本発明はとりわけ、免疫グロブリンのCH3領域、例えば抗体の重鎖に1つまたは複数の変異を含む、親ポリペプチドの変異体に関する。「親ポリペプチド」は、「親抗体」であってもよい。改変の前に本発明の出発材料として用いることになる、野生型抗体であってもよい「親」抗体は、例えば、Kohler et al., Nature 256, 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組換えDNA法によって作製されてもよい。また、モノクローナル抗体を、例えば、Clackson et al., Nature 352, 624 628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 597 (1991)に記載された手法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。モノクローナル抗体は任意の適した供給源から得ることができる。したがって、例えば、モノクローナル抗体を、関心対象の抗原による免疫処置を受けたマウスから得られたマウス脾臓B細胞から調製されたハイブリドーマから、例えば、表面上に抗原を発現する細胞の形、または関心対象の抗原をコードする核酸の形で得ることができる。また、モノクローナル抗体を、免疫処置を受けたヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えばウサギ、ラット、イヌ、霊長動物など）の抗体発現細胞に由来するハイブリドーマから得ることもできる。
Polypeptide of the present invention
Parent Polypeptides As described herein, the present invention relates to variants of a parent polypeptide that include one or more mutations in the CH3 region of an immunoglobulin, eg, the heavy chain of an antibody, among others. A “parent polypeptide” may be a “parent antibody”. A “parent” antibody, which may be a wild-type antibody, to be used as a starting material of the invention prior to modification is a hybridoma originally described, for example, by Kohler et al., Nature 256, 495 (1975). It may be made by a method or may be made by a recombinant DNA method. Monoclonal antibodies can also be obtained using the techniques described in, for example, Clackson et al., Nature 352, 624 628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 597 (1991). It can also be isolated from an antibody library. Monoclonal antibodies can be obtained from any suitable source. Thus, for example, monoclonal antibodies can be obtained from hybridomas prepared from mouse splenic B cells obtained from mice immunized with the antigen of interest, eg, in the form of cells expressing the antigen on the surface, or of interest It can be obtained in the form of a nucleic acid encoding the antigen. Monoclonal antibodies can also be obtained from hybridomas derived from antibody-expressing cells of an immunized human or non-human mammal (eg, rabbit, rat, dog, primate, etc.).
親抗体は、例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。別の態様において、抗体はヒト抗体である。ヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックマウスまたはトランスクロモソームマウス、例えば、HuMAbマウスを用いて作製することができる。HuMAbマウスは、再編成されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ座位を、内因性μおよびκ鎖座位を不活性化する標的化変異とともに含む（Lonberg, N. et al., Nature 368, 856 859 (1994)）。そのため、このマウスはマウスIgMまたはκの発現の低下を示し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子が免疫処置に応答してクラススイッチおよび体細胞変異を受け、高親和性ヒトIgG,κモノクローナル抗体を生じる（Lonberg, N. et al. (1994)、前記；Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49 101 (1994) , Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65 93 (1995) およびHarding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536 546 (1995)に総説）。HuMAbマウスの調製は、Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287 6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647 656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912 2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579 591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845 851 (1996)に詳細に記載されている。また、US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918およびWO 01/09187も参照されたい。これらのトランスジェニックマウスからの脾細胞を用いて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを周知の手法に従って作製することができる。
The parent antibody may be, for example, a chimeric antibody or a humanized antibody. In another embodiment, the antibody is a human antibody. Human monoclonal antibodies can be produced using transgenic mice or transchromosomal mice, eg, HuMAb mice, that possess part of the human immune system rather than the mouse system. HuMAb mice target the human immunoglobulin gene minilocus encoding unrearranged human heavy chain (μ and γ) and κ light chain immunoglobulin sequences, targeting mutations that inactivate endogenous μ and κ chain loci (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856 859 (1994)). Therefore, this mouse shows a decrease in the expression of mouse IgM or κ, the introduced human heavy and light chain transgenes undergo class switching and somatic mutation in response to immunization, and high affinity human IgG, κ Generate monoclonal antibodies (Lonberg, N. et al. (1994), supra; Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49 101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65 93 (1995) and Harding, F. and Lonberg, N. Ann. NY Acad. Sci 764 536 546 (1995)). HuMAb mice were prepared by Taylor, L. et al.,
さらに、本発明のヒト抗体、または他の種由来の本発明の抗体を、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、哺乳動物ディスプレイ、酵母ディスプレイおよび当技術分野において公知の他の手法を非限定的に含むディスプレイ型の技術によって同定して、その結果得られた分子を、当技術分野において周知である手法のような、さらなる成熟、例えば親和性成熟などに供することもできる。実施例17に記載されている具体的な戦略を任意の抗体に適用して、ファージ-ディスプレイを用いて本発明の変異体を調製および取得することができる。 In addition, human antibodies of the present invention, or antibodies of the present invention from other species, are not limited to phage display, retroviral display, ribosome display, mammalian display, yeast display and other techniques known in the art. And the resulting molecule can be subjected to further maturation, such as affinity maturation, as is well known in the art. The specific strategy described in Example 17 can be applied to any antibody to prepare and obtain mutants of the invention using phage-display.
親抗体は、天然型の、例えばヒトFcドメインを有する抗体には限定されず、それが本発明のもの以外の他の変異、例えば、グリコシル化に影響を及ぼすか、または抗体が二重特異性抗体であることを可能にする変異などを有する抗体であってもよい。「天然型の抗体」という用語は、遺伝的に導入されたいかなる変異も含まない、あらゆる抗体を意味する。天然に存在する修飾を含む抗体、例えば種々のアロタイプは、それ故、本発明の趣旨においては「天然型の抗体」と解釈されるべきであり、その結果、親抗体と解釈することができる。そのような抗体は、本発明の1つまたは複数の変異のためのテンプレートとして役立てることができ、それにより、本発明の変異型抗体を得ることができる。本発明のもの以外の他の変異を含む親抗体の一例は、IgG4様CH3領域を含む2つの抗体の半分子交換を促進するために還元条件を利用し、それにより、凝集物の随伴形成を伴うことなく二重特異性抗体を形成させる、WO 2011/131746号（Genmab）に記載されたような二重特異性抗体である。親抗体の他の例には、ヘテロダイマー二重特異性物：Triomab（Fresenius）；；二重特異性IgG1およびIgG2（Rinat neurosciences Corporation）；FcΔAdp（Regeneron）；ノブ・イントゥ・ホール（Genentech）；静電ステアリング（Amgen、Chugai、Oncomed）；SEEDbody（Merck）；Azymetric scaffold（Zymeworks）；mAb-Fv（Xencor）；およびLUZ-Y（Genentech）などの二重特異性抗体が非限定的に含まれる。他の例示的な親抗体フォーマットには、野生型抗体、完全長抗体もしくはFcを含有する抗体断片、ヒト抗体、またはそれらの任意の組み合わせが非限定的に含まれる。 The parent antibody is not limited to naturally occurring, eg, antibodies having a human Fc domain, as it affects other mutations other than those of the invention, eg, glycosylation, or the antibody is bispecific. It may be an antibody having a mutation that makes it possible to be an antibody. The term “native antibody” means any antibody that does not contain any genetically introduced mutations. Antibodies containing naturally occurring modifications, such as various allotypes, should therefore be construed as “natural antibodies” within the meaning of the present invention and as a result, can be interpreted as parent antibodies. Such an antibody can serve as a template for one or more mutations of the present invention, thereby obtaining a mutant antibody of the present invention. An example of a parent antibody containing other mutations other than those of the present invention utilizes reducing conditions to facilitate half-molecule exchange of two antibodies containing an IgG4-like CH3 region, thereby concomitant formation of aggregates. Bispecific antibodies as described in WO 2011/131746 (Genmab) that form bispecific antibodies without accompanying. Other examples of parent antibodies include heterodimeric bispecifics: Triomab (Fresenius) ;; Bispecific IgG1 and IgG2 (Rinat neurosciences Corporation); FcΔAdp (Regeneron); Knob Into Hall (Genentech); Bispecific antibodies such as, but not limited to, electrostatic steering (Amgen, Chugai, Oncomed); SEEDbody (Merck); Azymetric scaffold (Zymeworks); mAb-Fv (Xencor); and LUZ-Y (Genentech) . Other exemplary parent antibody formats include, but are not limited to, wild type antibodies, full length antibodies or antibody fragments containing Fc, human antibodies, or any combination thereof.
親抗体は任意の標的と結合することができ、本発明のそのような標的または抗原の例は、限定はされないものの、以下のものに対するものであってもよい；5T4；ADAM-10；ADAM-12；ADAM17；AFP；AXL；ANGPT2炭疽抗原；BSG；CAIX；CAXII；CA 72-4；癌関連抗原CTAA16.88；CCL11；CCL2；CCR4；CCR5；CCR6；CD2；CD3E；CD4；CD5；CD6；CD15；CD18；CD19；CD20；CD22；CD24；CD25；CD29；CD30；CD32B；CD33；CD37；CD38；CD40；CD40LG；CD44；CD47；CD52；CD56；CD66E；CD72；CD74；CD79a；CD79b；CD80；CD86；CD98；CD137；CD147；CD138；CD168；CD200；CD248；CD254；CD257；CDH3；CEA；CEACAM5；CEACAM6；CEACAM8;クローディン4；CS-1；CSF2RA；CSPG-4；CTLA4；Cripto；DLL4；ED-B；EFNA2；EGFR；エンドセリンB受容体；ENPP3；EPCAM；ERBB2；ERBB3；FAPα；FcγRI；FCER2；FGFR3；フィブリンIIβ鎖；FLT1；FOLH1；FOLR1；FRP-1；GD3ガングリオシド；GDF2；GLP1R；グリピカン-3；GPNM B；HBV（B型肝炎ウイルス）；HCMV（ヒトサイトメガロウイルス）；熱ショックタンパク質90ホモログ［カンジダ・アルビカンス］；単純ヘルペスウイルスgD糖タンパク質；HGF；HIV-1；HIV-1IIIB gp120 V3ループ；HLA-DRB（HLA-DRβ）；ヒト呼吸器合胞体ウイルス、糖タンパク質F；ICAM1；IFNA1；IFNA1；IFNB1 bispecific；IgE Fc；IGF1R；IGHE連結領域；IL12B；IL13；IL15；IL17A；IL1A；IL1B；IL2RA；IL4；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL9；インターロイキン-2受容体βサブユニット；ITGA2；ITGA2B ITGB3；ITGA4 ITGB7；ITGA5；ITGAL；ITGAV_ITGB3；ITGB2；KDR；L1CAM；Lewis-y；リピドA、リポ多糖LPSのドメイン；LTA；MET；MMP14；MMp15；MST1R；MSTN；MUC1；MUC4；MUC16；MUC5AC；NCA-90顆粒球細胞抗原；ネクチン4；NGF；NRP；NY-ESO-1；OX40L；PLAC-1；PLGF；PDGFRA；PD1；PDL1；PSCA；ホスファチジルセリン；PTK-7；緑膿菌血清型IATS O11；RSV（ヒト呼吸器合胞体ウイルス、糖タンパク質F）；ROR1；RTN4；SELL；SELP；STEAP1；志賀毒素様毒素IIBサブユニット［大腸菌］；SLAM7；SLC44A4；SOST；表皮ブドウ球菌リポテイコ酸；T細胞受容体α_β；TF；TGFB1；TGFB2；TMEFF2；TNC；TNF；TNFRSF10A；TNFRSF10B；TNFRSF12A；TNFSF13；TNFSF14；TNFSF2；TNFSF7；TRAILR2；TROP2；TYRP1；VAP-1；およびビメンチン。 The parent antibody can bind to any target, and examples of such targets or antigens of the present invention may include, but are not limited to: 5T4; ADAM-10; ADAM- 12; ADAM17; AFP; AXL; ANGPT2 anthrax antigen; BSG; CAIX; CAXII; CA 72-4; cancer-associated antigen CTAA16.88; CCL11; CCL2; CCR4; CCR5; CCR6; CD2; CD3E; CD4; CD5; CD15; CD18; CD19; CD20; CD22; CD24; CD25; CD29; CD30; CD32B; CD33; CD37; CD38; CD40LG; CD44; CD47; CD52; CD56; CD66E; CD72; CD86; CD98; CD137; CD147; CD138; CD168; CD200; CD248; CD254; CD257; CDH3; CEA; CEACAM5; CEACAM6; CEACAM8; claudin4; CS-1; CSF2RA; CSPG-4; CTLA4; Cripto; DLL4; ED-B; EFNA2; EGFR; endothelin B receptor; ENPP3; EPCAM; ERBB2; ERBB3; FAPα; FcγRI; FCER2; FGFR3; fibrin II β chain; FLT1; FOLH1; FOLR1; FRP-1; GD3 ganglioside; Gripi -3; GPNM B; HBV (hepatitis B virus); HCMV (human cytomegalovirus); heat shock protein 90 homolog [Candida albicans]; herpes simplex virus gD glycoprotein; HGF; HIV-1; HIV-1IIIB HLA-DRB (HLA-DRβ); human respiratory syncytial virus, glycoprotein F; ICAM1; IFNA1; IFNA1; IFNB1 bispecific; IgE Fc; IGF1R; IGHE junction region; IL12B; IL13; IL15; IL1A; IL1B; IL2RA; IL4; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL9; interleukin-2 receptor β subunit; ITGA2; ITGA2B ITGB3; ITGA4 ITGB7; ITGA5; ITGAL; ITGAV_ITGB3; ITGB2; KDR; L1CAM; y; Lipid A, Lipopolysaccharide LPS domain; LTA; MET; MMP14; MMp15; MST1R; MSTN; MUC1; MUC4; MUC16; MUC5AC; NCA-90 granulocyte cell antigen; Nectin4; NGF; NRP; 1; OX40L; PLAC-1; PLGF; PDGFRA; PD1; PDL1; PSCA; phosphatidylserine; PTK-7; Pseudomonas aeruginosa serotype IA TS O11; RSV (human respiratory syncytial virus, glycoprotein F); ROR1; RTN4; SELL; SELP; STEAP1; Shiga toxin-like toxin IIB subunit [E. coli]; SLAM7; SLC44A4; SOST; S. epidermidis lipoteichoic acid; TF; TGFB1; TGFB2; TMEFF2; TNC; TNF; TNFRSF10A; TNFRSF10B; TNFRSF12A; TNFSF13; TNFSF14; TNFSF2; TNFSF7; TRAILR2; TROP2;
親抗体は、任意のアイソタイプ、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgE、IgMおよびIgDなどの任意のヒト抗体であってもよく、任意で、ヒト完全長IgG1抗体などのヒト完全長抗体であってもよい。親抗体は、SEQ ID NO：1、2、3、4および5のいずれかによる配列を含みうる。 The parent antibody may be any human antibody such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, IgM and IgD, and optionally a human full-length IgG1 antibody. It may be a long antibody. The parent antibody may comprise a sequence according to any of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 and 5.
本発明に用いるためのモノクローナル抗体、例えば親抗体および／または変異体は、例えば、Kohler et al., Nature 256, 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組換えDNA法によって作製されてもよい。また、モノクローナル抗体を、例えば、Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)に記載された手法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。モノクローナル抗体は任意の適した供給源から得ることができる。したがって、例えば、モノクローナル抗体を、関心対象の抗原による免疫処置を受けたマウスから得られたマウス脾臓B細胞から調製されたハイブリドーマから、例えば、表面上に抗原を発現する細胞の形、または関心対象の抗原をコードする核酸の形で得ることができる。また、モノクローナル抗体を、免疫処置を受けたヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えばラット、イヌ、霊長動物など）の抗体発現細胞に由来するハイブリドーマから得ることもできる。 Monoclonal antibodies, such as parent antibodies and / or variants, for use in the present invention may be generated by the hybridoma method first described by, for example, Kohler et al., Nature 256, 495 (1975) or It may be produced by a replacement DNA method. Monoclonal antibodies can also be obtained using techniques described in, for example, Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). It can also be isolated from a phage antibody library. Monoclonal antibodies can be obtained from any suitable source. Thus, for example, monoclonal antibodies can be obtained from hybridomas prepared from mouse splenic B cells obtained from mice immunized with the antigen of interest, eg, in the form of cells expressing the antigen on the surface, or of interest It can be obtained in the form of a nucleic acid encoding the antigen. Monoclonal antibodies can also be obtained from hybridomas derived from antibody-expressing cells of an immunized human or non-human mammal (eg, rat, dog, primate, etc.).
1つの態様において、抗体はヒト抗体である。任意の抗原を対象とするヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックマウスまたはトランスクロモソームマウスを用いて作製することができる。そのようなトランスジェニックマウスまたはトランスクロモソームマウスには、それぞれ、本明細書においてHuMAb（登録商標）マウスおよびKMマウスと称されるマウスが含まれ、それらは本明細書において「トランスジェニックマウス」と総称される。 In one embodiment, the antibody is a human antibody. Human monoclonal antibodies directed to any antigen can be produced using transgenic mice or transchromosomal mice carrying part of the human immune system rather than the mouse system. Such transgenic mice or transchromosomal mice include mice referred to herein as HuMAb® mice and KM mice, which are collectively referred to herein as “transgenic mice”. Is done.
HuMAb（登録商標）マウスは、再編成されていないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ座位を、内因性μおよびκ鎖座位を不活性化する標的化変異とともに含む（Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)）。そのため、このマウスはマウスIgMまたはκの発現の低下を示し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は免疫処置に応答してクラススイッチおよび体細胞変異を受け、高親和性ヒトIgG,κモノクローナル抗体を生じる（Lonberg, N. et al. (1994)、前記；Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49 101 (1994) , Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65 93 (1995)およびHarding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536 546 (1995)に総説）。HuMAb（登録商標）マウスの調製は、Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287 6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647 656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912 2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579 591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845 851 (1996)に詳細に記載されている。また、US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918およびWO 01/09187も参照されたい。
HuMAb® mice inactivate the human immunoglobulin gene minilocus encoding unrearranged human heavy chain (μ and γ) and κ light chain immunoglobulin sequences, and the endogenous μ and κ chain loci (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). As such, this mouse exhibits reduced expression of mouse IgM or κ, and the introduced human heavy and light chain transgenes undergo class switching and somatic mutation in response to immunization, resulting in high affinity human IgG, κ Generate monoclonal antibodies (Lonberg, N. et al. (1994), supra; Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49 101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65 93 (1995) and Harding, F. and Lonberg, N. Ann. NY Acad. Sci 764 536 546 (1995)). Preparation of HuMAb® mice is described in Taylor, L. et al.,
HCo7、HCo12、HCo17およびHCo20マウスは、それらの内因性軽鎖（κ）遺伝子におけるJKD破壊（Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)に記載されたように）、それらの内因性重鎖遺伝子におけるCMD破壊（WO 01/14424号の実施例1に記載されたように）、およびKCo5ヒトκ軽鎖導入遺伝子（Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)に記載されたように）を有する。さらに、Hco7マウスはHCo7ヒト重鎖導入遺伝子を有し（US 5,770,429号に記載されたように）、HCo12マウスはHCo12ヒト重鎖導入遺伝子を有し（WO 01/14424号の実施例2に記載されたように）、HCo17マウスはHCo17ヒト重鎖導入遺伝子を有し（WO 01/09187号の実施例2に記載されたように）、HCo20マウスはHCo20ヒト重鎖導入遺伝子を有する。その結果生じたマウスは、内因性マウス重鎖およびκ軽鎖座位がホモ接合性に破壊されたバックグラウンドにおいて、ヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖導入遺伝子を発現する。 HCo7, HCo12, HCo17 and HCo20 mice have JKD disruption in their endogenous light chain (κ) genes (as described in Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), their CMD disruption in the endogenous heavy chain gene (as described in Example 1 of WO 01/14424) and the KCo5 human kappa light chain transgene (Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996) As described in). In addition, Hco7 mice have an HCo7 human heavy chain transgene (as described in US 5,770,429), and HCo12 mice have an HCo12 human heavy chain transgene (described in Example 2 of WO 01/14424). HCo17 mice have an HCo17 human heavy chain transgene (as described in Example 2 of WO 01/09187) and HCo20 mice have an HCo20 human heavy chain transgene. The resulting mice express human immunoglobulin heavy chain and kappa light chain transgenes in a background in which the endogenous mouse heavy chain and kappa light chain loci are homozygously disrupted.
KMマウス系統では、Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993)に記載されたように内因性マウスκ軽鎖遺伝子がホモ接合性に破壊されており、WO 01/09187号の実施例1に記載されたように内因性マウス重鎖遺伝子がホモ接合性に破壊されている。このマウス系統は、Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)に記載されたように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子KCo5を有する。このマウス系統はまた、WO 02/43478号に記載されたように、染色体14断片hCF（SC20）で構成されるヒト重鎖トランスクロモソームも有する。HCo12-Balb／Cマウスは、WO/2009/097006号に記載されたように、HCo12をKCo5［J／K］（Balb）と交雑させることによって作製することができる。これらのトランスジェニックマウスからの脾細胞を用いて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを周知の手法に従って作製することができる。 In the KM mouse strain, the endogenous mouse κ light chain gene is homozygously disrupted as described in Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993), and WO 01/09187 As described in Example 1, the endogenous mouse heavy chain gene has been homozygously disrupted. This mouse strain has the human kappa light chain transgene KCo5 as described in Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). This mouse strain also has a human heavy chain transchromosome composed of chromosome 14 fragment hCF (SC20) as described in WO 02/43478. HCo12-Balb / C mice can be generated by crossing HCo12 with KCo5 [J / K] (Balb) as described in WO / 2009/097006. Using splenocytes from these transgenic mice, hybridomas that secrete human monoclonal antibodies can be produced according to well-known techniques.
さらに、任意の抗原結合領域を、当技術分野において周知の手法を用いる、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイおよび他の手法を非限定的に含むディスプレイ型の技術によって同定されたヒト抗体または他の種由来の抗体から得ることもでき、その結果得られた分子を、当技術分野において周知である手法のような、さらなる成熟、例えば親和性成熟などに供することもできる（例えば、Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991)（ファージディスプレイ）、Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996)（ファージディスプレイ）、Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997)（リボソームディスプレイ）、Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988)（ファージディスプレイ）、Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992)、およびUS 5,733,743号を参照）。ディスプレイ技術を用いてヒト性でない抗体を作製する場合には、そのような抗体をヒト化することもできる。
In addition, any antigen binding region may be identified as a human antibody or other identified by display-type techniques including, but not limited to, phage display, retroviral display, ribosome display, and other techniques using techniques well known in the art. And the resulting molecules can be subjected to further maturation, such as affinity maturation, as is well known in the art (eg, Hoogenboom et al ., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (phage display), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (phage display), Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) ) (Ribosome display), Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (phage display), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990) , Russel et al., Nucl.Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell and
本発明の変異は、1つまたは複数のアミノ酸の欠失、挿入または置換であってもよいが、それらには限定されない。アミノ酸のそのような置換は、任意の天然型アミノ酸または非天然アミノ酸によるものであってもよい。 The mutation of the present invention may be, but is not limited to, a deletion, insertion or substitution of one or more amino acids. Such substitution of amino acids may be by any natural or unnatural amino acid.
「単一変異体」
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む他の親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに適用することもできることが理解されるべきである。
"Single mutant"
All embodiments described herein with reference to a parent antibody, a first parent antibody or a second parent antibody include other parent polypeptides comprising the Fc domain of an immunoglobulin and a binding region, the first It should be understood that it can also be applied to a parent polypeptide or a second parent polypeptide.
本発明の「単一変異体」局面の抗体またはポリペプチド変異体は、ヒトIgG1抗体におけるEUインデックスに従って番号が付された各アミノ酸残基を、IgG2、IgG3およびIgG4親抗体における対応する位置におけるアミノ酸、ならびに「例示的」および「好ましい」アミノ酸置換とともに列記している、表1に示された1つまたは複数のアミノ酸残基における変異、典型的にはアミノ酸置換を含む。IgG1の残基126〜326に対応するIgG2のセグメント、IgG1の残基177〜377に対応するIgG3のセグメント、およびIgG1の残基127〜327に対応するIgG4のセグメントが、図2に示されている。 The antibody or polypeptide variant of the “single variant” aspect of the present invention replaces each amino acid residue numbered according to the EU index in the human IgG1 antibody with the amino acid at the corresponding position in the IgG2, IgG3 and IgG4 parent antibodies. As well as mutations in one or more of the amino acid residues shown in Table 1, listed with “exemplary” and “preferred” amino acid substitutions. The segment of IgG2 corresponding to residues 126-326 of IgG1, the segment of IgG3 corresponding to residues 177-377 of IgG1, and the segment of IgG4 corresponding to residues 127-327 of IgG1 are shown in FIG. Yes.
（表１）「単一変異体」局面に関する例示的な変異部位およびアミノ酸置換
表1に見られるように、実施例19においてWien133細胞の細胞溶解の増強をもたらしたアミノ酸置換が「好ましい置換」として含められている。 As seen in Table 1, amino acid substitutions that resulted in enhanced cytolysis of Wien133 cells were included as “preferred substitutions” in Example 19.
1つの局面において、本発明は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの変異体であって、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含み、ただし、変異体の新生児Fc受容体（FcRn）に対する結合を変更する、Fcドメインにおけるさらなる変異を含まないことを条件とする変異体に関する。（FcRn）は、実施例34に開示された方法によって決定することができる。 In one aspect, the invention relates to a variant of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, wherein E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q in the Fc region of a human IgG1 heavy chain. Contains one or more mutations selected from the group corresponding to E345R, E345Y and S440W, but does not contain additional mutations in the Fc domain that alter the binding of the mutant to the neonatal Fc receptor (FcRn) It relates to a mutant as a condition. (FcRn) can be determined by the method disclosed in Example 34.
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの変異体であって、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含み、ただし、実施例34に開示された方法によって決定されたOD405nmでの吸光度の変化によって測定される変異体の新生児Fc受容体（FcRn）に対する結合を、30％を上回って、例えば20％、10％または5％を上回って増加または減少させる、Fcドメインにおけるさらなる変異を含まないことを条件とする変異体に関する。 In another aspect, the invention provides a variant of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, wherein E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q in the Fc region of a human IgG1 heavy chain. A newborn of a mutant comprising one or more mutations selected from the group corresponding to E345R, E345Y and S440W, but measured by the change in absorbance at OD405nm as determined by the method disclosed in Example 34 It relates to variants that do not contain further mutations in the Fc domain that increase or decrease binding to the Fc receptor (FcRn) by more than 30%, for example more than 20%, 10% or 5%.
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの変異体であって、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含み、ただし、変異体が、実施例34に開示された方法によって決定される親ポリペプチドもしくは親抗体のマウス新生児Fc受容体（FcRn）に対する見かけの親和性を0.5倍を上回って増強するFcドメインにおけるさらなる変異を含まないか、または親ポリペプチドもしくは親抗体のマウスFcRnに対する見かけの親和性を2倍を上回って低下させないことを条件とする変異体に関する。 In another aspect, the invention provides a variant of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, wherein E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q in the Fc region of a human IgG1 heavy chain. Mouse neonatal Fc of a parent polypeptide or parent antibody comprising one or more mutations selected from the group corresponding to E345R, E345Y and S440W, provided that the variant is determined by the method disclosed in Example 34 Does not contain additional mutations in the Fc domain that enhance the apparent affinity for the receptor (FcRn) by more than 0.5-fold or reduces the apparent affinity of the parent polypeptide or antibody to mouse FcRn by more than 2-fold It is related with the mutant on condition that it is not allowed.
1つの態様において、1つまたは複数の変異は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E345KおよびE345Qに対応する群から選択される。 In one embodiment, the one or more mutations are selected from the group corresponding to E430G, E430S, E345K and E345Q in the Fc region of the human IgG1 heavy chain.
1つの態様において、変異体は、変異体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）を変更させる、Fcドメインにおけるさらなる変異を含まない。 In one embodiment, the variant does not include additional mutations in the Fc domain that alter the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) of the variant.
1つの態様において、変異体は、実施例37に開示された方法によって決定される変異体の血漿クリアランス速度を変更させる、Fcドメインにおけるさらなる変異を含まない。 In one embodiment, the variant does not contain additional mutations in the Fc domain that alter the plasma clearance rate of the variant as determined by the method disclosed in Example 37.
別の態様において、変異体は、実施例37に開示された方法によって決定される変異体の血漿クリアランス速度を、3.0倍を上回って、例えば2.5倍、2.0倍、1.5倍または1.2倍を上回って増大または低下させる、Fcドメインにおけるさらなる変異を含まない。 In another embodiment, the variant has a plasma clearance rate determined by the method disclosed in Example 37 that is greater than 3.0 times, such as greater than 2.5 times, 2.0 times, 1.5 times, or 1.2 times. Does not include additional mutations in the Fc domain that increase or decrease.
1つの態様において、変異体は、変異体の血清中半減期を変更させる、Fcドメインにおけるさらなる変異を含まない。 In one embodiment, the variant does not include additional mutations in the Fc domain that alter the serum half-life of the variant.
1つの態様において、変異体は、実施例36に開示された方法によって決定される変異体の標的非依存的な液相中での補体活性化を変化させる、Fcドメインにおけるさらなる変異を含まない。 In one embodiment, the variant does not contain additional mutations in the Fc domain that alter the complement activation in the target-independent fluid phase of the variant as determined by the method disclosed in Example 36. .
1つの態様において、変異体は、Fcドメインにおけるさらなる変異を含まない。 In one embodiment, the variant does not contain further mutations in the Fc domain.
1つの態様において、変異体は、1つの変異のみを含む。 In one embodiment, the variant contains only one mutation.
1つの態様において、変異型ポリペプチドは、免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含む変異型抗体であってよい。 In one embodiment, the variant polypeptide may be a variant antibody comprising an immunoglobulin Fc domain and an antigen binding region.
1つの具体的な態様において、アミノ酸置換はE345Rである。 In one specific embodiment, the amino acid substitution is E345R.
実施例に示されているように、これらのアミノ酸置換の1つを含む、CD38抗体HuMab-005および-003（WO WO 2006／099875号に記載されているような）ならびに／またはCD20抗体HuMab-7D8および-11B8（WO 2004／035607号に記載されているような）ならびにリツキシマブおよび／またはEGFR抗体HuMab-2F8（WO 2002／100348号に記載されているような）の変異体はそれぞれ、野生型HuMab 005および7D8よりも高度のC1q結合、補体活性化および／またはCDCを有していた。
As shown in the examples, the CD38 antibodies HuMab-005 and -003 (as described in WO WO 2006/099875) and / or the CD20 antibody HuMab- containing one of these amino acid substitutions are included. Mutants of 7D8 and -11B8 (as described in WO 2004/035607) and rituximab and / or EGFR antibody HuMab-2F8 (as described in WO 2002/100348) are each wild type Has higher C1q binding, complement activation and / or CDC than
変異体が、表1に列記された「例示的な置換」の変異のうち1つのみを含んでもよいことが理解されるべきである。また、変異体が、表1に列記された任意の変異のうち複数の変異、例えば2つ、3つ、4つ、5つまたは6つを含んでもよい。 It should be understood that a variant may contain only one of the “exemplary substitution” mutations listed in Table 1. A variant may also include multiple mutations of any mutation listed in Table 1, eg 2, 3, 4, 5, or 6.
指定の変異に加えて、変異体が、親抗体に関して記載された特徴の任意のものを有してもよい。特に、それはヒト抗体であってもよい。変異体は、変異に加えて、任意のIgGサブタイプのものであってよい。 In addition to the designated mutation, the variant may have any of the characteristics described for the parent antibody. In particular, it may be a human antibody. The variant may be of any IgG subtype in addition to the mutation.
抗原発現細胞の表面上、細胞膜上、ビリオン上もしくは別の粒子上のその抗原と結合したときに、または抗原がビリオンと結合しており、任意で抗原がビリオンのタンパク質外被もしくは脂質エンベロープの中に含まれるときに、そのような抗体変異体は、親抗体と比較して、（i）抗体によって媒介されるCDC、（ii）抗体によって媒介される補体活性化、（iii）C1q結合、（iv）オリゴマー形成、（v）オリゴマー安定性、または（i）〜（v）のいずれかの組み合わせ、の増強のうち少なくとも1つを有しうる。（iv）または（v）の1つの態様において、オリゴマーはヘキサマーである。1つの態様において、変異体はまた、親ポリペプチドまたは親抗体と比較して、ADCCの増強も有する。1つのさらなる態様において、変異体は、親ポリペプチドまたは親抗体と比較して、同じまたは同程度の血漿クリアランス速度を保っている。1つのさらなる態様において、変異体は、親ポリペプチドまたは親抗体と比較した場合に、実施例37に開示された方法によって決定される血漿クリアランス速度が、3.0倍を上回って、例えば2.5倍、2.0倍、1.5倍または1.2倍を上回って増大または低下しない。 When bound to that antigen on the surface of an antigen-expressing cell, on the cell membrane, on a virion, or on another particle, or when the antigen is bound to a virion, optionally in the protein envelope or lipid envelope of the virion Such antibody variants, compared to the parent antibody, include (i) antibody-mediated CDC, (ii) antibody-mediated complement activation, (iii) C1q binding, It may have at least one of (iv) oligomer formation, (v) oligomer stability, or any combination of (i)-(v). In one embodiment of (iv) or (v), the oligomer is a hexamer. In one embodiment, the variant also has ADCC enhancement compared to the parent polypeptide or parent antibody. In one further embodiment, the variant retains the same or similar plasma clearance rate as compared to the parent polypeptide or parent antibody. In one further embodiment, the variant has a plasma clearance rate determined by the method disclosed in Example 37 when compared to the parent polypeptide or antibody of greater than 3.0 fold, for example 2.5 fold, 2.0 fold. Does not increase or decrease more than double, 1.5 times or 1.2 times.
いかなる特定の理論にも限定されることはないが、指定の位置にあるアミノ酸を本発明のアミノ酸残基によって置換することによって引き起こされる効果は、例えば、効果それ自体を引き起こしうること、別の分子のFcドメインとの接触に直接的に関与しうること、または分子間Fc：Fc相互作用に直接的もしくは間接的に影響を及ぼす別のFcドメインと相互作用するように変異させうることであってよい。したがって、置換は、理論に拘束されるわけではないが、オリゴマー形態にある抗体分子間の結合強度を直接的または間接的に増強して、ヘキサマー、ペンタマー、テトラマー、トリマーまたはダイマー構造といったオリゴマー構造の安定性を増強すると考えられる。例えば、アミノ酸置換は、新たな分子間Fc：Fc結合の形成を促進するかまたは強化するもの、例えば、これらには限定されないが、ファンデルワールス相互作用、水素結合、電荷-電荷間相互作用、もしくは芳香族スタッキング相互作用など、またはFc：Fc相互作用の際に水分子の遊離によってエントロピー増大を促進するものなどでありうる。さらに、表1を参照すると、分子間Fc：Fc相互作用または分子内相互作用に係わるかまたは促進するサイズおよび物理化学的特性に基づいて、「例示的な置換」を選択することができる。「好ましい置換」は、分子間Fc：Fc相互作用または分子内相互作用に係わるかまたはそれを刺激するために最適なサイズおよび物理化学的特性に基づいて選択することができる。 Without being limited to any particular theory, an effect caused by substituting an amino acid at a specified position with an amino acid residue of the present invention can be caused by, for example, the effect itself, another molecule Can be directly involved in contact with one Fc domain, or can be mutated to interact with another Fc domain that directly or indirectly affects intermolecular Fc: Fc interactions. Good. Thus, the substitution is not bound by theory, but directly or indirectly enhances the binding strength between antibody molecules in oligomeric form, resulting in oligomeric structures such as hexamer, pentamer, tetramer, trimer or dimer structures. It is thought to enhance stability. For example, amino acid substitutions promote or enhance the formation of new intermolecular Fc: Fc bonds, such as but not limited to van der Waals interactions, hydrogen bonds, charge-charge interactions, Alternatively, it may be an aromatic stacking interaction or the like, or one that promotes entropy increase by release of water molecules during Fc: Fc interaction. Further, with reference to Table 1, “exemplary substitutions” can be selected based on size and physicochemical properties that involve or promote intermolecular Fc: Fc or intramolecular interactions. “Preferred substitutions” can be selected based on optimal size and physicochemical properties to involve or stimulate intermolecular Fc: Fc or intramolecular interactions.
1つの態様において、変異体は、表1から選択されるさらなる変異を含みうる。 In one embodiment, the variant may comprise a further mutation selected from Table 1.
1つの態様において、変異体は、E345X／E430X、E345X／S440Y、E345X／S440W、E430X／S440YおよびE430X／S440Wに対応する群から選択されるアミノ酸残基における2つの変異の組み合わせを含む。 In one embodiment, the variant comprises a combination of two mutations in amino acid residues selected from the group corresponding to E345X / E430X, E345X / S440Y, E345X / S440W, E430X / S440Y and E430X / S440W.
少なくとも2つのアミノ酸におけるそのような変異が変異体に含まれる任意の態様において、それは変異体の重鎖のそれぞれに存在してもよく、またはそれぞれ、2つのうち一方が重鎖の1つに含まれ、もう一方が他方の重鎖に含まれてもよく、またはその反対であってもよい。 In any embodiment where such a mutation in at least two amino acids is included in the variant, it may be present in each of the heavy chains of the variant, or each one of the two is included in one of the heavy chains The other may be included in the other heavy chain, or vice versa.
1つの態様において、2つのアミノ酸残基における変異は、欠失、挿入または置換である。アミノ酸のそのような置換は、任意の天然アミノ酸または人工アミノ酸によるものであってよい。 In one embodiment, the mutation at two amino acid residues is a deletion, insertion or substitution. Such substitution of amino acids may be by any natural or artificial amino acid.
本発明による変異は、それぞれ、1つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換であってよいが、これらには限定されない。アミノ酸のそのような置換は、任意の天然アミノ酸または人工アミノ酸によるものであってよい。 Each mutation according to the invention may be, but is not limited to, a deletion, insertion or substitution of one or more amino acid residues. Such substitution of amino acids may be by any natural or artificial amino acid.
したがって、1つの態様において、少なくとも1つのアミノ酸残基における変異は欠失である。 Thus, in one embodiment, the mutation at at least one amino acid residue is a deletion.
別の態様において、少なくとも1つのアミノ酸残基における変異は挿入である。 In another embodiment, the mutation at at least one amino acid residue is an insertion.
別の態様において、少なくとも1つのアミノ酸残基における変異は置換である。 In another embodiment, the mutation at at least one amino acid residue is a substitution.
2つのアミノ酸残基における変異の例示的な具体的な組み合わせには、E345R／E430T、E345R／S440Y、E345R／S440W、E345R／E430G、E345Q／E430T、E345Q／S440Y、E345Q／S440W、E430T／S440Y、およびE430T／S440Wがある。 Exemplary specific combinations of mutations at two amino acid residues include E345R / E430T, E345R / S440Y, E345R / S440W, E345R / E430G, E345Q / E430T, E345Q / S440Y, E345Q / S440W, E430T / S440Y, And E430T / S440W.
本発明の態様に従う1つまたは複数のアミノ酸における変異のほかに、IgG重鎖が、当技術分野において公知の追加の変異、例えば、エフェクター機能をさらに向上させる変異などを含んでもよい。そのような追加の変異には、CDC、Fc-γ受容体結合もしくはFcRn結合を増強するか、かつ／またはFc-γ受容体媒介性エフェクター機能を向上させる、公知の変異が含まれる。 In addition to mutations in one or more amino acids according to embodiments of the invention, the IgG heavy chain may contain additional mutations known in the art, such as mutations that further improve effector function. Such additional mutations include known mutations that enhance CDC, Fc-γ receptor binding or FcRn binding and / or improve Fc-γ receptor-mediated effector function.
1つの態様において、本発明の変異体は、公知のCDC増強性修飾、例えば、キメラ性IgG分子を作製するためのIgGアイソタイプ間でのセグメントの交換（Natsume et al., 2008 Cancer Res 68(10), 3863-72）；ヒンジ領域における1つまたは複数のアミノ酸置換（Dall'Acqua et al., 2006 J Immunol 177, 1129-1138）、ならびに／または残基D270、K322、P329およびP331を中心とするCH2ドメイン内のC1q結合部位の内部もしくは近傍における1つもしくは複数のアミノ酸置換（Idusogie et al., 2001 J Immunol 166, 2571-2575；Michaelsen et al., 2009 Scand J Immunol 70, 553-564およびWO 99/51642号）などをさらに含む。例えば、1つの態様において、本発明の変異体は、CDCまたはADCCを介したエフェクター機能の増強をもたらす、アミノ酸置換S267E、H268F、S324T、S239D、G236AおよびI332Eのいずれかの組み合わせをさらに含む（Moore et al., 2010 mAbs 2(2), 181-189)）。また、Fc受容体に対する結合（WO 2006/105062号、WO 00/42072号、米国特許第6,737,056号および米国特許第7,083,784号に記載）または抗体の物理的特性（WO 2007/005612 A1号に記載）に影響を及ぼす他のFc変異を、本発明の変異体に用いることもできる。 In one embodiment, the variants of the present invention are known CDC-enhancing modifications, such as exchanging segments between IgG isotypes to create chimeric IgG molecules (Natsume et al., 2008 Cancer Res 68 (10 ), 3863-72); one or more amino acid substitutions in the hinge region (Dall'Acqua et al., 2006 J Immunol 177, 1129-1138) and / or around residues D270, K322, P329 and P331 One or more amino acid substitutions within or near the C1q binding site within the CH2 domain (Idusogie et al., 2001 J Immunol 166, 2571-2575; Michaelsen et al., 2009 Scand J Immunol 70, 553-564 and WO 99/51642) and the like. For example, in one embodiment, a variant of the invention further comprises any combination of amino acid substitutions S267E, H268F, S324T, S239D, G236A and I332E that results in enhanced effector function via CDC or ADCC (Moore et al., 2010 mAbs 2 (2), 181-189)). Also, binding to Fc receptors (described in WO 2006/105062, WO 00/42072, US Pat. No. 6,737,056 and US Pat. No. 7,083,784) or antibody physical properties (described in WO 2007/005612 A1) Other Fc mutations that affect can also be used in the mutants of the invention.
1つの態様において、本発明の変異体は、Fc-γ受容体結合および／またはFc-γ受容体媒介性エフェクター機能を増強する改変をさらに含む。そのような改変には、（i）CH2結合型グリコシル化におけるフコースの量を減少させること（糖鎖工学）（Umana P, et al., Nat Biotechnol 1999; 17: 176-80；Niwa R, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 6248-55.)）、および（ii）抗体のヒンジ領域またはCH2領域におけるアミノ酸の部位指定変異誘発（タンパク質工学）（Lazar GA, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: 4005-10）が含まれる。 In one embodiment, the variants of the invention further comprise modifications that enhance Fc-γ receptor binding and / or Fc-γ receptor-mediated effector function. Such modifications include (i) reducing the amount of fucose in CH2-linked glycosylation (glycan engineering) (Umana P, et al., Nat Biotechnol 1999; 17: 176-80; Niwa R, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 6248-55.)), and (ii) site-directed mutagenesis (protein engineering) of amino acids in the hinge or CH2 region of the antibody (Lazar GA, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: 4005-10).
1つの態様において、本発明の変異体は、例えば、IgG抗体の半減期（t1/2）を延長させるために、FcRn結合部位においてさらに操作される。そのような改変には、（i）N434AおよびT307A／E380A／N434A変異（Petcova et al. Int Immunol. 2006 Dec; 18(12): 1759)；（ii）Pro238、Thr256、Thr307、Gln311、Asp312、Glu380、Glu382およびAsn434のうち1つまたは複数の、FcRn結合を向上させるアラニン残基への置換（Shields RL, et al. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6591）；ならびに（iii）FcRnに対する親和性を増強する、IgG1におけるM252Y/S254T/T256E、M252W、M252Y、M252Y/T256Q、M252F/T256D、V308T/L309P/Q311S、G385D/Q386P/N389S、G385R/Q386T/P387R/N389P、H433K/N434F/Y436H、N434F/Y436H、H433R/N434Y/Y436H、M252Y/S254T/T256E-H433K/N434F/Y436HまたはM252Y/S254T/T256E-G385R/Q386T/P387R/N389Pから選択されるアミノ酸置換またはアミノ酸置換の組み合わせ（Dall'Acqua et al.、前記）が含まれる。 In one embodiment, the variants of the invention are further engineered at the FcRn binding site, eg, to increase the half-life (t1 / 2) of IgG antibodies. Such modifications include (i) N434A and T307A / E380A / N434A mutations (Petcova et al. Int Immunol. 2006 Dec; 18 (12): 1759); (ii) Pro238, Thr256, Thr307, Gln311, Asp312, Substitution of one or more of Glu380, Glu382 and Asn434 to an alanine residue that improves FcRn binding (Shields RL, et al. J. Biol. Chem. 2001; 276: 6591); and (iii) against FcRn Increase affinity, IgG1 M252Y / S254T / T256E, M252W, M252Y, M252Y / T256Q, M252F / T256D, V308T / L309P / Q311S, G385D / Q386P / N389S, G385R / Q386T / P387R / N389P, H433K / N434F / Amino acid substitution or combination of amino acid substitutions selected from Y436H, N434F / Y436H, H433R / N434Y / Y436H, M252Y / S254T / T256E-H433K / N434F / Y436H or M252Y / S254T / T256E-G385R / Q386T / P387R / N389P 'Acqua et al., Supra).
「二重変異体」
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む他の親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドにも適用可能であり得ることが理解されるべきである。
"Double mutant"
All embodiments described herein with reference to a parent antibody, a first parent antibody or a second parent antibody include other parent polypeptides comprising the Fc domain of an immunoglobulin and a binding region, the first It should be understood that it may also be applicable to a parent polypeptide or a second parent polypeptide.
