JP2018117567A - Cell culture device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、動物細胞や微生物などの生体細胞を培養して有用生産物を収穫する細胞培養装置に関する。 The present invention relates to a cell culture apparatus for culturing living cells such as animal cells and microorganisms to harvest useful products.
動物細胞や微生物など生体の細胞を培養することにより抗体タンパクなどの有用物質を生産することができる。培養方法として、回分培養、流加培養、高密度流加培養、連続培養、高密度連続培養がある。 Useful substances such as antibody proteins can be produced by culturing living cells such as animal cells and microorganisms. Examples of the culture method include batch culture, fed-batch culture, high-density fed-batch culture, continuous culture, and high-density continuous culture.
上記培養方法はいずれも培養環境、すなわち培養槽内を培養に適切な条件に維持する必要がある。適切な培養環境を維持するための運転パラメータとして、一般的に溶存酸素濃度、ｐＨ、温度、撹拌速度などが挙げられ、上記パラメータが、ある設定値の範囲内を維持するように運転制御が行われている。 In any of the above culture methods, it is necessary to maintain the culture environment, that is, the inside of the culture tank under conditions suitable for culture. The operation parameters for maintaining an appropriate culture environment generally include dissolved oxygen concentration, pH, temperature, stirring speed, etc., and operation control is performed so that the above parameters are maintained within a certain set value range. It has been broken.
例えば、特許文献１には、生体細胞の培養に適切な培養環境で必要に応じて運転状態の目標値を適切に変更する培養制御が記載されている。
For example,
生産性向上のために刻々と変化する細胞の状態に合わせて制御するには、細胞の増殖と生産物産生に適切な槽内条件を整える必要があり、培養環境因子（例えば、培地中の栄養成分濃度、酸素濃度、攪拌回転数、細胞密度、微生物個数濃度、溶存酸素濃度等）を計測して、生産性および製品の品質特性が向上もしくは一定の基準を維持するように制御する必要がある。そのためには、生産性および製品の品質特性と培養環境因子を細胞の代謝モデルを基に定式化し、生産性および製品の品質特性が最適値となるように培養環境因子の調整が必要である。 In order to control according to the state of cells that change every moment to improve productivity, it is necessary to prepare the conditions in the tank suitable for cell growth and product production, and culture environment factors (for example, nutrients in the medium) Component concentration, oxygen concentration, stirring speed, cell density, microbial count concentration, dissolved oxygen concentration, etc.) must be measured and controlled to improve productivity and maintain product quality characteristics or maintain a certain standard . For that purpose, it is necessary to formulate the productivity and product quality characteristics and the culture environment factors based on the cell metabolism model, and to adjust the culture environment factors so that the productivity and product quality characteristics become optimum values.
しかしながら、細胞内の代謝現象は非常に複雑であり、ある細胞の状態では定式化した細胞の代謝モデルで再現できるが、培養中に変化する細胞の状態をすべて細胞の代謝モデルで再現することは難しい。 However, intracellular metabolic phenomena are very complex and can be reproduced with a cell metabolism model formulated in a certain cell state. However, it is not possible to reproduce all cell states that change during culture with a cell metabolism model. difficult.
培養中の細胞の状態は刻々と変化し、培養初期の状況では良好に制御されていたものが、経時的に細胞の状態が変わることによって目標とする培養環境を維持できない状況となることがある。通常、培養装置は計測手段を多数設置しているが、各計測パラメータから細胞の状態を判断することは、細胞代謝の複雑性から極めて困難である。そのため、特許文献１を含む従来法では、培養槽内に不適切な培養環境が存在していたとしても、これを検出した上で最適環境を維持することまでは対応していない。
The state of cells in culture changes every moment, and things that were well controlled in the initial stage of culture may not be able to maintain the target culture environment due to changes in the state of cells over time . Usually, the culture apparatus is provided with a large number of measuring means, but it is extremely difficult to determine the state of cells from each measurement parameter due to the complexity of cell metabolism. For this reason, in the conventional method including
そこで、本発明の目的は、生体細胞の培養環境を適切に維持し、安定させる運転制御ができる細胞培養装置を提供することにある。 SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a cell culture apparatus that can perform operation control that appropriately maintains and stabilizes the culture environment of living cells.
前記課題を解決するために、本発明は、動物細胞あるいは微生物などの生体細胞を培養する細胞培養装置であって、生体細胞を培養する培養槽と、オンライン／インラインモニタリング装置と、無菌サンプリング装置、分析装置、データ収集装置、データ解析装置、クラスタ分析機能を備えた細胞状態判別装置と、クラスタごとの細胞の反応モデルの参照機能を備えた運転制御補正装置と、を備える。 In order to solve the above problems, the present invention provides a cell culture apparatus for culturing living cells such as animal cells or microorganisms, a culture vessel for culturing living cells, an on-line / in-line monitoring apparatus, a sterile sampling apparatus, An analysis device, a data collection device, a data analysis device, a cell state determination device having a cluster analysis function, and an operation control correction device having a cell reaction model reference function for each cluster.
本発明によれば、前記細胞状態判別装置で判別されたクラスタにより、設定した許容値内であればクラスタに応じた細胞の反応モデルから培養の制御値を決定し、設定した許容値外であれば培養の終了を決定することができる。生体細胞の培養に適切な培養環境が確実に維持できていることを検証しつつ培養を行い、必要に応じて目標値の変更を適切に実施することができる。 According to the present invention, if the cluster determined by the cell state determination device is within the set allowable value, the culture control value is determined from the cell reaction model corresponding to the cluster, and if it is outside the set allowable value. The end of the culture can be determined. Culturing is performed while verifying that a culture environment suitable for culturing living cells can be reliably maintained, and the target value can be appropriately changed as necessary.
