JP2018096930A - 加齢黄斑変性の診断マーカー、診断キット、診断補助方法、及び、発症リスク判定方法 - Google Patents

加齢黄斑変性の診断マーカー、診断キット、診断補助方法、及び、発症リスク判定方法 Download PDF

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Abstract

【課題】加齢黄斑変性の発症及び発症前のリスクを簡易に早期診断できる方法を提供する。【解決手段】加齢黄斑変性患者に含まれるHTRA1遺伝子変異により、眼組織のみならず被験者の血液においてHTRA1タンパク質の発現量が増大していること見出した。被験者の血液のHTRA1タンパク質である加齢黄斑変性の診断マーカーである。血液のHTRA1タンパク質が4.0 ng/mL以上の場合に、被験者が加齢黄斑変性であると診断する。【選択図】図２

Description

本発明は、加齢黄斑変性の診断マーカー、診断キット、診断補助方法、及び、発症リスク判定方法に関する。
加齢黄斑変性（Age-related Macular Degeneration；AMDと略することがある。）は、原因不明の目の難病であり、網膜色素上皮細胞の異常により網膜の黄斑部が変性することにより、視野の中心部分がぼけたり、歪んで見えたり、中心が見えなくなったり、暗くなる等の症状を引き起こす疾患である。
加齢黄斑変性は多くの場合は高齢者に見られる疾患であるが、現在の医療技術では発症してしまった患者に対して抗VEGF抗体治療等を施すことにより、進行を遅らせる以外になく、一度発症してしまうと根本的に治療する方法がない疾患である。従って、加齢黄斑変性は早期診断及び発症させないことが重要である。
非特許文献１には、健常者と加齢黄斑変性患者とで、加齢黄斑変性感受性遺伝子であるHTRA1遺伝子上流のプロモータ配列が異なることと、網膜由来の細胞に加齢黄斑変性患者由来のHTRA1遺伝子プロモータ配列を導入した場合、下流のHTRA1遺伝子の発現が亢進することが記載されている。
しかし、非特許文献１に記載された内容は、ヒトHTRA1遺伝子領域における、加齢黄斑変性患者に相関性の高い大規模欠損の存在と、その機能をインビトロで確認したものにすぎない。
非特許文献２には、HTRA1遺伝子を強制発現させたマウスに対する経過観察の結果、HTRA1を生体内で強発現させると、網膜に加齢黄斑変性類似の血管新生が生じることが記載されている。
しかし、非特許文献２に記載された内容は、人為的にHTRA1遺伝子を強制発現させたマウスモデルであり、ヒトでのHTRA1遺伝子の効果については示唆されていない。
Iejima, D. et al. JBC. 2015. Nakayama, M., Iejima, D. et al. IOVS. 2014.
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、加齢黄斑変性の発症及び発症前のリスクを簡易に早期診断できる方法を提供することを目的とする。
本発明にかかる加齢黄斑変性の診断マーカーは、血液試料中のHTRA1タンパク質であることを特徴とする。
本発明によれば、加齢黄斑変性の発症及び発症前のリスクを簡易に早期診断できる。
本実施例にかかるELISAのアッセイ過程の手順の概略図である。 血中のHTRA1タンパク質量を健常者とAMD患者とで比較して示す図である。
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
加齢黄斑変性においては染色体10番目に強い相関が観察されており、この領域のタグSNPであるrs10490924が強く相関する。rs10490924と連鎖不平衡を共有する領域はARMS2とHTRA1の２遺伝子にまたがっているが、HTRA1遺伝子のエクソン１上流において約400 baseにわたって大規模な欠損変異が見つかっている。
本発明者は、加齢黄斑変性患者に含まれるHTRA1遺伝子変異により、眼組織のみならず、被験者の体液においてHTRA1タンパク質の発現量が増大していることを新知見として見出し、かかる事実に基づいて本発明を完成させた。