上述し、以下にさらに説明するように、本発明はまた、2つの変異がそれぞれ個々にはエフェクター機能を低下させるが、一緒になるとエフェクター機能を親抗体のレベルに回復させる、「二重変異体」局面にも関する。一緒に用いた場合には、変異体の特異性が増強される。「二重変異体」局面の抗体変異体は、特異的なアミノ酸残基相互作用対であるK439およびS440、K447および448、またはK447、448および449に2つの変異（典型的にはアミノ酸置換）を含む。 As described above and further described below, the present invention also provides a “double mutant, where each of the two mutations individually reduces effector function, but when combined, restores effector function to the level of the parent antibody. It also relates to the aspect. When used together, the specificity of the mutant is enhanced. Antibody variants of the “double variant” aspect are two mutations (typically amino acid substitutions) in specific amino acid residue interaction pairs K439 and S440, K447 and 448, or K447, 448 and 449. including.
したがって、1つの局面において、本発明は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの変異体であって、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される第1の変異（例えばE430G、E430S、E345KまたはE345Qなど）と、以下に対応する群から選択される第2の変異とを含む変異体に関する：
（i）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するアミノ酸残基、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもなく、かつ、第1の変異がS440YもしくはS440Wであるならば第2の変異はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応するアミノ酸残基にある、
（ii）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D／Eに対応するか、もしくはK447K／R／Hおよび448Pに対応するアミノ酸残基；または
（iii）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D／Eに対応するか、もしくはK447K／R／Hおよび448K／R／Hおよび449Pに対応するアミノ酸残基。表2AおよびBは、「二重変異体」局面（表A）および「混合変異体」局面（表2B）に関する「例示的」および「好ましい置換」を示している。
Accordingly, in one aspect, the invention provides a variant of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, wherein E430G, E430S, E430F, E430T, E345K in the Fc region of a human IgG1 heavy chain, Includes a first mutation selected from the group corresponding to E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W (eg, E430G, E430S, E345K or E345Q, etc.) and a second mutation selected from the group corresponding to Regarding variants:
(I) the amino acid residues corresponding to K439 and S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, provided that the second mutation is S440Y or S440W and the first mutation is S440Y or S440W The mutation is at an amino acid residue corresponding to K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain,
(Ii) amino acid residues corresponding to K447D / E in the Fc region of human IgG1 heavy chain or corresponding to K447K / R / H and 448P; or (iii) K447D / E in the Fc region of human IgG1 heavy chain Amino acid residues corresponding to or corresponding to K447K / R / H and 448K / R / H and 449P. Tables 2A and B show “exemplary” and “preferred substitutions” for the “double mutant” aspect (Table A) and the “mixed mutant” aspect (Table 2B).
（表２Ａ）「二重変異体」局面に関する例示的な変異部位およびアミノ酸置換
（表２Ｂ）「混合変異体」局面（Ab1＋Ab2）に関する例示的な変異部位およびアミノ酸置換
1つの態様において、変異体は、E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、およびE345Yに対応する群から選択される第1の変異、ならびにヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するアミノ酸残基における第2の変異（ただし、S440における変異がS440WでもS440Yでもないことを条件とする）を含む。 In one embodiment, the variant is a first mutation selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, and E345Y, and K439 and S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain. A second mutation in the amino acid residue corresponding to (provided that the mutation in S440 is neither S440W nor S440Y).
変異体がアミノ酸残基置換の1つのみ、例えばK439EまたはS440Kのいずれかを含んでもよいことは、本発明に企図されており、例えば、変異体はK439における1つの変異を含み、任意でS440における変異を有しない。 It is contemplated by the present invention that a variant may contain only one of the amino acid residue substitutions, e.g. either K439E or S440K, e.g. the variant comprises one mutation in K439 and optionally S440 Has no mutation in
1つの態様において、本発明は、K439における変異がEおよびDから選択されるアミノ酸へのアミノ酸置換（例えばK439E）である変異体に関する。 In one embodiment, the invention relates to a variant wherein the mutation in K439 is an amino acid substitution (eg, K439E) with an amino acid selected from E and D.
別の態様において、変異体はS440における変異を含み、任意でK439における変異を有しない。 In another embodiment, the mutant comprises a mutation at S440 and optionally has no mutation at K439.
1つの態様において、本発明は、S440における変異がKおよびRから選択されるアミノ酸へのアミノ酸置換（例えばS440K）である変異体に関する。 In one embodiment, the invention relates to a variant wherein the mutation in S440 is an amino acid substitution (eg, S440K) with an amino acid selected from K and R.
1つの態様において、変異体はK439およびS440の両方に変異を含む。 In one embodiment, the mutant comprises a mutation in both K439 and S440.
別の態様において、K439における変異はK439からD、EまたはRへの変異（例えば、K439D/E）から選択され、S440における変異はS440からD、E、KおよびR（例えば、S440K/R）への変異から選択される。 In another embodiment, the mutation at K439 is selected from a K439 to D, E or R mutation (eg, K439D / E) and the mutation at S440 is S440 to D, E, K and R (eg, S440K / R). Selected from mutations to
別の態様において、K439における変異はK439DおよびK439Eから選択され、S440における変異はS440KおよびS440Rから選択される。 In another embodiment, the mutation at K439 is selected from K439D and K439E, and the mutation at S440 is selected from S440K and S440R.
別の態様において、変異体はK439EおよびS440K変異を含む。 In another embodiment, the variant comprises the K439E and S440K mutations.
1つの態様において、親ポリペプチドは、免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含む親抗体である。 In one embodiment, the parent polypeptide is a parent antibody comprising an immunoglobulin Fc domain and an antigen binding region.
実施例4〜6に記載されているように、K439EおよびS440K変異のうち1つのみを含む抗体変異体は、C1qに対するKDの劇的な増大を有し、これは補体活性化および／またはCDC能力の低下を反映している。驚いたことに、両方の変異を含むHuMAb 7D8または005の抗体変異体は、C1q結合またはCDCの回復または増強がみられることが見いだされた。いかなる特定の理論にも拘束されることはないが、その基礎にある機序はおそらく、図4および5に図示されているように、各々の変異が互いに立体的に代償することによって説明しうると考えられる。 As described in Examples 4-6, the antibody variant comprising only one of the K439E and S440K mutation have a dramatic increase in the K D for CIq, which complement activation and / Or reflects the decline in CDC capacity. Surprisingly, antibody variants of HuMAb 7D8 or 005 containing both mutations were found to recover or enhance C1q binding or CDC. Without being bound by any particular theory, the underlying mechanism may probably be explained by the steric compensation of each mutation as shown in Figures 4 and 5 it is conceivable that.
1つの態様において、親ポリペプチドは（およびそれに関してその変異体も）免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含む抗体であってもよい。 In one embodiment, the parent polypeptide (and also variants thereof) may be an antibody comprising an immunoglobulin Fc domain and an antigen binding region.
別の態様において、本明細書に記載されたような位置K439およびS440の両方に変異を含む変異体は、親抗体、またはK439およびS440のうち1つのみに変異を含む抗体変異体と比較して、補体依存性細胞傷害作用（CDC）、C1q結合、補体活性化、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）、Fc-γ受容体結合を含むFc受容体結合、プロテインA結合、プロテインG結合、抗体依存性細胞食作用（ADCP）、補体依存性細胞傷害作用（CDCC）、補体増強性細胞傷害作用、オプソニン作用、Fc含有ポリペプチドの細胞内移行、標的ダウンモジュレーション、ADC取り込み、アポトーシスの誘導、細胞死、細胞周期停止およびそれらの任意の組み合わせから選択されるFc媒介性エフェクター機能の増強を有する。 In another embodiment, a variant comprising a mutation at both positions K439 and S440 as described herein is compared to a parent antibody or an antibody variant comprising a mutation in only one of K439 and S440. Complement-dependent cytotoxicity (CDC), C1q binding, complement activation, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), Fc receptor binding, including Fc-γ receptor binding, protein A binding , Protein G binding, antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), complement-dependent cytotoxicity (CDCC), complement-enhanced cytotoxicity, opsonization, intracellular translocation of Fc-containing polypeptides, target down-modulation, Has enhanced Fc-mediated effector function selected from ADC uptake, induction of apoptosis, cell death, cell cycle arrest and any combination thereof.
本発明はまた、例えば野生型抗体でありうる親抗体、またはK439EもしくはS440K変異のうち1つのみを含む抗体変異体と比較して、（i）抗体によって媒介されるCDC、（ii）抗体によって媒介される補体活性化、（iii）C1q結合力、（iv）オリゴマー形成、（v）オリゴマー安定性、または（i）〜（v）のいずれかの組み合わせのうち1つまたは複数を回復させるための、抗体におけるK439EおよびS440K変異の使用を提供する。（iv）または（v）の1つの態様において、オリゴマーはヘキサマーである。 The present invention also includes (i) an antibody-mediated CDC, (ii) an antibody compared to a parent antibody, which can be, for example, a wild-type antibody, or an antibody variant comprising only one of the K439E or S440K mutations. Restores one or more of mediated complement activation, (iii) C1q binding power, (iv) oligomer formation, (v) oligomer stability, or any combination of (i)-(v) For use of the K439E and S440K mutations in antibodies. In one embodiment of (iv) or (v), the oligomer is a hexamer.
1つの態様において、変異体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体から選択される。 In one embodiment, the variant is selected from a monospecific antibody, a bispecific antibody or a multispecific antibody.
混合変異体
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む他の親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドにも適用可能であり得ることが理解されるべきである。
All embodiments described herein with reference to a mixed variant parent antibody, first parent antibody or second parent antibody include other parent polypeptides comprising an Fc domain of an immunoglobulin and a binding region; It should be understood that it may also be applicable to the first parent polypeptide or the second parent polypeptide.
上述したように、本発明の発明者らは、例えば、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置K439およびS440における変異のように、単独ではエフェクター機能を低下させるが、一緒に用いた場合にはエフェクター機能が回復する変異が存在することも見いだした。すなわち、この考え方は、一方の抗体にK439を、もう一方にS440を導入することによって、2種の異なる抗体を確実に対合させるために用いることができる。このように、「混合変異体」局面の抗体変異体は1つの変異を含むが、それは典型的には同一のFc分子間のFc：Fc相互作用の低下または大幅な低下を招くものである。しかし、本発明の「混合変異体」抗体変異体は互いに対合することができるため；それにより、例えば、各変異体のみ、または1つもしくは複数の親抗体の混合物と比較して、特異的な抗体変異体の対について、CDC、C1q結合、補体活性化、オリゴマー形成、および／またはオリゴマー安定性の回復またはさらには増強さえももたらすことができる。本発明の1つの態様において、オリゴマーはヘキサマーである。1つの態様において、抗体変異体の対はさらに、または代替的に、保たれているかまたは向上した他のエフェクター機能、例えばC1q結合、補体活性化、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）、FcRn結合、Fc-γ受容体結合を含むFc受容体結合、プロテインA結合、プロテインG結合、抗体依存性細胞食作用（ADCP）、補体依存性細胞傷害作用（CDCC）、補体増強性細胞傷害作用、オプソニン作用、Fc含有ポリペプチドの細胞内移行、標的ダウンモジュレーション、ADC取り込み、アポトーシスの誘導、細胞死、細胞周期停止およびそれらの任意の組み合わせなどを有する。本発明のこの局面は、C1q結合、補体活性化、CDCまたは他のエフェクター機能の強さだけでなく選択性をも調節することのできる、数多くの用途をもたらす。 As noted above, the inventors of the present invention alone reduced effector function when used together, such as mutations at positions K439 and S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, but when used together, We also found a mutation that restores function. That is, this concept can be used to reliably pair two different antibodies by introducing K439 into one antibody and S440 into the other. Thus, an antibody variant of the “mixed variant” aspect contains one mutation, which typically results in a reduced or significant reduction in Fc: Fc interactions between identical Fc molecules. However, because “mixed variant” antibody variants of the invention can pair with each other; thereby, for example, specific for each variant alone or compared to a mixture of one or more parent antibodies. For some antibody variant pairs, CDC, C1q binding, complement activation, oligomerization, and / or oligomer stability can be restored or even enhanced. In one embodiment of the invention, the oligomer is a hexamer. In one embodiment, antibody variant pairs may additionally or alternatively have other effector functions that are retained or improved, such as C1q binding, complement activation, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). ), FcRn binding, Fc receptor binding including Fc-γ receptor binding, protein A binding, protein G binding, antibody dependent cellular phagocytosis (ADCP), complement dependent cytotoxicity (CDCC), complement enhancement It has sex cytotoxicity, opsonization, intracellular translocation of Fc-containing polypeptide, target down-modulation, ADC uptake, induction of apoptosis, cell death, cell cycle arrest and any combination thereof. This aspect of the invention provides a number of uses that can modulate selectivity as well as the strength of C1q binding, complement activation, CDC or other effector functions.
「混合変異体」対における各抗体変異体に関する例示的な変異部位は、表2Bに示されている。具体的には、本発明は、抗原結合領域と免疫グロブリンのFcドメインとを含む抗体の変異体であって、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440のうち1つに対応する残基に変異を含む変異体を提供する。 Exemplary mutation sites for each antibody variant in the “mixed variant” pair are shown in Table 2B. Specifically, the present invention relates to a variant of an antibody comprising an antigen-binding region and an immunoglobulin Fc domain, the residue corresponding to one of K439 and S440 in the Fc region of human IgG1 heavy chain. Variants containing mutations are provided.
1つの態様において、変異はK439にあり、これはEまたはDから選択されるアミノ酸へのアミノ酸置換、例えばK439Eである。1つの態様において、変異はS440にあり、これはKまたはRから選択されるアミノ酸へのアミノ酸置換、例えばS440Kである。 In one embodiment, the mutation is at K439, which is an amino acid substitution to an amino acid selected from E or D, such as K439E. In one embodiment, the mutation is in S440, which is an amino acid substitution to an amino acid selected from K or R, such as S440K.
1つの態様において、変異体は、IgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置のみにアミノ酸変異を含み、位置S440に対応する位置には含まない。 In one embodiment, the variant comprises an amino acid mutation only at the position corresponding to K439 in the Fc region of the IgG1 heavy chain and not at the position corresponding to position S440.
1つの態様において、変異体は、S440に対応する位置のみにアミノ酸変異を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とし、IgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置にはアミノ酸変異を含まない。 In one embodiment, the variant comprises an amino acid mutation only at a position corresponding to S440, provided that the mutation at S440 is not S440Y or S440W, at a position corresponding to K439 in the Fc region of the IgG1 heavy chain. Does not contain amino acid mutations.
したがって、1つの態様において、本発明はまた、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される第1の変異；ならびにヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応するアミノ酸残基における第2の変異を含む変異体にも関する。 Thus, in one embodiment, the invention also provides a first selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of a human IgG1 heavy chain. Mutations; as well as variants comprising a second mutation in the amino acid residue corresponding to K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain.
別の態様において、本発明はまた、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345RおよびE345Yに対応する群から選択される第1の変異；ならびにヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応するアミノ酸残基における第2の変異を含み、ただし、第2の変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする変異体にも関する。 In another embodiment, the present invention also provides a first mutation selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R and E345Y in the Fc region of a human IgG1 heavy chain; and human IgG1 heavy It also includes a second mutation at the amino acid residue corresponding to S440 in the Fc region of the chain, provided that the second mutation is not S440Y or S440W.
1つの態様において、上記の2つの態様を、本発明による「混合変異体」対の局面において組み合わせることもできる。 In one embodiment, the above two embodiments can also be combined in a “mixed variant” pair aspect according to the present invention.
「混合変異体」対における各変異体が、表1に列記されたアミノ酸における変異をさらに含んでもよい。 Each variant in the “mixed variant” pair may further comprise a mutation in an amino acid listed in Table 1.
本発明の1つの態様において、「混合変異体」対は、親抗体の第1の変異体および親抗体の第2の変異体を含み、ここで第1の変異体は免疫グロブリンの第1のFcドメインと抗原結合領域とを含み、前記第1の変異体は（i）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される、K439における変異以外の、1つまたは複数のアミノ酸残基における第1の変異、例えばE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wなど、ならびにヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における第2の変異；を含み、かつ
第2の変異体は免疫グロブリンの第2のFcドメインと抗原結合領域とを含み、前記第2の変異体は（i）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430XおよびE345Xに対応する群から選択される、S440における変異以外の、1つまたは複数のアミノ酸残基における第1の変異、例えばE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345RおよびE345Yなど、ならびに
（ii）IgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における第2の変異、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、を含む。
In one embodiment of the invention, the “mixed variant” pair comprises a first variant of the parent antibody and a second variant of the parent antibody, wherein the first variant is the first of the immunoglobulin. An Fc domain and an antigen binding region, wherein the first variant is (i) selected from the group corresponding to E430X, E345X, S440Y and S440W in the Fc region of a human IgG1 heavy chain, other than a mutation at K439, Position corresponding to the first mutation in one or more amino acid residues, e.g. E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W, and K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain And wherein the second variant comprises an immunoglobulin second Fc domain and an antigen binding region, wherein the second variant is (i) in the Fc region of a human IgG1 heavy chain One other than the mutation at S440, selected from the group corresponding to E430X and E345X Or a first mutation at a plurality of amino acid residues, such as E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R and E345Y, and (ii) a second at a position corresponding to S440 in the Fc region of the IgG1 heavy chain Mutations, provided that the mutation at S440 is not S440Y or S440W.
その他の例示的な「混合変異体」対は、これらには限定されないが、以下の対の任意のものをさらに含んでもよい；変異K447Eを含む第1の変異体および変異K447／P448を含む第2の変異体；変異K447Eを含む第1の変異体および変異K447／K448／P449を含む第2の変異体。 Other exemplary “mixed variant” pairs may further include, but are not limited to, any of the following pairs; a first variant comprising mutation K447E and a first variant comprising mutation K447 / P448. 2 mutants; a first mutant comprising mutation K447E and a second mutant comprising mutation K447 / K448 / P449.
1つの態様において、変異は欠失、挿入または置換である。アミノ酸のそのような置換は、任意の天然型または非天然アミノ酸によるものであってよい。 In one embodiment, the mutation is a deletion, insertion or substitution. Such substitution of amino acids may be by any natural or unnatural amino acid.
1つの態様において、変異は欠失である。 In one embodiment, the mutation is a deletion.
別の態様において、変異は挿入である。 In another embodiment, the mutation is an insertion.
別の態様において、変異はアミノ酸の置換である。 In another embodiment, the mutation is an amino acid substitution.
1つの特定の態様において、第1の変異体および／または第2の変異体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E345KおよびE345Qに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を含む。 In one particular embodiment, the first variant and / or the second variant is one or more selected from the group corresponding to E430G, E430S, E345K and E345Q in the Fc region of the human IgG1 heavy chain. Includes mutations at amino acid residues.
例えば、1つの態様において、「混合変異体」対における一方の変異体はE430G、E430S、E345KまたはE345Qのうち1つをK439E変異と併せて含み、他方で別の変異体はE430G、E430S、E345KまたはE345Qのうち1つをS440K変異と併せて含み、それにより、より増強され、かつより特異的な、C1q結合力、補体活性化、CDC、オリゴマー形成、オリゴマー安定性、ならびに／または他のエフェクター関連機能、例えばADCC、Fc-γ受容体結合、プロテインA結合、プロテインG結合、ADCP、CDCC、補体増強性細胞傷害作用、抗体媒介性食作用、細胞内移行、アポトーシス、オプソニン化抗体の補体受容体に対する結合、および／またはそれらの組み合わせなどをもたらす。 For example, in one embodiment, one variant in a “mixed variant” pair comprises one of E430G, E430S, E345K or E345Q in combination with the K439E mutation, while the other variant is E430G, E430S, E345K. Or one of E345Q in combination with the S440K mutation, thereby enhancing and more specific C1q binding power, complement activation, CDC, oligomer formation, oligomer stability, and / or other Effector-related functions such as ADCC, Fc-γ receptor binding, protein A binding, protein G binding, ADCP, CDCC, complement-enhanced cytotoxicity, antibody-mediated phagocytosis, intracellular translocation, apoptosis, opsonized antibody This results in binding to complement receptors, and / or combinations thereof.
「混合変異体」局面はまた、例えば変異S440K／K447Eを含む第1の変異体および変異K439E／K447／P448を含む第2の変異体など；例えば変異K439E／K447Eを含む第1の変異体および変異S440K／K447／P448を含む第2の変異体などというように、それぞれがヒトIgG1重鎖のFc領域において表2Aに列記された複数の変異を含む、2つの変異体を含んでもよい。 The “mixed variant” aspect also includes, for example, a first variant comprising the mutation S440K / K447E and a second variant comprising the mutation K439E / K447 / P448; for example, a first variant comprising the mutation K439E / K447E and Two mutants each comprising a plurality of mutations listed in Table 2A in the Fc region of the human IgG1 heavy chain may be included, such as a second mutant comprising mutation S440K / K447 / P448.
本明細書に記載されたような「混合変異体」対における変異体は、同じ親抗体に由来してもよく、または異なる親抗体に由来してもよい。さらに、「混合変異体」局面を、二重特異性抗体または非対称性抗体に使用することもできる。さらに、第1、第2および第3の抗体が、同じまたは異なる標的上の異なるエピトープと結合してもよい。 Variants in “mixed variant” pairs as described herein may be derived from the same parent antibody or from different parent antibodies. Furthermore, the “mixed variant” aspect can also be used for bispecific or asymmetric antibodies. Furthermore, the first, second and third antibodies may bind to different epitopes on the same or different targets.
さらに、「混合変異体」局面は、K439E変異を有する、第1の抗原に対する第1の抗体と、S440KまたはS440R変異を有する、第2の抗原に対する第2の抗体とを利用することによって、2つの特異的腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞をより特異的に対象とするCDCまたは他のエフェクター応答をもたらすことができる。任意で二重特異性抗体である、3つの変異体を含む「混合変異体」局面を利用することにより、少なくとも2つ、例えば2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの特異的腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞をより特異的に対象とするCDCまたは他のエフェクター応答がもたらされる可能性がある。 Furthermore, the “mixed variant” aspect utilizes a first antibody against the first antigen having the K439E mutation and a second antibody against the second antigen having the S440K or S440R mutation, to CDC or other effector responses can be generated that more specifically target tumor cells that express one specific tumor antigen. By utilizing a “mixed variant” aspect comprising three variants, optionally bispecific antibodies, at least 2, eg 2, 3, 4, 5 or 6 specific tumors A CDC or other effector response that more specifically targets tumor cells expressing the antigen may result.
「単一変異体」局面、「二重変異体」局面および「混合変異体」局面の任意のものの1つの態様において、変異体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体から選択される。 In one embodiment of any of the “single variant”, “double variant” and “mixed variant” aspects, the variant is a monospecific antibody, bispecific antibody or multispecific Selected from antibodies.
「混合変異体」局面の任意の態様において、第1、第2および／または第3の変異体は、表1に列記されたアミノ酸置換のうちいずれかの同じまたは異なる変異を含んでもよい。 In any embodiment of the “mixed variant” aspect, the first, second and / or third variants may comprise the same or different mutations of any of the amino acid substitutions listed in Table 1.
多重特異性抗体
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む他の親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに対しても適用しうることが理解されるべきである。
All embodiments described herein with reference to a multispecific antibody parent antibody, first parent antibody or second parent antibody are other parent polypeptides comprising an Fc domain of an immunoglobulin and a binding region. It should be understood that this may also apply to the first parent polypeptide or the second parent polypeptide.
本明細書に記載された「単一変異体」局面、「二重変異体」局面および「混合変異体」局面の任意の態様を、以下に説明する多重特異性抗体局面に用いてもよいことが理解されるべきである。 Any embodiment of the “single variant”, “double variant” and “mixed variant” aspects described herein may be used in the multispecific antibody aspect described below. Should be understood.
したがって、1つの態様において、変異体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体から選択される抗体である。 Thus, in one embodiment, the variant is an antibody selected from monospecific antibodies, bispecific antibodies or multispecific antibodies.
1つの特定の態様において、二重特異性抗体は、WO 2011／131746号に記載された形式を有する。 In one particular embodiment, the bispecific antibody has the format described in WO 2011/131746.
1つの主要な局面において、本発明は、免疫グロブリンの第1のCH2-CH3領域と第1の抗原結合領域とを含む第1のポリペプチド、および、免疫グロブリンの第2のCH2-CH3領域と第2の抗原結合領域とを含む第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体である親抗体の変異体であって、第1および第2の抗原結合領域が同一の抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、第1および／または第2のCH2-CH3領域が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含み、かつ
第1のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択されるアミノ酸残基におけるさらなる変異を含み；かつ
第2のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択されるアミノ酸残基におけるさらなる変異を含み、かつ、第1のポリペプチドにおけるさらなる変異が、第2のポリペプチドにおけるさらなる変異とは異なる、変異体に関する。
In one major aspect, the present invention provides a first polypeptide comprising an immunoglobulin first CH2-CH3 region and a first antigen-binding region, and an immunoglobulin second CH2-CH3 region. A variant of a parent antibody that is a bispecific antibody comprising a second polypeptide comprising a second antigen-binding region, wherein the first and second antigen-binding regions are on the same antigen or on different antigens The first and / or second CH2-CH3 regions correspond to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain Selected from those corresponding to K409, T366, L368, K370, D399, F405 and Y407 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain. A further mutation in the amino acid residue to be selected; and a second polypeptide Contains a further mutation in an amino acid residue selected from those corresponding to F405, T366, L368, K370, D399, Y407 and K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, and further in the first polypeptide It relates to a variant, wherein the mutation is different from further mutations in the second polypeptide.
1つの態様において、変異は欠失、挿入または置換である。アミノ酸のそのような置換は、任意の天然型または非天然の酸による置換であってよい。 In one embodiment, the mutation is a deletion, insertion or substitution. Such substitution of amino acids may be any natural or non-natural acid substitution.
本発明の二重特異性抗体は特定の形式には限定されず、それは上記のものおよび本明細書に記載された任意のものであってよい。 The bispecific antibodies of the present invention are not limited to a particular format and may be those described above and any described herein.
本発明の1つの特定の態様において、（i）第1のポリペプチドは、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409に対応するアミノ酸残基におけるさらなる変異、例えばK409Rを含み；かつ
（ii）第2のポリペプチドは、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405に対応するアミノ酸残基におけるさらなる変異、例えばF405Lを含む；または代替的には
（iii）第1のポリペプチドは、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405に対応するアミノ酸残基におけるさらなる変異、例えばF405Lを含み；かつ
（iv）第2のポリペプチドは、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409に対応するアミノ酸残基におけるさらなる変異、例えばK409Rを含む。
In one particular embodiment of the invention, (i) the first polypeptide comprises a further mutation in the amino acid residue corresponding to K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, for example K409R; and (ii) the second The polypeptide comprises a further mutation in the amino acid residue corresponding to F405 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, eg, F405L; or alternatively (iii) the first polypeptide is the Fc of the human IgG1 heavy chain Further mutations in the amino acid residues corresponding to F405 in the region, eg F405L; and (iv) the second polypeptide is further mutations in amino acid residues corresponding to K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, eg K409R including.
1つの特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E345KおよびE345Qに対応する群から選択される。 In one particular embodiment, the mutation at one or more amino acid residues is selected from the group corresponding to E430G, E430S, E345K and E345Q in the Fc region of the human IgG1 heavy chain.
本発明のそのような二重特異性抗体は、実施例22に記載されたように作製することができる。その上、作製されたヘテロダイマータンパク質によるCDC致死に対する効果を、実施例23で用いたようなアッセイによって試験することもできる。 Such bispecific antibodies of the invention can be made as described in Example 22. Moreover, the effect of the generated heterodimeric protein on CDC lethality can be tested by an assay as used in Example 23.
二重特異性抗体は、例えば、CD20抗体の抗原結合領域およびCD38抗体の抗原結合領域、ならびに表1および／または2A/Bに列記された1つまたは複数のアミノ酸におけるアミノ酸置換を含みうる。例示的なCD20結合領域には、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO 2004/035607号に記載されたオファツムマブ（2F2）、7D8および11B8、ならびにリツキシマブ（WO 2005/103081号）のものが含まれる。例示的なCD38結合領域には、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO 2006/099875号に記載された003およびダラツムマブ（005）のものが含まれる。 Bispecific antibodies can include, for example, amino acid substitutions in one or more amino acids listed in Tables 1 and / or 2A / B, as well as the antigen binding region of the CD20 antibody and the antigen binding region of the CD38 antibody. Exemplary CD20 binding regions include those of ofatumumab (2F2), 7D8 and 11B8, and rituximab (WO 2005/103081) described in WO 2004/035607, which is incorporated herein by reference in its entirety. included. Exemplary CD38 binding regions include those of 003 and daratumumab (005) described in WO 2006/099875, which is incorporated herein by reference in its entirety.
1つの態様において、二重特異性抗体は、同一または異なる標的上の異なるエピトープと結合する。 In one embodiment, bispecific antibodies bind to different epitopes on the same or different targets.
別の態様において、第1および第2のポリペプチドにおける第1の変異は同じであっても異なってもよい。 In another embodiment, the first mutation in the first and second polypeptides can be the same or different.
「単一変異体」、「二重変異体」、「混合変異体」および多重特異性抗体の局面の1つの態様において、変異体はヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgMまたはIgE抗体であり、任意でヒト完全長IgG1抗体などのヒト完全長抗体である。 In one embodiment of the “single variant”, “double variant”, “mixed variant” and multispecific antibody aspects, the variant is a human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM or IgE antibody, optionally a human full length antibody such as a human full length IgG1 antibody.
任意の「単一変異体」、「二重変異体」、「混合変異体」局面および多重特異性抗体の局面において、抗体のC1q結合は実施例4に記載されたアッセイに従って決定され、CDCは実施例5、6または10に記載されたアッセイに従って決定され、変異はC1q結合に直接関与するアミノ酸残基にはなく、それは任意で実施例3に従ったELISAアッセイにおけるC1q結合を実施例4に従った細胞ベースアッセイにおけるC1q結合と比較することによって決定され、かつADCCは実施例12に記載されたアッセイに従って決定される。 In any “single variant”, “double variant”, “mixed variant” aspect and multispecific antibody aspect, the C1q binding of the antibody is determined according to the assay described in Example 4, and the CDC is Determined according to the assay described in Example 5, 6 or 10, the mutation is not in the amino acid residues directly involved in C1q binding, which optionally c1q binding in the ELISA assay according to Example 3 in Example 4. The ADCC is determined according to the assay described in Example 12 and determined by comparison with C1q binding in the cell-based assay followed.
さらに、本発明は、上記の任意の「単一変異体」、「二重変異体」、「混合変異体」および多重特異性抗体の局面または態様の変異体の調製物を提供する。本発明はまた、上記の任意の「二重変異体」局面および態様の変異体を含む組成物、例えば、薬学的組成物も提供する。本発明はまた、任意のそのような変異体、調製物または組成物の医薬品としての使用も提供する。 Furthermore, the present invention provides preparations of variants of any of the “single variants”, “double variants”, “mixed variants” and multispecific antibody aspects or embodiments described above. The invention also provides compositions, eg, pharmaceutical compositions, comprising variants of any of the “double variants” aspects and embodiments described above. The invention also provides the use of any such variant, preparation or composition as a medicament.
本発明の上記の「単一変異体」、「二重変異体」、「混合変異体」および多重特異性抗体の局面は、ヒトIgG1重鎖定常領域（UniProtアクセッション番号P01857；SEQ ID NO：1）の下線を付した残基130〜330に対応する該当セグメントP247〜K447を含むIgG1重鎖を有するヒト抗体分子に対して特に適用可能である。
本発明はまた、ヒトIgG2重鎖部分を有する抗体分子に対しても適用することができる。IgG1重鎖のアミノ酸残基P247〜K447 は、IgG2重鎖定常領域（アクセッション番号P01859；SEQ ID NO：2）の下線を付した残基126〜326に対応する。
本発明はまた、ヒトIgG3重鎖部分を有する抗体分子に対しても適用することができる。IgG1重鎖のアミノ酸残基P247〜K447は、以下に下線を付した、IgG3重鎖定常領域（UniProtアクセッション番号P01860、SEQ ID NO：3）の残基177〜377に対応する。
本発明はまた、ヒトIgG4重鎖部分を有する抗体分子に対しても適用することができる。IgG1重鎖のアミノ酸残基P247〜K447 は、IgG4重鎖定常領域（アクセッション番号P01859、SEQ ID NO：4）の下線を付した残基127〜327に対応する。
本発明はまた、ヒトIgG1m（f）アロタイプ重鎖部分を有する抗体に対しても適用することができる。IgG1m（f）アロタイプのアミノ酸配列（CH3配列に下線を付している）‐SEQ ID NO：5
IgG1、IgG2、IgG3、IgG4およびIgG1m（f）定常領域の各々のセグメントのアライメントを、図2に示している。したがって、表1または表2AおよびBに記載されたアミノ酸における任意の変異を、アライメントによって定められるIgG2、IgG3、IgG4および／またはIgG1m（f）におけるその等価な位置に導入して、本発明の変異体を得ることができる。 The alignment of each segment of the IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 and IgG1m (f) constant regions is shown in FIG. Thus, any mutation in the amino acid listed in Table 1 or Tables 2A and B is introduced at its equivalent position in IgG2, IgG3, IgG4 and / or IgG1m (f) as defined by the alignment, and the mutation of the invention You can get a body.
1つの態様において、本発明は、上記の任意の局面の1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、完全長IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4抗体の変異体を提供する。 In one embodiment, the present invention provides variants of full-length IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 antibodies comprising one or more amino acid substitutions of any of the above aspects.
任意の「単一変異体」、「二重変異体」、「混合変異体」局面、および多重特異性抗体において、IgG1重鎖のFc領域は、SEQ ID NO：1の残基130〜330、SEQ ID NO：2の残基126〜326、SEQ ID NO：3の残基177〜377、またはSEQ ID NO：4の残基127〜327の配列を含みうる。 In any “single variant”, “double variant”, “mixed variant” aspect, and multispecific antibody, the Fc region of the IgG1 heavy chain comprises residues 130-330 of SEQ ID NO: 1, It may comprise the sequence of residues 126-326 of SEQ ID NO: 2, residues 177-377 of SEQ ID NO: 3, or residues 127-327 of SEQ ID NO: 4.
1つの態様において、親抗体は、SEQ ID No.：1〜5から選択される配列、例えばSEQ ID No.：1、SEQ ID No.：2、SEQ ID No.：3、SEQ ID No.：4またはSEQ ID No.：5を含む。 In one embodiment, the parent antibody is a sequence selected from SEQ ID No .: 1-5, such as SEQ ID No .: 1, SEQ ID No .: 2, SEQ ID No .: 3, SEQ ID No .: 4 or SEQ ID No .: 5 is included.
1つの態様において、IgG1重鎖のFc領域は、SEQ ID NO：1の残基130〜330の配列を含む。 In one embodiment, the Fc region of an IgG1 heavy chain comprises the sequence of residues 130-330 of SEQ ID NO: 1.
親抗体は、本明細書に記載されたような任意の親抗体であってもよい。この文脈における親抗体は、第1の親抗体および第2の親抗体でもあることを意図している。 The parent antibody may be any parent antibody as described herein. A parent antibody in this context is also intended to be a first parent antibody and a second parent antibody.
1つの態様において、親抗体は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgMまたはIgE抗体である。 In one embodiment, the parent antibody is a human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM or IgE antibody.
1つの態様において、親抗体はヒト完全長抗体、例えばヒト完全長IgG1抗体である。 In one embodiment, the parent antibody is a human full length antibody, such as a human full length IgG1 antibody.
1つの態様において、親抗体、第1の親抗体および第2の親抗体は、ヒトIgG1抗体、例えばIgG1m（za）またはIgG1m（f）アロタイプであって、任意でSEQ ID NO：1または5を含むFc領域を含む。 In one embodiment, the parent antibody, the first parent antibody and the second parent antibody are human IgG1 antibodies, such as IgG1m (za) or IgG1m (f) allotypes, optionally comprising SEQ ID NO: 1 or 5 Includes Fc region.
1つの態様において、親抗体はヒトIgG2抗体であって、任意でSEQ ID NO：2を含むFc領域を含む。 In one embodiment, the parent antibody is a human IgG2 antibody and optionally comprises an Fc region comprising SEQ ID NO: 2.
1つの態様において、親抗体はヒトIgG3抗体であって、任意でSEQ ID NO：3を含むFc領域を含む。 In one embodiment, the parent antibody is a human IgG3 antibody and optionally comprises an Fc region comprising SEQ ID NO: 3.
1つの態様において、親抗体はヒトIgG4抗体であって、任意でSEQ ID NO：4を含むFc領域を含む。 In one embodiment, the parent antibody is a human IgG4 antibody and optionally comprises an Fc region comprising SEQ ID NO: 4.
「単一変異体」、「二重変異体」、「混合変異体」および多重特異性抗体の局面の任意のものの特定の態様において、変異体は、本発明に従って導入された変異を除き、SEQ ID No：1、2、3、4および5のアミノ酸P247〜K447に対して少なくとも70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または少なくとも約99％という同一性の程度を有するアミノ酸配列を含む。 In certain embodiments of any of the “single variants”, “double variants”, “mixed variants” and any of the multispecific antibody aspects, the variants are SEQ ID NOs, except for mutations introduced according to the present invention. ID No: at least 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% for amino acids P247-K447 of 1, 2, 3, 4 and 5 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least about 99% identity An amino acid sequence having a degree of
したがって、変異体は、本明細書で定義されたあらゆる変異を除き、SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4またはSEQ ID No：5による配列を含みうる。 Thus, a variant, except for any mutation defined herein, is a sequence according to SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 or SEQ ID No: 5. May be included.
本発明の上記の「単一変異体」、「二重変異体」、「混合変異体」および多重特異性の局面の任意のものにおいて、以下の態様を含むものと解釈されうる。 Any of the above “single variants”, “double variants”, “mixed variants” and multispecific aspects of the invention can be construed to include the following embodiments.
1つの態様において、第1および／または第2の親抗体は抗体断片であり、これは任意で、一価抗体、重鎖抗体、鎖交換組換えドメイン（SEED）、triomab、二重可変ドメイン免疫グロブリン（DVD-Ig）、ノブ・イントゥ・ホール抗体、ミニ抗体、二重親和性再標的指向性分子（Fc-DARTまたはIg-DART）；LUZ-Y抗体、Biclonic抗体、二重標的指向性（DT）-Ig抗体、ツー・イン・ワン抗体、架橋Mab、mAb2、CovX-body、IgG様二重特異性抗体、Ts2Ab、BsAb、HERCULES抗体、TvAb、ScFv／Fc Fusion抗体、SCORPION、Fcドメインと融合させたscFv断片、およびFcドメインと融合させた二重scFv断片から選択される。 In one embodiment, the first and / or second parent antibody is an antibody fragment, which is optionally a monovalent antibody, heavy chain antibody, chain exchange recombination domain (SEED), triomab, double variable domain immunity Globulin (DVD-Ig), knob-in-hole antibody, mini-antibody, dual affinity retargeting molecule (Fc-DART or Ig-DART); LUZ-Y antibody, Biclonic antibody, dual-targeting ( DT) -Ig antibody, two-in-one antibody, cross-linked Mab, mAb 2 , CovX-body, IgG-like bispecific antibody, Ts2Ab, BsAb, HERCULES antibody, TvAb, ScFv / Fc Fusion antibody, SCORPION, Fc domain Selected from a scFv fragment fused to and a double scFv fragment fused to an Fc domain.
1つのさらなる態様において、第1および第2の親抗体は両方とも、ヒト腫瘍細胞の表面上で発現される抗原と結合する。 In one further embodiment, both the first and second parent antibodies bind to an antigen expressed on the surface of a human tumor cell.
1つのさらなる態様において、第1および第2の親抗体に対する抗原は、erbB1（EGFR）、erbB2（HER2）、erbB3、erbB4、MUC-1、CD4、CD19、CD20、CD38、CD138、CXCR5、c-Met、HERV-エンベロープタンパク質、ペリオスチン、Bigh3、SPARC、BCR、CD79、CD37、EGFrvIII、L1-CAM、AXL、組織因子（TF）、CD74、EpCAMおよびMRP3からなる群より別々に選択される。 In one further embodiment, the antigens for the first and second parent antibodies are erbB1 (EGFR), erbB2 (HER2), erbB3, erbB4, MUC-1, CD4, CD19, CD20, CD38, CD138, CXCR5, c- It is selected separately from the group consisting of Met, HERV-envelope protein, periostin, Big3, SPARC, BCR, CD79, CD37, EGFrvIII, L1-CAM, AXL, tissue factor (TF), CD74, EpCAM and MRP3.
1つのさらなる態様において、第1および第2の親抗体は完全ヒト抗体である。 In one further embodiment, the first and second parent antibodies are fully human antibodies.
1つのさらなる態様において、第1および第2の親抗体に対する抗原は、順序を問わず、CD20およびCD38から選択され、任意で第1および第2の親抗体は、順序を問わず、7D8および005から選択される。 In one further embodiment, the antigens for the first and second parent antibodies are selected from CD20 and CD38, in any order, and optionally the first and second parent antibodies are in any order, 7D8 and 005 Selected from.
1つのさらなる態様において、第1の抗体および第2の抗体は両方とも、細菌細胞またはビリオンの表面上で発現される抗原と結合する。 In one further embodiment, both the first antibody and the second antibody bind to an antigen expressed on the surface of a bacterial cell or virion.
別の態様において、細菌細胞は、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、炭疽菌、緑膿菌、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、エルシニア、ネズミチフス菌、髄膜炎菌および結核菌からなる群より選択される。 In another embodiment, the bacterial cell is S. aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia, Salmonella typhimurium, meninges Selected from the group consisting of Streptococcus and Mycobacterium tuberculosis.
1つのさらなる態様において、第1および第2の親抗体は同じ抗原と結合する。 In one further embodiment, the first and second parent antibodies bind to the same antigen.
別の態様において、第1および第2の親抗体は同じ抗体である。 In another embodiment, the first and second parent antibodies are the same antibody.
別の態様において、親抗体は7D8および005から選択される。 In another embodiment, the parent antibody is selected from 7D8 and 005.
組成物
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む他の親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに対しても適用しうることが理解されるべきである。
All embodiments described herein with reference to a composition parent antibody, a first parent antibody or a second parent antibody include other parent polypeptides comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, It should be understood that it can also be applied to one parent polypeptide or a second parent polypeptide.
本発明はまた、本明細書に記載されたような任意の変異体および親抗体であってよい変異体および親抗体を含む組成物にも関する。具体的な局面および態様について以下に説明する。その上、そのような変異体を、本明細書に記載された任意の方法によって得ることもできる。 The invention also relates to compositions comprising a variant and parent antibody, which may be any variant and parent antibody as described herein. Specific aspects and embodiments will be described below. Moreover, such mutants can be obtained by any method described herein.
1つの局面において、本発明は、それぞれが免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの第1および第2の変異体を含む組成物であって、第1および／または第2の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含む、組成物に関する。 In one aspect, the present invention is a composition comprising first and second variants of a parent polypeptide, each comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, wherein the first and / or second The composition relates to a composition comprising one or more mutations selected from the group corresponding to E430X, E345X, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain.
1つの態様において、第1および／または第2の変異体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含む。 In one embodiment, the first and / or second variant is selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain Containing one or more mutations.
1つの好ましい態様において、第1および／または第2の変異体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E345KおよびE345Qに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含む。 In one preferred embodiment, the first and / or second variant comprises one or more mutations selected from the group corresponding to E430G, E430S, E345K and E345Q in the Fc region of the human IgG1 heavy chain.
1つの態様において、第1および第2の変異体は両方とも、同じであっても異なってもよい1つまたは複数の変異を含む。 In one embodiment, both the first and second variants comprise one or more mutations that may be the same or different.
別の態様において、第1の変異体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440W、例えば、E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異を含み、かつ
第2の変異体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択されるアミノ酸残基における1つまたは複数の変異、例えばE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wなどを含まない。
In another embodiment, the first variant is E430X, E345X, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, e.g., E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W. An amino acid residue selected from the group corresponding to E430X, E345X, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, comprising one or more mutations selected from the corresponding group Does not include one or more mutations such as E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W.
1つの態様において、組成物は、免疫グロブリンの少なくともCH2-CH3ドメインを含む少なくとも1つの分子と本発明による変異体とを含み、ここで当該分子は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異、例えばE430G、E430S、E345KおよびE345Qなどを含む。 In one embodiment, the composition comprises at least one molecule comprising at least a CH2-CH3 domain of an immunoglobulin and a variant according to the invention, wherein the molecule comprises E430X, E345X in the Fc region of a human IgG1 heavy chain. , Mutations in one or more amino acid residues selected from the group corresponding to S440Y and S440W, such as E430G, E430S, E345K and E345Q.
本態様に記載の分子は「Fcのみの分子」と称することができ、例えばヒンジ領域などをさらに含んでもよい。しかし、そのようなヒンジ領域が含まれなくてもよい。 The molecules described in this embodiment can be referred to as “Fc-only molecules” and may further include, for example, a hinge region. However, such a hinge region may not be included.
Fcのみの分子と本発明による任意の変異体とを含む組成物は、画像診断法に用いるために、または細胞表面とひとたび結合した際の変異体の結合力をモジュレートするために適用することができる。 A composition comprising an Fc-only molecule and any variant according to the invention is applied for use in diagnostic imaging or to modulate the binding power of the variant once bound to the cell surface. Can do.
