JP2018046868A - Production method of sheet-like cell culture product - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、比較的大きなサイズのシート状細胞培養物の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a sheet culture having a relatively large size.
近年の心臓病に対する治療の革新的進歩にかかわらず、重症心不全に対する治療体系は未だ確立されていない。心不全の治療法としては、βブロッカーやＡＣＥ阻害剤による内科治療が行われるが、これらの治療が奏功しないほど重症化した心不全には、補助人工心臓や心臓移植などの置換型治療、つまり外科治療が行われる。 Despite recent advances in the treatment of heart disease, a treatment system for severe heart failure has not yet been established. For the treatment of heart failure, medical treatment with β-blockers or ACE inhibitors is performed. For heart failure that has become so severe that these treatments are not successful, replacement therapy such as an artificial heart or a heart transplant, that is, surgical treatment Is done.
このような外科治療の対象となる重症心不全には、進行した弁膜症や高度の心筋虚血に起因するもの、急性心筋梗塞やその合併症、急性心筋炎、虚血性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）などによる慢性心不全やその急性憎悪など、多種多様の原因がある。
これらの原因と重症度に応じて弁形成術や置換術、冠動脈バイパス術、左室形成術、機械的補助循環などが適用される。
Severe heart failure that is the subject of such surgical treatment includes those caused by advanced valvular disease and severe myocardial ischemia, acute myocardial infarction and its complications, acute myocarditis, ischemic cardiomyopathy (ICM), dilation There are a wide variety of causes such as chronic heart failure due to dilated cardiomyopathy (DCM) and acute aversion.
Depending on these causes and severity, valvuloplasty and replacement, coronary artery bypass surgery, left ventricular plastic surgery, mechanical assisted circulation, etc. are applied.
この中で、ＩＣＭやＤＣＭによる高度の左室機能低下から心不全を来たしたものについては、心臓移植や人工心臓による置換型治療のみが有効な治療法とされてきた。しかしながら、これら重症心不全患者に対する置換型治療は、慢性的なドナー不足、継続的な免疫抑制の必要性、合併症の発症など解決すべき問題が多く、すべての重症心不全に対する普遍的な治療法とは言い難い。 Of these, only heart transplantation or replacement treatment with an artificial heart has been regarded as an effective treatment for those who have suffered heart failure due to a severe decrease in left ventricular function caused by ICM or DCM. However, replacement therapy for these patients with severe heart failure has many problems to be solved, such as chronic donor shortages, the need for continuous immunosuppression, and the development of complications. Is hard to say.
その一方、最近、重症心不全治療の解決策として新しい再生医療の展開が不可欠と考えられている。
重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されてアポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞***をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。
このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。
On the other hand, recently, development of new regenerative medicine is considered indispensable as a solution for the treatment of severe heart failure.
In severe myocardial infarction and the like, cardiomyocytes become dysfunctional, and fibroblast proliferation and interstitial fibrosis progress, resulting in heart failure. As the heart failure progresses, the cardiomyocytes are damaged and fall into apoptosis, but the cardiomyocytes hardly undergo cell division, so the number of cardiomyocytes decreases and the cardiac function further decreases.
Cell transplantation is considered useful for the recovery of cardiac function in such patients with severe heart failure, and clinical application with autologous skeletal myoblasts has already been started.
近年、その一例として、組織工学を応用した温度応答性培養皿を用いることによって、成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む心臓に適用可能な三次元に構成された細胞培養物と、その製造方法が提供された（特許文献１）。 In recent years, as an example, a three-dimensional cell culture that can be applied to the heart including cells derived from parts other than the adult myocardium by using a temperature-responsive culture dish that applies tissue engineering, and its A manufacturing method was provided (Patent Document 1).
しかし、これらの方法により製造されたシート状の細胞培養物には製造工程不純物を多く含んでいる。これらの製造工程由来不純物は、通常、細胞培養物をこれらの物質を含まない媒体で洗浄することによって除去するが、細胞培養物は機械的に極めて脆弱であり、洗浄時の水流などにより容易に破壊されるため、細胞培養物における製造工程由来不純物を臨床上障害とならないレベルまで洗浄することはこれまで極めて困難であった。 However, the sheet-shaped cell culture produced by these methods contains a lot of production process impurities. These process-derived impurities are usually removed by washing the cell culture with a medium that does not contain these substances, but the cell culture is mechanically extremely fragile and can be easily removed by water flow during washing. Due to the destruction, it has been extremely difficult to wash the impurities from the manufacturing process in the cell culture to a level that does not cause clinical problems.
しかも、かかる細胞培養物を培養基材から剥離するには、ピペッティングやスクレーピングなどによる機械的手法や、トリプシンなどによる酵素処理といった通常の付着細胞剥離法では、細胞培養物の構造が壊れたり、細胞が損傷したりするため、温度応答性材料がコートされた培養皿で細胞を培養し、温度を変化させて同材料の疎水性を変化させることにより細胞培養物を剥離する、などの方法が用いられている（特許文献１）。しかしながら、かかる培養皿は高価であるうえ、培養皿が温度低下するまでの待機時間や細胞による剥離状態の多様性に起因する、剥離時の細胞培養物構造の破壊や、細胞の損傷などの問題を有している。 Moreover, in order to detach such a cell culture from the culture substrate, a mechanical method such as pipetting or scraping, or a normal adherent cell detachment method such as enzyme treatment using trypsin, or the like, the structure of the cell culture may be broken, In order to damage the cells, the cells are cultured in a culture dish coated with a temperature-responsive material, and the cell culture is detached by changing the hydrophobicity of the material by changing the temperature. (Patent Document 1). However, such a culture dish is expensive and has problems such as destruction of cell culture structure and cell damage at the time of detachment due to the waiting time until the temperature of the culture dish decreases and the diversity of detachment state by cells. have.
