JP2018033434A - Tip for cell capturing, method of producing same and cell capturing method - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To capture a cell without damaging the same, and to increase the speed of passage of a cell suspension through a hole in a tip for cell capturing.SOLUTION: A tip for cell capturing 10 is comprised of a substrate with a first surface 11 as a main surface, a second surface 12, and a through-hole 13 which penetrates the first surface 11 toward the second surface 12 and can capture a single cell. The through-hole 13 has, in the inside thereof, a constricted part with a diameter less than the opening diameter of the first surface 11 and the opening diameter of the second surface 12, the constricted part being provided in a boundary between an inner wall on the first surface side and an inner wall on the second surface side, the inner wall on the second surface side is a hydrophilic treated surface which promotes the passage of liquid to the second surface side from the first surface side.SELECTED DRAWING: Figure 2

Description

本発明は、細胞懸濁液から単一細胞を捕捉可能で、細胞の性状や機能などの解析に好適な細胞捕捉チップ、その製造方法および細胞捕捉方法に関する。   The present invention relates to a cell capture chip capable of capturing a single cell from a cell suspension and suitable for analysis of cell properties and functions, a method for producing the same, and a cell capture method.

従来、下記特許文献１〜４に開示されているように、基板に多数の孔を２次元配列して、各孔に細胞を捕捉することで、孔の座標により細胞を特定してその性状や機能の分析を行うことが知られている。   Conventionally, as disclosed in the following Patent Documents 1 to 4, a plurality of holes are two-dimensionally arranged on a substrate, and cells are captured in each hole. It is known to perform functional analysis.

特許文献１において、Ｓｉ基板に細胞を捕捉する碗状凹部とその底部に連続する吸引孔から成る多数の貫通孔を２次元配列した細胞捕捉チップが知られている。この細胞捕捉チップでは、吸引孔からの吸引により細胞が碗状凹部に捕捉される。また、特許文献２によると、特許文献１に開示された構造と同様に、碗状凹部とその底部に連続する径のより小さな貫通孔とを有した構造において、碗状凹部の内壁面の一部は疎水処理が、貫通孔の内壁面には親水処理が施されている。貫通孔に液体が入り込む毛細管現象を利用して細胞を碗状凹部に捕捉するものである。   In Patent Document 1, there is known a cell trapping chip in which a plurality of through-holes including a bowl-shaped recess for trapping cells on a Si substrate and suction holes continuous at the bottom thereof are two-dimensionally arranged. In this cell trapping chip, cells are trapped in the bowl-shaped recess by suction from the suction hole. Further, according to Patent Document 2, similar to the structure disclosed in Patent Document 1, in a structure having a bowl-shaped recess and a through-hole having a smaller diameter continuous with the bottom, one of the inner wall surfaces of the bowl-shaped recess is provided. The part is subjected to hydrophobic treatment, and the inner wall surface of the through hole is subjected to hydrophilic treatment. The cells are trapped in the bowl-shaped recess using a capillary phenomenon in which liquid enters the through-hole.

また、特許文献３においては、基板をＰＥＴ樹脂として、２次元配列させる孔を、細胞を取り入れる側の開口の径が液体を流出させる側の開口の径よりも小さい、反すり鉢状とし、細胞懸濁液を孔に導入する流路内面を非イオン性活性剤で処理することが行われている。これにより孔の吐出口から吸引することによる細胞の破壊の防止と、導入流路に細胞が付着することが防止されている。   Also, in Patent Document 3, the holes for two-dimensional arrangement are made of PET resin, the diameter of the opening on the side for taking in the cells is smaller than the diameter of the opening on the side for flowing out the liquid, and the cell suspension is formed. Treatment of the inner surface of the flow path for introducing the turbid liquid into the pores with a nonionic active agent is performed. This prevents the destruction of the cells by suction from the discharge port of the hole and prevents the cells from adhering to the introduction channel.

さらに、特許文献４においては、細胞を捕捉する孔を２次元配列させたマイクロアレイチップにおいて、基板をポリスチレンなどの疎水性材料で構成した場合には、基板の表面を酸素プラズマ処理などの親水化処理を施すことが望ましく、基板をガラスなどの親水材料で構成した場合には、基板表面を親水化処理することが必要ではないとしている。   Further, in Patent Document 4, in a microarray chip in which holes for capturing cells are two-dimensionally arranged, when the substrate is made of a hydrophobic material such as polystyrene, the surface of the substrate is subjected to a hydrophilic treatment such as oxygen plasma treatment. In the case where the substrate is made of a hydrophilic material such as glass, it is not necessary to hydrophilize the substrate surface.

特開２００７−２２２１３２号公報JP 2007-222132 A 特許第５０８１８５４号公報Japanese Patent No. 5081854 特許第５２７８９１３号公報Japanese Patent No. 5278913 特許第５７７７０４５号公報Japanese Patent No. 5777045