Fcのみの分子は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439および／またはS440に対応するアミノ酸残基におけるさらなる変異をさらに含んでもよく、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもなく、第1の変異がS440YまたはS440Wであるならばさらなる変異はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応するアミノ酸残基にあることを条件とする。 The Fc-only molecule may further include additional mutations in amino acid residues corresponding to K439 and / or S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, provided that the mutation in S440 is not S440Y or S440W, and the first mutation If is S440Y or S440W, further mutations are provided at the amino acid residue corresponding to K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain.
別の態様において、（i）第1の変異体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における変異をさらに含み、かつ（ii）第2の変異体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における変異をさらに含み、ただし、変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする；または代替的に（i）および（ii）が、
（iii）第1の変異体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における変異をさらに含み、ただし、変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする；かつ
（iv）第2の変異体は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における変異をさらに含む、であってもよい。
In another embodiment, (i) the first variant further comprises a mutation at a position corresponding to K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, and (ii) the second variant is a human IgG1 heavy chain Further comprising a mutation at a position corresponding to S440 in the Fc region, provided that the mutation is not S440Y or S440W; or alternatively (i) and (ii)
(Iii) the first variant further comprises a mutation at a position corresponding to S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, provided that the mutation is neither S440Y nor S440W; and (iv) the second The variant may further comprise a mutation at a position corresponding to K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain.
1つの態様において、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置K439における変異はK439D／Eであり、かつ／またはヒトIgG1重鎖のFc領域における位置S440における変異はS440K／Rである。 In one embodiment, the mutation at position K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain is K439D / E and / or the mutation at position S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain is S440K / R.
1つのさらなる態様において、本発明は、本明細書において定義されたような組成物であって、
（i）第1の変異体がプロドラッグをさらに含み、かつ
（ii）第2の変異体が第1の変異体上のプロドラッグに対する活性化因子を含む；または代替的に（i）および（ii）が
（iii）第2の変異体がプロドラッグを含み、かつ
（iv）第1の変異体が第2の変異体上のプロドラッグに対する活性化因子を含む、
であってもよい、組成物に関する。
In one further embodiment, the present invention is a composition as defined herein comprising:
(I) the first variant further comprises a prodrug, and (ii) the second variant comprises an activator for the prodrug on the first variant; or alternatively (i) and ( ii) (iii) the second variant comprises a prodrug, and (iv) the first variant comprises an activator for the prodrug on the second variant,
It may relate to a composition.
「プロドラッグ」という用語は、活性のある薬理作用（抗癌）物質になるために、例えば代謝過程による化学変換を受けなければならない、相対的に非細胞傷害性である薬物前駆体として、本発明に従って理解される必要がある。プロドラッグの例およびこれらを調製する方法は、当技術分野において周知である。その一例は、同じ細胞上に存在する抗原標的に対する、プロドラッグとコンジュゲートされた抗体の結合、および前記プロドラッグに対する活性化因子とコンジュゲートされた抗体の結合によって薬物送達がもたらされる、酵素-プロドラッグを含む抗体化合物である。これにより、プロドラッグおよびその活性化因子が互いに近接し、これによって薬物が局所的に放出されて、例えば、周囲の細胞に浸透してこれらの細胞を死滅させることができる（Senter and Springer, 2001 Adv Drug Deliv Rev. 2001 Dec 31;53(3):247-64, Senter, 1994 FASEB J. 1990 Feb 1;4(2):188-93）。
The term “prodrug” is used as a relatively non-cytotoxic drug precursor that must undergo chemical transformation, eg, by metabolic processes, to become an active pharmacological (anticancer) substance. It needs to be understood according to the invention. Examples of prodrugs and methods for preparing them are well known in the art. One example is the binding of an antibody conjugated to a prodrug to an antigen target present on the same cell, and the binding of an antibody conjugated to an activator to the prodrug, resulting in drug delivery An antibody compound containing a prodrug. This allows the prodrug and its activator to be in close proximity, thereby releasing the drug locally, for example to penetrate surrounding cells and kill these cells (Senter and Springer, 2001 Adv Drug Deliv Rev. 2001 Dec 31; 53 (3): 247-64, Senter, 1994 FASEB J. 1990
「プロドラッグの活性化因子」という用語は、プロドラッグを活性薬物に変換することができる分子として、本発明に従って理解される必要がある。プロドラッグの活性化因子の例およびこれらを調製する方法は当技術分野において周知である。活性化因子の一例は、プロドラッグの活性薬物への変換のための触媒として振る舞う酵素でありうる（Senter and Springer, 2001 Adv Drug Deliv Rev. 2001 Dec 31;53(3):247-64, Senter, 1994 FASEB J. 1990 Feb 1;4(2):188-93）。
The term “prodrug activator” is to be understood according to the invention as a molecule capable of converting a prodrug into an active drug. Examples of prodrug activators and methods of preparing them are well known in the art. An example of an activator may be an enzyme that acts as a catalyst for the conversion of a prodrug to an active drug (Senter and Springer, 2001 Adv Drug Deliv Rev. 2001 Dec 31; 53 (3): 247-64, Senter , 1994 FASEB J. 1990
1つの態様において、第1および／または第2の親ポリペプチドは、免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とをそれぞれが含む第1および第2の親抗体である。 In one embodiment, the first and / or second parent polypeptide is a first and second parent antibody, each comprising an immunoglobulin Fc domain and an antigen binding region.
1つの態様において、第1および第2の抗体は、それぞれヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgMまたはIgE抗体であり、任意でそれぞれヒト完全長抗体、例えばそれぞれヒト完全長IgG1抗体である。 In one embodiment, the first and second antibodies are human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM or IgE antibodies, respectively, optionally each human full length antibody, e.g. each human full length antibody. IgG1 antibody.
1つの態様において、第1および第2の抗体はそれぞれ、単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体から選択される。 In one embodiment, the first and second antibodies are each selected from a monospecific antibody, a bispecific antibody, or a multispecific antibody.
1つのさらなる態様において、第1および／または第2の親抗体はそれぞれ、免疫グロブリンの第1のCH2-CH3領域と第1の抗原結合領域とを含む第1のポリペプチドおよび第2のCH2-CH3領域と第2の抗原結合領域とを含む第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体であり、第1および第2の抗原結合領域は同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、かつ、前記第1のCH2-CH3領域は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸変異を含み；かつ第2のCH2-CH3領域は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸変異を含み、かつ、第1のCH2-CH3領域におけるさらなるアミノ酸変異は、第2のCH2-CH3領域におけるさらなるアミノ酸変異とは異なる。 In one further embodiment, the first and / or second parent antibody each comprises a first polypeptide comprising a first CH2-CH3 region and a first antigen-binding region of an immunoglobulin and a second CH2-. A bispecific antibody comprising a second polypeptide comprising a CH3 region and a second antigen binding region, wherein the first and second antigen binding regions bind to different epitopes on the same antigen or on different antigens. And the first CH2-CH3 region comprises a further amino acid mutation at a position selected from those corresponding to K409, T366, L368, K370, D399, F405 and Y407 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain; And the second CH2-CH3 region comprises an additional amino acid mutation at a position selected from those corresponding to F405, T366, L368, K370, D399, Y407 and K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, and Additional amino acid mutations in the CH2-CH3 region of 1 Different from further amino acid mutations in the three regions.
1つの好ましい態様において、第1のCH2-CH3領域のさらなるアミノ酸変異は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409に対応する位置にあり、例えばK409Rであり；かつ、第2のCH2-CH3領域のさらなるアミノ酸変異は、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405に対応する位置にあり、例えばF405Lである。 In one preferred embodiment, the additional amino acid mutation of the first CH2-CH3 region is at a position corresponding to K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, such as K409R; and of the second CH2-CH3 region A further amino acid mutation is at a position corresponding to F405 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, for example F405L.
1つの態様において、組成物の第1および第2の変異体は、同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合する。 In one embodiment, the first and second variants of the composition bind to different epitopes on the same antigen or on different antigens.
1つの態様において、第1および第2の変異体の一方または両方は、第1および第2の変異体の一方または両方がリンカーを介して毒素とコンジュゲートされているというように、薬物、毒素または放射性標識とコンジュゲートされている。 In one embodiment, one or both of the first and second variants is a drug, toxin, such that one or both of the first and second variants are conjugated to the toxin via a linker. Or conjugated with a radioactive label.
1つの態様において、第1および第2の変異体の一方または両方は融合タンパク質の一部である。 In one embodiment, one or both of the first and second variants are part of a fusion protein.
1つの特定の態様において、組成物の第1および／または第2の変異体は1つの変異のみを含む。 In one particular embodiment, the first and / or second variant of the composition comprises only one mutation.
第2の変異体が本明細書に記載された列記された変異のいずれも含まない諸態様において、そのような第2の変異体は、CDCを増強する方法に関連して上記に列記した、適した第2の抗体の例のいずれかを含みうる。 In embodiments where the second variant does not include any of the listed mutations described herein, such second variant is listed above in connection with methods for enhancing CDC. Any of the examples of suitable second antibodies can be included.
1つの態様において、第1および第2の変異体における少なくとも1つの第1の変異は異なる。 In one embodiment, at least one first mutation in the first and second mutants is different.
1つの態様において、第1の変異体および第2の変異体はそれぞれヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgMまたはIgE抗体であり、任意でそれぞれヒト完全長IgG1抗体、例えばそれぞれヒト完全長抗体である。 In one embodiment, the first variant and the second variant are human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM or IgE antibodies, respectively, optionally human full length IgG1 antibodies, for example Each is a human full-length antibody.
1つの態様において、第1の変異体および第2の変異体はそれぞれ、単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体から選択される。 In one embodiment, the first variant and the second variant are each selected from a monospecific antibody, a bispecific antibody or a multispecific antibody.
1つのさらなる態様において、第1および第2の変異体は同一の抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合する。したがって、第1および第2の抗体が二重特異性である態様において、抗体がそれぞれ2つの異なるエピトープと結合してもよい。少なくとも2つの二重特異性抗体は同じでも異なってもよい。そのため、二重特異性抗体が異なる場合には、組成物は同一または異なる標的上に最大で4つの異なるエピトープの標的化を含む。 In one further embodiment, the first and second variants bind to different epitopes on the same antigen or on different antigens. Thus, in embodiments where the first and second antibodies are bispecific, each antibody may bind to two different epitopes. The at least two bispecific antibodies may be the same or different. Thus, where bispecific antibodies are different, the composition includes targeting up to four different epitopes on the same or different targets.
別の局面において、本発明は、本明細書に記載された任意の変異体、任意の二重特異性抗体または任意の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。 In another aspect, the invention relates to a composition comprising any variant, any bispecific antibody or any composition described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.
また、「混合変異体」局面の態様の任意のものが、組成物態様の任意のものの中に含まれうることも企図している。 It is also contemplated that any of the embodiments of the “mixed variant” aspect can be included in any of the composition embodiments.
1つの態様において、第1および第2の親抗体の変異体は、同一の細胞上に発現された抗原と結合する。 In one embodiment, the variants of the first and second parent antibody bind to an antigen expressed on the same cell.
別の態様において、第1の親抗体の変異体は、EおよびDから選択されるアミノ酸へのK439のアミノ酸置換を含む。 In another embodiment, the variant of the first parent antibody comprises an amino acid substitution of K439 with an amino acid selected from E and D.
別の態様において、第1の親抗体の変異体におけるアミノ酸置換はK439Eである。 In another embodiment, the amino acid substitution in the variant of the first parent antibody is K439E.
別の態様において、第2の親抗体の変異体は、KおよびRから選択されるアミノ酸へのS440のアミノ酸置換を含む。 In another embodiment, the variant of the second parent antibody comprises an amino acid substitution of S440 with an amino acid selected from K and R.
別の態様において、第2の親抗体の変異体におけるアミノ酸置換はS440Kである。 In another embodiment, the amino acid substitution in the variant of the second parent antibody is S440K.
別の局面において、本発明は、上記に列記した態様の任意のものの第1の親ポリペプチドまたは親抗体の変異体および第2の親ポリペプチドまたは親抗体の変異体を含む薬学的組成物に関する。 In another aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a first parent polypeptide or parent antibody variant and a second parent polypeptide or parent antibody variant of any of the embodiments listed above. .
薬学的組成物は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995に開示されたものなどの従来の手法に従って製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、例えば、希釈剤、増量剤、塩、緩衝剤、界面活性剤（例えば、Tween-20またはTween-80などの非イオン性界面活性剤）、安定化剤（例えば、糖またはタンパク質非含有アミノ酸）、保存料、等張化剤、酸化防止剤、組織固定剤、溶解補助剤、および／または、薬学的組成物に含めるのに適した他の材料を含みうる。本発明の薬学的組成物中に使用しうる適した水性および非水性担体の例には、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、エタノール、デキストロース、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）が含まれる。 The pharmaceutical composition can be formulated according to conventional techniques such as those disclosed in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. . The pharmaceutical composition of the present invention can be, for example, a diluent, a bulking agent, a salt, a buffer, a surfactant (eg, a nonionic surfactant such as Tween-20 or Tween-80), a stabilizer (eg, , Sugar or protein-free amino acids), preservatives, isotonic agents, antioxidants, tissue fixatives, solubilizing agents, and / or other materials suitable for inclusion in pharmaceutical compositions. Examples of suitable aqueous and non-aqueous carriers that may be used in the pharmaceutical compositions of the present invention include water, saline, phosphate buffered saline, ethanol, dextrose, polyol (eg, glycerol, propylene glycol, polyethylene glycol). ) Is included.
薬学的組成物は、任意の適した経路および様式によって投与することができる。1つの態様において、本発明の薬学的組成物は非経口的に投与される。本明細書で用いる「非経口的に投与される」という用語は、通常は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、これには表皮、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外および胸骨内への注射および注入が含まれる。 The pharmaceutical composition can be administered by any suitable route and mode. In one embodiment, the pharmaceutical composition of the present invention is administered parenterally. As used herein, the term “administered parenterally” refers to modes of administration other than enteral and topical administration, usually by injection, including the epidermis, intravenous, intramuscular, intraarterial. Intrathecal, intracapsular, intraorbital, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, intratendon, transtracheal, subcutaneous, epidermal, intraarticular, subcapsular, subarachnoid, spinal cord, intracranial, intrathoracic, dura mater Includes injections and infusions outside and into the sternum.
キット・オブ・パーツ
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む他の親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに対しても適用しうることが理解されるべきである。
All embodiments described herein with reference to a kit-of-part parent antibody, first parent antibody or second parent antibody include other parental polypeptides comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region. It should be understood that it may also apply to a peptide, a first parent polypeptide or a second parent polypeptide.
本発明はまた、親ポリペプチドおよび親抗体の変異体を含む治療法において同時に、別々にまたは逐次的に用いるためのキット・オブ・パーツにも関し、ここで親ポリペプチドおよび親抗体の任意の変異体は本明細書に記載された通りであってよい。具体的な局面および態様については以下に説明する。その上、そのような変異体を、本明細書に記載された任意の方法に従って得ることもできる。 The present invention also relates to a kit of parts for use simultaneously, separately or sequentially in a therapy comprising a parent polypeptide and a variant of the parent antibody, wherein any of the parent polypeptide and parent antibody. The variant may be as described herein. Specific aspects and embodiments will be described below. Moreover, such variants can be obtained according to any method described herein.
1つの局面において、本発明は、親ポリペプチドの第1の変異体および親ポリペプチドの第2の変異体を含む治療法において同時に、別々にまたは逐次的に用いるためのキット・オブ・パーツであって、第1の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異、例えばE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wなどを含み、ただし、変異体が、変異体の新生児Fc受容体（FcRn）に対する結合を変更する、Fcドメインにおけるさらなる変異を含まないことを条件とし、かつ
（i）前記第1の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における変異を含み、かつ前記第2の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における変異を含み、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、
（ii）前記第1の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D／Eに対応する位置における変異を含み；かつ前記第2の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K／R／Hおよび448Pに対応する位置における変異を含む、または
（iii）前記第1の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D／Eに対応する位置における変異を含み；かつ前記第2の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K／R／H、448K／R／Hおよび449Pに対応する位置における変異を含む、
キット・オブ・パーツに関する。
In one aspect, the invention is a kit of parts for use simultaneously, separately or sequentially in a therapy comprising a first variant of a parent polypeptide and a second variant of a parent polypeptide. Wherein the first variant is one or more mutations selected from the group corresponding to E430X, E345X, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, such as E430G, E430S, E430F, E430T, E345K , E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W, etc., provided that the variant does not contain additional mutations in the Fc domain that alter the binding of the variant to the neonatal Fc receptor (FcRn), and (I) the first mutant contains a mutation at a position corresponding to K439 in the Fc region of a human IgG1 heavy chain, and the second mutant corresponds to S440 in the Fc region of a human IgG1 heavy chain Including mutations in position And, with the proviso that not even S440W mutation in S440 even S440Y,
(Ii) the first variant comprises a mutation at a position corresponding to K447D / E in the Fc region of a human IgG1 heavy chain; and the second variant comprises K447K / in the Fc region of a human IgG1 heavy chain Or (iii) the first variant comprises a mutation at a position corresponding to K447D / E in the Fc region of a human IgG1 heavy chain; and The variant comprises mutations at positions corresponding to K447K / R / H, 448K / R / H and 449P in the Fc region of the human IgG1 heavy chain,
It relates to kits of parts.
1つの態様において、親ポリペプチドの変異体の第1のもの、または、親ポリペプチドの変異体の第1のものと親ポリペプチドの第2の変異体との両方は、免疫グロブリンのFcドメインと抗原結合領域とを含む抗体であってよい。 In one embodiment, the first of the variants of the parent polypeptide, or both the first of the variants of the parent polypeptide and the second variant of the parent polypeptide are immunoglobulin Fc domains. And an antigen-binding region.
1つの態様において、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における変異はK439D／Eであり、かつ／またはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における変異はS440K／Rである。 In one embodiment, the mutation at the position corresponding to K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain is K439D / E and / or the mutation at the position corresponding to S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain is S440K / R. is there.
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの第1の変異体および免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む親ポリペプチドの第2の変異体を含む、治療法において同時に、別々にまたは逐次的に用いるためのキット・オブ・パーツであって、変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数の変異、例えばE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wなどを含み、ただし、変異体が、変異体の新生児Fc受容体（FcRn）に対する結合を変更する、Fcドメインにおけるさらなる変異を含まないことを条件とし、かつ
第2の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択されるアミノ酸残基における変異、例えばE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wなどを含まない、
キット・オブ・パーツに関する。
In another aspect, the invention provides a first variant of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region and a second variant of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region. From the group corresponding to E430X, E345X, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain for simultaneous, separate or sequential use in therapy, comprising One or more selected mutations, such as E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W, provided that the mutant is a mutant neonatal Fc receptor (FcRn) The second variant is selected from the group corresponding to E430X, E345X, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, provided that it does not contain further mutations in the Fc domain that alter binding to Mutations in amino acid residues, not including e.g. E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, and S440Y and S440W,
It relates to kits of parts.
第2の変異体が本明細書に記載された列記された変異のいずれも含まない諸態様において、そのような第2の変異体は、エフェクター機能の方法に関連して上記に列記した、適した第2の抗体の例のいずれかを含みうる。 In embodiments where the second variant does not include any of the listed mutations described herein, such second variant is suitable as listed above in connection with the method of effector function. Any of the examples of the second antibody.
1つの態様において、第1および第2の変異体における少なくとも1つの第1の変異は異なる。 In one embodiment, at least one first mutation in the first and second mutants is different.
1つの態様において、第1の変異体および第2の変異体はそれぞれヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgMまたはIgE抗体であり、任意でそれぞれヒト完全長IgG1抗体、例えばそれぞれヒト完全長抗体である。 In one embodiment, the first variant and the second variant are human IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM or IgE antibodies, respectively, optionally human full length IgG1 antibodies, for example Each is a human full-length antibody.
1つの態様において、第1の変異体および第2の変異体はそれぞれ、単一特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体から選択される。 In one embodiment, the first variant and the second variant are each selected from a monospecific antibody, a bispecific antibody or a multispecific antibody.
1つのさらなる態様において、第1および第2の変異体は同一の抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合する。したがって、第1および第2の抗体が二重特異性である態様において、抗体がそれぞれ2つの異なるエピトープと結合してもよい。少なくとも2つの二重特異性抗体は同じでも異なってもよい。そのため、二重特異性抗体が異なる場合には、治療法における同時、別個または逐次的な使用のためのキット・オブ・パーツは、同一または異なる標的上に最大で4つの異なるエピトープの標的化を含む。 In one further embodiment, the first and second variants bind to different epitopes on the same antigen or on different antigens. Thus, in embodiments where the first and second antibodies are bispecific, each antibody may bind to two different epitopes. The at least two bispecific antibodies may be the same or different. Thus, when bispecific antibodies are different, kits of parts for simultaneous, separate or sequential use in therapy can target up to four different epitopes on the same or different targets. Including.
1つのさらなる態様において、第1の変異体および第2の変異体の一方または両方は、薬物、毒素、放射性標識とコンジュゲートされており、例えば、第1の変異体および第2の変異体の一方または両方は、リンカーを介して毒素とコンジュゲートされている。 In one further embodiment, one or both of the first variant and the second variant is conjugated to a drug, a toxin, a radioactive label, eg, of the first variant and the second variant. One or both are conjugated to the toxin via a linker.
1つのさらなる態様において、第1の変異体および第2の変異体の一方または両方は、融合タンパク質の一部である。 In one further embodiment, one or both of the first variant and the second variant is part of a fusion protein.
また、「混合変異体」局面の態様の任意のものが、治療法における同時、別個または逐次的な使用のためのキット・オブ・パーツの態様の任意のものの中に含まれうることも企図している。 It is also contemplated that any of the embodiments of the “mixed variant” aspect can be included in any of the kit-of-part embodiments for simultaneous, separate or sequential use in therapy. ing.
1つの態様において、第1および第2の親抗体の変異体は、同一の細胞上に発現された抗原と結合する。 In one embodiment, the variants of the first and second parent antibody bind to an antigen expressed on the same cell.
別の態様において、第1の親抗体の変異体は、EおよびDから選択されるアミノ酸へのK439のアミノ酸置換を含む。 In another embodiment, the variant of the first parent antibody comprises an amino acid substitution of K439 with an amino acid selected from E and D.
別の態様において、第1の親抗体の変異体におけるアミノ酸置換はK439Eである。 In another embodiment, the amino acid substitution in the variant of the first parent antibody is K439E.
別の態様において、第2の親抗体の変異体は、KおよびRから選択されるアミノ酸へのS440のアミノ酸置換を含む。 In another embodiment, the variant of the second parent antibody comprises an amino acid substitution of S440 with an amino acid selected from K and R.
別の態様において、第2の親抗体の変異体におけるアミノ酸置換はS440Kである。 In another embodiment, the amino acid substitution in the variant of the second parent antibody is S440K.
別の局面において、本発明は、上記に列記した態様の任意の1つの第1の親ポリペプチドまたは親抗体の変異体および第2の親ポリペプチドまたは親抗体の変異体を含む、治療法における同時、別個または逐次的な使用のための薬学的キット・オブ・パーツに関する。 In another aspect, the present invention relates to a therapeutic method comprising any one first parent polypeptide or parent antibody variant and second parent polypeptide or parent antibody variant of any of the embodiments listed above. It relates to a pharmaceutical kit of parts for simultaneous, separate or sequential use.
治療法における同時、別個または逐次的な使用のための薬学的キット・オブ・パーツは、任意の適した経路および様式によって投与しうる。1つの態様において、本発明の、治療法における同時、別個または逐次的な使用のための薬学的キット・オブ・パーツは、非経口的に投与される。本明細書で用いる「非経口的に投与される」という用語は、通常は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、これには表皮、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、腱内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、硬膜外および胸骨内への注射および注入が含まれる。 Pharmaceutical kits of parts for simultaneous, separate or sequential use in therapy may be administered by any suitable route and mode. In one embodiment, the pharmaceutical kit of parts of the present invention for simultaneous, separate or sequential use in therapy is administered parenterally. As used herein, the term “administered parenterally” refers to modes of administration other than enteral and topical administration, usually by injection, including the epidermis, intravenous, intramuscular, intraarterial. Intrathecal, intracapsular, intraorbital, intracardiac, intradermal, intraperitoneal, intratendon, transtracheal, subcutaneous, epidermal, intraarticular, subcapsular, subarachnoid, spinal cord, intracranial, intrathoracic, dura mater Includes injections and infusions outside and into the sternum.
組み合わせ
さらに、本発明は、上記の任意の「単一変異体」局面または態様の変異体の調製物、すなわち、変異体の複数のコピーを含む調製物も提供する。本発明はまた、上記の任意の「単一変異体」局面および態様の変異体を含む組成物、例えば、薬学的組成物も提供する。本発明はまた、任意のそのような「単一変異体」変異体、調製物または組成物の、医薬品としての使用も提供する。
Combinations Further, the present invention also provides variant preparations of any “single variant” aspect or embodiment described above, ie, preparations comprising multiple copies of the variant. The present invention also provides compositions, eg, pharmaceutical compositions, comprising variants of any “single variant” aspect and embodiment described above. The invention also provides the use of any such “single variant” variant, preparation or composition as a medicament.
本発明はまた、1つの変異体が本発明に従う少なくとも1つの変異を含み、かつ1つの変異体が本発明に従う少なくとも1つの他の変異を含む、変異体の組み合わせ、ならびにそのような変異体の組み合わせの調製物および薬学的組成物、ならびに医薬品としてのそれらの使用も提供する。好ましくは、2つの変異体は、同じ抗原と結合するか、または典型的には同じ細胞、細胞膜、ビリオンおよび／もしくは他の粒子の表面上に発現される異なる抗原と結合する。 The invention also provides a combination of variants, wherein one variant comprises at least one variant according to the invention and one variant comprises at least one other variant according to the invention, as well as of such variants Combination preparations and pharmaceutical compositions and their use as pharmaceuticals are also provided. Preferably, the two variants bind to the same antigen or to different antigens that are typically expressed on the surface of the same cell, cell membrane, virion and / or other particle.
コンジュゲート
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む他の親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドにも適用可能であり得ることが理解されるべきである。
All embodiments described herein with reference to a conjugated parent antibody, a first parent antibody or a second parent antibody include other parent polypeptides comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, It should be understood that it may also be applicable to one parent polypeptide or a second parent polypeptide.
1つの局面において、本発明は、薬物、毒素または放射性標識とコンジュゲートされている変異体に関し、例えば、リンカーを介して毒素とコンジュゲートされている変異体に関する。 In one aspect, the invention relates to variants conjugated to drugs, toxins or radiolabels, for example, variants conjugated to toxins via a linker.
1つの態様において、前記変異体は融合タンパク質の一部である。 In one embodiment, the variant is part of a fusion protein.
別の局面において、本発明の変異体は、C末端では毒素または標識などの別の分子とコンジュゲートされていない。1つの態様において、変異体は別の部位、典型的にはオリゴマー形成を妨げない部位で別の分子とコンジュゲートされている。例えば、抗体変異体は、その他方の部位で、毒素（放射性同位体を含む）、プロドラッグまたは薬物からなる群より選択される化合物と連結されている。そのような化合物は、例えば癌治療において、標的細胞の致死をより有効にすることができる。したがって、結果として得られる変異体は免疫コンジュゲートである。 In another aspect, the variants of the invention are not conjugated at the C-terminus with another molecule such as a toxin or label. In one embodiment, the variant is conjugated to another molecule at another site, typically one that does not interfere with oligomer formation. For example, the antibody variant is linked at the other site with a compound selected from the group consisting of toxins (including radioisotopes), prodrugs or drugs. Such compounds can make target cell killing more effective, for example, in cancer therapy. Accordingly, the resulting variant is an immunoconjugate.
したがって、1つのさらなる局面において、本発明は、1つまたは複数の治療用部分、例えば細胞毒素、化学療法薬、サイトカイン、免疫抑制剤および／または放射性同位体などと連結またはコンジュゲートされた抗体を提供する。そのようなコンジュゲートは、本明細書において「免疫コンジュゲート」または「薬物コンジュゲート」と称される。1つまたは複数の細胞毒素を含む免疫コンジュゲートは「イムノトキシン」と称される。 Accordingly, in one further aspect, the present invention provides an antibody conjugated or conjugated with one or more therapeutic moieties such as cytotoxins, chemotherapeutic agents, cytokines, immunosuppressive agents and / or radioisotopes. provide. Such conjugates are referred to herein as “immunoconjugates” or “drug conjugates”. Immunoconjugates that contain one or more cytotoxins are referred to as “immunotoxins”.
細胞毒素または細胞傷害剤には、細胞にとって有害な（例えば、細胞を死滅させる）任意の薬剤が含まれる。本発明の免疫コンジュゲートを形成させるのに適した治療薬には、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、マイタンシンまたはその類似体もしくは誘導体、ネオカルジノスタチン、カリケアミシン類、エスペラミシン類、ダイネミシン類、リダマイシン、ケダルシジンまたはその類似体もしくは誘導体を含むエンジイン系抗腫瘍抗生物質、アントラサイクリン類、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロ-テストステロン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、ダカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビンなど）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）、ロムスチン（CCNU）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（DTIC）、プロカルバジン、マイトマイシンC、シスプラチンおよび他の白金誘導体、例えばカルボプラチンなど；ならびにデュオカルマイシンA、デュオカルマイシンSA、CC-1065（別名ラケルマイシン）またはCC-1065の類似体もしくは誘導体）、ドラスタチン、ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアセピン類（PDB）またはそれらの類似体、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（AMC）など）、有糸***阻害剤（例えば、チューブリン阻害薬）、例えばモノメチルアウリスタチンE、モノメチルアウリスタチンF、またはドラスタチン10の他の類似体もしくは誘導体など；ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、例えばヒドロキサム酸トリコスタチンA、ボリノスタット（SAHA）、ベリノスタット、LAQ824、およびパノビノスタットならびにベンズアミド類、エンチノスタット、CI994、モセチノスタット、ならびに脂肪酸化合物、例えばフェニルブチレートおよびバルプロ酸など、プロテアソーム阻害薬、例えばダノプレビル、ボルテゾミブなど、アマトキシン類、例えばα-アマンチンなど、ジフテリア毒素および関連分子（例えば、ジフテリアA鎖およびその活性断片、ならびにハイブリッド分子）；リシン毒素（例えば、リシンAまたは脱グリコシル化リシンA鎖毒素など）、コレラ毒素、志賀毒素様毒素（SLT-I、SLT-II、SLT-IIV）、LT毒素、C3毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、ダイズBowman-Birkプロテアーゼインヒビター、緑膿菌外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ゲラニン（gelanin）、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Phytolacca americana）タンパク質（PAPI、PAPIIおよびPAP-S）、ニガウリ（momordica charantia）インヒビター、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシン毒素が含まれる。他の適したコンジュゲート分子には、抗菌性／溶解性ペプチド、例えばCLIP、マガイニン2、メリチン、セクロピンおよびP18など；リボヌクレアーゼ（RNアーゼ）、DNアーゼI、ブドウ球菌エンテロトキシン-A、ヨウシュヤマゴボウ（pokeweed）抗ウイルスタンパク質、ジフテリン毒素、ならびに緑膿菌内毒素が含まれる。例えば、Pastan et al., Cell 47, 641 (1986)およびGoldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994)を参照されたい。本明細書の他所に記載されたように本発明の抗体と組み合わせて投与しうる治療薬、例えば、抗癌サイトカインまたはケモカインなども、本発明の抗体とのコンジュゲートのために有用な治療用部分の候補である。
A cytotoxin or cytotoxic agent includes any agent that is detrimental to (eg, kills) cells. Suitable therapeutic agents for forming the immunoconjugates of the invention include taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, teniposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxy Endiyne antitumor antibiotics, anthracyclines, mitoxan, including anthracindione, maytansine or analogs or derivatives thereof, neocardinostatin, calicheamicins, esperamicins, dynemicins, lidamycin, kedarcidin or analogs or derivatives thereof Throne, mitramycin, actinomycin D, 1-dehydro-testosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, And puromycin, antimetabolites (eg, methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, fludarabine, 5-fluorouracil, dacarbazine, hydroxyurea, asparaginase, gemcitabine, cladribine, etc.), alkylating agents (eg, mechlorethamine, Thiotepa, chlorambucil, melphalan, carmustine (BSNU), lomustine (CCNU), cyclophosphamide, busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, dacarbazine (DTIC), procarbazine, mitomycin C, cisplatin and other platinum derivatives such as carboplatin; And duocarmycin A, duocarmycin SA, CC-1065 (also known as rachelmycin) or an analogue or derivative of CC-1065), dolastatin, pyrrolo [2 , 1-c] [1,4] benzodiacepines (PDB) or their analogs, antibiotics (eg, dactinomycin (formerly actinomycin), bleomycin, daunorubicin (formerly daunomycin), doxorubicin, idarubicin, mitra Mycin, mitomycin, mitoxantrone, pricamycin, anthramycin (AMC), etc.), mitotic inhibitors (eg, tubulin inhibitors) such as monomethyl auristatin E, monomethyl auristatin F, or other dolastatin 10 Analogues or derivatives; histone deacetylase inhibitors such as trichostatin A hydroxamic acid, vorinostat (SAHA), belinostat, LAQ824, and panobinostat and benzamides, entinostat, CI994, mosetinostat, and fatty acids Compounds, such as phenylbutyrate and valproic acid, proteasome inhibitors such as danoprevir, bortezomib, amatoxins such as α-amantine, diphtheria toxins and related molecules (eg, diphtheria A chain and its active fragments, and hybrid molecules) ); Ricin toxin (eg, ricin A or deglycosylated ricin A chain toxin), cholera toxin, Shiga toxin-like toxin (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT toxin, C3 toxin, Shiga toxin, Pertussis toxin, tetanus toxin, soybean Bowman-Birk protease inhibitor, Pseudomonas aeruginosa exotoxin, alloline, saporin, modesin, geranin, abrin A chain, modesin A chain, α-sarcin, Aleurites fordii protein, Giantin protein, Phytolacca americana protein (PA PI, PAPII and PAP-S), momordica charantia inhibitors, crucine, clotine, sapaonaria officinalis inhibitors, gelonin, mitogenin, restrictocin, phenomycin, and enomycin toxin. Other suitable conjugate molecules include antibacterial / lytic peptides such as CLIP,
1つの態様において、本発明の薬物コンジュゲートは、アウリスタチン類またはアウリスタチンペプチド類似体および誘導体（US5635483号；US5780588号）とコンジュゲートされた、本明細書に開示された抗体を含む。アウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解ならびに核***および細胞***を妨げること（Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584）、ならびに抗癌活性（US5663149号）および抗真菌活性（Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42: 2961-2965）を有することが示されている。アウリスタチン薬物部分を、リンカーによって、ペプチド薬物部分のN（アミノ）末端またはC（末端）を介して抗体と結びつけることもできる。 In one embodiment, a drug conjugate of the invention comprises an antibody disclosed herein conjugated with auristatins or auristatin peptide analogs and derivatives (US5635483; US5780588). Auristatin interferes with microtubule dynamics, GTP hydrolysis and nuclear and cell division (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12): 3580-3584), and anticancer activity (US5663149) And antifungal activity (Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42: 2961-2965). The auristatin drug moiety can also be linked to the antibody via the N (amino) terminus or C (terminal) of the peptide drug moiety by a linker.
例示的なアウリスタチン態様には、2004年3月28日に掲載されたSenter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research. Volume 45, abstract number 623に開示され、US 2005/0238649号に記載されている、N末端結合型モノメチルアウリスタチン薬物部分DEおよびDFが含まれる。 Exemplary auristatin embodiments are disclosed in Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research.Volume 45, abstract number 623, published March 28, 2004, and described in US 2005/0238649. N-terminally linked monomethyl auristatin drug moieties DE and DF are included.
1つの例示的なアウリスタチン態様はMMAE（モノメチルアウリスタチンE）である。別の例示的なアウリスタチン態様はMMAF（モノメチルアウリスタチンF）である。 One exemplary auristatin embodiment is MMAE (monomethyl auristatin E). Another exemplary auristatin embodiment is MMAF (monomethyl auristatin F).
1つの態様において、本発明の抗体は、コンジュゲートされた核酸または核酸結合分子を含む。1つのそのような態様において、コンジュゲートされる核酸は細胞傷害性リボヌクレアーゼ、アンチセンス核酸、抑制性RNA分子（例えば、siRNA分子）または免疫賦活性核酸（例えば、免疫賦活性CpGモチーフを含有するDNA分子）である。別の態様において、本発明の抗体は、アプタマーまたはリボザイムとコンジュゲートされている。 In one embodiment, the antibody of the invention comprises a conjugated nucleic acid or nucleic acid binding molecule. In one such embodiment, the conjugated nucleic acid is a cytotoxic ribonuclease, antisense nucleic acid, inhibitory RNA molecule (eg, siRNA molecule) or immunostimulatory nucleic acid (eg, DNA containing an immunostimulatory CpG motif) Molecule). In another embodiment, the antibody of the invention is conjugated to an aptamer or ribozyme.
1つの態様において、1つまたは複数の放射標識アミノ酸を含む抗体が提供される。放射標識された変異体は、診断目的および治療目的の両方に用いることができる（放射標識分子とのコンジュゲートは、別の考えられる特徴である）。ポリペプチドに対する標識の非限定的な例には、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tcおよび125I、131Iおよび186Reが含まれる。放射標識アミノ酸および関連したペプチド誘導体を調製するための方法は当技術分野において公知である（例えば、Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2nd Ed., Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)）ならびにU.S. 4,681,581号、U.S. 4,735,210号、U.S. 5,101,827号、U.S. 5,102,990号（US RE35,500号）、U.S. 5,648,471号およびU.S. 5,697,902号を参照）。例えば、放射性同位体をクロラミン-T法によってコンジュゲートさせることができる。 In one embodiment, an antibody is provided that comprises one or more radiolabeled amino acids. Radiolabeled variants can be used for both diagnostic and therapeutic purposes (conjugation with radiolabeled molecules is another possible feature). Non-limiting examples of labels for polypeptides include 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc and 125I, 131I and 186Re. Methods for preparing radiolabeled amino acids and related peptide derivatives are known in the art (see, eg, Junghans et al., In Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2nd Ed., Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) and US 4,681,581, US 4,735,210, US 5,101,827, US 5,102,990 (US RE 35,500), US 5,648,471 and US 5,697,902). For example, radioisotopes can be conjugated by the chloramine-T method.
1つの態様において、本発明の変異体は、放射性同位体または放射性同位体を含有するキレートにコンジュゲートされる。例えば、変異体を、抗体を放射性同位体と錯体化することを可能にするキレート剤リンカー、例えば、DOTA、DTPAまたはチウキセタンとコンジュゲートさせてもよい。変異体はさらに、または代替的に、1つまたは複数の放射標識アミノ酸または他の放射標識分子を含むか、またはそれらとコンジュゲートされてもよい。放射標識された変異体は、診断目的および治療目的の両方に用いることができる。1つの態様において、本発明の変異体は、α放射体とコンジュゲートされる。放射性同位体の非限定的な例には、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、125I、111In、131I、186Re、213Bs、225Acおよび227Thが含まれる。 In one embodiment, the variants of the invention are conjugated to a radioisotope or a chelate containing a radioisotope. For example, the variant may be conjugated with a chelator linker that allows the antibody to be complexed with a radioisotope, such as DOTA, DTPA or thixetane. Variants may additionally or alternatively include or be conjugated with one or more radiolabeled amino acids or other radiolabeled molecules. Radiolabeled variants can be used for both diagnostic and therapeutic purposes. In one embodiment, the variants of the invention are conjugated with an alpha emitter. Non-limiting examples of radioisotopes include 3 H, 14 C, 15 N, 35 S, 90 Y, 99 Tc, 125 I, 111 In, 131 I, 186 Re, 213 Bs, 225 Ac and 227 Th Is included.
1つの態様において、本発明の変異体は、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、IL-24、IL-27、IL-28a、IL-28b、IL-29、KGF、IFNα、IFNβ、IFNγ、GM-CSF、CD40L、Flt3リガンド、幹細胞因子、アンセスチムおよびTNFαからなる群より選択されるサイトカインとコンジュゲートさせることができる。 In one embodiment, the variants of the invention are IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL- Select from the group consisting of 23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα, IFNβ, IFNγ, GM-CSF, CD40L, Flt3 ligand, stem cell factor, ancestim and TNFα Can be conjugated to the cytokine.
また、本発明の変異体を、例えばそれらの血中半減期を延ばすために、ポリマーとの共有コンジュゲートによって化学的に修飾することもできる。例示的なポリマーおよびそれらをペプチドに結びつけるための方法は、例えば、US 4,766,106号、US 4,179,337号、US 4,495,285号およびUS 4,609,546号に説明されている。そのほかのポリマーには、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（PEG）（例えば、約1,000〜約40,000、例えば約2,000〜約20,000などの分子量を有するPEG）が含まれる。 The variants of the invention can also be chemically modified by covalent conjugates with polymers, for example, to increase their blood half-life. Exemplary polymers and methods for linking them to peptides are described, for example, in US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 and US 4,609,546. Other polymers include polyoxyethylated polyols and polyethylene glycol (PEG) (eg, PEG having a molecular weight of about 1,000 to about 40,000, such as about 2,000 to about 20,000).
Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981)およびNygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982)によって記載された方法を含む当技術分野において公知の任意の方法を使用して、本発明の変異体を上記のものなどのコンジュゲートされる分子とコンジュゲートさせることができる。そのような変異体は、もう一方の部分を、変異体またはその断片（例えば、抗体H鎖またはL鎖）のN末端側またはC末端側に対して化学的にコンジュゲートさせることによって作製することができる（例えば、Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)を参照）。また、そのようなコンジュゲートされた変異体誘導体を、適宜、内部の残基または糖でのコンジュゲートによって作製することもできる。 Hunter et al., Nature 144 , 945 (1962), David et al., Biochemistry 13 , 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40 , 219 (1981) and Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30 , 407 (1982) are used to conjugate the variants of the present invention to conjugated molecules such as those described above using any method known in the art. be able to. Such variants are made by chemically conjugating the other part to the N-terminus or C-terminus of the variant or fragment thereof (eg, antibody H chain or L chain). (See, for example, Antibody Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)). Such conjugated mutant derivatives can also be made by conjugation with internal residues or sugars as appropriate.
これらの薬剤は、本発明の変異体と直接的または間接的にカップリングさせることができる。第2の薬剤の間接的カップリングの一例は、二重特異性抗体におけるシステイン残基またはリジン残基に対する、スペーサー部分またはリンカー部分を介したカップリングである。1つの態様において、変異体は、インビボで活性化されて治療用薬物になることができるプロドラッグ分子と、スペーサーまたはリンカーを介してコンジュゲートされる。いくつかの態様において、リンカーは細胞内条件下で切断可能になり、その結果、リンカーの切断によって細胞内環境で抗体から薬物単位が放出される。いくつかの態様において、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラの内部）に存在する切断性物質によって切断可能である。例えば、スペーサーまたはリンカーは、腫瘍細胞に付随する酵素または他の腫瘍特異的条件によって切断可能になることができ、それにより、活性薬物が形成される。そのようなプロドラッグ技術およびリンカーの例は、Syntarga BV, et al.によるWO02083180号、WO 2004043493号、WO2007018431号、WO2007089149号、WO2009017394号およびWO201062171号に記載されている。また、適した抗体-プロドラッグ技術およびデュオカルマイシン類似体については、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,989,452（Medarex）号にも記載がある。リンカーはさらに、または代替的に、例えば、リソソーム性またはエンドソーム性プロテアーゼを非限定的に含む細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであってもよい。いくつかの態様において、ペプチジルリンカーは、少なくとも2アミノ酸長または少なくとも3アミノ酸長である。切断性物質にはカテプシンBおよびDならびにプラスミンが含まれ、これらはすべて、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して、標的細胞内での活性薬物の放出をもたらすことが知られている（例えば、Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123を参照）。1つの具体的な態様において、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、Val-Cit（バリン-シトルリン）リンカーまたはPhe-Lys（フェニルアラニン-リジン）リンカーである（例えば、Val-Citリンカーによるドキソルビシンの合成、およびPhe-Lysリンカーの種々の例を記載しているUS6214345号を参照）。Val-CitリンカーおよびPhe-Lysリンカーの構造の例には、下記のMC-vc-PAB、MC-vc-GABA、MC-Phe-Lys-PABまたはMC-Phe-Lys-GABAが非限定的に含まれ、ここでMCはマレイミドカプロイルの略号であり、vcはVal-Citの略号であり、PABはp-アミノベンジルカルバメートの略号であり、GABAはγ-アミノ酪酸の略号である。治療薬の細胞内タンパク質分解放出を用いることの1つの利点は、薬剤はコンジュゲートされると典型的には弱毒化されること、およびコンジュゲートの血清中安定性が典型的には高いことである。 These agents can be coupled directly or indirectly to the variants of the invention. An example of indirect coupling of a second agent is coupling through a spacer or linker moiety to a cysteine or lysine residue in a bispecific antibody. In one embodiment, the variant is conjugated via a spacer or linker with a prodrug molecule that can be activated in vivo to become a therapeutic drug. In some embodiments, the linker becomes cleavable under intracellular conditions such that cleavage of the linker releases the drug unit from the antibody in the intracellular environment. In some embodiments, the linker is cleavable by a cleavable substance present in the intracellular environment (eg, inside a lysosome or endosome or caveolae). For example, a spacer or linker can be cleavable by enzymes associated with tumor cells or other tumor-specific conditions, thereby forming an active drug. Examples of such prodrug techniques and linkers are described by Syntarga BV, et al. In WO02083180, WO 2004043493, WO2007018431, WO2007089149, WO2009017394 and WO201062171. Suitable antibody-prodrug technology and duocarmycin analogs are also described in US Pat. No. 6,989,452 (Medarex), incorporated herein by reference. The linker may additionally or alternatively be a peptidyl linker that is cleaved by an intracellular peptidase or protease enzyme including, for example, but not limited to lysosomal or endosomal proteases. In some embodiments, the peptidyl linker is at least 2 amino acids long or at least 3 amino acids long. Cleavage substances include cathepsins B and D and plasmin, all of which are known to hydrolyze dipeptide drug derivatives resulting in the release of active drugs in target cells (eg, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123). In one specific embodiment, the peptidyl linker cleavable by an intracellular protease is a Val-Cit (valine-citrulline) linker or a Phe-Lys (phenylalanine-lysine) linker (eg, of doxorubicin with a Val-Cit linker). See US6214345 which describes synthesis and various examples of Phe-Lys linkers). Examples of structures of Val-Cit linker and Phe-Lys linker include, but are not limited to, MC-vc-PAB, MC-vc-GABA, MC-Phe-Lys-PAB or MC-Phe-Lys-GABA described below. Where MC is an abbreviation for maleimidocaproyl, vc is an abbreviation for Val-Cit, PAB is an abbreviation for p-aminobenzylcarbamate, and GABA is an abbreviation for γ-aminobutyric acid. One advantage of using intracellular proteolytic release of a therapeutic agent is that the drug is typically attenuated when conjugated and the serum stability of the conjugate is typically high. is there.