そこで製造工程由来不純物成分を含まない良質な細胞培養物を製造する方法として、細胞を基材上に播種した後、基材に対して加圧してから培養することにより、シート状の細胞培養物を得る方法が見出された（特許文献２）。 Therefore, as a method of producing a high-quality cell culture that does not contain impurities derived from the production process, after seeding the cells on the base material, pressurizing the base material and then culturing the sheet-like cell culture product Has been found (Patent Document 2).
本発明者らは、上記特許文献２の方法についてさらに鋭意研究を進める中で、製造するシート状細胞培養物の大きさをスケールアップして製造した場合、かかる方法で製造されたシートが、小さなスケールの場合と異なり、非常に脆く簡単に破損が生じてしまうシートになってしまうという新たな課題に直面した。かかる課題を解決すべくさらに研究を進める中で、スケールアップしたことにより加圧の工程において圧力のかかり方に偏りが生じているという新たな知見を見出し、かかる知見に基づいて本発明を完成させた。 In the process of further diligent research on the method of Patent Document 2 described above, the present inventors have developed a sheet-like cell culture to be produced by scaling up the size of the sheet-like cell culture to be produced. Unlike the case of the scale, we faced the new challenge of becoming a sheet that was very brittle and easily broken. As further research is conducted to solve such problems, new findings have been found that there is a bias in how pressure is applied in the pressurization process due to scale-up, and the present invention has been completed based on such findings. It was.
すなわち本発明は以下に関する。
［１］遊離したシート状細胞培養物の製造方法であって、
（ｉ）細胞を基材上に播種する工程、
（ｉｉ）細胞を基材に対して加圧する工程、
（ｉｉｉ）細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程、および
（ｉｖ）形成された培養物を基材から遊離させる工程
を含み、ここで工程（ｉ）および（ｉｉ）からなる繰り返しセットが２回以上繰り返され、２回目以降の繰り返しセットにおける播種および／または加圧が、直前の加圧工程終了後における加圧の偏りによる細胞密度の疎密を是正するように行われることを特徴とする、前記方法。
［２］細胞の最終密度が、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度である、［１］に記載の方法。
［３］細胞の最終密度が３．５×１０５個／ｃｍ２以上、３．４×１０６個／ｃｍ２未満である、［１］または［２］の方法。
［４］細胞が、筋芽細胞を含む、［１］〜［３］の方法。
［５］基材が細胞非接着性の表面を有する、［１］〜［４］の方法。
［６］加圧が、遠心力によって行われる、［１］〜［５］の方法。
［７］加圧が、２〜２０００Ｇの力で行われる、［１］〜［６］の方法。
That is, the present invention relates to the following.
[1] A method for producing a released sheet-shaped cell culture,
(I) seeding cells on a substrate;
(Ii) pressurizing the cell against the substrate;
(Iii) culturing cells to form a sheet-like cell culture, and (iv) releasing the formed culture from the substrate, wherein the steps consist of steps (i) and (ii) The repeated set is repeated two or more times, so that seeding and / or pressurization in the second and subsequent repeat sets is performed so as to correct the density of cells due to the bias of pressurization after the end of the immediately preceding pressurization step. Said method.
[2] The method according to [1], wherein the final density of the cells is a density capable of forming a sheet-like cell culture without substantially growing.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the final density of the cells is 3.5 × 10 5 cells / cm 2 or more and less than 3.4 × 10 6 cells / cm 2 .
[4] The method of [1] to [3], wherein the cell comprises a myoblast.
[5] The method of [1] to [4], wherein the substrate has a cell non-adhesive surface.
[6] The method of [1] to [5], wherein the pressurization is performed by centrifugal force.
[7] The method of [1] to [6], wherein the pressing is performed with a force of 2 to 2000 G.
本発明により、特許文献２に記載の方法による効果である、製造工程由来不純物の混入を低減させ得ること、簡便な操作でシート状細胞培養物を培養基材から剥離することが出来ることなどに加え、スケールアップなど何らかの理由により加圧に偏りが生じる場合であっても、良質なシート状細胞培養物を製造することが可能となる。 According to the present invention, the effects of the method described in Patent Document 2 can be reduced, and contamination of manufacturing process-derived impurities can be reduced, and the sheet-like cell culture can be peeled off from the culture substrate by a simple operation. In addition, even if the pressurization is biased for some reason such as scale-up, a high-quality sheet-shaped cell culture can be produced.
本発明は、（ｉ）細胞を基材上に播種する工程、（ｉｉ）細胞を基材に対して加圧する工程、（ｉｉｉ）細胞を基材上に再び播種する工程、
（ｉｖ）工程（ｉｉ）における加圧の偏りを是正するように、細胞を基材に対して再加圧する工程、（ｖ）細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程、および（ｖｉ）形成された培養物を基材から遊離させる工程、を含む、遊離したシート状細胞培養物の製造方法に関する。
本発明における細胞には、細胞培養物、特にシート状の細胞培養物を形成し得る任意の細胞が含まれる。かかる細胞の例としては、限定されずに、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、心筋細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、上皮細胞、内皮細胞などが含まれる。これらのうち、本発明においては、単層の細胞培養物を形成するもの、例えば、筋芽細胞が好ましい。細胞は、細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどが含まれる。また、本発明の方法に用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。本発明の好ましい態様において、細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の比率（純度）は、細胞培養物製造終了時において、６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上である。
The present invention includes (i) a step of seeding cells on a substrate, (ii) a step of pressurizing the cells against the substrate, (iii) a step of seeding the cells again on the substrate,
(Iv) repressurizing the cells against the substrate so as to correct the bias in pressurization in step (ii), (v) culturing the cells to form a sheet-like cell culture, and (Vi) The present invention relates to a method for producing a released sheet-shaped cell culture, comprising a step of releasing the formed culture from a substrate.
