JP2018061520A - Methods for modifying n-type sugar chain structure of proteins produced by microorganisms of genus aspergillus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アスペルギルス属微生物が生産する高マンノース型糖鎖の構造を、遺伝子工学的手法により改変する方法に関し、特に、麹菌による生産されるタンパク質のＮ型糖鎖構造を改変させる方法に関する。 The present invention relates to a method for modifying the structure of a high-mannose sugar chain produced by an Aspergillus microorganism by genetic engineering techniques, and particularly to a method for modifying the N-type sugar chain structure of a protein produced by Aspergillus.
真核生物、例えば糸状菌、中でも例えばアスペルギルス属微生物（麹菌）は、糖質分解酵素であるアミラーゼやグルコアミラーゼ、タンパク質分解酵素などを大量に分泌生産するため、清酒や味噌などの発酵醸造産業に広く利用されているだけでなく、そのタンパク質分泌能力の高さから、異種タンパク質の発現宿主としても期待されている。
タンパク質を、異種タンパク質の発現宿主で発現させると、その生物活性が変化することがある。この理由は、真核生物において生体内で重要な機能を持つタンパク質の多くは糖鎖を持った糖タンパク質であり、当該タンパク質を異種タンパク質の発現宿主で発現すると、タンパク質に糖鎖が全く結合されなかったり、タンパク質に結合する糖鎖の構造が変化したりするので、本来の生物活性を示さなくなるから、と考えられている。
Eukaryotes such as filamentous fungi, especially Aspergillus microorganisms (gonococci), for example, produce amylases, glucoamylases, and proteolytic enzymes such as saccharide-degrading enzymes in large quantities. In addition to being widely used, it is also expected as an expression host for heterologous proteins because of its high protein secretion ability.
When a protein is expressed in a heterologous protein expression host, its biological activity may be altered. This is because most proteins that have important functions in vivo in eukaryotes are glycoproteins with sugar chains, and when these proteins are expressed in a heterologous protein expression host, the sugar chains are completely bound to the protein. It is thought that it does not show the original biological activity because there is no change or the structure of the sugar chain that binds to the protein.
タンパク質に結合する糖鎖にはタンパク質のアスパラギン残基に結合するＮ型とセリンまたはスレオニンに結合するＯ型の２種類がある。このうち、Ｎ型糖鎖の生合成経路については多くの知見があり、詳しく解析されている。
糖鎖の生合成は、まず小胞体（ＥＲ）で始まり、その後ゴルジ体でさらに糖鎖の修飾が起こる。このうちＥＲで生成する糖鎖は真菌も哺乳類細胞も基本的には同じであることが判明している。その糖鎖は８分子のマンノース（Ｍａｎ）と２分子のＮアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からなるコア構造（Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２）を構成している。このコア構造糖鎖を持つタンパク質はゴルジ体に輸送されて、種々の修飾を受ける。
酵母において、ＥＲでの糖鎖の生成過程は、ａｌｇファミリー遺伝子に基づいて合成される酵素によって制御される。まず、ａｌｇ７，ａｌｇ１３，ａｌｇ１４の働きによってタンパク質にＧｌｃＮＡｃが付加され、次いで、ａｌｇ１，ａｌｇ２，ａｌｇ１１，ａｌｇ３，ａｌｇ９の働きによってマンノースが付加されてコア構造を生成する。次に、ゴルジ体に運ばれた糖タンパク質はｏｃｈ１の働きによって前記コア構造にマンノースが付加された後、Ｍｎｎ１，Ｍｎｎ４，Ｍｎｎ６の働きによってさらに多量のマンノースが付加されて、ハイパーマンノース型の糖鎖となる。
There are two types of sugar chains that bind to proteins: N-type that binds to asparagine residues of proteins and O-type that binds to serine or threonine. Among these, there is a lot of knowledge about the biosynthetic pathway of N-type sugar chains, and it has been analyzed in detail.
The biosynthesis of sugar chains begins with the endoplasmic reticulum (ER), and then further glycosylation occurs in the Golgi apparatus. Of these, the sugar chains produced by ER have been found to be basically the same for fungi and mammalian cells. The sugar chain constitutes a core structure (Man 8 GlcNAc 2 ) composed of 8 molecules of mannose (Man) and 2 molecules of N acetylglucosamine (GlcNAc). A protein having this core structure sugar chain is transported to the Golgi apparatus and undergoes various modifications.
In yeast, the sugar chain production process in the ER is controlled by an enzyme synthesized based on the alg family gene. First, GlcNAc is added to the protein by the action of alg7, alg13, and alg14, and then mannose is added by the action of alg1, alg2, alg11, alg3, and alg9 to generate a core structure. Next, the glycoprotein transported to the Golgi body has mannose added to the core structure by the action of och1, and then a larger amount of mannose is added by the action of Mnn1, Mnn4, and Mnn6, resulting in a hypermannose type sugar chain. It becomes.