さらに別の態様において、リンカー単位は切断不能であり、薬物は抗体分解によって放出される（US 2005/0238649号を参照）。典型的には、そのようなリンカーは細胞外環境に対して実質的に感受性ではない。本明細書で用いる場合、リンカーの文脈における「細胞外環境に対して実質的に感受性ではない」とは、変異型抗体薬物コンジュゲート合物が細胞外環境内（例えば、血漿中）に存在する場合に、変異型抗体薬物コンジュゲート合物の試料中のリンカーの20％以下、典型的には約15％以下、より典型的には約10％以下、さらにより典型的には約5％以下、約3％以下または約1％以下しか切断されないことを意味する。リンカーが細胞外環境に対して実質的に感受性でないか否かは、例えば、変異型抗体薬物コンジュゲート合物を血漿とともに所定の期間（例えば、2、4、8、16または24時間）にわたってインキュベートし、続いて血漿中に存在する遊離薬物の量を定量することによって決定することができる。MMAEまたはMMAFとさまざまなリンカー成分とを含む例示的な態様は、以下の構造を有する（ここでAbは抗体を意味し、薬物負荷（または抗体分子1つ当たりの細胞***阻害薬または細胞傷害性薬物の平均数）を表すpは1〜約8であり、例えば、pは4〜6、例えば3〜5などであってもよく、またはpは1、2、3、4、5、6、7もしくは8であってもよい）。 In yet another embodiment, the linker unit is non-cleavable and the drug is released by antibody degradation (see US 2005/0238649). Typically, such linkers are not substantially sensitive to the extracellular environment. As used herein, “not substantially sensitive to the extracellular environment” in the context of a linker means that the variant antibody drug conjugate conjugate is present in the extracellular environment (eg, in plasma). In some cases, 20% or less, typically about 15% or less, more typically about 10% or less, even more typically about 5% or less of the linker in a sample of a variant antibody drug conjugate mixture. Means that only about 3% or less or about 1% or less is cut. Whether the linker is substantially insensitive to the extracellular environment can be determined, for example, by incubating the mutant antibody drug conjugate conjugate with plasma for a predetermined period of time (eg, 2, 4, 8, 16 or 24 hours). And subsequently can be determined by quantifying the amount of free drug present in the plasma. An exemplary embodiment comprising MMAE or MMAF and various linker components has the following structure (where Ab means antibody, drug load (or cell division inhibitor or cytotoxicity per antibody molecule) P representing the average number of drugs) is from 1 to about 8, for example, p may be 4-6, such as 3-5, or p is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8).
切断可能なリンカーをアウリスタチンと組み合わせる例には、MC-vc-PAB-MMAF（vcMMAFとも表記）およびMC-vc-PAB-MMAF（vcMMAEとも表記）が含まれ、ここでMCはマレイミドカプロイルの略号であり、vcはVal-Cit（バリン-シトルリン）を基にしたリンカーの略号であり、PABはp-アミノベンジルカルバメートの略号である。 Examples of combining cleavable linkers with auristatin include MC-vc-PAB-MMAF (also referred to as vcMMAF) and MC-vc-PAB-MMAF (also referred to as vcMMAE), where MC is maleimidocaproyl Abbreviation, vc is an abbreviation for a linker based on Val-Cit (valine-citrulline), and PAB is an abbreviation for p-aminobenzylcarbamate.
他の例にはアウリスタチンと非切断性リンカーとの組み合わせ、例えばmcMMAFなどが含まれる（mc（この文脈ではMCはmcと同じである）はマレイミドカプロイルの略号である）。 Other examples include combinations of auristatin and non-cleavable linkers, such as mcMMAF (where mc (MC is the same as mc in this context) is an abbreviation for maleimidocaproyl).
1つの態様において、薬物リンカー部分はvcMMAEである。vcMMAE薬物リンカー部分およびコンジュゲートの方法は、WO2004010957号、US7659241号、US7829531号、US7851437号およびUS 11/833,028号（Seattle Genetics, Inc.）（それらは参照により本明細書に組み入れられる）に開示されており、vcMMAE薬物リンカー部分は、それらの中に開示されているものと類似の方法を用いて、システインの箇所で抗体と結合される。 In one embodiment, the drug linker moiety is vcMMAE. vcMMAE drug linker moieties and methods of conjugation are disclosed in WO2004010957, US7659241, US7829531, US7851437 and US11 / 833,028 (Seattle Genetics, Inc.), which are incorporated herein by reference. The vcMMAE drug linker moiety is attached to the antibody at the cysteine site using methods similar to those disclosed therein.
1つの態様において、薬物リンカー部分はmcMMAFである。mcMMAF薬物リンカー部分およびコンジュゲートの方法は、US7498298号、US 11/833,954号およびWO2005081711号（Seattle Genetics, Inc.）（それらは参照により本明細書に組み入れられる）に開示されており、mcMMAF薬物リンカー部分は、それらの中に開示されているものと類似の方法を用いて、システインの箇所で変異体と結合される。 In one embodiment, the drug linker moiety is mcMMAF. mcMMAF drug linker moieties and methods of conjugation are disclosed in US7498298, US 11 / 833,954 and WO2005081711 (Seattle Genetics, Inc.), which are incorporated herein by reference, and include mcMMAF drug linkers The moieties are attached to the variant at the cysteine using methods similar to those disclosed therein.
1つの態様において、本発明の変異体は、二重特異性抗体を放射性同位体に対してコンジュゲートさせることを可能にするキレート剤リンカー、例えばチウキセタンと結びつけられる。 In one embodiment, the variants of the invention are coupled with a chelator linker, such as thixetane, that allows the bispecific antibody to be conjugated to a radioisotope.
1つの態様において、変異体の各アーム（またはFabアーム）は、同じ1つまたは複数の治療用部分に対して直接的または間接的にカップリングされる。 In one embodiment, each arm (or Fab arm) of the variant is coupled directly or indirectly to the same one or more therapeutic moieties.
1つの態様においては、変異体の1つのアームのみが、1つまたは複数の治療用部分に対して直接的または間接的にカップリングされる。 In one embodiment, only one arm of the variant is coupled directly or indirectly to one or more therapeutic moieties.
1つの態様において、変異体の各アームは、複数の異なる治療用部分に対して直接的または間接的にカップリングされる。例えば、本明細書に記載されたように、変異体が二重特異性抗体であって、2つの異なる単一特異性抗体、例えば第1および第2の抗体の制御されたFabアーム交換によって調製される態様において、そのような二重特異性抗体は、異なる治療用部分とコンジュゲートまたは会合している単一特異性抗体を用いることによって得ることができる。 In one embodiment, each arm of the variant is coupled directly or indirectly to a plurality of different therapeutic moieties. For example, as described herein, the variant is a bispecific antibody, prepared by controlled Fab arm exchange of two different monospecific antibodies, e.g., first and second antibodies In certain embodiments, such bispecific antibodies can be obtained by using monospecific antibodies that are conjugated or associated with different therapeutic moieties.
さらなる使用
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む他の親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドに関する態様としても解釈されるべきであることが理解されるべきである。
Further uses All embodiments described herein with reference to a parent antibody, a first parent antibody or a second parent antibody include other parent polypeptides comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, It should be understood that this should also be interpreted as an embodiment relating to one parent polypeptide or a second parent polypeptide.
1つのさらなる局面において、本発明は、医薬品として用いるため、特に、標的細胞（例えば、腫瘍細胞、細菌細胞もしくは真菌細胞）もしくは標的生物（例えば、ウイルス）または細菌もしくはウイルスに感染した細胞のCDC媒介性致死が望まれる疾患または障害の治療用の医薬品として用いるための、本明細書に記載されたような本発明の変異体に関する。そのような疾患および障害の例には、癌および細菌感染症、ウイルス感染症または真菌感染症が非限定的に含まれる。 In one further aspect, the present invention is for use as a medicament, in particular CDC-mediated of target cells (eg tumor cells, bacterial cells or fungal cells) or target organisms (eg viruses) or cells infected with bacteria or viruses. It relates to a variant of the invention as described herein for use as a medicament for the treatment of a disease or disorder in which sexual lethality is desired. Examples of such diseases and disorders include, but are not limited to, cancer and bacterial infections, viral infections or fungal infections.
別の局面において、本発明は、癌などの疾患の治療のための、本明細書に記載された変異体、二重特異性抗体、組成物およびキット・オブ・パーツに関する。 In another aspect, the invention relates to variants, bispecific antibodies, compositions and kits of parts described herein for the treatment of diseases such as cancer.
別の局面において、本発明は、本明細書に記載された変異体、組成物またはキット・オブ・パーツの投与を含む、ヒトの治療のための方法に関する。 In another aspect, the invention relates to a method for the treatment of humans comprising the administration of the variants, compositions or kits of parts described herein.
別の局面において、本発明は、変異体、組成物またはキット・オブ・パーツの投与を含む、ヒトにおける癌の治療のための方法に関する。 In another aspect, the invention relates to a method for the treatment of cancer in humans comprising the administration of a variant, composition or kit of parts.
「治療」とは、症状または疾患状態を緩和する、改善する、抑止する、または根絶する（治癒させる）目的で、本発明の治療活性のある化合物の有効量を投与することを指す。 “Treatment” refers to the administration of an effective amount of a therapeutically active compound of the present invention for the purpose of alleviating, ameliorating, suppressing, or eradicating (curing) symptoms or disease states.
「有効量」または「治療的有効量」とは、必要な投与量および期間で、所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。抗体の治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに抗体が個体において所望の応答を誘発する能力などの要因に応じて異なりうる。治療的有効量はまた、抗体または抗体部分の毒性作用または有害作用よりも治療的に有益な効果が上回る量でもある。 “Effective amount” or “therapeutically effective amount” refers to an amount effective to achieve the desired therapeutic result at the required dosage and duration. A therapeutically effective amount of the antibody can vary depending on factors such as the disease state, age, sex and weight of the individual, and the ability of the antibody to elicit a desired response in the individual. A therapeutically effective amount is also an amount that provides a therapeutically beneficial effect over the toxic or adverse effects of the antibody or antibody portion.
別の局面において、本発明は、診断方法に用いるための、本明細書に記載された態様の任意のものによる変異体、組成物またはキット・オブ・パーツの使用に関する。 In another aspect, the invention relates to the use of a variant, composition or kit of parts according to any of the embodiments described herein for use in a diagnostic method.
別の局面において、本発明は、本明細書に記載された態様の任意のものによる変異体、組成物またはキット・オブ・パーツを、ヒトまたは他の哺乳動物の身体の少なくとも一部に対して投与する段階を含む、診断方法に関する。 In another aspect, the present invention provides a variant, composition or kit of parts according to any of the embodiments described herein to at least a part of a human or other mammalian body. It relates to a diagnostic method comprising the step of administering.
別の局面において、本発明は、ヒトまたは他の哺乳動物の身体の少なくとも一部の画像化における、本明細書に記載された態様の任意のものによる変異体、組成物またはキット・オブ・パーツの使用に関する。 In another aspect, the present invention provides a variant, composition or kit of parts according to any of the embodiments described herein in the imaging of at least a part of a human or other mammalian body. About the use of.
別の局面において、本発明は、本明細書に記載された態様の任意のものによる変異体、組成物またはキット・オブ・パーツを投与する段階を含む、ヒトまたは他の哺乳動物の身体の少なくとも一部を画像化するための方法に関する。 In another aspect, the present invention relates to at least a human or other mammalian body comprising administering a variant, composition or kit of parts according to any of the embodiments described herein. It relates to a method for imaging a part.
理論に拘束されるわけではないが、治療活性のある化合物の有効量は、本発明の任意の「単一変異体」局面または態様をそのような治療活性のある化合物に導入した場合に、減少する可能性がある。 Without being bound by theory, an effective amount of a therapeutically active compound decreases when any “single variant” aspect or embodiment of the invention is introduced into such therapeutically active compound. there's a possibility that.
癌抗体に対する適した抗原は、本明細書に記載されたものと同じであってもよい。実施例15〜18は、腫瘍細胞の増強されかつ／またはより特異的な補体活性化またはCDCをもたらすための具体的な適用を記載している。例えば、E345R変異などを含む「単一変異体」局面の抗腫瘍抗体は、腫瘍細胞の増強されたCDCまたはADCC、ADCP応答をもたらすことができる。さらに、この方法の変異体において、「単一変異体」局面の変異、例えば、E345R、E430、もしくはS440S/Wまたは表1に列記されたような任意の他の変異を、各抗体に追加して、それにより、少なくとも2つの抗原を発現する腫瘍細胞を特異的に対象とする増強されたCDCおよび／またはADCC応答を与えることもできる。 Suitable antigens for cancer antibodies may be the same as those described herein. Examples 15-18 describe specific applications for producing enhanced and / or more specific complement activation or CDC of tumor cells. For example, anti-tumor antibodies of the “single variant” aspect, including E345R mutations, can result in enhanced CDC or ADCC, ADCP responses of tumor cells. In addition, in variants of this method, mutations of the “single variant” aspect, such as E345R, E430, or S440S / W or any other mutation as listed in Table 1, are added to each antibody. Thus, it may also provide an enhanced CDC and / or ADCC response specifically directed to tumor cells that express at least two antigens.
細菌感染症に対する適した抗体には、黄色ブドウ球菌を標的とするもの、例えば、ブドウ球菌の細胞壁に埋め込まれているリポテイコ酸（LTA）を標的とし、かつ、いずれもその全体が参照により組み入れられるBaker（Nat Biotechnol. 2006 Dec; 24(12): 1491-3)およびWeisman et al. （Int Immunopharmacol. 2009 May;9(5): 639-44）に記載されている、キメラ性モノクローナルIgG1パギバキシマブ（BSYX-A110；Biosynexus）などが非限定的に含まれる。実施例14は、E345R変異を含む黄色ブドウ球菌抗体変異体を用いる具体的な態様を開示している。しかし、E430GおよびS440Wを非限定的に含む、表1における他の変異を、細菌抗原に対する抗体のCDC媒介能力を増強するために、類似の様式で適用することもできる。 Suitable antibodies against bacterial infections target S. aureus, for example lipoteichoic acid (LTA) embedded in the cell wall of staphylococci, both of which are incorporated by reference in their entirety Chimeric monoclonal IgG1 pagibaximab described in Baker (Nat Biotechnol. 2006 Dec; 24 (12): 1491-3) and Weisman et al. (Int Immunopharmacol. 2009 May; 9 (5): 639-44) BSYX-A110; Biosynexus) and the like. Example 14 discloses a specific embodiment using S. aureus antibody mutants containing the E345R mutation. However, other mutations in Table 1, including but not limited to E430G and S440W, can also be applied in a similar manner to enhance the CDC-mediated ability of antibodies to bacterial antigens.
ウイルス感染症または真菌感染症に対する適した抗原は、本明細書に記載された任意のものであってもよい。 Suitable antigens for viral or fungal infections may be any of those described herein.
1つの態様において、変異体が結合する抗原はヒトEphA2ではない。別の態様において、変異体はヒトEphA2 mAb 12G3H11（Dall'Acqua et al., 前記に記載、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に由来しない。別の態様において、変異体が結合する抗原はIL-9ではない。別の態様において、変異体は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO2007005612号に記載されたFa-hG1抗体にもFa-hG4抗体にも、またはそれらのいかなる変異体にも由来しない。1つの態様において、変異体が結合する抗原はHIV-1 gp120ではない。別の態様において、変異体は、gp120を対象とするb12ヒトIgG1κ抗体に由来しない。 In one embodiment, the antigen to which the variant binds is not human EphA2. In another embodiment, the variant is not derived from human EphA2 mAb 12G3H11 (described in Dall'Acqua et al., Supra, which is hereby incorporated by reference in its entirety). In another embodiment, the antigen to which the variant binds is not IL-9. In another embodiment, the variant is not derived from the Fa-hG1 antibody or Fa-hG4 antibody or any variant thereof described in WO2007005612, which is incorporated herein by reference in its entirety. In one embodiment, the antigen to which the variant binds is not HIV-1 gp120. In another embodiment, the variant is not derived from a b12 human IgG1κ antibody directed against gp120.
1つの特定の態様において、変異体は二重特異性親抗体に由来する。二重特異性抗体は、例えばIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4といった任意のアイソタイプのものであってもよく、完全長抗体であってもそのFc含有断片であってもよい。二重特異性抗体を調製するための例示的な方法は、WO 2008/119353号（Genmab）に記載されている。 In one particular embodiment, the variant is derived from a bispecific parent antibody. The bispecific antibody may be of any isotype, for example IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, and may be a full-length antibody or an Fc-containing fragment thereof. An exemplary method for preparing bispecific antibodies is described in WO 2008/119353 (Genmab).
投与量
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む他の親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドにも適用可能であり得ることが理解されるべきである。抗体の有効投与量および投与レジメンは、治療しようとする疾患または病状に依存し、それは当業者によって決定されうる。本発明の抗体の治療的有効量の例示的で非限定的な範囲は、約0.1〜100mg／kg、例えば約0.1〜50mg／kg、例えば約0.1〜20mg／kg、例えば約0.1〜10mg／kg、例えば約0.5mg／kg、例えば約0.3、約1、約3、約5または約8mg／kgである。
All embodiments described herein with reference to a dose parent antibody, first parent antibody or second parent antibody include other parent polypeptides comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, It should be understood that it may also be applicable to one parent polypeptide or a second parent polypeptide. The effective dose and dosage regimen of an antibody depends on the disease or condition to be treated and can be determined by one skilled in the art. An exemplary, non-limiting range for a therapeutically effective amount of an antibody of the invention is about 0.1-100 mg / kg, such as about 0.1-50 mg / kg, such as about 0.1-20 mg / kg, such as about 0.1-10 mg / kg. For example about 0.5 mg / kg, for example about 0.3, about 1, about 3, about 5 or about 8 mg / kg.
また、本発明の抗体変異体を、変異体の治療活性を増強するため、および／または補体消費を補うために、1つまたは複数の補体因子または関連成分と組み合わせて投与することもできる。そのような補体因子および関連成分には、C1q、C4、C2、C3、C5、C6、C7、C8、C9、MBLおよびB因子が非限定的に含まれる。併用投与は、同時、別個または逐次的であってもよい。1つの特定の態様において、本発明は、本発明の変異体を含む薬学的組成物、および同じまたは異なる薬学的組成物中にある少なくとも1つの補体因子または関連成分を使用説明書とともに含むキットを提供する。 The antibody variants of the invention can also be administered in combination with one or more complement factors or related components to enhance the therapeutic activity of the variant and / or to supplement complement consumption. . Such complement factors and related components include, but are not limited to, C1q, C4, C2, C3, C5, C6, C7, C8, C9, MBL and factor B. Co-administration may be simultaneous, separate or sequential. In one particular embodiment, the invention comprises a pharmaceutical composition comprising a variant of the invention and at least one complement factor or related component in the same or different pharmaceutical composition together with instructions for use. I will provide a.
また、本発明の抗体変異体を、併用療法において、すなわち、治療しようとする疾患または病状に対して妥当な他の治療薬と組み合わせて投与することもできる。したがって、1つの態様において、抗体含有医薬品は、細胞傷害剤、化学療法薬または血管新生阻害剤といった1つまたは複数のさらなる治療薬と併用するためのものである。そのような併用投与は同時、別個または逐次的であってもよい。 The antibody variants of the invention can also be administered in combination therapy, ie in combination with other therapeutic agents appropriate for the disease or condition being treated. Accordingly, in one embodiment, the antibody-containing medicament is for use in combination with one or more additional therapeutic agents such as cytotoxic agents, chemotherapeutic agents or angiogenesis inhibitors. Such combined administration may be simultaneous, separate or sequential.
1つのさらなる態様において、本発明は、癌などの疾患を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に対して、放射線療法および／または外科手術と組み合わせて、本発明の変異体または薬学的組成物の治療的有効量を投与することを含む方法を提供する。 In one further embodiment, the present invention is a method for treating or preventing a disease, such as cancer, for a subject in need thereof in combination with radiation therapy and / or surgery. There is provided a method comprising administering a therapeutically effective amount of a variant or pharmaceutical composition.
調製方法
親抗体、第1の親抗体または第2の親抗体に言及して本明細書において記載されたすべての態様は、免疫グロブリンのFcドメインと結合領域とを含む他の親ポリペプチド、第1の親ポリペプチドまたは第2の親ポリペプチドにも適用可能であり得ることが理解されるべきである。
Methods of PreparationAll embodiments described herein with reference to a parent antibody, a first parent antibody or a second parent antibody include other parent polypeptides comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, It should be understood that it may also be applicable to one parent polypeptide or a second parent polypeptide.
本発明はまた、上記の諸局面のいずれか1つによる変異体をコードする単離された核酸およびベクター、ならびに変異体をコードするベクターおよび発現系も提供する。抗体およびその変異体に対する適した核酸構築物、ベクターおよび発現系は当技術分野において公知であり、実施例に記載されている。変異体が重鎖（またはそのFc含有断片）だけでなく軽鎖も含む態様において、重鎖部分および軽鎖部分をコードするヌクレオチド配列は、同じまたは異なる核酸上またはベクター上に存在しうる。 The present invention also provides isolated nucleic acids and vectors encoding variants according to any one of the above aspects, and vectors and expression systems encoding variants. Suitable nucleic acid constructs, vectors and expression systems for antibodies and variants thereof are known in the art and are described in the examples. In embodiments where the variant includes not only the heavy chain (or Fc-containing fragment thereof) but also the light chain, the nucleotide sequence encoding the heavy chain portion and the light chain portion can be on the same or different nucleic acids or vectors.
本発明はまた、宿主細胞において、上記の諸局面のいずれか1つによる抗体変異体を産生させるための方法であって、該変異体が重鎖の少なくともFc領域を含み、該方法が以下の段階を含む方法を提供する：
a）該変異体の該Fc領域をコードするヌクレオチド構築物を用意する段階、
b）該ヌクレオチド構築物を宿主細胞において発現させる段階、および
c）該宿主細胞の細胞培養物から該抗体変異体を回収する段階。
The present invention also provides a method for producing an antibody variant according to any one of the above aspects in a host cell, wherein the variant comprises at least the Fc region of a heavy chain, wherein the method comprises the following: Provide a method that includes steps:
a) providing a nucleotide construct encoding the Fc region of the variant;
b) expressing the nucleotide construct in a host cell; and
c) recovering the antibody variant from the cell culture of the host cell.
いくつかの態様において、抗体は重鎖抗体である。しかし、ほとんどの態様において、抗体は軽鎖も含有すると考えられ、それ故に、前記宿主細胞は、同一のベクター上または異なるベクター上のいずれかに、軽鎖をコードする構築物もさらに発現する。 In some embodiments, the antibody is a heavy chain antibody. However, in most embodiments, the antibody will also contain a light chain, and thus the host cell will also express a construct encoding the light chain, either on the same vector or on a different vector.
抗体の組換え発現のために適した宿主細胞は当技術分野において周知であり、これにはCHO細胞、HEK-293細胞、PER-C6細胞、NS／0細胞およびSp2／0細胞が含まれる。1つの態様において、前記宿主細胞は、タンパク質のAsn結合型グリコシル化を行いうる細胞、例えば真核細胞、例えばヒト細胞などの哺乳動物細胞である。1つのさらなる態様において、前記宿主細胞は、ヒト様またはヒト性のグリコシル化を有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された非ヒト細胞である。そのような細胞の例には、遺伝的に改変されたピキア・パストリス（Pichia pastoris）（Hamilton et al., Science 301 (2003) 1244-1246；Potgieter et al., J. Biotechnology 139 (2009) 318-325）および遺伝的に改変されたコウキクサ（Lemna minor）（Cox et al., Nature Biotechnology 12 (2006) 1591-1597）がある。 Suitable host cells for recombinant expression of the antibody are well known in the art and include CHO cells, HEK-293 cells, PER-C6 cells, NS / 0 cells and Sp2 / 0 cells. In one embodiment, the host cell is a cell capable of performing Asn-linked glycosylation of a protein, eg, a mammalian cell such as a eukaryotic cell, eg, a human cell. In one further embodiment, the host cell is a non-human cell that has been genetically engineered to produce a glycoprotein with human-like or human glycosylation. Examples of such cells include genetically modified Pichia pastoris (Hamilton et al., Science 301 (2003) 1244-1246; Potgieter et al., J. Biotechnology 139 (2009) 318 -325) and genetically modified Lemna minor (Cox et al., Nature Biotechnology 12 (2006) 1591-1597).
1つの態様において、前記宿主細胞は、抗体重鎖からC末端リジンK447残基を効率的に除去することができない宿主細胞である。例えば、Liu et al. (2008) J Pharm Sci 97: 2426（参照により本明細書に組み入れられる）における表2は、C末端リジンの部分的除去しか得られない、いくつかのそのような抗体産生系、例えば、Sp2／0、NS／0またはトランスジェニック乳腺（ヤギ）を列記している。1つの態様において、宿主細胞は、グリコシル化機構が改変された宿主細胞である。そのような細胞は当技術分野において記載されており、本発明の変異体を発現させて、それにより、グリコシル化が改変された抗体を産生させるための宿主細胞として用いることができる。例えば、Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740；Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-1、ならびにEP1176195号；WO03/035835号；およびWO99/54342号を参照されたい。操作されたグリコフォームを作製するためのそのほかの方法も当技術分野において公知であり、Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74: 288-294；Shields et al, 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740；Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473）、US6602684号、WO00/61739A1号；WO01/292246A1号；WO02/311140A1号；WO 02/30954A1号；Potelligent（商標）技術（Biowa, Inc. Princeton, N.J.）；GlycoMAb（商標）グリコシル化操作技術（GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland）；US 20030115614号；Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49に記載されたものが非限定的に含まれる。 In one embodiment, the host cell is a host cell that cannot efficiently remove the C-terminal lysine K447 residue from the antibody heavy chain. For example, Table 2 in Liu et al. (2008) J Pharm Sci 97: 2426 (incorporated herein by reference) shows the production of several such antibodies that only result in partial removal of the C-terminal lysine. Lines such as Sp2 / 0, NS / 0 or transgenic mammary glands (goats) are listed. In one embodiment, the host cell is a host cell with altered glycosylation machinery. Such cells have been described in the art and can be used as host cells to express the variants of the invention and thereby produce antibodies with altered glycosylation. For example, Shields, RL et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-1, and EP 1176195; WO03 / 035835; See WO99 / 54342. Other methods for making engineered glycoforms are also known in the art and are described in Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277: 26733- Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473), US6602684, WO00 / 61739A1; WO01 / 292246A1; WO02 / 311140A1; WO02 / 30954A1; Potelligent ™ technology (Biowa , Inc. Princeton, NJ); GlycoMAb ™ glycosylation engineering (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland); US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49 Included without limitation.
本発明はまた、上記の本発明の方法によって得られた、または得ることのできる抗体にも関する。 The present invention also relates to an antibody obtained or obtainable by the method of the present invention described above.
1つのさらなる局面において、本発明は、本発明の抗体変異体を産生しうる宿主細胞に関する。1つの態様において、宿主細胞は、本発明のヌクレオチド構築物による形質転換またはトランスフェクションを受けている。 In one further aspect, the present invention relates to a host cell capable of producing the antibody variant of the present invention. In one embodiment, the host cell has been transformed or transfected with a nucleotide construct of the invention.
本発明を以下の実施例によってさらに例示するが、それらはさらに限定するものとは解釈されるべきではない。 The invention is further illustrated by the following examples, which should not be construed as further limiting.
実施例1
７Ｄ８変異体の設計および作製
ヒトモノクローナル抗体HuMab-7D8（WO 2004/035607号に記載）をモデル抗体として用いた。これは、オファツムマブ（HuMax-CD20、2F2）を含むヒト抗CD20 IgG1抗体の一群に属する。これらの抗体はCD20分子上の独特な膜近位エピトープを標的とし、強いCDCを示す。
Example 1
Design and production of 7D8 mutant Human monoclonal antibody HuMab-7D8 (described in WO 2004/035607) was used as a model antibody. It belongs to a group of human anti-CD20 IgG1 antibodies including ofatumumab (HuMax-CD20, 2F2). These antibodies target a unique membrane proximal epitope on the CD20 molecule and exhibit strong CDC.
補体活性化およびCDCにおけるオリゴマーFc-Fc相互作用の機能的関連性について検討するために、7D8のFc-Fcサイドオン型（side-on）相互作用およびCDC活性を損なわせることを目指して、Fc：Fc境界面にある疎水性パッチ内のアミノ酸を変異させた。第1のセットの変異体（表3）では、1HZH結晶構造に基づいて選ばれた、CH2-CH3ドメインで疎水性パッチ内に露出していることが記載されている位置で電荷を変化させるために、変異を導入した（Burton Mol Immunol 1985 Mar；22(3): 161-206)）。 To investigate the functional relevance of complement activation and oligomeric Fc-Fc interactions in CDC, we aim to impair the Fc-Fc side-on interaction and CDC activity of 7D8. Fc: Amino acids in the hydrophobic patch at the Fc interface were mutated. In the first set of variants (Table 3), to change the charge at the position described in the CH2-CH3 domain exposed in the hydrophobic patch, selected based on the 1HZH crystal structure A mutation was introduced (Burton Mol Immunol 1985 Mar; 22 (3): 161-206)).
第1のセットの変異から、I253DおよびH433Aが、7D8によるCDCの喪失に対して最も強い効果を誘導することが見いだされた（例えば、実施例5）。1HZH結晶構造により、I253およびH433は、パートナー抗体の対向するFc位置における2つの異なるポケットと結合することが示されている。これらのデータに基づき、Fc：Fcサイドオン境界面にある残基のCDCに対する重要性をさらに調べるために、結晶構造におけるI253およびH433位置の周辺に第2のセットの変異を合成した。Fc：Fc境界面を不安定化し、その結果としてCDCを不安定化する見込みのあるI253およびH433位置の周辺にある第2のセットの変異を、表4に列記している。 From the first set of mutations, I253D and H433A were found to induce the strongest effect on CDC loss by 7D8 (eg, Example 5). The 1HZH crystal structure indicates that I253 and H433 bind to two different pockets at opposite Fc positions of the partner antibody. Based on these data, a second set of mutations was synthesized around the I253 and H433 positions in the crystal structure to further investigate the importance of residues at the Fc: Fc side-on interface to CDC. The second set of mutations around the I253 and H433 positions that are likely to destabilize the Fc: Fc interface and consequently destabilize the CDC are listed in Table 4.
C1qに対する直接結合部位の破壊が、CDCに対して観測された効果の原因であるという可能性を否定するために、CDCの喪失を示した2つの単一変異体を基にして二重変異体を作製し、それが単一変異体によるCDCの喪失を復旧させる能力について検討した。この原理を図1Dに模式的に表している。二重変異体は表5に列記されており、構造的表示は図4および図5に示されている。 Double mutants based on two single mutants that showed loss of CDC to negate the possibility that destruction of the direct binding site for C1q is responsible for the observed effects on CDC Were examined for their ability to restore loss of CDC by a single mutant. This principle is schematically shown in FIG. 1D. Double mutants are listed in Table 5 and structural representations are shown in FIGS. 4 and 5.
変異体は、Quikchange部位指定変異誘発キット（Stratagene, US）を用いて調製した。手短に述べると、所望の変異をコードする順方向および逆方向プライマーを用いて、IgG1m（f）アロタイプを有する7D8重鎖をコードする完全長プラスミドDNAテンプレートを複製した。その結果得られたDNA混合物を、ソースプラスミドDNAを取り除くためにDpnIで消化した上で、大腸菌の形質転換のために用いた。その結果得られたコロニーから単離した変異体のプラスミドDNAを、DNAシークエンシング（Agowa, Germany）によって検査した。抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードするプラスミドDNA混合物を、293fectin（Invitrogen, US）を本質的には製造元による記載の通りに用いて、Freestyle HEK293F細胞（Invitrogen, US）に一過性にトランスフェクトした。 Mutants were prepared using the Quikchange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, US). Briefly, a full-length plasmid DNA template encoding a 7D8 heavy chain with IgG1m (f) allotype was replicated using forward and reverse primers encoding the desired mutation. The resulting DNA mixture was digested with DpnI to remove the source plasmid DNA and used for transformation of E. coli. Mutant plasmid DNA isolated from the resulting colonies was examined by DNA sequencing (Agowa, Germany). A plasmid DNA mixture encoding both the heavy and light chains of the antibody is transiently transferred to Freestyle HEK293F cells (Invitrogen, US) using 293fectin (Invitrogen, US) essentially as described by the manufacturer. Transfected.
（表３）7D8のCH2-CH3ドメインに導入したセット1変異
(-)負荷電
(+)正荷電
(δ+)部分的正荷電
(Table 3)
(-) Negative load
(+) Positive charge
(δ +) partial positive charge
（表４）7D8のCH2-CH3ドメインに導入したセット2変異
(-)負荷電
(+)正荷電
(δ+)部分的正荷電
(Table 4)
(-) Negative load
(+) Positive charge
(δ +) partial positive charge
（表５）それぞれがCDCの喪失を示す2つの単一変異を組み合わせるために7D8のCH2-CH3ドメインに導入した二重変異
(-)負荷電
(+)正荷電
(Table 5) Double mutations introduced into the CH2-CH3 domain of 7D8 to combine two single mutations, each indicating loss of CDC
(-) Negative load
(+) Positive charge
実施例2
7D8変異体による細胞上でのCD20結合
精製した抗体試料のCD20陽性細胞に対する結合をFACS分析によって分析した。第1のセットの変異（表3）をDaudi細胞において試験し、第2のセットの変異（表4）はRaji細胞において試験した。ポリスチレン製96ウェル丸底プレート（Greiner bio-one 650101）中にて、105個の細胞を50μL中で、RPMI1640／0.1％ BSA中にある抗体調製物の系列希釈物（Daudiに対する第1のセットについては3倍希釈で0.04〜10μg／mLの範囲、Rajiに対する第2のセットについては3倍希釈で0.003〜10μg／mLの範囲）とともに4℃で30分間インキュベートした。RPMI1640／0.1％ BSAにて2回洗浄した後に、細胞を100μL中で、二次抗体とともに4℃で30分間インキュベートした。二次抗体としては、フルオロセインイソチオシアネート（FITC）結合ウサギ-抗ヒトIgG（F0056, Dako, Glostrup, Denmark；1／100）を、Daudi細胞に対するすべての実験、およびRaji細胞に対する7D8抗体による実験に用いた。Raji細胞に対する精製7D8抗体による実験については、R-フィコエリトリン（R-PE）結合ヤギF(ab')2抗ヒトκ軽鎖（2062-09、SouthernBiotech；1／500）を二次抗体として用いた。次に、細胞をPBS／0.1％ BSA／0.02％アジドにて2回洗浄し、100μLのPBS／0.1％ BSA／0.02％アジド中に再懸濁させた上で、FACS Cantoll（BD Biosciences）にて分析した。結合曲線を、GraphPad Prism V5.01ソフトウエア（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用いる非線形回帰（可変勾配によるシグモイド用量反応）を用いて解析した。
Example 2
CD20 binding on cells by 7D8 mutants Binding of purified antibody samples to CD20 positive cells was analyzed by FACS analysis. The first set of mutations (Table 3) was tested in Daudi cells, and the second set of mutations (Table 4) was tested in Raji cells. Serial dilutions of antibody preparations in RPMI 1640 / 0.1% BSA in 50 μL of 10 5 cells in polystyrene 96-well round bottom plates (Greiner bio-one 650101) (first set against Daudi Incubate for 30 minutes at 4 ° C. with a 3-fold dilution in the range of 0.04-10 μg / mL, and for the second set for Raji, a 3-fold dilution in the range of 0.003-10 μg / mL). After washing twice with RPMI 1640 / 0.1% BSA, the cells were incubated with secondary antibody in 100 μL at 4 ° C. for 30 minutes. Secondary antibodies include fluorescein isothiocyanate (FITC) -conjugated rabbit-anti-human IgG (F0056, Dako, Glostrup, Denmark; 1/100) for all experiments on Daudi cells and 7D8 antibody on Raji cells. Using. For experiments with purified 7D8 antibody against Raji cells, R-phycoerythrin (R-PE) -conjugated goat F (ab ') 2 anti-human kappa light chain (2062-09, SouthernBiotech; 1/500) was used as the secondary antibody . Next, the cells were washed twice with PBS / 0.1% BSA / 0.02% azide, resuspended in 100 μL PBS / 0.1% BSA / 0.02% azide, and then FACS Cantoll (BD Biosciences). analyzed. Binding curves were analyzed using non-linear regression (sigmoidal dose response with variable slope) using GraphPad Prism V5.01 software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Daudi細胞に対する7D8抗体の結合は、CH2-CH3ドメインにおける点変異の導入による影響を受けず、試験した変異体および野生型7D8のすべてについて同一であった。さらに、Raji細胞に対する7D8抗体の結合は、E345Rを除き、野生型7D8と比較して、CH2-CH3ドメインにおける点変異の導入による有意な影響を受けなかった。0.3μg／mLを上回る試験濃度では、CD20陽性Raji細胞に対するIgG1-7D8-E345Rの結合低下が検出された。同じくH433DおよびH433Rについても、試験した最も高い抗体濃度（10μg／mL）において結合低下が検出された。E345RおよびH433Rの直接標識がDaudi細胞において同程度の結合、またはさらには結合増強さえも生じさせたことから、IgG1-7D8-E345R、H433DおよびH433Rによる結合低下は二次抗体のエピトープの遮蔽によって説明しうると考えられる。この結合力の増強は、野生型IgG1-7D8と比較した、E345RおよびH433RによるFc-Fcサイドオン型結合の増強によって説明することができる。 The binding of 7D8 antibody to Daudi cells was unaffected by the introduction of point mutations in the CH2-CH3 domain and was identical for all mutants tested and wild type 7D8. Furthermore, the binding of the 7D8 antibody to Raji cells was not significantly affected by the introduction of point mutations in the CH2-CH3 domain compared to wild type 7D8, except for E345R. At test concentrations above 0.3 μg / mL, decreased binding of IgG1-7D8-E345R to CD20 positive Raji cells was detected. Similarly for H433D and H433R, a decreased binding was detected at the highest antibody concentration tested (10 μg / mL). Since direct labeling of E345R and H433R resulted in similar or even enhanced binding in Daudi cells, the decreased binding by IgG1-7D8-E345R, H433D and H433R is explained by the shielding of the secondary antibody epitope It is considered possible. This enhancement of binding power can be explained by the enhancement of Fc-Fc side-on binding by E345R and H433R compared to wild type IgG1-7D8.
K439E変異とS440K変異を組み合わせることは、Raji細胞に対する7D8抗体の結合に影響を及ぼさず、単一変異体および野生型7D8のものと同一であった。 Combining the K439E and S440K mutations did not affect the binding of the 7D8 antibody to Raji cells and was identical to that of the single mutant and wild type 7D8.
実施例3
7D8変異体によるC1q結合ELISA
精製抗体をプラスチック表面上にコーティングしてランダムな抗体多量体化を生じさせるELISAにおいて、7D8変異体によるC1q結合について試験した。プールヒト血清をC1qの供給源として用いた。
Example 3
C1q binding ELISA with 7D8 mutant
We tested for C1q binding by the 7D8 mutant in an ELISA that coats the purified antibody onto a plastic surface resulting in random antibody multimerization. Pooled human serum was used as the source of C1q.
96ウェルのMicrolon ELISAプレート（Greiner, Germany）を、PBS中にある抗体の系列希釈物（1.5倍希釈で0.58〜10.0μg／mLの範囲）により、4℃で一晩かけてコーティングした。プレートを洗浄し、0.025％ Tween 20および0.1％ゼラチンを加えた200μL／ウェルの0.5倍PBSによってブロックした。インキュベーション間に洗浄を行いながら、3％プールヒト血清（Sanquin、製品番号M0008）とともに37℃で1時間、100μL／ウェルのウサギ抗ヒトC1q（DAKO、製品番号A0136、1／4,000）とともに室温で1時間、および検出用抗体としての100μL／ウェルのブタ抗ウサギIgG-HRP（DAKO、P0399、1：10,000）とともに室温で1時間、順番にインキュベートした。現像は、1mg／mLの2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-硫酸)（ABTS；Roche, Mannheim, Germany）を用いて約30分間行った。反応を100μLの2％シュウ酸の添加によって停止させた。吸光度を、マイクロプレートリーダー（Biotek, Winooski, VT）にて405nmで測定した。対数変換データを、GraphPad Prismソフトウエアを用いて可変勾配によるシグモイド用量反応曲線に適合させることによって解析した。変異体のEC50値をプレート毎に野生型IgG1-7D8に対して標準化し、すべての野生型IgG1-7D8データの平均に対して乗算した。
A 96-well Microlon ELISA plate (Greiner, Germany) was coated overnight at 4 ° C. with serial dilutions of antibody in PBS (range 1.58 to 10.0 μg / mL at 1.5 fold dilution). Plates were washed and blocked with 200 μL / well 0.5 × PBS with 0.025
図6および表6に示されているように、試験した点変異は、ELISAによる測定ではC1q結合に対してほとんど効果を及ぼさなかった。IgG1-7D8-I253D変異体については、幾分効率の低いC1q結合がELISAで測定された（EC50値がより高い）。コーティングの活性をすべての抗体について試験したところ、すべての抗体で同程度であることが見いだされた。 As shown in FIG. 6 and Table 6, the point mutations tested had little effect on C1q binding as measured by ELISA. For the IgG1-7D8-I253D mutant, somewhat less efficient C1q binding was measured by ELISA (higher EC 50 values). The activity of the coating was tested for all antibodies and found to be comparable for all antibodies.
（表６）ELISAにおけるC1q結合に関するEC50
2 統計：Dunnett多重比較検定（GraphPad Prism 5.01）を用いた対数変換データに対する一元配置ANOVA。有意性は野生型IgG1-7D8との比較で算出した：（na）該当なし （ns）非有意 （*）p=0.01〜0.05 （**）p=0.001〜0.01 （***）p＜0.001。
Table 6 EC 50 for C1q binding in ELISA
2 Statistics: One-way ANOVA for log-transformed data using Dunnett's multiple comparison test (GraphPad Prism 5.01). Significance was calculated by comparison with wild type IgG1-7D8: (na) Not applicable (ns) Not significant ( * ) p = 0.01-0.05 ( ** ) p = 0.001-0.01 ( *** ) p <0.001 .
