JP2018102323A - XTENおよびvon Willebrand因子タンパク質を有する第VIII因子の複合体、および、その使用 - Google Patents
XTENおよびvon Willebrand因子タンパク質を有する第VIII因子の複合体、および、その使用 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】本発明は、VWFのD´ドメインおよびD3ドメインを含有するVWFタンパク質、1以上のXTEN配列、およびFVIIIタンパク質を含有するキメラタンパク質を提示するものであり、ここで、当該VWF断片、当該XTEN配列、または当該FVIIIタンパク質は、互いに連結または関連付けられている。当該キメラタンパク質はさらに、1以上のIg定常領域またはその一部(たとえば、Fc領域)を含有してもよい。
【選択図】なし
Description
(a)V−X−FVIII、
(b)FVIII−X−V、
(c)V−X:FVIII、
(d)X−V:FVIII、
(e)FVIII:V−X、または、
(f)FVIII:X−V
を含有する式を含有し、ここで、
VはVWF断片を含有し、
Xは1以上のXTEN配列を含有し、および、
FVIIIはFVIIIタンパク質を含有する。ハイフン(−)は、ペプチド結合またはリンカー(たとえば、開裂可能なリンカー)であっても良く、コロン(:)は、ポリペプチドの間の化学的関連または物理的関連(たとえば、共有結合または非共有結合)を表す。
(g)V−L2−X−L1−F1:FVIII−L3−F2、
(h)V−L2−X−L1−F1:F2−L3−FVIII、
(i)F1−L1−X−L2−V:FVIII−L3−F2、
(j)F1−L1−X−L2−V:F2−L3−FVIII、
(k)V−L2−X−L1−F1−L4−FVIII−L3−F2、
(l)F2−L3−FVIII−L4−F1−L1−X−L2−V、
(m)FVIII−L3−F2−L4−V−L2−X−L1−F1、および、
(n)F1−L1−X−L2−V−L4−F2−L3−FVIII、
を含有する式を含有し、ここで、
VはVWF断片を含有し、
L1、L2およびL3のぞれぞれは任意のリンカー(たとえば、開裂可能なリンカー)を含有し、
L4は任意のリンカー(たとえば、プロセッシング可能なリンカー)であり、
FVIIIはFVIIIタンパク質を含有し、
Xは1以上のXTEN配列を含有し、
F1は任意の第一のIg定常領域またはその一部を含有し、
F2は任意の第二のIg定常領域またはその一部を含有し、および、
(:)は共有結合または非共有結合である。
(1)FVIII(X1)−L1−F1:V−L2−X2−L3−F2、
(2)FVIII(X1)−L1−F1:F2−L3−X2−L2−V、
(3)F1−L1−FVIII(X1):V−L2−X2−L3−F2、
(4)F1−L1−FVIII(X1);F2−L3−X2−L2−V、
(5)FVIII(X1)−L1−F1−L4−V−L2−X2−L3−F2、
(6)FVIII(X1)−L1−F1−L4−F2−L3−X2−L2−V、
(7)F1−L1−FVIII(X1)−L4− V−L2−X2−L3−F2、または、
(8)F1−L1−FVIII(X1)−L4− F2−L3−X2−L2−V、
を含有する式を含有しても良く、ここで、
FVIII(X1)は、FVIIIタンパク質および1以上のXTEN配列を含有し、ここで、1以上のXTEN配列は、FVIIIタンパク質のN末端またはC末端に連結され、またはFVIIIタンパク質中の1以上のアミノ酸のすぐ下流(たとえば、1以上のXTEN挿入部位)に挿入されており、
L1、L2またはL3のそれぞれは、たとえば開裂可能なリンカー等の任意のリンカーを含有しており、
L4は、リンカー(プロセッシング可能なリンカー)であり、
X2は、1以上のXTEN配列を含有し、
F1はIg定常領域またはその一部を含有し、
F2は任意の追加のIg定常領域またはその一部を含有し、および、
VはVWF断片を含有し、
(−)はペプチド結合または1以上のアミノ酸であり、および、
(:)は共有結合または非共有結合を含有する。
(1) アミノ酸3、(2)アミノ酸18、
(3) アミノ酸22、(4) アミノ酸26、
(5) アミノ酸32、(6) アミノ酸40、
(7) アミノ酸60、(8) アミノ酸65、
(9) アミノ酸81、(10) アミノ酸116、
(11) アミノ酸119、(12) アミノ酸130、
(13) アミノ酸188、(14) アミノ酸211、
(15) アミノ酸216、(16) アミノ酸220、
(17) アミノ酸224、(18) アミノ酸230、
(19) アミノ酸333、(20) アミノ酸336、
(21) アミノ酸339、(22) アミノ酸375、
(23) アミノ酸399、(24) アミノ酸403、
(25) アミノ酸409、(26) アミノ酸416、
(26) アミノ酸442、(28) アミノ酸487、
(29) アミノ酸490、(30) アミノ酸494、
(31) アミノ酸500、(32) アミノ酸518、
(33) アミノ酸599、(34) アミノ酸603、
(35) アミノ酸713、(36) アミノ酸745、
(37) アミノ酸1656、(38) アミノ酸1711、
(39) アミノ酸1720、(40) アミノ酸1725、
(41) アミノ酸1749、(42) アミノ酸1796、
(43) アミノ酸1802、(44) アミノ酸1827、
(45) アミノ酸1861、(46) アミノ酸1896、
(47) アミノ酸1900、(48) アミノ酸1904、
(49) アミノ酸1905、(50) アミノ酸1910、
(51) アミノ酸1937、(52) アミノ酸2019、
(53) アミノ酸2068、(54) アミノ酸2111、
(55) アミノ酸2120、(56) アミノ酸2171、
(57) アミノ酸2188、(58) アミノ酸2227、
(59) アミノ酸2277、および、(60)それらの2以上の組み合わせ
からなる群から選択される1以上のアミノ酸のすぐ下流である。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
(i)von Willebrand因子(VWF)のD´ドメインおよびD3ドメインを含有するVWFタンパク質、(ii)XTEN配列、および、(iii)FVIIIタンパク質を含有するキメラタンパク質であって、ここで、上記VWF断片および上記XTEN配列は、任意選択的なリンカーで連結されており、ここで、上記VWF断片または上記XTEN配列は、上記FVIIIタンパク質に連結または関連付けられている、キメラタンパク質。
(項目2)
(a)V−X−FVIII、
(b)FVIII−X−V、
(c)V−X:FVIII、
(d)X−V :FVIII、
(e)FVIII:V−X、または、
(f)FVIII:X−V、
を含有する式を含有するキメラタンパク質であって、ここで、
Vは、VWF断片を含有し、
Xは、1以上のXTEN配列を含有し、
FVIIIは、FVIIIタンパク質を含有し;
(−)は、ペプチド結合または1以上のアミノ酸であり;
(:)は、共有結合または非共有結合である、キメラタンパク質。
(項目3)
上記XTEN配列が、リンカーによりFVIIIタンパク質に連結されている、項目1または2のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目4)
上記リンカーが、開裂可能なリンカーである、項目3に記載のキメラタンパク質。
(項目5)
上記VWF断片、上記XTEN配列、および上記FVIIIタンパク質を含有する、一本鎖ポリペプチドを含有する、項目1〜4のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目6)
第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖がFVIIIを含有し、上記第二のポリペプチド鎖が上記VWF断片および上記XTEN配列を含有する、項目1〜4のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目7)
(iv)上記VWF断片、上記XTEN配列、もしくは上記FVIIIタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかに連結されたIg定常領域またはその一部をさらに含有する、項目1〜6のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目8)
(g)V−L2−X−L1−F1:FVIII−L3−F2;
(h)V−L2−X−L1−F1:F2−L3−FVIII;
(i)F1−L1−X−L2−V:FVIII−L3−F2;
(j)F1−L1−X−L2−V:F2−L3−FVIII;
(k)V−L2−X−L1−F1−L4−FVIII−L3−F2;
(l)F2−L3−FVIII−L4−F1−L1−X−L2−V;
(m)FVIII−L3−F2−L4−V−L2−X−L1−F1;および、
(n)F1−L1−X−L2−V−L4−F2−L3−FVIII、
を含有する式を含有するキメラタンパク質であって、ここで、
Vは、VWF断片を含有し、
L1、L2、およびL3のそれぞれは、任意選択的なリンカーを含有し、
L4は、任意選択的なリンカーであり、
FVIIIは、FVIIIタンパク質を含有し、
Xは、1以上のXTEN配列を含有し、
F1は、任意選択的なIg定常領域またはその一部を含有し、
F2は、任意選択的な追加のIg定常領域またはその一部を含有し、
(−)は、ペプチド結合または1以上のアミノ酸であり;
(:)は、共有結合または非共有結合である、キメラタンパク質。
(項目9)
上記Ig定常領域またはその一部は、上記VWF断片の半減期を延長させる、項目7または8のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目10)
上記Ig定常領域またはその一部は、上記XTEN配列または上記VWF断片に連結されている第一のFc領域を含有する、項目7〜9のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目11)
上記Ig定常領域またはその一部は、リンカーにより上記XTEN配列に連結されている、項目10に記載のキメラタンパク質。
(項目12)
上記リンカーは、開裂可能なリンカーを含有する、項目12に記載のキメラタンパク質。
(項目13)
追加のIg定常領域またはその一部をさらに含有する、項目7〜12のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目14)
上記追加のIg定常領域またはその一部は、追加のFc領域を含有する、項目13に記載のキメラタンパク質。
(項目15)
上記追加のIg定常領域またはその一部は、FVIIIタンパク質の半減期を延長させる、項目14に記載のキメラタンパク質。
(項目16)
上記追加のIg定常領域またはその一部は、上記FVIIIタンパク質に連結されている、項目13〜15のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目17)
上記第二のFc領域はさらに、リンカーにより上記VWF断片に連結されている、項目16に記載のキメラタンパク質。
(項目18)
上記リンカーは、プロセッシング可能なリンカーである、項目17に記載のキメラタンパク質。
(項目19)
L4は、プロセッシング可能なリンカーである、項目8〜18のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目20)
上記追加のIg定常領域またはその一部は、、上記Ig定常領域またはその一部と関連付けられている、項目7〜19のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目21)
上記追加のIg定常領域またはその一部は、共有結合により、上記Ig定常領域またはその一部と関連付けられている、項目20に記載のキメラタンパク質。
(項目22)
上記共有結合は、ジスルフィド結合である、項目21に記載のキメラタンパク質。
(項目23)
上記VWF断片は、非共有結合により上記FVIIIタンパク質と関連付けられている、項目1〜22のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目24)
上記FVIIIタンパク質の半減期は、上記VWF断片を有していないFVIIIタンパク質、または野生型FVIIIタンパク質と比較して、延長されている、項目1〜23のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目25)
上記FVIIIの半減期が、上記VWF断片を有していないFVIIIタンパク質よりも、または野生型FVIIIと比較して、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、または少なくとも約12倍長く延長されている、項目24に記載のキメラタンパク質。
(項目26)
上記第VIII因子の半減期が、少なくとも約17時間、少なくとも約18時間、少なくとも約19時間、少なくとも約20時間、少なくとも約21時間、少なくとも約22時間、少なくとも約23時間、少なくとも約24時間、少なくとも約25時間、少なくとも約26時間、少なくとも約27時間、少なくとも約28時間、少なくとも約29時間、少なくとも約30時間、少なくとも約31時間、少なくとも約32時間、少なくとも約33時間、少なくとも約34時間、少なくとも約35時間、少なくとも約36時間、少なくとも約48時間、少なくとも約60時間、少なくとも約72時間、少なくとも約84時間、少なくとも約96時間、または少なくとも約108時間である、項目24に記載のキメラタンパク質。
(項目27)
(i)FVIIIタンパク質、(ii)XTEN配列、および、(iii)Ig定常領域またはその一部を含有するキメラタンパク質であって、ここで、上記XTEN配列は、任意選択的なリンカーにより上記FVIIIタンパク質のN末端またはC末端で上記FVIIIタンパク質に連結されており、または、上記FVIIIタンパク質中の少なくとも1以上の挿入部位の2アミノ酸の間に挿入されており、および、ここで、上記Ig定常領域またはその一部は、上記FVIIIタンパク質または上記XTEN配列に連結され、または関連付けられている、キメラタンパク質。
(項目28)
上記XTEN配列および上記Ig定常領域またはその一部は、上記FVIIIタンパク質の半減期を延長する、項目27に記載のキメラタンパク質。
(項目29)
上記VWF結合部位は、上記FVIIIタンパク質のA3ドメイン、またはC2ドメイン、または上記A3ドメインおよび上記C2ドメインの両方に位置づけられている、項目27および28のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目30)
上記VWF結合部位は、配列番号4のアミノ酸1669〜1689およびアミノ酸2303〜2332に相当するアミノ酸配列を含有する、項目29に記載のキメラタンパク質。
(項目31)
上記FVIIIタンパク質の半減期は、上記Ig定常領域またはその一部を有していないFVIIIタンパク質、または、上記XTEN配列を有していないFVIIIタンパク質と比較して、延長されている、項目27〜30のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目32)
上記FVIIIタンパク質の半減期が、上記Ig定常領域またはその一部を有していないFVIIIタンパク質、または、上記XTEN配列を有していないFVIIIタンパク質、または、野生型FVIIIよりも、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、または少なくとも約12倍長く延長されている、項目31に記載のキメラタンパク質。
(項目33)
上記FVIIIタンパク質の半減期が、少なくとも約10時間、少なくとも約11時間、少なくとも約12時間、少なくとも約13時間、少なくとも約14時間、少なくとも約15時間、少なくとも約16時間、少なくとも約17時間、少なくとも約18時間、少なくとも約19時間、少なくとも約20時間、少なくとも約21時間、少なくとも約22時間、少なくとも約23時間、少なくとも約24時間、少なくとも約36時間、少なくとも約48時間、少なくとも約60時間、少なくとも約72時間、少なくとも約84時間、少なくとも約96時間、または少なくとも約108時間である。項目31に記載のキメラタンパク質。
(項目34)