酵母や糸状菌において、遺伝子工学的手法を用いることによって、上述する遺伝子の破壊により、分泌されるタンパク質に結合する糖鎖の構造を改変することが試みられている。例えば、非特許文献１には、糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｒａｎｓにおいてａｌｇ３（ａｌｇＣ）遺伝子を破壊することによって、Ｎ型糖鎖に含まれるヘキソース量が低減することが示されており、ａｌｇ３遺伝子がα１，３マンノシルトランスフェラーゼをコードすることが調べられている。さらに、非特許文献２においては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓにおいて、ｏｃｈ１遺伝子を破壊することによって、糖鎖組成が変化することが調べられている。
他方、糸状菌においては、ａｌｇ１，ａｌｇ２を人為的に破壊したという報告は無い。非特許文献３によると、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ａｌｇ２のＧ３７７Ｒ変異体は温度感受性になり、且つ糖鎖鎖長も大幅に低減することが調べられているが、完全なａｌｇ２破壊株は取得することが出来ないことが言及されている。糸状菌においては、非特許文献４においてＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓにおいて、ａｌｇ２の変異体を取得したことが報告されており、５ｂｐの挿入変異によってａｌｇ２の機能が低下した変異体においてＮ型糖鎖の殆どが、Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２若しくは、Ｍａｎ２ＧｌｃＮＡｃ２の構造を有することが調べられているが、人為的に遺伝子を破壊して取得した変異体ではない。
また、ａｌｇ１については、非特許文献５において酵母では破壊することによって致死となることが記されており、糸状菌においてもその遺伝子破壊に関する報告は無く、糸状菌において糖鎖組成を改変することは限度があった。
In yeast and filamentous fungi, attempts have been made to modify the structure of sugar chains that bind to secreted proteins by disrupting the genes described above by using genetic engineering techniques. For example, Non-Patent Document 1 shows that by destroying the arg3 (algC) gene in the filamentous fungi Aspergillus niger and Aspergillus nidurans, the amount of hexose contained in the N-type sugar chain is reduced. It has been investigated to encode α1,3 mannosyltransferase. Furthermore, in Non-Patent Document 2, it has been investigated that the sugar chain composition is changed by destroying the och1 gene in Aspergillus fumigatus.
On the other hand, in filamentous fungi, there is no report that alg1 and alg2 were artificially destroyed. According to Non-Patent Document 3, it has been investigated that in the yeast Saccharomyces cerevisiae, the G377R mutant of alg2 becomes temperature sensitive and the sugar chain length is greatly reduced, but a complete alg2 disruption strain should be obtained. It is mentioned that cannot be done. In filamentous fungi, it has been reported in Non-Patent Document 4 that a mutant of arg2 has been obtained in Rhizomucor pusillus, and most of the N-type sugar chain in the mutant in which the function of arg2 is reduced by a 5 bp insertion mutation, Although it has been investigated to have the structure of Man1GlcNAc2 or Man2GlcNAc2, it is not a mutant obtained by artificially destroying a gene.
In addition, with respect to alg1, it is described in Non-patent Document 5 that it is lethal in yeast, and there is no report on gene disruption in filamentous fungi, and it is not possible to modify the sugar chain composition in filamentous fungi. There was a limit.
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、麹菌においてタンパク質のＮ型糖鎖構造を改変する新たな方法を提供することにある。 The present invention was created in view of the current state of the prior art, and an object thereof is to provide a new method for modifying the N-type sugar chain structure of a protein in Aspergillus.
本発明者らは、かかる目的を達成するために鋭意検討した結果、糸状菌の一種である麹菌アスペルギルス・オリゼに分類される微生物を宿主として使用し、この微生物の糖鎖合成関連遺伝子を破壊することにより、分泌タンパク質のＮ型糖鎖が減少し、さらにその糖鎖構造、糖鎖組成が大きく変化することを見出した。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors use a microorganism classified as a Aspergillus oryzae, which is a type of filamentous fungus, as a host, and destroy the sugar chain synthesis-related gene of this microorganism. As a result, it was found that the N-type sugar chain of the secreted protein is decreased, and the sugar chain structure and sugar chain composition are greatly changed.
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、以下の（１）〜（２）から構成されるものである。
項１．
アスペルギルス属微生物に異種タンパク質を発現させる場合において、宿主であるアスペルギルス属微生物のゲノムＤＮＡのうちａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに改変を加えることにより、前記ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分がコードする糖鎖合成酵素の機能を低減若しくは完全に停止させた宿主微生物を培養する工程を含む前記異種タンパク質の製造方法。
項２．
改変前のａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡが、次の（１）〜（４）のいずれかである、項１に記載の方法。
（１）配列番号１から４のいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（２）配列番号１から４のいずれかのアミノ酸配列と６８％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡであり、かつ、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号５から８のいずれかのＤＮＡ
（４）配列番号５から８のいずれかのＤＮＡ配列と６８％以上の同一性を有するＤＮＡであり、かつ、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
項３．
改変が次の（ａ）から（ｃ）のいずれかである、項１または２に記載の方法。
（ａ）ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡの全部または一部を除去する。
（ｂ）ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに、１または数個の置換、欠失もしくは付加する。
（ｃ）ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡを、改変前のＤＮＡ配列との同一性が８０％未満であるＤＮＡ配列と置き換える。
The present invention has been completed based on these findings, and comprises the following (1) to (2).
Item 1.
In the case of expressing a heterologous protein in an Aspergillus microorganism, by modifying the DNA encoding the portion corresponding to arg1, arg2, arg3, or och1 in the genomic DNA of the host Aspergillus microorganism, A method for producing a heterologous protein comprising the step of culturing a host microorganism in which the function of a sugar chain synthase encoded by a portion corresponding to arg3 or och1 is reduced or completely stopped.
Item 2.
Item 2. The method according to Item 1, wherein the DNA encoding a portion corresponding to alg1, alg2, alg3, or och1 before modification is one of the following (1) to (4).