実施例4
7D8変異体による細胞上でのC1q結合
プラスチック表面上に抗体をコーティングすることにより、抗体結合およびFc尾部提示に関する人工的な静止系が得られる。そのため、細胞ベースアッセイにより補体結合についても試験した。ここでは、抗体によりオプソニン化されたCD20陽性B細胞におけるC1q結合をFACS分析によって測定した。セット1の変異体を用いる実験では、Daudi細胞またはRaji細胞を氷上で、10％ FBSを含む90μLのRPMI1640培地中に懸濁させた（2×106個／mL）。10μLのC1q濃度系列（Complement Technologies, Tyler, TX）を添加した（最大結合に応じて、最終濃度範囲は0〜60μg／mLおよび0〜140μg／mLの間でさまざまである）。続いて、10μLの精製抗体（最終濃度10μg／mL、すなわち飽和濃度）を添加し、反応混合物を直ちに37℃水浴に移して、1時間インキュベートした。セット2の変異体を用いる実験では、試験mAbを大量にDaudi細胞に添加し、続いてさまざまな濃度のC1qをアリコートに添加した上で、混合物を上記の通りにインキュベートした。細胞をPBS／1％ BSAで3回洗浄し、ウサギFITC-標識抗C1q抗体（DakoCytomation、10ug／mL）ととともに室温で30分間インキュベートした。細胞をPBS／1％ BSAで洗浄して、PBS中に再懸濁させるか、または2％ホルムアミドを含むPBS中で固定した。フローサイトメトリーをFACSCalibur flow cytometer（BD Biosciences）で行い、較正されたビーズ（Spherotech）を用いて、平均蛍光強度を可溶性蛍光色素分子等量（MESF）に変換した。指定の7D8抗体でオプソニン化したCD20陽性細胞に対するC1qの結合の解離定数（KD値）を、SigmaPlot（登録商標）ソフトウエア（Systat Software Inc., Washington）を用いて算出した。平均KD値を反復結合実験（Daudi細胞においては4回、Raji細胞においては3回）によって算出し、野生型7D8でオプソニン化した細胞上のC1q結合に関するKD値と比較した（表7および表8）。
Example 4
Coating an antibody on a C1q-binding plastic surface on a cell with the 7D8 variant provides an artificial resting system for antibody binding and Fc tail presentation. Therefore, complement binding was also tested by a cell-based assay. Here, C1q binding in CD20 positive B cells opsonized with antibodies was measured by FACS analysis. In experiments using set 1 mutants, Daudi or Raji cells were suspended on ice in 90 μL RPMI 1640 medium containing 10% FBS (2 × 10 6 cells / mL). A 10 μL C1q concentration series (Complement Technologies, Tyler, TX) was added (the final concentration range varies between 0-60 μg / mL and 0-140 μg / mL, depending on maximum binding). Subsequently, 10 μL of purified antibody (
セット1の変異体をDaudi細胞およびRaji細胞の両方に対して試験したところ、同じ結果が得られた。C1q ELISAの結果とは対照的に、試験したほとんどの変異体は、抗体でオプソニン化したDaudi細胞（表7A）およびRaji細胞（表8）の両方で、C1q結合力の低下（KD増大）を示した。野生型7D8と比較して、IgG1-7D8-Q311AおよびH435Aは、オプソニン化したDaudi細胞またはRaji細胞におけるC1q結合力の低下をほとんどまたは全く示さず、I253A、I253YおよびN434Aはより顕著な低下を示し、I253DおよびH433Aは極めて劇的な低下を示した。IgG1-7D8-H435Rは、C1q結合に関して両方の細胞種の表面で野生型7D8よりも幾分より高い結合力（より低いKD）を示したが、それは有意ではなかった。
The same results were obtained when the
セット2の変異体をDaudi細胞において試験した。野生型7D8と比較して、IgG1-7D8-E345R、E382RおよびH433Rは、オプソニン化Daudi細胞に対する結合力の増強を示し、これはより低いKD値に反映されている（表7B）。セット2の他の変異体はすべて、野生型7D8と比較して結合力の低下を示し、G385D、Y436D、Q438D、K439EおよびS440Kは劇的に増大したKD値を示したが（表7B）、そのように劇的に低下した結合を示すH433DおよびY436Cでは信頼性のあるKD値を測定することができなかった。
二重変異体IgG1-7D8-K439E／S440Kは、抗体でオプソニン化したDaudi細胞に対するC1q結合の回復を示したが、一方、単一変異体は両方とも、野生型7D8と比較してC1q結合の低下を示した。K439E／S440K二重変異体の結合力は、野生型7D8と比較して幾分増強さえしていた（表7C）。単一変異体IgG1-7D8-K439EとIgG1-7D8-K440Eの混合物はC1q結合を完全に回復させることができ、それは野生型7D8のC1q結合と同等であった（表7C）。 The double mutant IgG1-7D8-K439E / S440K showed restoration of C1q binding to Daudi cells opsonized with antibodies, whereas both single mutants showed C1q binding compared to wild type 7D8. Showed a decline. The binding power of the K439E / S440K double mutant was even somewhat enhanced compared to wild type 7D8 (Table 7C). A mixture of single mutant IgG1-7D8-K439E and IgG1-7D8-K440E was able to fully restore C1q binding, which was equivalent to that of wild type 7D8 (Table 7C).
IgG1-7D8変異体によってELISAではC1q結合が変化せず（実施例3）、細胞ベースアッセイではC1q結合が影響を受けたという矛盾は、抗体分子間のFc：Fc相互作用に関与する試験CH3位置が、C1q結合には直接影響しないが、細胞上に結合した場合には抗体Fc尾部の動的配置に影響を及ぼして、その結果、C1q結合の強さにも影響を及ぼす重要な決定要因であることを示している。 The IgG1-7D8 variant did not alter C1q binding in the ELISA (Example 3), and the C1q binding was affected in the cell-based assay is due to the test CH3 position involved in Fc: Fc interaction between antibody molecules However, it does not directly affect C1q binding, but when bound on a cell, it affects the dynamic placement of the antibody Fc tail and, as a result, is an important determinant that also affects the strength of C1q binding. It shows that there is.
（表７Ａ）抗体でオプソニン化したDaudi細胞に対するC1q結合に関するKD値（変異体セット1）
**（na）該当なし
(Table 7A) K D values for C1q binding to the Daudi cells opsonized with antibodies (variant Set 1)
** (na) Not applicable
（表７Ｂ）抗体でオプソニン化したDaudi細胞に対するC1q結合に関するKD値（変異体セット2）
**（na）該当なし
*** 7D8の平均KDは実験1、2、3、4、10および11から算出した。
**** これらの変異体の結合が弱すぎるため、信頼性のある適合曲線およびKD値を測定することができなかった。
(Table 7B) K D values for C1q binding to the Daudi cells opsonized with antibodies (variant Set 2)
** (na) Not applicable
Mean K D of *** 7D8 was calculated from the experimental 1,2,3,4,10 and 11.
**** For the binding of these mutants too weak, it was not possible to measure a reliable fit curve and K D values.
（表７Ｃ）抗体でオプソニン化したDaudi細胞に対するC1q結合に関するKD値（二重変異体）
**（na）該当なし
*** 7D8の平均KDは実験1、2、3、4、10および11から算出した。
(Table 7C) K D values for C1q binding to the Daudi cells opsonized with antibodies (double mutant)
** (na) Not applicable
Mean K D of *** 7D8 was calculated from the experimental 1,2,3,4,10 and 11.
（表８）抗体でオプソニン化したRaji細胞に対するC1q結合に関するKD値（変異体セット1）
**（na）該当なし
(Table 8) K D values for C1q binding to Raji cells opsonized with antibodies (variant Set 1)
** (na) Not applicable
実施例5
CD20陽性Raji細胞でのCDCアッセイにおける7D8変異体によるC1q活性
観察されたC1q結合力の変化がCDC活性に及ぼす影響について調べるために、IgG1-7D8変異体でオプソニン化した細胞を用いたC1q活性を、CDCアッセイにおいて試験した。すなわち、所定の濃度系列のC1qを加えたC1q枯渇正常ヒト血清を用いて、CDCアッセイを行った。0.1×106個のRaji細胞を、丸底96ウェルプレート（Nunc, Rochester, NY）中にて、0.1％ BSAを加えた総容積100μLのRPMI1640培地中で、10μg／mLの精製抗体およびヒトC1qの濃度系列（0.005、0.025、0.1、0.3、1.0、5.0、30.0μg／mL）とともに室温で15分間プレインキュベートした。次に、25μLのC1q枯渇血清（Quidel, San Diego, CA）を添加して、37℃にて水浴中で30分間インキュベートするか、またはインキュベーター内で45分間インキュベートした。インキュベーション後に、試料を氷上に置くことによって反応を停止させた。細胞溶解については、ヨウ化プロピジウム（PI, Sigma Aldrich, Zwijndrecht, Netherlands）生細胞排除アッセイを用いることによってFACSで決定した。溶解率（％ lysis）は以下の通りに求めた：溶解率＝（PI陽性細胞の数／細胞の総数）×100％。
Example 5
C1q activity by 7D8 mutant in CD20 assay in CD20 positive Raji cells C1q activity using cells opsonized with IgG1-7D8 mutant was examined in order to investigate the effect of observed C1q binding changes on CDC activity. Tested in a CDC assay. That is, a CDC assay was performed using C1q-depleted normal human serum to which a predetermined concentration series of C1q was added. 0.1 × 10 6 Raji cells in round bottom 96-well plates (Nunc, Rochester, NY) in 10 μg / mL purified antibody and human C1q in RPMI 1640 medium with a total volume of 100 μL plus 0.1% BSA And a concentration series (0.005, 0.025, 0.1, 0.3, 1.0, 5.0, 30.0 μg / mL) for 15 minutes at room temperature. Next, 25 μL of C1q-depleted serum (Quidel, San Diego, Calif.) Was added and incubated in a water bath for 30 minutes at 37 ° C. or incubated for 45 minutes in an incubator. After incubation, the reaction was stopped by placing the sample on ice. Cell lysis was determined by FACS by using a propidium iodide (PI, Sigma Aldrich, Zwijndrecht, Netherlands) live cell exclusion assay. The lysis rate (% lysis) was determined as follows: lysis rate = (number of PI positive cells / total number of cells) × 100%.
30μg／mLのC1qの存在下での野生型7D8による溶解から、C1qを全く添加していない場合の溶解を差し引いたものを、100％に設定した。CH50値（50％の溶解をもたらすC1q濃度）を、GraphPad Prismソフトウエアを用いて対数変換データに対するシグモイド用量反応曲線の適合化を行うことによって算出した。変異体のCH50値を野生型7D8に対して標準化した（表9）。 The lysis with wild type 7D8 in the presence of 30 μg / mL C1q minus the lysis when no C1q was added was set to 100%. CH 50 values (C1q concentration resulting in 50% lysis) were calculated by fitting sigmoidal dose response curves to log-transformed data using GraphPad Prism software. Mutant CH 50 values were normalized to wild-type 7D8 (Table 9).
表9におけるデータは、C1q結合力の測定値と一致して、IgG1-7D8-Q311A、E382RおよびH435Aが、C1q活性の低下を示さなかったことを示している；I253A、I253Y、G385D、N434AおよびY436CではC1q活性の有意な低下がみられ；I253D、H310K、K322A、H433A、H433D、Y436D、Q438D、K439EおよびS440Kでは、試験したすべてのC1q濃度でCDCを誘導する能力がほぼ完全に失われていた。 The data in Table 9 shows that IgG1-7D8-Q311A, E382R and H435A did not show a decrease in C1q activity, consistent with the measured C1q binding force; I253A, I253Y, G385D, N434A and Y436C has a significant decrease in C1q activity; I253D, H310K, K322A, H433A, H433D, Y436D, Q438D, K439E and S440K almost completely lose the ability to induce CDC at all tested C1q concentrations. It was.
IgG1-7D8-H435RおよびH433Rは、野生型7D8よりも幾分効率的にC1qを利用し、その結果、より効率的なCDCを示した。IgG1-7D8-E345RはC1q活性の劇的な増強を示し、それは野生型7D8と比較して有意に高いCDC溶解をもたらした（表9）。 IgG1-7D8-H435R and H433R utilized C1q somewhat more efficiently than wild type 7D8, resulting in more efficient CDC. IgG1-7D8-E345R showed a dramatic enhancement of C1q activity, which resulted in significantly higher CDC lysis compared to wild type 7D8 (Table 9).
図7は、いずれも単一変異体としてはCDCの喪失をもたらすK439E変異とS440K変異を組み合わせることにより、両方の変異を1つの分子中に組み合わせた場合（K439E／S440K二重変異体）に、または両方の単一変異体を組み合わせた場合（K439E＋S440K混合物）に、C1q活性アッセイにおけるCDCが回復したことを示している。 Figure 7 shows that when both mutations are combined in one molecule (K439E / S440K double mutant) by combining the K439E and S440K mutations, both resulting in CDC loss as a single mutant. Or when both single mutants were combined (K439E + S440K mixture), CDC in the C1q activity assay was restored.
（表９）Raji細胞でのCDCアッセイにおけるC1q活性に関するCH50
(2)平均およびSDは、実施したすべての実験から算出した。
(3)統計：Dunnett多重比較検定（GraphPad Prism 5.01）を用いた対数変換データに対する一元配置ANOVA。有意性は野生型IgG1-7D8との比較で算出した：（na）該当なし （nd）未決定 （ns）非有意 （*）p=0.01〜0.05 （**）p=0.001〜0.01 （***）p＜0.001。
(4)溶解が50％に達しない場合には、CH50を＞30μg／mLに設定した
(5)溶解度50％に達しなかった変異体についてはP値を決定することができなかった。しかし、これらはIgG1-7D8-WTとは有意に異なるものと推測される。
Table 9 CH 50 for C1q activity in CDC assay in Raji cells
(2) Mean and SD were calculated from all experiments performed.
(3) Statistics: One-way ANOVA for log-transformed data using Dunnett's multiple comparison test (GraphPad Prism 5.01). Significance was calculated by comparison with wild type IgG1-7D8: (na) Not applicable (nd) Not determined (ns) Not significant ( * ) p = 0.01-0.05 ( ** ) p = 0.001-0.01 ( ** * ) P <0.001.
(4) If dissolution did not reach 50%, CH 50 was set to> 30 μg / mL
(5) P values could not be determined for mutants that did not reach 50% solubility. However, these are assumed to be significantly different from IgG1-7D8-WT.
実施例6
CD20陽性細胞でのCDCアッセイにおける、7D8変異体によるCDC
0.1×106個の細胞を、丸底96ウェルプレート（Nunc, Rochester, NY）中にて、総容積80μL中で、抗体の濃度系列（0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg／mL）とともに、振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、20μLの正常ヒト血清をC1qの供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。0.1％ BSAを加えた30μLの氷冷RPMI培地を添加することによって反応を停止させた。細胞溶解は、ヨウ化プロピジウムを用いることによってFACSで決定した。
Example 6
CDC with 7D8 mutant in CDC assay on CD20 positive cells
0.1 × 10 6 cells in a round bottom 96-well plate (Nunc, Rochester, NY) in a total volume of 80 μL, antibody concentration series (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0 μg / mL) and preincubation for 15 minutes at room temperature on a shaker. Next, 20 μL of normal human serum was added as a source of C1q (
Daudi細胞でのCDCアッセイについては、EC50値（50％の溶解率をもたらす抗体濃度）を、GraphPad Prismソフトウエアを用いて対数変換データに対するシグモイド用量反応曲線の適合化を行うことによって算出した。変異体のEC50値を野生型7D8に対して標準化した（表10および表11）。 For CDC assays on Daudi cells, EC 50 values (antibody concentration that resulted in a 50% lysis rate) were calculated by fitting a sigmoidal dose response curve to log-transformed data using GraphPad Prism software. Mutant EC 50 values were normalized to wild-type 7D8 (Table 10 and Table 11).
表10は、Daudi細胞において、IgG1-7D8-I253A、Q311A、E382R、H433RおよびH435Aが、CDC野生型7D8と比較して差を示さなかったことを示している；
IgG1-7D8-I253D、I253Y、H310K、G385D、H433A、H433D、N434A、Y436C、Y436D、Q438D、K439E、S440KおよびI253D/H433Aについては野生型7D8よりも有意に不良なCDC（より高いEC50）が見いだされ、これらは高い抗体濃度でしかCDCを誘導しなかった；対照として含めたC1q結合能欠損性変異体IgG1-7D8-K322Aは、CDCを誘導する能力をほぼ完全に喪失しており、試験した濃度ではEC50に達しなかった；IgG1-7D8-H435Rは、Daudi細胞において、野生型7D8よりも効率的なCDCを示した。重要なこととして、C1q活性CDCアッセイと一致して、E345RはDaudi細胞において野生型7D8よりも劇的に良好なCDCを示し、EC50値が10分の1の低さであった（表10）。図8は、いずれも単一変異体としてはCDCの喪失をもたらすK439E変異とS440K変異を組み合わせることにより、両方の変異を1つの分子中に組み合わせた場合（K439E／S440K二重変異体）に、または両方の単一変異体を組み合わせた場合（K439E＋S440K混合物）に、CDCが回復したことを示している。
Table 10 shows that in Daudi cells IgG1-7D8-I253A, Q311A, E382R, H433R and H435A showed no difference compared to CDC wild type 7D8;
IgG1-7D8-I253D, I253Y, H310K, G385D, H433A, H433D, N434A, Y436C, Y436D, Q438D, K439E, S440K and I253D / H433A have significantly worse CDC (higher EC 50 ) than wild type 7D8 Found, they only induced CDC at high antibody concentrations; the C1q binding-deficient mutant IgG1-7D8-K322A, included as a control, almost lost the ability to induce CDC and was tested The EC 50 was not reached at the concentrations tested; IgG1-7D8-H435R showed more efficient CDC in Daudi cells than wild type 7D8. Importantly, consistent with the C1q activity CDC assay, E345R showed dramatically better CDC in Daudi cells than wild type 7D8, with an EC 50 value that was 10 times lower (Table 10). ). Figure 8 shows that when both mutations are combined in one molecule (K439E / S440K double mutant) by combining the K439E and S440K mutations, both resulting in loss of CDC as single mutants. Or when both single mutants were combined (K439E + S440K mixture), CDC was restored.
表11は、Raji細胞におけるIgG1-7D8変異体についても類似のデータが見いだされたことを示している。 Table 11 shows that similar data were found for the IgG1-7D8 mutant in Raji cells.
（表１０）Daudi細胞でのCDCアッセイから算出されたEC50
(2)平均およびSDは、実施したすべての実験から算出した。
(3)統計：Dunnett多重比較検定（GraphPad Prism 5.01）を用いた対数変換データに対する一元配置ANOVA。有意性は野生型7D8との比較で算出した：（na）該当なし （nd）未決定 （ns）非有意 （*）p=0.01〜0.05 （**）p=0.001〜0.01 （***）p＜0.001。
(4)溶解が50％に達しない場合には、EC50を＞30μg／mLに設定した
(5)EC50に達しなかった変異体についてはP値を決定することができなかった。しかし、これらは野生型7D8-WTとは有意に異なるものと推測される。
Table 10 EC 50 calculated from CDC assay in Daudi cells
(2) Mean and SD were calculated from all experiments performed.
(3) Statistics: One-way ANOVA for log-transformed data using Dunnett's multiple comparison test (GraphPad Prism 5.01). Significance was calculated by comparison with wild type 7D8: (na) Not applicable (nd) Not determined (ns) Not significant ( * ) p = 0.01-0.05 ( ** ) p = 0.001-0.01 ( *** ) p <0.001.
(4) If dissolution did not reach 50%, EC 50 was set to> 30 μg / mL
(5) P values could not be determined for mutants that did not reach EC 50 . However, it is speculated that these are significantly different from wild type 7D8-WT.
（表１１）Raji細胞でのCDCアッセイから算出されたEC50
(2)平均およびSDは、実施したすべての実験から算出した。
(3)統計：Dunnett多重比較検定（GraphPad Prism 5.01）を用いた対数変換データに対する一元配置ANOVA。有意性は野生型7D8との比較で算出した：（na）該当なし （nd）未決定 （ns）非有意 （*）p=0.01〜0.05 （**）p=0.001〜0.01 （***）p＜0.001。
(4)CH50に達しない場合には、CH50を＞30μg／mLに設定した
(5)EC50に達しなかった変異体についてはP値を決定することができなかった。しかし、これらは野生型7D8-WTとは有意に異なるものと推測される。
Table 11 EC 50 calculated from CDC assay in Raji cells
(2) Mean and SD were calculated from all experiments performed.
(3) Statistics: One-way ANOVA for log-transformed data using Dunnett's multiple comparison test (GraphPad Prism 5.01). Significance was calculated by comparison with wild type 7D8: (na) Not applicable (nd) Not determined (ns) Not significant ( * ) p = 0.01-0.05 ( ** ) p = 0.001-0.01 ( *** ) p <0.001.
(4) If CH 50 was not reached, CH 50 was set to> 30 μg / mL
(5) P values could not be determined for mutants that did not reach EC 50 . However, it is speculated that these are significantly different from wild type 7D8-WT.
実施例7
CDC誘導能による7D8変異体のランク付け
試験した7D8変異体について、Daudi細胞におけるC1q結合アッセイ（実施例4に記載）とRaji細胞におけるC1q活性アッセイ（実施例5に記載）との間、ならびにDaudi細胞におけるC1q結合アッセイとDaudi細胞およびRaji細胞おけるCDCアッセイとの間（実施例6に記載）に相関が見いだされた（相関データ表13）。そのため、Daudi細胞におけるC1q結合アッセイのKD値を用いて、試験したすべての7D8変異体を、表12に示すように、それらがCDCを誘導する能力に従ってランク付けした。
Example 7
Ranking of 7D8 mutants by CDC inducibility For 7D8 mutants tested, between the C1q binding assay in Daudi cells (described in Example 4) and the C1q activity assay in Raji cells (described in Example 5), as well as Daudi A correlation was found between the C1q binding assay in cells and the CDC assay in Daudi and Raji cells (described in Example 6) (correlation data table 13). Therefore, by using the K D values of C1q binding assay in Daudi cells, all 7D8 variants tested, as shown in Table 12, were ranked according to their ability to induce CDC.
（表１２）試験したすべての7D8変異体の、それらがCDCを誘導する能力を表すものとして役立つ、Daudi細胞表面におけるC1q結合に関する、KD値が高いものから順のランク付け
（表１３）Daudi細胞におけるC1q結合アッセイ（実施例4）とRaji細胞におけるC1q活性アッセイ（実施例5）との間での相関、ならびにDaudi細胞におけるC1q結合アッセイとDaudi細胞およびRaji細胞におけるCDCアッセイとの間（実施例06）での相関。相関について解析する前に、データを対数変換した。
実施例8
CD38抗体005変異体の設計および作製
ヒトモノクローナル抗体HuMab 005は、WO/2006/099875号に記載されている完全ヒトIgG1,κ抗体である。本明細書ではそれを、同定されたFc変異がCDC活性を増強することを検証するためのモデル抗体として用いた。試験した変異は表14に列記されている。
Example 8
Design and production of
種々の変異体についてDNA構築物を調製し、IgG1m（f）アロタイプを有するHuMab 005の重鎖を変異誘発反応のためのテンプレートとして用いて、実施例1に記載した通りに一過性にトランスフェクトした。
DNA constructs were prepared for the various mutants and transiently transfected as described in Example 1, using the heavy chain of
（表１４）005（HuMax-CD38）のCH2-CH3ドメインに導入した変異のセット
(-)負荷電
(+)正荷電
(δ+)部分的正荷電
(Table 14) Set of mutations introduced into CH2-CH3 domain of 005 (HuMax-CD38)
(-) Negative load
(+) Positive charge
(δ +) partial positive charge
実施例9
HuMab-005変異体による細胞上でのCD38結合
CD38陽性Daudi細胞およびRaji細胞に対する非精製抗体試料の結合を、FACS分析によって分析した。105個の細胞を、ポリスチレン製96ウェル丸底プレート中にて、100μL中で、RPMI1640／0.1％ BSA中にある抗体調製物の系列希釈物（0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg／mL）とともに、4℃で30分間インキュベートした。RPMI1640／0.1％ BSAにて2回洗浄した後に、細胞を、FITC結合ウサギF(ab')2抗ヒトIgG（カタログ番号F0056；DAKO；1：150）とともに、50μL中で、4℃で30分間インキュベートした。次に、細胞をPBS／0.1％ BSA／0.02％アジドにて2回洗浄し、100μL PBS／0.1％ BSA／0.02％アジド中に再懸濁させた上で、FACS Cantoll（BD Biosciences）で分析した。結合曲線はGraphPad Prism V5.01ソフトウエアを用いて解析した。陰性対照として、擬似トランスフェクトした細胞の上清を用いた。
Example 9
CD38 binding on cells by HuMab-005 mutant
Binding of unpurified antibody samples to CD38 positive Daudi cells and Raji cells was analyzed by FACS analysis. 10 5 cells were serially diluted (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 0.01%, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0) in 100 μL in a 96-well round bottom plate made of polystyrene in RPMI 1640 / 0.1% BSA. 10.0, 30.0 μg / mL) and incubation at 4 ° C. for 30 minutes. After washing twice with RPMI 1640 / 0.1% BSA, the cells were combined with FITC-conjugated rabbit F (ab ′) 2 anti-human IgG (Catalog No. F0056; DAKO; 1: 150) in 50 μL at 4 ° C. for 30 minutes. Incubated. The cells were then washed twice with PBS / 0.1% BSA / 0.02% azide, resuspended in 100 μL PBS / 0.1% BSA / 0.02% azide and analyzed with FACS Cantoll (BD Biosciences). . The binding curve was analyzed using GraphPad Prism V5.01 software. As a negative control, mock-transfected cell supernatant was used.
Daudi細胞に対するHuMab 005の結合は、CH2-CH3ドメインにおける点変異の導入により、それほど大きな影響は受けなかった。試験した抗体はすべて、Daudi細胞と用量依存的な様式で結合した。幾分低下した結合を示した005-E345Rを除き、試験した変異体のすべてで、結合は野生型HuMab-005と同程度であった。しかし、いかなる理論にも拘束されないものの、結合がより低下していることは、実施例2におけるIgG1-7D8-E345と同様に、二次抗体による結合低下の結果である可能性がある。005-E345Rによる実際の結合力は005-WTと比較して同程度であるかまたはさらに増強されている可能性もあるが、直接標識された抗体がないため、本発明者らはこのことを確かめることができなかった。
Raji細胞に対するHuMab-005の結合も、CH2-CH3ドメインにおける点変異の導入によってそれほど大きな影響を受けなかった。試験した抗体はすべて、Raji細胞と用量依存的な様式で結合した。最大結合は、005-I253DおよびH433A変異体については野生型005のものと同程度であり、005-E435R、K439E、S440K変異体および005-K439E＋005-S440Kの組み合わせについてはより低下していた。しかし、いかなる理論にも拘束されないものの、結合がより低下していることは、実施例2におけるIgG1-7D8-E345R（エピトープの遮蔽）と同様に、二次抗体による結合低下の結果である可能性がある。
HuMab-005 binding to Raji cells was also not significantly affected by the introduction of point mutations in the CH2-CH3 domain. All tested antibodies bound Raji cells in a dose-dependent manner. Maximum binding was comparable for the 005-I253D and H433A mutants to that of
実施例10
CD38抗体005の変異体による、CD38陽性細胞でのCDCアッセイ
0.1×106個のDaudi細胞またはRaji細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μLで、非精製抗体の濃度系列（0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg／mL）とともに、振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、25μLの正常ヒト血清をC1qの供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μLのヨウ化プロピジウムを添加し、細胞溶解をFACSによって決定した。
Example 10
CDC assay on CD38 positive cells with a variant of
0.1 × 10 6 Daudi cells or Raji cells in a round bottom 96-well plate with a total volume of 100 μL and a concentration series of unpurified antibodies (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0 μg / ML) and preincubation for 15 minutes at room temperature on a shaker. Next, 25 μL of normal human serum was added as a source of C1q (
Daudi細胞およびRaji細胞において7D8抗体および005抗体の両方のCDC活性を増強することが示されたE435R変異のCDC増強能力について、Wien133細胞において種々の濃度の正常ヒト血清（NHS）を用いてさらに分析した。0.1×106個のWien133細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積50μLで、非精製抗体の濃度系列（0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg／mL）とともに、振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、C1qの供給源としてNHSを、総容積100μLで、20％または50％ NHSのいずれかの最終濃度に達するまで添加した。反応混合物を37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μLのヨウ化プロピジウム添加し、細胞溶解をFACSによって決定した。 Further analysis of the CDC-enhancing ability of the E435R mutation shown to enhance the CDC activity of both 7D8 and 005 antibodies in Daudi and Raji cells using various concentrations of normal human serum (NHS) in Wien133 cells did. 0.1 × 10 6 Wien133 cells in a round bottom 96-well plate with a total volume of 50 μL and a concentration series of non-purified antibodies (0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0 μg / mL) and preincubation for 15 minutes at room temperature on a shaker. NHS was then added as a source of C1q in a total volume of 100 μL until a final concentration of either 20% or 50% NHS was reached. The reaction mixture was incubated for 45 minutes in a 37 ° C. incubator. The reaction was stopped by placing the plate on ice. 10 μL of propidium iodide was added and cell lysis was determined by FACS.
CD20抗体7D8に関してCDC活性の喪失または増強をもたらした、CH2-CH3領域において同定された変異は、CD38を認識する005抗体に対しても同じ効果を及ぼすことが見いだされた。図9は、005-I253D、H443A、K439EおよびS440KがDaudi細胞（図9A）およびRaji細胞（図9B）の両方においてCDC活性の完全な喪失を示し、一方、005-E345R変異体がいずれの細胞株においても強く増強されたCDC活性を示したことを示している。7D8のデータと同等に、いずれも単一変異体としてはCDCの喪失をもたらす005-K439E＋005-S440Kの組み合わせは、CDCの回復をもたらした。驚いたことに、005-E435Rは、野生型005がCDCによる致死を誘導することができないWien133細胞においてもCDCを強く誘導した（図9C）。Wien133細胞における005-E345RによるCDC致死は、20％および50％のいずれの血清濃度でも観察された（図9C）。同じくRaji細胞においても、7D8-E345Rおよび005-E345Rは両方とも、50％血清中でインビトロでのCDCの増強を示し、20％血清中でも同程度の活性であった（図9D）。
Mutations identified in the CH2-CH3 region that resulted in loss or enhancement of CDC activity with respect to the CD20 antibody 7D8 were found to have the same effect on the 005 antibody that recognizes CD38. FIG. 9 shows that 005-I253D, H443A, K439E and S440K show a complete loss of CDC activity in both Daudi cells (FIG. 9A) and Raji cells (FIG. 9B), while the 005-E345R mutant is in any cell This shows that the strain also showed strongly enhanced CDC activity. Equivalent to the 7D8 data, the combination of 005-K439E + 005-S440K, both resulting in loss of CDC as a single mutant, resulted in recovery of CDC. Surprisingly, 005-E435R also strongly induced CDC in Wien133 cells, where
CH2-CH3領域におけるE345R変異が、試験したCD20抗体7D8およびCD38抗体005の両方においてCDC活性の増強をもたらしたことから、E345R変異はCDCを誘導または増強するために適用しうる一般的な抗体改変であると考えられる。
The E345R mutation in the CH2-CH3 region resulted in enhanced CDC activity in both the CD20 antibody 7D8 and
実施例11
CDC増強性変異E345Rを含むIgG1抗体は、野生型抗体よりも、Fc結合ペプチドDCAWHLGELVWCT（SEQ ID NO:19）によるCDCの阻害に対する感受性が低い
IgGのFc：Fc境界面にある疎水性パッチ中のアミノ酸位置を変異させることによって、CDCの活性が損なわれること、または増強されることが見いだされた。b12結晶構造において観察されているような、Fc-Fc境界面での相互作用、およびそれ故に可能性としてオリゴマー（例えば、ヘキサマー環）構造の形成がCDCの活性に及ぼす関与についてさらに調べた。すなわち、野生型IgG Fcの表面上の疎水性パッチ領域におけるコンセンサス結合部位を標的とする、13残基のペプチド（DCAWHLGELVWCT（SEQ ID NO：19））を用いた（Delano et al., Science 2000 Feb 18; 287(5456): 1279-83）。実際に、種々の異なる分子との相互作用に向けて備わっている適応領域としてのIgG Fcの表面上のコンセンサス結合部位の実体（Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456): 1279-83）は、IgG1 b12結晶構造においてFc-Fc相互作用に関与する疎水性パッチにおけるコアアミノ酸の実体と一致する（Saphire et al., Science 2001 Aug 10; 293(5532): 1155-9）。結合境界面のすべてに存在する相互作用は、共通する6つのアミノ酸のセット（Met-252、Ile-253、Ser-254、Asn-434、His-435およびTyr-436）、ならびに共通の骨格接触によって媒介される（Delano et al., Science 2000 Feb 18;287(5456): 1279-83）。そのため、Fc結合ペプチドはFc-Fc相互作用に影響を及ぼし、その結果としてCDCの活性にも影響を及ぼすと予想される。
Example 11
IgG1 antibody containing CDC enhancing mutation E345R is less sensitive to inhibition of CDC by Fc-binding peptide DCAWHLGELVWCT (SEQ ID NO: 19) than wild-type antibody
It has been found that by mutating amino acid positions in hydrophobic patches at the Fc: Fc interface of IgG, the activity of CDC is impaired or enhanced. We further investigated the interaction at the Fc-Fc interface, as observed in the b12 crystal structure, and possibly the formation of oligomer (eg, hexamer ring) structure on the activity of CDC. That is, a 13-residue peptide (DCAWHLGELVWCT (SEQ ID NO: 19)) that targets a consensus binding site in the hydrophobic patch region on the surface of wild-type IgG Fc was used (Delano et al., Science 2000 Feb). 18; 287 (5456): 1279-83). In fact, the entity of a consensus binding site on the surface of IgG Fc as an adaptation region provided for interaction with a variety of different molecules (Delano et al., Science 2000 Feb 18; 287 (5456): 1279- 83) is consistent with the identity of the core amino acid in the hydrophobic patch involved in the Fc-Fc interaction in the IgG1 b12 crystal structure (Saphire et al., Science 2001
0.1×106個のDaudi細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、75μL中で、1.0μg／mLの非精製抗体とともに振盪機上にて室温で10分間プレインキュベートした。Fc結合ペプチドDCAWHLGELVWCT（SEQ ID NO:19）の濃度系列（最終濃度は0.06〜60μg／mLの範囲）の25μLをオプソニン化細胞に添加して、室温で振盪機上で10分間インキュベートした。次に、25μLのNHSを補体の供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。0.1％ BSAを加えた25μLの氷冷RPMI培地を添加することによって反応を停止させた。15μLのヨウ化プロピジウムを添加し、細胞溶解をFACS分析によって決定した。
0.1 × 10 6 Daudi cells were preincubated in a round bottom 96-well plate in 75 μL with 1.0 μg / mL unpurified antibody for 10 minutes on a shaker at room temperature. 25 μL of a concentration series of Fc-binding peptide DCAWHLGELVWCT (SEQ ID NO: 19) (final concentration range 0.06-60 μg / mL) was added to the opsonized cells and incubated at room temperature on a shaker for 10 minutes. Next, 25 μL NHS was added as a complement source (
野生型005（図10A）または7D8（図10B）によって媒介されるCDCは、Fc結合ペプチドDCAWHLGELVWCT（SEQ ID NO:19）によって用量依存的な様式で阻害されることが見いだされた。これらの競合データも同じく、IgGの疎水性パッチでのFc-Fc相互作用がCDCの活性に関与することを示唆している。CDCが増強されたIgG1-005-E345RおよびIgG1-7D8-E345R変異体は両方とも、それらの対応する野生型抗体と比較して、Fc結合ペプチドによる競合に関する感受性が低く、このことはE345R変異がFc-Fc相互作用の安定性の増強をもたらし、その結果としてCDCの増強をもたらすことを示唆する。 CDC mediated by wild type 005 (FIG. 10A) or 7D8 (FIG. 10B) was found to be inhibited in a dose-dependent manner by the Fc-binding peptide DCAWHLGELVWCT (SEQ ID NO: 19). These competition data also suggest that the Fc-Fc interaction in the hydrophobic patch of IgG is involved in CDC activity. Both CD1-enhanced IgG1-005-E345R and IgG1-7D8-E345R mutants are less sensitive to competition by Fc-binding peptides compared to their corresponding wild-type antibodies, indicating that the E345R mutation It suggests that it enhances the stability of the Fc-Fc interaction, resulting in enhanced CDC.
実施例12
CD38抗体HuMAb 005の変異体によるCD38発現細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ADCC）
Daudi細胞を採取し（5×106個／ml）、洗浄（PBSにて2回、1200rpm、5分間）した上で、10％コスミック仔ウシ血清（cosmic calf serum）（CCS）（HyClone, Logan, UT, USA）を加えた1mLのRPMI1640培地中に収集し、それに対して200μCiの51Cr（クロム-51；Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Netherlands）を添加した。混合物を振盪水浴中にて37℃で1時間インキュベートした。細胞の洗浄（PBSにて2回、1200rpm、5分間）の後に、細胞を、10％ CCSを加えたRPMI1640培地中に再懸濁させ、トリパンブルー排除によって算定して、1×105個／mLの濃度に希釈した。
Example 12
Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) of CD38-expressing cells by a variant of
Daudi cells were collected (5 × 10 6 cells / ml), washed (twice with PBS, 1200 rpm, 5 minutes), and then 10% cosmic calf serum (CCS) (HyClone, Logan , UT, USA) in 1 mL RPMI1640 medium plus 200 μCi 51 Cr (Chromium-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Netherlands). The mixture was incubated for 1 hour at 37 ° C. in a shaking water bath. After cell washing (twice in PBS, 1200 rpm, 5 min), cells were resuspended in RPMI 1640 medium supplemented with 10% CCS and counted by trypan blue exclusion, 1 × 10 5 cells / Dilute to a concentration of mL.
その間に、新鮮なバフィーコート（Sanquin, Amsterdam, Netherlands）から、標準的なFicoll密度勾配遠心分離を製造元の指示に従って用いて（リンパ球分離培地；Lonza, Verviers, France）、末梢血単核細胞（PBMC）を単離した。10％ CCSを加えたRPMI1640培地中への細胞の再懸濁の後に、細胞をトリパンブルー排除によって算定し、1×107個／mLに濃縮した。 Meanwhile, from a fresh buffy coat (Sanquin, Amsterdam, Netherlands) using standard Ficoll density gradient centrifugation according to the manufacturer's instructions (lymphocyte separation medium; Lonza, Verviers, France), peripheral blood mononuclear cells ( PBMC) was isolated. After resuspension of the cells in RPMI 1640 medium supplemented with 10% CCS, the cells were counted by trypan blue exclusion and concentrated to 1 × 10 7 cells / mL.
ADCC実験については、50μLの51Cr標識Daudi細胞（5,000個）を、96ウェルマイクロタイタープレート中にて、総容積100μLで、10％ CCSを加えたRPMI培地中にある15μg／mLのCD38抗体IgG1-005または変異体IgG1-005-E345Rとともにプレインキュベートした。室温で10分後に、50μLのPBMC（500,000個）を添加して、エフェクター-標的比が100：1となるようにした。50μLの51Cr標識Daudi細胞（5,000個）を100μLの5％ Triton-X100とともにインキュベートすることによって、細胞溶解の最大量を決定した。抗体もエフェクター細胞も伴わずに、5,000個の51Cr標識Daudi細胞を150μLの培地中でインキュベートすることにより、自然発生的な溶解の量を決定した。抗体と無関係な細胞溶解のレベルは、5,000個のDaudi細胞を500,000個のPBMCとともに、抗体を伴わずにインキュベートすることによって決定した。その後に、細胞を37℃、5％ CO2にて4時間インキュベートした。細胞溶解の量を決定するためには、細胞を遠心分離して（1200rpm、3分間）、上清の75μLをmicronicチューブに移し、その後に、放出された51Crをガンマカウンターを用いて算定した。測定された1分間当たりのカウント数（cpm）を用いて、抗体媒介性溶解のパーセンテージを以下の通りに算出した：
（試料cpm − Abと無関係な溶解のcpm）／（最大溶解のcpm − 自然発生的な溶解のcpm）×100％
For ADCC experiments, 50 μL of 51 Cr-labeled Daudi cells (5,000 cells) in a 96-well microtiter plate with a total volume of 100 μL, 15 μg / mL CD38 antibody IgG1 in RPMI medium supplemented with 10% CCS Pre-incubated with -005 or mutant IgG1-005-E345R. After 10 minutes at room temperature, 50 μL of PBMC (500,000) was added to achieve an effector-target ratio of 100: 1. The maximum amount of cell lysis was determined by incubating 50 μL of 51 Cr labeled Daudi cells (5,000) with 100 μL of 5% Triton-X100. The amount of spontaneous lysis was determined by incubating 5,000 51 Cr-labeled Daudi cells in 150 μL medium without antibodies or effector cells. The level of cell lysis unrelated to antibody was determined by incubating 5,000 Daudi cells with 500,000 PBMC without antibody. The cells were then incubated for 4 hours at 37 ° C., 5% CO 2 . To determine the amount of cell lysis, the cells were centrifuged (1200 rpm, 3 minutes), 75 μL of the supernatant was transferred to a micronic tube, and then the released 51 Cr was counted using a gamma counter . Using the measured counts per minute (cpm), the percentage of antibody-mediated lysis was calculated as follows:
(Sample cpm-cpm of lysis unrelated to Ab) / (maximum lysis cpm-spontaneous lysis cpm) x 100%
表15は、実施したADCCアッセイにおけるIgG1-005-wtおよびIgG1-005-E345Rの算出されたEC50値を示している。4種の試料を試験した。IgG1-005-E345Rは、試験した4種の試料のすべてで、IgG1-005-wtよりも有意に低いEC50値を示している。 Table 15 shows the calculated EC 50 values for IgG1-005-wt and IgG1-005-E345R in the ADCC assay performed. Four samples were tested. IgG1-005-E345R shows a significantly lower EC 50 value than IgG1-005-wt in all four samples tested.
（表１５）実施した4つの実験の算出EC50値
図11は、野生型抗体HuMab-005と比較して、変異体IgG1-005-E345RがADCC能力の活性の増強を明らかに示し、より低い濃度でADCCを誘導できたことを示している。 FIG. 11 clearly shows that the mutant IgG1-005-E345R showed enhanced ADCC ability activity compared to the wild-type antibody HuMab-005, and was able to induce ADCC at lower concentrations.
実施例13
野生型7D8と比較した7D8変異体のFcRn結合および薬物動態分析
新生児Fc受容体（FcRn）は、IgGを分解から防御することにより、IgGの長い血漿中半減期の原因となる。抗体の細胞内移行後に、FcRnはエンドソーム内で抗体Fc領域と結合するが、そこは相互作用が安定な穏やかな酸性環境（pH 6.0）にある。環境が中性（pH7.4）である原形質膜までリサイクルされると、相互作用がなくなり、抗体は再び血流中に放出される。これがIgGの血漿中半減期に影響する。
Example 13
FcRn binding and pharmacokinetic analysis of 7D8 mutants compared to wild-type 7D8 The neonatal Fc receptor (FcRn) contributes to the long plasma half-life of IgG by protecting it from degradation. After antibody intracellularization, FcRn binds to the antibody Fc region within the endosome, but in a mild acidic environment (pH 6.0) where the interaction is stable. When the environment is recycled to a neutral (pH 7.4) plasma membrane, the interaction is lost and the antibody is released back into the bloodstream. This affects the plasma half-life of IgG.
7D8変異体IgG1-7D8-E354Rがマウス、カニクイザルおよびヒト由来のFcRnと相互作用する能力を、ELISAにおいて試験した。インキュベーションはすべて室温で行った。0.2％ BSAを加えたPBST中に希釈した、5μg／mL（100μL／ウェル）の、組換え法で作製したFcRn（マウス、ヒトまたはカニクイザル）のビオチン化細胞外ドメイン（FcRnECDHis-B2M-BIO）により、96ウェルプレートを1時間コーティングした。プレートをPBSTで3回洗浄し、3倍系列で希釈した（PBST／0.2％ BSA、pH 6.0中）野生型IgG1-7D8またはIgG1-7D8-E354Rを添加して、プレートを1時間インキュベートした。プレートをPBST／0.2％ BSA、pH 6.0で洗浄した。PBST／0.2％ BSA、pH 6.0中に希釈したヤギ-抗ヒトIgG(Fab'2)-HRP（JacksonImmuno Research、カタログ番号：109-035-097）を添加して、プレートを1時間インキュベートした。洗浄後に、ABTSを基質として添加し、プレートを暗所下で30分間インキュベートした。EL808 ELISAリーダーを用いて、吸光度を405で読み取った。 The ability of the 7D8 mutant IgG1-7D8-E354R to interact with FcRn from mice, cynomolgus monkeys and humans was tested in ELISA. All incubations were at room temperature. By biotinylated extracellular domain (FcRnECDHis-B2M-BIO) of recombinantly prepared FcRn (mouse, human or cynomolgus) diluted in PBST with 0.2% BSA, 5 μg / mL (100 μL / well) A 96-well plate was coated for 1 hour. Plates were washed 3 times with PBST and wild type IgG1-7D8 or IgG1-7D8-E354R diluted in 3-fold series (in PBST / 0.2% BSA, pH 6.0) was added and the plates were incubated for 1 hour. Plates were washed with PBST / 0.2% BSA, pH 6.0. Goat-anti-human IgG (Fab'2) -HRP (Jackson Immuno Research, catalog number: 109-035-097) diluted in PBST / 0.2% BSA, pH 6.0 was added and the plates were incubated for 1 hour. After washing, ABTS was added as a substrate and the plate was incubated for 30 minutes in the dark. Absorbance was read at 405 using an EL808 ELISA reader.
本研究におけるマウスは、Central Laboratory Animal Facility（Utrecht, The Netherlands）のバリアユニットに収容し、フィルタートップケージに入れた上で、水および飼料を自由に摂取させた。実験はすべて、ユトレヒト大学の動物倫理委員会によって承認された。 The mice in this study were housed in a barrier unit of the Central Laboratory Animal Facility (Utrecht, The Netherlands), placed in a filter top cage, and freely fed water and feed. All experiments were approved by the Animal Ethics Committee at Utrecht University.
7D8変異体のインビボでの薬物動態を分析するために、100μg（5mg／kg）の野生型7D8、IgG1-7D8-E354R、-S440KまたはK322AをSCIDマウス（C.B-17／IcrCrl-scid-BR, Charles-River）に静脈内注射した；1群当たりマウス3匹。 To analyze the in vivo pharmacokinetics of 7D8 mutants, 100 μg (5 mg / kg) of wild-type 7D8, IgG1-7D8-E354R, -S440K or K322A were used in SCID mice (CB-17 / IcrCrl-scid-BR, Charles-River) was injected intravenously; 3 mice per group.
抗体投与から10分後、4時間後、24時間後、2日後、7日後、14日後および21日後に、伏在静脈から血液試料50μLを収集した。血液をヘパリン含有バイアル中に収集し、10,000gで5分間遠心分離した。mAb濃度の決定まで血漿を-20℃で貯蔵した。 Blood samples of 50 μL were collected from the saphenous vein at 10 minutes, 4 hours, 24 hours, 2 days, 7 days, 14 days and 21 days after antibody administration. Blood was collected in heparin containing vials and centrifuged at 10,000g for 5 minutes. Plasma was stored at -20 ° C until determination of mAb concentration.