上記Ig定常領域またはその一部が、第一のFc領域を含有している、項目27〜33のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目35)
追加のIg定常領域またはその一部をさらに含有する、項目27〜34のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目36)
上記追加のIg定常領域またはその一部が、上記第一のFc領域に連結または関連付けられている、第二のFc領域を含有する、項目35に記載のキメラタンパク質。
(項目37)
上記第二のFc領域が、共有結合により上記第一のFc領域に関連付けられている、項目36に記載のキメラタンパク質。
(項目38)
上記第一のFc領域が、リンカーにより上記第二のFc領域に連結されている、項目36に記載のキメラタンパク質。
(項目39)
上記リンカーが、プロセッシング可能なリンカーである、項目38に記載のキメラタンパク質。
(項目40)
上記FVIIIタンパク質、上記XTEN配列、および上記Ig定常領域またはその一部を含有する一本鎖ポリペプチドを含有する、項目27〜34のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目41)
第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が、上記FVIIIの重鎖を含有し、上記第二のポリペプチド鎖が、上記FVIIIタンパク質の軽鎖およびXTEN配列ならびに、上記Ig定常領域またはその一部を含有する、項目27〜34のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目42)
第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記FVIIIタンパク質、上記XTEN配列、および上記Ig定常領域を含有し、および、上記第二のポリペプチド鎖が上記追加のIg定常領域またはその一部を含有する、項目35〜39のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目43)
第一のポリペプチド鎖、第二のポリペプチド鎖、および第三のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記FVIIIタンパク質の重鎖および上記XTEN配列を含有し、上記第二のポリペプチド鎖が上記FVIIIタンパク質の軽鎖および上記Ig定常領域またはその一部を含有し、および、上記第三のポリペプチド鎖が上記追加のIg定常領域またはその一部を含有する、項目35〜39のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目44)
上記FVIIIタンパク質、上記XTEN配列、上記Ig定常領域またはその一部、および、上記追加のIg定常領域またはその一部を含有する一本鎖ポリペプチドを含有する、項目35〜39のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目45)
VWFのD´ドメインおよびD3ドメインを含有する、(i)FVIIIタンパク質、(ii)XTEN配列、(iii)VWF断片、および(iv)Ig定常領域またはその一部を含有するキメラタンパク質であって、ここで、上記XTEN配列は、任意選択的なリンカーにより、上記FVIIIタンパク質のN末端またはC末端で上記FVIIIタンパク質に連結され、または、上記FVIIIタンパク質の1以上の挿入部位のすぐ下流で挿入されており、上記VWF断片は、上記FVIIIタンパク質または上記XTEN配列に連結または関連付けられており、および、上記Ig定常領域またはその一部は、上記FVIIIタンパク質、上記XTEN配列、上記VWF断片、またはそれらの任意の組み合わせに連結されている、キメラタンパク質。
(項目46)
(1)FVIII(X1)−L1−F1:V−L2−X2−L3−F2;
(2)FVIII(X1)−L1−F1:F2−L3−X2−L2−V;
(3)F1−L1−FVIII(X1):V−L2−X2−L3−F2;
(4)F1−L1−FVIII(X1);F2−L3−X2−L2−V;
(5)FVIII(X1)−L1−F1−L4−V−L2−X2−L3−F2;
(6)FVIII(X1)−L1−F1−L4−F2−L3−X2−L2−V;
(7)F1−L1−FVIII(X1)−L4−V−L2−X2−L3−F2;または、(8)F1−L1−FVIII(X1)−L4−F2−L3−X2−L2−V、
を含有する式を含有するキメラタンパク質であって、ここで、FVIII(X1)は、FVIIIタンパク質およびXTEN配列を含有し、ここで、上記XTEN配列は、上記FVIIIタンパク質のN末端またはC末端に連結され、または、上記FVIIIタンパク質の1以上のアミノ酸(「1以上の挿入部位」)のすぐ下流に挿入されており;
L1、L2、またはL3のそれぞれは、任意選択的なリンカーを含有し;
L4は、リンカーであり、
X2は、1以上のXTEN配列を含有し、
F1は、Ig定常領域またはその一部を含有し、
F2は、任意選択的な追加のIg定常領域またはその一部を含有し、および、
Vは、VWF断片を含有し、
(−)は、ペプチド結合または1以上のアミノ酸であり;ならびに、
(:)は、共有結合または非共有結合である、キメラタンパク質。
(項目47)
上記VWF断片は、VWFクリアランス受容体に結合しない、項目45または46のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目48)
上記VWF断片は、1以上のプロテアーゼによる開裂から上記FVIIIタンパク質を保護することができる、活性化から上記FVIIIタンパク質を保護することができる、上記FVIIIタンパク質の重鎖および/または軽鎖を安定化することができる、または、1以上のスカベンジャー受容体による上記FVIIIタンパク質の除去を妨害することができる、項目45〜47のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目49)
上記Ig定常領域またはその一部は、上記FVIIIタンパク質のVWF結合部位を遮蔽または妨害することにより、上記FVIIIタンパク質に内因性VWFが結合することを抑制または妨害する、項目45〜48のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目50)
上記VWF結合部位は、上記FVIIIタンパク質のA3ドメイン、またはC2ドメイン、または、上記A3ドメインおよび上記C2ドメインの両方に位置づけられている、項目49に記載のキメラタンパク質。
(項目51)
上記VWF結合部位は、配列番号4のアミノ酸1669〜1689およびアミノ酸2303〜2332に相当するアミノ酸配列を含有する、項目49または50のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目52)
上記FVIIIタンパク質の半減期は、上記VWF断片を有していないFVIIIタンパク質と比較して、延長されている、項目45〜51のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目53)
上記FVIIIタンパク質の半減期が、野生型FVIIIよりも、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、または少なくとも約12倍長く延長されている、項目52に記載のキメラタンパク質。
(項目54)
上記FVIIIタンパク質の半減期が、少なくとも約10時間、少なくとも約11時間、少なくとも約12時間、少なくとも約13時間、少なくとも約14時間、少なくとも約15時間、少なくとも約16時間、少なくとも約17時間、少なくとも約18時間、少なくとも約19時間、少なくとも約20時間、少なくとも約21時間、少なくとも約22時間、少なくとも約23時間、少なくとも約24時間、少なくとも約36時間、少なくとも約48時間、少なくとも約60時間、少なくとも約72時間、少なくとも約84時間、少なくとも約96時間、または少なくとも約108時間である、項目52に記載のキメラタンパク質。
(項目55)
上記FVIIIタンパク質、上記XTEN配列、上記VWF断片、および上記Ig定常領域またはその一部を含有する一本鎖ポリペプチドを含有する、項目45〜54のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目56)
上記Ig定常領域またはその一部は、第一のFc領域を含有する、項目45〜54のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目57)
上記Ig定常領域またはその一部は、任意選択的なリンカーにより上記VWF断片に連結されている、項目45〜54のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目58)
上記リンカーは、開裂可能なリンカーを含有する、項目57に記載のキメラタンパク質。
(項目59)
上記FVIIIタンパク質、上記Ig定常領域またはその一部、上記VWF断片、またはそれらの任意の組み合わせに、任意選択的なリンカーにより連結されている、追加のIg定常領域またはその一部をさらに含有する、項目45〜50のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目60)
上記追加のIg定常領域またはその一部は、任意選択的なリンカーにより上記FVIIIタンパク質に連結されている、項目59に記載のキメラタンパク質。
(項目61)
上記Ig定常領域またはその一部は、第二のFc領域である。項目59または60に記載のキメラタンパク質。
(項目62)
上記Ig定常領域またはその一部、および、上記追加のIg定常領域またはその一部は、同一であるか、または異なっている、項目8〜26、42〜44、および46〜61のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目63)
第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記FVIIIタンパク質、上記XTEN配列、および上記Ig定常領域またはその一部を含有し、および、上記第二のポリペプチド鎖が、上記VWF断片および上記追加のIg定常領域またはその一部を含有する、項目46〜62のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目64)
第一のポリペプチド鎖、第二のポリペプチド鎖、および第三のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記FVIIIタンパク質の重鎖および上記XTEN配列を含有し、上記第二のポリペプチド鎖が上記FVIIIタンパク質の軽鎖および上記Ig定常領域またはその一部を含有し、および、上記第三のポリペプチド鎖が上記VWF断片および上記追加のIg定常領域またはその一部を含有する、項目46〜62のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目65)
第一のポリペプチド鎖、第二のポリペプチド鎖、および第三のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記FVIIIタンパク質の重鎖を含有し、上記第二のポリペプチド鎖が上記FVIIIタンパク質の軽鎖、上記XTEN配列および上記Ig定常領域またはその一部を含有し、および、上記第三のポリペプチド鎖が上記VWF断片および上記追加のIg定常領域またはその一部を含有する、項目46〜62のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目66)
第一のポリペプチド鎖、および第二のポリペプチド鎖を含有し、ここで、上記第一のポリペプチド鎖が上記FVIIIタンパク質の重鎖および上記XTEN配列を含有し、および、上記第二のポリペプチド鎖が上記FVIIIタンパク質の軽鎖、上記Ig定常領域またはその一部、上記VWF断片、および上記追加のIg定常領域またはその一部を含有する、項目46〜62のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目67)
上記VWF断片または上記追加のIg定常領域もしくはその一部に連結された追加のXTEN配列をさらに含有する、項目63〜66のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目68)
上記FVIIIタンパク質が、上記FVIIIタンパク質のC末端またはN末端でXTEN配列に連結されている、または、上記FVIIIタンパク質の1以上のアミノ酸のすぐ下流で挿入されている、またはそれらの任意の組み合わせである、項目1〜26のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目69)
上記FVIIIタンパク質が、少なくとも2つのXTEN配列、少なくとも3つのXTEN配列、少なくとも4つのXTEN配列、少なくとも5つのXTEN配列、または、少なくとも6つのXTEN配列に連結されている、項目27〜68のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目70)
上記FVIIIタンパク質が、A1ドメイン、a1酸性領域、A2ドメイン、a2酸性領域、Bドメイン、A3ドメイン、a3酸性領域、C1ドメイン、C2ドメイン、それらの1以上の断片、および、それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるFVIIIの1以上のドメインを含有する、項目1〜69のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目71)
上記FVIIIタンパク質の上記1以上の挿入部位が、A1ドメイン、a1酸性領域、A2ドメイン、a2酸性領域、A3ドメイン、Bドメイン、C1ドメイン、C2ドメイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される上記FVIIIタンパク質の1以上のドメインの内に位置付けられる、または、A1ドメインとa1酸性領域、a1酸性領域とA2ドメイン、A2ドメインとa2酸性領域、a2酸性領域とBドメイン、BドメインとA3ドメイン、A3ドメインとC1ドメイン、C1ドメインとC2ドメイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される上記FVIIIタンパク質の1以上のドメインの間に位置付けられる、または、A1ドメインとa1酸性領域、a1酸性領域とA2ドメイン、A2ドメインとa2酸性領域、a2酸性領域とBドメイン、BドメインとA3ドメイン、A3ドメインとC1ドメイン、C1ドメインとC2ドメイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される上記FVIIIタンパク質の2つのドメインの間に位置づけられる、項目27〜70のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目72)
上記FVIIIタンパク質の1以上の挿入部位が、表7、表8、表9、および表10のアミノ酸残基からなる群から選択される1以上のアミノ酸である、項目27〜71のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目73)
配列番号4のアミノ酸3Rに相当する挿入部位で挿入された上記XTEN配列が、ATRのアミノ酸配列をさらに含有する、項目72に記載のキメラタンパク質。
(項目74)
上記FVIIIタンパク質の1以上の挿入部位が、
(1) アミノ酸3、(2)アミノ酸18、
(3) アミノ酸22、(4) アミノ酸26、
(5) アミノ酸32、(6) アミノ酸40、
(7) アミノ酸60、(8) アミノ酸65、
(9) アミノ酸81、(10) アミノ酸116、
(11) アミノ酸119、(12) アミノ酸130、
(13) アミノ酸188、(14) アミノ酸211、
(15) アミノ酸216、(16) アミノ酸220、
(17) アミノ酸224、(18) アミノ酸230、
(19) アミノ酸333、(20) アミノ酸336、
(21) アミノ酸339、(22) アミノ酸375、
(23) アミノ酸399、(24) アミノ酸403、
(25) アミノ酸409、(26) アミノ酸416、
(26) アミノ酸442、(28) アミノ酸487、