しかしながら、上記特許文献１、３に開示のマイクロアレイチップは、孔の吐出口から吸引することで、細胞を孔に捕捉するチップであるので、細胞に損傷を与えるという問題があった。また、特許文献２によると細胞を捕捉する径の大きな碗状凹部とその底部に連続する径のより小さな貫通孔とを設けることが必要であり、さらには、碗状凹部には疎水処理、貫通孔には親水処理を必要とするために、加工が複雑になるという問題がある。また、特許文献４に開示のマイクロアレイチップは、樹脂製基板の表面にプラズマを照射して、接触角が所定範囲に制御された親水性を持たせることで、基板表面に細胞懸濁液を滴下して孔に細胞を捕捉するようにしている。しかしながら、基板表面における細胞懸濁液の流動性は向上しても、孔内部での親水性については示唆がなく、細胞懸濁液における分散媒の通過速度が未だ高くないという問題がある。   However, since the microarray chip disclosed in Patent Documents 1 and 3 is a chip that captures a cell in a hole by suction from the discharge port of the hole, there is a problem in that the cell is damaged. Further, according to Patent Document 2, it is necessary to provide a large bowl-shaped recess for capturing cells and a through-hole having a smaller diameter continuous with the bottom thereof. Since the hole requires hydrophilic treatment, there is a problem that processing becomes complicated. In addition, the microarray chip disclosed in Patent Document 4 irradiates plasma on the surface of a resin substrate to give hydrophilicity with a contact angle controlled within a predetermined range, thereby dropping a cell suspension on the surface of the substrate. And trap the cells in the pores. However, even if the fluidity of the cell suspension on the substrate surface is improved, there is no suggestion about the hydrophilicity inside the pores, and there is a problem that the passing speed of the dispersion medium in the cell suspension is not yet high.

そこで、本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、細胞に損傷を与えることなく細胞を捕捉し、細胞捕捉チップの孔において細胞懸濁液における分散媒の通過速度を向上させることを目的とする。   Therefore, the present invention has been made to solve the above-described problems, captures cells without damaging the cells, and improves the passage speed of the dispersion medium in the cell suspension in the pores of the cell capture chip. The purpose is to let you.

本発明の細胞捕捉チップは、主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通する、単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板からなり、前記貫通孔は、その内部において、前記第１面の開口径および第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有し、かつ、前記くびれ部を境界とする第２面側内壁が、前記第１面側から前記第２面側に液体の通過を促進させる親水化処理面であることを特徴とする。   The cell trapping chip of the present invention includes a substrate having a first surface and a second surface as main surfaces, and a through-hole penetrating from the first surface toward the second surface and capable of capturing a single cell. And the through hole has a constricted portion whose diameter is smaller than the opening diameter of the first surface and the opening diameter of the second surface, and the inner wall on the second surface with the constricted portion as a boundary. Is a hydrophilic treatment surface that promotes the passage of liquid from the first surface side to the second surface side.

本発明の他の細胞捕捉チップは、主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通する、単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板からなり、前記貫通孔は、その内部において、前記第１面の開口径および第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有し、かつ、前記くびれ部を境界とする第２面側内壁が、純水の滴下直後の動的接触角が３０度以下となる親水化処理面であることを特徴とする。   Another cell capture chip of the present invention has a first surface and a second surface as main surfaces, and a through-hole penetrating from the first surface toward the second surface and capable of capturing a single cell. The through-hole has a constricted portion having a diameter smaller than the opening diameter of the first surface and the opening diameter of the second surface, and the second surface has the constricted portion as a boundary. The inner side wall is a hydrophilic treatment surface having a dynamic contact angle of 30 degrees or less immediately after dropping pure water.

本発明の細胞捕捉チップの製造方法は、主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通し、その内部において、前記第１面の開口径および前記第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有する単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板に対し、前記貫通孔の前記くびれ部を境界とする第２面側内壁に、前記第１面側から前記第２面側に液体の通過を促進させる親水化処理を施すことを特徴とする。   The method for producing a cell trapping chip of the present invention includes a first surface and a second surface as main surfaces, and penetrating from the first surface toward the second surface, and in the inside thereof, an opening diameter of the first surface and A substrate having a through-hole capable of capturing a single cell having a constricted portion whose diameter is smaller than the opening diameter of the second surface, on a second surface side inner wall having the constricted portion of the through-hole as a boundary A hydrophilization treatment for promoting the passage of liquid from the first surface side to the second surface side is performed.

本発明の他の細胞捕捉チップの製造方法は、主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通し、その内部において、前記第１面の開口径および前記第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有する単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板に対し、前記貫通孔の前記くびれ部を境界とする第２面側内壁に、純水の滴下直後の動的接触角が３０度以下となる親水化処理を施すことを特徴とする。   Another method for producing a cell-trapping chip of the present invention includes a first surface and a second surface as main surfaces, and penetrating from the first surface toward the second surface, and the first surface is opened inside the first surface and the second surface. The second surface side having the narrowed portion of the through-hole as a boundary with respect to the substrate having a diameter and a through-hole capable of capturing a single cell having a narrowed portion smaller than the opening diameter of the second surface The inner wall is subjected to a hydrophilization treatment in which the dynamic contact angle immediately after dropping pure water is 30 degrees or less.

本発明の細胞捕捉方法は、上記本発明の細胞捕捉チップの前記第１面に、細胞懸濁液を滴下して、前記貫通孔に単一細胞を捕捉させることを特徴とする。   The cell trapping method of the present invention is characterized in that a cell suspension is dropped onto the first surface of the cell trapping chip of the present invention so that a single cell is trapped in the through hole.