ヒトIgG濃度はサンドイッチELISAを用いて決定した。96ウェルMicrolon ELISAプレート（Greiner, Germany）に2μg／mLの濃度でコーティングしたマウスmAb抗ヒトIgG-κクローンMH16（#M1268、CLB Sanquin, Netherlands）を捕捉用抗体として用いた。2％ニワトリ血清を加えたPBSでプレートをブロックした後に、ELISA緩衝液（0.05％ Tween 20および2％ニワトリ血清を加えたPBS）中に系列希釈した試料を添加し、室温（RT）にて振盪機で1時間インキュベートした。その後、プレートをヤギ抗ヒトIgG免疫グロブリン（#109-035-098, Jackson, West Grace, PA）とともにインキュベートし、2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンズチアゾリン-6-硫酸）（ABTS；Roche, Mannheim, Germany）で現像した。吸光度はマイクロプレートリーダー（Biotek, Winooski, VT）で405nmで測定した。
Human IgG concentration was determined using a sandwich ELISA. Mouse mAb anti-human IgG-κ clone MH16 (# M1268, CLB Sanquin, Netherlands) coated at a concentration of 2 μg / mL on a 96-well Microlon ELISA plate (Greiner, Germany) was used as a capture antibody. After blocking the plate with PBS containing 2% chicken serum, add serially diluted samples in ELISA buffer (PBS containing 0.05
SCIDマウスを選んだ理由は、それらの血漿IgG濃度が低く、そのためIgGのクリアランスが比較的緩徐だからである。このことにより、Fcγ部分と新生児Fc受容体（FcRn）との結合の低下に起因するクリアランスの変化を検出する感度が非常に高いPKモデルが得られる。 The reason for choosing SCID mice is that their plasma IgG concentration is low and thus the clearance of IgG is relatively slow. This provides a very sensitive PK model for detecting clearance changes due to reduced binding between the Fcγ moiety and the neonatal Fc receptor (FcRn).
統計学的検定は、GraphPad PRISMバージョン4（Graphpad Software）を用いて行った。 Statistical tests were performed using GraphPad PRISM version 4 (Graphpad Software).
図12は、野生型HuMab-7D8およびIgG1-7D8-E345Rがいずれも、マウス、ヒトおよびカニクイザルのFcRnと良好に結合したことを示している。IgG1-7D8-E345Rの結合は、野生型7D8のそれよりも幾分良好であった。 FIG. 12 shows that both wild-type HuMab-7D8 and IgG1-7D8-E345R bound well to mouse, human and cynomolgus FcRn. The binding of IgG1-7D8-E345R was somewhat better than that of wild type 7D8.
図13は、経時的な血漿中濃度を示している。野生型HuMab-7D8とIgG1-7D8-E345R、-S440KまたはK322Aのいずれの間にも、経時的な血漿中濃度の変化（クリアランス）に関して差はみられなかった。 FIG. 13 shows plasma concentrations over time. There was no difference between the wild-type HuMab-7D8 and IgG1-7D8-E345R, -S440K, or K322A with respect to changes in plasma concentration (clearance) over time.
実施例14
Fc結合性表面タンパク質を発現する細菌に対するIgG抗体の殺菌活性を高めるためのFc-Fc安定化変異E345Rの使用
補体カスケード系は病原体に対する重要な宿主防御機構であり、病原体を認識する上で3種の異なる活性化経路に分けることができる：i）病原体に結合した抗体へのC1q結合によって活性化される抗体媒介性古典的経路、ii）レクチン、およびiii）補体系が病原体を直接認識し、抗体がなくても病原体によって誘発される、代替経路。この3つの経路は、C3切断およびC3b沈着の段階で集束する。微生物は、補体回避の複数の機序を生み出しており、その1つはプロテインAによって媒介される（Joiner Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42: 201-30；Foster Nat Rev Microbiol (2005) Dec;3(12) :948-58）。プロテインAは黄色ブドウ球菌の細胞壁で最初に同定され、IgGのFc領域に結合することがよく知られている（Deisenhofer et al., Biochem (1981) 20, 2361-70；Uhlen et al., J. Biol. Chem (1984) 259,1695-1702）。これまでのところ、プロテインAの抗食作用効果および黄色ブドウ球菌の病的作用におけるその役割は、プロテインAとIgGとの相互作用によって説明されており、当該相互作用は、好中球のFc受容体により認識される抗体の指向を誤ったものにする（Foster Nat Rev Microbiol (2005) Dec;3(12): 948-58）。
Example 14
Use of the Fc-Fc stabilizing mutation E345R to enhance the bactericidal activity of IgG antibodies against bacteria expressing Fc-binding surface proteins The complement cascade system is an important host defense mechanism against pathogens, It can be divided into different activation pathways: i) the antibody-mediated classical pathway activated by C1q binding to pathogen-bound antibodies, ii) lectins, and iii) the complement system directly recognizes pathogens Alternative pathways, induced by pathogens without antibodies. The three pathways converge at the stage of C3 cleavage and C3b deposition. Microorganisms have generated multiple mechanisms of complement evasion, one of which is mediated by protein A (Joiner Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42: 201-30; Foster Nat Rev Microbiol (2005) Dec; 3 (12): 948-58). Protein A was first identified in the cell wall of S. aureus and is well known to bind to the Fc region of IgG (Deisenhofer et al., Biochem (1981) 20, 2361-70; Uhlen et al., J Biol. Chem (1984) 259,1695-1702). So far, its anti-phagocytic effect and its role in the pathogenic action of S. aureus has been explained by the interaction between protein A and IgG, which is neutrophil Fc receptor The antibody directed by the body is misdirected (Foster Nat Rev Microbiol (2005) Dec; 3 (12): 948-58).
実施例11は、B細胞特異的IgG1抗体によって媒介されるCDCが競合性Fc結合ペプチドDCAWHLGELVWCT（SEQ ID NO:19）によって阻害されたことを示している。このペプチドはIgG Fc上のコンセンサス結合部位を標的とし、これはプロテインA、プロテインGおよびリウマチ因子の結合部位と一致する（Delano et al., Science 2000 Feb 18；287(5456): 1279-83）。これらのデータに基づき、プロテインAが媒介する細菌の補体回避機構は、Fcへの結合をめぐって競合することによって働いて、微生物特異的な抗体のFc-Fc相互作用の不安定化をもたらし、その結果として抗体媒介性補体活性化の阻害をもたらすと考えられている。さらに、実施例11は、CDCを増強するE345R変異を含有するB細胞特異的IgG1抗体が、野生型の親抗体よりも、競合性Fc結合ペプチドDCAWHLGELVWCT（SEQ ID NO:19）によるCDCの阻害に対する感受性が低いことも示している。これらの結果から微生物の表面で発現されるFc結合タンパク質について推定すると、E345R変異によるIgG1 Fc-Fc相互作用の安定化の増強が、プロテインAなどの微生物表面タンパク質によるFcへの結合の競合を介する病原体の回避戦略による補体阻害を受けにくい微生物特異的抗体につながると考えられる。その結果として、細菌を対象とするIgG抗体へのE345R変異の導入は、野生型の親抗体と比較して、細菌上でのC3b沈着の増大および殺菌活性の増強をもたらすと考えられる。 Example 11 shows that CDC mediated by B cell specific IgG1 antibody was inhibited by the competitive Fc binding peptide DCAWHLGELVWCT (SEQ ID NO: 19). This peptide targets the consensus binding site on IgG Fc, which is consistent with the binding sites for protein A, protein G and rheumatoid factor (Delano et al., Science 2000 Feb 18; 287 (5456): 1279-83) . Based on these data, the protein A-mediated bacterial complement escape mechanism works by competing for binding to Fc, resulting in destabilization of the Fc-Fc interaction of microorganism-specific antibodies, It is thought to result in inhibition of antibody-mediated complement activation. Furthermore, Example 11 shows that the B cell specific IgG1 antibody containing the E345R mutation that enhances CDC is more resistant to inhibition of CDC by the competitive Fc binding peptide DCAWHLGELVWCT (SEQ ID NO: 19) than the wild-type parent antibody. It also shows low sensitivity. Based on these results, the Fc binding protein expressed on the surface of microorganisms is estimated, and the stabilization of IgG1 Fc-Fc interaction by the E345R mutation is mediated by competition for binding to Fc by microbial surface proteins such as protein A. It is thought to lead to microorganism-specific antibodies that are less susceptible to complement inhibition by pathogen avoidance strategies. As a result, introduction of the E345R mutation into IgG antibodies directed against bacteria is thought to result in increased C3b deposition and enhanced bactericidal activity on bacteria compared to the wild-type parent antibody.
補体媒介性の細菌死滅に関するインビトロでの尺度として、好中球による食作用と、細菌表面におけるC3b沈着に一致する血漿中でのC3aの生成との両方を、以下に記載するようにして決定することができる。実際に、黄色ブドウ球菌表面におけるC3b沈着は食作用の増強をもたらし、細菌死滅と相関することが記載されている（Rooijakkers et. al., Nature Immunology 2005: 6,920-927）。 As an in vitro measure of complement-mediated bacterial killing, both phagocytosis by neutrophils and production of C3a in plasma consistent with C3b deposition on the bacterial surface are determined as described below can do. Indeed, it has been described that C3b deposition on the surface of S. aureus results in enhanced phagocytosis and correlates with bacterial killing (Rooijakkers et. Al., Nature Immunology 2005: 6,920-927).
指数的に増殖している細菌培養物を、0.1M炭酸塩緩衝液（pH 9.6）中で100μg／mLのFITCとともに37℃で1時間インキュベートすることにより、黄色ブドウ球菌をFITCで標識する。Ficoll勾配を用いてヒト多形核細胞（PMN）を単離する。FITC標識した細菌を、変異E345Rを伴うかまたは伴わない特異的抗体の濃度系列によってオプソニン化する。1×108個のオプソニン化FITC標識細菌を、補体の供給源としての25％ IgG枯渇血清の存在下で、総容積200μL中で、ヒトPMNとともに37℃で25分間、激しく震盪しながらインキュベートすることによって、インビトロで食作用を行わせる。細胞を固定して、BD FACS溶解溶液との室温での15分間のインキュベーションにより、赤血球を溶解させる。洗浄後に、食作用をFACSによって測定する。好中球集団を前方散乱および側方散乱ゲーティングによって選別し、食作用を好中球集団における平均蛍光として表す。または、補体活性化およびC3b沈着の尺度として、ELISAによって試料におけるC3a生成を測定する。 S. aureus is labeled with FITC by incubating exponentially growing bacterial cultures in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.6) with 100 μg / mL FITC for 1 hour at 37 ° C. Isolate human polymorphonuclear cells (PMN) using Ficoll gradient. FITC-labeled bacteria are opsonized by a specific antibody concentration series with or without the mutation E345R. Incubate 1x10 8 opsonized FITC-labeled bacteria with human PMN for 25 minutes at 37 ° C in vigorous shaking in the presence of 25% IgG-depleted serum as a complement source in a total volume of 200 μL To cause phagocytosis in vitro. Cells are fixed and red blood cells are lysed by incubation with BD FACS lysis solution for 15 minutes at room temperature. After washing, phagocytosis is measured by FACS. Neutrophil populations are sorted by forward and side scatter gating and phagocytosis is expressed as mean fluorescence in the neutrophil population. Alternatively, C3a production in the sample is measured by ELISA as a measure of complement activation and C3b deposition.
E345R変異を含有する黄色ブドウ球菌特異的抗体は、野生型の親抗体よりも高度に、補体活性化および好中球による食作用を誘導すると考えられる。そのような実験に用いうると考えられる抗体の一例は、ブドウ球菌の細胞壁に組み込まれているリポテイコ酸（LTA）を標的とするキメラ性モノクローナルIgG1パギバキシマブ（BSYX-A110；Biosynexus）である（Baker, Nat Biotechnol. 2006 Dec；24(12): 1491-3；Weisman et al., Int Immunopharmacol. 2009 May;9(5): 639-44）。 S. aureus-specific antibodies containing the E345R mutation are thought to induce complement activation and phagocytosis by neutrophils to a greater extent than the wild-type parent antibody. An example of an antibody that could be used in such experiments is the chimeric monoclonal IgG1 pagibaximab (BSYX-A110; Biosynexus) that targets lipoteichoic acid (LTA) incorporated into the cell wall of staphylococci (Baker, Nat Biotechnol. 2006 Dec; 24 (12): 1491-3; Weisman et al., Int Immunopharmacol. 2009 May; 9 (5): 639-44).
実施例15
2つの異なる治療モノクローナル抗体の混合物による結合を同時に受けた標的細胞にCDC活性化を限定するCDC阻害性変異の使用
実施例6に記載したように、CD20抗体7D8の変異K439EおよびS440Kは、モノクローナル抗体としてのCDCの活性を低下させた。これらの変異を含有する7D8抗体を混合することにより、CDCが回復した。すなわち、効率的なCDCは、両方の変異型抗体による結合を同時に受けた細胞に限定された。実施例10に記載したように、CD38抗体005の変異K439EおよびS440K は、モノクローナル抗体としてのCDCの活性を低下させた。これらの変異を含有する005抗体を混合することにより、CDCが回復した。すなわち、効率的なCDCは、両方の変異型抗体による結合を同時に受けた細胞に限定された。
Example 15
Use of CDC inhibitory mutations to limit CDC activation to target cells that were simultaneously bound by a mixture of two different therapeutic monoclonal antibodies As described in Example 6, mutations K439E and S440K of CD20 antibody 7D8 are monoclonal antibodies. As the CDC activity decreased. CDC was restored by mixing 7D8 antibody containing these mutations. That is, efficient CDC was limited to cells that received binding by both mutant antibodies simultaneously. As described in Example 10, mutations K439E and S440K of
効率的なCDCの誘導を、2つの特異的抗原を同時に発現する標的細胞に限定して、それらの複合発現をCDC誘導の選択性を向上させるために利用することは、有利である可能性がある。CDC誘導を、CD20およびCD38抗体による結合を同時に受けた細胞に限定するために、以下のようなCDC実験において、7D8-K439Eおよび005-S440Kの対、または7D8-S440Kおよび005-K439Eの対を別々に添加するか、または1：1で混合することが考えられる。0.1×106個のDaudi細胞またはRaji細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中で、非精製抗体または抗体混合物の濃度系列（0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg／mL）とともに、振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートする。次に、25μLの正常ヒト血清を補体の供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートする。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させる。10μLのヨウ化プロピジウムを添加し、細胞溶解をFACSによって決定する。7D8-K439E、005-S440K、7D8-S440Kおよび005-K439Eは、限定されたCDC活性を呈することが予想される。7D8-K439Eおよび005-S440Kの同時添加は、CD20およびCD38の両方を発現する細胞に対する効率的なCDCを特異的に回復させることが予想される。同様に、7D8-S440Kおよび005-K439Eの混合物も、CD20およびCD38の両方を発現する細胞に対する効率的なCDCを特異的に回復させることが予想される。
It may be advantageous to limit efficient CDC induction to target cells that simultaneously express two specific antigens and use their combined expression to improve the selectivity of CDC induction. is there. In order to limit CDC induction to cells that were simultaneously bound by CD20 and CD38 antibodies, a 7D8-K439E and 005-S440K pair, or a 7D8-S440K and 005-K439E pair, It can be added separately or mixed 1: 1. 0.1 × 10 6 Daudi cells or Raji cells in a round bottom 96 well plate in a total volume of 100 μL, a concentration series of unpurified antibody or antibody mixture (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0 μg / mL) for 15 minutes at room temperature on a shaker. Next, 25 μL of normal human serum is added as a complement source (
実施例16
2つの異なるモノクローナル抗体の混合物において、E345Rを補完性の阻害性変異K439EおよびS440Kと組み合わせることによる、増強されたCDCの特異性の増強
実施例6に記載したように、CD20抗体7D8の変異K439EおよびS440Kは、モノクローナル抗体としてのCDCの活性を低下させた。これらの変異を含有する7D8抗体を混合することにより、CDCが回復した。すなわち、効率的なCDCは、両方の変異型抗体による結合を同時に受けた細胞に限定された。実施例10に記載したように、CD38抗体005の変異K439EおよびS440K は、モノクローナル抗体としてのCDCの活性を低下させた。これらの変異を含有する005抗体を混合することにより、CDCが回復した。すなわち、効率的なCDCは、両方の変異型抗体による結合を同時に受けた細胞に限定された。
Example 16
Enhanced specificity of CDC by combining E345R with complementary inhibitory mutations K439E and S440K in a mixture of two different monoclonal antibodies As described in Example 6, mutations K439E of CD20 antibody 7D8 and S440K reduced the activity of CDC as a monoclonal antibody. CDC was restored by mixing 7D8 antibody containing these mutations. That is, efficient CDC was limited to cells that received binding by both mutant antibodies simultaneously. As described in Example 10, mutations K439E and S440K of
CDC誘導の増強を、2つの特異的抗原を同時に発現する標的細胞に限定して、それらの複合発現をCDC誘導の増強を選択的に向上させるために利用することは、有利である可能性がある。また、CDC誘導の増強を、同一の細胞表面抗原と2つの異なるエピトープで同時に結合するか、または2つの交差競合する類似もしくは同一のエピトープで結合する抗体である、少なくとも2つの異なる抗体の混合物による結合を同時に受けた標的細胞に限定することも、有利である可能性がある。 It may be advantageous to limit the enhancement of CDC induction to target cells that simultaneously express two specific antigens and to use their combined expression to selectively enhance the enhancement of CDC induction. is there. Also, the enhancement of CDC induction is due to a mixture of at least two different antibodies, which are antibodies that bind to the same cell surface antigen simultaneously at two different epitopes, or bind at two cross-competing similar or identical epitopes. It may also be advantageous to limit to target cells that have received binding simultaneously.
このように、CDC誘導の増強を、CD20およびCD38抗体による結合を同時に受けた細胞に限定するために、抗体7D8-E345R／K439E、7D8-E345R／S440K、005-E345R／S440Kおよび005-E345R／K439Eにおいて、CDC増強性変異E345RをCDC阻害性変異と組み合わせた。これらの抗体を、以下のようなCDC実験において、別々に添加するか、または1：1で混合した。0.1×106個のWien133細胞（Daudi細胞またはRaji細胞などの他の細胞種を用いてもよい）を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中で、非精製抗体の濃度系列（7D8-E345R／K439E、7D8-E345R／S440K、005-E345R／S440Kまたは005-E345R／K439Eについては3倍希釈で最終濃度0.056〜10,000ng／mLに）または抗体混合物（最終濃度0.01μg／mLのCD20抗体を0〜333ng／mLのCD38抗体の3倍希釈物と混合；または3.3μg／mLのCD38抗体を0.0056〜1,000ng／mLのCD20抗体の3倍希釈物と混合）とともに、振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、25μLの正常ヒト血清を補体の供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μLのヨウ化プロピジウムを添加して、細胞溶解をFACSによって決定した。
Thus, to limit the enhancement of CDC induction to cells that simultaneously received binding by CD20 and CD38 antibodies, antibodies 7D8-E345R / K439E, 7D8-E345R / S440K, 005-E345R / S440K and 005-E345R / In K439E, the CDC enhancing mutation E345R was combined with the CDC inhibitory mutation. These antibodies were added separately or mixed 1: 1 in CDC experiments as follows. 0.1 × 10 6 Wien133 cells (other cell types such as Daudi cells or Raji cells may be used) in a round bottom 96-well plate in a total volume of 100 μL (non-purified antibody concentration series ( For 7D8-E345R / K439E, 7D8-E345R / S440K, 005-E345R / S440K, or 005-E345R / K439E, a 3-fold dilution to a final concentration of 0.056-10,000 ng / mL) or antibody mixture (final concentration of 0.01 μg / mL) CD20 antibody mixed with a 3-fold dilution of 0-333 ng / mL CD38 antibody; or 3.3 μg / mL CD38 antibody mixed with a 3-fold dilution of 0.0056-1,000 ng / mL CD20 antibody) on a shaker For 15 minutes at room temperature. Next, 25 μL of normal human serum was added as a complement source (
005-E345R／K439E抗体または005-E345R／S440K抗体の濃度系列を、0.01μg／mLという固定濃度の7D8二重変異型抗体（図14Aから決定されるような、単一の薬剤としてWien133細胞に対するCDCが最小限である最大濃度）と混合して、005-E345R／K439E＋7D8-E345R／S440Kまたは005-E345R／S440K＋7D8-E345R／K439Eという補完的な組み合わせを作り出した。図14Cは、固定濃度の補完的な7D8-E345R／K439Eまたは7D8-E345R／S440K CD20抗体のそれぞれの存在下で、005二重変異体CD38抗体がCDCを用量依存的に誘導したことを示している。これらの補完的な組み合わせによるCDCの活性（図14C）は、単一の薬剤としての005-E345R単一変異体（エンハンサー）抗体と同等であった（図14B）。対照的に、無関係な抗体b12の存在下では、005-E345R／K439Eおよび005-E345R／S440Kはいずれも、試験した濃度系列においてほとんどCDCを示さなかった（図14Bに示されている単一の薬剤としての005-E345R／K439Eまたは005-E345R／S440Kと同等）。 Concentration series of 005-E345R / K439E antibody or 005-E345R / S440K antibody was used as a single agent against Wien133 cells as a single drug, as determined from a fixed concentration of 0.01 μg / mL 7D8 double mutant antibody (Figure 14A). Mixed with the highest concentration at which CDC is minimal) to produce complementary combinations of 005-E345R / K439E + 7D8-E345R / S440K or 005-E345R / S440K + 7D8-E345R / K439E. FIG. 14C shows that 005 double mutant CD38 antibody induced CDC in a dose-dependent manner in the presence of each of a fixed concentration of complementary 7D8-E345R / K439E or 7D8-E345R / S440K CD20 antibody. Yes. The activity of CDC with these complementary combinations (FIG. 14C) was comparable to the 005-E345R single mutant (enhancer) antibody as a single agent (FIG. 14B). In contrast, in the presence of irrelevant antibody b12, both 005-E345R / K439E and 005-E345R / S440K showed almost no CDC in the concentration series tested (single single as shown in FIG. 14B). Equivalent to 005-E345R / K439E or 005-E345R / S440K as a drug).
7D8-E345R／K439Eまたは7D8-E345R／S440K抗体の濃度系列を、3.3μg／mLという固定濃度の005二重変異型抗体（図14Bから決定されるように、単一の薬剤としてWien133細胞においてわずかな、ただし限定的なCDCを示す）と混合して、7D8-E345R／K439E＋005-E345R／S440Kまたは7D8-E345R／S440K＋005-E345R／K439Eという補完的な組み合わせを作り出した。図14Dは、補完的な005-E345R／K439Eまたは005-E345R／S440K CD38抗体のそれぞれの存在下で、細胞1個当たり数個にとどまる7D8二重変異型抗体分子に相当するような最も低い試験濃度であっても、7D8二重変異体CD20抗体がCDCを極めて効率的に誘導したことを示している。7D8および005抗体と補完的なK439EおよびS440K変異の混合物によって観察されたCDC増強への、細胞膜上でのFc尾部の密度の増大の寄与を否定するために、非補完的な変異との抗体の組み合わせについても試験した。図14Dは、非補完的な組み合わせが、補完的な組み合わせよりも効率的でないFc-Fc相互作用の結果として、補完的な組み合わせよりもはるかに弱いCDCの活性を示したことを示している。 A concentration series of 7D8-E345R / K439E or 7D8-E345R / S440K antibody was obtained in Wien133 cells as a single agent in a fixed concentration of 005 double mutant antibody (as determined from FIG. 14B) (But with limited CDC shown) to create complementary combinations of 7D8-E345R / K439E + 005-E345R / S440K or 7D8-E345R / S440K + 005-E345R / K439E. FIG. 14D shows the lowest test corresponding to several 7D8 double mutant antibody molecules per cell in the presence of each of the complementary 005-E345R / K439E or 005-E345R / S440K CD38 antibodies. Even at concentrations, it shows that the 7D8 double mutant CD20 antibody induced CDC very efficiently. To negate the contribution of increased Fc tail density on the cell membrane to the CDC enhancement observed by a mixture of the 7D8 and 005 antibodies and complementary K439E and S440K mutations, the antibody with non-complementary mutations Combinations were also tested. FIG. 14D shows that the non-complementary combination showed much weaker CDC activity than the complementary combination as a result of less efficient Fc-Fc interactions than the complementary combination.
これらのデータは、治療用抗体による（増強された）CDCの誘導を、2つの補完的な抗体の、この場合には異なる抗原特異性を有するものの混合物と同時に結合する細胞に限定することができ、それにより、両方の抗原の同時発現を要求することによって標的細胞特異性を高めうることを示唆している。 These data can limit the induction of (enhanced) CDC by therapeutic antibodies to cells that bind simultaneously with a mixture of two complementary antibodies, in this case having different antigen specificities. This suggests that target cell specificity can be increased by requiring co-expression of both antigens.
図14Aおよび14Bに見てとれるように、7D8-E345R／K439E、005-E345R／S440K、7D8-E345R／S440Kおよび005-E345R／K439Eは、7D8-E345R単独と比較して、限定的なCDC効率を呈した。さらに、7D8-E345R／K439Eおよび7D8-E345R／S440Kの混合物が、単一の薬剤としての野生型7D8抗体と比較して、効率の増強されたCDCを可能にしたことも見てとれる。同様に、005-E345R／K439Eおよび005-E345R／S440Kの混合物も、単一の薬剤としての野生型005抗体と比較して、効率の増強されたCDCを可能にしたことも観察された（データは提示せず）。
As seen in Figures 14A and 14B, 7D8-E345R / K439E, 005-E345R / S440K, 7D8-E345R / S440K and 005-E345R / K439E have limited CDC efficiency compared to 7D8-E345R alone. Was presented. It can also be seen that the mixture of 7D8-E345R / K439E and 7D8-E345R / S440K allowed enhanced efficiency CDC compared to wild type 7D8 antibody as a single agent. Similarly, it was also observed that a mixture of 005-E345R / K439E and 005-E345R / S440K allowed enhanced efficiency of CDC compared to wild-
実施例17
効率的なCDC活性化を、治療用に投与される抗体のみからなる抗体複合体に限定するためのCDC阻害性変異の使用
実施例6に記載したように、CD20抗体7D8の二重変異体K439E／S440Kは、K439EまたはS440K単一点変異体によって減じたCDC効率を回復させた。実施例10に記載したように、CD38抗体005の二重変異体K439E／S440Kは、K439EまたはS440K単一点変異体によって阻害されたCDC効率を回復させた。観察されたように、これらの単一点変異は、Fc：Fc境界面の対向面における変異していないアミノ酸とのFc：Fc相互作用を損なわせた。Fc：Fc境界面の対向面への代償変異の導入により、CDC効率が回復した。このように、効率的なCDCは、見たところ、両方の変異を含有する抗体からなる抗体複合体に限定された。
Example 17
Use of CDC inhibitory mutations to limit efficient CDC activation to antibody conjugates consisting only of therapeutically administered antibodies As described in Example 6, double mutant K439E of CD20 antibody 7D8 / S440K restored CDC efficiency reduced by K439E or S440K single point mutants. As described in Example 10, double mutant K439E / S440K of
別の例では、CDCの誘導を、治療用に投与された抗体のみからなる抗体複合体に限定させる。CDC誘導を、治療用にCD20抗体またはCD38抗体が結合した細胞のみに限定するためには、CDC阻害性変異K439EおよびS440Kを、抗体7D8-K439E／S440Kまたは005-K439E／S440Kの形で組み合わせることが考えられる。これらの抗体を、以下のように、非標的特異的なIgGの存在下または非存在下で、CDC実験において別々に投与することが考えられる。0.1×106個のDaudi細胞またはRaji細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中で、非精製抗体または抗体混合物の濃度系列（0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg／mL）とともに、振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートする。次に、25μLの正常ヒト血清を補体の供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートする。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させる。10μlのヨウ化プロピジウムを添加し、細胞溶解をFACSによって決定する。
In another example, the induction of CDC is limited to antibody conjugates consisting only of therapeutically administered antibodies. To limit CDC induction only to cells that are bound by CD20 or CD38 antibody for therapy, combine CDC inhibitory mutations K439E and S440K in the form of antibodies 7D8-K439E / S440K or 005-K439E / S440K Can be considered. These antibodies could be administered separately in a CDC experiment in the presence or absence of non-target specific IgG as follows. 0.1 × 10 6 Daudi cells or Raji cells in a round bottom 96 well plate in a total volume of 100 μL, a concentration series of unpurified antibody or antibody mixture (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0 μg / mL) for 15 minutes at room temperature on a shaker. Next, 25 μL of normal human serum is added as a complement source (
7D8-K439E／S440Kは野生型7D8抗体と同程度の効率でCDCを誘導することが予想される。7D8-K439E／S440Kへの非特異的IgGの添加は、この抗体についてのCDC誘導の効率には影響を及ぼさないと予想される。同様に、005-K439E／S440Kは野生型HuMAb 005と同程度の効率でCDCも可能にすると予想される。005-K439E／S440Kへの非特異的IgGの添加は、この抗体に関するCDC誘導の効率には影響を及ぼさないと予想される。
7D8-K439E / S440K is expected to induce CDC with the same efficiency as wild type 7D8 antibody. The addition of non-specific IgG to 7D8-K439E / S440K is not expected to affect the efficiency of CDC induction for this antibody. Similarly, 005-K439E / S440K is expected to enable CDC with similar efficiency as wild-
実施例18
CDC活性化の増強を、治療用に投与された抗体のみからなる抗体複合体に限定する、CDC阻害性変異の使用
実施例6に記載したように、CD20抗体7D8の二重変異体K439E／S440Kは、K439EまたはS440K単一点変異体によって減じたCDC効率を回復させた。実施例10に記載したように、CD38抗体HuMAb 005の二重変異体K439E／S440Kは、K439EまたはS440K単一点変異体によって阻害されたCDC効率を回復させた。観察されたように、これらの単一点変異は、Fc：Fc境界面の対向面における変異していないアミノ酸とのFc：Fc相互作用を損なわせた。Fc：Fc境界面の対向面への代償変異の導入により、CDC効率が回復した。このように、効率的なCDCは、見たところ、両方の変異を含有する抗体のみからなる抗体複合体に限定された。
Example 18
Use of CDC inhibitory mutations to limit the enhancement of CDC activation to antibody conjugates consisting only of therapeutically administered antibodies As described in Example 6, CD20 antibody 7D8 double mutant K439E / S440K Restored CDC efficiency reduced by K439E or S440K single point mutants. As described in Example 10, double mutant K439E / S440K of
別の例では、CDC誘導の増強を、治療用に投与された抗体のみからなる抗体複合体に限定させる。CDC刺激に利用されるFc：Fc相互作用を刺激する変異のスクリーニングおよび選択によって、関心対象の抗原標的に対して特異的でない血清中抗体とCDC誘導性抗体複合体を形成しうる変異を同定しうると考えられる。CDC誘導の増強を、治療用にCD20抗体またはCD38抗体が結合した細胞のみに限定するためには、CDC増強性変異E345Rを、抗体7D8-E345R／K439E／S440Kまたは005-E345R／K439E／S440Kの形でCDC阻害性変異と組み合わせることが考えられる。これらの抗体を、以下のように、非標的特異的なIgGの存在下または非存在下で、CDC実験において別々に投与することが考えられる。0.1×106個のDaudi細胞またはRaji細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中で、非精製抗体または抗体混合物の濃度系列（0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0μg／mL）とともに、振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートする。次に、25μLの正常ヒト血清を補体の供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートする。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させる。10μLのヨウ化プロピジウムを添加し、細胞溶解をFACSによって決定する。
In another example, the enhancement of CDC induction is limited to antibody conjugates consisting only of therapeutically administered antibodies. Screening and selecting mutations that stimulate Fc: Fc interactions used for CDC stimulation identify mutations that can form CDC-inducible antibody complexes with serum antibodies that are not specific for the antigenic target of interest. It is thought to be possible. In order to limit the enhancement of CDC induction to only cells that are bound by CD20 antibody or CD38 antibody for therapeutic use, the CDC enhancing mutation E345R can be treated with antibodies 7D8-E345R / K439E / S440K or 005-E345R / K439E / S440K. In combination with CDC inhibitory mutations. These antibodies could be administered separately in a CDC experiment in the presence or absence of non-target specific IgG as follows. 0.1 × 10 6 Daudi cells or Raji cells in a round bottom 96 well plate in a total volume of 100 μL, a concentration series of unpurified antibody or antibody mixture (0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0 μg / mL) for 15 minutes at room temperature on a shaker. Next, 25 μL of normal human serum is added as a complement source (
7D8-E345R／K439E／S440Kは、野生型HuMAb 7D8と比較して、効率の増強されたCDCを誘導することが予想される。7D8-E345R／K439E／S440Kに対する非特異的IgGの添加は、野生型7D8抗体との比較で、CDC誘導の効率に影響を及ぼさないと予想される。同様に、005-E345R／K439E／S440Kは、野生型005抗体と比較して、効率の増強されたCDCも可能にすると予想される。005-E345R／K439E／S440Kに対する非特異的IgGの添加は、野生型005抗体に比して、CDCの効率に影響を及ぼさないと予想される。
7D8-E345R / K439E / S440K is expected to induce enhanced efficiency CDC compared to wild-type HuMAb 7D8. Addition of non-specific IgG to 7D8-E345R / K439E / S440K is not expected to affect the efficiency of CDC induction compared to wild type 7D8 antibody. Similarly, 005-E345R / K439E / S440K is expected to allow for enhanced efficiency CDC as compared to
実施例19
CDCアッセイによって検出されたFc：Fc相互作用を介する抗体オリゴマー形成を刺激する変異を同定するための、変異体スクリーニングアプローチの使用
実施例6および10に記載したように、CD20およびCD38という2つの異なる標的抗原を認識する抗体についてのCDCを、前記抗原をさまざまなレベルで発現する複数の細胞株に対して増強する、アミノ酸変異が同定された。驚いたことに、単一点変異E345Rは、抗CD38抗体005に対するWien133細胞のCDC依存性細胞溶解をもたらすには十分であるが、これらの細胞を野生型IgG1フォーマットでのCDCによって溶解させることはできないことが実証された。
Example 19
Use of mutant screening approaches to identify mutations that stimulate antibody oligomerization via Fc: Fc interactions detected by CDC assays. As described in Examples 6 and 10, two different CD20 and CD38 Amino acid mutations have been identified that enhance CDC for antibodies that recognize the target antigen against multiple cell lines that express the antigen at various levels. Surprisingly, the single point mutation E345R is sufficient to result in CDC-dependent cytolysis of Wien133 cells against
Fc：Fc境界面上またはその周辺にある他の変異が、類似の様式でオリゴマー形成およびCDCを刺激しうる可能性もある。または、変異が、例えばFc：Fc相互作用をアロステリック性に誘導することによって、オリゴマー形成を間接的に刺激しうる可能性もある。 It is possible that other mutations on or around the Fc: Fc interface could stimulate oligomerization and CDC in a similar manner. Alternatively, mutations may be able to indirectly stimulate oligomerization, for example by inducing Fster: Fc interactions allosterically.
他のアミノ酸変異がFc媒介性抗体オリゴマー形成を刺激しうるか否かを決定するために、抗CD38IgG1-005変異体ライブラリーを、個別的に、さらには例えばFc：Fc境界面にまたがって相互作用するアミノ酸の対を選択するためのペアワイズ様式で混合するかの両方として、CDCアッセイを用いてスクリーニングした。しかしながら、同じ戦略を、他の抗体、例えば別のIgG1抗体またはIgG3抗体などに対して適用することもできる。 In order to determine whether other amino acid mutations can stimulate Fc-mediated antibody oligomerization, anti-CD38 IgG1-005 mutant libraries can be interacted individually and even across, for example, the Fc: Fc interface The CDC assay was used to screen both as a pairwise format for selecting amino acid pairs to be mixed. However, the same strategy can be applied to other antibodies, such as another IgG1 or IgG3 antibody.
表16に表記した位置での変異のフォーカスド・ライブラリーを作製した。変異は、Quikchange部位指定変異誘発キット（Stratagene, US）を用いて、IgG1-005 Fc領域に導入した。手短に述べると、所望のそれぞれの変異位置について、所望の場所で縮重コドンをコードする順方向および逆方向プライマーを用いて、IgG1m（f）アロタイプを有する005重鎖の完全長プラスミドDNAテンプレートを複製した。その結果得られたDNA混合物を、ソースプラスミドDNAを取り除くためにDpnIで消化した上で、大腸菌の形質転換のために用いた。その結果得られたコロニーをプールして培養し、これらのプールからプラスミドDNAを単離した上で、大腸菌に形質転換導入してクローン性コロニーを得た。その結果得られたコロニーから単離された変異型プラスミドDNAを、DNAシークエンシング（LGC genomics、Berlin, Germany）によって確かめた。プラスミドDNAからPCRによって発現カセットを増幅し、IgG1-005抗体の変異型重鎖および野生型軽鎖の両方を含有するDNA混合物を、293fectin（Invitrogen, US）を本質的には製造元による記載の通りに用いて、Freestyle HEK293F細胞（Invitrogen, US）に一過性にトランスフェクトした。抗体変異体を含有するトランスフェクト細胞の上清を収集した。変異型抗体上清を、以下のように、個別的におよびペアワイズ混合物の両方として、CDCアッセイでスクリーニングした。 A focused library of mutations at the positions indicated in Table 16 was generated. Mutations were introduced into the IgG1-005 Fc region using the Quikchange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, US). Briefly, for each desired mutation position, a 005 heavy chain full-length plasmid DNA template with IgG1m (f) allotype is generated using forward and reverse primers encoding degenerate codons at the desired location. Duplicated. The resulting DNA mixture was digested with DpnI to remove the source plasmid DNA and used for transformation of E. coli. The resulting colonies were pooled and cultured, and plasmid DNA was isolated from these pools and transformed into E. coli to obtain clonal colonies. Mutant plasmid DNA isolated from the resulting colonies was verified by DNA sequencing (LGC genomics, Berlin, Germany). Amplification of the expression cassette from plasmid DNA by PCR, and a DNA mixture containing both the mutated heavy and wild type light chains of the IgG1-005 antibody, essentially as described by the manufacturer, 293fectin (Invitrogen, US) Were used to transiently transfect Freestyle HEK293F cells (Invitrogen, US). The supernatant of the transfected cells containing the antibody variant was collected. Mutant antibody supernatants were screened in the CDC assay both individually and as a pairwise mixture as follows.
0.1×106個のDaudi細胞またはWien-133細胞（Raji細胞などの他の細胞種を用いてもよい）を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中で、1.0ug／mlの非精製抗体とともに、振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、30μLの正常ヒト血清を補体の供給源として添加し（最終濃度30％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μlのヨウ化プロピジウムを添加して、細胞溶解をFACSによって決定した。
0.1 × 10 6 Daudi cells or Wien-133 cells (other cell types such as Raji cells may be used) in a round bottom 96 well plate in a total volume of 100 μL, 1.0 ug / ml Preincubated with unpurified antibody for 15 minutes on a shaker at room temperature. Next, 30 μL of normal human serum was added as a complement source (
表16、表17および表18に記載された変異を、単一変異体として、または例えばFc：Fc境界面にまたがる変異に面する他の変異体と混合した上で、CDC効率によって検出されるオリゴマー形成をそれらが増強する能力に関して選別した。変異を、任意で、FcRn、プロテインAもしくはプロテインGの結合、ADCC、ADCP、またはFcドメインによって媒介される他のエフェクター機能をそれらが損なわない能力に関してさらにスクリーニングすることもできる。そのような点変異を1つのFcドメイン中に組み合わせることにより、オリゴマー形成およびCDC効率をさらに刺激することができる。 Mutations described in Table 16, Table 17 and Table 18 are detected by CDC efficiency as a single mutant or mixed with other mutants facing mutations across the Fc: Fc interface, for example Oligomer formation was screened for their ability to enhance. Mutations can optionally be further screened for their ability to not impair FcRn, protein A or protein G binding, ADCC, ADCP, or other effector functions mediated by the Fc domain. Combining such point mutations in one Fc domain can further stimulate oligomerization and CDC efficiency.
CD38抗体005に組み入れたCH2-CH3領域における変異を、Daudi細胞に対するCDCによって決定されるようなオリゴマー形成をそれらが阻害する能力について試験した。変異型抗体の溶解を野生型005と比較し、後者の溶解を100％に設定した。阻害に関するカットオフは溶解率66％以下に設定した。このようにして測定したところ、試験した変異のほとんどがCDCを阻害した（表16参照）。
Mutations in the CH2-CH3 region incorporated into
CD38抗体005に組み入れたCH2-CH3領域における変異を、Wien133細胞に対するCDCによって決定されるようなオリゴマー形成をそれらが増強する能力について試験した（表17）。野生型CD38抗体005は、Wien133細胞に対するCDCを誘導することができない。39％以上の細胞溶解を呈する変異体を増強性として評価した。全く予想外のことに、アミノ酸E345およびE430から得られた置換の事実上すべてが、CDCによる細胞溶解を刺激した。この結果を検証するために、アミノ酸E345、E430およびS440を部位指定変異誘発によってそれぞれの可能な変異に置換した上で、新たなヒト血清バッチを用いて、それらがWien133細胞のCDCによって決定されるようなオリゴマー形成を増強する能力に関して試験したところ、幾分より効率的な溶解が生じた（表18）。この場合にも、E345およびE430のすべての置換物が、Wien133細胞の効率的なCDCを誘導した。
Mutations in the CH2-CH3 region incorporated into
以下の好ましい変異が、Wien133細胞の39％以上の細胞溶解を引き起こした：P247G、I253V、S254L、Q311L、Q311W、E345A、E345C、E345D、E345F、E345G、E345H、E345I、E345K、E345L、E345M、E345N、E345P、E345Q、E345R、E345S、E345T、E345V、E345W、E345Y、D/E356G、D/E356R、T359R、E382L、E382V、Q386K、E430A、E430C、E430D、E430F、E430G、E430H、E430I、E430L、E430M、E430N、E430P、E430Q、E430R、E430S、E430T、E430V、E430W、E430Y、Y436I、S440YおよびS440W。 The following preferred mutations caused more than 39% cell lysis of Wien133 cells: P247G, I253V, S254L, Q311L, Q311W, E345A, E345C, E345D, E345F, E345G, E345H, E345I, E345K, E345L, E345M, E345N , E345P, E345Q, E345R, E345S, E345T, E345V, E345W, E345Y, D / E356G, D / E356R, T359R, E382L, E382V, Q386K, E430A, E430C, E430D, E430F, E430G, E430H, E430I, E430L, E430M , E430N, E430P, E430Q, E430R, E430S, E430T, E430V, E430W, E430Y, Y436I, S440Y and S440W.
（表１６）1.0μg／mlのIgG1-005抗体点変異体の存在下におけるdaudi細胞の溶解率。IgG1-005野生型は、これらの条件下で細胞の66％を溶解させた。別のアミノ酸に置換した個々の位置のそれぞれを左外欄に記している。個々の位置の横列に、それぞれの特定の位置で置換されたアミノ酸を記し、それに続いて、測定された溶解率を括弧内に示している。
（表１７）1.0μg／mlのIgG1-005抗体点変異体の存在下におけるWien-133細胞の溶解率。IgG1-005野生型は、これらの条件下で細胞の3％を溶解させた。別のアミノ酸に置換した個々の位置のそれぞれを左外欄に記している。個々の位置の横列に、それぞれの特定の位置で置換されたアミノ酸を記し、それに続いて、測定された溶解率を括弧内に示している。
（表１８）1.0μg／mlのIgG1-005抗体点変異体の存在下におけるWien-133細胞の溶解率。IgG1-005野生型は、これらの条件下で細胞の12％を溶解させた。別のアミノ酸に置換した個々の位置のそれぞれを左外欄に記している。個々の位置の横列に、それぞれの特定の位置で置換されたアミノ酸を記し、それに続いて、測定された溶解率を括弧内に示している。
実施例20
B細胞リンパ腫皮下異種移植モデルにおけるIgG1-7D8-E345Rのインビボ活性
IgG1-7D8-E345R抗体のインビボ抗腫瘍活性を、Raji-luc #2D1細胞による皮下モデルにおいて評価した。これらの細胞は細胞1個当たりほぼ300,000個のCD20分子（QIFIKIT分析による決定、データは提示せず）および高度の補体防御受容体発現を示す。10％コスミック仔ウシ血清（HyClone, Logan, UT）、ペニシリンおよびストレプトマイシン、1％（v／v）ピルビン酸ナトリウムならびに1μg／mLピューロマイシン（P-8833, Sigma, Zwijndrecht）を加えたRPMI中で細胞を培養した。細胞を対数増殖期（集密度およそ70％）に採取した。6〜11週齡の雌性SCIDマウス（C.B-17／IcrPrkdc-scid／CRL）を用いた（Charles-River）。第0日に、200μL PBS中にある5×106個のRaji-luc #2D1細胞を各マウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍の発育をキャリパー測定によってモニターした。平均腫瘍体積が100mm3となった時点（第7日前後）で、マウスを複数群（n＝9）に分けて、マウス1匹当たり抗体50μg（2.5mg／kg）の単回用量の腹腔内（i.p.）注射を行った。すべての抗体試料に無関係な抗体b12を加えて、総抗体濃度が0.5mg／mLになるようにした。処置群を表18に示している。処置から7日後に、抗体投与の適正さを確かめる目的でヒトIgG血清レベルを決定するために、血液試料を入手した。腫瘍の測定は、1500mm3というエンドポイント腫瘍体積に達するまで、腫瘍が潰瘍化を示すまで、または重篤な臨床徴候が観察されるまで、キャリパー（PLEXX）を用いて毎週少なくとも2回行った。
Example 20
In vivo activity of IgG1-7D8-E345R in a B cell lymphoma subcutaneous xenograft model
The in vivo antitumor activity of IgG1-7D8-E345R antibody was evaluated in a subcutaneous model with Raji-luc # 2D1 cells. These cells show approximately 300,000 CD20 molecules per cell (determined by QIFIKIT analysis, data not shown) and a high degree of complement protective receptor expression. Cells in RPMI with 10% cosmic calf serum (HyClone, Logan, UT), penicillin and streptomycin, 1% (v / v) sodium pyruvate and 1 μg / mL puromycin (P-8833, Sigma, Zwijndrecht) Was cultured. Cells were harvested at logarithmic growth phase (confluence approximately 70%). Female SCID mice (CB-17 / IcrPrkdc-scid / CRL) 6-11 weeks old were used (Charles-River). On
（表１８）処置群および投与
図15Aは、全群がまだ揃っていた第22日での平均腫瘍増殖を示している。野生型抗体IgG1-7D8は、陰性対照抗体IgG1-b12と比較して腫瘍増殖を幾分阻害したが、これは統計学的に有意ではなかった。陰性対照抗体IgG1-b12と比較して腫瘍増殖を有意に阻害したのは、IgG1-7D8-E345Rのみであった（一元配置ANOVA分析でp＜0.01）。
FIG. 15A shows the mean tumor growth at
図15Bは、腫瘍サイズが700mm3よりも小さいマウスのパーセンテージに関するKaplan-Meierプロットを示している。陰性対照抗体IgG1-b12を投与したマウスと比較して、IgG1-7D8-E345R抗体を投与したマウスでは腫瘍形成が有意に遅延した（Mantel-Cox分析でp＜0.01）が、野生型IgG1-7D8を投与したマウスではそうではなかった。 FIG. 15B shows a Kaplan-Meier plot for the percentage of mice with tumor size smaller than 700 mm 3 . Tumor formation was significantly delayed in mice administered IgG1-7D8-E345R antibody (p <0.01 by Mantel-Cox analysis) compared to mice administered negative control antibody IgG1-b12, but wild type IgG1-7D8 This was not the case in mice receiving.