(29) アミノ酸490、(30) アミノ酸494、
(31) アミノ酸500、(32) アミノ酸518、
(33) アミノ酸599、(34) アミノ酸603、
(35) アミノ酸713、(36) アミノ酸745、
(37) アミノ酸1656、(38) アミノ酸1711、
(39) アミノ酸1720、(40) アミノ酸1725、
(41) アミノ酸1749、(42) アミノ酸1796、
(43) アミノ酸1802、(44) アミノ酸1827、
(45) アミノ酸1861、(46) アミノ酸1896、
(47) アミノ酸1900、(48) アミノ酸1904、
(49) アミノ酸1905、(50) アミノ酸1910、
(51) アミノ酸1937、(52) アミノ酸2019、
(53) アミノ酸2068、(54) アミノ酸2111、
(55) アミノ酸2120、(56) アミノ酸2171、
(57) アミノ酸2188、(58) アミノ酸2227、
(59) アミノ酸2277、および、(60)それらの2以上の組み合わせ、
からなる群から選択される1以上のアミノ酸のすぐ下流に位置づけられる、項目27〜71のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目75)
上記FVIIIタンパク質が、Bドメインまたはその一部を含有する、項目1〜74のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目76)
上記FVIIIタンパク質が、SQ Bドメイン欠損FVIIIである、項目75に記載のキメラタンパク質。
(項目77)
上記FVIIIタンパク質が、一本鎖FVIIIを含有する、項目1〜76のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目78)
上記一本鎖FVIIIが、全長成熟型第VIII因子ポリペプチド(配列番号4)の、1648残基、1645残基、もしくはその両方に相当する残基で、または、SQ BDD第VIII因子(配列番号6)の754残基、751残基、もしくはその両方に相当する残基で、少なくとも1以上のアミノ酸置換を含有する、項目77に記載のキメラタンパク質。
(項目79)
上記アミノ酸置換が、アルギニン以外のアミノ酸である、項目78に記載のキメラタンパク質。
(項目80)
上記FVIIIタンパク質が、FVIIIの重鎖および第VIII因子の軽鎖を含有し、ここで、上記重鎖および軽鎖は、金属結合により互いに関連付けられている、項目1〜76のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目81)
上記FVIIIタンパク質が、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質(LRP)に対し、低いアフィニティを有するか、または結合しない、項目1〜80のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目82)
上記FVIIIタンパク質が、上記LRPに対するアフィニティを減少させる、または、上記LRPに対する結合を消失させる、アミノ酸置換を少なくとも1つ含有する、項目81に記載のキメラタンパク質。
(項目83)
上記少なくとも1つのアミノ酸置換が、全長成熟型FVIIIの、471残基、484残基、487残基、490残基、497残基、2092残基、2093残基またはそれらの2以上の組み合わせに相当する残基の位置である、項目82に記載のキメラタンパク質。
(項目84)
471、484または497残基でのアミノ酸置換は、アルギニン以外のアミノ酸であり、487残基でのアミノ酸置換は、チロシン以外のアミノ酸であり、2092残基でのアミノ酸置換はリシン以外のアミノ酸であり、または、2093残基でのアミノ酸置換は、フェニルアラニン以外のアミノ酸である、項目83に記載のキメラタンパク質。
(項目85)
上記FVIIIタンパク質が、上記置換を有していないFVIIIタンパク質よりも、上記FVIIIタンパク質をより安定化させるアミノ酸置換を少なくとも1つ含有する、項目1〜84のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目86)
上記FVIIIタンパク質の上記A2ドメインおよびA3ドメインが、共有結合により互いに関連付けられている、項目85に記載のキメラタンパク質。
(項目87)
上記少なくとも1つのアミノ酸置換が、全長成熟型FVIIIの664残基、1826残基、662残基、1828残基、またはそれらの2以上の組み合わせに相当する残基の位置である、項目85または86に記載のキメラタンパク質。
(項目88)
上記FVIIIタンパク質が、(a)全長成熟型FVIIIの664残基に相当する残基でシステイン、および全長成熟型FVIIIの1826残基に相当する残基でシステイン、または、(b)全長成熟型FVIIIの662残基に相当する残基でシステイン、および全長成熟型FVIIIの1828残基に相当する残基でシステイン、を含有する、項目87に記載のキメラタンパク質。
(項目89)
上記VWF断片が、配列番号2のアミノ酸764〜1274ではない、項目1〜26および45〜88のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目90)
上記D´ドメインのアミノ酸配列が、配列番号2のアミノ酸764〜866に対して、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、または、100%同一である、項目1〜26および45〜89のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目91)
上記D3ドメインのアミノ酸配列が、配列番号2のアミノ酸867〜1240に対して、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、または、100%同一である、項目1〜26および45〜90のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目92)
上記VWF断片が、単量体である、項目1〜26および45〜91のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目93)
上記VWF断片が、少なくとも2つのVWF断片、少なくとも3つのVWF断片、少なくとも4つのVWF断片、少なくとも5つのVWF断片、または、少なくとも6つのVWF断片を含有する、項目1〜26および45〜91のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目94)
上記VWF断片が、配列番号2のアミノ酸764〜1240に対して、少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、または、100%同一であるアミノ酸を含有する、項目1〜26および45〜93のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目95)
上記VWF断片が、配列番号2のアミノ酸764〜1240から本質的になる、または、からなる、項目94に記載のキメラタンパク質。
(項目96)
上記VWF断片が、配列番号2の1099残基、1142残基または、1099残基および1142残基の両方に相当する残基で、少なくとも1つのアミノ酸置換を含有する、項目1〜26および45〜95のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目97)
上記VWF断片が、配列番号2の1099残基、1142残基または、1099残基および1142残基の両方に相当する残基に対して置換された、システイン以外のアミノ酸を含有する、項目96に記載のキメラタンパク質。
(項目98)
上記VWF断片がさらに、VWFのD1ドメイン、D2ドメインまたは、D1およびD2ドメインを含有する、項目1〜26および45〜97のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目99)
上記VWF断片がさらに、A1ドメイン、A2ドメイン、A3ドメイン、D4ドメイン、B1ドメイン、B2ドメイン、B3ドメイン、C1ドメイン、C2ドメイン、CKドメイン、それらの1以上の断片、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるVWFドメインを含有する、項目1〜27および45〜98のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目100)
上記VWF断片が:(1)VWFのD´およびD3ドメイン、またはその断片;(2)VWFのD1、D´およびD3ドメインまたはその断片;(3)VWFのD2、D´およびD3ドメインまたはその断片;(4)VWFのD1、D2、D´およびD3ドメインまたはその断片;または、(5)VWFのD1、D2、D´、D3およびA1ドメインまたはその断片から本質的になる、または、からなる、項目1〜27および45〜99のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目101)
上記VWF断片が、上記VWF断片に作動可能に連結されているVWFまたはFVIIIのシグナルペプチドをさらに含有する、項目1〜27および45〜100いずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目102)
上記リンカーのうちの1以上が、少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800、または2000アミノ酸の長さを有する、項目1〜101のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。(項目103)
上記リンカーのうちの1以上が、約1〜約2000アミノ酸の長さを有する、項目1〜101のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目104)
上記リンカーのうちの1以上が、少なくとも約20、35、42、48、73、75、95、98、144、288、324、333、576、または864アミノ酸の長さを有する、項目103に記載のキメラタンパク質。
(項目105)
上記リンカーのうちの1以上が、Gly/Serペプチドを含有する、項目1〜104のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目106)
上記Gly/Serペプチドが、(Gly4Ser)n(配列番号139)、または、Ser(Gly4Ser)n(配列番号140)の式を有し、ここで、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9および10からなる群から選択される正の整数である、項目105に記載のキメラタンパク質。
(項目107)
上記(Gly4Ser)nリンカーが、(Gly4Ser)3(配列番号63)または、(Gly4Ser)4(配列番号138)である、項目106に記載のキメラタンパク質。
(項目108)
上記XTEN配列が、AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、およびAG144からなる群から選択される、項目1〜107のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目109)
上記XTEN配列が、配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;配列番号41;配列番号42;配列番号43、配列番号44および、配列番号127からなる群から選択される、項目108に記載のキメラタンパク質。
(項目110)
上記XTEN配列が、AE288またはAG288である、項目109に記載のキメラタンパク質。
(項目111)
上記リンカーが、上記リンカーのN末端で少なくとも1つの第一の開裂部位を含有し、上記リンカーのC末端で少なくとも1つの第二の開裂部位を含有し、または、その両方である、項目1〜110のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目112)
上記リンカーが、20アミノ酸、35アミノ酸、48アミノ酸、73アミノ酸、または95アミノ酸を含有する、項目1〜111のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目113)
上記リンカーが、48アミノ酸のトロンビン開裂リンカーである、項目112に記載のキメラタンパク質。
(項目114)
上記リンカーが、35アミノ酸のトロンビン開裂リンカーである、項目112に記載のキメラタンパク質。
(項目115)
上記開裂部位の1以上が、TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(配列番号8)である、項目111に記載のキメラタンパク質。
(項目116)
上記開裂部位の1以上が、第XIa因子、第XIIa因子、カリクレイン、第VIIa因子、第IXa因子、第Xa因子、第IIa因子(トロンビン)、エラスターゼ2、グランザイム−B、TEV、エンテロキナーゼ、プロテアーゼ3C、ソルターゼA、MMP−12、MMP−13、MMP−17およびMMP−20からなる群から選択されるプロテアーゼにより開裂される、項目111に記載のキメラタンパク質。
(項目117)
上記開裂部位の1以上が、RRRR(配列番号9)、RKRRKR(配列番号10)、RRRRS(配列番号11)、TQSFNDFTR(配列番号12)、SVSQTSKLTR(配列番号13)、DFLAEGGGVR(配列番号14)、TTKIKPR(配列番号15)、LVPRG(配列番号16)、ALRPR(配列番号17)、KLTRAET(配列番号18)、DFTRVVG(配列番号19)、TMTRIVGG(配列番号20)、SPFRSTGG(配列番号21)、LQVRIVGG(配列番号22)、PLGRIVGG(配列番号23)、IEGRTVGG(配列番号24)、LTPRSLLV(配列番号25)、LGPVSGVP(配列番号26)、VAGDSLEE(配列番号27)、GPAGLGGA(配列番号28)、GPAGLRGA(配列番号29)、APLGLRLR(配列番号30)、PALPLVAQ(配列番号31)、ENLYFQG(配列番号32)、DDDKIVGG(配列番号33)、LEVLFQGP(配列番号34)、およびLPKTGSES(配列番号35)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、項目111または116のいずれかに記載のキメラタンパク質。
(項目118)
上記第一の開裂部位および上記第二の開裂部位が、同一、または異なっている、項目111〜117のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目119)
ポリシアル化、ペグ化、またはヘシル化されている、項目1〜118のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目120)
項目1〜120のいずれか1項に記載のキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは、ポリヌクレオチドのセット。
(項目121)
PC5または、PC7をコードする、ポリヌクレオチド鎖をさらに含有する、項目120に記載のポリヌクレオチド。
(項目122)
項目120または121に記載のポリヌクレオチド、および上記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットに作動可能に連結されている1以上のプロモーターを含有する、ベクター。
(項目123)
PC5またはPC7をコードするポリヌクレオチド鎖を含有する、追加のベクターをさらに含有する、項目122に記載のベクター。
(項目124)
項目120または121のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、または項目122または123のいずれか1項に記載のベクターを含有する、宿主細胞。
(項目125)
哺乳類細胞である、項目124に記載の宿主細胞。
(項目126)
上記哺乳類細胞が、HEK293細胞、CHO細胞、およびBHK細胞からなる群から選択される、項目125に記載の宿主細胞。
(項目127)