(1) DNA encoding any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 4
(2) DNA encoding an amino acid sequence having 68% or more identity with any of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 4, and a DNA encoding a protein having the functions of alg1, alg2, alg3, or och1
(3) DNA of any one of SEQ ID NOs: 5 to 8
(4) DNA having 68% or more identity with any of the DNA sequences of SEQ ID NOS: 5 to 8, and encoding a protein having the functions of alg1, alg2, alg3 or och1
Item 3.
Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the modification is any of the following (a) to (c).
(A) All or part of the DNA encoding the portion corresponding to alg1, alg2, alg3 or och1 is removed.
(B) One or several substitutions, deletions or additions are made to DNA encoding a portion corresponding to alg1, alg2, alg3 or och1.
(C) The DNA encoding the portion corresponding to alg1, alg2, alg3 or och1 is replaced with a DNA sequence having less than 80% identity with the DNA sequence before modification.
本発明の方法によれば、アスペルギルス属が生産するタンパク質の糖鎖構造を改変することが可能となる。さらに、その糖鎖構造は野生型に比べて鎖長が短く且つ均一性が高いので、精製や品質管理が容易であるという点で優れている。 According to the method of the present invention, it is possible to modify the sugar chain structure of a protein produced by Aspergillus. Furthermore, since the sugar chain structure has a shorter chain length and higher uniformity than the wild type, it is excellent in that purification and quality control are easy.
本発明は、アスペルギルス属の微生物由来の糖鎖合成関連遺伝子の機能を欠損させることにより、本来宿主微生物が生産する糖鎖の構造を変化させることを特徴とするものである。 The present invention is characterized in that the structure of a sugar chain originally produced by a host microorganism is changed by deleting the function of a sugar chain synthesis-related gene derived from a microorganism belonging to the genus Aspergillus.
具体的には、本発明の方法では、麹菌アスペルギルス・オリゼのａｌｇ１遺伝子、ａｌｇ２遺伝子、ａｌｇ３遺伝子、ｏｃｈ１遺伝子を破壊してその機能を欠失させることにより、分泌生産されるタンパク質の糖鎖構造をより短く、均一な構造に変化させることが可能となる。 Specifically, in the method of the present invention, the glycan structure of a secreted protein is produced by destroying the alg1, arg2, arg3, and och1 genes of Aspergillus oryzae and deleting their functions. It becomes possible to change to a shorter and uniform structure.
さらに本発明によって得られた遺伝子破壊宿主を遺伝子発現の宿主として用いて且つ、所望のタンパク質を高発現させることにより、糖鎖構造が改変された遺伝子組み換えタンパク質を大量に発現させることが可能となる。 Furthermore, by using the gene disruption host obtained by the present invention as a gene expression host and expressing a desired protein at a high level, it becomes possible to express a large amount of a recombinant protein having a modified sugar chain structure. .
本発明の実施形態の一つは、アスペルギルス属微生物に異種タンパク質を発現させる場合において、宿主であるアスペルギルス属微生物のゲノムＤＮＡのうちａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに改変を加えることにより、前記ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分がコードする糖鎖合成酵素の機能を低減若しくは完全に停止させた宿主微生物を培養する工程を含む前記異種タンパク質の製造方法である。 In one embodiment of the present invention, when a heterologous protein is expressed in an Aspergillus microorganism, it is modified to a DNA encoding a portion corresponding to arg1, arg2, alg3, or och1 in the genomic DNA of the Aspergillus microorganism as a host. A method of producing a heterologous protein comprising the step of culturing a host microorganism in which the function of a sugar chain synthase encoded by the portion corresponding to alg1, alg2, alg3 or och1 is reduced or completely stopped by adding .
本発明の方法で用いる、異種タンパク質を発現させる宿主であるアスペルギルス属微生物としては、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ），アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）などが挙げられるが、特に限定されない。好ましくはアスペルギルス・オリゼである。 Aspergillus microorganisms that are hosts for expressing heterologous proteins used in the method of the present invention include Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus terreus, and Aspergillus terreus. fumigatus), Aspergillus nidulans and the like, but are not particularly limited. Aspergillus oryzae is preferred.
アスペルギルス属微生物のゲノムＤＮＡのうちａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分は、いずれも、糖鎖合成を司るａｌｇファミリーに属する酵素タンパク質をコードするＤＮＡである。ａｌｇ１はβ１，４マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードし、ａｌｇ２はα１，６、もしくはα１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードし、ａｌｇ３はα１，３マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードし、ｏｃｈ１はα１，６マンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードすると予測される。 Of the genomic DNA of microorganisms belonging to the genus Aspergillus, all of the portions corresponding to alg1, alg2, alg3 or och1 are DNAs encoding an enzyme protein belonging to the alg family responsible for sugar chain synthesis. alg1 encodes a protein having β1,4 mannosyltransferase activity, alg2 encodes a protein having α1,6 or α1,3 mannosyltransferase activity, alg3 encodes a protein having α1,3 mannosyltransferase activity, och1 is predicted to encode a protein having α1,6 mannosyltransferase activity.