なお、本明細書において「親水化処理面」とは、上記基板において親水化処理を施された面を言い、処理前よりも処理後において親水性が高められたものを指す。このような親水化処理面は、例えば、貫通孔において、上記基板の第１面側から第２面側への液体の通過を促進させるために設けられる。また、この親水化処理面の親水性は、動的接触角測定によって評価される。なお、本明細書における動的接触角測定は、細胞捕捉チップの基板とは、貫通孔のあいていない点のみ異なる単なる平板状の基板表面に、純水を滴下した直後の動的接触角を測定して行われる。   In the present specification, the “hydrophilic treatment surface” refers to a surface of the substrate that has been subjected to a hydrophilic treatment, and indicates a surface having improved hydrophilicity after treatment than before treatment. Such a hydrophilic treatment surface is provided, for example, in the through hole in order to promote the passage of the liquid from the first surface side to the second surface side of the substrate. Further, the hydrophilicity of the hydrophilized surface is evaluated by dynamic contact angle measurement. In addition, the dynamic contact angle measurement in this specification is based on the dynamic contact angle immediately after dropping pure water on the surface of a simple flat substrate that differs from the substrate of the cell trapping chip only in that there are no through holes. It is done by measuring.

この動的接触角の測定は、基板の側面にＣＣＤカメラ等の撮像装置を設置し、基板の主面上に滴下された純水の状態を経時的に観察して行う。上記発明における動的接触角は、滴下直後（滴下後０秒）の撮影画像における接触角をいう。   The dynamic contact angle is measured by installing an imaging device such as a CCD camera on the side surface of the substrate and observing the state of pure water dropped on the main surface of the substrate over time. The dynamic contact angle in the said invention means the contact angle in the picked-up image immediately after dripping (0 second after dripping).

本発明の細胞捕捉チップ、細胞捕捉チップの製造方法および細胞捕捉方法によれば、吸引などの外力を用いることなく貫通孔に細胞懸濁液における分散媒を通過させると共に、目的とする細胞をトラップできるため、細胞に損傷を与えることなく該貫通孔に細胞を捕捉できる。さらに、本発明の細胞捕捉チップは、貫通孔における細胞懸濁液の通過速度を向上させたものであるため、細胞の捕捉操作を効率的に行うことができる。   According to the cell trapping chip, the method for manufacturing a cell trapping chip, and the cell trapping method of the present invention, the dispersion medium in the cell suspension is passed through the through-hole without using an external force such as suction, and the target cell is trapped. Therefore, the cells can be captured in the through-hole without damaging the cells. Furthermore, since the cell capture chip of the present invention has an improved passage speed of the cell suspension in the through-hole, the cell capture operation can be performed efficiently.

本発明の一実施例に係る細胞捕捉チップの構成を示した平面図。The top view which showed the structure of the cell trapping chip concerning one Example of this invention. 図１Ａに示した細胞捕捉チップのＡ−Ａ断面図。FIG. 1B is a cross-sectional view of the cell capture chip shown in FIG. 図１Ａに示した貫通孔１３を説明するための拡大図。The enlarged view for demonstrating the through-hole 13 shown to FIG. 1A. 孔あき基板のミクロな接触角について説明する図。The figure explaining the micro contact angle of a perforated board | substrate. ミクロな接触角αとマクロな接触角βとの関係を示したグラフ。The graph which showed the relationship between micro contact angle (alpha) and macro contact angle (beta).

以下、本発明について図面を参照しながら詳細に説明する。なお、本発明は下記の実施形態に限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings. In addition, this invention is not limited to the following embodiment.

＜細胞捕捉チップ＞
本発明の一実施形態である細胞捕捉チップ１０は、図１Ａおよび図１Ｂに示したように孔あき基板からなり、この孔あき基板は、主面として、第１面１１と第２面１２とを有し、さらに、この第１面１１から第２面１２に向けて貫通する、単一細胞を捕捉可能な貫通孔１３、を有する板状体である。なお、図１Ａは、本発明の一実施形態である細胞捕捉チップ１０の平面図を、図１Ｂは、図１Ａに示した細胞捕捉チップ１０のＡ−Ａ断面図を示している。また、図１Ｃは、図１Ａおよび図１Ｂに示した貫通孔１３を説明するための拡大図である。 <Cell capture chip>
As shown in FIGS. 1A and 1B, the cell trapping chip 10 according to an embodiment of the present invention includes a perforated substrate. The perforated substrate has a first surface 11 and a second surface 12 as main surfaces. And a through-hole 13 penetrating from the first surface 11 toward the second surface 12 and capable of capturing a single cell. 1A is a plan view of the cell trapping chip 10 according to an embodiment of the present invention, and FIG. 1B is a cross-sectional view taken along line AA of the cell trapping chip 10 shown in FIG. 1A. FIG. 1C is an enlarged view for explaining the through hole 13 shown in FIGS. 1A and 1B.

この細胞捕捉チップ１０は、細胞を捕捉するために用いられ、一方の主面（第１面１１）に細胞懸濁液を滴下した際、細胞懸濁液における分散媒は貫通孔１３を通過し、他方の主面（第２面１２）から排出され、細胞懸濁液中に含まれる細胞を貫通孔１３に捕捉する。すなわち、この細胞捕捉チップ１０はフィルターとして用いられる。なお、本明細書において「分散媒」とは、上記のように細胞懸濁液において、細胞を分散させている液体成分をいう。   The cell trapping chip 10 is used for trapping cells. When the cell suspension is dropped onto one main surface (first surface 11), the dispersion medium in the cell suspension passes through the through-holes 13. The cells contained in the cell suspension are trapped in the through-hole 13 after being discharged from the other main surface (second surface 12). That is, this cell capture chip 10 is used as a filter. In the present specification, the “dispersion medium” refers to a liquid component in which cells are dispersed in a cell suspension as described above.