項目1〜119のいずれか1項に記載のキメラタンパク質、項目120または121のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、項目122または123のいずれか1項に記載のベクター、または、項目124〜125のいずれか1項に記載の宿主細胞、および、薬学的に受容可能な担体を含有する、医薬組成物。
(項目128)
上記FVIIIタンパク質が、野生型FVIIIタンパク質と比較して、半減期が延長されている、項目127に記載の組成物。
(項目129)
上記FVIIIタンパク質の半減期が、野生型FVIIIよりも、少なくとも約少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約11倍、または少なくとも約12倍長く延長されている、項目127または128のいずれか1項に記載の組成物。
(項目130)
上記第VIII因子の半減期が、少なくとも約17時間、少なくとも約18時間、少なくとも約19時間、少なくとも約20時間、少なくとも約21時間、少なくとも約22時間、少なくとも約23時間、少なくとも約 24時間、少なくとも約25時間、少なくとも約26時間、少なくとも約27時間、少なくとも約28時間、少なくとも約29時間、少なくとも約30時間、少なくとも約31時間、少なくとも約32時間、少なくとも約33時間、少なくとも約34時間、少なくとも約35時間、少なくとも約36時間、少なくとも約48時間、少なくとも約60時間、少なくとも約72時間、少なくとも約84時間、少なくとも約96時間、または少なくとも約108時間である、項目128または129のいずれか1項に記載の組成物。
(項目131)
局所投与、眼球内投与、非経口投与、くも膜下投与、硬膜下投与、および経口投与からなる群から選択される経路により投与される、項目127〜130のいずれか1項に記載の組成物。
(項目132)
上記非経口投与が、静脈内投与または皮下投与である、項目131に記載の組成物。
(項目133)
その必要のある対象における、出血性疾患または状態を処置するために用いられる、項目127〜132のいずれか1項に記載の組成物。
(項目134)
上記出血性疾患または状態が、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目133に記載の組成物。
(項目135)
上記対象が、外科手術を受ける予定である、項目133または134のいずれか1項に記載の組成物。
(項目136)
上記処置が、予防的に、または、要求に応じて行われるものである、項目133〜135のいずれか1項に記載の組成物。
(項目137)
項目1〜26および45〜119のいずれか1項に記載のキメラタンパク質、項目120または121のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目122または123のいずれか1項に記載のベクター、項目124〜126のいずれか1項に記載の宿主細胞、または、項目127〜136のいずれか1項に記載の組成物の有効量を、それを必要とする対象に添加することを含む、内因性VWFとFVIIIタンパク質の結合を妨害または抑制する方法であって、ここで、上記VWF断片は、上記FVIIIタンパク質に結合し、それによって、内因性VWFの結合を妨害または抑制する、方法。
(項目138)
上記FVIIIタンパク質の半減期を延長または増加させる方法であって、ここで、上記方法は、項目1〜26および45〜119のいずれか1項に記載のキメラタンパク質、項目120または121のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目122または123のいずれか1項に記載のベクター、項目124〜126のいずれか1項に記載の宿主細胞、または、項目127〜136のいずれか1項に記載の組成物の有効量を、それを必要とする対象に添加することを含み、ここで、上記VWF断片は、上記FVIIIタンパク質に結合し、それによって、上記FVIIIタンパク質の半減期を延長または増加させる、方法。
(項目139)
細胞からのFVIIIタンパク質の除去を妨害または抑制する方法であって、ここで、上記方法は、項目1〜26および45〜119のいずれか1項に記載のキメラタンパク質、項目120または121のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目122または123のいずれか1項に記載のベクター、項目124〜126のいずれか1項に記載の宿主細胞、または、項目127〜136のいずれか1項に記載の組成物の有効量を、FVIIIタンパク質または上記FVIIIタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する細胞に添加することを含み、ここで、上記VWF活性を有するタンパク質は、上記FVIIIタンパク質に結合する、方法。
(項目140)
上記対象が、動物である、項目137〜139のいずれか1項に記載の方法。
(項目141)
上記動物が、ヒトである、項目140に記載の方法。
(項目142)
上記対象が、血友病Aに罹患している、項目140に記載の方法。
(項目143)
項目1〜26および45〜119のいずれか1項に記載のキメラタンパク質、項目120または121のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目122または123のいずれか1項に記載のベクター、項目124〜126のいずれか1項に記載の宿主細胞、または、項目127〜136のいずれか1項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、それを必要とする対象に、出血性疾患または障害を処置する方法であって、ここで、上記出血性疾患または障害は、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、腸腰筋鞘の出血からなる群から選択される、方法。
(項目144)
上記処置が、予防的または要求に応じて行われる、項目143に記載の方法。
(項目145)
上記有効量が、0.1μg/kg〜500mg/kgである、項目143または144のいずれか1項に記載の方法。
(項目146)
項目1〜119のいずれか1項に記載のキメラタンパク質、項目120または121のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目122または123のいずれか1項に記載のベクター、項目124〜126のいずれか1項に記載の宿主細胞、または、項目127〜136のいずれか1項に記載の組成物が、局所投与、眼球内投与、非経口投与、くも膜下投与、硬膜下投与、および経口投与からなる群から選択される経路により投与される、項目143〜145のいずれか1項に記載の方法。
(項目147)
上記非経口投与が、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、および皮内投与からなる群から選択される、項目146に記載の方法。
(項目148)
項目120または121のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または、項目122または123のいずれか1項に記載のベクターで、宿主細胞の1以上をトランスフェクトすること、および、上記キメラタンパク質を上記宿主細胞内で発現させること、を含有する、キメラタンパク質を作製する方法。
(項目149)
上記XTEN挿入部位が、成熟型FVIIIタンパク質(配列番号4)の745残基のすぐ下流である、項目27〜119のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目150)
上記XTEN挿入部位が、上記FVIIIタンパク質の1656残基および1900残基のすぐ下流である、項目27〜119のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目151)
上記XTEN挿入部位が、上記FVIIIタンパク質の26残基、1656残基および1900残基のすぐ下流である、項目27〜119のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目152)
上記XTEN挿入部位が、上記FVIIIタンパク質の403残基および745残基のすぐ下流である、項目27〜119のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目153)
上記XTEN挿入部位が、上記FVIIIタンパク質の745残基および1900残基のすぐ下流である、項目27〜119のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目154)
上記XTEN挿入部位が、上記FVIIIタンパク質の18残基および745残基のすぐ下流である、項目27〜119のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目155)
上記FVIIIタンパク質が、二本鎖FVIIIアイソフォームである、項目149〜154のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目156)
上記FVIIIタンパク質が、一本鎖FVIIIアイソフォームである、項目149〜154のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目157)
1つのXTENを含有する、項目149〜156のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目158)
2つのXTENを含有する、項目149〜156のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目159)
挿入されている3つのXTENを含有する、項目149〜156のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目160)
上記XTENが、配列番号39(AE288)である、項目149〜157のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目161)
上記XTENが、配列番号38および37(AG144およびAE144)である、項目149〜156および158のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目162)
上記XTENが、配列番号37、38および37(AE144、AG144、およびAE144)である、項目149〜156および159のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目163)
上記XTENが、配列番号38および39(AE144およびAE288)である、項目149〜156および157のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
(項目164)
上記PC5またはPC7が、VWFの上記D1D2ドメインを開裂する、項目124に記載の宿主細胞。
(項目165)
少なくとも2つのXTEN、少なくとも3つのXTEN、少なくとも4つのXTEN、少なくとも5つのXTEN、または少なくとも6つのXTENを含有する、項目1〜27のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
「一つの」(「a」または「an」)という用語の実体は、その実体の1以上を指すことに注意されたい。たとえば、「一つのヌクレオチド配列」とは、1以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。同様に、「一つの」、「一つ以上の」および「少なくとも一つの」という用語は、本明細書において、相互交換可能に用いることができる。
program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix(登録商標), Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711))を用いて決定することができる。BESTFITでは、Smithand Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)の部分的相同性アルゴリズムを用いて、2つの配列間の最も良い相同性セグメントが見出される。特定の配列が、本発明に従う基準配列と、たとえば、95%の同一であるかどうかを決定するために、BESTFITまたは任意の他の配列アライメントプログラムを用いる場合、パラメーターは、同一性のパーセントが基準ポリペプチド配列の全長にわたって算出され、基準配列中のアミノ酸の総数のうちの5%までの相同性ギャップが許可されるよう、セットされる。
本発明は、VWF断片とXTEN配列を用いて、FVIII半減期制限因子(すなわち、内因性VWF)が、FVIIIタンパク質と関連することを妨害または抑制することにより、第VIII因子タンパク質の半減期を延長させることを目的とする。内因性VWFは、非共有結合性複合体のFVIIIの約95〜98%と関連する。内因性VWFはFVIIIの半減期制限因子であり、また、内因性VWFのFVIIIタンパク質への結合は、様々な方法でFVIIIを保護することが知られている。たとえば、全長VWF(約250kDaを有する多量体)は、プロテアーゼ開裂およびFVIII活性化からFVIIIを保護することができ、FVIIIの重鎖および/または軽鎖を安定化させ、ならびに、スカベンジャー受容体によるFVIIIのクリアランスを妨害することができる。しかし、同時に、内因性VWFは、ピノサイトーシスを妨害し、そして、VWFクリアランス経路を介し、身体からFVIII−VWF複合体を除去することにより、FVIIIの半減期を制限する。学説に縛られることは望まないが、内因性VWFは半減期制限因子であり、これによって、半減期延長物質に融合したFVIIIタンパク質の半減期は、野生型FVIIIの約2倍より長くはならないと考えられている。それゆえ、本発明は、VWF断片を用いて内因性VWFとFVIIIタンパク質の間の相互作用を妨害または抑制し、それにより、XTEN配列のみを用いて、または、Ig定常領域もしくはその一部との組み合わせでXTEN配列を用いることにより、FVIIIタンパク質の半減期を延長させることを目的とする。XTEN配列は、FVIIIタンパク質またはVWF断片に連結されてもよい。それにより、VWF断片と関連したFVIIIタンパク質は、1以上のVWFクリアランス受容体により、さらにゆっくりと循環系から除去され、VWF断片を有していないFVIIIタンパク質または野生型FVIIIと比較して、XTEN配列またはIg定常領域と組み合わせたXTEN配列による完全な半減期延長が得られる。
(1)D´ドメインおよびD3ドメインを含有するVWF断片、XTEN配列、およびFVIIIであり、ここで、XTEN配列は、VWF断片に連結されている、
(2)FVIIIタンパク質、XTEN配列、およびIg定常領域またはその一部であり、ここで、FVIIIタンパク質はXTEN配列およびIg定常領域またはその一部に連結されており、または、
(3)FVIIIタンパク質、XTEN配列、およびVWF断片であり、ここで、XTEN配列は、C末端またはN末端でFVIIIタンパク質に連結されているか、または、FVIIIの1以上のアミノ酸のすぐ下流(たとえば、1以上のXTEN挿入部位)に挿入されており、および、VWF断片およびFVIIIタンパク質は互いに関連している。
本発明は、(i)VWFのD´ドメインおよびD3ドメインを含有するVWF断片、(ii)XTEN配列、および、(iii)FVIIIタンパク質を含有するキメラタンパク質を目的とするものであり、ここで、(i)、(ii)および(iii)は、互いに連結または関連している。本発明のキメラタンパク質の一部として、XTEN配列に連結されたVWFは、FVIIIタンパク質を関連し、それによって、内因性VWFとそのFVIIIタンパク質の間の相互作用を妨害または抑制する。ある実施態様において、内因性VWFとFVIIIタンパク質の結合を妨害または抑制することができるVWF断片は、同時に、少なくとも1つのVWF様FVIII保護特性を有することができる。VWF様FVIII保護特性の例としては、限定されないが、プロテアーゼ開裂およびFVIII活性化からFVIIIを保護すること、ならびに、FVIII重鎖および/または軽鎖を安定化させること、ならびに、スカベンジャー受容体によるFVIIIの除去を妨害することが挙げられる。その結果として、VWF断片は、VWFクリアランス経路を介したFVIIIタンパク質の除去を阻害し、それによって、身体からのFVIIIの除去を減少させる。一部の実施態様において、本発明のVWF断片は、FVIIIタンパク質と結合または関連し、および/または、FVIIIタンパク質のVWF結合部位を物理的にもしくは化学的に封鎖する。VWF断片に関連したFVIIIタンパク質は、そのようにして、野生型FVIIIまたはVWF断片と関連していないFVIIIと比較して、循環系からさらにゆっくりと除去される。