The cell in the present invention includes any cell that can form a cell culture, particularly a sheet-shaped cell culture. Examples of such cells include, but are not limited to, myoblasts (eg, skeletal myoblasts), cardiomyocytes, fibroblasts, synovial cells, epithelial cells, endothelial cells, and the like. Among these, in the present invention, those that form a monolayer cell culture, such as myoblasts, are preferred. The cells can be derived from any organism capable of being treated with cell culture. Such organisms include, but are not limited to, humans, non-human primates, dogs, cats, pigs, horses, goats, sheep and the like. Further, only one type of cell may be used in the method of the present invention, but two or more types of cells can also be used. In a preferred embodiment of the present invention, when there are two or more types of cells forming a cell culture, the most cell ratio (purity) is 65% or more, preferably 70% or more at the end of cell culture production. Preferably it is 75% or more.
本発明において、「基材」は、細胞をそれに対して加圧し得る表面または界面を有するものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形、半固形もしくは液体の表面または界面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。また、容器は、その内部に固形、半固形もしくは液体の表面または界面を有してもよい。固形の表面としては、種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリクスなどが、液体の表面としては、高粘性の液体媒体、液体の界面としては、比重の異なる液体間に生じる界面、例えば、密度勾配法による細胞分離用の比重液（ショ糖、塩化セシウム、硫酸セシウム、Percoll（Ｒ）、Ficoll（Ｒ）、Nycodenz（Ｒ）、OptiPrepＴＭ、ISolateＴＭ、ISOLYMPHなどの溶液）における界面などが挙げられる。
上記表面または界面は、種々の形状であってもよいが、平坦であることが好ましい。また、その面積は特に限定されないが、典型的には、１〜２００ｃｍ２、好ましくは２〜１００ｃｍ２、より好ましくは３〜８０ｃｍ２である。
In the present invention, the “substrate” is not particularly limited as long as it has a surface or interface capable of pressurizing cells against it. For example, containers of various materials, solid, semi-solid or liquid in containers Includes surface or interface. The container preferably has a structure / material that does not allow permeation of a liquid such as a culture solution. The container preferably has at least one flat surface. Examples of such containers include, but are not limited to, cell culture dishes and cell culture bottles. The container may have a solid, semi-solid, or liquid surface or interface therein. As a solid surface, various materials such as plates and containers, as a semi-solid surface, a gel, a soft polymer matrix, etc., as a liquid surface, as a highly viscous liquid medium, as a liquid interface, Interfaces formed between liquids having different specific gravity, for example, specific gravity liquids for cell separation by density gradient method (sucrose, cesium chloride, cesium sulfate, Percoll (R) , Ficoll (R) , Nycodenz (R) , OptiPrep ™ , ISolate TM , ISOLYMPH, etc.)).
The surface or interface may have various shapes, but is preferably flat. Although the area is not particularly limited, typically, 1～200Cm 2, preferably 2～100Cm 2, more preferably 3~80cm 2.
本発明の好ましい態様において、基材は細胞非接着性の表面または界面を有する。ここで、「細胞非接着性」とは、付着細胞が接着しないか、または接着しにくいことを意味する。例えば、付着細胞は、接する表面の疎水性または親水性がある程度以上高いと接着しにくくなることが知られている。したがって、本発明における細胞非接着性の表面または界面は、ある程度以上の疎水性または親水性を有することが好ましい。表面の疎水性または親水性の程度は、例えば、水接触角で表すことができるが、本発明において、細胞非接着性表面の水接触角は、好ましくは７０°以上または５０°以下、特に７５°以上または４０°以下である。 In a preferred embodiment of the invention, the substrate has a non-cell-adhesive surface or interface. Here, “cell non-adhesive” means that adherent cells do not adhere or are difficult to adhere. For example, it is known that adherent cells are difficult to adhere if the surface or surface to be contacted has a higher hydrophobicity or hydrophilicity to some extent. Therefore, the non-cell-adhesive surface or interface in the present invention preferably has a certain degree of hydrophobicity or hydrophilicity. The degree of hydrophobicity or hydrophilicity of the surface can be expressed by, for example, a water contact angle. In the present invention, the water contact angle of the non-cell-adhesive surface is preferably 70 ° or more or 50 ° or less, particularly 75. It is more than or less than 40 degrees.
細胞非接着性の材料としては、例えば、限定することなく、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミドなどを挙げることができる。また、市販の浮遊細胞培養用の容器は細胞非接着性の表面を有するため、これを本発明の基材として用いることもできる。さらにまた、表面を改質して細胞非接着性とすることもできる。具体的には、例えば、表面に親水性または疎水性の分子をコーティングしたり、表面に温度変化により疎水性または親水性となる温度応答性材料（特開平２−２１１８６５参照）を被覆したりすることができる。しかし、本発明の一態様において、基材は温度応答性材料から構成される表面を有しない。 Examples of the non-cell-adhesive material include, but are not limited to, polyethylene, polypropylene, Teflon (registered trademark), polyethylene terephthalate, polymethyl methacrylate, nylon 6,6, polyvinyl alcohol, cellulose, silicon, polystyrene, glass, poly Examples include acrylamide and polydimethylacrylamide. Moreover, since the commercially available container for floating cell cultures has a cell non-adhesive surface, this can also be used as a base material of this invention. Furthermore, the surface can be modified to make it non-cell-adhesive. Specifically, for example, the surface is coated with hydrophilic or hydrophobic molecules, or the surface is coated with a temperature-responsive material (see JP-A-2-21865) that becomes hydrophobic or hydrophilic due to temperature change. be able to. However, in one embodiment of the present invention, the substrate does not have a surface composed of a temperature responsive material.