このような用途に適するように、細胞捕捉チップ１０を構成する孔あき基板は平板状であり、その厚さは５０μｍ〜５００μｍが好ましく、７５μｍ〜４００μｍがより好ましく、１００μｍ〜３００μｍが特に好ましい。孔あき基板の厚さが５０μｍ以上であればハンドリング性が良好で、５００μｍ以下であれば圧力損失を不必要に大きくすることなく細胞懸濁液を通過させることができ、また、孔加工する際にも加工量が減少するため好ましい。   In order to be suitable for such applications, the perforated substrate constituting the cell trapping chip 10 has a flat plate shape, and the thickness is preferably 50 μm to 500 μm, more preferably 75 μm to 400 μm, and particularly preferably 100 μm to 300 μm. When the thickness of the perforated substrate is 50 μm or more, the handling property is good, and when the thickness is 500 μm or less, the cell suspension can be passed without unnecessarily increasing the pressure loss. Further, it is preferable because the processing amount is reduced.

この細胞捕捉チップ１０は、細胞懸濁液が上記貫通孔１３を通過でき、その際、貫通孔１３に単一細胞を捕捉できるものであれば、その材質は特に限定されずに使用できる。ここで用いることができる材質としては、例えば、ガラス、樹脂、セラミックス、金属等が挙げられ、なかでも細胞を観察する観点からは、透明であり、自家蛍光が少ないガラスが好ましい。   The cell capture chip 10 can be used without any particular limitation as long as the cell suspension can pass through the through-hole 13 and can capture a single cell in the through-hole 13. Examples of the material that can be used here include glass, resin, ceramics, metal, and the like, and from the viewpoint of observing cells, glass that is transparent and has little autofluorescence is preferable.

第１面１１、第２面１２は共に、上記したように、細胞捕捉チップ１０の主面であり、本明細書では、第１面１１は、細胞懸濁液が滴下、供給される面であり、第２面１２は、貫通孔１３を通過した細胞懸濁液における分散媒が排出される面とする。   Both the first surface 11 and the second surface 12 are the main surfaces of the cell trapping chip 10 as described above. In this specification, the first surface 11 is a surface on which a cell suspension is dropped and supplied. The second surface 12 is a surface from which the dispersion medium in the cell suspension that has passed through the through hole 13 is discharged.

貫通孔１３は、上記第１面１１から上記第２面１２に向かって貫通しており、この貫通孔１３は、その内部に、第１面１１における開口径および第２面１２における開口径よりも径の小さいくびれ部を有している。このように、開口径は大きくしながら、径の小さい部分を基板内部に形成することで、単一細胞を貫通孔の形成部分に誘導すると共に、該貫通孔による捕捉を可能としている。   The through-hole 13 penetrates from the first surface 11 toward the second surface 12, and the through-hole 13 has an opening diameter in the first surface 11 and an opening diameter in the second surface 12 therein. Also has a constricted portion with a small diameter. As described above, by forming a small-diameter portion inside the substrate while increasing the opening diameter, a single cell is guided to the through-hole forming portion and can be captured by the through-hole.

ここで、図１Ｃには、細胞捕捉チップ１０に設けられた貫通孔１３の拡大図を示した。図１Ｃの（ａ）は貫通孔１３における内壁とくびれ部の位置を説明するための図であり、図１Ｃの（ｂ）は貫通孔１３の径と内壁の傾斜角度θを説明するための図であり、図１Ｃの（ｃ）は、貫通孔１３において、細胞懸濁液滴下後の第２面側内壁１３ｂにおける分散媒の状態を説明する図である。   Here, FIG. 1C shows an enlarged view of the through hole 13 provided in the cell trapping chip 10. FIG. 1C is a diagram for explaining the positions of the inner wall and the constricted portion in the through hole 13, and FIG. 1C is a diagram for explaining the diameter of the through hole 13 and the inclination angle θ of the inner wall. FIG. 1C is a diagram for explaining the state of the dispersion medium on the second surface side inner wall 13b after the cell suspension is dropped in the through hole 13.

図１Ｃの（ａ）に示したように、貫通孔１３は、第１面側内壁１３ａと、第２面側内壁１３ｂと、くびれ部１３ｃと、から構成される。第１面側内壁１３ａと第２面側内壁１３ｂとは、くびれ部１３ｃを境界として分けられる。   As shown to (a) of FIG. 1C, the through-hole 13 is comprised from the 1st surface side inner wall 13a, the 2nd surface side inner wall 13b, and the constriction part 13c. The first surface side inner wall 13a and the second surface side inner wall 13b are divided with the constricted portion 13c as a boundary.

この貫通孔１３は、第１面１１からくびれ部１３ｃに向かって徐々に径が狭くなる逆円錐形状の孔と、くびれ部１３ｃから第２面１２に向かって徐々に径が広くなる円錐形状の孔が連通して形成されている。   The through hole 13 has an inverted conical hole whose diameter gradually decreases from the first surface 11 toward the constricted portion 13c, and a conical shape whose diameter gradually increases from the constricted portion 13c toward the second surface 12. A hole is formed in communication.

図１Ｃ（ａ）〜図１Ｃ（ｃ）では、このくびれ部１３ｃは基板の細胞捕捉チップ１０の厚さ方向における中心位置に設けられ、第１面側内壁１３ａと第２面側内壁１３ｂとがくびれ部１３ｃを挟んで対称となる形状に形成されている。   In FIG. 1C (a) to FIG. 1C (c), the constricted portion 13c is provided at the center position of the substrate in the thickness direction of the cell trapping chip 10, and the first surface side inner wall 13a and the second surface side inner wall 13b are provided. It is formed in a symmetrical shape with the constricted portion 13c interposed therebetween.