(b)FVIII−X−V、
(c)V−X:FVIII、
(d)X−V:FVIII、
(e)FVIII:V−X、
(f)FVIII:X−V、または、
(a5)X−V−FVIII、
であり、ここで、VはVWF断片を含有し、
Xは1以上のXTEN配列を含有し、
FVIIIはFVIIIタンパク質を含有し;
(−)はペプチド結合または1以上のアミノ酸を表し;および、
(:)は化学的関連または物理的関連である。1つの実施態様において、(:)は、化学的関連(たとえば、少なくとも1つの非ペプチド結合)を表す。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、(:)は共有結合である。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、(:)は非共有結合的相互作用(たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、Van der Waals相互作用、または水素結合)である。他の実施態様において、(:)は、非ペプチド共有結合である。さらに他の実施態様において、(:)はペプチド結合である。さらに他の実施態様において、(:)は2つの配列の間の物理的関連を表し、ここで、第一の配列の一部は、第二の配列に非常に近接しており、それによって、その第二の配列の一部は、第一の配列によって他の部分と相互作用することから保護され、または妨害され、および、さらに、その第二の配列と他の部分が相互作用せずに、この物理的関連は維持される。本明細書のポリペプチドの式の方向は、N末端(左側)からC末端(右側)へと列記されている。たとえば、式V−X−FVIIIは、式NH2−V−X−FVIII−COOHを意味する。1つの実施態様において、本明細書に記述される式は、2つの部分の間に任意の追加の配列を含有しても良い。たとえば、式V−X−FVIIIはさらに、他で特定されない限り、VとXの間のVのN末端で、XとFVIIIの間で、または、FVIIIのC末端で、任意の配列を含有しても良い。他の実施態様において、ハイフン(−)はペプチド結合を示す。
(b)FVIII−X2−V(X1)、
(c)V(X1):FVIII、
(d)FVIII:V(X1)、または、
(a5)X2−V(X1)−FVIII、
であり、ここで、V(X1)はVWF断片および第一のXTEN配列(X1)を含有し、ここで、XTEN配列は、VWF断片の1以上のアミノ酸のすぐ下流に挿入され、X2は1以上の任意選択的なXTEN配列を含有し、
FVIIIはFVIIIタンパク質を含有し、
(−)はペプチド結合または1以上のアミノ酸を表し;および、
(:)は化学的関連または物理的関連である。
(b1)V−L1−X−L2−FVIII、
(b2)FVIII−L2−X−L1−V、
(b3)V−L1−X:FVIII、
(b4)X−L1−V:FVIII、
(b5)FVIII:V−L1−X、
(b6)FVIII:X−L1−V、
(b7)X−L1−V−L2−FVIII、または、
(b8)FVIII−L2−V−L1−X、
であり、ここで、VはVWF断片を含有し、
Xは1以上のXTEN配列を含有し、
FVIIIはFVIIIタンパク質を含有し;
L1は第一の任意選択的なリンカー(たとえば、第一の開裂可能なリンカー)を含有し、L2は第二の任意選択的なリンカー(たとえば、第二の開裂可能なリンカー、または任意選択的なプロセッシング可能なリンカー)を含有し、
(−)はペプチド結合または1以上のアミノ酸であり;および、
(:)は化学的関連または物理的関連である。1つの実施態様において、(:)は、化学的関連(たとえば、少なくとも1つの非ペプチド結合)を表す。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、(:)は共有結合である。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、(:)は非共有結合的相互作用(たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、Van der Waals相互作用、または水素結合)である。他の実施態様において、(:)は、非ペプチド共有結合である。さらに他の実施態様において、(:)はペプチド結合である。さらに他の実施態様において、(:)は2つの配列の間の物理的関連を表し、ここで、第一の配列の一部は、第二の配列に非常に近接しており、それによって、その第二の配列の一部は、第一の配列によって他の部分と相互作用することから保護され、または妨害され、および、さらに、その第二の配列と他の部分が相互作用せずに、この物理的関連は維持される。本明細書のポリペプチドの式の方向は、N末端(左側)からC末端(右側)へと列記されている。たとえば、式(b1)V−L1−X−L2−FVIIIは、式NH2−V−L1−X−L2−FVIII−COOHを意味する。1つの実施態様において、本明細書に記述される式は、2つの部分の間に任意の追加の配列を含有しても良い。他の実施態様において、ハイフン(−)はペプチド結合を示す。
(g)V−L2−X−L1−F1:FVIII−L3−F2;
(h)V−L2−X−L1−F1:F2−L3−FVIII;
(i)F−L1−X−L2−V:FVIII−L3−F2;
(j)F−L1−X−L2−V:F2−L3−FVIII;
(k)V−L2−X−L1−F1−L4−FVIII−L3−F2;
(l)F2−L3−FVIII−L4−F1−L1−X−L2−V;
(m)FVIII−L2−F2−L4−V−L2−X−L1−F1;または、
(n)F1−L1−X−L2−V−L4−F2−L2−FVIII、
であり、ここで、VはVWF断片を含有し、
L1およびL3のそれぞれは、任意選択的なリンカーを含有し、
L2は、任意選択的なリンカー(たとえば、開裂可能なリンカー)を含有し、
L4は、任意選択的なリンカー(たとえば、プロセッシング可能なリンカー)であり、
FVIIIはFVIIIタンパク質を含有し、
Xは1以上のXTEN配列を含有し、
F1は任意選択的なIg定常領域またはその一部を含有し、
F2は任意選択的な追加のIg定常領域またはその一部を含有し、
(−)はペプチド結合または1以上のアミノ酸であり;および、
(:)は化学的関連または物理的関連である。
本発明のキメラタンパク質はまた、(i)FVIIIタンパク質、(ii)XTEN配列(第一の半減期伸長物質)、および、(iii)Ig定常領域またはその一部(第二の半減期伸長物質)を含有し、その中で、XTEN配列は任意選択的なリンカーによりFVIIIタンパク質に連結され、追加の任意選択的なリンカーによりIg定常領域またはその一部に連結されている。XTEN配列およびIg定常領域またはその一部を共に用いて、FVIIIタンパク質の半減期を延長することができる。1つの実施態様において、キメラタンパク質は単量体である。他の実施態様において、キメラタンパク質は二量体(ホモ二量体またはヘテロ二量体)である。
その組み合わせの例としては、限定されないが、CH2ドメイン、CH3ドメインおよびヒンジドメイン(それらは、Fc領域(またはFcドメイン)としても知られる)が挙げられる(たとえば、第一のFc領域)。Ig定常領域またはその一部の追加例は、本明細書の別項に記述する。
1つの態様において、本発明のキメラタンパク質は、(i)FVIIIタンパク質、(ii)XTEN配列、および、(iii)VWFのD´ドメインおよびD3ドメインを含有するVWF断片、を含有し、ここで、FVIIIタンパク質は、XTEN配列に連結され、ここで、FVIIIタンパク質は、VWF断片と関連し、または連結されている。1つの実施態様において、本明細書に記述されるキメラタンパク質のVWF断片は、VWFクリアランス受容体に結合することができない。他の実施態様において、VWF断片は、FVIIIタンパク質を1以上のプロテアーゼ開裂から保護すること、FVIIIタンパク質を活性化から保護すること、FVIIIタンパク質の重鎖および/または軽鎖を安定化させること、または、1以上のスカベンジャー受容体によるFVIIIタンパク質の除去を妨げること、ができる。他の実施態様において、VWF断片は、内因性VWFが、FVIIIタンパク質のVWF結合部位へと結合することを、妨害または抑制する。VWF結合部位は、FVIIIタンパク質のA3ドメインまたはC2ドメインに位置していてもよく、または、A3ドメインおよびC2ドメインの両方に位置していても良い。特定の実施態様において、VWF結合部位は、配列番号2の、アミノ酸1669〜1689および/または2303〜2332に対応するアミノ酸配列を含有する。
(1)FVIII(X1)−L1−F1:V−L2−X2−L3−F2、
(2)FVIII(X1)−L1−F1:F2−L3−X2−L2−V、
(3)F1−L1−FVIII(X1):V−L2−X2−L3−F2、
(4)F1−L1−FVIII(X1);F2−L3−X2−L2−V、
(5)FVIII(X1)−L1−F1−L4−V−L2−X2−L3−F2、
(6)FVIII(X1)−L1−F1−L4−F2−L3−X2−L2−V、
(7)F1−L1−FVIII(X1)−L4−V−L2−X2−L3−F2、または、(8)F1−L1−FVIII(X1)−L4−F2−L3−X2−L2−V、
であり、ここで、FVIII(X1)は、FVIIIタンパク質および1以上のXTEN配列を含有し、ここで、1以上のXTENは、FVIIIタンパク質のN末端またはC末端に連結され、または、FVIIIタンパク質の1以上のアミノ酸のすぐ下流(たとえば、本明細書に開示される1以上のXTEN挿入部位)に挿入され、
L1、L2またはL3のそれぞれは、任意のリンカー(たとえば開裂可能なリンカー)を含有し、
L4は、リンカー(たとえば、プロセッシング可能なリンカー)であり、
X2は、1以上の任意選択的なXTEN配列を含有し、
F1はIg定常領域またはその一部を含有し、
F2は任意選択的な追加のIg定常領域またはその一部を含有し、および、
VはVWF断片を含有し、
(−)はペプチド結合または1以上のアミノ酸であり、および、
(:)は共有結合または非共有結合を含有する。1つの実施態様において、(:)は、化学的関連(たとえば、少なくとも1つの非ペプチド結合)を表す。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、(:)は、共有結合である。他の実施態様において、化学的関連、すなわち、(:)は非共有結合的相互作用(たとえば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、Van der Waals相互作用、または水素結合)である。他の実施態様において、(:)は、非ペプチド共有結合である。さらに他の実施態様において、(:)はペプチド結合である。さらに他の実施態様において、(:)は2つの配列の間の物理的関連を表し、ここで、第一の配列の一部は、第二の配列に非常に近接しており、それによって、その第二の配列の一部は、第一の配列によって他の部分と相互作用することから保護され、または妨害され、および、さらに、その第二の配列と他の部分が相互作用せずに、この物理的関連は維持される。本明細書のポリペプチドの式の方向は、N末端(左側)からC末端(右側)へと列記されている。たとえば、式V−X−FVIIIは、式NH2−V−X−FVIII−COOHを意味する。1つの実施態様において、本明細書に記述される式は、2つの部分の間に任意の追加の配列を含有しても良い。たとえば、式V−X−FVIIIはさらに、他で特定されない限り、VとXの間のVのN末端で、XとFVIIIの間で、または、FVIIIのC末端で、任意の配列を含有しても良い。他の実施態様において、ハイフン(−)はペプチド結合を示す。
VWF(F8VWFとしてもまた知られる)は、血漿中に存在する大きな多量体糖タンパク質であり、内皮(バイベル・パラーデ(Weibel−Palade)小体)、巨核球(血小板のα顆粒)および内皮下結合組織において、構造的に産生される。基礎となるVWF単量体は、2813アミノ酸のタンパク質である。すべての単量体には、D´/D3ドメイン(第VIII因子に結合する)、A1ドメイン(血小板GPIb受容体、ヘパリン、および/または、おそらくコラーゲンに結合する)、A3ドメイン(コラーゲンに結合する)、C1ドメイン(活性化された際に、その中のRGDドメインが血小板インテグリンαIIbβ3に結合する)、およびタンパク質のC末端の「システインノット」ドメイン(VWFが、血小板由来成長因子(PDGF)、形質転換成長因子β(TGFβ)、およびβヒト絨毛性ゴナドトロピン(βHCG)と共有する)等の特定の機能を有する多くの特定ドメインが含有される。
´D3ドメインおよび、A1ドメイン、A2ドメイン、A3ドメイン、D4Nモジュール、VWD4モジュール、C8−4モジュール、TIL−4モジュール、C1モジュール、C2モジュール、C3モジュール、C4モジュール、C5モジュール、C5モジュール、C6モジュールおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1以上のドメインまたはモジュールを含有しても良い。
本明細書において、「XTEN配列」とは、主に小さな親水性アミノ酸から構成される、天然には存在せず、実質的に非反復性の配列を有し、生理学的条件下で低次構造を有する、または二次構造もしくは三次構造を有さない配列を有する、伸長された長さのポリペプチドを指す。キメラタンパク質のパートナーとして、XTENは、キメラタンパク質の作製のために本発明のVWF断片またはFVIII配列に連結された際、ある所望の薬物動態特性、物理化学特性、および薬剤特性をもたらす、担体としての役割を果たすことができる。そのような所望の特性としては、限定されないが、薬物動態パラメーターおよび可溶性の特徴の増強が挙げられる。本明細書において、「XTEN」は、たとえば、抗体、または、一本鎖抗体または軽鎖もしくは重鎖のFc断片等の抗体断片を具体的に除外する。
本明細書に用いられる「FVIIIタンパク質」とは、他で特定されない限り、凝固系におけるその通常の役割において、機能的であるFVIIIポリペプチドを意味する。FVIIIタンパク質という用語には、凝固系における全長の野生型第VIII因子の機能を保持する、その機能性断片、変異体、アナログまたは誘導体が含まれる。「FVIIIタンパク質」は、FVIIIポリペプチド(またはタンパク質)またはFVIIIと相互交換可能に用いられる。FVIII機能の例としては、限定されないが、凝固系を活性化する能力、第IX因子の補因子として作用する能力、または、Ca2+およびリン脂質の存在下で第IX因子とテナーゼ(tenase)複合体を形成し、それによって第X因子を活性化形態第Xa因子へと転換させる能力、が挙げられる。FVIIIタンパク質は、ヒト、ブタ、イヌ、ラット、またはマウスFVIIIタンパク質であっても良い。さらに、ヒトのFVIIIと他種のFVIIIを比較することにより、その機能のために必要とされる可能性がある、保存残基が特定されている(Cameronet al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US6,251,632)。
venom time、dRVVT)、混合血小板機能テスト、トロンボエラストグラフィ(TEGまたはSonoclot)、トロンボエラストメトリー(TEM(登録商標)、たとえば、ROTEM(登録商標))、または真性グロブリン溶解時間(ELT)。
al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier,J., et al., Nature 312:326-330(1984); Wood, W. I., et al., Nature312:330-337 (1984); Vehar, G. A., et al.,Nature 312:337-342 (1984);WO87/04187;WO88/08035;WO88/03558;および、米国特許第4,757,006号)。FVIIIアミノ酸配列は、米国特許第4,965,199号において示されるように、cDNAから推定されている。さらに、部分的Bドメイン欠損、または完全Bドメイン欠損したFVIIIは、米国特許第4,994,371号および第4,868,112号において示されている。一部の実施態様において、ヒトFVIII Bドメインは、ヒト第V因子のBドメインと置換されている(米国特許第5,004,803号)。ヒト第VIII因子をコードするcDNA配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、米国特許出願公開第2005/0100990号の配列番号4および5に示されている。
