JP2018074983A - Method for producing differentiation-induced cell population from which undifferentiated cells have been removed - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、未分化細胞が除去された分化誘導細胞集団の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a differentiation-inducing cell population from which undifferentiated cells have been removed.
多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団について、研究開発が盛んに行われている。これらの細胞集団（多能性幹細胞加工製品）は、医薬（細胞医薬品）として、あるいは創薬や発生等における研究ツールとしての有用性が注目されている。医薬として利用される場合はヒトの細胞が主に用いられるが、研究ツールとして利用する場合は特にヒト細胞に限定されず、幅広い生物由来の細胞が用いられている。目的に応じて、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞が幅広く利用されている。 Research and development are actively conducted on cell populations containing differentiated cells that can be obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells. These cell populations (manufactured pluripotent stem cell products) are attracting attention as useful as pharmaceuticals (cell medicines) or as research tools in drug discovery and development. When used as a medicine, human cells are mainly used. However, when used as a research tool, human cells are not particularly limited, and cells derived from a wide range of organisms are used. According to the purpose, pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells are widely used.
しかし、これらの分化誘導細胞集団においては、未分化な状態のままの多能性幹細胞の残存及び混入が避けられない。いずれの目的で利用するにせよ、分化誘導細胞の純度は高いほうが好ましいため、この点は問題となる。特に、多能性幹細胞を用いる場合、未分化のままでは造腫瘍性を有するなど、分化誘導細胞集団に未分化多能性幹細胞が混入していると、医薬として用いる場合、安全面のリスクを伴う。 However, in these differentiation-inducing cell populations, it is inevitable that pluripotent stem cells remain unmixed and remain in an undifferentiated state. Regardless of which purpose is used, this is problematic because the purity of the differentiation-inducing cells is preferably high. In particular, when pluripotent stem cells are used, if they are undifferentiated pluripotent stem cells are mixed in the differentiation-inducing cell population, such as having tumorigenicity if they are undifferentiated, there is a safety risk when used as a medicine. Accompany.
そのため、分化誘導細胞集団の純度をより向上させる技術が種々提案されている。これらの技術は、主に分化誘導効率を向上させる技術群と、分化誘導細胞を純化・精製する技術群とに大別される。後者としては、分化誘導細胞を選択的に選り分ける技術（ポジティブセレクション）と、不可避的に混入する未分化多能性幹細胞を除去する技術（ネガティブセレクション）とにさらに分けられる。分化誘導細胞を純化・精製する技術として提案されているものを手法の違いによって整理すると、以下の通りとなる。 Therefore, various techniques for further improving the purity of the differentiation-inducing cell population have been proposed. These techniques are roughly divided into a technique group that mainly improves differentiation induction efficiency and a technique group that purifies and purifies differentiation-inducing cells. The latter can be further divided into a technique for selectively selecting differentiation-inducing cells (positive selection) and a technique for removing unavoidable undifferentiated pluripotent stem cells (negative selection). The technologies proposed for purifying and purifying differentiation-inducing cells can be summarized as follows according to the method used.
例えば、特殊培地を用いたアプローチとして、メチオニン（−）培地を利用する方法（非特許文献１及び２）、及び無糖培地を利用する方法（非特許文献３及び４）等が提案されている。また、ＦＡＣＳソーティングを用いたアプローチとして、抗ＳＳＥＡ−５抗体によるパージング（非特許文献５）、糖鎖抗体（レクチン）を用いたパージング（非特許文献６）、及び抗ＣＤ３０抗体結合薬剤を用いた方法（特許文献１）が提案されている。さらに、低分子化合物を用いたアプローチとして、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ阻害剤を利用する方法（非特許文献７）、塩化ケレリトリン、コーヒー酸、イベルメクチンを利用する方法（特許文献２）、スタチン類を利用する方法（特許文献３、４）、３，４−ジヒドロキシベンジルアミン誘導体を利用する方法（非特許文献８）、ＢＥＴ阻害剤であるＪＱ１を利用する方法（特許文献１）が提案されている。 For example, as an approach using a special medium, a method using a methionine (-) medium (Non-Patent Documents 1 and 2), a method using a sugar-free medium (Non-Patent Documents 3 and 4), and the like have been proposed. . Further, as an approach using FACS sorting, purging with an anti-SSEA-5 antibody (Non-Patent Document 5), purging with a sugar chain antibody (lectin) (Non-Patent Document 6), and an anti-CD30 antibody binding agent were used. A method (Patent Document 1) has been proposed. Furthermore, as an approach using a low molecular weight compound, a method using a Survivin inhibitor (Non-patent Document 7), a method using chelerythrine chloride, caffeic acid and ivermectin (Patent Document 2), a method using a statin (Patent) Documents 3 and 4), a method using a 3,4-dihydroxybenzylamine derivative (Non-Patent Document 8), and a method using JQ1 which is a BET inhibitor (Patent Document 1) have been proposed.
本発明は、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団において、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減させる方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for reducing the content ratio of undifferentiated pluripotent stem cells in a cell population containing differentiated cells that can be obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells.
本発明者らは、ポリフェノール化合物の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を、従来の方法よりも効率的に低減できることを見出した。本発明は、以下の態様を含む。 By culturing a cell population containing differentiated cells that can be obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells in the presence of a polyphenol compound, the present inventors have determined the content ratio of undifferentiated pluripotent stem cells, It has been found that it can be reduced more efficiently than the conventional method. The present invention includes the following aspects.
項１．
多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団の製造方法であって、
ポリフェノール化合物の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減する工程
を含む、製造方法。
項２．
前記ポリフェノール化合物が、レスベラトロール、ピセアタンノール、イソフラボン類、クルクミン、アントシアニジン、クェルセチン、エピカテキン、エピカテキンガラート、エピガロカテキン及びエピガロカテキンガラート、並びにそれらの改変体からなる群より選択される少なくとも一種のポリフェノール化合物である、項１に記載の製造方法。
項３．
前記ポリフェノール化合物が、スチルベン骨格、フラバン骨格又はイソフラボン骨格を有するポリフェノール化合物である、項１に記載の製造方法。
項４．
前記ポリフェノール化合物が、下記一般式（１）又は（２）を有する、項１に記載の製造方法
項５．
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である、項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
項６．
前記人工多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、項５に記載の製造方法。
項７．
前記分化細胞が、心筋細胞である、項５に記載の製造方法。
項８．
多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団の製造方法において、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減するために用いられる組成物であって、ポリフェノール化合物を含有する、組成物。
項９．
項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法により得られうる、細胞集団。
Item 1.
A method for producing a cell population containing differentiated cells obtainable by inducing differentiation of pluripotent stem cells,
Manufacturing comprising the step of reducing the content ratio of undifferentiated pluripotent stem cells by culturing a cell population containing differentiated cells that can be obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells in the presence of a polyphenol compound Method.
Item 2.
The polyphenol compound is selected from the group consisting of resveratrol, piceatannol, isoflavones, curcumin, anthocyanidins, quercetin, epicatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin and epigallocatechin gallate, and variants thereof Item 2. The production method according to Item 1, which is at least one polyphenol compound.
Item 3.
Item 2. The production method according to Item 1, wherein the polyphenol compound is a polyphenol compound having a stilbene skeleton, a flavan skeleton, or an isoflavone skeleton.
Item 4.