温度応答性材料としては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーが挙げられる。 Examples of temperature-responsive materials include (meth) acrylamide compounds, N-alkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (for example, N-ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, N-isopropyl). Acrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N-cyclopropylmethacrylamide, N-ethoxyethylacrylamide, N-ethoxyethylmethacrylamide, N-tetrahydrofurfurylacrylamide, N-tetrahydrofurfurylmethacrylamide, etc.) N, N-dialkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N, N-dimethyl (meth) acrylamide, N, N-ethylmethylacrylamide, N, N-diethylacrylic) ), (Meth) acrylamide derivatives having a cyclic group (for example, 1- (1-oxo-2-propenyl) -pyrrolidine, 1- (1-oxo-2-propenyl) -piperidine, 4- (1-oxo -2-propenyl) -morpholine, 1- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl) -pyrrolidine, 1- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl) -piperidine, 4- (1-oxo -2-methyl-2-propenyl) -morpholine, etc.), or homopolymers or copolymers of vinyl ether derivatives (eg methyl vinyl ether).
本発明の好ましい態様において、細胞は、最終細胞密度が実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度となるように播種される。「実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」とは、成長因子を含まない非増殖系の培養液で培養した場合に、シート状細胞培養物を形成することができる細胞密度を意味する。例えば、骨格筋芽細胞の場合、成長因子を含む培養液を用いる従来法では、シート状細胞培養物を形成するために、約６，５００個／ｃｍ２の密度の細胞をプレートに播種していたが（例えば、特許文献１参照）、かかる密度の細胞を、成長因子を含まない培養液で培養してもシート状の細胞培養物を形成することはできない。したがって、本態様における細胞密度は、成長因子を含む培養液を用いる従来法におけるものよりも高いものである。具体的には、例えば、骨格筋芽細胞については、かかる密度は典型的には３００，０００個／ｃｍ２以上である。細胞密度の上限は、細胞培養物の形成が損なわれず、細胞が分化に移行しなければ特に制限されないが、骨格筋芽細胞については、例えば、３．４×１０６個／ｃｍ２である。当業者であれば、本発明に適した細胞密度を、実験により適宜決定することができる。培養期間中、細胞は増殖してもしなくてもよいが、増殖するとしても、細胞の性状が変化する程には増殖しない。例えば、骨格筋芽細胞はコンフルエントになると分化を開始するが、本発明においては、骨格筋芽細胞は、細胞培養物は形成するが、分化に移行しない密度で播種される。本発明の好ましい態様において、細胞は計測誤差の範囲を超えて増殖しない。細胞が増殖したか否かは、例えば、播種時の細胞数と、細胞培養物形成後の細胞数とを比較することにより評価することができる。本態様において、細胞培養物形成後の細胞数は、典型的には播種時の細胞数の３００％以下、好ましくは２００％以下、より好ましくは１５０％以下、さらに好ましくは１２５％以下、特に好ましくは１００％以下である。 In a preferred embodiment of the invention, the cells are seeded such that the final cell density is such that it can form a sheet-like cell culture without substantial growth. “The density at which a sheet-like cell culture can be formed without substantially growing” means that a sheet-like cell culture can be formed when cultured in a non-proliferating culture medium that does not contain growth factors. Refers to cell density. For example, in the case of skeletal myoblasts, in the conventional method using a culture solution containing a growth factor, cells having a density of about 6,500 cells / cm 2 are seeded on a plate in order to form a sheet-like cell culture. However (for example, refer to Patent Document 1), even if cells having such a density are cultured in a culture solution containing no growth factor, a sheet-like cell culture cannot be formed. Therefore, the cell density in this embodiment is higher than that in the conventional method using a culture solution containing a growth factor. Specifically, for example, for skeletal myoblasts, such density is typically 300,000 cells / cm 2 or more. The upper limit of the cell density is not particularly limited as long as the formation of the cell culture is not impaired and the cells do not shift to differentiation, but for skeletal myoblasts, for example, it is 3.4 × 10 6 cells / cm 2 . A person skilled in the art can appropriately determine the cell density suitable for the present invention by experiments. During the culture period, the cells may or may not proliferate, but even if they proliferate, they do not proliferate to the extent that the properties of the cells change. For example, skeletal myoblasts start to differentiate when they become confluent, but in the present invention, skeletal myoblasts are seeded at a density that forms a cell culture but does not transition to differentiation. In a preferred embodiment of the invention, the cells do not grow beyond the range of measurement errors. Whether or not the cells have proliferated can be evaluated, for example, by comparing the number of cells at the time of seeding with the number of cells after formation of the cell culture. In this embodiment, the number of cells after the formation of the cell culture is typically 300% or less, preferably 200% or less, more preferably 150% or less, even more preferably 125% or less, particularly preferably the number of cells at the time of seeding. Is 100% or less.
本発明において、「基材に対して加圧する」とは、細胞を所定の大きさの力で基材、または、基材に直接もしくは他の細胞を介して接触している他の細胞に接触させることを意味する。力の種類は、上記作用を奏するものであれば特に限定されず、例えば、遠心力や圧力などが挙げられる。
遠心力を負荷する場合、基材と細胞とを含む容器などを、遠心分離器を用いて遠心することができる。負荷する遠心力は、典型的には約２〜２０００Ｇ、好ましくは約５〜１０００Ｇ、より好ましくは約１０〜８００Ｇ、特に好ましくは５０〜４５０Ｇである。細胞に損傷を与えない程度で、より強い遠心力を負荷することにより、細胞培養物の均一性をより高めること、すなわち、細胞培養物の空隙をより少なくすることができる。遠心時間は、典型的には２〜６０分間、好ましくは３〜１５分間、より好ましくは３〜５分間であり、遠心温度は、典型的には２〜３７℃、より好ましくは４〜２５℃である。
In the present invention, “pressurizing the substrate” means that the cell is contacted with a substrate of a predetermined size or other cells that are in contact with the substrate directly or via other cells. It means that The type of force is not particularly limited as long as it exhibits the above action, and examples thereof include centrifugal force and pressure.