ただし、このくびれ部１３ｃは、上記中心位置に限定されず、基板の板厚方向において、第１面１１側に近くても、第２面１２側に近くても、いずれでもよい。例えば、図１Ｃ（ｂ）に示したように、第１面１１から第２面１２までの板厚をＬとしたとき、くびれ部の位置は、０．２Ｌ〜０．８Ｌの範囲が好ましく、０．３Ｌ〜０．７Ｌの範囲がより好ましく、０．４Ｌ〜０．６Ｌの範囲がさらに好ましい。   However, the constricted portion 13c is not limited to the center position, and may be either close to the first surface 11 side or close to the second surface 12 side in the thickness direction of the substrate. For example, as shown in FIG. 1C (b), when the plate thickness from the first surface 11 to the second surface 12 is L, the position of the constricted portion is preferably in the range of 0.2L to 0.8L. The range of 0.3L to 0.7L is more preferable, and the range of 0.4L to 0.6L is more preferable.

このくびれ部の径ｒｃは、細胞懸濁液の種類、捕捉対象とする細胞の種類、大きさ、変形能力等により、単一の細胞が捕捉できるように適宜設定できる。このくびれ部の径ｒｃとしては、例えば、１〜３０μｍの範囲が好ましく、５〜２０μｍがより好ましい。   The diameter rc of the constricted portion can be appropriately set so that a single cell can be captured depending on the type of cell suspension, the type, size, deformability, and the like of cells to be captured. As the diameter rc of the constricted portion, for example, a range of 1 to 30 μm is preferable, and 5 to 20 μm is more preferable.

貫通孔１３の第１面の開口径ｒ１および第２面の開口径ｒ２は、くびれ部の径ｒｃよりも大きい径である。これら開口径ｒ１およびｒ２は、それぞれ独立に、５０〜２００μｍが好ましく、６０〜１５０μｍがより好ましく、７０〜１００μｍがさらに好ましい。また、くびれ部の径ｒｃの径に対して、４〜２０倍が好ましく、６〜１６倍がより好ましく、８〜１２倍がさらに好ましい。   The opening diameter r1 of the first surface and the opening diameter r2 of the second surface of the through hole 13 are larger than the diameter rc of the constricted portion. These opening diameters r1 and r2 are each independently preferably 50 to 200 μm, more preferably 60 to 150 μm, and even more preferably 70 to 100 μm. Moreover, 4-20 times are preferable with respect to the diameter rc of the constriction part, 6-16 times are more preferable, and 8-12 times are further more preferable.

このように、くびれ部の径ｒｃに対して、第１面の開口径ｒ１を大きくすることで、捕捉したい細胞を貫通孔１３ｃに導入しやすくすると共に、圧力損失を増大させないようにできる。また、くびれ部の径ｒｃに対して、第２面の開口径ｒ２を大きくすることで、同様に圧力損失を増大させないようにすると共に、細胞懸濁液における分散媒を排出しやすくできる。   Thus, by increasing the opening diameter r1 of the first surface with respect to the diameter rc of the constricted portion, it is possible to facilitate introduction of cells to be captured into the through-hole 13c and not to increase pressure loss. Further, by increasing the opening diameter r2 of the second surface with respect to the diameter rc of the constricted portion, it is possible not to increase the pressure loss, and to easily discharge the dispersion medium in the cell suspension.

また、貫通孔１３が図１Ａ〜図１Ｃに示した、２つの円錐状の頂点を重ねて結合したような砂時計型の形状である場合、第１面側内壁１３ａおよび第２面側内壁１３ｂのそれぞれの傾斜面について、細胞懸濁液における分散媒を自律的に第１面から第２面へ移動させ、排出を促進できる理由について、以下説明する。   Further, when the through hole 13 has an hourglass shape as shown in FIGS. 1A to 1C in which two conical apexes are overlapped and joined, the first surface side inner wall 13a and the second surface side inner wall 13b The reason why the dispersion medium in the cell suspension can be autonomously moved from the first surface to the second surface for each inclined surface to facilitate the discharge will be described below.

まず、図１Ｃ（ｂ）に示すように、径ｒｃのくびれ部１３ｃから径ｒ２の第２面開口に向かう第２面側内壁１３ｂにおいて、その壁面の貫通孔１３の軸に対する傾斜角度を傾斜角θと定義する。別の表現をすれば、図１Ｃ（ｂ）は貫通孔１３の中心軸に沿って切断した断面図を表すが、傾斜角θは、その断面図における第２面側内壁１３ｂの切断線と貫通孔１３の軸とのなす角度と言うこともできる。   First, as shown in FIG. 1C (b), in the second surface side inner wall 13b from the constricted portion 13c having the diameter rc to the second surface opening having the diameter r2, the inclination angle of the wall surface with respect to the axis of the through hole 13 is set to the inclination angle. It is defined as θ. In other words, FIG. 1C (b) shows a cross-sectional view cut along the central axis of the through-hole 13, and the inclination angle θ is the cutting line and the through-line of the second surface side inner wall 13b in the cross-sectional view. It can also be said to be an angle formed with the axis of the hole 13.