II配列のPCR増幅から得られた、完全ブタcDNA配列は、Healey, J. F., et al.,
Blood 88:4209-4214 (1996)、に報告されている。すべてのドメイン、すべてのサブユニット、および特定のアミノ酸配列の置換を有するハイブリッドのヒト/ブタFVIIIは、LollarおよびRungeによる米国特許第5,364,771号およびWO93/2009
3に開示されている。さらに最近になって、ブタFVIIIのA1ドメインおよびA2ドメインのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列、および、ブタA1および/またはA2ドメインが、対応するヒトのドメインで置換されたキメラFVIIIが、WO94/11503に報告されている。米国特許第5,859,204号(Lollar,J. S.)もまた、ブタcDNAおよび推定アミノ酸配列を開示している。米国特許第6,458,563号は、Bドメイン欠損ブタFVIIIを開示している。
少したFVIIIの機能的変異体を報告している。米国特許第6,376,463号(Lollar, J. S.)もまた、免疫反応性が減少したFVIIIの変異体を報告している。米国
特許出願公開第2005/0100990号(Saenko et al.)は、FVIIIのA2ド
メインにおける機能性変異を報告している。
(13): 7318-7323 (1990)。Bドメイン欠損第VIII因子はまた、FVIIIのアミノ
酸771−1666または、アミノ酸868−1562の欠損を含有しても良い。Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4):301-6 (1988)。本発明の一部である、さらなるBド
メインの欠損としては、以下が挙げられる:アミノ酸982〜1562、または、760〜1639の欠損 (Toole et al., Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83,5939-5942))、797〜1562の欠損(Eaton, et al.Biochemistry(1986) 25:8343-8347))、7
41〜1646の欠損(Kaufman (PCT国際特許出願公開WO87/04187))、747〜1560の欠損(Sarver, et al., DNA(1987) 6:553-564))、741〜1648の
欠損(Pasek(PCT国際特許出願88/00831))、または、816〜1598、も
しくは、741〜1648の欠損 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988)、欧州特許第295597号))。他の実施態様において、BDD FVIIIとしては、1以上のN結合型グリコシル化部位(たとえば、残基757、784、828、900、963、または、任意選択的に、943(全長FVIII配列のアミノ酸配列に対応している))の1つ以上を保持するBドメインの断片を含有するFVIIIポリペプチドが挙げられる。Bドメイン断片の例としては、Miao,H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda,A, et al., J. Thromb.Haemost. 6: 1352-1359 (2008)、および、Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9:2235-2242 (2011)に開示されている、Bドメインの226アミノ酸または163アミノ酸が挙げられる(すなわち、Bドメインの最初の226アミノ酸、または163アミノ酸が保持されている)。さらに他の実施態様において、BDD FVIIIはさらに、BDD FVIIIタンパク質の発現を改善するために、残基309の位置で点変異(PheからSerへの)を含有する。Miao,H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004)を参照のこと。さらに他の実施態様において、BDD FVIIIには、Bドメインの一部を含有するが、1以上のfurin開裂部位(たとえば、Arg1313およびArg1648)を含有しないFVIIIポリペプチドが含まれる。Pipe,S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)を参照のこと。前述の各
欠損は、任意のFVIII配列において作製されうる。
aは、FVIIIタンパク質の第一の部分のN末端アミノ酸残基であり、
bは、FVIIIタンパク質の第一の部分のC末端アミノ酸残基であり、XTEN配列が挿入されている挿入部位の2アミノ酸のN末端アミノ酸残基でもあり、
cは、FVIIIタンパク質の第二の部分のN末端アミノ酸残基であり、XTEN配列が挿入されている挿入部位の2アミノ酸のC末端アミノ酸残基でもあり、
dは、FVIIIタンパク質のC末端アミノ酸残基であり、
ここで、FVIIIタンパク質の第一の部分およびFVIIIタンパク質の第二の部分は、互いに同一ではなく、および、併せて、FVIIIタンパク質が、FVIII凝固活性を有するのに十分な長さのものである。
間に挿入されており、ここで、アミノ酸740と1690の間のFVIII配列は、任意
選択的に、存在しない。他の例において、XTENは、配列番号4のアミノ酸741と1648の間に挿入されており、ここで、アミノ酸741と1648の間のFVIII配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、XTENは、配列番号4のアミノ酸743と1638の間に挿入されており、ここで、アミノ酸743と1638の間のFVIII配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、XTENは、配列番号4のアミノ酸745と1656の間に挿入されており、ここで、アミノ酸745と1656の間のFVIII配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、XTENは、配列番号4のアミノ酸745と1657の間に挿入されており、ここで、アミノ酸745と1657の間のFVIII配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、XTENは、配列番号4のアミノ酸745と1667の間に挿入されており、ここで、アミノ酸745と1667の間のFVIII配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、XTENは、配列番号4のアミノ酸745と1686の間に挿入されており、ここで、アミノ酸745と1686の間のFVIII配列は、任意選択的に、存在しない。一部の他の例において、XTENは、配列番号4のアミノ酸747と1642の間に挿入されており、ここで、アミノ酸747と1642の間のFVIII配列は、任意選択的に、存在しない。さらに他の例において、XTENは、配列番号4のアミノ酸751と1667の間に挿入されており、ここで、アミノ酸751と1667の間のFVIII配列は、任意選択的に、存在しない。
(1)アミノ酸3、(2)アミノ酸18、(3)アミノ酸22、
(4) アミノ酸26、(5)アミノ酸32、(6)アミノ酸40、
(7)アミノ酸60、(8)アミノ酸65、(9)アミノ酸81、
(10)アミノ酸116、(11)アミノ酸119、(12)アミノ酸130、
(13)アミノ酸188、(14)アミノ酸211、(15)アミノ酸216、
(16)アミノ酸220、(17)アミノ酸224、(18)アミノ酸230、
(19)アミノ酸333、(20)アミノ酸336、(21)アミノ酸339、
(22)アミノ酸375、(23)アミノ酸399、(24)アミノ酸403、
(25)アミノ酸409、(26)アミノ酸416、(26)アミノ酸442、
(28)アミノ酸487、(29)アミノ酸490、(30)アミノ酸494、
(31)アミノ酸500、(32)アミノ酸518、(33)アミノ酸599、
(34)アミノ酸603、(35) アミノ酸713、(36)アミノ酸745、
(37)アミノ酸1656、(38)アミノ酸1711、(39)アミノ酸1720、
(40)アミノ酸1725、(41)アミノ酸1749、(42)アミノ酸1796、
(43)アミノ酸1802、(44)アミノ酸1827、(45)アミノ酸1861、
(46)アミノ酸1896、(47)アミノ酸1900、(48)アミノ酸1904、
(49)アミノ酸1905、(50)アミノ酸1910、(51)アミノ酸1937、
(52)アミノ酸2019、(53)アミノ酸2068、(54)アミノ酸2111、
(55)アミノ酸2120、(56)アミノ酸2171、(57)アミノ酸2188、
(58)アミノ酸2227、(59)アミノ酸2277、および、
(60)それらの2以上の組み合わせ、
からなる群から選択される1以上のアミノ酸のすぐ下流である。
本発明のXTEN配列に連結されたVWF断片またはFVIIIタンパク質はさらに、Ig定常領域またはその一部を含有してもよい。Ig定常領域またはその一部は、XTEN配列を組み合わされたVWF断片またはFVIIIタンパク質の薬物動態特性または薬力学特性を改善してもよい。ある実施態様において、Ig定常領域またはその一部は、Ig定常領域またはその一部と融合された分子の半減期を延長する。
1993. Methods Enzymol. 217:270)に詳述されている。コンセンサス定常領域プライマーにより、または、公開されている重鎖および軽鎖DNA配列およびアミノ酸配列に基づいた、より特異的なプライマーにより、PCRが開始されてもよい。上述のように、PCRを用いて抗体の重鎖および軽鎖をコードするDNAクローンを単離してもよい。この場合において、ライブラリは、コンセンサスプライマーまたはより大きな相同プローブ(たとえばマウス定常領域プローブ)によりスクリーニングされてもよい。抗体遺伝子の増幅に適切な多くのプライマーセットが当分野に公知である(たとえば、精製抗体のN末端配列に基づいた5´プライマー(Benharand Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509);cDNA末端の急速増幅(Ruberti, F. et al.1994. J.Immunol. Methods 173:33));抗体リーダー配列(Larrick et al. 1989 Biochem.Biophys. Res. Commun. 160:1250)等)。抗体配列のクローニングは、Newmanらの米国特許第5,658,570
号(1995年1月25日出願、参照により本明細書に援用される)にさらに詳述されている。
、一部の例においては、FcRnに対するアフィニティが、野生型のそれを超えて増加しうることが挙げられる。このアフィニティの増加は、「オン」の比率の増加、「オフ」の比率の減少、または、「オン」の比率増加と「オフ」の比率減少の両方を反映している可能性がある。FcRnに対するアフィニティ増加をもたらすと考えられている変異の例として、限定されないが、T256A、T307A、E380A、および、N434Aが挙げられる(Shieldset al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591)。
Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77、および、Armour et al. 1999, Eur. J.Immunol. 29:2613。
本発明のキメラタンパク質はさらに、1以上のリンカーを含有する。リンカーのうちの1つのタイプは、対象にin vivoで投与された際に、様々なプロテアーゼにより、(たとえば、凝固部位で)、開裂されることができる、開裂可能なリンカーである。1つの実施態様において、開裂可能なリンカーにより、凝固カスケードが発生している部位での、キメラタンパク質からの部分(たとえば、VWF断片)の開裂が可能となり、それによって、活性化されたFVIII(FVIIIa)が、そのFVIIIa活性を有するようになる。他のタイプのリンカーは、細胞内開裂部位を含有するプロセッシング可能なリンカーであり、それにより、宿主細胞内の細胞内プロセッシング酵素により開裂されることができ、ポリペプチドの簡便な発現およびキメラタンパク質の形成が可能となる。
A1、WO2010144502 A2、WO2010144508 A1、WO2011028228 A1、WO2011028229 A1、もしくは、WO2011028344 A2に開示されている。他の実施態様において、リンカーは、PAS配列である。
リンカーはまた、他分子から1分子を放出させるために、化学的に(たとえば、エステル結合の加水分解等)、酵素的に(すなわち、プロテアーゼ開裂配列の組み込み)、または光分解(たとえば、3−アミノ−3−(2−ニトロフェニル)プロピオン酸(ANP))のいずれかで開裂することができる部分を組み込んでもよい。
本発明において、本明細書に記述される、(a)XTEN配列およびFVIIIタンパク質に連結されたVWF断片、(b)XTEN配列およびFcに連結されたFVIIIタンパク質、または、(c)XTEN配列およびVWF断片に連結されるFVIIIタンパク質、もまた開示される。キメラタンパク質が一本鎖ポリペプチドである場合(たとえば、F2−L2−X−V−L1−F1−FVIIIであり、ここで、FVIIIタンパク質はFVIIIタンパク質を含有し、F1は第一のIg定常領域またはその一部(たとえば、第一のFc領域)を含有し、L1は第一のリンカーを含有し、VはVWF断片を含有し、XはXTEN配列を含有し、L2は第二のリンカーを含有し、および、F2は第二のIg定常領域またはその一部(たとえば、第二のFc領域)を含有する)、本発明は、一本鎖ポリペプチドをコードする一本鎖ポリヌクレオチドを含有する。キメラタンパク質が第一および第二のポリペプチド鎖を含有する場合(F2−L2−X−V:FVIII−F1)、第一のポリペプチド鎖はXTEN配列に連結されたVWF断片を含有し、それはさらに、開裂可能なリンカーにより第一のIg定常領域またはその一部(たとえば、第一のFc領域)に連結され(たとえば、F2−L2−X−V)、および、第二のポリペプチド鎖はFVIIIタンパク質および第二のIg定常領域またはその一部(たとえば、第二のFc領域)を含有し(たとえば、FVIII−F1)、ここで、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は互いに関連し、ポリヌクレオチドは第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列を含有してもよい。1つの実施態様において、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は、一本鎖ポリヌクレオチドによりコードされてもよい。他の実施態様において、第一のポリペプチド鎖および第二のポリペプチド鎖は、2つの異なるポリヌクレオチド(すなわち、第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列)によりコードされる。他の実施態様において、第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列は、2つの異なるポリヌクレオチド上にある(たとえば、異なるベクター)。ある実施態様において、本発明は、第一のヌクレオチド鎖および第二のヌクレオチド鎖を含有するポリヌクレオチドのセットを目的とするものであり、ここで、第一のヌクレオチド鎖は、キメラタンパク質のVWF断片をコードし、および、第二のヌクレオチド鎖は、FVIIIタンパク質をコードする。一部の実施態様において、2つのポリペプチド鎖または3つのポリペプチド鎖を含有するキメラタンパク質は、一本鎖ポリヌクレオチドによりコードされ、次いで、2または3(またはそれ以上)のポリペプチド鎖にプロセッシングされてもよい。さらに他の実施態様において、これらのポリペプチド鎖を含有するキメラタンパク質は、2または3のポリヌクレオチド鎖によりコードされてもよい。