本発明の実施形態について、ＣＨＯ細胞の培養を一例として説明する。本発明の実施方法は、ＣＨＯ細胞に限定されず、微生物、酵母、動物細胞、植物などにも適用できる。 The embodiment of the present invention will be described by taking CHO cell culture as an example. The implementation method of the present invention is not limited to CHO cells, but can also be applied to microorganisms, yeasts, animal cells, plants, and the like.
＜細胞状態の分類方法＞
培養槽内における細胞の状態を各計測パラメータからクラスタ分析技術を用いて識別する。クラスタ分析とは、異なる性質のものが混ざり合った集団から、互いに似た性質を持つものを集め、クラスタを作る方法で、様々な手法が存在する。分類の形式（種類、生成）においては階層的方法か非階層的方法、分類に用いる対象間の距離（類似度）においてはユークリッド距離、マハラノビス距離、コサイン距離など、クラスタの合併方法（クラスタ間の距離の測定方法）においてはウォード法、群平均法、最短距離法、最長距離法などがある。本発明においては上記いずれの方法を用いてもよいが、一例として、適応共鳴理論（ＡＲＴ：Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｔｈｅｏｒｙ）を用いた方法について示す。適応共鳴理論は典型的な認知情報処理モデルとされ、入力と記憶の類似度に基づいてカテゴリを適応的に生成・拡大させるシステムである。ニューラルネットワークの学習もよく用いられが、この手法は、新しいパターンを学習すると過去の記憶が失われ、過去の記憶を重視すると新しいパターンの入手が困難になる問題が存在する。一方、適応共鳴理論では、入力と記憶の類似度はビジランスパラメータ（警戒パラメータ）を分類尺度として用いることにより、上記問題点を解決できる。細胞培養では、過去のデータ記憶（実績）を基に細胞の状態を判断するとともに、新しいパターンの細胞状態も出てくるため、本実施例では適応共鳴理論を適用した。
<Classification method of cell state>
The state of cells in the culture tank is identified from each measurement parameter using a cluster analysis technique. Cluster analysis is a method of creating a cluster by collecting items having similar properties from a group in which different properties are mixed, and there are various methods. The classification method (type, generation) is a hierarchical or non-hierarchical method, and the distance between objects used for classification (similarity) is the Euclidean distance, Mahalanobis distance, cosine distance, etc. Examples of the distance measuring method include a Ward method, a group average method, a shortest distance method, and a longest distance method. In the present invention, any of the above methods may be used. As an example, a method using an adaptive resonance theory (ART) will be described. Adaptive resonance theory is a typical cognitive information processing model, and is a system that adaptively generates and expands categories based on the similarity between input and memory. Although learning of a neural network is often used, this method has a problem that a past pattern is lost when a new pattern is learned, and it becomes difficult to obtain a new pattern when the past memory is emphasized. On the other hand, in the adaptive resonance theory, the above-mentioned problem can be solved by using a vigilance parameter (warning parameter) as a classification measure for the similarity between input and memory. In cell culture, the state of cells is determined based on past data storage (actual results), and a new pattern of cell states also appears. Therefore, in this example, adaptive resonance theory was applied.
ここで細胞の状態の分類例を図３に示す。改善もしくは一定に維持したい変数（例えば、細胞数の時間積分、細胞数、抗体濃度、糖鎖修飾割合、夾雑物割合など）を目的変数とし、培養槽内において計測されるプロセス値（オンライン、インライン、オフラインいずれでもよい）で、培養環境因子（例えば、ｐＨ、溶存酸素、溶存二酸化炭素、せん断応力、攪拌回転速度、温度、栄養濃度など）および/あるいは状態変数（例えば、細胞増殖速度、生存率、細胞径の平均、細胞径の分布、タンパク生産速度、乳酸分泌速度、アンモニア分泌速度など）のデータを入力値とし、適応共鳴理論解析を行うと、各プロセス値の組合せに応じて、細胞の状態（例えば、細胞数、増殖速度、生存率、細胞代謝）あるいは生産量・品質を図３に示すようにカテゴリ分類することができる。分類１、分類２、分類３、分類４の各カテゴリの内部は同一の細胞状態とみなすことができる。
Here, FIG. 3 shows an example of classification of cell states. Process values (online, inline) that are measured in the culture tank with variables that you want to improve or maintain constant (for example, time integration of the number of cells, cell number, antibody concentration, sugar chain modification ratio, contaminant ratio, etc.) Culture environment factors (eg, pH, dissolved oxygen, dissolved carbon dioxide, shear stress, stirring speed, temperature, nutrient concentration, etc.) and / or state variables (eg, cell growth rate, viability) , Cell diameter average, cell diameter distribution, protein production rate, lactate secretion rate, ammonia secretion rate, etc.) as input values, and adaptive resonance theory analysis is performed, depending on the combination of each process value, The state (for example, cell number, growth rate, survival rate, cell metabolism) or production / quality can be classified into categories as shown in FIG. The inside of each category of
培養槽内の様々なプロセスデータは適応共鳴理論解析を行うことで、正常状態のグループや異常状態のグループを記憶させ、また過去に経験のない状態の場合も新規グループとしてカテゴリを生成させることができる。 By performing adaptive resonance theory analysis on various process data in the culture tank, it is possible to memorize normal groups and abnormal groups, and to create categories as new groups even if there is no previous experience. it can.
図１に示す細胞培養装置において、ＣＨＯ細胞を１Ｌ培養にて培養し（培養条件：１０％ウシ血清を含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地）、そのモニタリングパラメータを適応共鳴理論により分析した。プロセス値が正常な培養（溶存酸素濃度を２．７ｍｇ／Ｌ、温度を３７℃、攪拌速度５０ｒｐｍ、ｐＨ７．２）と、プロセス値が設定値とずれた培養（溶存酸素の場合、温度の場合）で培養した際の細胞増殖曲線を図４に示す。正常培養と溶存酸素がずれた場合は、細胞増殖に違いは認められず、温度がずれた場合には、細胞増殖が低下することがわかる。 In the cell culture apparatus shown in FIG. 1, CHO cells were cultured in 1 L culture (culture conditions: Ham's F12 medium containing 10% bovine serum), and the monitoring parameters were analyzed by adaptive resonance theory. Culture with normal process values (dissolved oxygen concentration: 2.7 mg / L, temperature: 37 ° C., stirring speed: 50 rpm, pH 7.2) and culture with process values deviating from set values (in the case of dissolved oxygen, temperature) FIG. 4 shows a cell growth curve when the cells are cultured in (1). It can be seen that there is no difference in cell growth when the normal culture and dissolved oxygen deviate, and that the cell growth decreases when the temperature deviates.