体液試料中にHTRA1タンパク質が一定レベル以上検出された場合、当該体液試料の由来する被験者は、加齢黄斑変性を発症するリスク／している可能性が高いと判断することができる（加齢黄斑変性を発症するリスクが高い、又は、加齢黄斑変性を発症している可能性が高いと判断することができる）。逆に、体液試料中にHTRA1タンパク質が一定レベル未満で検出された場合、当該体液試料の由来する被験者は、加齢黄斑変性を発症するリスク／している可能性が低いと判断することができる。
加齢黄斑変性の発症リスク及び発症可能性を判断する場合、例えばカットオフ値を設定し、カットオフ値以上であれば被験者は加齢黄斑変性を発症するリスク／している可能性が高いと判断し、逆にカットオフ値未満であれば被験者は加齢黄斑変性を発症するリスク／している可能性が低いと判断することができる。
例えば、被験者の体液試料中のHTRA1タンパク質が3.5 ng/mL以上の場合に、好ましくは4.0 ng/mL以上の場合に、より好ましくは4.0 ng/mL以上10.0 ng/mL以下の場合に加齢黄斑変性を発症するリスク／している可能性が高いと判断することができる。
被験者の体液は、例えば、血液、尿、唾液、涙、汗、母乳、***、膣液等であるが、好ましくは血液である。本実施形態にかかる発明において判断可能な加齢黄斑変性は、滲出型(Wet-AMD)でも萎縮型(Dry-AMD)でも可能である。なお、被験者の体液のみならず組織試料中にHTRA1タンパク質が一定レベル以上検出された場合、当該体液試料の由来する被験者は、加齢黄斑変性を発症するリスク／している可能性が高いと判断することも可能である。
HTRA1タンパク質の発現量の測定は、特に限定されるものではなく、単にHTRA1タンパク質の有無を検出するものであってもよく、またHTRA1タンパク質の発現量を相対的又は絶対的に決定するものでもよい。被験者の体液試料中でのHTRA1タンパク質の検出を行うには、HTRA1タンパク質に対する特異的抗体を作製し、特異的抗体を使用したウエスタンブロット法、固相酵素免疫検定法(ELIZA)、免疫組織学的染色法等の免疫学的方法によりHTRA1タンパク質の発現の有無または発現の程度を測定する。
ヒトHTRA1はMQIPRAALLPLLLLLLAAPASAQLSRAGRSAPLAAGCPDRCEPARCPPQPEHCEGGRARDACGCCEVCGAPEGAACGLQEGPCGEGLQCVVPFGVPASATVRRRAQAGLCVCASSEPVCGSDANTYANLCQLRAASRRSERLHRPPVIVLQRGACGQGQEDPNSLRHKYNFIADVVEKIAPAVVHIELFRKLPFSKREVPVASGSGFIVSEDGLIVTNAHVVTNKHRVKVELKNGATYEAKIKDVDEKADIALIKIDHQGKLPVLLLGRSSELRPGEFVVAIGSPFSLQNTVTTGIVSTTQRGGKELGLRNSDMDYIQTDAIINYGNSGGPLVNLDGEVIGINTLKVTAGISFAIPSDKIKKFLTESHDRQAKGKAITKKKYIGIRMMSLTSSKAKELKDRHRDFPDVISGAYIIEVIPDTPAEAGGLKENDVIISINGQSVVSANDVSDVIKRESTLNMVVRRGNEDIMITVIPEEIDP（配列番号１）なる配列を有する。HTRA1タンパク質に対する特異的抗体としては、例えばKYIGIRMMSLTSSKAKELKDRHRDFPDVISGA（配列番号２）を認識する抗体とすることが可能である。また、例えばQLSRAGRSAPLAAGCPDRCEPARCPPQPEHCEGGRARDACGCCEVCGAPEGAACGLQEGPCGEGLQCVVPFGVPASATVRRRAQAGLCVCASSEPVCGSDANTYANLCQLRAASRRSERLHRPPVIVLQRGACGQGQEDPNSLRHKYNFIADVVEKIAPAVVHIELFRKLPFSKREVPVASGSGFIVSEDGLIVTNAHVVTNKHRVKVELKNGATYEAKIKDVDEKADIALIKIDHQGKLPVLLLGRSSELRPGEFVVAIGSPFSLQNTVTTGIVSTTQRGGKELGLRNSDMDYIQTDAIINYGNSGGPLVNLDGEVIGINTLKVTAGISFAIPSDKIKKFLTESHDRQAKGKAITKKKYIGIRMMSLTSSKAKELKDRHRDFPDVISGAYIIEVIPDTPAEAGGLKENDVIISINGQSVVSANDVSDVIKRESTLNMVVRRGNEDIMITVIPEEIDP（配列番号３）を認識する抗体とすることが可能である。また、例えばEPVCGSDANTYANLCQLRAASRRSERLHRPPV（配列番号４）を認識する抗体とすることが可能である。