図１Ｃに示した第２面側内壁１３ｂのような、下方に末広がりのテーパー孔形状（円錐の逆形状）において、くびれ部１３ｃから第２面１２の開口に向かって分散媒が移動する際の原理について、図１Ｃ（ｃ）を参照しながら以下説明する。この分散媒の移動に際して、分散媒は、その表面エネルギーγにより、第２面側内壁１３ｂではミクロな接触角α_１をもって、メニスカス凹面（第２面１２に向かって凹面を有する）を形成する。ここでミクロな接触角α_１は、第２面側内壁１３ｂにおけるミクロな接触角を表す。このミクロな接触角α_１も含めミクロな接触角αについては後述する。このメニスカス凹面の曲率半径をＲとすれば、毛管力は２γｃｏｓ（α_１）／Ｒとなり、主に分散媒の表面エネルギーにより決定されることがわかる。また、表面エネルギーは分散媒の物性値で決まるが、この毛管力はミクロな接触角α_１によっても大きく影響されることがわかる。 When the dispersion medium moves from the constricted portion 13c toward the opening of the second surface 12 in a tapered hole shape (the reverse shape of the cone) spreading downward at the bottom like the second surface side inner wall 13b shown in FIG. 1C. The principle will be described below with reference to FIG. 1C (c). During movement of the dispersion medium, the dispersion medium, the surface energy gamma, with the contact angle alpha ₁ in the micro second surface side inner wall 13b, forming a meniscus concave (having a concave surface toward the second surface 12). Here, the micro contact angle α ₁ represents the micro contact angle at the second surface side inner wall 13b. The micro contact angle α including the micro contact angle α ₁ will be described later. If the radius of curvature of the meniscus concave surface is R, it can be seen that the capillary force is 2γcos (α ₁ ) / R, which is mainly determined by the surface energy of the dispersion medium. Further, the surface energy is determined by the physical properties of the dispersion medium, the capillary force is understood to be greatly affected by microscopic contact angle alpha _1.

ここで、第２面１２から分散媒の排出を促進するためには、毛管力とメニスカス凹面の曲率半径Ｒがそれぞれ所定の範囲であることが必要とされる。メニスカス凹面の曲率半径Ｒが顕著に小さいと、開口の中心位置での液面の凹面の凹み変位量が大きくなり、第２面１２での分散媒の排出促進が難しくなる。一方で、メニスカス凹面の曲率半径Ｒが大きすぎると毛管力が不足して、やはり分散媒の排出の促進が難しくなってしまう。   Here, in order to promote the discharge of the dispersion medium from the second surface 12, the capillary force and the radius of curvature R of the meniscus concave surface are required to be in a predetermined range, respectively. When the curvature radius R of the meniscus concave surface is remarkably small, the amount of concave displacement of the concave surface of the liquid surface at the center position of the opening becomes large, and it becomes difficult to promote the discharge of the dispersion medium on the second surface 12. On the other hand, if the curvature radius R of the meniscus concave surface is too large, the capillary force is insufficient, and it becomes difficult to promote the discharge of the dispersion medium.

そこで、上記傾斜角θを考慮すれば、ミクロな接触角α_１とは、傾斜面に対して接触角α_１が構成されるので、傾斜角θが大きいほど凹面の曲率半径Ｒが大きくなる。すなわち、ミクロな接触角α_１が表面の特性で決まっていると、傾斜角θに接触角α_１を加えた形で、メニスカス凹面が形成される。例えば、親水化処理されたガラスのミクロな接触角α_１を１５度とすれば、傾斜角θをもたない直管では、メニスカス凹面が顕著であり、開口の中心位置での液面の凹面の凹み変位量が大きい（つまり、液面の曲率半径Ｒが小さい）。 Therefore, in light of the above inclination angle theta, and the microscopic contact angle alpha _1, the contact angle alpha ₁ is configured for the inclined surface, the concave surface of radius of curvature R is increased larger inclination angle theta is. That is, when the micro contact angle α ₁ is determined by the surface characteristics, the meniscus concave surface is formed by adding the contact angle α ₁ to the inclination angle θ. For example, if the microscopic contact angle alpha ₁ of glass which is hydrophilized and 15 degrees, in the straight pipe with no inclination angle theta, the meniscus concave is remarkable, concave liquid surface at the center position of the opening The dent displacement amount is large (that is, the curvature radius R of the liquid surface is small).

一方で、傾斜角θをもうけると、実質（α_１＋θ）の角度のメニスカス凹面を形成できるので、開口中心での凹み変位を小さくできる。そのため、毛管力で駆動された分散媒を第２面の面位置になるべく近くすることができ、第２面からの分散媒の排出を促進することができる。 On the other hand, when the inclination angle θ is provided, a meniscus concave surface having a substantial (α ₁ + θ) angle can be formed, so that the concave displacement at the center of the opening can be reduced. Therefore, the dispersion medium driven by the capillary force can be brought as close as possible to the surface position of the second surface, and the discharge of the dispersion medium from the second surface can be promoted.

しかし、傾斜角θをあまり大きくしてしまうと開口部面積が大きくなることで孔密度が低くなってしまいフィルター用途には不適となる。これらのことを鑑みて、第２面側内壁１３ｂは２０〜６０度の傾斜角θを有するように形成されることが好ましい。この傾斜角θは３０〜５５度がより好ましく、３５〜５０度がさらに好ましい。
また、この第１面側内壁１３ａと第２面側内壁１３ｂの傾斜面の角度は、それぞれ独立に設けてもよい。 However, if the inclination angle θ is increased too much, the area of the opening is increased, resulting in a decrease in the hole density, which is not suitable for a filter application. In view of these matters, the second surface side inner wall 13b is preferably formed to have an inclination angle θ of 20 to 60 degrees. The inclination angle θ is more preferably 30 to 55 degrees, and further preferably 35 to 50 degrees.
Moreover, you may provide the angle of the inclined surface of this 1st surface side inner wall 13a and the 2nd surface side inner wall 13b each independently.