本培養のプロセス値を適応共鳴理論にて分析すると図５のようになった。正常培養と溶存酸素のずれた培養は、同じカテゴリの経時変化を示したが、温度がずれた場合には、カテゴリの経時変化が異なることがわかる。この結果は、図４の細胞増殖曲線の結果と一致し、溶存酸素のずれは異常ではないが、温度のずれは異常となることが判断可能となる。 When the process value of the main culture was analyzed by the adaptive resonance theory, it was as shown in FIG. The normal culture and the culture with dissolved oxygen showed the same category change over time, but it can be seen that the category change with time is different when the temperature is different. This result agrees with the result of the cell growth curve of FIG. 4, and it can be determined that the difference in dissolved oxygen is not abnormal, but the temperature shift is abnormal.
カテゴリが経時的に変化するのは、細胞培養を行うと、細胞は栄養を消費し、老廃物を排出するため、培養環境が経時的に変化し、それが本クラスタ分析にも反映されたためである。適応共鳴理論を用いた本クラスタ分析では、条件が変化しない定常条件だけでなく、細胞培養のように経時的に条件が変化する非定常条件でも適用可能であることがわかる。また、時刻とカテゴリの組合せにより、培養状態の異常の有無を検知することが可能であることを確認した（図５から判断できるように単にカテゴリだけでは、異常であっても違う時刻で同じカテゴリが生成することがあるため）。 The category changes over time because when cells are cultured, the cells consume nutrients and discharge waste products, so the culture environment changes over time, which is reflected in this cluster analysis. is there. This cluster analysis using the adaptive resonance theory can be applied not only to the steady condition where the condition does not change, but also to the non-steady condition where the condition changes with time, such as cell culture. In addition, it was confirmed that the presence or absence of abnormalities in the culture state can be detected by the combination of time and category (as can be determined from FIG. May generate).
以上述べたように、想定される異常な培養条件で培養データを取得し、時刻とカテゴリを記録し、データベース化しておくことで、新たに細胞培養した際の細胞の状態を正常と異常に分類することができるとともに、異常の際の原因もデータベースとの照合で特定することができる。
＜細胞の状態に合わせた制御のためのモデル定式化＞
細胞の培養過程で、細胞状態の分類にて異常と判断された場合、正常な培養状態に戻すため、ｐＨ、溶存酸素、溶存二酸化炭素、せん断応力、攪拌回転速度、温度、栄養濃度などの制御因子をフィードバック制御する場合がある。その際、異常の原因ごとに制御方式が異なるため、原因ごとに制御方式のモデル定式化することが望ましく、原因ごとに、物理モデル、生物化学モデル等のモデル定式化が望ましい。一例として、細胞内代謝解析を利用したモデル定式化を以下に述べる。
As described above, by acquiring culture data under the expected abnormal culture conditions, recording the time and category, and creating a database, the state of the cell when newly cultured is classified as normal or abnormal In addition, the cause of the abnormality can be identified by collation with the database.
<Model formulation for control according to cell condition>
Control of pH, dissolved oxygen, dissolved carbon dioxide, shear stress, stirring rotation speed, temperature, nutrient concentration, etc. to return to the normal culture state if it is judged abnormal in the cell culture process during the cell culture process The factor may be feedback controlled. At that time, since the control method differs depending on the cause of the abnormality, it is desirable to formulate a model of the control method for each cause, and it is desirable to formulate a model such as a physical model and a biochemical model for each cause. As an example, model formulation using intracellular metabolism analysis is described below.
ＣＨＯ細胞での細胞内代謝解析方法の一例を以下に述べる。本実施例では代謝解析シミュレーションを行った。シミュレーションでは解析対象となる細胞の細胞内代謝経路を想定する必要がある。本実施例では、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ細胞の細胞内代謝経路モデルを使用した。 An example of the intracellular metabolism analysis method in CHO cells is described below. In this example, a metabolic analysis simulation was performed. In the simulation, it is necessary to assume the intracellular metabolic pathway of the cell to be analyzed. In this example, an intracellular metabolic pathway model of CHO cells, which are Chinese hamster ovary cells, was used.
ＣＨＯ細胞の細胞内代謝経路では、（１）解糖系（生物が使いやすい有機酸に変換）、（２）ペントースリン酸経路（補酵素ＮＡＤＰＨの生産過程、ヌクレオチド、ヒスチジンの合成材料）、（３）ピルビン酸−乳酸代謝（嫌気呼吸でのエネルギー生産）、（４）ＴＣＡ Ｃｙｃｌｅ（効率の良いエネルギー生産）、（５）アナプレロティック反応糖新生（不足物質の補充、糖新生に関与）、（６）脂肪酸代謝（タンパク質修飾（機能・局在制御、シグナル伝達））、（７）グリセロール３−リン酸代謝（脂質代謝に関与）、（８）アミノ酸代謝（タンパク合成に関与）を網羅しており、詳細に細胞内の代謝を表現することができることが特徴である。 In the intracellular metabolic pathway of CHO cells, (1) glycolysis (converted into an organic acid easy to use by organisms), (2) pentose phosphate pathway (coenzyme NADPH production process, nucleotide, histidine synthesis material), (3 ) Pyruvate-lactic acid metabolism (energy production in anaerobic respiration), (4) TCA cycle (efficient energy production), (5) Anaprerotic reaction gluconeogenesis (replenishment of deficient substances, gluconeogenesis), ( 6) Fatty acid metabolism (protein modification (function / localization control, signal transduction)), (7) Glycerol 3-phosphate metabolism (involved in lipid metabolism), (8) Amino acid metabolism (involved in protein synthesis) It is characterized by being able to express intracellular metabolism in detail.