Item 2. The production method according to Item 1, wherein the polyphenol compound has the following general formula (1) or (2).
Item 5.
Item 5. The production method according to any one of Items 1 to 4, wherein the pluripotent stem cell is an induced pluripotent stem cell or an embryonic stem cell.
Item 6.
Item 6. The production method according to Item 5, wherein the induced pluripotent stem cell is an iPS cell.
Item 7.
Item 6. The production method according to Item 5, wherein the differentiated cells are cardiomyocytes.
Item 8.
In a method for producing a cell population containing differentiated cells obtainable by inducing differentiation of pluripotent stem cells, the composition is used for reducing the content ratio of undifferentiated pluripotent stem cells, comprising a polyphenol compound A composition containing.
Item 9.
Item 8. A cell population obtainable by the production method according to any one of Items 1 to 7.
本発明によれば、従来のものよりも純度の高い分化誘導細胞集団を利用することができ、造腫瘍性等の副作用がより低減された医薬や、より精度の高い研究ツール等が提供される。 According to the present invention, it is possible to use a differentiation-inducing cell population having a purity higher than that of the conventional one, and to provide a drug with reduced side effects such as tumorigenicity, a highly accurate research tool, and the like. .
１．多能性幹細胞
多能性幹細胞としては、特に限定されず、幅広く用いることができる。多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞のいずれも用いることができる。
1. The pluripotent stem cell is not particularly limited and can be widely used. As the pluripotent stem cell, either an induced pluripotent stem cell or an embryonic stem cell can be used.
人工多能性幹細胞としては、特に限定されないが、例えば、ｉＰＳ細胞等を用いることができる。胚性幹細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＥＳ細胞等を用いることができる。これらの中でも、特に医薬としての利用を考えた場合、安全性等の面からｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞が特に好ましい。特にヒト由来のｉＰＳ細胞（ｈ−ｉＰＳ細胞）が好ましい。 The artificial pluripotent stem cell is not particularly limited, and for example, iPS cells can be used. Although it does not specifically limit as embryonic stem cell, For example, ES cell etc. can be used. Among these, iPS cells and ES cells are particularly preferable from the viewpoint of safety and the like, especially when considering use as a medicine. In particular, human-derived iPS cells (h-iPS cells) are preferable.
本発明は、後述する通り、具体的には、未分化の状態のまま残存している多能性幹細胞の特性に着目して純化を行う技術に関する。したがって、本発明においては、分化細胞の種類は特に限定されない。 As will be described later, the present invention specifically relates to a technique for performing purification by paying attention to the characteristics of pluripotent stem cells remaining in an undifferentiated state. Therefore, in the present invention, the type of differentiated cells is not particularly limited.
特に限定されないが、分化細胞としては、心筋細胞、神経細胞、網膜色素上皮細胞などの網膜細胞、血液（造血）細胞、肝細胞、膵ベータ細胞、腎臓細胞、軟骨細胞及び生殖細胞等が挙げられる。これらの中でも特に心筋細胞が好ましい。 Although not particularly limited, differentiated cells include retinal cells such as cardiomyocytes, nerve cells, and retinal pigment epithelial cells, blood (hematopoietic) cells, hepatocytes, pancreatic beta cells, kidney cells, chondrocytes and germ cells. . Among these, cardiomyocytes are particularly preferable.
分化誘導方法は、従来公知の方法を適宜使用することができる。例えば、ｈ−ｉＰＳ細胞からの心筋細胞への分化誘導方法としては、Biochemical and Biophysical Research Communications 425 (2012) 321-327に記載の方法、又はProc Natl Acad Sci U S A. 2013 Aug 27;110(35):E3281-90.に記載の方法等を用いることができるが、これらに限定されない。 As a differentiation induction method, a conventionally known method can be appropriately used. For example, as a method for inducing differentiation of h-iPS cells into cardiomyocytes, the method described in Biochemical and Biophysical Research Communications 425 (2012) 321-327, or Proc Natl Acad Sci US A. 2013 Aug 27; 110 (35 ): The method described in E3281-90. Can be used, but is not limited thereto.
２．本発明の製造方法により得られる細胞集団
本発明の製造方法により得られる細胞集団は、特に限定されないが、未分化多能性幹細胞の含有割合が、通常は０．２％以下であり、好ましくは０．１％以下であり、より好ましくは０．０５％以下であり、さらに好ましくは０．０１％以下である。本発明の製造方法により得られる細胞集団は、未分化多能性幹細胞の含有割合が低いことが特徴であり、必要に応じて、分化誘導細胞及び未分化多能性幹細胞とは異なる細胞をさらに含んでいてもよい。
2. Cell population obtained by the production method of the present invention The cell population obtained by the production method of the present invention is not particularly limited, but the content of undifferentiated pluripotent stem cells is usually 0.2% or less, preferably It is 0.1% or less, More preferably, it is 0.05% or less, More preferably, it is 0.01% or less. The cell population obtained by the production method of the present invention is characterized by a low content of undifferentiated pluripotent stem cells, and if necessary, cells different from differentiation-inducing cells and undifferentiated pluripotent stem cells are further added. May be included.
本発明の製造方法により得られる細胞集団における未分化多能性幹細胞の含有割合は、フローサイトメトリーを用いた未分化細胞マーカー解析により求められるものとして定義できる。この解析は、具体的には以下のようにして行うことができる。 The content ratio of undifferentiated pluripotent stem cells in the cell population obtained by the production method of the present invention can be defined as that obtained by undifferentiated cell marker analysis using flow cytometry. Specifically, this analysis can be performed as follows.
未分化多能性幹細胞を分化誘導した後、約１×１０５〜５×１０５個の分化細胞にＡｃｃｕｔａｓｅ等の細胞剥離液を３７℃、５分間作用させ、分化細胞を剥離及び遠心回収する。分化細胞をＰＢＳ１００μＬずつに懸濁し、蛍光標識された抗ヒトＴＲＡ―１−６０抗体及びアイソタイプコントロール抗体をそれぞれ添加し、４℃、暗所で２０分間反応させる。分化細胞をＰＢＳで洗浄し遠心回収後、それぞれＰＢＳ３００μＬずつに懸濁し、セルストレイナーを通した後ＦＡＣＳチューブに回収する。フローサイトメトリーにおいては、標識蛍光に対応した検出器でその蛍光発光を検出し定量化する。アイソタイプコントロール抗体で染まる分画を陰性分画と定義し、それに比して蛍光強度の高い分画を陽性分画と定義する。抗ヒトＴＲＡ―１−６０抗体で染まる分画のうち、陽性分画に属する割合をパーセンテージで定量表記する。 After inducing differentiation of undifferentiated pluripotent stem cells, a cell detachment solution such as Accutase is allowed to act on approximately 1 × 10 5 to 5 × 10 5 differentiated cells at 37 ° C. for 5 minutes, and the differentiated cells are detached and centrifuged. . Differentiated cells are suspended in 100 μL each of PBS, fluorescence-labeled anti-human TRA-1-60 antibody and isotype control antibody are added, respectively, and reacted at 4 ° C. in the dark for 20 minutes. Differentiated cells are washed with PBS and collected by centrifugation, then suspended in 300 μL each of PBS, passed through a cell strainer, and then collected in a FACS tube. In flow cytometry, the fluorescence emission is detected and quantified by a detector corresponding to the labeled fluorescence. A fraction stained with an isotype control antibody is defined as a negative fraction, and a fraction with higher fluorescence intensity is defined as a positive fraction. Of the fraction stained with the anti-human TRA-1-60 antibody, the proportion belonging to the positive fraction is quantitatively expressed as a percentage.