7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991)に提示されている。
Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989を参照のこと。ここ数年において、プラスミドベクターは宿主ゲノム内を置換す
ることができず、および宿主ゲノム内に組み込まれることができないことから、in vivoで細胞へと遺伝子を送達する場合において特に有利であることが判明している。しかしながら、宿主細胞と同等のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内に作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。市販されている、普遍的に用いられているプラスミドのいくつかを挙げると、pBR322、pUC18、pUC19、様々なpcDNAプラスミド、pRC/CMV、様々なpCMVプラスミド、pSV40、および、pBlueScriptがある。具体的なプラスミドの追加例としては、pcDNA3.1、カタログ番号V79020;pcDNA3.1/hygro、カタログ番号V87020;pcDNA4/myc−His、カタログ番号V86320;および、pBudCE4.1、カタログ番号V53220(すべて、Invitrogen (Carlsbad, CA.)より入手)が挙げられる。他のプラスミドも、当業者に公知である。さらに、標準的な分子生物学的技法を用いてプラスミドのカスタム設計を行い、特定のDNA断片を除去および/または付加してもよい。
である。
本発明のキメラタンパク質を含有する組成物は、適切な薬学的に受容可能な担体を含有してもよい。たとえば、活性化合物が、作用部位への送達のために設計された調製物へプロセッシングされることを促進する、賦形剤および/または補助剤を含有してもよい。
R.Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
Co., Easton, Pa.1980)を参照のこと。
本発明のキメラタンパク質は、治療的に有益であろう、出血凝固障害、関節出血、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉内への大量出血、口腔内での大量出血、外傷、頭部外傷、消化管出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後腔の出血、腹膜後腔の出血、および腸腰筋鞘の出血からなる群から選択される出血性疾患または障害の治療に対する遺伝子治療法を用いて、哺乳類(たとえば、ヒト患者)において、in vivoで産生されてもよい。1つの実施態様において、出血性疾患または障害は、血友病である。他の実施態様において、出血性疾患または障害は、血友病Aである。これには、適切な発現制御配列に作動可能に連結された、適切なキメラタンパク質をコードする核酸の投与が含まれる。ある実施態様において、これらの配列は、ウイルスベクターへと組み込まれている。そのような遺伝子治療に適切なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、Epstein Barrウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターが挙げられる。他の実施態様において、アデノウイルスベクターは、そのE1遺伝子およびE3遺伝子を欠損している。アデノウイルスベクターを用いる場合、哺乳動物は、選択マーカー遺伝子をコードする核酸に曝露されなくともよい。他の実施態様において、配列は、当業者公知の非ウイルス性ベクターへと組み込まれる。
本発明は、内因性VWFのFVIIIタンパク質への結合を妨害または抑制するために、本明細書に記述されるキメラタンパク質を使用する方法を目的とする。本発明はまた、XTENおよびIg定常領域またはその一部に連結されたFVIIIを有するキメラタンパク質を使用する方法を目的とする。
概して、本発明の実施には、他に示されない限り、標準的な化学的技術、生物物理学的技術、分子生物学的技術、組み換えDNA技術、免疫学的技術(特に、たとえば、抗体の技術)および、電気泳動の標準的な技術(たとえば、Sambrook,Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989); Antibody Engineering Protocols (Methods inMolecular Biology), 510,Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: APractical Approach(Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr(1996); Antibodies: ALaboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press,Pub. (1999);および、CurrentProtocols in Molecular Biology,eds. Ausubel et
al., John Wiley & Sons (1992)を参照のこと)を採用している。
(a)pSYN−VWF−002のクローニング
pSYN−VWF−002は、配列番号100のアミノ酸1〜477である。[VWF−D´D3タンパク質配列]アミノ酸番号は、プロぺプチドを有していない成熟型VWF配列に相当し、および、配列番号2のアミノ酸764〜1240に相当する。pSYN−VWF−002構築物は、N末端に、合成されたタンパク質を適切に分泌させるFVIIIシグナルペプチドを有しており、続いて、タンパク質の精製のために用いられる、C末端の6xHisタグを有している。以下のプライマーの組み合わせを用いて、合成された。
VIIIシグナルおよびBsiW1部位を有する、ESC48−Fwd−VWF−D´D3
TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG (配列番号90)
6HisおよびNot1部位を有する、ESC51−Rev−VWF D´D3(1−477アミノ酸)
TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAGGTTGACAAC (配列番号91)
pSYN−VWF 010は、pSYN−VWF−008およびpSYN−VWF−002を用いて構築した。pSYN−VWF−008は、pcDNA 3.1中に全長VWF配列を含有し(配列番号2のアミノ酸1−2813)、その中には、763アミノ酸のプロペプチド(すなわち、D1D2ドメイン)が含まれ、その後に成熟型VWFの残りの2050アミノ酸配列が続く。pSYN−VWF−002のFVIIIシグナルペプチドは、pSYN−VWF−008由来のD1D2ドメインと置換され、得られた構築物が、pSYN−VWF−010である。pSYN−VWF−008は、Arg907で、BamH1部位を有し、コード領域の末端(ストップコドンの後)でNot1部位を有する。pSYN−VWF−008および002を、BamH1およびNot1制限酵素で消化した。pSYN−VWF−002由来の挿入物(1026bp)を、bamH1/Not1で消化したpSYN−VWF−008(8242bp)へとライゲートし、pSYN−VWF−010(D1D2D´D3:配列番号2のアミノ酸1−1240)を得て、6xHisタグもまた、C末端に付加された。形質転換された細胞において、pSYN−VWF−010はプロペプチドとともに合成されるが、細胞内プロセッシングにより、分泌された産物にプロペプチド(D1D2)は含有されない。VWF−010由来のタンパク質は、二量体として存在する。
pSYN−VWF−025は、pLIVEベクターにおいて、全長VWFの野生型D1D2D´D3配列を含有し、pSYN−VWF−029は、C336AおよびC379Aの変異を伴うD1D2D´D3配列を含有する。pSYN−VWF−025のクローニングに対し、以下のプライマーの組み合わせを用いた:
Nhe1部位を有する、ESC89−fwd=
CTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCG (配列番号92)
Sal1を有する、ESC91−rev=
CTGGATCCCGGGAGTCGACTCGTCAGTGGTGATGGTGATGATG (配列番号93)
30秒、55℃ 30秒、68℃ 4分))で、実施した。予測されたサイズのバンド(約3800bp)を、Gel Extractionキット(Qiagen, Valencia, Calif.)を用いてゲル精製し、pLIVE−Mirusベクター(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)のNhe1およびSal1制限酵素部位へとクローニングして、pSYN−VWF 025および029を作製した。
pSYN−VWF−031は、48アミノ酸の長さのトロンビン開裂可能なリンカー(8xGGGGS(配列番号94)+トロンビン部位)をVWF D1D2D´D3(C336A/C379A)とFc配列の間に有する、D1D2D´D3(C336A/C379A)−Fc構築物である。この構築物を作製するために、VWF−Fc領域を、pSYN−FVIII−064構築物(以下、FVIII−VWF構築物と呼称)から増幅した。pSYN−FVIII−VWFをXba1およびNhe1で消化した。得られた4165bpの挿入領域(VWF断片およびFc領域を含有)を、VWFおよびFc領域のLW22/LW23のプライマーの組み合わせによる増幅のための鋳型として用いた。
FVIIIシグナル配列およびBsiW1部位を有するLW22−FWD−VWF−D´D3
GCGCCGGCCGTACGATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(配列番号95)
ストップコドンおよびNot1部位を有するLW23−Rev−Fc
TCATCAATGTATCTTATCATGTCTGAATTCGCGGCCGCTCATTTACC(配列番号96)
BsiW1部位を有するLW24−Fwd−VWF D1D2D´D3クローニングオリゴ
GCGCCGGCCGTACGATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTG(配列番号97)
EcoRVを有する、LW27−Rev−VWF D´D3オリゴ
CCACCGCCAGATATCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAG(配列番号98)
VWF−D1D2D´D3タンパク質配列1(配列番号99)
VWF−D´D3タンパク質配列2(配列番号100)
rFVIII−XTEN融合タンパク質の、D´D3 FVIII半減期延長の可能性を評価するために、VWF D´D3二量体を、その対応するDNA構築物VWF−025(実施例1)の水圧注入により、FVIII−VWF DKOマウスへと導入した。D´D3が安定して発現される状態になった後(注入後5日目)、rFVIII−XTENの単回投与を、200IU/kgの投与量で、IV注射により投与した。rFVIII−XTEN投与後の120時間まで、血液試料を採取した。血漿FVIII活性を、FVIII発色アッセイにより分析した。D´D3発現レベルを、VWF ELISAにより測定し、rFVIIIFc PKプロファイルを、WinNonlinプログラムを用いて解析した。
AE288 XTENを、本実験のために、BDD−FVIIIのC末端に挿入した。このタンパク質を精製するために、接線流ろ過(TFF)工程を最初に用いて、馴化培地をバッファー交換した。次いで、ろ過物中の産物を、強陰イオン交換クロマトグラフィを用いて捕捉し、次いで、アフィニティクロマトグラフィを用いてさらに精製した。分子の純度は、HPLC−SECによる許容範囲にあり、ウェスタンブロッティングによりさらに確認された。分子の比活性は、aPTTアッセイおよびELISAによる測定で、Bドメイン欠損FVIIIと同等であった。
FVIII活性は、DiaPharma(lot# N089019)から入手したCOATEST SP FVIIIキットを用いて測定し、すべてのインキュベーションは、37℃のプレートヒーター上で振とうさせながら行った。
ヤギ抗ヒトVWF抗体(アフィニティ精製、affinity biological、GAVWF−AP)を捕捉抗体として、0.5ug/ウェルで用いて、VWF−EIA−D(Affinity Biologicals、VWF−EIA−D、1:100希釈)をVWF ELISAに対する検出抗体として用いた。ELISAアッセイを、以下の標準的なELISAの手順に従い実施し、TMBをHRP基質として用いて、PBST/1.5% BSA/0.5M NaCl緩衝液をブロッキングおよび結合緩衝液として用いた。アッセイの標準範囲は、100ng〜0.78ngであり、アッセイの定量下限(LLQQ)は、7.8ng/mLである。
(a)pSYN−FVIII−161のクローニング(図3)
FVIII−161プラスミドは、細胞での合成の間にプロセッシングされる酵素開裂部位を有する、一本鎖Fc(scFc)スキャホールドを含有する。構築物は、全長VWF(D´D3)のFVIII結合ドメインを有する。
pSYN−FVIII−168、172、174および175は、pSYN−FVIII−161の誘導体である。R1645A/R1648A変異をpSYN−FVIII−161に導入して、SC−FVIIIアイソフォームを産生するpSYN−FVIII−168を形成し、さらなる半減期延長のために、AE288 XTENをFVIII−HCのC末端に直接融合した。FVIII半減期延長に対するFcおよびXTEN技術の効果を評価するために、pSYN−FVIII−175を構築するために、D´D3コドン配列をpSYN−FVIII−168から除去した。
FVIII半減期延長に対するXTENおよびD´D3断片の効果を評価するために、pSYN−FVIII−170を構築した。コドン配列VWF−D1D2D´D3断片およびBDD−FVIIIを、発現キャスケットの5´および3´末端へと導入し、35aaトロンビン開裂可能なリンカーがすぐ後に続くAE288 XTENコドン配列を用いて、VWFおよびFVIII分子を接続した。細胞内プロセッシングの後、分泌されたタンパク質は、AE288 XTEN/35aaトロンビン開裂可能なリンカーにより成熟型BDD−FVIIIのN末端に連結されている成熟型VWF分子のD´D3断片を含有する、ポリペプチドを含有する。
pSYN−FVIII−170タンパク質配列(配列番号102)
図3および4のDNA構築物を含有するXTENはともに、2〜3の半減期延長因子と組み合わされている。それらのFVIII半減期延長の可能性を評価するために、図3および図4のDNA構築物の選択群を、水圧注入(HDI)により、100ug/マウスの投与量で、FVIII/VWFダブルノックアウト(DKO)マウスへと導入した。次いで、眼窩腔血液採取により、血液試料を、HDI後24時間で採取した。HDI後の血漿FVIIIの活性は、FVIII発色アッセイにより分析され、結果は、表17および図5に示す。野生型BDD−FVIIIと比較して、DNA構築物を含有するすべてのXTENは、HDI後24時間で、有意に高いFVIII血漿活性を有していたことから、対応する分子は、BDD−FVIIIよりも有意に長い循環タンパク質半減期を有していたことが示唆される。それら半減期延長因子の組み合わせ応用を、血友病動物においてさらに評価した。
水圧注入は、小動物(たとえばマウスおよびラット)の肝臓へ、効果的および安全に非ウイルス遺伝子を送達する方法である。元々は、約5〜7秒で、動物の体重の10分の1量の裸のプラスミドDNA/生理食塩水溶液(エンドトキシンフリー)を急速に注入するものとして特徴付けられていた。裸のプラスミドDNAに対象の遺伝子が含有され、肝臓において、動物の体重の10分の1量で産生された。標的タンパク質は、注入されたDNAから肝臓において産生され、注入後24時間以内で検出することができる。次いで、血漿試料を採取し、発現されたタンパク質の治療性を検討する。