ウエスタンブロット法は、例えばHTRA1タンパク質を含有する体液試料をアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、これをメンブランに転写し、HTRA1タンパク質を認識しうる抗体(一次抗体)と反応させ、生成する免疫複合体を標識した二次抗体を用いて検出する方法である。生成した免疫複合体と結合した標識二次抗体の標識量を測定することにより、存在するHTRA1タンパク質の量を測定できる。
免疫組織学的染色法は、スライドガラス上に固定された体液試料中の細胞等を、抗体と反応させて免疫複合体を生成させ、これと結合した標識二次抗体により検出する。
使用する特異的抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、特異的抗体は既知の抗体作製方法によって得ることができる。ポリクローナル抗体の場合、合成ペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、この動物の血清等から産生された抗体を常法により得る。モノクローナル抗体の作製も常法により行うことができ、合成ペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、脾臓等に含まれる抗体産生細胞を採取し、骨髄腫細胞と融合させて得たハイブリドーマ細胞より製造することができる。
以下に、一例として、ELIZA法を使用する場合のHTRA1タンパク質の検出を具体的に説明する。まず、へパリンやEDTA等の抗凝固剤を含んだ採血管又は注射器等を用いて、被験者より血液を採取する。採血管や注射器の材質は、細胞無毒性のものであればよく、例えばガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートが好ましい。また、採血管や注射器の形状は、市販のものと同様の円筒形のものが好ましいが、特に限定されるものではない。また採血部位は静脈血が好ましいが、血漿が採取可能であれば、採血部位については特に限定されるものではない。
採血した血液は、遠心分離が可能な容器に移し、遠心分離により血液を血球画分と血漿画分とに分け、血漿を採取する。容器については、遠心操作が可能であれば特に限定されるものではなく、遠心操作が可能な採血管を用いた場合はそのまま用いてもよく、他の容器を用いる場合は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート等が好ましい。
マイクロプレートにHTRA1タンパク質に対する特異的抗体を固相化し、血漿中のHTRA1タンパク質を反応させる。続いて酵素標識したHTRA1タンパク質に対する別の特異的抗体（２次抗体）を反応させ、洗浄後、マイクロプレートに残る酵素活性を検出する。２次抗体については、マウス、ウサギ、ヤギ由来の抗体をアルカリフォスファターゼ（AP）、または西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を用いて酵素標識したものを使用可能である。発色基質については、標識した酵素の種類に応じて選択可能であり、アルカリフォスファターゼを用いる場合は、PNPP（p-ニトロフェニルリン酸、ジナトリウム塩）等が使用可能であり、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる場合は、ABTS（2,2'-アジノビス[3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸]-ジアンモニウム塩）、OPD（o-フェニレンジアミン二塩酸塩）、TMB（3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン）等の発色基質が使用可能である。