代謝フラックスの推定方法の概念を図６に示す。シミュレーションでは最初にランダムな代謝フラックスの値（図６中、Ｒ１からＲ８）を与え、代謝経路を基に、定常状態での細胞内の各代謝物質に含まれる同位体炭素の数の比を計算する。この計算値と実験で測定した細胞内代謝物質の同位体炭素数比との比較を行い、統計学的に有意に差がある場合（異なっている場合）は、シミュレーションによる代謝物質中の同位体数炭素比の値を実験による代謝物質中の同位体炭素数比の値との平均自乗誤差が最小となるようにシミュレーションによる代謝フラックスの値を修正し、同位体炭素比を計算する。そして、統計学的な有意差がなくなるまで、以上のような実験による代謝物質中の同位体炭素数比の値を比較するという操作を繰り返す。通常は２、３回の繰り返し計算で推定できるが、何度繰り返しても統計学的な有意差が生じる場合は、代謝経路モデルが間違っているか、実験データが適切に測定されていないと判断する。また、本方法では、統計学的な考え方より推定値の信頼区間も求めることが出来る。まず、推定代謝フラックスを求め、その推定代謝フラックス（図６中、Ｒ１からＲ８）の内１つの代謝フラックス（例えばＲ３）に着目し、少しずつその代謝フラックスの値を大きくしていく。そして、実験値との比較で統計学的に有意差が出たところで、その代謝フラックスの上限値となる。下限は推定フラックスの値から少しずつ値を下げていき、統計学的に有意差が出たところで下限値となる。順次この操作を他の代謝フラックスに行うことで、すべての代謝フラックスで信頼区間を求めることが出来る。 The concept of the metabolic flux estimation method is shown in FIG. In the simulation, first, random metabolic flux values (R1 to R8 in FIG. 6) are given, and the ratio of the number of isotope carbons contained in each metabolite in the cell in the steady state is calculated based on the metabolic pathway. To do. Compare this calculated value with the isotope carbon number ratio of the intracellular metabolite measured in the experiment. If there is a statistically significant difference (if different), the isotope in the metabolite by simulation The metabolic flux value by simulation is corrected so that the mean square error between the number carbon ratio value and the isotope carbon number ratio value in the metabolite by experiment is minimized, and the isotope carbon ratio is calculated. Then, the operation of comparing the values of the isotope carbon number ratio in the metabolite by the above experiment is repeated until there is no statistically significant difference. Usually it can be estimated by a few iterations, but if there is a statistically significant difference after many iterations, it is judged that the metabolic pathway model is wrong or that the experimental data is not measured properly . In this method, the confidence interval of the estimated value can also be obtained from a statistical concept. First, an estimated metabolic flux is obtained, and attention is paid to one metabolic flux (for example, R3) of the estimated metabolic flux (R1 to R8 in FIG. 6), and the value of the metabolic flux is gradually increased. Then, when there is a statistically significant difference in comparison with the experimental value, the upper limit value of the metabolic flux is reached. The lower limit is gradually reduced from the estimated flux value, and becomes the lower limit when there is a statistically significant difference. By sequentially performing this operation on other metabolic fluxes, confidence intervals can be obtained for all metabolic fluxes.
上記シミュレーションでは実験による観測パラメータ（細胞内の各代謝物質の同位体炭素数比及び細胞外代謝フラックス）を必要とするが、通常、対象細胞あるいは使用する培地等によって、必要とする観測パラメータは異なる。本実施例では、細胞外フラックスとして、グルタミン、グルコース、乳酸、グルタミン酸の４種、細胞内代謝物としては、Ｐｒｙ、Ｌａｃ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｕｃ、Ｆｕｍ、Ｓｅｒ、Ａｋｇ、Ｍａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｃｉｔの１３種類を測定パラメータとした。 The above simulation requires experimental observation parameters (the isotope carbon number ratio and extracellular metabolic flux of each metabolite in the cell), but usually the required observation parameters differ depending on the target cell or the medium used. . In this example, as the extracellular flux, 4 types of glutamine, glucose, lactic acid, and glutamic acid, and intracellular metabolites include Pry, Lac, Ala, Gly, Suc, Fum, Ser, Akg, Mal, Asp, Glu, Thirteen types of Gln and Cit were used as measurement parameters.