When a centrifugal force is applied, a container containing a base material and cells can be centrifuged using a centrifuge. The centrifugal force to be applied is typically about 2 to 2000 G, preferably about 5 to 1000 G, more preferably about 10 to 800 G, and particularly preferably 50 to 450 G. By applying a stronger centrifugal force without damaging the cells, the uniformity of the cell culture can be further increased, that is, the voids of the cell culture can be reduced. The centrifugation time is typically 2 to 60 minutes, preferably 3 to 15 minutes, more preferably 3 to 5 minutes, and the centrifugation temperature is typically 2 to 37 ° C, more preferably 4 to 25 ° C. It is.
圧力の負荷は、例えば、透過性の基材に向けて細胞に水圧を負荷することにより行うことができる。水圧は、シリンジやポンプなどにより負荷することができる。負荷する水圧は、典型的には１０〜１００ｍｍＨｇ、好ましくは２０〜８０ｍｍＨｇ、より好ましくは３０〜５０ｍｍＨｇであり、負荷時間は、典型的には３〜９０分間、好ましくは５〜６０分間、より好ましくは５〜１５分間であり、負荷温度は、典型的には２〜３７℃、より好ましくは４〜２５℃である。 The pressure can be applied, for example, by applying a water pressure to the cells toward the permeable substrate. The water pressure can be applied by a syringe or a pump. The loading water pressure is typically 10 to 100 mmHg, preferably 20 to 80 mmHg, more preferably 30 to 50 mmHg, and the loading time is typically 3 to 90 minutes, preferably 5 to 60 minutes, more preferably. Is 5 to 15 minutes, and the load temperature is typically 2 to 37 ° C, more preferably 4 to 25 ° C.
圧力は、シート状細胞培養物が形成される培養面全体に対して均一に負荷されるのが好ましい。しかしながら、形成されるシート状細胞培養物のサイズが大きくなればなるほど圧力に偏りが生じやすくなる。本発明者らは、より大きなサイズのシート状細胞培養物の製造について試行錯誤する中で、製造するシート状細胞培養物の大きさが大きくなると、シート状細胞培養物の質、特に物理的強度の致命的な低下が生じるとの新たな課題に直面し、これが上記圧力の偏りにより、細胞密度分布に疎密が生じることに起因する現象であることを見出した。そこで、かかる圧力の偏りによる細胞密度分布の疎密を是正するように播種および／または加圧する工程を繰り返し行うことにより、シート状細胞培養物の質を低下させることなく、より大きなサイズのシートが製造可能であることを発見したものである。 The pressure is preferably uniformly applied to the entire culture surface on which the sheet-like cell culture is formed. However, the larger the size of the sheet-like cell culture formed, the more likely the pressure will be biased. In the process of trial and error in producing a larger-sized sheet-shaped cell culture, the present inventors have increased the quality of the sheet-shaped cell culture, particularly the physical strength. We faced a new problem of causing a fatal decline in the cell density, and found that this is a phenomenon caused by the density of the cell density being sparse due to the pressure bias. Therefore, by repeating the seeding and / or pressurization process so as to correct the density of the cell density distribution due to such pressure bias, a larger size sheet can be produced without degrading the quality of the sheet-like cell culture. It was discovered that it was possible.
本発明において、「加圧の偏り」とは、加圧工程においてシートを形成する培養面全体に均一な圧力がかからないことをいい、「加圧の偏りによる細胞密度の疎密」とは、加圧の偏りにより、播種された細胞の密度分布に疎密が生じた状態をいう。したがって加圧の偏りによる細胞密度の疎密は、加圧後の培養面全体の細胞密度分布を計測することにより検出可能である。細胞密度分布の計測は、当該技術分野において用いられる通常の方法を用いてよく、これに限定するものではないが、例えば肉眼による視認、吸光光度分析、画像分析などの方法が用いられ得る。本発明において、「加圧の偏りによる細胞の疎密を是正する」とは、最終細胞密度が均一となるようにすることを言う。したがって、本発明の一態様において、各加圧工程の後、培養面全体の細胞密度分布を計測する工程を含んでよい。 In the present invention, the “pressure bias” means that a uniform pressure is not applied to the entire culture surface on which the sheet is formed in the pressurizing step, and “cell density density due to the pressure bias” This means that the density distribution of the seeded cells is sparse due to the bias. Therefore, the density of the cell density due to the bias of pressure can be detected by measuring the cell density distribution of the entire culture surface after pressurization. The measurement of the cell density distribution may be performed using a normal method used in the technical field, and is not limited thereto. For example, methods such as visual recognition with the naked eye, absorptiometric analysis, and image analysis may be used. In the present invention, “correcting cell density due to pressure bias” means to make the final cell density uniform. Therefore, in one embodiment of the present invention, a step of measuring the cell density distribution of the entire culture surface after each pressing step may be included.
加圧の偏りによる細胞密度の疎密を是正する方法としては、これに限定するものではないが、例えば計測した細胞密度分布の疎密に対応するように細胞の播種時の密度分布を変更する方法、圧力のかかり方を変更する方法などが挙げられる。例えば遠心による加圧の場合、培養面が大きくなると、回転中心からの距離に差異が生じることにより、距離が遠い位置ほど大きな圧力がかかることによって圧力の偏りが生じ、回転中心より遠い位置の細胞密度が疎となったり、回転方向に対する慣性力により、回転方向の位置が疎となったりする。かかる偏りを是正するためには、例えば細胞密度が疎の位置への細胞播種密度を密にする、培養面の位置をずらすことにより回転中心からの距離を調節する、などの方法により、加圧の偏りによる細胞密度の疎密を是正することが出来る。当該技術分野における通常の知識を有するものであれば、加圧方法、加圧の偏り具合などに依拠して、加圧の偏りを是正する最適な方法を適宜選択可能である。 As a method of correcting the density of the cell density due to the bias of pressure, but not limited to this, for example, a method of changing the density distribution at the time of cell seeding to correspond to the density of the measured cell density distribution, For example, a method of changing how pressure is applied. For example, in the case of pressurization by centrifugation, if the culture surface becomes larger, the distance from the center of rotation will differ, and a greater pressure will be applied to a position farther away from the center of the cell. The density is sparse, or the position in the rotation direction is sparse due to the inertial force in the rotation direction. In order to correct this bias, pressurization is performed by, for example, increasing the cell seeding density at positions where the cell density is sparse, or adjusting the distance from the center of rotation by shifting the position of the culture surface. It is possible to correct the density of cells due to the bias. Those who have ordinary knowledge in the technical field can appropriately select an optimum method for correcting the pressurization bias depending on the pressurization method, the pressurization bias, and the like.