改変を加える前の、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡの塩基配列は特に限定されないが、次の（１）〜（４）のいずれかであることが好ましい。
（１）配列番号１から４のいずれかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（２）配列番号１から４のいずれかのアミノ酸配列と６８％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡであり、かつ、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号５から８のいずれかのＤＮＡ
（４）配列番号５から８のいずれかのＤＮＡ配列と６８％以上の同一性を有するＤＮＡであり、かつ、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
上記（１）〜（４）において、配列番号１は、アスペルギルス・オリゼにおけるａｌｇ１タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２はａｌｇ２タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号３はａｌｇ３タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号４はｏｃｈ１タンパク質のアミノ酸配列である。
上記（１）〜（４）において、配列番号５は、アスペルギルス・オリゼにおけるａｌｇ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。配列番号６はａｌｇ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。配列番号７はａｌｇ３タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。配列番号８はｏｃｈ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列である。
上記（２）において、アミノ酸配列の同一性は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上である。
上記（４）において、塩基配列の同一性は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上である。
The base sequence of the DNA encoding the portion corresponding to alg1, alg2, alg3 or och1 before modification is not particularly limited, but is preferably any of the following (1) to (4).
(1) DNA encoding any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 4
(2) DNA encoding an amino acid sequence having 68% or more identity with any of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 4, and a DNA encoding a protein having the functions of alg1, alg2, alg3, or och1
(3) DNA of any one of SEQ ID NOs: 5 to 8
(4) DNA having 68% or more identity with any of the DNA sequences of SEQ ID NOS: 5 to 8, and encoding a protein having the functions of alg1, alg2, alg3 or och1
In the above (1) to (4), SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the alg1 protein in Aspergillus oryzae. SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of the alg2 protein. SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of the alg3 protein. SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of the och1 protein.
In the above (1) to (4), SEQ ID NO: 5 is a DNA sequence encoding the alg1 protein in Aspergillus oryzae. SEQ ID NO: 6 is a DNA sequence encoding the alg2 protein. SEQ ID NO: 7 is a DNA sequence encoding arg3 protein. SEQ ID NO: 8 is a DNA sequence encoding och1 protein.
In the above (2), the identity of the amino acid sequence is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more.
In the above (4), the identity of the base sequence is preferably 80% or higher, more preferably 90% or higher, more preferably 95% or higher, more preferably 98% or higher, and more preferably 99% or higher.
本明細書において、アミノ酸配列や塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列や塩基配列の同一性を算出する。
In this specification, various methods are known as methods for calculating the identity of amino acid sequences and base sequences. For example, it can be calculated using an analysis tool that is commercially available or available through a telecommunication line (Internet).
In the present specification, the homology algorithm BLAST (Basic local alignment search tool) http: //www.National Institute of Biotechnology Information (NCBI). ncbi. nlm. nih. By using default (initial setting) parameters in gov / BLAST /, the identity of amino acid sequences and base sequences is calculated.
本発明の方法において、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに加える改変の形態は、前記ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分がコードする糖鎖合成酵素の機能を低減若しくは完全に停止させるような形態であれば特に限定されない。
例えば、次の（ａ）から（ｃ）のいずれかの改変が例示できる。
（ａ）ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡの全部または一部を除去する。
（ｂ）ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに、１または数個の置換、欠失もしくは付加する。
（ｃ）ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡを、改変前のＤＮＡ配列との同一性が８０％未満であるＤＮＡ配列と置き換える。
In the method of the present invention, the form of modification added to the DNA encoding the portion corresponding to arg1, arg2, alg3, or och1 is the function of the sugar chain synthase encoded by the portion corresponding to arg1, arg2, arg3, or och1. It will not specifically limit if it is a form which reduces or stops completely.
For example, the following modifications (a) to (c) can be exemplified.
(A) All or part of the DNA encoding the portion corresponding to alg1, alg2, alg3 or och1 is removed.
(B) One or several substitutions, deletions or additions are made to DNA encoding a portion corresponding to alg1, alg2, alg3 or och1.
(C) The DNA encoding the portion corresponding to alg1, alg2, alg3 or och1 is replaced with a DNA sequence having less than 80% identity with the DNA sequence before modification.
本発明の方法では、アスペルギルス属微生物のゲノムＤＮＡのうち、上記で示したように、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに改変を加え、前記ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分がコードする糖鎖合成酵素の機能を低減若しくは完全に停止させる。そして、前記アスペルギルス属微生物を宿主微生物として用い、培養することにより異種タンパク質を製造することができる。アスペルギルス属微生物を用いた異種タンパク質の製造法は、既にその技術が確立されており、種々の公知の方法を用いることが可能である。その態様は特に制限されない。 In the method of the present invention, as described above, the DNA encoding the portion corresponding to arg1, arg2, arg3, or och1 is modified in the genomic DNA of the microorganism belonging to the genus Aspergillus, and the arg1, arg2, arg3, or och1 is modified. The function of the sugar chain synthase encoded by the portion corresponding to is reduced or completely stopped. A heterologous protein can be produced by culturing the Aspergillus microorganism as a host microorganism. A technique for producing a heterologous protein using Aspergillus microorganisms has already been established, and various known methods can be used. The embodiment is not particularly limited.
本発明の別の実施形態の一つは、アスペルギルス属微生物に異種タンパク質を発現させる場合において、宿主であるアスペルギルス属微生物のゲノムＤＮＡのうちａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分をコードするＤＮＡに改変を加えることにより、前記ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３またはｏｃｈ１に相当する部分がコードする糖鎖合成酵素の機能を低減若しくは完全に停止させることによって、宿主微生物が生産する前記異種タンパク質の糖鎖構造を変化させる方法である。 In another embodiment of the present invention, when a heterologous protein is expressed in an Aspergillus microorganism, DNA encoding a portion corresponding to arg1, arg2, alg3, or och1 in the genomic DNA of the Aspergillus microorganism as a host By modifying the sugar chain structure of the heterologous protein produced by the host microorganism by reducing or completely stopping the function of the sugar chain synthase encoded by the portion corresponding to the alg1, alg2, alg3 or och1 It is a method to change.