実験方法を以下に示す。細胞内代謝物の測定では、３つの工程（細胞内代謝物抽出、代謝物の誘導体化、ＧＣ／ＭＳ分析）からなる。細胞内代謝物抽出では、培養槽からＣＨＯ細胞を無菌的にサンプリング後、ＨＣｌ・１０５℃による加水分解処理を行った。その後、純粋に溶解し、０．２２μｍフィルタでフィルトレーションを行い、エバポレータにて乾燥した。代謝物の誘導体化では、乾燥したサンプルに２％ ｍｅｔｈｏｘｙａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ （Ｐｉｅｒｃｅ社）を３０μＬずつ加え、軽くボルテックスにより混合し、卓上遠心で溶液を中部下部に集めた後、ヒートブロック上で５５℃、２時間反応させた。ＭＢＴＳＴＦＡ＋１％ ＴＢＤＭＣＳ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ社）を４５μＬずつ加え、軽くボルテックスにより混合し、卓上遠心で溶液を中部下部に集めた後、ヒートブロック上で３７℃、１時間反応させた。反応溶液をＧＣ／ＭＳ分析用容器に入れ替え、分析まで常温で保管した。ＧＣ／ＭＳ分析では、ＧＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用い、カラムは３０ｍ ＤＢ−３５ＭＳ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｃｏｌｕｍｎを使用し、測定条件はカラム温度勾配が３．５℃／ｍｉｎで１００℃から３００℃までの温度制御で、注入口温度２７０℃、キャリアガスはヘリウムガスで流量１ｍＬ／ｍｉｎで分析を行った。これらの細胞内代謝物分析データを利用して細胞内代謝フラックスを推定した。 The experimental method is shown below. Measurement of intracellular metabolites consists of three steps (extraction of intracellular metabolites, derivatization of metabolites, and GC / MS analysis). In the extraction of intracellular metabolites, CHO cells were aseptically sampled from the culture tank and then subjected to hydrolysis treatment with HCl · 105 ° C. Then, it melt | dissolved purely, filtered with a 0.22 micrometer filter, and dried with the evaporator. For derivatization of metabolites, 30 μL of 2% methoxyhydrochloride (Pierce) was added to the dried sample, mixed gently by vortexing, and the solution was collected at the lower part of the middle part by tabletop centrifugation. Reacted for hours. MBTSTFA + 1% TBDMCS solution (Pierce) was added 45 μL at a time, mixed gently by vortexing, collected on the lower part of the center by tabletop centrifugation, and then reacted at 37 ° C. for 1 hour on a heat block. The reaction solution was replaced with a GC / MS analysis container and stored at room temperature until analysis. In GC / MS analysis, GC-MS / MS (Agilent) was used, the column used was 30m DB-35MS capillary column, and the measurement conditions were from 100 ° C to 300 ° C with a column temperature gradient of 3.5 ° C / min. Under the temperature control, the inlet temperature was 270 ° C., the carrier gas was helium gas, and the flow rate was 1 mL / min. Using these intracellular metabolite analysis data, the intracellular metabolic flux was estimated.
次に、モデル定式化について述べる。様々な培養条件の下に実際に培養実験を行い、細胞内代謝解析を行うことで、代謝経路モデルを基にした定量的なモデル化を行う。培養条件ごとに代謝フラックスが定量的に決まるので、それをデータベース化しておき、培養中に細胞状態が異常と判断された際には、基の状態に戻すための代謝フラックスを推定し、事前に取得してあるデータベースと照合し、その推定値に合致もしくは近似できる代謝フラックス群を有する培養条件を決定し、その条件となるように培養条件の設定値を見直す。 Next, model formulation will be described. Quantitative modeling based on metabolic pathway models is performed by conducting actual cell culture experiments under various culture conditions and analyzing intracellular metabolism. Since the metabolic flux is quantitatively determined for each culture condition, create a database, and if the cell state is determined to be abnormal during culture, estimate the metabolic flux to return to the original state and Collation with the acquired database, the culture condition having a metabolic flux group that matches or approximates the estimated value is determined, and the set value of the culture condition is reviewed so as to be the condition.
以上は、適正な細胞状態を維持するための培養に必要な事前準備（データベース構築等）である。次に、それを用いた培養制御について、１Ｌ培養槽を用いた実施例を説明する。
［細胞及び培地］
培養実験には糖タンパクである組織性プラスミノーゲンアクティベータ（ｔＰＡ）を産生するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞；ＣＲＬ−９６０６細胞）（付着培養／浮遊培養兼用）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）より購入し、使用した。使用培地はＨａｍ’ｓ Ｆ１２基本培地にＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ）（最終濃度１０％）、抗生物質であるペニシリン、ストレプトマイシンを添加した培地を用いた。
［浮遊細胞の調製（付着細胞から浮遊細胞への馴化）］
培養フラスコを用いて付着状態で培養したＣＨＯ細胞をトリプシンで剥離し、遠心分離（室温、５００ｘｇ、５分）によりトリプシン溶液を取り除いた後、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地で希釈し、スピンナフラスコを用い１×１０５個／ｍＬの細胞濃度、容量１００ｍＬでインキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２、湿度９０％以上）にて攪拌培養した。本実験では、上記手順で付着性細胞を浮遊細胞に馴化させた細胞を用いた。
［培養操作］
１Ｌ培養槽を用いて、前節で述べた培養条件で培養を行った。播種密度は１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養中は、溶存酸素２．７ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．２、温度３７℃を維持するように制御した。無菌サンプリングを１日に１〜２回行い、培養液成分分析を行った。
［培養液成分の分析］
サンプリングした培養液より、（１）生細胞数の測定、（２）培地成分であるグルコース、グルタミン、乳酸、アンモニアの分析方法を以下に記す。
The above is preliminary preparation (database construction etc.) required for culture | cultivation for maintaining a suitable cell state. Next, an embodiment using a 1 L culture tank will be described for culture control using the same.
[Cells and media]
For culture experiments, Chinese hamster ovary cells (CHO cells; CRL-9606 cells) that produce tissue protein plasminogen activator (tPA), a glycoprotein, were used as American Type Culture Collection (ATCC). More purchased and used. The medium used was Ham's F12 basal medium supplemented with Fetal Bovine Serum (FBS) (
[Preparation of suspension cells (acclimation from adherent cells to suspension cells)]
The CHO cells cultured in an adherent state using a culture flask are detached with trypsin, the trypsin solution is removed by centrifugation (room temperature, 500 × g, 5 minutes), diluted with Ham's F12 medium, and a spinner flask is used. The cells were stirred and cultured in an incubator (at 37 ° C., 5
[Culture operation]
Using a 1 L culture tank, culture was performed under the culture conditions described in the previous section. The seeding density was 1 × 10 5 cells / mL, and the culture was controlled so as to maintain dissolved oxygen of 2.7 mg / L, pH 7.2, and temperature of 37 ° C. Aseptic sampling was performed once or twice a day, and the culture solution component analysis was performed.
[Analysis of culture fluid components]
From the sampled culture solution, (1) measurement of the number of living cells, (2) analysis methods of glucose, glutamine, lactic acid, and ammonia as medium components are described below.