本発明の一態様において、繰り返しセットは、複数回繰り返されてもよい。すなわち、再加圧も含め、加圧する工程は２回以上行われてよい。それぞれの工程における加圧の方法も、最終的に加圧の偏りによる細胞密度の疎密を是正できる限り、同一の方法でも異なる方法でもよい。
本明細書において「細胞密度」とは、培養面１ｃｍ２あたりの細胞の個数をいう。したがって「細胞播種密度」とは、培養面１ｃｍ２あたりに播種される細胞の密度を意味し、「最終細胞密度」または「細胞の最終密度」とは、加圧後の細胞密度を意味する。
In one aspect of the invention, the repeating set may be repeated multiple times. That is, the pressurizing step including repressurization may be performed twice or more. The method of pressurization in each step may be the same method or a different method as long as the density of the cell density due to the bias of the pressurization can be finally corrected.
As used herein, “cell density” refers to the number of cells per 1 cm 2 of the culture surface. Therefore, “cell seeding density” means the density of cells seeded per 1 cm 2 of the culture surface, and “final cell density” or “final cell density” means the cell density after pressurization.
上述の通り、本発明の一態様において、細胞の最終密度が実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度となるように、細胞が播種される。製造方法における骨格筋芽細胞の播種密度は、ある態様では３．０×１０５〜３．４×１０６個／ｃｍ２、別の態様では３．５×１０５〜３．４×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では１．０×１０６〜３．４×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では３．０×１０５〜１．７×１０６個／ｃｍ２、別の態様では３．５×１０５〜１．７×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では１．０×１０６〜１．７×１０６個／ｃｍ２である。上記範囲は、上限が３．４×１０６個／ｃｍ２未満である限り、上限および下限の両方、または、そのいずれか一方を含んでもよい。したがって、本発明の製造方法における骨格筋芽細胞の播種密度は、例えば、３．０×１０５個／ｃｍ２以上３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限を含み、上限は含まない）、３．５×１０５個／ｃｍ２以上３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限を含み、上限は含まない）、１．０×１０６個／ｃｍ２以上３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限を含み、上限は含まない）、１．０×１０６個／ｃｍ２超３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限も上限も含まない）、１．０×１０６個／ｃｍ２超１．７×１０６個／ｃｍ２以下（下限は含まないが、上限は含む）であってもよい。当業者であれば、骨格筋芽細胞以外の細胞について、本発明に適した細胞密度を、本明細書の教示に従い、実験により適宜決定することができる。 As described above, in one embodiment of the present invention, cells are seeded so that the final density of the cells is a density that can form a sheet-like cell culture without substantially growing. The seeding density of skeletal myoblasts in the production method is 3.0 × 10 5 to 3.4 × 10 6 cells / cm 2 in one embodiment, and 3.5 × 10 5 to 3.4 × 10 6 in another embodiment. Pieces / cm 2 , in yet another aspect, 1.0 × 10 6 to 3.4 × 10 6 pieces / cm 2 , and in yet another aspect, 3.0 × 10 5 to 1.7 × 10 6 pieces / cm 2. In another embodiment, it is 3.5 × 10 5 to 1.7 × 10 6 pieces / cm 2 , and in another embodiment, 1.0 × 10 6 to 1.7 × 10 6 pieces / cm 2 . As long as an upper limit is less than 3.4 * 10 < 6 > piece / cm < 2 >, the said range may include both an upper limit and a lower limit, or any one thereof. Therefore, the seeding density of skeletal myoblasts in the production method of the present invention is, for example, 3.0 × 10 5 cells / cm 2 or more and less than 3.4 × 10 6 cells / cm 2 (including the lower limit and not including the upper limit). ), 3.5 × 10 5 pieces / cm 2 or more and less than 3.4 × 10 6 pieces / cm 2 (including the lower limit, not including the upper limit), 1.0 × 10 6 pieces / cm 2 or more and 3.4 × 10 less than 6 / cm 2 (including the lower and the upper limit is not included), 1.0 × 10 6 cells / cm 2 ultra 3.4 × 10 than 6 / cm 2 (lower limit also contains no upper limit), 1 It may be more than 0.0 × 10 6 pieces / cm 2 and 1.7 × 10 6 pieces / cm 2 or less (not including the lower limit but including the upper limit). A person skilled in the art can appropriately determine the cell density suitable for the present invention for cells other than skeletal myoblasts by experiments according to the teaching of the present specification.
本発明において、細胞の培養は、対象となる細胞がシート状の細胞培養物を形成するのに適した条件で行われる。
本発明において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には１つの細胞層からなるものであるが、２以上の細胞層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも機械的に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも機械的に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
In the present invention, the cells are cultured under conditions suitable for the target cells to form a sheet-like cell culture.