本発明の製造方法により得られる細胞集団は、特に限定されず、幅広い用途に用いることができる。例えば、未分化多能性幹細胞の含有割合がより低減されているため、医薬（細胞医薬品）として利用する場合、安全面のリスクがより少なく、好ましい。医薬としての用途、すなわち対象疾患、用量・用法等については、分化細胞の種類によって適宜決定することができる。特に限定されないが、例えば分化細胞が心筋細胞である場合、本発明の細胞集団は、心筋梗塞や心筋症（拡張型心筋症など）に伴う重症心不全等の治療の目的で使用することができる。 The cell population obtained by the production method of the present invention is not particularly limited and can be used for a wide range of applications. For example, since the content ratio of undifferentiated pluripotent stem cells is further reduced, when used as a medicine (cellular medicine), there are fewer safety risks and it is preferable. The use as a medicine, that is, the target disease, dose, usage and the like can be appropriately determined depending on the type of differentiated cells. Although not particularly limited, for example, when the differentiated cells are cardiomyocytes, the cell population of the present invention can be used for the purpose of treating severe heart failure associated with myocardial infarction or cardiomyopathy (such as dilated cardiomyopathy).
本発明の製造方法により得られる細胞集団は、医薬として用いる場合、造腫瘍等の安全面のリスクが低減されているという効果を有する。 When used as a medicine, the cell population obtained by the production method of the present invention has an effect that the risk of safety such as tumor formation is reduced.
本発明の製造方法により得られる細胞集団は、医薬として用いる場合、医薬組成物における有効成分として使用できる。この医薬組成物は、特に限定されず、いわゆる細胞医薬品において含まれうる種々のその他の成分を含有していてもよい。 When the cell population obtained by the production method of the present invention is used as a medicine, it can be used as an active ingredient in a pharmaceutical composition. This pharmaceutical composition is not particularly limited, and may contain various other components that can be contained in so-called cell medicines.
本発明の製造方法により得られる細胞集団は、上記の通り説明される細胞集団を、使用目的等に応じて適宜、細胞培養培地中に含有していてもよいし、シート化していてもよい。 The cell population obtained by the production method of the present invention may contain the cell population described above as appropriate in the cell culture medium according to the purpose of use, or may be formed into a sheet.
３．本発明の製造方法
本発明の製造方法は、ポリフェノール化合物の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減する工程を含むことを特徴とする。
3. Production method of the present invention The production method of the present invention comprises an undifferentiated pluripotent cell culture by culturing a cell population containing differentiated cells that can be obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells in the presence of a polyphenol compound. It includes a step of reducing the content ratio of the stem cells.
ポリフェノール化合物としては、特に限定されず、幅広く使用することができる。 The polyphenol compound is not particularly limited and can be used widely.
ポリフェノール化合物としては、レスベラトロール、ピセアタンノール、イソフラボン類、クルクミン、アントシアニジン、クェルセチン、エピカテキン、エピカテキンガラート、エピガロカテキン及びエピガロカテキンガラート、並びにそれらの改変体からなる群より選択される少なくとも一種のポリフェノール化合物を使用できる。 The polyphenol compound is selected from the group consisting of resveratrol, piceatannol, isoflavones, curcumin, anthocyanidins, quercetin, epicatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin and epigallocatechin gallate, and variants thereof At least one polyphenol compound can be used.
ポリフェノール化合物が、スチルベン骨格、フラバン骨格又はイソフラボン骨格を有するポリフェノール化合物であれば好ましい。これらのうち、特に、スチルベン骨格又はフラバン骨格を有するポリフェノール化合物が好ましい。 It is preferable if the polyphenol compound is a polyphenol compound having a stilbene skeleton, a flavan skeleton or an isoflavone skeleton. Of these, polyphenol compounds having a stilbene skeleton or a flavan skeleton are particularly preferred.
スチルベン骨格を有するポリフェノール化合物としては、例えば、下記一般式（１）を有するものが挙げられる。 Examples of the polyphenol compound having a stilbene skeleton include those having the following general formula (1).
（式中、Ｒ１〜Ｒ７は、同一又は異なって、水素原子又は水酸基を示す）。 (In formula, R < 1 > -R < 7 > is the same or different and shows a hydrogen atom or a hydroxyl group).
これらのポリフェノール化合物の例として、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ７の少なくとも一つが水素原子を示すものが挙げられる。Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ７が全て水素原子であるものも挙げられる。 Examples of these polyphenol compounds include those in which at least one of R 1 , R 3 , R 4 and R 7 represents a hydrogen atom. Examples include those in which R 1 , R 3 , R 4 and R 7 are all hydrogen atoms.
これらのポリフェノール化合物の具体例として、レスベラトロール及びピセアタンノール等が挙げられる。これらのポリフェノール化合物をさらに修飾したものも使用できる。 Specific examples of these polyphenol compounds include resveratrol and piceatannol. Those obtained by further modifying these polyphenol compounds can also be used.
なお、本発明において「フラバン骨格」には、以下の構造がいずれも含まれる。 In the present invention, the “flavan skeleton” includes any of the following structures.
これらのうち、前者は、いわゆる狭義のフラバン骨格として知られる。また、後者は、クェルセチンの部分構造に相当する。 Among these, the former is known as a so-called narrowly defined flavan skeleton. The latter corresponds to a partial structure of quercetin.
フラバン骨格を有するポリフェノール化合物としては、例えば、下記一般式（２）を有するものが挙げられる。 Examples of the polyphenol compound having a flavan skeleton include those having the following general formula (2).
（式中、Ｒ７〜Ｒ１１は、同一又は異なって、水素原子又は水酸基を示し、Ｒ１２は、水酸基、アルコキシ基又はエステル基を表わし、Ａは、カルボニル基、メチレン基、ヒドロキシメチレン基又はアシルオキシメチレン基を表わし、かつ実線と破線とからなる二重線は、単結合又は二重結合を表わす）。 (In formula, R < 7 > -R < 11 > is the same or different, shows a hydrogen atom or a hydroxyl group, R < 12 > represents a hydroxyl group, an alkoxy group, or an ester group, A is a carbonyl group, a methylene group, a hydroxymethylene group, or A double line representing an acyloxymethylene group and consisting of a solid line and a broken line represents a single bond or a double bond).
これらのポリフェノール化合物の例として、Ｒ７、Ｒ９及びＲ１１の少なくとも一つが水素原子を示すものが挙げられる。Ｒ７、Ｒ９及びＲ１１が全て水素原子であるものも挙げられる。 Examples of these polyphenol compounds include those in which at least one of R 7 , R 9 and R 11 represents a hydrogen atom. Examples include those in which R 7 , R 9 and R 11 are all hydrogen atoms.