これらのデータは、E345R変異がCD20抗体7D8のインビボ抗腫瘍活性を増強したことを示している。 These data indicate that the E345R mutation enhanced the in vivo antitumor activity of the CD20 antibody 7D8.
実施例21
B細胞リンパ腫皮下異種移植モデルにおけるIgG1-005-E345Rのインビボ活性
IgG1-005-E345R抗体のインビボ抗腫瘍活性を、Raji-luc #2D1細胞による皮下モデルにおいて評価した。これらの細胞は細胞1個当たりほぼ150,000個のCD38分子（QIFIKIT分析による決定、データは提示せず）および高度の補体防御受容体発現を示す。腫瘍接種および測定に関するプロトコールは、実施例20に記載したものと基本的には同じである。第0日に、200μL PBS中にある5×106個のRaji-luc #2D1細胞をSCIDマウスの右側腹部に皮下注射した。平均腫瘍体積が100mm3となった時点（第7日前後）で、マウスを複数群（n＝7）に分けて、マウス1匹当たり抗体500μg（25mg／kg）の単回用量の腹腔内（i.p.）注射を行った。処置群を表19に示している。大きな苦痛を避けるために、腫瘍の測定は、1500mm3というエンドポイント腫瘍体積に達するまで、腫瘍が潰瘍化を示すまで、または重篤な臨床徴候が観察されるまで行った。
Example 21
In vivo activity of IgG1-005-E345R in B cell lymphoma subcutaneous xenograft model
The in vivo anti-tumor activity of the IgG1-005-E345R antibody was evaluated in a subcutaneous model with Raji-luc # 2D1 cells. These cells show approximately 150,000 CD38 molecules per cell (determined by QIFIKIT analysis, data not shown) and high complement defense receptor expression. The protocol for tumor inoculation and measurement is basically the same as that described in Example 20. On
図16Aは、全群がまだ揃っていた第21日での平均腫瘍増殖を示している。野生型抗体IgG1-005は腫瘍増殖を幾分阻害したが、これは統計学的に有意ではなかった。第21日において無関係な抗体対照と比較して腫瘍増殖を有意に阻害したのは、IgG1-005-E345Rのみであった（一元配置ANOVA分析でp＜0.05）。 FIG. 16A shows the mean tumor growth on day 21 when all groups were still in place. Wild type antibody IgG1-005 somewhat inhibited tumor growth, which was not statistically significant. Only IgG1-005-E345R significantly inhibited tumor growth compared to an irrelevant antibody control on day 21 (p <0.05 by one-way ANOVA analysis).
図16Bは、腫瘍サイズが500mm3よりも小さいマウスのパーセンテージに関するKaplan-Meierプロットを示している。IgG1-005-E345R抗体を投与したマウスでは、陰性対照抗体IgG1-b12（Mantel-Cox分析でp＜0.001）または野生型IgG1-005を投与したマウス（p＜0.05）と比較して、腫瘍形成が有意に遅延した。 FIG. 16B shows a Kaplan-Meier plot for the percentage of mice with tumor size smaller than 500 mm 3 . Tumor formation in mice treated with IgG1-005-E345R antibody compared to mice administered negative control antibody IgG1-b12 (p <0.001 in Mantel-Cox analysis) or wild-type IgG1-005 (p <0.05) Was significantly delayed.
これらのデータは、CD38抗体005におけるE345R変異がインビボ抗腫瘍活性の増強をもたらしたことを示している。
These data indicate that the E345R mutation in
（表１９）処置群および投与
実施例22
一価標的結合はE345R抗体のCDC活性をさらに増強する
b12結晶構造において観察されるIgG1ヘキサマー環の分子表面は、ヘキサマー環内の各IgGについて、2つのC1q結合部位のうち一方は環構造に対して上向きであって、もう一方の部位は下向きであり、さらに各抗体の1つのFabアームは上方に配向し、1つは下方に配向していて、その結果、抗原結合にかかわるのは抗体1つ当たり1つのFabアームのみであることを明らかに示しており、このことはヘキサマー抗体環における抗体分子1つ当たりの結合が一価であることを示唆する。一価であることにより、抗体が抗原結合に際してヘキサマー化に適合した配向をとっている可能性がある。この仮説を検証するために、E345R変異を有する二重特異性CD38／EGFR抗体のCDC活性を、この二重特異性抗体がCD38を介して一価でしか結合することができないCD38陽性でEGFR陰性のWien133細胞において試験して、同じくE345R変異を有する二価結合CD38抗体のCDC活性と比較した。ヒトモノクローナル抗体HuMax-EGFr（2F8、WO 2004/056847号に記載）を、この実施例に記載したEGFR抗体の基礎になるものとして用いた。
Example 22
Monovalent target binding further enhances CDC activity of E345R antibody
The molecular surface of the IgG1 hexamer ring observed in the b12 crystal structure is that for each IgG in the hexamer ring, one of the two C1q binding sites is upward with respect to the ring structure and the other is downward. Furthermore, one Fab arm of each antibody is oriented upwards, one is oriented downwards, so that it clearly shows that only one Fab arm per antibody is involved in antigen binding. This suggests that the binding per antibody molecule in the hexamer antibody ring is monovalent. By being monovalent, the antibody may have an orientation suitable for hexamerization upon antigen binding. To test this hypothesis, the CDC activity of the bispecific CD38 / EGFR antibody with the E345R mutation was shown to be CD38 positive and EGFR negative that the bispecific antibody can only bind monovalently through CD38. Were tested in Wien133 cells and compared to the CDC activity of a bivalent binding CD38 antibody, also carrying the E345R mutation. The human monoclonal antibody HuMax-EGFr (2F8, described in WO 2004/056847) was used as the basis for the EGFR antibody described in this example.
二重特異性抗体は、DuoBody（商標）プラットフォームにより、すなわち、WO 2011/147986号に記載されたような2-MEA誘導性Fabアーム交換により、インビトロで作製した。この方法の基礎となっているのは、特定のアッセイ条件下でヘテロダイマーの形成を促進する補完的なCH3ドメインの使用である。この方法による二重特異性抗体の生成が可能になるように、CH3ドメインにある種の変異を保有するIgG1分子を作製した：親IgG1抗体の一方にはF405L変異があり、もう一方の親IgG1抗体にはK409R変異がある。二重特異性抗体を作製するために、これらの2つの親抗体を、各抗体が最終濃度0.5mg／mLとなるように、総容積100μLのTE中にて、25mM 2-メルカプトエチルアミン-HCl（2-MEA）とともに、37℃で90分間インキュベートした。この還元反応は、スピンカラム（Microcon遠心濾過器, 30k, Millipore）を製造元のプロトコールを用いることによって還元剤2-MEAが除去されると停止する。 Bispecific antibodies were generated in vitro by the DuoBody ™ platform, ie by 2-MEA-induced Fab arm exchange as described in WO 2011/147986. Underlying this method is the use of complementary CH3 domains that promote heterodimer formation under specific assay conditions. In order to be able to generate bispecific antibodies by this method, an IgG1 molecule carrying certain mutations in the CH3 domain was generated: one of the parent IgG1 antibodies has the F405L mutation and the other parent IgG1 The antibody has a K409R mutation. To make bispecific antibodies, these two parent antibodies were combined with 25 mM 2-mercaptoethylamine-HCl (in a total volume of 100 μL of TE so that each antibody had a final concentration of 0.5 mg / mL). 2-MEA) and incubated at 37 ° C. for 90 minutes. The reduction reaction is stopped when the reducing agent 2-MEA is removed by using a spin column (Microcon centrifugal filter, 30k, Millipore) using the manufacturer's protocol.
CDCアッセイのために、0.1×106個のWien133細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中で、抗体の濃度系列（0.01〜10.0μg／mL）とともに振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、25μLの正常ヒト血清を補体の供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μLのヨウ化プロピジウムを添加して、細胞溶解をFACSによって決定した。
For the CDC assay, 0.1 × 10 6 Wien133 cells were placed in a round-bottom 96-well plate in a total volume of 100 μL at room temperature on a shaker with antibody concentration series (0.01-10.0 μg / mL). For 15 minutes. Next, 25 μL of normal human serum was added as a complement source (
図17は、予想された通り、E345R変異を有しないCD38抗体（野生型IgG1-005およびIgG-b12-K409R × IgG1-005-F405L）が、Wien133細胞の致死を誘導しなかったことを示している。同じく、EGFR陰性Wien133細胞と結合しなかったEGFR抗体IgG1-2F8-E345R／F405L（データは提示せず）も、予想された通り、CDCを誘導しなかった。K409R変異の導入は、IgG1-005-E345R抗体がWien133細胞においてほぼ60％の致死を誘導する能力（実施例10に記載）に影響を及ぼさなかった。興味深いことに、CD38陽性でEGFR陰性のWien133細胞において一価でしか結合することができない二重特異性CD38／EGFR抗体であるIgG1-005-E345R／K409R × IgG1-2F8-E345R／F405Lは、最大CDC致死の増強を示した（ほぼ60％の致死からほぼ100％に）。 FIG. 17 shows that, as expected, CD38 antibodies without the E345R mutation (wild type IgG1-005 and IgG-b12-K409R × IgG1-005-F405L) did not induce lethality of Wien133 cells. Yes. Similarly, EGFR antibody IgG1-2F8-E345R / F405L (data not shown) that did not bind to EGFR negative Wien133 cells did not induce CDC, as expected. The introduction of the K409R mutation did not affect the ability of the IgG1-005-E345R antibody to induce nearly 60% lethality in Wien133 cells (described in Example 10). Interestingly, IgG1-005-E345R / K409R x IgG1-2F8-E345R / F405L, a bispecific CD38 / EGFR antibody that can only bind monovalently in CD38 positive and EGFR negative Wien133 cells, is the largest It showed enhanced CDC lethality (from nearly 60% lethality to almost 100%).
これらのデータは、一価標的化により、CDC増強性E345R変異を含有する抗体の最大致死能力をさらに増強しうることを示している。その上、これらのデータは、増強性CDC活性によって測定されるようなE345Rオリゴマー形成増強性変異を、DuoBodyなどの他の抗体フォーマットにも適用しうることを示している。 These data indicate that monovalent targeting can further enhance the maximum lethality of antibodies containing the CDC-enhancing E345R mutation. In addition, these data indicate that E345R oligomerization enhancing mutations as measured by enhanced CDC activity can be applied to other antibody formats such as DuoBody.
実施例23
オリゴマー形成増強性E345R変異は、DuoBody（商標）などの他の抗体フォーマットに適用しうる
E345R変異の効果を、DuoBodyフォーマットの二重特異性抗体において試験した。CDCアッセイを、CD20陽性でCD38陽性のWien133細胞およびRaji細胞においてCD20／CD38二重特異性抗体を用いて行った。
Example 23
The oligomerization enhancing E345R mutation may be applied to other antibody formats such as DuoBody ™
The effect of the E345R mutation was tested on a bispecific antibody in DuoBody format. CDC assays were performed with CD20 / CD38 bispecific antibodies in CD20 positive and CD38 positive Wien133 and Raji cells.
二重特異性抗体を、実施例22に記載した通りに作製した。CDCアッセイのために、0.1×106個のWien133細胞またはRaji細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中で、抗体の濃度系列（0.01〜30.0μg／mL）とともに振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、25μLの正常ヒト血清を補体の供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μLのヨウ化プロピジウムを添加して、細胞溶解をFACSによって決定した。
Bispecific antibodies were made as described in Example 22. For CDC assay, 0.1 × 10 6 Wien133 cells or Raji cells were placed on a shaker with antibody concentration series (0.01-30.0 μg / mL) in a round bottom 96-well plate in a total volume of 100 μL. For 15 minutes at room temperature. Next, 25 μL of normal human serum was added as a complement source (
図18は、E345R変異の導入により、Wien 133細胞（図18A）およびRaji細胞（図18B）に対する二重特異性IgG1-005-F405L × IgG1-7D8-K409R抗体のCDCが増強されたことを示している。これらのデータは、E345Rオリゴマー形成増強性変異を、CDC活性を増強するために他の抗体フォーマットに適用しうることを示している。 Figure 18 shows that the introduction of the E345R mutation enhanced CDC of the bispecific IgG1-005-F405L x IgG1-7D8-K409R antibody on Wien 133 cells (Figure 18A) and Raji cells (Figure 18B). ing. These data indicate that E345R oligomerization enhancing mutations can be applied to other antibody formats to enhance CDC activity.
実施例24
E345RはEGFR抗体2F8によるCDCを復旧させ、一価標的結合によってそれをさらに増強することができる
実施例6、10および26に記載したように、E345Rは種々の血液腫瘍標的を認識する抗体（CD20およびCD38）についてのCDCを増強するか、または復旧させた。この分析を固形腫瘍抗原にも拡張するために、EGFR抗体2F8のCDC能力に対するE345Rの効果を、A431類表皮癌細胞において試験した。さらに、E345R媒介性CDC誘導に対する一価EGFR標的化の効果についても、EGFR陽性でCD20陰性のA431細胞において二重特異性EGFR×CD20抗体（IgG1-2F8-E345R／F405L × IgG1-7D8-E345R／K409R）を用いて試験した。
Example 24
E345R can restore CDC by EGFR antibody 2F8 and further enhance it by monovalent target binding As described in Examples 6, 10 and 26, E345R is an antibody that recognizes various blood tumor targets (CD20 And CDC for CD38) were enhanced or restored. To extend this analysis to solid tumor antigens, the effect of E345R on the CDC ability of EGFR antibody 2F8 was tested in A431 epidermoid carcinoma cells. Furthermore, the effect of monovalent EGFR targeting on E345R-mediated CDC induction was also demonstrated in bispecific EGFR x CD20 antibodies (IgG1-2F8-E345R / F405L x IgG1-7D8-E345R /) in EGFR positive and CD20 negative A431 cells. K409R).
二重特異性抗体を、実施例22に記載した通りに作製した。CDCアッセイのために、5×106個／mLのA431細胞を、100μCiの51Crによって37℃で1時間標識した。細胞をPBSで3回洗浄し、培地中に1×105個／mLの濃度で再懸濁させた。25,000個の標識細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中で、非精製抗体の濃度系列（3倍希釈で0〜30μg／mL）とともに室温で15分間インキュベートした。次に、50μLの正常ヒト血清希釈物を補体の供給源として添加し（最終濃度25％）、37℃のインキュベーター内で1時間インキュベートした。細胞を遠心沈降させ（300×gで3分間）、25μLの上清を、白色96ウェルoptiplate（PerkinElmer）中の100μLマイクロシンチ（microscint）に添加して、振盪機（750rpm）上での15分間のインキュベーションを行った。51Cr放出を、シンチレーションカウンターにて1分間当たりのカウント数（cpm）として決定した。最大溶解（100％）は、Triton X-100で処理した細胞の上清中で測定された51Crレベルによって決定した。自然発生的な溶解は、抗体を伴わずにインキュベートした細胞の上清中で測定された51Crレベルによって決定した。特異的細胞溶解は、式：特異的溶解＝100×（試料cpm − 自然発生的cpm）／（最大cpm − 自然発生的cpm）。
Bispecific antibodies were made as described in Example 22. For the CDC assay, 5 × 10 6 cells / mL A431 cells were labeled with 100 μCi 51 Cr for 1 hour at 37 ° C. Cells were washed 3 times with PBS and resuspended in media at a concentration of 1 × 10 5 cells / mL. 25,000 labeled cells were incubated for 15 minutes at room temperature in a round bottom 96-well plate with a concentration series of unpurified antibody (0-30 μg / mL at 3-fold dilution) in a total volume of 100 μL. Next, 50 μL of normal human serum dilution was added as a complement source (
図19は、IgG1-2F8-E345R／F405LはA431細胞をCDCによって溶解させうるが、一方、野生型2F8はA431細胞を死滅させることができないことを示している。これらのデータは、E345R変異の導入によってEGFR抗体2F8においてCDC活性を復旧させうることを示している。このことは、CDC増強性E345R変異の適用可能範囲を、固形腫瘍抗原を標的とする抗体にも拡張しうる可能性を示すものである。 FIG. 19 shows that IgG1-2F8-E345R / F405L can lyse A431 cells by CDC, whereas wild type 2F8 cannot kill A431 cells. These data indicate that CDC activity can be restored in EGFR antibody 2F8 by introducing E345R mutation. This indicates the possibility that the applicable range of the CDC-enhanced E345R mutation can be extended to antibodies targeting solid tumor antigens.
二重特異性EGFR×CD20抗体であるIgG-2F8-E345R／F405L × IgG1-7D8-E345R／K409Rは、EGFR陽性でCD20陰性のA431細胞において、CDCのさらなる増強を示した。 The bispecific EGFR × CD20 antibody IgG-2F8-E345R / F405L × IgG1-7D8-E345R / K409R showed further enhancement of CDC in EGFR positive and CD20 negative A431 cells.
これらのデータは、実施例22に記載されたCD38結合抗体に関して仮定したように、一価であることにより、Fc-Fc相互作用の形成およびその後のCDC誘導が助長されるという仮説をさらに裏づけるものである。 These data further support the hypothesis that monovalence facilitates the formation of Fc-Fc interactions and subsequent CDC induction as hypothesized for the CD38 binding antibody described in Example 22. It is.
実施例25
E345Rは、CD38抗体003ならびにCD20抗体11B8およびリツキシマブによるCDCを増強するか、または復旧させる
実施例6、10および24に記載したように、E345Rは、前記抗原をさまざまなレベルで発現する複数の細胞株に対して試験されたように、いくつかの抗体のCDC活性を、異なる標的特異性（CD20、CD38およびEGFR）で増強するか、または誘導する。このことから、E345R変異の導入は、既存の抗体についてのCDCを増強するかまたは復旧させるための一般的な機序であると判断された。このことをさらに裏づけるために、CDCに対するE345R変異の効果を、Daudi細胞およびWien133細胞に対する固有のCDC活性がさまざまであるさらなる抗体：WO 2006/099875号に記載されたCD38抗体003、ならびにWO 2005/103081号に記載されたCD20抗体リツキシマブ（I型）および11B8（II型）に関しても試験した。CD20抗体は2つのサブグループに分けることができる（Beers et al. Seminars in Hematology 47, (2) 2010, 107-114）。I型CD20抗体は、原形質膜中のCD20分子を脂質ラフト中に再分布させ、そのことで抗体Fc領域をクラスター化してC1q結合を向上させることによって、補体を活性化してCDCを誘発する顕著な能力を呈する。II型CD20抗体はCD20分布を明らかには変化させず、それに付随するクラスター化も伴わず、それらはCDCへの効果が比較的低い。
Example 25
E345R enhances or restores CDC by CD38 antibody 003 and CD20 antibody 11B8 and rituximab As described in Examples 6, 10 and 24, E345R is a plurality of cells that express the antigen at various levels. As tested against strains, the CDC activity of some antibodies is enhanced or induced with different target specificities (CD20, CD38 and EGFR). From this, the introduction of the E345R mutation was judged to be a general mechanism for enhancing or restoring CDC for existing antibodies. To further support this, the effect of the E345R mutation on CDC was further investigated with additional antibodies with varying intrinsic CDC activity on Daudi and Wien133 cells: CD38 antibody 003 described in WO 2006/099875, and WO 2005 / The CD20 antibodies rituximab (type I) and 11B8 (type II) described in 103081 were also tested. CD20 antibodies can be divided into two subgroups (Beers et al. Seminars in Hematology 47, (2) 2010, 107-114). Type I CD20 antibodies activate complement and induce CDC by redistributing CD20 molecules in the plasma membrane into lipid rafts, thereby clustering the antibody Fc region and improving C1q binding Exhibits remarkable ability. Type II CD20 antibodies do not appreciably change the CD20 distribution and are not associated with clustering, which are relatively ineffective on CDC.
0.1×106個のDaudi細胞またはRaji細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積70μL中で、非精製抗体の濃度系列（0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0μg／mL）とともに、振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、30μLの正常ヒト血清をC1qの供給源として添加し（最終濃度30％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μLのヨウ化プロピジウムを添加して、細胞溶解をFACSによって決定した。
0.1 × 10 6 Daudi cells or Raji cells in a round bottom 96-well plate in a total volume of 70 μL, a concentration series of unpurified antibodies (0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 , 10.0 μg / mL) for 15 minutes at room temperature on a shaker. Next, 30 μL of normal human serum was added as a source of C1q (
図20は、E345R変異により、試験した抗体のすべてについて、（A）Daudi細胞および（B）Wien133細胞の両方に対するCDCが増強されたことを示している。興味深いことに、用いた濃度ではすべての抗体が野生型フォーマットではCDCを誘導しなかったが、E345R変異の導入後にはCDCを効率的に誘導した：Daudi細胞に対するCD38 mAb 003およびCD20 II型mAb 11B8、ならびにWien133細胞に対するCD38 mAb 005および003ならびにCD20 II型mAb 11B8。これらのデータは、抗体オリゴマー形成の増強、より具体的にはE345R変異の導入によるそれが、既存の抗体によるCDCを増強させるため、または復旧させるための一般的な機序であることを示唆する。
FIG. 20 shows that the E345R mutation enhanced CDC on both (A) Daudi and (B) Wien133 cells for all tested antibodies. Interestingly, all antibodies did not induce CDC in the wild-type format at the concentrations used, but efficiently induced CDC after the introduction of the E345R mutation: CD38 mAb 003 and CD20 type II mAb 11B8 on Daudi cells And
実施例26
E345Rは組織因子抗体の細胞内移行を増強する
増強されたオリゴマー形成によって抗体細胞内移行の増強が誘導されるか否かについて検討するために、野生型およびE345R変異型の組織因子（TF）抗体の共局在試験を、リソソームマーカーLAMP1を用いて、共焦点顕微鏡検査によって行った。
Example 26
E345R enhances intracellular translocation of tissue factor antibodies. To investigate whether enhanced oligomerization induces enhanced intracellular translocation of antibodies, wild-type and E345R mutant tissue factor (TF) antibodies Was co-localized by confocal microscopy using the lysosomal marker LAMP1.
SK-OV-3細胞を、標準的な組織培養培地中にて、カバーグラス（厚さ1.5ミクロン、Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Germany）上で37℃で1日間増殖させた。リソソーム活性をブロックするために、細胞を50μg／mLロイペプチン（Sigma）とともに細胞を1時間プレインキュベートし、その後に10μg／mLの組織因子（TF）抗体（WO 2010/066803号）を添加した。細胞を37℃でさらに1時間、3時間または16時間インキュベートした。その後に、細胞をPBSで洗浄し、4％ ホルムアミド（Klinipath）とともに室温（RT）で30分間インキュベートした。スライドをブロッキング緩衝液（0.1％サポニン［Roche］および2％ BSA［Roche］を加えたPBS）で洗浄して、ホルムアミドを失活させるために20mM NH4Clを含むブロッキング緩衝液とともに20分間インキュベートした。スライドをブロッキング緩衝液で再び洗浄して、リソソームLAMP1を同定するためのマウス-抗ヒトCD107a-APC（BD Pharmingen）とTF抗体を同定するためのヤギ-抗ヒトIgG-FITC（Jackson）との混合液とともに、室温で45分間インキュベートした。スライドをブロッキング緩衝液で再び洗浄した上で、20μLのマウント用培地（6gのグリセロール［Sigma］および2.4gのMowiol 4-88［Omnilabo］を6mLの蒸留水に添加して、それに12mLの0.2M Tris［Sigma］ pH8.5を添加し、その後に50〜60℃で10分間のインキュベーションを行ったもの；マウント用培地は定量分取して-20℃で貯蔵した）を用いて顕微鏡スライドに一晩かけてマウントした。63倍の1.32-0.6油浸対物レンズおよびLAS-AFソフトウエアを装備したLeica SPE-II共焦点顕微鏡（Leica Microsystems）を用いて、スライドを撮像した。 SK-OV-3 cells were grown in standard tissue culture media for 1 day at 37 ° C. on coverslips (1.5 microns thick, Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Germany). To block lysosomal activity, cells were preincubated with 50 μg / mL leupeptin (Sigma) for 1 hour, after which 10 μg / mL tissue factor (TF) antibody (WO 2010/066803) was added. Cells were incubated at 37 ° C. for an additional hour, 3 hours or 16 hours. Subsequently, the cells were washed with PBS and incubated with 4% formamide (Klinipath) for 30 minutes at room temperature (RT). Slides were washed with blocking buffer (PBS with 0.1% saponin [Roche] and 2% BSA [Roche]) and incubated for 20 minutes with blocking buffer containing 20 mM NH 4 Cl to inactivate formamide . Slides are washed again with blocking buffer and mixed with mouse-anti-human CD107a-APC (BD Pharmingen) to identify lysosomal LAMP1 and goat-anti-human IgG-FITC (Jackson) to identify TF antibodies The solution was incubated for 45 minutes at room temperature. The slides were washed again with blocking buffer, and 20 μL of mounting medium (6 g glycerol [Sigma] and 2.4 g Mowiol 4-88 [Omnilabo] was added to 6 mL distilled water, to which 12 mL 0.2 M was added. Tris [Sigma] pH 8.5, followed by incubation at 50-60 ° C for 10 minutes; mount medium was quantified and stored at -20 ° C). I mounted it overnight. Slides were imaged using a Leica SPE-II confocal microscope (Leica Microsystems) equipped with a 63x 1.32-0.6 oil immersion objective and LAS-AF software.
12ビットのグレイスケールTIFF画像を、MetaMorph（登録商標）ソフトウエア（Meta Seriesバージョン6.1、Molecular Devices Inc, Sunnyvale California, USA）を用いて、共局在に関して解析した。画像はスタックとして取り込み、バックグラウンドを差し引いた。すべてのFITC画像およびすべてのAPC画像に対して同一の閾値設定を用いた（手動で設定）。共局在は、関心対象領域（ROI）におけるFITCのピクセル強度として示され、ここでROIはAPC陽性領域のすべてで構成される。異なるTF抗体で染色された異なるスライドを比較するために、APCのピクセル強度を用いて画像を標準化した。マウス-抗ヒトCD107a-APCを、リソソームマーカーLAMP1（CD107a）を染色するために用いた。LAMP1のピクセル強度は、撮像したさまざまなTF抗体間で異なっているべきではない。 12-bit grayscale TIFF images were analyzed for co-localization using MetaMorph® software (Meta Series version 6.1, Molecular Devices Inc, Sunnyvale California, USA). Images were captured as a stack and background was subtracted. The same threshold setting was used for all FITC images and all APC images (manually set). Co-localization is shown as FITC pixel intensity in the region of interest (ROI), where ROI is composed of all of the APC positive regions. In order to compare different slides stained with different TF antibodies, images were normalized using APC pixel intensity. Mouse-anti-human CD107a-APC was used to stain the lysosomal marker LAMP1 (CD107a). The pixel intensity of LAMP1 should not differ between the various imaged TF antibodies.
FITCとAPCとの共局在に関する標準化された値は、式［（FITCのTPI×共局在率）／100］×［1／APCのTPI］に従い、任意単位として表される。
共局在率＝APCピクセルと共局在するFITCのTPI／APCのTPI
TPI、総ピクセル強度
The standardized values for the co-localization of FITC and APC are expressed as arbitrary units according to the formula [(FITC TPI × co-localization rate) / 100] × [1 / APC TPI].
Colocalization rate = FITC TPI co-localized with APC pixels / APC TPI
TPI, total pixel intensity
図21は、APC標識したリソソームマーカーと重なり合う、野生型およびE345R変異型のTF抗体のFITCピクセル強度の量を示している。試験した各抗体または条件について、ほぼ1個、3個または5個を上回る細胞を含む1枚のスライドからの3つの異なる画像を解析した。各スライド内の異なる画像間には差異が観察された。しかし依然として、抗体011および098に対するE345R変異が、野生型011および098と比較した場合に、1時間インキュベーション後のリソソーム共局在の増強をもたらしたことは明白であった。これらの結果は、変異E345Rがより迅速な細胞内移行およびリソソーム共局在を誘導し、それによって抗体薬物コンジュゲートを増強しうることを指し示している。 FIG. 21 shows the amount of FITC pixel intensity of wild-type and E345R mutant TF antibodies overlapping with APC-labeled lysosomal markers. For each antibody or condition tested, three different images from one slide containing approximately 1, 3, or more than 5 cells were analyzed. Differences were observed between the different images in each slide. However, it was still clear that the E345R mutation for antibodies 011 and 098 resulted in enhanced lysosomal colocalization after 1 hour incubation when compared to wild type 011 and 098. These results indicate that mutant E345R can induce faster intracellular translocation and lysosomal colocalization, thereby enhancing antibody drug conjugates.
実施例27
CD20発現は同程度であるが膜結合型補体調節タンパク質のレベルが異なる種々のB細胞株における、リツキシマブ中のE345R変異によるCDCの増強
実施例25および28は、Daudi細胞およびWien133細胞に対する野生型リツキシマブのCDC活性が、E345R変異を導入することによって増強されたことを示している。この増強されたCDC活性は、Fc-Fc相互作用のE345R媒介性安定化に起因する。続いて、それに伴って形成された標的細胞膜上のヘキサマー抗体環構造が、細胞膜の近傍にある活性化補体成分の捕捉および濃縮を助長することによって、膜傷害性複合体の効率的な生成を促進させることができる。この効率的な補体活性化の結果として、膜結合型補体調節タンパク質（mCRP）による阻害効果が部分的に克服されうると考えられる。CD55、CD46およびCD59などのmCRPの過剰発現は、モノクローナル抗腫瘍抗体を用いる免疫療法の奏効のための障害になると考えられている（Jurianz et al., Mol Immunol 1999 36 :929-39；Fishelson et al. Mol Immunol 2003 40: 109-23, Gorter et al., Immunol Today 1999 20: 576-82, Zell et al., Clin Exp Immunol. 2007 Dec 150(3): 576-84）。このことから、mCRPであるCD46、CD55およびCD59のレベルは異なるがCD20標的発現のレベルは同等である一連のB細胞株に対するリツキシマブ-E345Rの活性を、野生型リツキシマブのそれと比較した。
Example 27
Enhancement of CDC by E345R mutation in rituximab in various B cell lines with similar levels of CD20 but different levels of membrane-bound complement regulatory proteins Examples 25 and 28 are wild-type for Daudi and Wien133 cells It shows that the CDC activity of rituximab was enhanced by introducing the E345R mutation. This enhanced CDC activity is due to E345R-mediated stabilization of the Fc-Fc interaction. Subsequently, the accompanying hexamer antibody ring structure on the target cell membrane facilitates the capture and enrichment of activated complement components in the vicinity of the cell membrane, thereby efficiently producing a membrane-damaging complex. Can be promoted. As a result of this efficient complement activation, it is believed that the inhibitory effect by membrane-bound complement regulatory protein (mCRP) can be partially overcome. Overexpression of mCRP such as CD55, CD46 and CD59 is thought to be an obstacle for the response of immunotherapy with monoclonal anti-tumor antibodies (Jurianz et al., Mol Immunol 1999 36: 929-39; Fishelson et al. Mol Immunol 2003 40: 109-23, Gorter et al., Immunol Today 1999 20: 576-82, Zell et al., Clin Exp Immunol. 2007 Dec 150 (3): 576-84). This compared the activity of rituximab-E345R against that of wild-type rituximab against a series of B cell lines with different levels of the mCRPs CD46, CD55 and CD59 but equivalent levels of CD20 target expression.
B細胞株であるDaudi、WIL2-S、WSU-NHL、MEC-2およびARH-77は、QIFIKIT分析による決定で、同等量のCD20分子を発現する（特異的抗体結合能力‐sABCがほぼ250,000）（データは提示せず）。これらの細胞株の間での補体調節タンパク質の発現レベルを比較するために、CD46（マウス抗ヒトCD46、CBL488、クローンJ4.48 Chemicon）、CD55（マウス抗ヒトCD55、CBL511、クローンBRIC216、Chemicon）およびCD59（マウス抗ヒトCD59、MCA1054x、クローンMEM-43、Serotec）のレベルを決定するためのQIFIKIT分析を行った。 The B cell lines Daudi, WIL2-S, WSU-NHL, MEC-2 and ARH-77 express equivalent amounts of CD20 molecules as determined by QIFIKIT analysis (specific antibody binding capacity-sABC is almost 250,000) (Data not shown). To compare the expression levels of complement regulatory proteins between these cell lines, CD46 (mouse anti-human CD46, CBL488, clone J4.48 Chemicon), CD55 (mouse anti-human CD55, CBL511, clone BRIC216, Chemicon) ) And CD59 (mouse anti-human CD59, MCA1054x, clone MEM-43, Serotec) were subjected to QIFIKIT analysis.
CDCアッセイのために、0.1×106個の細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中で、飽和性の抗体濃度系列（4倍希釈で0.002〜40.0μg／mL）とともに、振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、25μLの正常ヒト血清を補体の供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μLのヨウ化プロピジウムを添加して、細胞溶解をFACSによって決定した。最大CDC媒介性致死を、GraphPad PRISM 5における非線形適合の最良適合値の最上位のものを用いて、独立した2回の実験から算出した。
For the CDC assay, 0.1 × 10 6 cells were placed in a round bottom 96-well plate in a total volume of 100 μL with a saturating antibody concentration series (0.002-40.0 μg / mL at 4-fold dilution) Pre-incubated for 15 minutes at room temperature on a shaker. Next, 25 μL of normal human serum was added as a complement source (
図22A〜Dは、野生型リツキシマブへのE345Rの導入により、試験したすべてのB細胞株についての最大溶解の増強およびEC50の低下によって観察されたように、CDC活性の増強がもたらされたことを示している。 Figures 22A-D show that introduction of E345R into wild-type rituximab resulted in enhanced CDC activity, as observed by enhanced maximal lysis and reduced EC 50 for all B cell lines tested. It is shown that.
図22Eは、リツキシマブ-E345R変異体によって誘導される最大CDC媒介性致死が、膜結合型補体調節タンパク質の発現レベルとは無関係に、野生型リツキシマブよりも常に高度であったことを示している。これらのデータは、腫瘍細胞がE345Rを含有する抗体による抗体媒介性補体攻撃を回避する効果はより低いことから、E345Rの導入により、モノクローナル抗体の治療能力が増強されることを指し示している。 Figure 22E shows that maximal CDC-mediated lethality induced by the rituximab-E345R mutant was always higher than wild-type rituximab, regardless of the expression level of membrane-bound complement regulatory protein . These data indicate that the introduction of E345R enhances the therapeutic potential of monoclonal antibodies because tumor cells are less effective in avoiding antibody-mediated complement attack by antibodies containing E345R.
実施例28
野生型抗体およびE345R抗体に関するCDC動態の比較
実施例6（DaudiおよびRajiに対するCD20抗体7D8）、実施例10（Daudi、RajiおよびWien133に対するCD38抗体005）ならびに実施例25（DaudiおよびWien133に対するCD38抗体003ならびにCD20抗体リツキシマブおよび11B8）に記載された種々の細胞株に対する種々の抗体に関するEC50値の低下および最大溶解の増強によって観察されたように、Fc：Fc相互作用を安定化するE345R変異の導入は、CDCを増強させるか、または復旧させることが示された。次に、野生型抗体とE345R抗体との間でのCDC活性の差をさらに解明するために、CDC反応の動態を分析した。
Example 28
Comparison of CDC kinetics for wild type antibody and E345R antibody Example 6 (CD20 antibody 7D8 against Daudi and Raji), Example 10 (CD38
0.1×106個のRaji細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中で、飽和濃度（10.0μg／mL）の抗体とともに振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、25μLの正常ヒト血清を補体の供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で、0〜60分間の範囲にわたる種々の期間にわたってインキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μLのヨウ化プロピジウムを添加して、細胞溶解をFACSによって決定した。
0.1 × 10 6 Raji cells were preincubated for 15 minutes at room temperature on a shaker with a saturating concentration (10.0 μg / mL) of antibody in a round bottom 96-well plate in a total volume of 100 μL. Next, 25 μL of normal human serum was added as a source of complement (
図23Aは、野生型CD20抗体IgG1-7D8がRaji細胞の80％という最大CDC媒介性致死を示し、試験条件下で5分後には既にそれに達したことを示している。しかし、IgG-7D8-E345Rについては、Raji細胞の80％致死がより迅速に、3分後には観察された。また、IgG-7D8-E345Rによる最大溶解（95％）にも5分後には到達した。 FIG. 23A shows that wild type CD20 antibody IgG1-7D8 showed a maximum CDC-mediated lethality of 80% of Raji cells, which was already reached after 5 minutes under the test conditions. However, for IgG-7D8-E345R, 80% lethality of Raji cells was observed more rapidly after 3 minutes. In addition, the maximum dissolution (95%) by IgG-7D8-E345R was reached after 5 minutes.
図23Bは、用いたRaji細胞においてCDCを誘導する効力が7D8よりも弱い野生型CD20抗体リツキシマブについても、E345R変異の導入により、標的細胞のより迅速な致死がもたらされたことを示している。野生型リツキシマブは32％という最大CDC媒介性致死を示し、それには20分後に到達した。リツキシマブ-E345Rはおよそ3分後に32％の致死に既に到達しており、注目すべきことに、リツキシマブ-E345Rによる最大溶解（85％）にも20分後に到達した。 FIG. 23B also shows that the introduction of the E345R mutation resulted in faster killing of target cells for the wild-type CD20 antibody rituximab, which is less potent than 7D8 in inducing CDC in the Raji cells used . Wild-type rituximab showed maximum CDC-mediated lethality of 32%, which was reached after 20 minutes. Rituximab-E345R has already reached 32% lethality after approximately 3 minutes, and notably, maximum lysis (85%) with rituximab-E345R was also reached after 20 minutes.
図23C＋Dは、野生型CD38抗体IgG1-003およびIgG1-005によるCDC媒介性致死に対して抵抗性である、用いたRaji細胞を、E345R変異を導入することによって迅速に死滅させることができたことを示している。IgG1-003-E345RおよびIgG1-005-E345Rは、最大CDC（それぞれ50％および60％）を既に5分間後に示した。 FIG. 23C + D shows that Raji cells used, resistant to CDC-mediated lethality by wild-type CD38 antibodies IgG1-003 and IgG1-005, could be rapidly killed by introducing the E345R mutation. Is shown. IgG1-003-E345R and IgG1-005-E345R showed maximum CDC (50% and 60%, respectively) already after 5 minutes.
以上をまとめると、E345R抗体は、それらの野生型対応物よりも効力が強く、そのことは、より高い活性（より低いEC50）、最大溶解の増強、およびCDC反応のより迅速な動態の組み合わせに起因する。 In summary, E345R antibodies are more potent than their wild-type counterparts, a combination of higher activity (lower EC 50 ), enhanced maximum lysis, and faster kinetics of the CDC response caused by.
実施例29
E345R変異を伴うか、または伴わない二重特異性抗体に関するCDC動態の比較
実施例23には、DuoBodyプラットフォームによって作製されたCD38×CD20二重特異性抗体であるIgG1-005-F405L × IgG1-7D8-K409Rに対してE345R変異を適用して、Raji細胞およびWien133細胞でのCDCアッセイにおけるEC50の低下によって観察されたように、致死能力の増強をもたらしうることが記載されている。次に、E345Rを伴うCD38×CD20二重特異性抗体とそれを伴わないものとの間でのCDC活性の差をさらに解明するために、CDC反応の動態を分析した。
Example 29
Comparison of CDC kinetics for bispecific antibodies with or without E345R mutation Example 23 includes a CD38 × CD20 bispecific antibody IgG1-005-F405L × IgG1-7D8 produced by the DuoBody platform It has been described that applying the E345R mutation to -K409R can result in enhanced lethality as observed by a decrease in EC 50 in CDC assays in Raji and Wien133 cells. Next, to further elucidate the difference in CDC activity between CD38 × CD20 bispecific antibody with E345R and without it, the kinetics of the CDC reaction was analyzed.
0.1×106個のRaji細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中で、飽和濃度（10.0μg／mL）の抗体とともに振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、25μLの正常ヒト血清を補体の供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で、0〜60分間の範囲にわたる種々の期間にわたってインキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μLのヨウ化プロピジウムを添加して、細胞溶解をFACSによって決定した。
0.1 × 10 6 Raji cells were preincubated for 15 minutes at room temperature on a shaker with a saturating concentration (10.0 μg / mL) of antibody in a round bottom 96-well plate in a total volume of 100 μL. Next, 25 μL of normal human serum was added as a source of complement (
図24は、二重特異性抗体IgG1-005-F405L × IgG1-7D8-K409Rが83％という最大CDC媒介性致死を誘導し、10分後にはそれに達していたことを示している。E345Rの導入は、IgG1-005-E345R-F405L × IgG1-7D8-E345R-K409Rによる最大致死の増強をもたらし（98％）、2分後には既にそれに達していた。これらのデータは、Fc-Fcを安定化するE345R変異を二重特異性抗体に導入することにより、標的細胞のCDC媒介性致死の迅速化がもたらされることを指し示している。 FIG. 24 shows that the bispecific antibody IgG1-005-F405L × IgG1-7D8-K409R induced maximal CDC-mediated lethality of 83% and reached it after 10 minutes. The introduction of E345R resulted in a maximal lethal enhancement with IgG1-005-E345R-F405L x IgG1-7D8-E345R-K409R (98%), which was already reached after 2 minutes. These data indicate that introduction of an E345R mutation that stabilizes Fc-Fc into a bispecific antibody results in faster CDC-mediated lethality of target cells.
実施例30
E345Rを伴うおよび伴わない一価結合抗体に関するCDC動態の比較
実施例22は、一価標的結合により、CD38陽性でEGFR陰性のWien133細胞に対するCD38×EGFR二重特異性抗体による最大溶解の増強によって観察されたように、E345R抗体のCDC活性がさらに増強されたことを示している。次に、E345Rを伴う一価性結合抗体とそれを伴わないものとの間でのCDC媒介性致死能力の差をさらに解明するために、CDC反応の動態を分析した。
Example 30
Comparison of CDC kinetics for monovalent binding antibodies with and without E345R Example 22 observed by enhanced maximal lysis by CD38 x EGFR bispecific antibody against CD38 positive and EGFR negative Wien133 cells by monovalent target binding As shown, it was shown that the CDC activity of the E345R antibody was further enhanced. Next, to further elucidate the difference in CDC-mediated lethal capacity between monovalent binding antibodies with E345R and those without it, the kinetics of the CDC reaction was analyzed.
E345R変異を伴うかまたは伴わない二重特異性CD38×EGFR抗体およびCD20×EGFR抗体を、実施例22に記載したようにDuoBodyプラットフォームによってインビトロで作製した。CD38×EGFR二重特異性抗体のCDC活性を、二重特異性抗体がCD38を介して一価でしか結合することができない、CD38陽性でEGFR陰性のRaji細胞において試験した。0.1×106個のRaji細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中で、飽和濃度（10.0μg／mL）の抗体とともに振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、25μLの正常ヒト血清を補体の供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で、0〜60分間の範囲にわたる種々の期間にわたってインキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μLのヨウ化プロピジウムを添加して、細胞溶解をFACSによって決定した。
Bispecific CD38 × EGFR and CD20 × EGFR antibodies with or without the E345R mutation were generated in vitro by the DuoBody platform as described in Example 22. The CDC activity of the CD38 × EGFR bispecific antibody was tested in CD38 positive and EGFR negative Raji cells, where the bispecific antibody can only bind monovalently through CD38. 0.1 × 10 6 Raji cells were preincubated for 15 minutes at room temperature on a shaker with a saturating concentration (10.0 μg / mL) of antibody in a round bottom 96-well plate in a total volume of 100 μL. Next, 25 μL of normal human serum was added as a source of complement (
図25は、二重特異性抗体CD38×EGFR（IgG1-005-K409R × IgG1-2F8-F405L）が、55％という最大CDC媒介性致死を誘導し、およそ10分後にはそれに到達したことを示している。E345Rの導入は最大致死の増強をもたらし（96％）、それには5分以内に既に到達した。 Figure 25 shows that the bispecific antibody CD38 x EGFR (IgG1-005-K409R x IgG1-2F8-F405L) induced a maximum CDC-mediated lethality of 55% and reached it after approximately 10 minutes. ing. The introduction of E345R resulted in an increase in maximum lethality (96%), which was already reached within 5 minutes.