In the present invention, the “sheet-shaped cell culture” refers to a sheet in which cells are connected to each other and is typically composed of one cell layer, but is composed of two or more cell layers. Including those that are made. The cells may be linked to each other directly and / or via an intervening substance. The intervening substance is not particularly limited as long as it is a substance capable of mechanically connecting cells to each other, and examples thereof include an extracellular matrix. The intervening substance is preferably derived from cells, in particular, derived from the cells constituting the cell culture. The cells are at least mechanically linked, but may be further functionally, eg, chemically or electrically linked.
本発明のシート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本発明の細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本発明の細胞培養物は、好ましくは、細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。 The sheet-shaped cell culture of the present invention preferably does not contain a scaffold (support). Scaffolds may be used in the art to attach cells on and / or within its surface and maintain the physical integrity of the cell culture, eg, polyvinylidene difluoride (PVDF) Although manufactured membranes are known, the cell culture of the present invention can maintain its physical integrity even without such a scaffold. In addition, the cell culture of the present invention preferably consists only of substances derived from the cells constituting the cell culture and does not contain any other substances.
本発明の一態様において、細胞の培養は、所定の期間内、好ましくは、細胞が分化に移行しない期間内に行われる。したがって、この態様において、細胞は、培養期間中、未分化の状態に維持される。細胞の分化への移行は、当業者に知られた任意の方法で評価することができる。例えば、骨格筋芽細胞の場合は、ＭＨＣの発現や、細胞の多核化を分化の指標とすることができる。本発明の好ましい態様において、培養期間は４８時間以内、より好ましくは４０時間以内、さらに好ましくは２４時間以内である。 In one embodiment of the present invention, cell culture is performed within a predetermined period, preferably within a period in which cells do not shift to differentiation. Thus, in this embodiment, the cells are maintained in an undifferentiated state during the culture period. The transition to cell differentiation can be evaluated by any method known to those skilled in the art. For example, in the case of skeletal myoblasts, MHC expression and cell multinucleation can be used as indicators of differentiation. In a preferred embodiment of the present invention, the culture period is within 48 hours, more preferably within 40 hours, and even more preferably within 24 hours.
細胞の培養は、当該技術分野で通常なされている条件で行うことができる。例えば、典型的な培養条件としては、３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。培養期間は、細胞培養物の十分な形成、および、細胞分化防止の観点から、好ましくは４８時間以内、より好ましくは４０時間以内、さらに好ましくは２４時間以内である。培養は任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。本発明の方法において、細胞は実質的に増殖しないため、従来の方法のように細胞培養物が所望の大きさに成長するのを待つことなく、所望の大きさおよび形状の細胞培養物を短期間で得ることが可能となる。細胞培養物の大きさや形状は、培養容器の細胞付着面の大きさ・形状を調整すること、または、培養容器の細胞付着面に、所望の大きさ・形状の型枠を設置し、その内部で細胞を培養することなどにより任意に調節することができる。
細胞培養物の基材からの遊離は、細胞培養物が少なくとも部分的に、シート構造を保ったまま、足場となっている基材から遊離できれば特に限定されないが、典型的には、ピペッティングなどによって行う。また、細胞を、温度によって表面の親水性が変化する温度応答性基材上で培養し、形成された細胞培養物を温度変化により、非酵素的に遊離することもできる。
Cell culture can be performed under conditions usually used in the art. For example, typical culture conditions include culture at 37 ° C. and 5% CO 2 . The culture period is preferably within 48 hours, more preferably within 40 hours, and even more preferably within 24 hours, from the viewpoint of sufficient formation of a cell culture and prevention of cell differentiation. Culturing can be performed in containers of any size and shape. In the method of the present invention, since the cells do not substantially proliferate, the cell culture of the desired size and shape can be rapidly transferred without waiting for the cell culture to grow to the desired size as in the conventional method. It becomes possible to get between. The size and shape of the cell culture can be adjusted by adjusting the size and shape of the cell adhesion surface of the culture vessel, or by installing a mold of the desired size and shape on the cell adhesion surface of the culture vessel. It can be arbitrarily adjusted by culturing the cells with, for example.
The release of the cell culture from the base material is not particularly limited as long as the cell culture can be released from the base material serving as a scaffold while at least partially maintaining the sheet structure, but typically pipetting, etc. Do by. It is also possible to culture cells on a temperature-responsive substrate whose surface hydrophilicity changes with temperature, and to release the formed cell culture non-enzymatically due to temperature changes.
本発明はまた、上記製造方法によって作製された細胞培養物、さらには、他家血清、成長因子、ステロイド剤および／またはセレン成分を実質的に含まない細胞培養物、特にシート状の細胞培養物に関する。好ましい態様において、本発明の細胞培養物は、上記成分を含む製造工程由来不純物を実質的に含まない。この細胞培養物は、細胞を、他家血清、成長因子、ステロイド剤および／またはセレン成分を実質的に含まない培養液で培養して、細胞培養物を形成させることにより作製することができる。ここで、細胞培養物が他家血清、成長因子、ステロイド剤および／またはセレン成分を実質的に含まないとは、細胞培養物が、これらの成分を、レシピエントに悪影響を与える濃度で含まないことを少なくとも意味するが、細胞培養物の形成を、他家血清、成長因子、ステロイド剤および／またはセレン成分を実質的に含まない培養液で行うことにより、かかる条件を充足することができる。さらに好ましい態様において、本発明の細胞培養物は、製造工程由来不純物のほか、自己血清も実質的に含まない。ここで、「実質的に含まない」の意味は、上記と同様である。
本発明の細胞培養物は、対象の疾病、傷病の治療に用いることができる。例えば、骨格筋芽細胞による細胞培養物は、心疾患、例えば、心筋梗塞、拡張型心筋症などに、移植片などの形態で用いることができる。したがって、本発明の別の態様は、上記細胞培養物を含む移植片に関する。
The present invention also provides a cell culture produced by the above production method, and further a cell culture substantially free of allogeneic serum, growth factor, steroid agent and / or selenium component, particularly a sheet-shaped cell culture. About. In a preferred embodiment, the cell culture of the present invention is substantially free of manufacturing process-derived impurities containing the above components. This cell culture can be produced by culturing cells in a culture solution substantially free of allogeneic serum, growth factors, steroids and / or selenium components to form a cell culture. Here, the cell culture is substantially free of allogeneic serum, growth factors, steroids and / or selenium components, so that the cell culture does not contain these components at concentrations that adversely affect the recipient. At least that means that the cell culture can be formed in a culture solution that is substantially free of allogeneic serum, growth factors, steroids and / or selenium components. In a further preferred embodiment, the cell culture of the present invention is substantially free from autologous serum in addition to impurities originating from the manufacturing process. Here, the meaning of “substantially free” is the same as described above.