これらのポリフェノール化合物の例として、Ｒ１２が、エステル基を表わし、かつ、Ａが、メチレン基、ヒドロキシメチレン基又はアシルオキシメチレン基を表わすものが挙げられる。より好ましい例として、Ｒ１２が、エステル基を表わし、かつ、Ａが、メチレン基を表わすものが挙げられる。より好ましい例として、Ｒ１２が、エステル基を表わし、Ａが、メチレン基を表わし、かつＲ７、Ｒ９及びＲ１１が全て水素原子であるものが挙げられる。 Examples of these polyphenol compounds include those in which R 12 represents an ester group and A represents a methylene group, a hydroxymethylene group or an acyloxymethylene group. More preferred examples include those in which R 12 represents an ester group and A represents a methylene group. More preferred examples include those in which R 12 represents an ester group, A represents a methylene group, and R 7 , R 9 and R 11 are all hydrogen atoms.
Ｒ１２が、エステル基である場合、そのエステル基の例としては、炭素数１〜１２の、置換されていてもよく、官能基を有していてもよい炭化水素部分を有するエステル基が挙げられる。 When R 12 is an ester group, examples of the ester group include an ester group having 1 to 12 carbon atoms and a hydrocarbon moiety which may be substituted and may have a functional group. It is done.
炭化水素部分に任意に含まれる置換構造は、特に限定されず、例えば、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、エステル結合、アミド結合及びカルボニル基等が挙げられる。当該炭化水素部分は、これら置換構造群から選択される少なくとも二種で置換されていてもよい。 The substitution structure optionally contained in the hydrocarbon moiety is not particularly limited, and examples thereof include an oxygen atom, a sulfur atom, a nitrogen atom, an ester bond, an amide bond, and a carbonyl group. The hydrocarbon moiety may be substituted with at least two selected from these substituted structure groups.
当該炭化水素部分は、飽和又は不飽和であってもよい。また、当該炭化水素部分は、直鎖状、分岐状、環状、又はこれらのうち少なくとも二種を組み合わせた構造であってもよい。炭化水素部分の好ましい具体例としては、芳香族基等が挙げられる。 The hydrocarbon moiety may be saturated or unsaturated. The hydrocarbon moiety may be linear, branched, cyclic, or a combination of at least two of these. Preferable specific examples of the hydrocarbon moiety include aromatic groups.
炭化水素部分に任意に含まれる官能基は、特に限定されず、例えば、水酸基、アミノ基等が挙げられる。 The functional group arbitrarily contained in the hydrocarbon moiety is not particularly limited, and examples thereof include a hydroxyl group and an amino group.
官能基を有する炭化水素部分の好ましい具体例としては、フェノール基、ジヒドロキシベンゼン基及びトリヒドロキシベンゼン基等が挙げられる。 Preferable specific examples of the hydrocarbon moiety having a functional group include a phenol group, a dihydroxybenzene group, and a trihydroxybenzene group.
Ｒ１２が、エステル基である場合、Ｒ１２の好ましい例として、ガラート基等が挙げられる。 When R 12 is an ester group, preferred examples of R 12 include a gallate group.
これらのポリフェノール化合物の具体例として、クェルセチン、エピカテキン、エピカテキンガラート、エピガロカテキン及びエピガロカテキンガラート等が挙げられる。これらのポリフェノール化合物をさらに修飾したものも使用できる。 Specific examples of these polyphenol compounds include quercetin, epicatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin and epigallocatechin gallate. Those obtained by further modifying these polyphenol compounds can also be used.
未分化多能性幹細胞は、ポリフェノール化合物の存在下で培養することにより死滅する。ポリフェノール化合物の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減することができる。 Undifferentiated pluripotent stem cells are killed by culturing in the presence of a polyphenol compound. By culturing a cell population containing differentiated cells that can be obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells in the presence of a polyphenol compound, the content ratio of undifferentiated pluripotent stem cells can be reduced.
ポリフェノール化合物の細胞培地中における濃度は、１０μＭ〜１０００μＭが好ましく、５０μＭ〜５００μＭがより好ましく、７０μＭ〜２００μＭがさらに好ましい。 The concentration of the polyphenol compound in the cell culture medium is preferably 10 μM to 1000 μM, more preferably 50 μM to 500 μM, and even more preferably 70 μM to 200 μM.
培養時間は、多能性幹細胞の種類等に応じて適宜設定できるが、１２時間〜９６時間が好ましく、２４時間〜７２時間がより好ましく、３６時間〜６０時間がさらに好ましい。 The culture time can be appropriately set according to the type of pluripotent stem cells and the like, but is preferably 12 hours to 96 hours, more preferably 24 hours to 72 hours, and further preferably 36 hours to 60 hours.
（３）その他の薬剤
本発明の製造方法では、さらに他の薬剤の存在下で未分化多能性幹細胞を培養してもよく、そのような他の薬剤として例えば、未分化細胞マーカーとして知られるＣＤ３０を特異的に認識する抗体からなる抗ＣＤ３０抗体結合薬剤等が挙げられる。
(3) Other drugs In the production method of the present invention, undifferentiated pluripotent stem cells may be further cultured in the presence of other drugs, and such other drugs are known as undifferentiated cell markers, for example. Examples thereof include an anti-CD30 antibody binding agent comprising an antibody that specifically recognizes CD30.
ＣＤ３０は、ＴＮＦ−Ｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙに属し、一部のリンパ腫に発現している。正常組織では活性化リンパ球に発現するのみとされる。下流のシグナルとしてＮＦ−κＢやＭＡＰＫ経路が知られ、これらを介して生存に寄与するとされる。 CD30 belongs to TNF-R superfamily and is expressed in some lymphomas. In normal tissues, it is only expressed on activated lymphocytes. NF-κB and MAPK pathways are known as downstream signals, and are considered to contribute to survival through these signals.
具体的には、この抗ＣＤ３０抗体結合薬剤は、細胞を死滅させる活性を有する薬剤を細胞内環境で開裂するリンカーで結合させた抗体薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＤｒｕｇＣｏｎｊｕｇａｔｅ；ＡＤＣ）である。この抗ＣＤ３０抗体結合薬剤は、抗体認識した細胞内に侵入し、薬剤が細胞内に放出されることによって、その細胞を選択的に死滅させることができる。 Specifically, this anti-CD30 antibody binding agent is an antibody-drug conjugate (ADC) in which an agent having an activity of killing cells is bound with a linker that cleaves in the intracellular environment. This anti-CD30 antibody-binding drug enters into the antibody-recognized cell, and the drug is released into the cell, whereby the cell can be selectively killed.
薬剤としては、特に限定されないが、例えば、微小管阻害剤ＭＭＡＥ等が挙げられる。
また、リンカーとしては、特に限定されないが、例えば、蛋白質分解酵素により開裂するリンカー等が挙げられる。
Although it does not specifically limit as a chemical | medical agent, For example, microtubule inhibitor MMAE etc. are mentioned.
The linker is not particularly limited, and examples thereof include a linker that is cleaved by a proteolytic enzyme.
抗ＣＤ３０抗体結合薬剤として、特に限定されないが、例えば、抗体医薬として市販されているＡｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）（ＳＧＮ−３５）（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ社、ＳｅａｔｔｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓ社及び武田薬品）等を用いることができる。なお、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）は、適応疾患をＣＤ３０陽性リンパ腫として、ＦＤＡ承認を２０１１年に受けているほか、日本においても薬事承認を２０１４年４月に受けている。 Although it does not specifically limit as an anti-CD30 antibody binding agent, For example, Adcetris (trademark) (SGN-35) (Millenium, Seattle Genetics, and Takeda Pharmaceutical) etc. which are marketed as an antibody pharmaceutical can be used. In addition, Adtris (registered trademark) has received FDA approval in 2011 as an indication for CD30 positive lymphoma, and also received regulatory approval in Japan in April 2014.