異種タンパク質の糖鎖構造の変化は、ＭＳ分析によって明らかにすることができる。本発明において、異種タンパク質の糖鎖がどのように変化するかは限定されないが、例えば、好ましい変化としては、ピークの数を減少させることである。 Changes in the sugar chain structure of heterologous proteins can be revealed by MS analysis. In the present invention, how the sugar chain of the heterologous protein changes is not limited. For example, a preferable change is to reduce the number of peaks.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
１．アスペルギルス・オリゼ由来糖鎖合成関連遺伝子の選抜
アスペルギルス・オリゼ由来糖鎖合成関連遺伝子の選抜は、糖鎖合成関連遺伝子がよく研究されている、酵母サッカロマイセス・セレビシエの遺伝子情報から相同性が高い配列を選抜することにより行った。選抜した遺伝子がコードすると推定されるアミノ酸をそれぞれ、配列番号１、２、３、４に示す。選抜した遺伝子がコードすると推定されるアミノ酸配列情報を元に、同アスペルギルス属においてホモロジー検索を行った結果を図１に示す。図１によると、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・ニドランスにおいて、６８％から７８％の相同性を示すアミノ酸配列をコードする遺伝子が存在しており、これら遺伝子群はアスペルギルス属において高度に保存されていると考えられる。
1. Selection of Aspergillus oryzae-derived glycan synthesis-related genes Selection of Aspergillus oryzae-derived glycan synthesis-related genes is based on gene sequences of yeast Saccharomyces cerevisiae, which are well-studied for glycan synthesis-related genes. It was done by selecting. The amino acids presumed to be encoded by the selected genes are shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4, respectively. FIG. 1 shows the result of homology search in the genus Aspergillus based on the amino acid sequence information presumed to be encoded by the selected gene. According to FIG. 1, in Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus and Aspergillus nidulans, there are genes encoding amino acid sequences having 68% to 78% homology, and these gene groups are highly conserved in the genus Aspergillus. It is thought that.
２．アスペルギルス・オリゼ由来糖鎖合成関連遺伝子破壊カセットの作製
１．で示された、アスペルギルス・オリゼ由来糖鎖合成関連遺伝子であるａｌｇ１， ａｌｇ２，ａｌｇ３，ｏｃｈ１遺伝子の破壊カセットを以下のようにして構築した。
まず、各糖鎖合成関連遺伝子の開始コドンから上流約２ｋｂｐの位置と、各糖鎖合成関連遺伝子の終始コドンから下流約２ｋｂｐの位置にプライマーを設計し、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲによって増幅されたＰＣＲ産物を東洋紡社製のＴａｒｇｅｔ ｃｌｏｎｅ ｐｌｕｓによってＴＡクローニングした。次に、各糖鎖合成関連遺伝子のＯＲＦ部分を除去するため、東洋紡社製のＫＯＤ ｐｌｕｓ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔを用いてＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲを行い、さらに、得られたプラスミドを制限酵素処理して、アスペルギルス・ニドランス由来のｓＣマーカー（ＡＴＰスルフリラーゼ）カセットを挿入することにより遺伝子破壊カセットを構築した。ａｌｇ１遺伝子の破壊コンストラクトの作製に用いたプライマー配列を配列番号９，１０、１１、１２に、ａｌｇ２遺伝子の破壊コンストラクトの作製に用いたプライマーを配列番号１３，１４、１５，１６にａｌｇ３遺伝子の破壊コンストラクトの作製に用いたプライマー配列を配列番号１７，１８、１９，２０に、ｏｃｈ１遺伝子の破壊コンストラクトの作製に用いたプライマー配列を２１，２２、２３，２４にそれぞれ示した。
2. 1. Production of Aspergillus oryzae-derived glycosylation-related gene disruption cassette The disruption cassette of the alg1, arg2, alg3, och1 gene, which is a gene related to Aspergillus oryzae-derived glycan synthesis, was constructed as follows.
First, a primer is designed at a position about 2 kbp upstream from the start codon of each sugar chain synthesis-related gene and a position about 2 kbp downstream from the start codon of each sugar chain synthesis-related gene, and PCR is performed using Aspergillus oryzae genomic DNA as a template. Went. The PCR product amplified by PCR was TA-cloned using Target clone plus manufactured by Toyobo. Next, in order to remove the ORF portion of each sugar chain synthesis-related gene, Inverse PCR was performed using a KOD plus mutationation kit manufactured by Toyobo Co., Ltd., and the resulting plasmid was further treated with a restriction enzyme to obtain a gene derived from Aspergillus nidulans. A gene disruption cassette was constructed by inserting an sC marker (ATP sulfurylase) cassette. The primer sequences used for the construction of the alg1 gene disruption construct are shown in SEQ ID NOs: 9, 10, 11 and 12, and the primers used for the construction of the alg2 gene destruction construct are shown in SEQ ID NOs: 13, 14, 15 and 16 and the alg3 gene is disrupted. The primer sequences used for constructing the constructs are shown in SEQ ID NOs: 17, 18, 19, and 20, and the primer sequences used for constructing the och1 gene disruption construct are shown in 21, 22, 23, and 24, respectively.