そして、本実施形態においては、貫通孔１３の第２面側内壁１３ｂが親水化処理面であることを特徴とする。
ここで、本明細書において「親水化処理面」とは、上記基板において親水化処理を施された面を言い、処理前よりも処理後において親水性が高められたものを指す。このような親水化処理面は、本発明の１実施形態によれば、貫通孔１３において、上記基板の第１面１１側から第２面１２側への液体の通過を促進させるために設けられる。また、この親水化処理面の親水性は、動的接触角測定によって評価される。なお、本明細書における動的接触角測定は、細胞捕捉チップの基板とは、貫通孔のあいていない点のみ異なる単なる平板状の基板表面に、純水を滴下した直後の動的接触角を測定して行われる。本発明の一実施形態においては、この測定における動的接触角が３０度以下となる親水化処理面を有することが特徴である。 And in this embodiment, the 2nd surface side inner wall 13b of the through-hole 13 is a hydrophilic treatment surface, It is characterized by the above-mentioned.
Here, the “hydrophilic treatment surface” in this specification refers to a surface of the substrate that has been subjected to a hydrophilic treatment, and indicates a surface having improved hydrophilicity after the treatment than before the treatment. According to one embodiment of the present invention, such a hydrophilic treatment surface is provided in order to promote the passage of the liquid from the first surface 11 side to the second surface 12 side of the substrate in the through hole 13. . Further, the hydrophilicity of the hydrophilized surface is evaluated by dynamic contact angle measurement. In addition, the dynamic contact angle measurement in this specification is based on the dynamic contact angle immediately after dropping pure water on the surface of a simple flat substrate that differs from the substrate of the cell trapping chip only in that there are no through holes. It is done by measuring. One embodiment of the present invention is characterized by having a hydrophilized surface that has a dynamic contact angle of 30 degrees or less in this measurement.

なお、貫通孔があいている基板でミクロな接触角αを測定しようとすると、貫通孔の形状や貫通孔ピッチの影響を受け、マクロな接触角βとなってしまう。そのため、本明細書においては、貫通孔のあいていない基板で同様の表面処理をした場合の動的接触角測定の測定結果により親水化処理面の性状を定義する。すなわち、ミクロな接触角αは、その評価対象の表面と同等の表面状態を有する、単なる平板状の基板表面で測定した動的接触角と同視できるものである。
このように第２面側内壁１３ｂが親水性を有することで、細胞懸濁液における分散媒の通過を促進させることができ、通過速度を向上できる。 If a micro contact angle α is to be measured on a substrate having a through hole, the contact angle β becomes macro under the influence of the shape of the through hole and the through hole pitch. Therefore, in this specification, the property of a hydrophilization treatment surface is defined by the measurement result of the dynamic contact angle measurement when the same surface treatment is performed on a substrate having no through hole. That is, the micro contact angle α can be equated with a dynamic contact angle measured on a mere flat substrate surface having a surface state equivalent to the surface to be evaluated.
Thus, the 2nd surface side inner wall 13b has hydrophilicity, can promote the passage of the dispersion medium in a cell suspension, and can improve a passage speed.

以下、マクロな（見かけの）接触角βとミクロな接触角αの関係性について説明する。
細胞捕捉チップ１０の第１面１１、第２面１２にはそれぞれ開口が設けられているため、数μｌの微量な分散媒を基板上に滴下して計測されるマクロな接触角βは、開口の傾斜角θに大きく依存する。Ｃａｓｓｉｅによって異なる接触角α_Ｃ ^（１）ならびにα_Ｃ ^（２）をもつ物質が混在している表面では、それらの占有率ｆ_１ならびにｆ_２によって、マクロな接触角β_Ｃがｃｏｓ（β_Ｃ）＝ｆ_１ｃｏｓ（α_Ｃ ^（１））＋ｆ_２ｃｏｓ（α_Ｃ ^（２））で表されるとした。 Hereinafter, the relationship between the macro (apparent) contact angle β and the micro contact angle α will be described.
Since the first surface 11 and the second surface 12 of the cell trapping chip 10 are each provided with an opening, the macro contact angle β measured by dropping a small amount of a small dispersion medium on the substrate is Greatly depends on the inclination angle θ. On the surface where substances having different contact angles α _C ⁽¹⁾ and α _C ⁽²⁾ are mixed depending on Cassie, the macro contact angle β _C is cos (β _C ) depending on their occupation ratios f ₁ and f ₂ . = F ₁ cos (α _C ⁽¹⁾ ) + f ₂ cos (α _C ⁽²⁾ )

そこで、孔が設けられた基板表面における接触角について以下説明する。
まず、図２のように、例えば、基板に、ピッチ１００μｍで開けられたφ８０μｍの開口をもつ孔が設けられており、基板表面と孔内壁との表面状態（親水性）が同一であって、該基板に分散媒の液滴がφ５００μｍ以上で表面に滴下された場合のマクロな接触角βについて説明する。 Therefore, the contact angle on the substrate surface provided with the holes will be described below.
First, as shown in FIG. 2, for example, the substrate is provided with holes having openings of φ80 μm opened at a pitch of 100 μm, and the surface state (hydrophilicity) of the substrate surface and the inner wall of the hole is the same, A macro contact angle β when a dispersion medium droplet is dropped on the surface with a diameter of 500 μm or more on the substrate will be described.