抗ＣＤ３０抗体結合薬剤の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減することができる。 It is possible to reduce the content ratio of undifferentiated pluripotent stem cells by culturing a cell population containing differentiated cells that can be obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells in the presence of an anti-CD30 antibody binding agent. it can.
抗ＣＤ３０抗体結合薬剤の細胞培地中における濃度は、多能性幹細胞の種類等に応じて適宜設定することができるが、５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌが好ましく、１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌがより好ましく、２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌがさらに好ましい。 The concentration of the anti-CD30 antibody binding agent in the cell culture medium can be appropriately set according to the type of pluripotent stem cells, etc., but is preferably 5 μg / ml to 50 μg / ml, more preferably 10 μg / ml to 50 μg / ml. Preferably, 25 μg / ml to 50 μg / ml is more preferable.
４．本発明の組成物
本発明はさらに、上記の方法のために用いられる組成物であって、ポリフェノール化合物を少なくとも含有する、組成物を包含する。
4). Composition of the Invention The present invention further includes a composition used for the above-described method, wherein the composition contains at least a polyphenol compound.
本発明の組成物は、細胞培養液中に添加して使用する。より詳細には、細胞培養液中に、ポリフェノール化合物が含まれるようにするために使用する。 The composition of the present invention is used by being added to a cell culture medium. More specifically, it is used so that a polyphenol compound is contained in the cell culture medium.
これらの組成物における、ポリフェノール化合物の配合濃度は、特に限定されず、要求される保存安定性や使用目的等に応じて適宜設定することができる。 The blending concentration of the polyphenol compound in these compositions is not particularly limited, and can be appropriately set according to the required storage stability, purpose of use, and the like.
これらの組成物は、上記の方法を阻害しない限りにおいて、さらに他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、特に限定されないが、例えば、グルコース、マルトース、シュークロース、ラクトース、ラフィノース、トレハロース、マンニトール、ヒドロキシエチル澱粉及びプルラン等の糖質、グルコン酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸、β−ヒドロキシ酪酸及びクエン酸等の有機酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウム等の電解質、Ｌ−アスコルビン酸及びビタミンＥ等のビタミン、グリシン、グルタミン酸及びリジン等のアミノ酸、抗利尿ホルモン及びインスリン等のホルモン、クエン酸、クエン酸塩、ヘパリン及びエデト酸ナトリウム等の抗凝固剤、カルシウム拮抗剤、アドレナリンβ受容体拮抗剤及びアンギオテンシン変換酵素阻害剤等の降圧剤、アデノシン三リン酸等の核酸塩基、凍結防止蛋白質等の凍結防止剤；並びに活性酸素消去剤、細胞賦活剤、抗生物質、抗血小板因子、肝障害抑制剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、分散剤、粘性剤、再吸収促進剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、防腐剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、緩衝剤及びｐＨ調整剤等が挙げられ、これらの少なくとも一種を必要に応じて配合することができる。 These compositions may further contain other components as long as the above methods are not inhibited. Examples of other components include, but are not limited to, carbohydrates such as glucose, maltose, sucrose, lactose, raffinose, trehalose, mannitol, hydroxyethyl starch and pullulan, gluconic acid, lactic acid, acetic acid, propionic acid, β- Organic acids such as hydroxybutyric acid and citric acid, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sodium bicarbonate, Electrolytes such as potassium bicarbonate, sodium carbonate and potassium carbonate, vitamins such as L-ascorbic acid and vitamin E, amino acids such as glycine, glutamic acid and lysine, hormones such as antidiuretic hormone and insulin, citric acid, citrate, heparin Anticoagulants such as sodium edetate, antihypertensives such as calcium antagonists, adrenergic β receptor antagonists and angiotensin converting enzyme inhibitors, nucleobases such as adenosine triphosphate, and cryoprotectants such as antifreeze proteins; and Active oxygen scavenger, cell activator, antibiotic, antiplatelet factor, liver injury inhibitor, excipient, binder, disintegrant, dispersing agent, viscosity agent, resorption enhancer, surfactant, solubilizer, Preservatives, preservatives, emulsifiers, isotonic agents, stabilizers, buffers, pH adjusters and the like can be mentioned, and at least one of these can be blended as necessary.
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. The present invention is not limited to the following examples.
＜試験例＞
細胞増殖アッセイ（ＣＣＫ−８アッセイ）
細胞を96ウェルプレートに播種し、3−4日培養後、被験物質を含む維持培地に交換し、一定時間３７度５％ＣＯ２でインキュベートし、その後各ウェルにＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ ８ （Ｄｏｊｉｎｄｏ、３４７−０７６２１）を添加し、一定時間３７度５％ＣＯ２でインキュベートし、マイクロプレートリーダーで４５０nmの吸光度を測定する。
<Test example>
Cell proliferation assay (CCK-8 assay)
The cells were seeded in a 96-well plate, cultured for 3-4 days, then replaced with a maintenance medium containing a test substance, incubated at 37 ° C. for 5 hours with 5% CO 2, and then each cell was treated with Cell Counting Kit 8 (Dojindo, 347- 07621) is added, incubated at 37 ° C. for 5 hours with 5% CO 2, and the absorbance at 450 nm is measured with a microplate reader.
細胞増殖アッセイ（セルカウント）
細胞を０．５×Triple Select 又は、０．０５％Tripsin/EDTAで酵素処理し、それに維持培地を加え１０００rpm、５分遠心を行う。沈殿した細胞を維持培地に懸濁する。細胞懸濁液とトリパンブルー液を１：１で混合し、カウンテス（invitrogen）を用い、生細胞数を測定する。
Cell proliferation assay (cell count)
Treat the cells with 0.5 × Triple Select or 0.05% Tripsin / EDTA, add a maintenance medium, and centrifuge at 1000 rpm for 5 minutes. Suspend the precipitated cells in maintenance medium. The cell suspension and trypan blue solution are mixed 1: 1, and the number of viable cells is measured using an invitrogen.
Lin28発現細胞に関する定量的ＰＣＲ
セルカウント後の培養細胞からPure Link RNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific社製)を用い全mRNA抽出を行った。mRNAからSuper Script VIRO Mater Mix (Thermo Fisher Scientific社製)を用いてcDNAを合成し、SYBR Green Real-Time PCR Master Mixe (Thermo Fisher Scientific社製)を用い、Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific社製)により未分化細胞のマーカーとしてＬｉｎ２８の測定を行った。
Quantitative PCR for Lin28 expressing cells
Total mRNA was extracted from the cultured cells after cell counting using Pure Link RNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific). cDNA was synthesized from mRNA using Super Script VIRO Mater Mix (Thermo Fisher Scientific), and Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Thermo) using SYBR Green Real-Time PCR Master Mixe (Thermo Fisher Scientific). Fisher 28) was used to measure Lin28 as a marker for undifferentiated cells.
cTnT発現細胞に関するＦＡＣＳ
セルカウントを行った細胞サンプルを、0.5% BSA/PBSで洗浄後、細胞を固定・透過処理剤（BD Cytofix Cytoperm、Fixation/Permeabilization Solution Kit、BD社製）で固定、透過処理し、処理後の細胞を抗cTnT抗体（Troponin T-C antibody(CT3)、マウスIgG2a、Santa Cruz biotechnology社製）、次いで、蛍光標識二次抗体（Alexa Fluor 647結合マウスIgG2a抗体、Life technology社製）と反応することにより行った。
標識した細胞を、BD FACS Canto IIフローサイトメーターおよびBD FACS Divaソフトウェア（いずれもBD社製）を用いて解析した。
FACS for cTnT expressing cells
After washing the cell sample with cell count with 0.5% BSA / PBS, the cells were fixed and permeabilized with a fixative / permeabilization agent (BD Cytofix Cytoperm, Fixation / Permeabilization Solution Kit, manufactured by BD). Performed by reacting cells with anti-cTnT antibody (Troponin TC antibody (CT3), mouse IgG2a, manufactured by Santa Cruz biotechnology), and then fluorescent labeled secondary antibody (Alexa Fluor 647-conjugated mouse IgG2a antibody, manufactured by Life technology) It was.