３．糖鎖合成関連遺伝子破壊株の作製
組換え宿主には麹菌アスペルギルス・オリゼ ＮＳ４株を使用した。本菌株は、独立行政法人酒類総合研究所にて取得された変異体であり、同研究所から分譲されている。ＮＳ４株はＳＯ４資化性とＮＯ３資化性がそれぞれｓＣ遺伝子とｎｉａＤ遺伝子の欠損により失われており、同遺伝子を用いて形質転換を行い、ＳＯ４資化性とＮＯ３資化性によって形質転換体を選抜することが可能である。上述の通り作製した、遺伝子破壊はカセットを用いて、ＮＳ４株を宿主にプロトプラスト−ＰＥＧ法により、形質転換を行った。遺伝子破壊の原理については図２に示す。得られた形質転換体の中から目的の遺伝子破壊株を、ＰＣＲによって確認して選抜した。
3. Production of Glycosylation Related Gene Disrupted Strain Aspergillus oryzae NS4 strain was used as a recombinant host. This strain is a mutant obtained at the National Research Institute for Liquors, and has been distributed from the laboratory. NS4 strain has lost SO 4 utilization and NO 3 utilization due to the deficiency of sC gene and niaD gene, respectively, and transformed using the same gene, SO 4 utilization and NO 3 utilization. It is possible to select transformants. The gene disruption produced as described above was performed by transforming NS4 strain as a host by protoplast-PEG method using a cassette. The principle of gene disruption is shown in FIG. The target gene disruption strain was selected from the obtained transformants after confirmation by PCR.
４．糖鎖合成関連遺伝子破壊株の生育比較
３で取得した形質転換体から１０５個／ｍｌ濃度に調整した作製し、ＤＰ寒天培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％リン酸１カリウム、０．１％硫酸マグネシウム７水和物、１．５％寒天、ｐＨ６．０）、ＤＰ＋０．８Ｍ ＮａＣｌ培地、ＤＰ＋１．４Ｍソルビトール培地にそれぞれの分生子懸濁液を０．０１ｍｌ分植菌して、３０℃で３日間静置培養した。培養の結果を図３に示す。図３に示すとおり、ａｌｇ１破壊株及び、ａｌｇ２破壊株はＤＰ培地上で基底菌糸の生育が見られず、分生子能が大きく低下していた。一方で、ＤＰ培地にＮａＣｌ又はソルビトールを添加した、ＤＰ＋０．８Ｍ ＮａＣｌ培地及びＤＰ＋１．４Ｍ ソルビトール培地ではａｌｇ１破壊株及びａｌｇ２破壊株で基底菌糸の生育が回復し、分生子形成能も僅かに回復した。
4). Prepared by adjusting to a concentration of 10 5 cells / ml from the transformant obtained in the growth comparison 3 of sugar chain synthesis-related gene-disrupted strains , DP agar medium (2% dextrin, 1% polypeptone, 0.5% monopotassium phosphate) 0.1% magnesium sulfate heptahydrate, 1.5% agar, pH 6.0), DP + 0.8M NaCl medium, DP + 1.4M sorbitol medium inoculate 0.01 ml of each conidial suspension. And static culture at 30 ° C. for 3 days. The culture results are shown in FIG. As shown in FIG. 3, the alg1 disrupted strain and the alg2 disrupted strain showed no growth of basal hyphae on the DP medium, and the conidia ability was greatly reduced. On the other hand, in the DP + 0.8M NaCl medium and DP + 1.4M sorbitol medium in which NaCl or sorbitol was added to the DP medium, the growth of the basal mycelium was restored in the alg1 disrupted strain and the alg2 disrupted strain, and the conidia forming ability was also slightly restored. .
５．糖鎖合成関連遺伝子破壊株の培養
４．で作製した各遺伝子破壊株の分生子懸濁液（１０５-個／ｍｌ）を２００ｍｌ容バッフル付三角フラスコを用いて、６０ｍｌのＤＰ＋０．８Ｍ ＮａＣｌ培地（２％デキストリン、１％ポリペプトン、０．５％リン酸１カリウム、０．１％硫酸マグネシウム７水和物、０．８Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０））に０．６ｍｌ植菌し、３０℃、７２時間培養し、培養液を回収した。培養液を３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ遠心分離して上清を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ Ｕｌｔｒａｃｅｌ ３０Ｋ（メルク・ミリポア社製）にアプライし、３０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ遠心して培養液上清を濃縮した。濃縮液に２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）を１０ｍｌ加えて濃縮し、この操作を３回繰り返すことによって、低分子を除去し、バッファー置換を行って加水濃縮液とした。得られた加水濃縮液を Ｎｕ−ＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動することにより、分泌タンパク質の分子量を求めた。結果を図４に示す。図４からわかるように、遺伝子組み換え宿主であるＮＳ４株では約５３ｋＤａ付近にαアミラーゼと推測されるバンドが検出されるのに対し、ａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３、ｏｃｈ１破壊株では、５０〜５２ｋＤａ程度の位置にαアミラーゼと推測されるバンドが出現しており、ＮＳ４株に比べて糖鎖含量が少ないαアミラーゼが生産されていると考えられた。
5. 3. Cultivation of sugar chain synthesis related gene disruption strain Using a 200 ml baffled Erlenmeyer flask, the conidia suspension (10 5 -ml / ml) of each gene-disrupted strain prepared in (1) was added to 60 ml of DP + 0.8M NaCl medium (2% dextrin, 1% polypeptone, 0. 0.6 ml of 5% monopotassium phosphate, 0.1% magnesium sulfate heptahydrate, 0.8M NaCl, pH 6.0)) was inoculated, cultured at 30 ° C. for 72 hours, and the culture solution was collected. The culture solution was centrifuged at 3000 rpm for 10 min to collect the supernatant, applied to Amicon Ultra Centrifugal Filters Ultracel 30K (manufactured by Merck Millipore), and centrifuged at 3000 rpm for 30 min to concentrate the culture supernatant. 10 ml of 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) was added to the concentrate and concentrated, and this operation was repeated three times to remove low molecules, and buffer replacement was performed to obtain a hydrolyzed concentrate. The obtained concentrated concentrate was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using Nu-PAGE 4-12% Bis-Tris Gel (manufactured by Invitrogen) to determine the molecular weight of the secreted protein. The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 4, in the NS4 strain, which is a genetically modified host, a band presumed to be α-amylase is detected in the vicinity of about 53 kDa, whereas in the alg1, alg2, alg3, and och1 disrupted strains, about 50 to 52 kDa. A band presumed to be α-amylase appeared at the position, and it was considered that α-amylase having a lower sugar chain content than NS4 strain was produced.