ELISA法に使用する容器は、ポリスチレン製の96穴容器が好ましいが、測定可能なものであれば、材質や形状は特に限定されるものではない。ELISA法に用いられる検出系には、酵素反応系を用いた発色法による吸光度測定が一般的だが、特に限定されるものではない。
なお、10番染色体のHTRA1遺伝子の第１エクソン上流約４キロの位置に加齢黄斑変性と相関性の高い変異領域があるが、加齢黄斑変性患者では健常者と比較して変異型が有意に多い。そのため、本実施形態にかかる被験者の体液試料中のHTRA1タンパク質を検出する手法と、被験者の体液試料中のゲノムDNAにおける変異型を検出する手法とを組み合わせることにより、更に高い精度にて、加齢黄斑変性の発症リスク／発症している可能性を判断することができる。
変異部位の検出は例えばPCR法により可能であり、PCR用のプライマーは上記の変異領域を挟むようにデザインする。変異領域の大きさが、健常者が多く持つ正常型の配列で443ベースの長さで、加齢黄斑変性患者が多く持つ変異型の配列が59ベースの長さであるため、PCR産物についてはこの長さの差が検出できるようにプライマーをデザインする。Forward側プライマーをARMS2のエクソン２領域内に例えばACATATCTCCTTAAAGCCACTG（配列番号５）のように作成可能である。Reverse側プライマーをARMS2エクソン２の下流の、HTRA1イントロン領域内に例えばATCCATCCCTACTCACCCATTA（配列番号６）のように作成可能である。
抗血液凝固剤の入った真空採血管を用いて、加齢黄斑変性非発症の被験者99人、並びに加齢黄斑変性患者91人より静脈採血を行った。静脈採血はEDTAを含んだ採血管を用いて被験者より血液採取した。その後、採取した血液を比重遠心液上に重層してスイングロータ式遠心機を用いて1000Gで15分間遠心し、上層に観察される血漿をパイペットで採取した。
次に血漿中のHTRA1タンパク質の発現量の測定をELISAキットで測定した。使用したELISAキットはHuman Serine protease HTRA1(HTRA1)ELISA kit No.CSB-EL010901HU CUSABIO BIOTECH CO.,LTD.であった。該ELISAキットの内容は下記に示すものであった。ビオチン抗体は、ビオチン抗体10μlとビオチン抗体希釈液990μlとを混合することにより100倍に希釈された。HPRアビジンは、HPRアビジン10μlとHPRアビジン希釈液990μlとを混合することにより100倍に希釈された。
図１のアッセイ過程に示すように96ウェルプレートに抗HTRA1抗体を固相化し、血漿中のHTRA1タンパク質を反応させた。続いてビオチン標識した別のHTRA1抗体を反応させ、洗浄後、アビジンhorseradish peroxidaseが加えられて発色検出された。発色したサンプルを、プレートリーダーを用いて吸光度測定を行い、吸光度と目的タンパク質量とが相関することを利用して、HTRA1タンパク質量を定量した。
検出した結果は図２のとおりとなり、血中のHTRA1タンパク質量は、健常者と比較して加齢黄斑変性患者で有意に高い値を示した。
加齢黄斑変性の診断に利用できる。
配列番号５、６：プライマー

Claims (5)

  1. 加齢黄斑変性の診断マーカーであって、被験者の体液試料中のHTRA1タンパク質であることを特徴とする診断マーカー。
  2. 前記体液試料中のHTRA1タンパク質が4.0 ng/mL以上の場合に、前記被験者が加齢黄斑変性であると診断する請求項１記載の診断マーカー。
  3. 被験者の体液試料中のHTRA1タンパク質に特異的に結合する、固相に固定される第１のHTRA1抗体と、
    被験者の体液試料中のHTRA1タンパク質に特異的に結合する、酵素標識されている第２のHTRA1抗体と、を有することを特徴とする加齢黄斑変性の診断キット。
  4. 被験者の体液試料中のHTRA1タンパク質を測定することを含むことを特徴とする加齢黄斑変性の診断補助方法。
  5. 被験者の体液試料中のHTRA1タンパク質を測定することを含むことを特徴とする加齢黄斑変性の発症リスク判定方法。
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