The labeled cells were analyzed using a BD FACS Canto II flow cytometer and BD FACS Diva software (both manufactured by BD).
実施例１．ｉＰＳ細胞および正常細胞に対するレスベラトロールの作用
ヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１）を９６穴プレートへ播種した（細胞密度：２０％ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）。播種３−４日後、各ウェルにレスベラトロールを０〜２００μＭ添加し（以後培地交換なし）、細胞数を反映する細胞増殖アッセイ （ＣＣＫ−８アッセイ）によって生細胞の定量的評価を行った。その結果、濃度依存的に細胞死が誘導され、レスベラトロール２００μＭ添加群において、２４時間後に６０〜７０％の細胞死が誘導されることが確認された（図１）。
Example 1. Effect of resveratrol on iPS cells and normal cells A human iPS cell line (253G1) was seeded in a 96-well plate (cell density: 20% confluency). Three to four days after seeding, resveratrol was added to each well in an amount of 0 to 200 μM (hereinafter, medium was not changed), and the live cells were quantitatively evaluated by a cell proliferation assay (CCK-8 assay) reflecting the number of cells. As a result, cell death was induced in a concentration-dependent manner, and it was confirmed that 60-70% cell death was induced after 24 hours in the resveratrol 200 μM addition group (FIG. 1).
ヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１）を6cm2ディッシュへ播種した。播種４日後（細胞密度：８０−９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）、各ディッシュにレスベラトロールを５０μＭ添加し（以後培地交換なし）、培養１、３、６、２４、４８時間ごとにセルカウントによって生細胞の定量的評価を行った。その結果、継時的に細胞死が誘導され、レスベラトロール添加４８時間後に９０％以上の細胞死が誘導されることが確認された（図２）。 Human iPS cell line (253G1) was seeded into 6 cm 2 dishes. Four days after seeding (cell density: 80-90% confluency), resveratrol was added to each dish at 50 μM (no medium change thereafter), and cell viability was determined by cell count every 1, 3, 6, 24, and 48 hours of culture. Quantitative evaluation was performed. As a result, it was confirmed that cell death was induced over time, and that 90% or more cell death was induced 48 hours after addition of resveratrol (FIG. 2).
ヒト正常細胞（皮膚線維芽細胞：ＮＨＤＦ）に対してレスベラトロールが及ぼす影響を調べる目的で、ヒトｉＰＳ細胞の場合と同様の条件で細胞増殖アッセイを行った。ヒト線維芽細胞を１０cm2ディッシュへ播種し（細胞密度：５０％ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）、４８時間培養した。培養後、各ウェルにレスベラトロールを１００μＭ添加し（以後培地交換なし）、４８時間培養後にセルカウントによって生細胞の定量的評価を行った。その結果、ヒト線維芽細胞に対しては、レスベラトロール１００μＭの添加では４８時間経過しても、ほぼ細胞死の誘導は認められなかった（図３）。 In order to examine the effect of resveratrol on human normal cells (skin fibroblasts: NHDF), a cell proliferation assay was performed under the same conditions as for human iPS cells. Human fibroblasts were seeded in 10 cm 2 dishes (cell density: 50% confluency) and cultured for 48 hours. After culturing, 100 μM resveratrol was added to each well (no medium exchange thereafter), and after 48 hours of culturing, live cells were quantitatively evaluated by cell count. As a result, with respect to human fibroblasts, the addition of resveratrol 100 μM hardly induced cell death even after 48 hours (FIG. 3).
実施例２．ｉＰＳ−ＣＭに対するレスベラトロールの作用による未分化細胞除去
ヒトｉＰＳ細胞株（253G1）から分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞集団（ｉＰＳ−ＣＭ）を対象としてレスベラトロールの作用を検討した。ｉＰＳ−ＣＭは心筋細胞の他、造腫瘍性を有する未分化細胞および平滑筋細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞も含有すると考えられる。
Example 2 The action of resveratrol was examined on human iPS cell-derived cardiomyocyte population (iPS-CM) induced to differentiate from an undifferentiated cell-removed human iPS cell line (253G1) by the action of resveratrol on iPS-CM. iPS-CM is considered to contain undifferentiated cells having tumorigenicity and smooth muscle cells, fibroblasts, and vascular endothelial cells in addition to cardiomyocytes.
心筋への分化誘導方法は、Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｋ, ｅｔ ａｌ. Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉａｃ ｃｅｌｌ ｓｈｅｅｔｓ ｕｓｉｎｇｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ. Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、２０１２、 ４２５（２）、ｐｐ．３２１−７に従った。
ｉＰＳ−ＣＭを6cm2ディッシュへ播種し（細胞密度：４×106）、播種と同時に、各ディッシュにレスベラトロールをそれぞれ０、５０、７５、１００、２００μＭ添加し（以後培地交換なし）、７２、９６時間培養した。まず、培養後のサンプルから全ｍＲＮＡを抽出し、未分化マーカーであるＬｉｎ２８発現量を定量的ＰＣＲで測定し、未分化細胞を定量した。また、同じサンプルから心筋細胞マーカーである心臓トロポニンＴ（cTnT）発現細胞を免疫染色し、FACSによって心筋細胞を定量した。レスベラトロールの処理濃度と処理時間に対して、回収細胞に含まれる未分化細胞、心筋細胞の割合（含有率）及び回収心筋細胞数を表１に示す。
A method for inducing differentiation into the myocardium is described in Matsuura K, et al. Creation of human cardiac cell sheets using pluripotent stem cells. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 425 (2), opp. 321-7.
iPS-CM was seeded in 6 cm 2 dishes (cell density: 4 × 10 6 ), and at the same time as seeding, resveratrol was added to each dish at 0, 50, 75, 100, and 200 μM (no medium change thereafter). Cultured for 72, 96 hours. First, total mRNA was extracted from the cultured sample, the expression level of Lin28 as an undifferentiated marker was measured by quantitative PCR, and undifferentiated cells were quantified. In addition, cardiac troponin T (cTnT) -expressing cells, which are cardiomyocyte markers, were immunostained from the same sample, and cardiomyocytes were quantified by FACS. Table 1 shows the ratio (content ratio) of undifferentiated cells and cardiomyocytes contained in the collected cells and the number of collected cardiomyocytes with respect to the treatment concentration and treatment time of resveratrol.