図25は、二重特異性抗体CD20×EGFR（IgG1-7D8-K409R × IgG1-2F8-F405L）が、85％という最大CDC媒介性致死を誘導し、およそ5分後にはそれに到達したことを示している。しかし、E345Rが導入されたCD20×EGFR抗体を用いた場合には、85％の溶解がより迅速に、2分後には観察された。また、E345R CD20×EGFR抗体による最大溶解（97％）にも5分後には到達した。 FIG. 25 shows that the bispecific antibody CD20 × EGFR (IgG1-7D8-K409R × IgG1-2F8-F405L) induced a maximum CDC-mediated lethality of 85% and reached it after approximately 5 minutes. ing. However, 85% lysis was observed more rapidly after 2 minutes when using CD20xEGFR antibody with E345R introduced. In addition, the maximum dissolution (97%) by the E345R CD20 × EGFR antibody was reached after 5 minutes.
以上をまとめると、これらの一価結合抗体へのE345R変異の導入によって、より効力の強い抗体がもたらされ、そのことは、最大溶解の増強と、CDC反応のより迅速な動態との組み合わせに起因する。 In summary, the introduction of the E345R mutation into these monovalent binding antibodies results in a more potent antibody, which combines the enhancement of maximum lysis with the faster kinetics of the CDC reaction. to cause.
実施例31
治療用抗体とE345R／Q386K抗体との組み合わせによるCDC
実施例19に記載したように、IgG1-005に由来する変異型CD38抗体は、野生型抗体のE345位置をグルタミン酸（E）以外の任意のアミノ酸に置換することによって、Wien133細胞において効率的なCDCを誘導することができた。このことは、CDCの前提条件としてのオリゴマー形成が、抗体の位置345でのグルタミン酸側鎖の存在によって妨げられることを示唆する。1つのFc上のE345は、ヘキサマー抗体環構造において対向する第2のFc部分上のQ386に近接しているため、第1の抗体におけるオリゴマー形成のE345媒介性妨害は、第2の抗体のQ386位置での置換によっておそらく取り除かれうると考えられる。これにより、続いて、第1の抗体におけるE345が、第2の抗体における変異させた386位置と、この両方の抗体を組み合わせた場合に、より良好に相互作用することが可能になると考えられる。この仮説を検証するために、Wien133に対して、一例として野生型抗体（IgG1-003、IgG1-005またはIgG1-11B8）をIgG1-005-E345R／Q386KまたはIgG1-005-E345R／Q386K／E430Gと混合するCDCアッセイを行った。
Example 31
CDC with combination of therapeutic antibody and E345R / Q386K antibody
As described in Example 19, a mutant CD38 antibody derived from IgG1-005 is an efficient CDC in Wien133 cells by replacing the E345 position of the wild-type antibody with any amino acid other than glutamic acid (E). Could be induced. This suggests that oligomerization as a prerequisite for CDC is hindered by the presence of glutamate side chains at position 345 of the antibody. Since E345 on one Fc is in close proximity to Q386 on the second Fc moiety that opposes in the hexamer antibody ring structure, E345-mediated hindrance of oligomerization in the first antibody is the Q386 of the second antibody. It is likely that it could be removed by substitution at the position. This would subsequently enable E345 in the first antibody to interact better when both antibodies are combined with the mutated 386 position in the second antibody. To test this hypothesis, for Wien133, wild type antibodies (IgG1-003, IgG1-005 or IgG1-11B8) were used as IgG1-005-E345R / Q386K or IgG1-005-E345R / Q386K / E430G as an example. A mixed CDC assay was performed.
0.1×106個のWien133細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中で、非精製IgG1-005-E345R／Q386K、IgG1-005-E345R／Q386K／E430Gまたは対照抗体の濃度系列（3.33倍希釈で0.0001〜20.0μg／mL）とともに、1.0または10.0μg／mLの野生型IgG1-003、IgG1-005またはIgG1-11B8抗体の存在下または非存在下で、振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、25μLの正常ヒト血清を補体の供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μLのヨウ化プロピジウムを添加して、細胞溶解をFACSによって決定した。
Concentration series of non-purified IgG1-005-E345R / Q386K, IgG1-005-E345R / Q386K / E430G or control antibody in 0.1 × 10 6 Wien133 cells in a round bottom 96-well plate in a total volume of 100 μL At room temperature on a shaker in the presence or absence of 1.0 or 10.0 μg / mL of wild type IgG1-003, IgG1-005 or IgG1-11B8 antibody (0.003 to 20.0 μg / mL at 3.33 dilution) For 15 minutes. Next, 25 μL of normal human serum was added as a complement source (
図26A／B／Cは、CD38抗体IgG1-005-E345R／Q386Kが、Wien133細胞のCDC媒介性溶解を用量依存的な様式で誘導したことを示している（破線）。IgG1-005-E345R／Q386Kと、1μg／mLまたは10μg／mLの野生型CD38抗体IgG1-003（図26A）または野生型CD20抗体IgG1-11B8（図26B）とを組み合わせることにより、最大細胞溶解の増強がもたらされた。IgG1-005-E345R／Q386Kと野生型IgG1-005とを組み合わせることにより、CDCが用量依存的な様式で阻害されたが、これはおそらく結合部位をめぐる競合によると考えられる（図26C）。 FIG. 26A / B / C shows that CD38 antibody IgG1-005-E345R / Q386K induced CDC-mediated lysis of Wien133 cells in a dose-dependent manner (dashed line). By combining IgG1-005-E345R / Q386K with 1 μg / mL or 10 μg / mL wild-type CD38 antibody IgG1-003 (FIG. 26A) or wild-type CD20 antibody IgG1-11B8 (FIG. 26B), maximum cell lysis is achieved. An enhancement was brought about. Combining IgG1-005-E345R / Q386K with wild-type IgG1-005 inhibited CDC in a dose-dependent manner, probably due to competition for binding sites (FIG. 26C).
図26D／E／Fは、CD38抗体IgG1-005-E345R／Q386K／E430Gに関する同様のデータを示している。 FIG. 26D / E / F shows similar data for the CD38 antibody IgG1-005-E345R / Q386K / E430G.
これらのデータは、野生型抗体IgG1-003およびIgG1-11B8が、IgG1-005-E345R／Q386KまたはIgG1-005-E345R／Q386K／E430Gと組み合わされた場合に、抗体オリゴマー形成およびCDC活性化にかかわったことを指し示している。そのような組み合わせでは、野生型抗体に存在するE345位置によるオリゴマー形成の妨害が、変異型抗体におけるQ386K置換によって、少なくとも部分的には取り除かれうると考えられる。本出願は特に、リツキシマブ、オファツムマブ、ダラツムマブまたはトラスツズマブといった、E345位置において野生型である抗体を用いる治療法を改良する上で興味深い。また、そのようなオリゴマー形成誘導性の抗体は、腫瘍細胞または細菌のような標的細胞を対象とする患者自身の抗体との細胞結合型複合体の形成も促進しうる可能性がある。 These data are related to antibody oligomerization and CDC activation when wild-type antibodies IgG1-003 and IgG1-11B8 are combined with IgG1-005-E345R / Q386K or IgG1-005-E345R / Q386K / E430G. It points to that. In such a combination, it is believed that the blockage of oligomer formation due to the E345 position present in the wild type antibody can be at least partially removed by Q386K substitution in the mutant antibody. The application is particularly interesting in improving therapies using antibodies that are wild-type at the E345 position, such as rituximab, ofatumumab, daratumumab or trastuzumab. Such oligomerization-inducing antibodies may also promote the formation of cell-bound complexes with the patient's own antibodies directed against target cells such as tumor cells or bacteria.
実施例19は、それらの特定の変異が、CD38抗体IgG1-005に組み入れられた場合にWien133細胞に対する効率的なCDCを誘導した、変異を受けるとCDCを増強する、E345のほかの複数のアミノ酸、例えばE430およびS440を記載している。I253およびY436変異体を除き、同定されたオリゴマー形成増強性変異は、ヘキサマー環構造において、対向性の第2のFc部分上の変異していないアミノ酸と接触している。したがって、同定されたオリゴマー形成増強性変異は、単独または組み合わせのいずれでも、変異していない抗体とのオリゴマー形成をも促進すると予想することができ、実施例19で適用したものと類似の選別戦略によって、そのような変異体のさらなる最適化を達成しうると考えられる。 Example 19 shows that these specific mutations induced efficient CDC against Wien133 cells when incorporated into the CD38 antibody IgG1-005, and other amino acids other than E345 that enhance CDC when subjected to the mutation. For example, E430 and S440 are described. With the exception of the I253 and Y436 mutants, the identified oligomerization enhancing mutation is in contact with the unmutated amino acid on the opposing second Fc moiety in the hexamer ring structure. Thus, the identified oligomerization-enhancing mutations can be expected to promote oligomer formation with unmutated antibodies, either alone or in combination, and a selection strategy similar to that applied in Example 19. It is believed that further optimization of such variants can be achieved.
実施例32
E345RはIgG2、IgG3およびIgG4抗体アイソタイプにおけるCDCを誘導した
オリゴマー形成促進性変異の導入によって、非IgG1抗体アイソタイプのCDC活性が刺激されうるか否かを検討するために、当技術分野において公知の方法によって、CD38抗体IgG1-005のアイソタイプ変異体をヒトIgG2、IgG3またはIgG4の定常ドメインを用いて作製し、IgG2-005、IgG3-005およびIgG4-005を得た。さらに、オリゴマー形成増強性E345R変異をこれらの抗体すべてに導入して、IgG2-005-E345R、IgG3-005-E345RおよびIgG4-005-E345Rを得た。同様の様式で、CD38抗体IgG1-003からIgG2-003およびIgG2-003-E345Rも作製した。種々のアイソタイプのCDC活性を、インビトロCDCアッセイにおいて比較した。
Example 32
In order to investigate whether E345R can stimulate CDC activity in non-IgG1 antibody isotypes by introducing CDC-induced oligomerization-induced mutations in IgG2, IgG3 and IgG4 antibody isotypes, it is performed by methods known in the art. , Isotype variants of the CD38 antibody IgG1-005 were generated using human IgG2, IgG3 or IgG4 constant domains to yield IgG2-005, IgG3-005 and IgG4-005. In addition, the oligomerization enhancing E345R mutation was introduced into all of these antibodies to yield IgG2-005-E345R, IgG3-005-E345R and IgG4-005-E345R. In a similar manner, CD38 antibodies IgG1-003 to IgG2-003 and IgG2-003-E345R were also produced. The CDC activity of various isotypes was compared in an in vitro CDC assay.
0.1×106個のWien133細胞を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中で、10μg／mLの非精製抗体とともに振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。IgG1-005-E345Rを3.0μg／mLで添加した。次に、25μLの正常ヒト血清を補体の供給源として添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μLのヨウ化プロピジウムを添加して、細胞溶解をFACSによって決定した。
0.1 × 10 6 Wien133 cells were preincubated for 15 minutes at room temperature on a shaker with 10 μg / mL unpurified antibody in a round bottom 96-well plate in a total volume of 100 μL. IgG1-005-E345R was added at 3.0 μg / mL. Next, 25 μL of normal human serum was added as a complement source (
図27は、IgG2-005、IgG2-003、IgG3-005およびIgG4-005が、試験した条件下では、（A）Daudi細胞も（B）Wien133細胞も効率的に溶解させることができなかったことを示している（観察されたほぼ20％の溶解はバックグラウンドと考えられた）。E345R変異の導入により、試験したすべてのIgGアイソタイプに関して、Daudi細胞に対する強力なCDCが可能となった。これらの結果はWien133細胞に対するCDCを用いても確認されたものの、IgG3-005-E345Rは他のアイソタイプ変異体と比較して限定されたCDC活性を呈した。これらのデータは、E345Rなどのオリゴマー形成増強性変異を、IgG1に加えて、IgG2、IgG3およびIgG4抗体のCDC活性を促進するためにも適応しうることを指し示している。 FIG. 27 shows that IgG2-005, IgG2-003, IgG3-005 and IgG4-005 could not efficiently lyse (A) Daudi cells or (B) Wien133 cells under the conditions tested. (Almost 20% lysis observed was considered background). The introduction of the E345R mutation allowed for powerful CDC on Daudi cells for all tested IgG isotypes. Although these results were confirmed using CDC on Wien133 cells, IgG3-005-E345R exhibited limited CDC activity compared to other isotype mutants. These data indicate that oligomerization enhancing mutations such as E345R can be adapted to promote CDC activity of IgG2, IgG3 and IgG4 antibodies in addition to IgG1.
実施例33
患者由来のCD38陽性B細胞慢性リンパ球白血病（CLL）細胞についてのエクスビボCDCアッセイにおけるIgG1-005およびIgG1-005-E345RによるCDC
CLL患者試料由来の凍結保存された初代細胞を、CDB-IDIBAPS-Hospital Clinic（Dr. Elias Campo, Hematopathology Unit, Department of Pathology, Hospital Clinic, Institut d'Investigacions Biomediques August Pi i Sunyer（IDIBAPS）, University of Barcelona, Barcelona, Spain）からの血液学バイオバンク（hematopathology biobank）から、または米国国立心肺血液研究所（National Heart, Lung and Blood Institute（NHLBI））（Dr. Adrian Wiestner, NHLBI, Hematology Branch of the NationalInstitutes of Health（NIH）, Bethesda）による臨床研究例から得た。Hospital Clinic（Barcelona, Spain）の国際倫理委員会（Institutional Ethics Committee）またはNIHの施設内審査委員会（Institutional Review Board）およびヘルシンキ宣言（Declaration of Helsinki）に準拠して、すべての患者からインフォームドコンセントを得た。すべての試料を、遺伝学的および免疫表現型的に特性決定した。
Example 33
CDC with IgG1-005 and IgG1-005-E345R in an ex vivo CDC assay on patient-derived CD38-positive B-cell chronic lymphocyte leukemia (CLL) cells
Cryopreserved primary cells from CLL patient samples were obtained from CDB-IDIBAPS-Hospital Clinic (Dr. Elias Campo, Hematopathology Unit, Department of Pathology, Hospital Clinic, Institut d'Investigacions Biomediques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), University of From the hematopathology biobank from Barcelona, Barcelona, Spain or from the National Heart, Lung and Blood Institute (NHLBI) (Dr. Adrian Wiestner, NHLBI, Hematology Branch of the National Institutes of Health (NIH), Bethesda). Informed consent from all patients in accordance with the Hospital Clinic (Barcelona, Spain) Institutional Ethics Committee or NIH Institutional Review Board and Declaration of Helsinki Got. All samples were characterized genetically and immunophenotypically.
CLL試料を、FACSによって決定したそのCD38発現に従って、2群にカテゴリー分けした：5件の試料は高CD38群（Daudi細胞上のCD38発現が50％〜98％）に含められ、4件の試料は低CD38群（Daudi細胞上のCD38発現が0.5％〜3％）に含められた。
CLL samples were categorized into two groups according to their CD38 expression determined by FACS: 5 samples were included in the high CD38 group (CD38 expression on
蛍光標識したCLL細胞（5μMカルセインAMによる標識）を、抗体の濃度系列（10倍希釈で0.01〜10μg／mL）とともにインキュベートした。次に、抗体でオプソニン化した細胞（100,000個／ウェル）に対して、正常ヒト血清を補体の供給源として添加し（最終濃度10％）、37℃で45分間インキュベートした。上清を回収し、細胞溶解の尺度として、蛍光をSynergy（商標）HT蛍光光度計で読み取った。細胞致死は以下の通りに算出した：特異的溶解＝100×（試料 − 自然発生的溶解）／（最大溶解 − 自然発生的溶解）、式中、最大溶解は1％ Tritonで処理した細胞の試料によって決定され、自然発生的溶解は、抗体を伴わずに10％ NHSの存在下で細胞をインキュベートした試料から決定される。 Fluorescently labeled CLL cells (labeled with 5 μM calcein AM) were incubated with an antibody concentration series (0.01-10 μg / mL at 10-fold dilution). Next, normal human serum was added as a complement source (10% final concentration) to cells opsonized with antibodies (100,000 cells / well) and incubated at 37 ° C. for 45 minutes. The supernatant was collected and fluorescence was read on a Synergy ™ HT fluorometer as a measure of cell lysis. Cell lethality was calculated as follows: specific lysis = 100 x (sample-spontaneous lysis) / (maximum lysis-spontaneous lysis), where maximum lysis is a sample of cells treated with 1% Triton. Spontaneous lysis is determined from samples incubated with cells in the presence of 10% NHS without antibody.
図28は、IgG1-005-E345Rが、CD38発現が高度であるCLL初代細胞およびCD38発現が軽度であるCLL初代細胞のいずれに対しても、野生型IgG1-005と比較してCDC活性を強く増強したことを示している。 FIG. 28 shows that IgG1-005-E345R has stronger CDC activity compared to wild-type IgG1-005 in both CLL primary cells with high CD38 expression and CLL primary cells with mild CD38 expression. It shows that it has increased.
実施例34
野生型IgG1-005と比較した、IgG1-005変異体のFcRn結合
新生児Fc受容体（FcRn）は、IgGを分解から防御することによって、IgGの長い血漿中半減期の原因となる。抗体の細胞内移行後に、FcRnはエンドソーム内で抗体Fc領域と結合するが、そこは相互作用が安定な穏やかな酸性環境（pH 6.0）にある。環境が中性（pH 7.4）である原形質膜で再利用されると、相互作用がなくなり、抗体は再び流血中に放出される。これがIgGの血漿中半減期に影響する。
Example 34
Compared to wild-type IgG1-005, the IgG1-005 mutant FcRn-binding neonatal Fc receptor (FcRn) is responsible for the long plasma half-life of IgG by protecting IgG from degradation. After antibody intracellularization, FcRn binds to the antibody Fc region within the endosome, but in a mild acidic environment (pH 6.0) where the interaction is stable. When reused at the plasma membrane where the environment is neutral (pH 7.4), the interaction is lost and the antibody is released again into the bloodstream. This affects the plasma half-life of IgG.
IgG1-005変異体E345K、E345Q、E345R、E345Y、E430F、E430G、E430S、E430T、S440Y、K439EおよびS440Kがマウス、カニクイザルおよびヒト由来のFcRnと相互作用する能力を、ELISAにおいて試験した。マウスFcRn ELISAでは、変異体P247GおよびI253Dも試験した。I253Dは、FcRnに対する結合に関する陰性対照として用いた。インキュベーションはすべて室温で行った。96ウェルプレートを、0.2％ BSAを加えたPBST中に希釈した、組換え法で作製したFcRn（マウス、ヒトまたはカニクイザル）のビオチン化細胞外ドメイン（FcRnECDHis-B2M-BIO）5μg／mL（100μL／ウェル）により1時間インキュベートして、コーティングした。プレートをPBSTで3回洗浄し、3倍系列で希釈した（PBST／0.2％ BSA、pH 6.0中）野生型IgG1-005または005変異体を添加して、プレートを1時間インキュベートした。プレートをPBST／0.2％ BSA、pH 6.0で洗浄した。PBST／0.2％ BSA、pH 6.0中に希釈したヤギ-抗ヒトIgG(Fab'2)-HRP（JacksonImmuno Research、カタログ番号：109-035-097）を添加して、プレートを1時間インキュベートした。洗浄後に、ABTSを基質として添加し、プレートを暗所下で30分間インキュベートした。EL808 ELISAリーダーを用いて、吸光度を405nmで読み取った。マウスFcRn ELISAで得られたデータを、GraphPad PRISM 5において対数変換濃度を用いる非線形アゴニスト用量反応適合の最良適合値を用いて解析して、見かけの親和性（EC50）を算出した（表20）。この実験により、FcRn結合は、野生型IgG1-005と比較して、IgG1-005変異体のいずれによっても改変されなかったことが示された。
The ability of IgG1-005 mutants E345K, E345Q, E345R, E345Y, E430F, E430G, E430S, E430T, S440Y, K439E and S440K to interact with FcRn from mice, cynomolgus monkeys and humans was tested in ELISA. In the mouse FcRn ELISA, mutants P247G and I253D were also tested. I253D was used as a negative control for binding to FcRn. All incubations were at room temperature. 96-well plates diluted in PBST supplemented with 0.2% BSA, biotinylated extracellular domain (FcRnECDHis-B2M-BIO) of recombinantly produced FcRn (mouse, human or cynomolgus) 5 μg / mL (100 μL / mL) Well) and coated for 1 hour. Plates were washed 3 times with PBST and wild type IgG1-005 or 005 variants diluted in 3-fold series (in PBST / 0.2% BSA, pH 6.0) were added and the plates were incubated for 1 hour. Plates were washed with PBST / 0.2% BSA, pH 6.0. Goat-anti-human IgG (Fab'2) -HRP (Jackson Immuno Research, catalog number: 109-035-097) diluted in PBST / 0.2% BSA, pH 6.0 was added and the plates were incubated for 1 hour. After washing, ABTS was added as a substrate and the plate was incubated for 30 minutes in the dark. Absorbance was read at 405 nm using an EL808 ELISA reader. Data obtained with the mouse FcRn ELISA was analyzed using best fit values for non-linear agonist dose response fits using log-transformed concentrations in
（表２０）IgG1-005および変異体のマウスFcRnに対する見かけの親和性（EC50）（μg／ml単位）
図29は、野生型IgG1-005、およびIgG1-005の試験したすべての変異体が、pH 6.0でマウス、ヒトおよびカニクイザルのFcRnと良好に結合したことを示している。pH 7.4では、FcRnに対する有意な結合は検出されなかった（データは提示せず）。 FIG. 29 shows that wild type IgG1-005 and all tested variants of IgG1-005 bound well to mouse, human and cynomolgus FcRn at pH 6.0. At pH 7.4, no significant binding to FcRn was detected (data not shown).
実施例35
B細胞株RamosおよびSU-DHL-4における、リツキシマブにおける種々の変異によるCDCの増強
実施例19に記載したように、抗CD38抗体IgG1-005のオリゴマー化およびCDC活性は、Fc：Fc境界面上またはその周辺にある特定の残基での単一の変異によって刺激される可能性がある。また、Fc：Fc相互作用をアロステリック性に強化する、Fc：Fc境界面から隔たった残基での別の種類の変異によって間接的にオリゴマー化が刺激される可能性もある。このことを、2種類のB細胞株（RamosおよびSU-DHL-4）に対して、IgG1抗CD20抗体リツキシマブに関しても試験した。（本質的には実施例19に記載した通りに）以下の変異について試験した：E345K、E345Q、E345R、E345Y、E430G、E430S、E430TおよびS440Y。
Example 35
Enhancement of CDC by various mutations in rituximab in B cell lines Ramos and SU-DHL-4 As described in Example 19, the oligomerization and CDC activity of anti-CD38 antibody IgG1-005 is on the Fc: Fc interface Or it may be stimulated by a single mutation at a particular residue in the vicinity. Oligomerization may also be indirectly stimulated by other types of mutations at residues remote from the Fc: Fc interface that enhance the Fc: Fc interaction allosterically. This was also tested for the IgG1 anti-CD20 antibody rituximab against two B cell lines (Ramos and SU-DHL-4). The following mutations were tested (essentially as described in Example 19): E345K, E345Q, E345R, E345Y, E430G, E430S, E430T and S440Y.
CDCアッセイのために、0.1×106個の細胞（RamosまたはSU-DHL-4）を、丸底96ウェルプレート中にて、総容積100μL中、飽和性の抗体濃度系列（3倍希釈で0.0001〜10.0μg／mL）とともに、振盪機上にて室温で15分間プレインキュベートした。次に、補体の供給源として25μLの正常ヒト血清を添加し（最終濃度20％）、37℃のインキュベーター内で45分間インキュベートした。プレートを氷上に載せることによって反応を停止させた。10μLのヨウ化プロピジウムを添加し、FACSによって細胞溶解を決定した。データは、GraphPad PRISM 5において対数変換濃度を用いる非線形アゴニスト用量反応の最良適合値を用いて解析した。図30は、試験したすべてのリツキシマブ変異体が、両方のB細胞株においてCDC活性を増強することができたことを示している。
For the CDC assay, 0.1 × 10 6 cells (Ramos or SU-DHL-4) were placed in a round bottom 96-well plate in a total volume of 100 μL with a saturating antibody concentration series (0.0001 at 3-fold dilution). ˜10.0 μg / mL) for 15 minutes at room temperature on a shaker. Next, 25 μL of normal human serum was added as a complement source (
実施例36
標的非依存的な液相中での補体活性化：IgG1-005変異体と野生型IgG1-005との比較
標的非依存的な補体活性化は、抗体が、例えば血流または臓器組織などにおいて補体を活性化する際に、安全上の問題となる可能性がある。これは、望まれない補体活性化産物または望まれない補体沈着をもたらす可能性がある。標的非依存的な液相中での補体活性化について検討するために、100μg／mlのIgG1-005変異体E345K、E345Q、E345R、E345Y、E430F、E430G、E430S、E430T、S440Y、野生型IgG1-005または熱凝集IgG（HAG、陽性対照）を、90％正常ヒト血清中にて37℃で1時間インキュベートした。続いて試料を、C4d生成を測定するためのELISAキットに移した（Micro Vue C4d-fragment, Quidel, San Diego, CA, USA）。C4dは、古典的補体経路の活性化のマーカーであるC4の活性化断片である。
Example 36
Complement activation in the target-independent fluid phase: Comparison of IgG1-005 mutants with wild-type IgG1-005 Target-independent complement activation involves antibodies such as bloodstream or organ tissue Can be a safety issue when activating complement. This can lead to unwanted complement activation products or unwanted complement deposition. 100 μg / ml IgG1-005 mutants E345K, E345Q, E345R, E345Y, E430F, E430G, E430S, E430T, S440Y, wild-type IgG1 to investigate complement activation in target-independent liquid phase -005 or heat-aggregated IgG (HAG, positive control) was incubated for 1 hour at 37 ° C in 90% normal human serum. Samples were then transferred to an ELISA kit for measuring C4d production (Micro Vue C4d-fragment, Quidel, San Diego, CA, USA). C4d is an activated fragment of C4, a marker of classical complement pathway activation.
図31は、野生型IgG1-005、IgG1-005-E345K、IgG1-005-E345Q、IgG1-005-E345Y、IgG1-005-E430G、IgG1-005-E430SおよびIgG1-005-S440YはわずかなC4活性化を呈したが、一方、IgG1-005-E345R、IgG1-005-E430FおよびIgG1-005-E430Tは野生型IgG1-005と比較してC4d生成（C4活性化）の増大を呈したことを示している。 FIG. 31 shows that wild type IgG1-005, IgG1-005-E345K, IgG1-005-E345Q, IgG1-005-E345Y, IgG1-005-E430G, IgG1-005-E430S and IgG1-005-S440Y have little C4 activity While IgG1-005-E345R, IgG1-005-E430F and IgG1-005-E430T showed increased C4d production (C4 activation) compared to wild-type IgG1-005 ing.
実施例37
野生型IgG1-005と比較した、IgG1-005変異体の血漿クリアランス速度
本研究におけるマウスは、Central Laboratory Animal Facility（Utrecht, The Netherlands）のバリアユニットに収容し、フィルタートップケージに入れた上で、水および飼料を自由に摂取させた。実験はすべて、Utrecht Universityの動物倫理委員会によって承認された。1群当たりマウス3匹を用いて、SCIDマウス（C.B-17／Icr-Prkdc<Scid＞／IcrIcoCrl, Charles-River）に対して、500μgの抗体を注射した。
Example 37
Plasma clearance rate of IgG1-005 mutant compared to wild type IgG1-005 The mice in this study were housed in a barrier unit of the Central Laboratory Animal Facility (Utrecht, The Netherlands) and placed in a filter top cage. Ad libitum access to water and feed. All experiments were approved by the Utrecht University Animal Ethics Committee. Three mice per group were used to inject 500 μg of antibody to SCID mice (CB-17 / Icr-Prkdc <Scid> / IcrIcoCrl, Charles-River).
抗体投与から10分後、4時間後、1日後、2日後、7日後、14日後および21日後に、伏在静脈から50μLの血液試料を収集した。血液をヘパリン含有バイアル中に収集し、10,000gで5分間遠心分離した。抗体濃度の決定まで血漿を-20℃で貯蔵した。 50 μL blood samples were collected from the saphenous vein at 10 minutes, 4 hours, 1 day, 2 days, 7 days, 14 days and 21 days after antibody administration. Blood was collected in heparin containing vials and centrifuged at 10,000g for 5 minutes. Plasma was stored at −20 ° C. until determination of antibody concentration.
特定のヒトIgGの濃度は、総hIgG ELISAおよびCD38特異的サンドイッチELISAを用いて決定した。 The concentration of specific human IgG was determined using a total hIgG ELISA and a CD38 specific sandwich ELISA.
総hIgG ELISAのためには、96ウェルMicrolon ELISAプレート（Greiner, Germany）に2μg／mLの濃度でコーティングしたマウスmAb抗ヒトIgG-κクローンMH16（#M1268、CLB Sanquin, Netherlands）を捕捉用抗体として用いた。0.2％ウシ血清アルブミンを加えたPBSでプレートをブロックした後に、試料を添加し、ELISA緩衝液（0.05％ Tween 20および0.2％ウシ血清アルブミンを加えたPBS）中にて系列希釈した上で、室温（RT）にてプレート振盪機上で1時間インキュベートした。その後、プレートをヤギ抗ヒトIgG免疫グロブリン（#109-035-098, Jackson, West Grace, PA）とともにインキュベートし、2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンズチアゾリン-6-硫酸）（ABTS；Roche, Mannheim, Germany）で現像した。吸光度はマイクロプレートリーダー（Biotek, Winooski, VT）にて405nmで測定した。
For total hIgG ELISA, mouse mAb anti-human IgG-κ clone MH16 (# M1268, CLB Sanquin, Netherlands) coated on a 96-well Microlon ELISA plate (Greiner, Germany) at a concentration of 2 μg / mL as capture antibody Using. After blocking the plate with PBS supplemented with 0.2% bovine serum albumin, samples were added and serially diluted in ELISA buffer (PBS supplemented with 0.05
特異的CD38 ELISAのためには、96ウェルMicrolon ELISAプレート（Greiner, Germany）を、Hisタグで標識したCD38細胞外ドメイン（濃度2μg／mL）でコーティングした。プレートをELISA緩衝液でブロックした後に、ELISA緩衝液で系列希釈した試料を添加した上で、室温（RT）にてプレート振盪機上で1時間インキュベートした。その後、プレートを30ng／mlのマウス抗ヒトIgG1-HRP（Sanquin M 1328、クローンMH161-1）とともにインキュベートして、2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンズチアゾリン-6-硫酸）（ABTS；Roche, Mannheim, Germany）で現像した。吸光度はマイクロプレートリーダー（Biotek, Winooski, VT）にて405nmで測定した。
For specific CD38 ELISA, 96-well Microlon ELISA plates (Greiner, Germany) were coated with CD38 extracellular domain (
図32Aは、野生型参照抗体IgG1-005および抗体変異体IgG1-005-E345K、IgG1-005-E345Q、IgG1-005-E345R、IgG1-005-E345Y、IgG1-005-E430F、IgG1-005-E430G、IgG1-005-E430S、IgG1-005-E430T、IgG1-005-S440YのIgGクリアランス速度を示している。変異体IgG1-005-E430S、IgG1-005-E430GおよびIgG1-005-S440Y、IgG1-005-E430T、IgG1-005-E345K、IgG1-005-E345QおよびIgG1-005-E345Yは、野生型IgG1-005の場合とほぼ同等のクリアランス速度を示した。変異体IgG1-005-E430FおよびIgG1-005-E345Rは、より速いクリアランス速度を呈した。血漿クリアランス速度は、用量／AUC（mL／日／kg）として算出した。AUC値（曲線下面積）は濃度-時間曲線から求めた。 FIG.32A shows wild type reference antibody IgG1-005 and antibody variants IgG1-005-E345K, IgG1-005-E345Q, IgG1-005-E345R, IgG1-005-E345Y, IgG1-005-E430F, IgG1-005-E430G IgG clearance rates of IgG1-005-E430S, IgG1-005-E430T, IgG1-005-S440Y are shown. Mutants IgG1-005-E430S, IgG1-005-E430G and IgG1-005-S440Y, IgG1-005-E430T, IgG1-005-E345K, IgG1-005-E345Q and IgG1-005-E345Y are wild-type IgG1-005 The clearance rate was almost the same as in the case of. Mutants IgG1-005-E430F and IgG1-005-E345R exhibited faster clearance rates. Plasma clearance rate was calculated as dose / AUC (mL / day / kg). The AUC value (area under the curve) was determined from the concentration-time curve.
図32Bは、8.0mgの無関係なIgG1-B12対照抗体の腹腔内投与から1日後に静脈内注射した場合の、野生型参照抗体IgG1-005および抗体変異体IgG1-005-E345K、IgG1-005-E345R、IgG1-005-E430G、IgG1-005-E430SおよびIgG1-005-S440YのCD38特異的ELISAによって決定したIgGクリアランス速度を示している。無関係なb12対照の非存在下における野生型参照抗体IgG1を対照として含めた。変異体IgG1-005-E430S、IgG1-005-E430G、IgG1-005-S440YおよびIgG1-005-E345Kは、野生型の場合とほぼ同等のクリアランス速度を示した。変異体IgG1-005-E345Rは、より速いクリアランスを呈した。 FIG. 32B shows wild type reference antibody IgG1-005 and antibody variants IgG1-005-E345K, IgG1-005- when injected intravenously one day after intraperitoneal administration of 8.0 mg of an irrelevant IgG1-B12 control antibody. The IgG clearance rates determined by CD38-specific ELISA of E345R, IgG1-005-E430G, IgG1-005-E430S and IgG1-005-S440Y are shown. A wild type reference antibody IgG1 in the absence of an irrelevant b12 control was included as a control. Mutants IgG1-005-E430S, IgG1-005-E430G, IgG1-005-S440Y and IgG1-005-E345K showed almost the same clearance rate as the wild type. Mutant IgG1-005-E345R exhibited faster clearance.
均等物
当業者は、通例の実験を用いて、本明細書に記載された本発明の具体的な態様の多くの同等物を認識し、または確認することができるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。従属請求項において開示された態様の任意のおよび全ての組み合わせも、本発明の範囲内にあると企図している。
Equivalents Those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments of the invention described herein. Such equivalents are intended to be encompassed by the following claims. Any and all combinations of the embodiments disclosed in the dependent claims are intended to be within the scope of the present invention.
Claims (76)
該親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345XおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階。 A method for enhancing complement dependent cytotoxicity (CDC) of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, comprising the following steps:
Introducing into the parent polypeptide a mutation in one or more amino acid residues selected from the group corresponding to E430X, E345X and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain.
該親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345XおよびS440Wに対応する1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階。 A method for enhancing CDC and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, comprising the following steps:
Introducing a mutation in one or more amino acid residues corresponding to E430X, E345X and S440W in the Fc region of human IgG1 heavy chain into the parent polypeptide.
該第1および第2の抗原結合領域が、同じ抗原上または異なる抗原上の異なるエピトープと結合し、かつ、前記方法が、該第1および／または第2のCH2-CH3領域に対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430X、E345X、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を導入する段階を含み；かつ
該第1のCH2-CH3領域が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸変異を含み；かつ、該第2のCH2-CH3領域が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択される位置にさらなるアミノ酸変異を含み；かつ、該第1のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸変異が、該第2のCH2-CH3領域における該さらなるアミノ酸変異とは異なる、前記方法。 A first polypeptide comprising an immunoglobulin first CH2-CH3 region and a first antigen-binding region and a second polypeptide comprising an immunoglobulin second CH2-CH3 region and a second antigen-binding region; A method for enhancing the complement dependent cytotoxicity (CDC) of a parent antibody, which is a bispecific antibody comprising a peptide, comprising:
The first and second antigen binding regions bind to different epitopes on the same antigen or on different antigens, and the method is directed against the first and / or second CH2-CH3 regions, Introducing a mutation in one or more amino acid residues selected from the group corresponding to E430X, E345X, S440Y and S440W in the Fc region of the IgG1 heavy chain; and the first CH2-CH3 region comprises: A further amino acid mutation at a position selected from those corresponding to K409, T366, L368, K370, D399, F405 and Y407 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain; and the second CH2-CH3 region is human An additional amino acid mutation at a position selected from those corresponding to F405, T366, L368, K370, D399, Y407 and K409 in the Fc region of the IgG1 heavy chain; and the additional amino acid in the first CH2-CH3 region Mutations in the second CH2-CH3 region The method, which is different from an amino acid mutation.
（i）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するアミノ酸残基のそれぞれにおける変異であって、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、変異、
（ii）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447および448に対応するアミノ酸残基のそれぞれにおける変異、例えばヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447K／R／Hおよび448E／D、好ましくはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447Kおよび448E、または
（iii）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447、448および449に対応するアミノ酸残基のそれぞれにおける変異、例えばヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447D／E、448K／R／Hおよび449P、好ましくはヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK447E、448Kおよび449P
をさらに導入する段階
を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。 Introducing a mutation other than S440Y and S440W at one or more positions, and (i) a mutation in each of the amino acid residues corresponding to K439 and S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, provided that S440 A mutation, provided that the mutation in is not S440Y or S440W,
(Ii) mutations in each of the amino acid residues corresponding to K447 and 448 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, for example K447K / R / H and 448E / D, preferably human IgG1 heavy chain in the Fc region of the human IgG1 heavy chain (Iii) mutations in each of the amino acid residues corresponding to K447, 448 and 449 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, eg, K447D / E, 448K in the Fc region of the human IgG1 heavy chain / R / H and 449P, preferably K447E, 448K and 449P in the Fc region of the human IgG1 heavy chain
12. The method according to any one of claims 1 to 11, further comprising the step of introducing.
（ii）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される1つまたは複数のアミノ酸残基における変異を含まない、前記第2の親ポリペプチドを提供する段階、
を含む、請求項16に記載の方法。 (I) 1 selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain with respect to the first parent polypeptide Introducing mutations in one or more amino acid residues;
(Ii) including mutations in one or more amino acid residues selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of human IgG1 heavy chain Providing the second parent polypeptide,
The method of claim 16 comprising:
（i）前記第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置K439に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階；および
（ii）前記第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階であって、ただし、該変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、段階
をさらに含み、段階（i）および（ii）が代替的に、
（iii）該第1の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置S440に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階であって、ただし、該変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする、段階；
（iv）該第2の親ポリペプチドに対して、ヒトIgG1重鎖のFc領域における位置K439に対応するアミノ酸残基に第2の変異を導入する段階
であってもよい、請求項15〜18のいずれか一項に記載の方法。 The mutation at one or more positions is different from S440Y and S440W, and the method comprises:
(I) introducing a second mutation into the amino acid residue corresponding to position K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain with respect to the first parent polypeptide; and (ii) the second parent poly A step of introducing a second mutation into the amino acid residue corresponding to S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain with respect to the peptide, provided that the mutation is neither S440Y nor S440W Further comprising steps (i) and (ii)
(Iii) a step of introducing a second mutation into an amino acid residue corresponding to position S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain with respect to the first parent polypeptide, provided that the mutation is S440Y Stage, provided that it is not S440W;
(Iv) The second parent polypeptide may be a step of introducing a second mutation at an amino acid residue corresponding to position K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain. The method as described in any one of.
ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択される第1の変異；ならびに
以下に対応する群から選択される第2の変異を含む、前記変異体：
（i）ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439およびS440に対応するアミノ酸残基、ただし、S440における変異がS440YでもS440Wでもなく、かつ、該第1の変異がS440YもしくはS440Wであるならば該第2の変異はヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応するアミノ酸残基にある；
（ii）ヒトIgG1重鎖のFc領域における、K447D／Eに対応するか、もしくはK447K／R／Hおよび448Pに対応するアミノ酸残基；または
（iii）ヒトIgG1重鎖のFc領域における、K447D／Eに対応するか、もしくはK447K／R／Hおよび448K／R／Hおよび449Pに対応するアミノ酸残基。 A variant of a parent polypeptide comprising an immunoglobulin Fc domain and a binding region, comprising:
A first mutation selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain; and selected from the group corresponding to Said variant comprising a second mutation:
(I) amino acid residues corresponding to K439 and S440 in the Fc region of human IgG1 heavy chain, provided that the mutation in S440 is neither S440Y nor S440W, and the first mutation is S440Y or S440W 2 mutations are in the amino acid residue corresponding to K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain;
(Ii) amino acid residues corresponding to K447D / E or corresponding to K447K / R / H and 448P in the Fc region of human IgG1 heavy chain; or (iii) K447D / in the Fc region of human IgG1 heavy chain Amino acid residues corresponding to E or corresponding to K447K / R / H and 448K / R / H and 449P.
該第1のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409、T366、L368、K370、D399、F405およびY407に対応するものから選択されるアミノ酸残基におけるさらなる変異を含み；かつ
該第2のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405、T366、L368、K370、D399、Y407およびK409に対応するものから選択されるアミノ酸残基におけるさらなる変異を含み、かつ、該第1のポリペプチドにおける該さらなる変異が、該第2のポリペプチドにおける該さらなる変異とは異なる、前記変異体。 A first polypeptide comprising an immunoglobulin first CH2-CH3 region and a first antigen-binding region and a second polypeptide comprising an immunoglobulin second CH2-CH3 region and a second antigen-binding region; A variant of a parent antibody that is a bispecific antibody comprising a peptide, wherein the first and second antigen binding regions bind to different epitopes on the same antigen or on different antigens; and And / or the second CH2-CH3 region is selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain or A further mutation in an amino acid residue comprising a plurality of mutations and wherein the first polypeptide is selected from those corresponding to K409, T366, L368, K370, D399, F405 and Y407 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain And wherein the second polypeptide is a Fc region of a human IgG1 heavy chain Further mutations in amino acid residues selected from those corresponding to F405, T366, L368, K370, D399, Y407 and K409, and wherein the further mutation in the first polypeptide comprises the second poly Said variant different from said further mutation in a peptide.
（ii）前記第2のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405に対応するアミノ酸残基におけるさらなる変異、例えばF405Lを含むか；または代替的に
（iii）該第1のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるF405に対応するアミノ酸残基におけるさらなる変異、例えばF405Lを含み；かつ
（iv）該第2のポリペプチドが、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK409に対応するアミノ酸残基におけるさらなる変異、例えばK409Rを含む、
請求項49に記載の変異体。 (I) the first polypeptide comprises a further mutation in the amino acid residue corresponding to K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, for example K409R; and (ii) the second polypeptide comprises human IgG1 heavy A further mutation in an amino acid residue corresponding to F405 in the Fc region of the chain, eg F405L; or alternatively (iii) the first polypeptide is an amino acid corresponding to F405 in the Fc region of a human IgG1 heavy chain A further mutation at a residue, for example F405L; and (iv) the second polypeptide comprises a further mutation at an amino acid residue corresponding to K409 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, for example K409R;
50. A variant according to claim 49.
前記第2の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440YおよびS440Wに対応する群から選択されるアミノ酸残基における1つまたは複数の変異を含まない、請求項55に記載の組成物。 Said first variant comprises one or more mutations selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of human IgG1 heavy chain And the second variant is in an amino acid residue selected from the group corresponding to E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y and S440W in the Fc region of the human IgG1 heavy chain 56. The composition of claim 55, wherein the composition does not comprise one or more mutations.
（ii）前記第2の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における変異をさらに含み、ただし、該変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とする；または（i）および（ii）が代替的に、
（iii）該第1の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるS440に対応する位置における変異をさらに含み、ただし、該変異がS440YでもS440Wでもないことを条件とし；かつ
（iv）該第2の変異体が、ヒトIgG1重鎖のFc領域におけるK439に対応する位置における変異をさらに含む；
であってもよい、請求項54〜57のいずれか一項に記載の組成物。 (I) the first mutant further comprises a mutation at a position corresponding to K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain; and (ii) the second mutant is in the Fc region of the human IgG1 heavy chain. Further comprising a mutation at a position corresponding to S440, provided that the mutation is neither S440Y nor S440W; or (i) and (ii) alternatively
(Iii) the first variant further comprises a mutation at a position corresponding to S440 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain, provided that the mutation is not S440Y or S440W; and (iv) the The second variant further comprises a mutation at a position corresponding to K439 in the Fc region of the human IgG1 heavy chain;
58. The composition according to any one of claims 54 to 57, which may be
（ii）前記第2の変異体が、該第1の変異体上の該プロドラッグに対する活性化因子を含む；または（i）および（ii）が代替的に、
（iii）該第2の変異体がプロドラッグを含み、かつ
（iv）該第1の変異体が、該第2の変異体上の該プロドラッグに対する活性化因子を含む
であってもよい、請求項54〜59のいずれか一項に記載の組成物。 (I) the first variant further comprises a prodrug, and (ii) the second variant comprises an activator for the prodrug on the first variant; or (i) And (ii) is alternatively
(Iii) the second variant comprises a prodrug, and (iv) the first variant may comprise an activator for the prodrug on the second variant, 60. The composition according to any one of claims 54 to 59.
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