JP2018113898A - 遺伝子の変異検出キット及び遺伝子の変異検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域それぞれに、該領域の塩基配列が野生型の場合にハイブリダイズするプローブと、
前記プローブそれぞれが前記領域にハイブリダイズしたことを示す標識物質と、
前記複数の領域のすべてを、ポリメラーゼ連鎖反応で得られる1つのアンプリコンに含むように設計されたプライマー対と、
を備える。
前記プローブが有する蛍光色素であって、
前記プローブは、
前記蛍光色素の発光を抑制する消光剤をさらに有し、
前記プローブが前記領域にハイブリダイズすると、前記消光剤による前記蛍光色素の発光の抑制が解除される、
こととしてもよい。
エキソヌクレアーゼ活性によって前記領域にハイブリダイズした前記プローブが分解されると解除される、
こととしてもよい。
複数の部位に変異が含まれ得る、
こととしてもよい。
βカテニン遺伝子のエクソン3の塩基配列であって、
前記プローブは、
配列番号1に示される塩基配列を有する第1のプローブと、
配列番号2に示される塩基配列を有する第2のプローブと、
を含み、
前記プライマー対は、
配列番号3に示される塩基配列を有するフォワードプライマーと、
配列番号4に示される塩基配列を有するリバースプライマーと、
からなる、
こととしてもよい。
次の(a)〜(d)を含む反応液でポリメラーゼ連鎖反応を行う反応ステップと、
(a)標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域それぞれに、該領域の塩基配列が野生型の場合にハイブリダイズするプローブ、
(b)前記プローブそれぞれが前記領域にハイブリダイズしたことを示す標識物質、
(c)前記複数の領域のすべてを、ポリメラーゼ連鎖反応で得られる1つのアンプリコンに含むように設計されたプライマー対、
(d)前記複数の領域を含む核酸、
前記標識物質に基づいて、前記プローブがそれぞれ前記領域にハイブリダイズしたか否かを判定する判定ステップと、
を含む。
本実施の形態に係る遺伝子の変異検出キットは、プローブと、標識物質と、プライマー対と、を備える。プローブは、標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域それぞれに対応させるため、複数種である。「相互に重複しない独立した複数の領域」とは、同一部位の塩基を共有しない複数の領域を意味する。領域間の間隔は、特に限定されないが、1〜30bp、1〜20bp又は1〜10bpである。
βカテニン遺伝子のエクソン3を標的遺伝子として変異の有無を検出した。βカテニンのAsp32をコードするコドンがTyrをコードするコドンに変異したDNAが野生型のDNAに混在するサンプル、及びβカテニンのThr41をコードするコドンがIleをコードするコドンに変異したDNAが野生型のDNAに混在するサンプルを解析した。Asp32をコードするコドンは、上記R1に存在する。Thr41をコードするコドンは、上記R2に存在する。
鋳型DNA 1μl
プローブ1(FAM)(20μM) 1μl
プローブ2(HEX)(20μM) 0.5μl
フォワードプライマー(10μM) 1μl
リバースプライマー(10μM) 1μl
DNAポリメラーゼ(1unit/μl) 2μl
バッファー(2xddPCR Supermix) 10μl
蒸留水 5.5μl
95℃で10分を1サイクル
95℃で30秒、57℃で40秒を40サイクル
95℃で10分を1サイクル
4℃で保存
図3はAsp32Tyrに対応する変異を有するDNAが混在したサンプルの結果を示す。縦軸にプローブ1を標識したFAMの蛍光強度、横軸にプローブ2を標識したHEXの蛍光強度をプロットすると、両方の蛍光強度が相対的に高いシグナルとHEXの蛍光強度のみが相対的に高いシグナルとを検出できた。両方の蛍光強度が相対的に高いシグナルは、R1及びR2が野生型の塩基配列であることを示す。一方、HEXの蛍光強度のみが相対的に高いシグナルは、Asp32Tyrの変異があることを示す。図3に示される野生型のシグナルと変異型のシグナルとを比較することで、野生型に対する変異型の割合を明らかにできた。
Claims (6)
- 標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域それぞれに、該領域の塩基配列が野生型の場合にハイブリダイズするプローブと、
前記プローブそれぞれが前記領域にハイブリダイズしたことを示す標識物質と、
前記複数の領域のすべてを、ポリメラーゼ連鎖反応で得られる1つのアンプリコンに含むように設計されたプライマー対と、
を備える、遺伝子の変異検出キット。 - 前記標識物質は、
前記プローブが有する蛍光色素であって、
前記プローブは、
前記蛍光色素の発光を抑制する消光剤をさらに有し、
前記プローブが前記領域にハイブリダイズすると、前記消光剤による前記蛍光色素の発光の抑制が解除される、
請求項1に記載の遺伝子の変異検出キット。 - 前記蛍光色素の発光の抑制は、
エキソヌクレアーゼ活性によって前記領域にハイブリダイズした前記プローブが分解されると解除される、
請求項2に記載の遺伝子の変異検出キット。 - 前記複数の領域各々には、
複数の部位に変異が含まれ得る、
請求項1から3のいずれか一項に記載の遺伝子の変異検出キット。 - 前記標的遺伝子のエクソンの塩基配列は、
βカテニン遺伝子のエクソン3の塩基配列であって、
前記プローブは、
配列番号1に示される塩基配列を有する第1のプローブと、
配列番号2に示される塩基配列を有する第2のプローブと、
を含み、
前記プライマー対は、
配列番号3に示される塩基配列を有するフォワードプライマーと、
配列番号4に示される塩基配列を有するリバースプライマーと、
からなる、
請求項1から4のいずれか一項に記載の遺伝子の変異検出キット。 - 次の(a)〜(d)を含む反応液でポリメラーゼ連鎖反応を行う反応ステップと、
(a)標的遺伝子のエクソン内に含まれる相互に重複しない独立した複数の領域それぞれに、該領域の塩基配列が野生型の場合にハイブリダイズするプローブ、
(b)前記プローブそれぞれが前記領域にハイブリダイズしたことを示す標識物質、
(c)前記複数の領域のすべてを、ポリメラーゼ連鎖反応で得られる1つのアンプリコンに含むように設計されたプライマー対、
(d)前記複数の領域を含む核酸、
前記標識物質に基づいて、前記プローブがそれぞれ前記領域にハイブリダイズしたか否かを判定する判定ステップと、
を含む、遺伝子の変異検出方法。
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