Ｌｉｎ２８発現量を指標とした未分化細胞の解析から、レスベラトロール添加群でＬｉｎ２８の発現量は濃度依存的に減少した。純粋なヒトｉＰＳ細胞のＬｉｎ２８発現量を１００％とした場合、コントロール群では培養７２および９６時間でＬｉｎ２８発現量はそれぞれ０．０３６％、０．０２８％であったのに対し、レスベラトロール２００μＭ添加群では７２、９０時間後に０．０１４％、０．０１１％に減少し、いずれもコントロール群の値の３９％ほどに減少した（表１、図４）。 From the analysis of undifferentiated cells using the expression level of Lin28 as an index, the expression level of Lin28 decreased in a concentration-dependent manner in the resveratrol addition group. When the expression level of Lin28 of pure human iPS cells was 100%, the expression level of Lin28 was 0.036% and 0.028% at 72 and 96 hours in the control group, respectively, whereas resveratrol was 200 μM. In the added group, it decreased to 0.014% and 0.011% after 72 and 90 hours, and both decreased to about 39% of the value of the control group (Table 1, FIG. 4).
また、cTnT発現量を指標とする心筋細胞の解析から、レスベラトロール添加群でcTnT発現量は濃度依存的に増加した。コントロール群では培養７２および９６時間でcTnT発現細胞含有率はそれぞれ３４．７％、３５．７％であったのに対し、レスベラトロール２００μＭ添加群では７２、９０時間後の含有率はそれぞれ７７．４％（２．２倍）、７１％（２倍）に増加した（表１、図５）。 From the analysis of cardiomyocytes using cTnT expression level as an index, cTnT expression level increased in a concentration-dependent manner in the resveratrol addition group. In the control group, the contents of cTnT-expressing cells were 34.7% and 35.7% in the culture 72 and 96 hours, respectively, whereas in the resveratrol 200 μM addition group, the contents after 72 and 90 hours were 77 respectively. Increased to 4% (2.2 times) and 71% (2 times) (Table 1, FIG. 5).
ｉＰＳ−ＣＭをレスベラトロール存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、レスベラトロール添加量に依存して僅かに減少するものの、培養７２、９６時間のレスベラトロール２００μＭ処理においても、それぞれコントロールの６５％、９１％の細胞数が維持された（図６）。
ｉＰＳ−ＣＭをレスベラトロール存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、レスベラトロール添加量に依存して減少するものの、回収された心筋細胞数は、培養７２、９６時間のレスベラトロール２００μＭ処理においても、それぞれコントロールの１４５％、１８２％の心筋細胞数が維持された（図７）。
When iPS-CM is cultured in the presence or absence of resveratrol, the total number of recovered cells slightly decreases depending on the amount of resveratrol added, but resveratrol is cultured for 72 or 96 hours. Even with 200 μM treatment, the cell numbers of 65% and 91% of the control were maintained, respectively (FIG. 6).
When iPS-CM is cultured in the presence or absence of resveratrol, the total number of recovered cells decreases depending on the amount of resveratrol added, but the number of recovered cardiomyocytes is 72, Even when resveratrol was treated with 200 μM for 96 hours, the numbers of cardiomyocytes of 145% and 182% of the control were maintained (FIG. 7).
以上の結果から、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導したｉＰＳ−ＣＭをレスベラトロール（２００μＭ）で９８時間処理することによって、Ｌｉｎ２８陽性の未分化細胞含有率を０．０１１％までを除去できることが判明した。また、この処理により心筋細胞含有率はコントロールの３６％から７１％まで向上し、ｉＰＳ−ＣＭの精製法として優れていることが明らかになった。 From the above results, it was found that by treating iPS-CM induced to differentiate from human iPS cells with resveratrol (200 μM) for 98 hours, the content of Lin28-positive undifferentiated cells can be removed up to 0.011%. . In addition, the cardiomyocyte content was improved from 36% to 71% of the control by this treatment, and it was revealed that this is an excellent method for purifying iPS-CM.
実施例３．ｉＰＳ−ＣＭに対するエピガロカテキンガラートによる未分化細胞除去
実施例１と同様に、ヒトｉＰＳ細胞および皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対するエピガロカテキンガラートの作用を検討した。
エピガロカテキンガラートはヒトｉＰＳ細胞に対して高濃度（１００μＭ）において細胞障害性を示し、皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対しては強い細胞障害性を示さなかった（図８、図９）。
Example 3 FIG. Removal of undifferentiated cells by epigallocatechin gallate for iPS-CM In the same manner as in Example 1, the effect of epigallocatechin gallate on human iPS cells and skin fibroblasts (NHDF) was examined.
Epigallocatechin gallate was cytotoxic to human iPS cells at a high concentration (100 μM) and did not show strong cytotoxicity to dermal fibroblasts (NHDF) (FIGS. 8 and 9). .
実施例２と同様にヒトｉＰＳ細胞から分化誘導したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞集団（ｉＰＳ−ＣＭ）を対象としてエピガロカテキンガラートの作用を検討した。ｉＰＳ−ＣＭを１０cm2ディッシュへ播種し（細胞密度：１２×106）エピガロカテキンガラート（５０μＭ及び１００μＭ）で９６時間処理した場合、未分化細胞の含有率は０．２７８％からそれぞれ０.０７４％および０．０１％まで低下した（表２、図１０）。また、この処理によって心筋細胞の含有率は５８．２％からそれぞれ６７．９％及び８８．２％まで向上した（表２、図１１）。 As in Example 2, the action of epigallocatechin gallate was examined on a human iPS cell-derived cardiomyocyte population (iPS-CM) derived from human iPS cells. When iPS-CM was seeded in 10 cm 2 dishes (cell density: 12 × 10 6 ) and treated with epigallocatechin gallate (50 μM and 100 μM) for 96 hours, the content of undifferentiated cells decreased from 0.278% to 0 respectively. It decreased to 0.074% and 0.01% (Table 2, FIG. 10). This treatment also increased the content of cardiomyocytes from 58.2% to 67.9% and 88.2%, respectively (Table 2, FIG. 11).
ｉＰＳ−ＣＭをエピガロカテキンガラート存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、エピガロカテキンガラート添加によって減少するものの、培養９６時間のエピガロカテキンガラート５０μＭおよび１００μＭ処理においてもコントロールのそれぞれ９２％及び５３％の細胞数が維持された（図１２）。 When iPS-CM is cultured in the presence or absence of epigallocatechin gallate, the total number of cells recovered decreases with the addition of epigallocatechin gallate, but epigallocatechin gallate at 50 μM for 96 hours in culture and Even with 100 μM treatment, the cell numbers of 92% and 53% of the control were maintained (FIG. 12).
ｉＰＳ−ＣＭをエピガロカテキンガラート存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、エピガロカテキンガラート添加量に依存して減少するものの、回収された心筋細胞数は、培養９６時間のエピガロカテキンガラート５０μＭ及び１００μＭ処理においても、それぞれコントロールの１０７％、８０．６％の心筋細胞数が維持された（図１３）。
エピガロカテキンガラートはｉＰＳ細胞に対する細胞障害性によってｉＰＳ−ＣＭに含まれる未分化細胞の含有率を低下させ、同時に心筋細胞の含有率を増加させる作用が認められ、ｉＰＳ−ＣＭをエピガロカテキンガラートで処理する方法は心筋細胞の精製法として優れていることが明らかになった。
When iPS-CM is cultured in the presence or absence of epigallocatechin gallate, the total number of recovered cells decreases depending on the amount of epigallocatechin gallate added, but the number of recovered cardiomyocytes is In addition, even when treated with epigallocatechin gallate 50 μM and 100 μM for 96 hours in culture, the number of cardiomyocytes of 107% and 80.6% of the control was maintained (FIG. 13).