６．糖鎖合成関連遺伝子破壊株が生産する分泌タンパク質の糖鎖構造解析
５．で調製した培養液上清の加水濃縮液を用いて、糖鎖構造解析を行った。具体的には、加水濃縮液をｐＮＧａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）により糖鎖を遊離させた後、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によってタンパク質を分解し、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（住友ベークライト社製）によって遊離糖鎖を精製した。手法については、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏに付属のマニュアルに従って操作し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析用サンプルを調製した。精製した遊離糖鎖をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ解析した結果を図５に示す。
糖鎖解析の結果、宿主菌株であるＮＳ４株の培養液上清加水濃縮液からは複数のピークが検出された。これらのピークはＨｅｘＮＡｃ２Ｈｅｘ（５〜１１）の構造を有していると推定された。
6). 4. Analysis of sugar chain structure of secreted protein produced by a sugar chain synthesis-related gene disruption strain The glycan structure analysis was performed using the hydrolyzed concentrate of the culture supernatant prepared in 1. Specifically, after releasing the sugar chain from the hydrolyzed concentrate with pNGase (Roche), the protein was decomposed with trypsin (Promega) and the free sugar chain was purified with BlotGlyco (Sumitomo Bakelite). . About the method, it operated according to the manual attached to BlotGlyco, and prepared the sample for MALDI-TOF MS analysis. The result of MALDI-TOF MS analysis of the purified free sugar chain is shown in FIG.
As a result of the sugar chain analysis, a plurality of peaks were detected from the culture supernatant supernatant concentrate of the NS4 strain as the host strain. These peaks were presumed to have the structure HexNAc 2 Hex (5-11) .
ａｌｇ１破壊株からはメインピークは１つのみ検出されたが、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ解析の結果からは本ピークの構造を推定することは出来なかった。そこで、ａｌｇ１破壊株から検出された糖鎖の構造を決定するためＭＳ／ＭＳ解析を行ったところ、還元末端からＨｅｘｏｓｅを２つ有する構造であることが推定された。
ａｌｇ２破壊株からはメインピークは２つ検出されたが、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ解析の結果からはこれらのピークの構造を推定することは出来なかった。上記と同様に糖鎖の構造を決定するためＭＳ／ＭＳ解析を行ったところ、ｍ／ｚ＝１４４３のピークに関しては、還元末端からＨｅｘＮＡｃを２つ、Ｈｅｘを少なくとも１つ有する構造であることが推定された。
ａｌｇ３の破壊株からは複数のピークが検出されたが、これらのピークはＨｅｘＮＡｃ２Ｈｅｘ（２〜５）の構造を有していると推定され、ＮＳ４株から取得された糖鎖構造と比較してＨｅｘの数が大幅に低減されていることが推定された。
ｏｃｈ１の破壊株からも複数のピークが検出されたが、これらのピークはＨｅｘＮＡｃ２Ｈｅｘ（５〜１０）の構造を有していると推定され、ＮＳ４株から取得された糖鎖構造と比較してＨｅｘの数がやや低減されていることが推定された。
以上の結果から、麹菌アスペルギルス・オリゼにおいてａｌｇ１、ａｌｇ２、ａｌｇ３、ｏｃｈ１遺伝子を破壊した菌株では、宿主株であるＮＳ４株に比べて糖鎖構造が変化し、鎖長が短い糖鎖が付加されたタンパク質が分泌生産されていることが明らかとなった。
Only one main peak was detected from the alg1 disruption strain, but the structure of this peak could not be estimated from the results of MALDI TOF-MS analysis. Therefore, when MS / MS analysis was performed to determine the structure of the sugar chain detected from the alg1 disruption strain, it was estimated that the structure had two hexoses from the reducing end.
Two main peaks were detected from the alg2 disruption strain, but the structure of these peaks could not be estimated from the results of MALDI TOF-MS analysis. When MS / MS analysis was performed to determine the structure of the sugar chain in the same manner as described above, the peak at m / z = 1443 was a structure having two HexNAc and at least one Hex from the reducing end. Estimated.