The cell culture of the present invention can be used for treatment of a target disease or injury. For example, a cell culture using skeletal myoblasts can be used in the form of a graft for heart diseases such as myocardial infarction and dilated cardiomyopathy. Accordingly, another aspect of the present invention relates to a graft comprising the above cell culture.
以下に、本発明を具体例に基づいてさらに説明するが、かかる具体例は、本発明の例示であり、本発明を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be further described based on specific examples. However, the specific examples are examples of the present invention and do not limit the present invention.
ヒト骨格筋芽細胞を２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有のＭＣＤＢ１３１培地（GIBCO製）で増殖させた後、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、３％（ｖ／ｖ）ヒト血清アルブミン含有のＭＣＤＢ１３１培地で液体窒素中に凍結保存した。該凍結細胞を３７℃で急速融解後、ＨＢＳＳ(-)で２回洗浄し、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有のＭＣＤＢ１３１培地で懸濁し、細胞非接着性表面を有する浮遊系細胞用のペトリディッシュ（BD製、code:35-1008）に１．０×１０７個／枚（１．０×１０６個／ｃｍ２）の密度で播種した。ディッシュを遠心機（RL-603、TOMY製、TS-9ローター）にセットして、４５０Ｇ（１５００ｒｐｍ）、２０℃で５分遠心した。再度１．０×１０７個／枚（１．０×１０６個／ｃｍ２）の密度で細胞を播種し、ディッシュを左右反転して遠心機にセットし、さらに４５０Ｇ（１５００ｒｐｍ）、２０℃で５分遠心をした。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６時間培養後、ピペッティングによりシート状になった細胞培養物をプレートから剥離させた。比較例として、シートを特開２０１０−２２６９６２の方法を用いて作成した。 Human skeletal myoblasts were grown in 20% (v / v) FBS-containing MCDB131 medium (GIBCO) and then 10% (v / v) DMSO, 3% (v / v) human serum albumin-containing MCDB131 The medium was stored frozen in liquid nitrogen. The frozen cells were rapidly thawed at 37 ° C., then washed twice with HBSS (−), suspended in MCDB131 medium containing 20% (v / v) FBS, and used for suspension cells having a cell non-adhesive surface. Dish (BD, code: 35-1008) was seeded at a density of 1.0 × 10 7 pieces / plate (1.0 × 10 6 pieces / cm 2 ). The dish was set in a centrifuge (RL-603, manufactured by TOMY, TS-9 rotor), and centrifuged at 450 G (1500 rpm) at 20 ° C. for 5 minutes. The cells were seeded again at a density of 1.0 × 10 7 cells / plate (1.0 × 10 6 cells / cm 2 ), the dish was inverted left and right and set in a centrifuge, and further 450G (1500 rpm), 20 ° C. And centrifuged for 5 minutes. After culturing the cells at 37 ° C. and 5% CO 2 for 6 hours, the cell culture formed into a sheet by pipetting was detached from the plate. As a comparative example, a sheet was prepared using the method disclosed in JP2010-226962.
結果を図１および２に示す。一定方向のみで遠心したサンプルは、細胞の偏りがあり非常にもろく、簡単に崩れてしまう（図１）のに対し、左右反転して遠心し、加圧の偏りによる細胞密度の疎密を無くしたサンプルでは、臨床で使用出来うる強固なシート状の細胞培養物の形成が認められた（図２）。 The results are shown in FIGS. Samples centrifuged only in a certain direction are extremely fragile due to cell bias and easily collapse (Fig. 1), while centrifuging left and right and centrifuging to eliminate cell density density due to pressure bias In the sample, the formation of a strong sheet-like cell culture that could be used clinically was observed (FIG. 2).
本発明により、スケールアップにより見出された課題が解決され、より大きなサイズの物理的強度の高い良質のシート状細胞培養物を、簡便な作業で製造することが可能となった。 According to the present invention, the problems found by the scale-up have been solved, and it has become possible to produce a high-quality sheet-like cell culture having a large physical strength and a simple size by a simple operation.
Claims (7)
（ｉ）細胞を基材上に播種する工程、
（ｉｉ）細胞を基材に対して加圧する工程、
（ｉｉｉ）細胞を培養してシート状の細胞培養物を形成する工程、および
（ｉｖ）形成された培養物を基材から遊離させる工程
を含み、ここで工程（ｉ）および（ｉｉ）からなる繰り返しセットが２回以上繰り返され、２回目以降の繰り返しセットにおける播種および／または加圧が、直前の加圧工程終了後における加圧の偏りによる細胞密度の疎密を是正するように行われることを特徴とする、前記方法。 A method for producing a released sheet-shaped cell culture comprising:
(I) seeding cells on a substrate;
(Ii) pressurizing the cell against the substrate;
(Iii) culturing cells to form a sheet-like cell culture, and (iv) releasing the formed culture from the substrate, wherein the steps consist of steps (i) and (ii) The repeated set is repeated two or more times, so that seeding and / or pressurization in the second and subsequent repeat sets is performed so as to correct the density of cells due to the bias of pressurization after the end of the immediately preceding pressurization step. Said method.
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