（１）生細胞数の測定
生細胞数は、生死細胞判定装置Ｖｉ−ＣＥＬＬ（ベックマン・コールター社）を用いて計測した。細胞培養液をＶｉ−ＣＥＬＬにセットし、トリパンブルー染色法により生死細胞の区別を行い、細胞の画像データを取得、自動計数することにより、生細胞数の値を得た。
(1) Measurement of the number of living cells The number of living cells was measured using a viable / dead cell determination device Vi-CELL (Beckman Coulter). A cell culture solution was set in Vi-CELL, viable cells were differentiated by trypan blue staining, cell image data was obtained, and the number of viable cells was obtained by automatic counting.
（２）培地成分分析（グルコース、グルタミン、乳酸、アンモニア）
培養液中のグルコース、グルタミン、乳酸、アンモニアはＢｉｏｐｌｏｆｉｌｅ １００ｐｌｕｓ（Ｎｏｖａ社）を使用して測定した。
［培養装置の構成］
図１を参照して、本発明の実施の形態に係る培養装置の構成について説明する。
(2) Medium component analysis (glucose, glutamine, lactic acid, ammonia)
Glucose, glutamine, lactic acid, and ammonia in the culture solution were measured using Bioprofile 100plus (Nova).
[Composition of culture equipment]
With reference to FIG. 1, the structure of the culture apparatus which concerns on embodiment of this invention is demonstrated.
図１に示すように、培養装置１は、培養槽２００、オンライン／インラインモニタリング装置１０１、無菌サンプリング装置１０２、分析装置１０３、データ収集装置１０４、データ解析装置１０５、細胞状態判断装置１０６、運転制御補正装置１０７、制御装置２０、ポンプ１０、モータ３０、攪拌翼４０、の他、不図示のガス（例えば、空気、酸素、二酸化炭素、等）通気装置、アルカリ添加装置、培地添加装置、等を備える。培養槽２００には計測手段を設置し、制御の指標となる値、例えば、圧力、流速、流量、温度、ｐＨ、濁度、伝導率、グルタミン濃度、溶存酸素濃度、溶存二酸化炭素濃度、グルコース濃度、アンモニア濃度、乳酸濃度、タンパク質濃度、アミノ酸濃度、培養液濁度、等を計測する。そして、それぞれの計測値に基づいて予め定めた制御目標値に収束させるべく制御手段が設けられており、それぞれ独立した制御操作を実施する。
As shown in FIG. 1, the
オンライン／インラインモニタリング装置１０１は、培養装置の運転中に計測されるプロセス値（例えば、オンライン計測値、インライン計測値、等）をモニタリングし、モニタリングしたデータを、データ収集装置１０４へと出力する。オンラインで計測可能な計測値としては、例えば、溶存酸素濃度、温度、ｐＨ、等が挙げられる。
The on-line / in-
無菌サンプリング装置１０２は、オフラインでプロセス値を計測するサンプリングポートを通して、培養液のサンプリングを行う。オフラインで計測可能な計測値としては、例えば、培地成分濃度、細胞数、細胞の生存率、有用物質濃度、アンモニア濃度、グルコース濃度、グルタミン濃度、乳酸濃度、アミノ酸濃度、タンパク質濃度等が挙げられる。無菌サンプリング装置１０２を使用せず、手動により、サンプリングを行っても良い。
The
分析装置１０３は、無菌サンプリング装置１０２によりサンプリングされたサンプルを、例えば、細胞数、生存率、有用物質濃度、アンモニア濃度、グルコース濃度、グルタミン濃度、乳酸濃度、等分析をする。これ以外にも、アミノ酸濃度、アポトーシス分析、糖鎖分析などを行ってもよい。
The
データ収集装置１０４は、オンライン／インラインモニタリング装置１０１により計測された計測結果、及び分析装置１０３により分析された分析結果に基づいて、モニタリングパラメータｍｉを集積する。なお、データ収集装置１０４は、計測結果及び分析結果を、直接データ記録しても良いし、手動により入力しても良い。
The
モニタリングパラメータｍｉとしては、例えば、溶存酸素濃度、温度、ｐＨ、細胞数、細胞の生存率、有用物質濃度、アンモニア濃度、グルコース濃度、グルタミン濃度、乳酸濃度、アミノ酸濃度、アポトーシス細胞割合、糖鎖割合、溶存二酸化炭素、せん断応力、栄養濃度、老廃物濃度、等が挙げられる。 Monitoring parameters mi include, for example, dissolved oxygen concentration, temperature, pH, cell number, cell viability, useful substance concentration, ammonia concentration, glucose concentration, glutamine concentration, lactic acid concentration, amino acid concentration, apoptotic cell ratio, sugar chain ratio , Dissolved carbon dioxide, shear stress, nutrient concentration, waste product concentration, and the like.