A plurality of peaks were detected from the alg3 disruption strain, but these peaks were presumed to have the structure of HexNAc 2 Hex (2-5) and compared with the sugar chain structure obtained from the NS4 strain. Thus, it was estimated that the number of Hex was greatly reduced.
A plurality of peaks were also detected from the och1 disruption strain, but these peaks were presumed to have the structure of HexNAc 2 Hex (5-10) , and compared with the sugar chain structure obtained from the NS4 strain. Thus, it was estimated that the number of Hex was slightly reduced.
From the above results, in the strains in which the alg1, alg2, alg3, and och1 genes were disrupted in Aspergillus oryzae, the sugar chain structure was changed and a sugar chain having a shorter chain length was added compared to the NS4 strain as the host strain. It was revealed that the protein was secreted.
なお、本発明の遺伝子破壊株を用いて異種タンパク質を組換え発現させることによっても、改変された糖鎖構造を有する組換えタンパク質を取得することが可能になると考えられる。 In addition, it is considered that a recombinant protein having a modified sugar chain structure can also be obtained by recombinantly expressing a heterologous protein using the gene-disrupted strain of the present invention.
本発明によれば、麹菌アスペルギルス・オリゼの糖鎖合成関連遺伝子を分子生物学的手法を用いて破壊することによって、糖鎖構造が改変されたタンパク質を発現することが可能である。従って、本発明は、麹菌アスペルギルス・オリゼを用いて糖鎖結合タンパク質を生産するために極めて有用である。 According to the present invention, it is possible to express a protein having a modified sugar chain structure by destroying a sugar chain synthesis-related gene of Aspergillus oryzae using a molecular biological technique. Therefore, the present invention is extremely useful for producing a sugar chain binding protein using Aspergillus oryzae.
Claims (5)
（１）配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（２）配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡであり、かつ、ａｌｇ２の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号６のＤＮＡ
（４）配列番号６のＤＮＡ配列と９０％以上の同一性を有するＤＮＡであり、かつ、ａｌｇ２の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ The method according to claim 1, wherein the DNA encoding alg2 before modification is any one of the following (1) to (4).
(1) DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
(2) DNA encoding an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having the function of alg2
(3) DNA of SEQ ID NO: 6
(4) DNA having 90% or more identity with the DNA sequence of SEQ ID NO: 6 and encoding a protein having the function of alg2
（１）配列番号４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（２）配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡであり、かつ、ｏｃｈ１の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（３）配列番号８のＤＮＡ
（４）配列番号８のＤＮＡ配列と９０％以上の同一性を有するＤＮＡであり、かつ、ｏｃｈ１の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ The method according to claim 2, wherein the DNA encoding och1 before modification is any of the following (1) to (4).
(1) DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
(2) DNA encoding an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and encoding a protein having the function of och1
(3) DNA of SEQ ID NO: 8
(4) DNA encoding 90% or more of the DNA sequence of SEQ ID NO: 8 and encoding a protein having the function of och1
（ａ）ａｌｇ２またはｏｃｈ１をコードするＤＮＡの全部または一部を除去する
（ｂ）ａｌｇ２またはｏｃｈ１をコードするＤＮＡに、１または数個の置換、欠失もしくは付加する
（ｃ）ａｌｇ２またはｏｃｈ１をコードするＤＮＡを、改変前のＤＮＡ配列との同一性が８０％未満であるＤＮＡ配列と置き換える The method according to claim 1 or 2, wherein the modification is any of the following (a) to (c).
(A) removing all or part of DNA encoding alg2 or och1 (b) adding one or several substitutions, deletions or additions to DNA encoding alg2 or och1 (c) encoding alg2 or och1 Replace the DNA sequence with a DNA sequence that is less than 80% identical to the unmodified DNA sequence
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020213374A1 (en) * | 2019-04-15 | 2020-10-22 | 東洋紡株式会社 | Recombinant production of peroxidase |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001161376A (en) * | 1999-08-31 | 2001-06-19 | Eisai Co Ltd | GLYCOSYLTRANSFERASE GENE och1 DERIVED FROM FISSION YEAST |
| JP2012506710A (en) * | 2008-10-31 | 2012-03-22 | ロンザ リミテッド | A novel tool for the production of glycosylated proteins in host cells |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001161376A (en) * | 1999-08-31 | 2001-06-19 | Eisai Co Ltd | GLYCOSYLTRANSFERASE GENE och1 DERIVED FROM FISSION YEAST |
| JP2012506710A (en) * | 2008-10-31 | 2012-03-22 | ロンザ リミテッド | A novel tool for the production of glycosylated proteins in host cells |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| KAMPF ET AL., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 284, no. 18, JPN6018051784, 2009, pages 11900 - 11912 * |
| KOTZ ET AL., PLOS ONE, vol. 5, no. 12, JPN6018051785, 2010, pages 1 - 10 * |
| OGAWA ET AL., JOURNAL OF APPLIED GLYCOSCIENCE, vol. 59, no. 1, JPN6018014455, 10 February 2012 (2012-02-10), pages 37 - 42 * |
| TAKEUCHI ET AL., GLYCOBIOLOGY, vol. 9, no. 12, JPN6018051782, 1999, pages 1287 - 1293 * |
| 井上、鈴木, 化学と生物, vol. 31, no. 3, JPN6018014456, March 1993 (1993-03-01), pages 201 - 205 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020213374A1 (en) * | 2019-04-15 | 2020-10-22 | 東洋紡株式会社 | Recombinant production of peroxidase |
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