タンパク質産生量を増加させるために、タンパク質産生のための2つの共トランスフェクションシステム(3つのDNA構築物を含有する)を作成した。第一のDNA構築物は、AE288 XTEN断片がFVIII重鎖のC末端に直接融合され、その後に野生型FVIII軽鎖断片(pSYN−FVIII−173、図6B)または、R1645A/R1648A変異を有するFVIII軽鎖断片(pSYN−FVIII−169、図6A)のいずれかが続き、次いで、FVIII軽鎖は単一Fc断片に直接融合されている、FVIII−Fc融合タンパク質をコードした。第二のDNA構築物は、D´D3−Fc融合タンパク質をコードしているpSYN−VWF−031(実施例1)である。HEK293F細胞に、第三のプラスミド(PC5)と共に2つのプラスミドが80:15:5の比率でトランスフェクトされた。合成されたタンパク質は、FVIII(XTEN)Fc/D´D3Fcヘテロ二量体およびD´D3Fc二量体として分泌され、そして、FVIII(XTEN)Fc/D´D3Fcヘテロ二量体は、タンパク質精製によりD´D3Fc二量体から分離された。
pSYN−FVIII−169成熟型タンパク質配列(配列番号103)
pSYN−FVIII−173成熟型タンパク質配列(配列番号104)
接線流ろ過(TFF)工程を用いて、澄まされた馴化培地を緩衝液交換した。次いで、2工程クロマトグラフィプロセスを用いて、FVIII−169/VWF−031またはFVIII−173/VWF−031を精製した。弱い陰イオン交換樹脂を用いて、アフィニティクロマトグラフィを行った。最終精製産物は、SEC−HPLCの許容範囲の純度であった。比活性は、Bドメイン欠損FVIIIと同等であった(FVIII発色アッセイおよびA280濃度で測定)。純度および本分子の各部分の存在は、SDS−PAGEおよびウェスタンブロッティングにより確認された。
FVIII−169/VWF−031の、VWF結合能は、Bio−Layer Interferometry(BLI)を基にした測定(Octet assay)により、ForteBio Octet 384で、Tris結合緩衝液(50mM Tris、pH7.2、150mM NaCl、5mM CaCl2)を用いて、25℃で得られた。FVIII結合を測定するためのOctetアッセイは、APS Biosensor上へのヒトvon Willebrand因子(Haematologic Technologies カタログ番号HCVWF−0191)の疎水性固定化後の1.0%ウシ血清アルブミン(Jackson ImmunoResearch カタログ番号001−000−161)の結合に基づいた。簡潔に述べると、hvWF(20 μg/mL)をTris緩衝液中で希釈し、600秒間、APS Biosensors全体にわたってロードし、反応プローブ上でおよそ3.0〜3.5nmの結合を得た。対照APSプローブは、基準差し引きのために、hvWFの非存在下で、1.0%BSAと共にロードした。ロードの後、すべてのプローブを、300秒間、Tris緩衝液中でインキュベートし、新たな基準線を確立した。続いて、バイオセンサープローブを、FVIII−XTEN 169または、FVIIIFc Drug基質(0、0.6、2、6、20、60、200、600IU/mL)の溶液中で、5分間、室温でインキュベートし、次いで、5分間の解離工程を行った。Octetデータ分析ソフトウェアを用いて、結合応答(nm)を、差し引きデータ(反応プローブから基準プローブを差し引いた)から導いた。FVIII−169/VWF−031(図7)に対しては、固定化VWFへの結合が検出されなかったことから、D´D3断片による、全長VWF分子からのFVIIIの遮蔽が完全であったことが示された。
FVIII−169/VWF−031のPKプロファイルを、HemAマウスおよびFVIII/VWF DKOマウスにおいて検証し、内因性VWFからFVIII部分を遮蔽するD´D3断片の能力を評価した。HemAマウスまたはFVIII/VWF DKOマウスを、FVIII−169/VWF−031の単回静脈内投与(200IU/kg)で処置して、次いで、血漿試料を、投与後、5分、8時間、24時間、48時間および72時間で採取した。血漿試料のFVIII活性は、FVIII発色アッセイにより検証し、FVIII−169/VWF−031の半減期は、WinNonlinプログラムを用いて算出した。
D´D3断片の、FVII−XTENのt1/2を延長する能力を、D´D3発現FVIII/VWF DKOマウスモデル(実施例2に記述)において評価した。この実験においては、循環中にD´D3二量体を導入するためにVWF−025を用いる代わりに、VWF−029構築物を用いて、循環中にD´D3単量体を導入した。FVIII−XTEN変異体タンパク質を調製するために、小スケール(50〜100mL)の一過性トランスフェクション培養培地を、トランスフェクション後4日目で調製し、細胞培養物を回収し、PK実験に適したFVIII活性の範囲(10〜20IU/mL)になるまで濃縮した。次いで、濃縮された細胞培地を、循環中にD´D3を有する、または有しないFVIII/VWF DKOマウスにおける標準的なPK実験に用いた。
rFVIIIFcタンパク質変異体の血漿安定性を、FVIII/VWFダブルノックアウトマウス(DKO)の血漿において検証した。安定性アッセイのために、HEK293細胞を、rFVIIIFcまたはFVIII−169(Bドメイン接合部分で挿入された、288AE XTENを有するrFVIIIFc)を発現するプラスミド、およびIgG−FcまたはVWF−031(IgG−Fcに融合されたVWF D´D3領域)のいずれかを発現するプラスミドと共トランスフェクションした。トランスフェクション後4日目で、細胞培養培地を回収し、FVIII発色活性に基づき、30IU/mLまで濃縮した。濃縮された細胞培養培地を、次いで、5IU/mLのFVIII活性をもたらすためにDKOマウス血漿に添加し、37℃でインキュベートした。発色アッセイによる活性測定のために、異なる時点でアリコートを回収した。各時点での活性を二重で測定し、平均活性を時間関数としてプロットした。FVIIIFc(重鎖と軽鎖が非共有結合的相互作用により共に保持されている二本鎖(dc)FVIII分子)の活性は、DKOマウス血漿中で、時間と共に減少した(図10)。FVIII−169:Fc(Bドメイン接合部分で288AE XTENの挿入を含有する)の活性は、rFVIIIFcと比較して、ゆっくりと低下したことから、XTENの挿入により安定性の増強がもたらされたことが示された。in vivoでFVIIIの安定性を増強するためにVWFを導入したとして、FVIII−169:VWF−031の血漿安定性を評価した。このヘテロ二量体(FVIII因子とVWF D´D3因子がFcの各ドメインの一部に融合されている)は、FVIII−169:Fcと比較して、さらなる血漿安定性を示したことから、VWF D´D3ドメインおよびXTENは、rFVIIIFcの血漿安定性に対し相乗効果を有することが示された。
Fc融合物、XTEN挿入およびVWFのD´D3断片のFVIII半減期に対する効果を評価するために、Bドメイン欠損組換えFVIII(rBDD−FVIII)、rFVIIIFc、FVIII−169:FcおよびFVIII−169:VWF−031の薬物動態特性を、FVIII/VWFダブルノックアウトマウス(DKO)において評価した。
FVIII半減期に対する、VWF−D´D3断片とXTEN挿入の組み合わせの効果を評価するために、FVIII−XTEN−Fc:VWF−Fcヘテロ二量体の薬物動態特性を、HemAマウスにおいて検証し、BDD−FVIIIの一本鎖アイソフォーム(scBDD−FVIII)およびFVIII−169:VWF−031(実施例10)と比較した。7つの新たなFVIII−XTEN−Fc構築物を作製した(タンパク質配列は表24に示す)。これら構築物の概略図は、図14A〜Hに示す。FVIII−195およびFVIII−199はそれぞれ、FVIII二本鎖および一本鎖アイソフォームであり、各々、1900位と1656位に2つのXTEN挿入を含有する。FVIII−196およびFVIII−201は、それぞれ、FVIII二本鎖および一本鎖アイソフォームであり、各々、26位、1900位と1656位に3つのXTEN挿入を含有する。FVIII−203、204および205は、Bドメインの接合部分および、1900位、403位、または18位にそれぞれ、2つのXTEN挿入を有するsc−FVIIIFc分子である。各FVIII−XTEN−Fc構築物を、HEK293細胞においてVWF−031と共に共発現させ、FVIII−XTEN−Fc/VWFヘテロ二量体タンパク質を産生させた。トランスフェクション後4日目、細胞培養培地を回収し、FVIII発色活性に基づき、20IU/mLまで濃縮(FVIII−195:VWF−031、FVIII−196:VWF−031、FVIII−199:VWF−031、FVIII−203:VWF−031およびFVIII−204:VWF−031)、または、精製(scBDD−FVIII、FVIII−169:VWF−031、FVIII−201:VWF−031 and FVIII−205:VWF−031)のいずれかを行った。FVIII−XTEN−Fc:VWF−Fcヘテロ二量体(FVIII−169:VWF−031、実施例5)において、D´D3断片によって内因性VWFからFVIII分子は完全に分子間遮蔽されたことが示されているため、HemAマウスをPK評価に選択した。精製タンパク質または濃縮細胞培養培地を、8〜12週齢のHemAマウスに、静脈内投与によって、200IU/10mL/kgの投与量で投与した。血漿試料は、投与後、5分、8時間、16時間、24時間、32時間、48時間、72時間、または96時間で採取した。血漿試料のFVIII活性は、FVIII発色アッセイにより分析し、半減期は、WinNonlin−Phoenixプログラムを用いて算出した。検証分子の薬物動態パラメーターは、表22に示す。選択時点での、FVIII−XTEN−Fc/VWF−Fc変異体に対する血漿FVIII活性を、図12A〜Cにプロットした。
FVIII−XTEN_VWFヘテロ二量体を、薬物動態特性に関し、HemAマウスにおいて検証した。検証したヘテロ二量体は、FVIII169/VWF034、FVIII205/VWF034、FVIII205/VWF036およびFVIII266/VWF031である。HemAマウスに、200IU/10mL/kgで、様々なヘテロ二量体タンパク質を単回静脈内投与した。血漿試料を、投与後5分、24、48、72、96および120時間で採取した。血漿試料のFVIII活性は、FVIII発色アッセイにより分析し、半減期は、WinNonlin−Phoenixプログラムを用いて算出した。PKの結果を、以下の表24に示す。
FVIIIの新規分子は、2つのポリペプチド(1つは、FVIII配列内の1以上の位置で挿入XTENを有する一本鎖Bドメイン欠損(BDD)FVIIIからなり、もう1つは、VWFのD´D3領域から構成される)を含有するように設計された。各ポリペプチドはまた、IgG1のFc領域に遺伝子組み換えにより融合され、D´D3領域がFVIII部分に結合するように正確に位置づけられた。得られたFVIII変異体を、一過性トランスフェクションによりHEK293細胞において発現させ、馴化培地から精製した。FVIII活性はFVIII発色アッセイにより評価し、薬物動態特性は、FVIIIノックアウト(HemAマウス)マウスおよびFVIII/VWFダブルノックアウト(DKO)マウスの両方において評価した。
表25:FVIII−XTEN−FcおよびVWF−Fc構築物のタンパク質配列
FVIII195タンパク質配列(アミノ酸1656および1900で、2つの144 AE XTENを有する、二本鎖FVIIIFc)(配列番号105)
AE XTENを有する)(配列番号109)
するFVIII Fc)(配列番号114)
FVIII−XTEN−Fc:VWF−Fcヘテロ二量体のFVIII特異的活性を測定した。ヘテロ二量体は、2ステップのクロマトグラフィプロセスを用いて精製した。弱陰イオン交換樹脂を用いて、アフィニティクロマトグラフィを行った。最終精製産物は、SEC−HPLCに受容可能な純度であった。特異的活性を、Bドメイン欠損FVIIIい(BDD−FVIII)と比較した(FVIII発色アッセイおよびA280濃度により測定)。データを表26に示す。すべての検証分子は、BDD−FVIIIと同等のFVIII特異的活性を示した。分子の純度および各部分の存在は、SDS−PAGEおよびウェスタンブロッティングにより確認した。
止血におけるFVIII−XTEN−Fc:VWF−Fcヘテロ二量体の有効性を、FVIII特異的aPTT活性により評価した(表28にまとめる)。表28に示されるように、VWF D´D3断片の付加およびFVIIIのドメイン内へのXTEN挿入により、ヘテロ二量体のFVIII特異的aPTT活性が減少する一方(FVIII155/VWF031データおよびFVIII205/VWF031データにより示される)で、FVIII Bドメイン領域のXTEN挿入またはVWF D´D3断片のC末端のXTEN挿入は、FVIII特異的aPTT活性に悪影響を与えなかった(FVIII169/VWF031データおよびFVIII169/VWF034データにより示される)。二本鎖BDD−FVIII(dcBDD−FVIII)と比較して、FVIII155/VWF031、FVIII169/VWF031、FVIII169/VWF034およびVWF205/VWF031は、それぞれ、2.5倍、2.8倍、2.6倍および、
5.5倍の特異的aPTT活性の減少を示した。
FVIII変異体を、aPTT緩衝液(0.15M NaCl、0.05M Tris−HCl、1% BSA、pH7.4)を用いて線形アッセイ範囲(200〜1.6mU/mL)で希釈した。その後に、50μLの希釈試料または標準物を、50μLの37℃、天然型ヒトHemAのプールされた血漿、50μLの37℃、aPTT試薬(ACTIN(登録商標)FSL活性化セファロプラスチン試薬、Dade Behring、参照番号B4219−2)と混合し、37℃、4分間、インキュベートした。次いで、50μlの20mM CaCl2(Dade Behring[参照番号ORFO37])を試薬混合物に添加して、凝固反応を開始させた。各試料の凝固時間(CaCl2の添加から、血塊形成開始までの時間の長さ)を用いて、aPTT活性を、標準物(第8版 国際標準FVIII濃縮物で作製された)に対して、算出した。特異的aPTT活性は、OD280により測定された各分子のタンパク質濃度に対して算出された。
ヘテロ二量体の止血有効性をさらに評価するために、HemAマウスおよび尾切断出血モデルにおける、FVIII169/VWF034および、FVIII205/VWF031の急性有効性を、BDD−FVIIIとの比較で評価した。HemAマウスを、200、65、および20IU/kgのBDD−FVIII単回IV注射で処置し、尾切断損傷後の失血対照レベルを作成した。200IU/kgのFVIII169/VWF034またはFVIII205/VWF031で処置されたマウスからの失血を、BDD−FVIIIで処置された対照群と比較して、止血における有効性を推定した。ビヒクル処置動物を用いて、当該モデルの失血ベースラインを作成した。図16に示されるように、ビヒクル処置動物と比較して、失血の有意な減少が、すべてのFVIII処置群で観察された(p<0.05)。FVIII169/VWF034および、FVIII205/VWF031の両方が、HemAマウス尾切断モデルにおいて有効であった。BDD−FVIIIと比較して、FVIII169/VWF034については約3倍低い有効性が観察された(65IU/kg BDD−FVIIIおよび200IU/kg FVIII169/VWF034は、同様の失血減少であった)。FVIII205/VWF034に対しては、10倍の有効性減少が観察された(20IU/kg BDD−FVIIIおよび200IU/kg FVIII205/VWF031は、同様の失血減少であった)。
8〜10週齢のオスのHemAマウスを実験に用いた。尾切断の前に、マウスを、50mg/kgのケタミン、0.5mg/kgのデクスメデトミジンのカクテルで麻酔し、37℃のヒートパッド上に乗せ、体温を維持させた。次いで、マウスの尾を37℃の水の中に10分間浸し、側血管脈を拡張させた。血管を拡張させた後、rFVIIIまたはビヒクル溶液を、尾静脈から注射し、5分後、尾の末梢1cmを、#11のストレージエッジの外科用メスを用いて切断した。流出した値を、13mlの37℃に温めた生理食塩水へ30分間採取し、次いで、マウスを、麻酔下で両側開胸により安楽死させた。血液採取前後の血液採取管の重量変化による重量測定で、失血量をグラム単位で定量し、それを失血量ミリリットル(mL)へと変換した(1gの重量変化=1mLの失血)。
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