データ解析装置１０５は、モニタリングパラメータｍｉを、必要に応じて品質パラメータｑｉ（＝Ｆ（ｍｉ））に変換する。品質パラメータｑｉとしては、例えば、増殖速度、グルタミン消費速度、グルコース消費速度、アンモニア分泌速度、乳酸分泌速度、有用物質生産速度、単位時間単位細胞数あたりのグルタミン消費速度、単位時間単位細胞数あたりのグルコース消費速度、単位時間単位細胞数あたりのアンモニア分泌速度、単位時間単位細胞数あたりの乳酸分泌速度、単位時間単位細胞数あたりの有用物質生産速度、等が挙げられる。
The
例えば、データ解析装置１０５は、細胞数を、細胞の経時変化に基づいて、増殖速度に変換する。また、データ解析装置１０５は、グルタミン濃度を、グルタミン消費速度へと変換する。また、データ解析装置１０５は、グルコース濃度を、グルコース消費速度に変換する。また、データ解析装置１０５は、アンモニアを、アンモニア分泌速度に変換する。また、データ解析装置１０５は、乳酸を、乳酸分泌速度へと変換する。また、データ解析装置１０５は、細胞数と増殖速度の結果における様々な組み合わせを、単位時間、単位細胞数あたりのグルタミン消費速度、グルコース消費速度、アンモニア分泌速度、乳酸分泌速度に変換する。
For example, the
細胞状態判断装置１０６は、モニタリングパラメータｍｉ及びデータ解析装置１０５により変換されたパラメータ群（品質パラメータｑｉ）を入力値として、クラスタ分析を行い、細胞の状態を判断する。細胞状態判断装置１０６は、過去の培養実績を記録した実績データベースと、現在のデータとを照合し、細胞の状態が異常であるか否かの判別や、細胞の状態が異常である場合の原因推定を行う。
The cell
運転制御補正装置１０７は、細胞状態判断装置１０６により、細胞の状態が正常と判断された場合、元の設定値を変更することなく、そのまま培養条件が一定となるように、制御する。
When the cell
一方、運転制御補正装置１０７は、細胞状態判断装置１０６により、細胞の状態が異常と判断された場合、元の設定値を変更し、新たな培養条件となるように、制御する。この場合、運転制御補正装置１０７は、過去のカテゴリ例、過去の時刻例に基づいて、クラスタ分析により生成したカテゴリ、細胞の状態が異常と判断された時点での培養時刻から原因推定を行う。
On the other hand, when the cell
原因解決が可能な場合、運転制御補正装置１０７は、カテゴリごとの反応モデル（例えば、カテゴリ１：ｑｉ＝Ｆ（Ｓｉ），カテゴリ２：ｒｉ＝Ｆ（Ｓｉ））が蓄積されたデータベースの中から、原因解決に適した培養条件を選択し、元の設定値を変更する。一方、原因解決が不可能な場合、あるいは、原因が判明しない場合、運転制御補正装置１０７は、必要に応じて、培養装置の運転を停止させるために、元の設定値を変更する。
If the cause can be resolved, the operation
制御装置２０は、培養装置の運転中に計測されるプロセス値（計測値）が、予め設定された目標値と一致するように、培養条件（例えば、培養制御パラメータＳｉ）を制御する。培養制御パラメータＳｉとしては、例えば、攪拌翼４０の回転速度、ガス通気量、アルカリ注入量、ヒーター電流、冷却水循環速度、等が挙げられる。
The
制御装置２０は、細胞状態判断装置１０６により、細胞の状態が正常と判断された場合、培養制御パラメータＳｉを変更しない。一方、制御装置２０は、細胞状態判断装置１０６により、細胞の状態が異常と判断された場合、異常の種類により、培養制御パラメータＳｉを変更するか否かを決定する。細胞の状態が正常に戻る異常であれば、制御装置２０は、培養制御パラメータＳｉを変更する。この際、制御装置２０は、細胞の状態とフィードバック制御のための定式化されたモデルにおけるデータベースを照合し、細胞の状態を正常に戻すために、最も適切な培養制御パラメータＳｉを選択する。細胞の状態が正常に戻らない異常であれば、制御装置２０は、培養制御パラメータＳｉを変更しない。この際、制御装置２０は、必要に応じて警報手段によって異常警報（アラーム）を出力する制御を行っても良い。
The
また、制御装置２０は、培養槽２００より採取される培養液試料の分析値を含むプロセス値に基づいて、細胞の状態を推定し、推定した細胞の状態に基づいて、目標値の設定及び変更を行う。制御装置２０による目標値の設定及び変更は、コンピュータによって行うことが可能である。
Further, the
また、制御装置２０は、培養槽２００に設けられる計測手段により得られる計測値と、予め設定された目標値とを比較し、適切な動作信号を操作手段（例えば、ポンプ１０）に伝達し、操作手段の操作量を制御する。即ち、制御装置２０は、計測手段とは独立して、操作手段の制御動作を実行し、各々の計測値を目標値に収束させる。
The
例えば、操作手段として、炭酸ガス供給弁、ポンプ、等を適用する場合、制御装置２０は、ｐＨを制御することが可能である。この場合、操作因子は、炭酸ガス供給量、アルカリ注入量、等となる。また、例えば、操作手段として、酸素供給弁、窒素供給弁、等を適用する場合、制御装置２０は、溶存酸素濃度を制御することが可能である。この場合、操作因子は、酸素供給量、窒素供給量、等となる。また、例えば、操作手段として、加温用ヒーター電流調節器、蒸気供給弁、冷却水供給弁、等を適用する場合、制御装置２０は、温度を制御することが可能である。この場合、操作因子は、ヒーターへの供給電力量、蒸気供給量、冷却水供給量、等となる。
For example, when a carbon dioxide supply valve, a pump, or the like is applied as the operation means, the
なお、制御装置２０における制御方法は、特に限定されるものではなく、例えば、比例制御法、ＰＩＤ制御法、等の公知のフィードバック制御手法を適用することができる。
［培養制御装置の動作］
図２を参照して本発明の実施例に係る培養制御装置の動作について説明する。まず、ステップＳ２０１において、制御装置２０は、モニタリングパラメータｍｉの一部である溶存酸素濃度、温度、ｐＨ、等が一定となるように、培養制御パラメータＳｉを制御し、細胞を培養するための培養制御を行う。
In addition, the control method in the
[Operation of culture controller]
The operation of the culture control apparatus according to the embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. First, in step S201, the
ステップＳ２０２において、データ収集装置１０４は、オンライン／インライン計測装置１０１により計測された計測結果、及び分析装置１０３により分析された分析結果に基づいて、モニタリングパラメータｍｉを集積する。
In step S <b> 202, the
次に、ステップＳ２０３において、データ解析装置１０５は、モニタリングパラメータｍｉを、必要に応じて品質パラメータｑｉ（＝Ｆ（ｍｉ））に変換する。
Next, in step S203, the
ステップＳ２０４において、細胞状態判断装置１０６は、モニタリングパラメータｍｉ及びデータ解析装置１０５により変換されたパラメータ群（品質パラメータｑｉ）を入力値として、クラスタ分析を行い、細胞の状態を判断する。
In step S204, the cell