Epigallocatechin gallate has the effect of decreasing the content of undifferentiated cells contained in iPS-CM and at the same time increasing the content of cardiomyocytes due to cytotoxicity against iPS cells. It was revealed that the method of treating with gallate is excellent as a purification method for cardiomyocytes.
実施例４．ｉＰＳ−ＣＭに対するエピガロカテキンによる未分化細胞除去
実施例２と同様にヒトｉＰＳ細胞から分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞集団（ｉＰＳ−ＣＭ）を対象としてエピガロカテキンの作用を検討した。その結果、ｉＰＳ−ＣＭをエピガロカテキン（１００μＭ）で９６時間処理した場合、未分化細胞の含有率は０．３４％から０．０１％まで低下した（表３、図１４）。また、この処理によって心筋細胞の含有率は３９．３％から８２．１％まで向上した（表３、図１５）。
Example 4 Removal of Undifferentiated Cells with Epigallocatechin for iPS-CM The effect of epigallocatechin was examined on human iPS cell-derived cardiomyocyte population (iPS-CM) induced to differentiate from human iPS cells in the same manner as in Example 2. As a result, when iPS-CM was treated with epigallocatechin (100 μM) for 96 hours, the content of undifferentiated cells decreased from 0.34% to 0.01% (Table 3, FIG. 14). This treatment also increased the content of cardiomyocytes from 39.3% to 82.1% (Table 3, FIG. 15).
ｉＰＳ−ＣＭをエピガロカテキン存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、エピガロカテキン添加によって減少するものの、培養９６時間のエピガロカテキン１００μＭ処理においてもコントロールの５５％の細胞数が維持された（図１６）。 When iPS-CM is cultured in the presence or absence of epigallocatechin, the total number of cells recovered is reduced by the addition of epigallocatechin, but even when treated with epigallocatechin 100 μM for 96 hours, 55% of the control. Cell number was maintained (FIG. 16).
ｉＰＳ−ＣＭをエピガロカテキン存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、エピガロカテキン添加によって減少するものの、回収された心筋細胞数は、培養９６時間のエピガロカテキン１００μＭ処理においても、コントロールの１１６％の心筋細胞数が維持された（図１７）。 When iPS-CM is cultured in the presence or absence of epigallocatechin, the total number of cells recovered decreases with the addition of epigallocatechin, but the number of recovered cardiomyocytes is the epigallocatechin for 96 hours in culture. Even with 100 μM treatment, 116% of the number of cardiomyocytes of the control was maintained (FIG. 17).
エピガロカテキンはｉＰＳ細胞に対する細胞障害性によってｉＰＳ−ＣＭに含まれる未分化細胞の含有率を低下させ、同時に心筋細胞の含有率を増加させる作用が認められ、ｉＰＳ−ＣＭをエピガロカテキンで処理する方法は心筋細胞の精製法として優れていることが明らかになった。 Epigallocatechin has been shown to reduce the content of undifferentiated cells in iPS-CM due to cytotoxicity against iPS cells, and at the same time increase the content of cardiomyocytes, and treat iPS-CM with epigallocatechin. It was revealed that this method is superior as a method for purifying cardiomyocytes.
実施例５．ｉＰＳ−ＣＭに対するクェルセチンによる未分化細胞除去
実施例１と同様に、ヒトｉＰＳ細胞および皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対するクェルセチンの作用を検討した。
クェルセチンはヒトｉＰＳ細胞に対して高濃度（１００μＭ）において細胞障害性を示し、皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対しては強い細胞障害性を示さなかった（図１８、図１９）。
Example 5 FIG. Removal of undifferentiated cells by quercetin for iPS-CM In the same manner as in Example 1, the effect of quercetin on human iPS cells and skin fibroblasts (NHDF) was examined.
Quercetin was cytotoxic to human iPS cells at a high concentration (100 μM) and not strongly cytotoxic to dermal fibroblasts (NHDF) (FIGS. 18 and 19).
実施例２と同様にヒトｉＰＳ細胞から分化誘導したヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞集団（ｉＰＳ−ＣＭ）を対象としてクェルセチンの作用を検討した。その結果、ｉＰＳ−ＣＭをクェルセチン１００μＭで９６時間処理した場合、未分化細胞の含有率は０．３２％からそれぞれ０.１％まで低下した（表４、図２０）。また、この処理によって心筋細胞の含有率は３９．５％からそれぞれ５５．５％まで向上した（表４、図２１）。 In the same manner as in Example 2, the action of quercetin was examined on a human iPS cell-derived cardiomyocyte population (iPS-CM) derived from human iPS cells. As a result, when iPS-CM was treated with quercetin 100 μM for 96 hours, the content of undifferentiated cells decreased from 0.32% to 0.1% (Table 4, FIG. 20). This treatment also increased the content of cardiomyocytes from 39.5% to 55.5% (Table 4, FIG. 21).
ｉＰＳ−ＣＭをクェルセチン存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、クェルセチン添加によって減少するものの、培養９６時間のクェルセチン１００μＭ処理においてもコントロールのそれぞれ６４％の細胞数が維持された（図２２）。 When iPS-CM is cultured in the presence or absence of quercetin, the total number of cells recovered decreases with the addition of quercetin, but 64% of the control cells are maintained even when treated with quercetin at 100 μM for 96 hours in culture. (FIG. 22).
ｉＰＳ−ＣＭをクェルセチン存在下あるいは非存在下で培養した場合、回収された全細胞数は、クェルセチン添加量に依存して減少するものの、回収された心筋細胞数は、培養９６時間のクェルセチン１００μＭ処理においても、それぞれコントロールの９０％の心筋細胞数が維持された（図２３）。 When iPS-CM is cultured in the presence or absence of quercetin, the total number of recovered cells decreases depending on the amount of quercetin added, but the number of recovered cardiomyocytes is treated with quercetin 100 μM for 96 hours in culture. Also, the number of cardiomyocytes of 90% of each control was maintained (FIG. 23).
クェルセチンはｉＰＳ細胞に対する細胞障害性によってｉＰＳ−ＣＭに含まれる未分化細胞の含有率を低下させ、同時に心筋細胞の含有率を増加させる作用が認められ、ｉＰＳ−ＣＭをクェルセチンで処理する方法は心筋細胞の精製法として優れていることが明らかになった。 Quercetin has the effect of reducing the content of undifferentiated cells contained in iPS-CM due to cytotoxicity against iPS cells and at the same time increasing the content of cardiomyocytes. The method of treating iPS-CM with quercetin is a myocardium. It became clear that it was excellent as a cell purification method.
Claims (9)
ポリフェノール化合物の存在下で、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られうる分化細胞を含有する細胞集団を培養することにより、未分化多能性幹細胞の含有割合を低減する工程
を含む、製造方法。 A method for producing a cell population containing differentiated cells obtainable by inducing differentiation of pluripotent stem cells,
Manufacturing comprising the step of reducing the content ratio of undifferentiated pluripotent stem cells by culturing a cell population containing differentiated cells that can be obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells in the presence of a polyphenol compound Method.
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