細胞状態判断装置１０６は、過去の培養実績を記録した実績データベースと、現在のデータとを照合し、同じ培養時刻において、現在のカテゴリと、細胞の状態が正常であった過去のカテゴリとが、一致すれば、ステップＳ２０４において、細胞の状態が正常であると判断する。即ち、細胞状態判断装置１０６は、モニタリングパラメータｍｉ及び品質パラメータｑｉが許容範囲以下であれば（ｍｉ、ｑｉ≦許容範囲）、細胞の状態が正常であると判断し、ステップＳ２０１へと進む。ステップＳ２０１において、制御装置２０は、元の培養条件で、培養制御を行う。
The cell
また、細胞状態判断装置１０６は、過去の培養実績を記録した実績データベースと、現在のデータとを照合し、同じ培養時において、現在のカテゴリと、細胞の状態が正常であった過去のカテゴリとが、一致しなければ、ステップＳ２０４において、細胞の状態が異常であると判断する。即ち、細胞状態判断装置１０６は、モニタリングパラメータｍｉ及び品質パラメータｑｉが許容範囲を超えていれば（ｍｉ、ｑｉ＞許容範囲）、細胞の状態が異常であると判断し、ステップＳ２０５へと進む。
In addition, the cell
ステップＳ２０５において、運転制御補正装置１０７は、カテゴリごとの反応モデルが蓄積されたデータベースの中から、現在のカテゴリに適したモデルを選択し、原因推定を行う。運転制御補正装置１０７は、原因が推定できる場合、ステップＳ２０６へと進む。この場合、運転制御補正装置１０７は、現在のカテゴリが、データベースの中で、既に異常原因がわかっているカテゴリと一致すれば、細胞の状態が異常となった原因が、該カテゴリの異常原因と同じであると推定する。一方、運転制御補正装置１０７は、原因が推定できない場合、あるいは、細胞の状態を正常に戻すための適切な培養条件が見つからない場合、ステップＳ２０７へと進む。この場合、運転制御補正装置１０７は、現在のカテゴリが、データベースの中で、既に異常原因がわかっているカテゴリと一致しない新規カテゴリであれば、細胞の状態が異常となった原因が、不明であると判断する。
In step S205, the operation
ステップＳ２０６において、運転制御補正装置１０７は、各原因ごとに適切な培養条件が蓄積されたデータベースと、現在のデータとを照合し、最も適切な培養条件qiを選択して、元の培養条件ｑｉｏｂｓに基づいて、設定値の変更を行い（ｍｉｎφ＝Σ（ｑｉ−ｑｉｏｂｓ）２）、ステップＳ２０１へと進む。ステップＳ２０１において、制御装置２０は、変更後の設定値に合わせて、培養制御パラメータＳｉを制御し、新たな培地を使用して、新たな培養条件で、培養制御を行う。
In step S206, the operation
ステップＳ２０７において、制御装置２０は、オペレータに警告を知らせる画面を表示する、又は、オペレータに警告を知らせる警告音を鳴らす、等により、オペレータの判断を仰ぎ、細胞の培養を停止する制御を行う。なお、制御装置２０は、オペレータの判断を仰ぐことなく、培養を停止する制御を自動的に行っても良い。
In step S207, the
本発明の実施の形態による培養制御装置によれば、刻々と変化する培養状況に対応して目標値の変更を適切に実施することができ、かつ培養に適切な培養環境が確実に維持できていることを検証しつつ培養を行うことが可能となり、安全で確実な培養制御が可能な細胞培養装置を提供することができる。 According to the culture control device according to the embodiment of the present invention, it is possible to appropriately change the target value corresponding to the constantly changing culture situation, and to reliably maintain a culture environment suitable for culture. Therefore, it is possible to perform culture while verifying that the cell culture apparatus can be provided, and it is possible to provide a cell culture apparatus capable of safe and reliable culture control.
１ 細胞培養装置
１０ ポンプ
２０ 制御装置
３０ モータ
４０ 攪拌翼
１００ 培養槽
１０１ オンライン／インラインモニタリング装置
１０２ 無菌サンプリング装置
１０３ 分析装置
１０４ データ収集装置
１０５ データ解析装置
１０６ 細胞状態判断装置
１０７ 運転制御補正装置
DESCRIPTION OF
Claims (10)
オンライン／インラインモニタリング装置と、
無菌サンプリング装置、分析装置、データ収集装置、データ解析装置、クラスタ分析機能を備えた細胞状態判別装置と、
クラスタごとの細胞の反応モデルの参照機能を備えた運転制御補正装置と、を備える
ことを特徴とする細胞培養装置。 A culture vessel for culturing living cells;
Online / inline monitoring equipment,
Aseptic sampling device, analysis device, data collection device, data analysis device, cell state determination device with cluster analysis function,
A cell culture device comprising: an operation control correction device having a reference function of a cell reaction model for each cluster.
前記無菌サンプリング装置は、培地成分濃度、細胞数、細胞の生存率、有用物質濃度、アンモニア濃度、グルコース濃度、グルタミン濃度、乳酸濃度、アミノ酸濃度、タンパク質濃度、の何れかを測定することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養装置。 The online / in-line monitoring device measures any of pressure, flow rate, flow rate, temperature, pH, turbidity, conductivity, dissolved oxygen concentration, dissolved carbon dioxide concentration, and culture turbidity.
The aseptic sampling apparatus is characterized in that it measures any of medium component concentration, cell number, cell viability, useful substance concentration, ammonia concentration, glucose concentration, glutamine concentration, lactic acid concentration, amino acid concentration, protein concentration. The cell culture device according to claim 1.
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