なお、マクロな接触角βを説明するにあたって、先にミクロな接触角αについて説明する。図２（ａ）には、開口径と同じ径で垂直に開けられた孔（貫通していない）の場合、図２（ｂ）に図１Ａ〜１Ｃに示したテーパー状の孔（貫通している）の場合、における各部におけるミクロな接触角について示している。   In describing the macro contact angle β, the micro contact angle α will be described first. In FIG. 2 (a), in the case of a hole (not penetrating) perpendicular to the same diameter as the opening diameter, the tapered hole (penetrating through) shown in FIG. In this case, the micro contact angle in each part is shown.

まず、図２（ａ）に示す垂直に開けられた孔の場合について説明する。この図２（ａ）の（１’）平坦部ではミクロな接触角αをもっている。これは孔の形成されていない平板状の基板表面における動的接触角と同視できる。また、図２（ａ）、（ｂ）において、基板表面に円弧状の実線で示したのは、純水の液滴の輪郭を表し、その輪郭の接線（破線）はミクロな接触角αを示すものである。次に（２’）平坦部と孔との境界部分においては、垂直に開けられた孔の場合境界に達した時点で、αに孔の側面の傾斜角度（９０度）が加わり、（９０＋α）度になり、（３’）内壁面に接している状態では、（２’）と同様に（９０＋α）度である。さらに、（４’）反対の内壁面では、メニスカス凹面になるため、開口は液体で満たされ、再び平坦面での接触角を示す。   First, the case of the vertically opened holes shown in FIG. The (1 ') flat portion in FIG. 2A has a micro contact angle α. This can be equated with a dynamic contact angle on a flat substrate surface in which no hole is formed. 2 (a) and 2 (b), the arc-shaped solid line on the substrate surface represents the contour of the pure water droplet, and the tangent (broken line) of the contour represents the micro contact angle α. It is shown. Next, (2 ′) at the boundary portion between the flat portion and the hole, when the boundary is reached in the case of the hole opened vertically, the inclination angle (90 degrees) of the side surface of the hole is added to α, and (90 + α) In the state where it is in contact with the inner wall surface of (3 ′), it is (90 + α) degree like (2 ′). Further, on the opposite inner wall surface (4 '), since it becomes a meniscus concave surface, the opening is filled with liquid and again exhibits a contact angle on a flat surface.

図２（ｂ）においても同様に考えれば、（１）平坦部ではミクロな接触角αをもっている。（２）テーパー状の孔の境界部では壁面の傾斜角θにより、ここで加えられる角度は（９０−θ）度であり、（９０−θ＋α）度が見かけの接触角となり、（３）内壁面（くびれ部の境界まで）では（２）と同様に（９０−θ＋α）度である。さらに、（４）くびれ部より先では凹面になるため、液体が満たされ再度接触角αとなる。   In the same way in FIG. 2B, (1) the flat portion has a micro contact angle α. (2) Due to the inclination angle θ of the wall surface at the boundary of the tapered hole, the angle added here is (90−θ) degrees, and (90−θ + α) degrees is the apparent contact angle, and (3) On the wall surface (up to the boundary of the constricted portion), the angle is (90−θ + α) as in (2). Furthermore, (4) since the surface is concave before the constricted portion, the liquid is filled and the contact angle α is obtained again.

そのため、分散媒の液滴の液体−基板界面の周辺長、接触線が、どの程度開口の影響を受けるかを見積もれればよい。開口の平均ピッチをｐとして、平坦部の占める長さの比率で、マクロな接触角βが見積もられる。ミクロな接触角α（α_１）を１０度として、傾斜角θを３０度、平均ピッチｐを１２０μｍ、開口径ｒの半分で（９０−θ＋α）度になるとすれば、ｃｏｓ（β）＝（１−ｒ／２ｐ）ｃｏｓ（α）＋（ｒ／２ｐ）ｃｏｓ（９０−θ＋α）である。そのため、接触面周囲の外周長に平均ピッチで貫通孔からなる微細構造が形成されていると近似すれば、ｐと孔の占有率のみで考えてよい。 Therefore, it is only necessary to estimate how much the peripheral length of the liquid-substrate interface of the dispersion medium droplet and the contact line are affected by the opening. The macro contact angle β is estimated by the ratio of the length occupied by the flat portion, where p is the average pitch of the openings. Assuming that the micro contact angle α (α ₁ ) is 10 degrees, the inclination angle θ is 30 degrees, the average pitch p is 120 μm, and half of the opening diameter r is (90−θ + α) degrees, cos (β) = ( 1−r / 2p) cos (α) + (r / 2p) cos (90−θ + α). Therefore, if it is approximated that a fine structure composed of through-holes is formed at an average pitch on the outer peripheral length around the contact surface, only p and the occupation ratio of the holes may be considered.

この観点から、図３には基板面のミクロな接触角αを横軸にとったときに、傾斜角θを３０度，４５度，６０度とした場合に、マクロな接触角βがどう生じるかを見積もったグラフを示した。図３から分かる通り、マクロな接触角βは、傾斜角θに強く依存した接触角として計測されることとなる。しかしながら、ミクロな接触角αが低くなければ、計測したマクロな接触角βも小さくならない。そのため、上記仮想的に見積もった条件において、本発明の目的とする分散媒の通過速度を有意に向上させるために好ましいマクロな接触角βは５５度以下である。 From this point of view, FIG. 3 shows how the macro contact angle β occurs when the micro contact angle α of the substrate surface is taken on the horizontal axis and the tilt angle θ is 30 degrees, 45 degrees, and 60 degrees. The graph which estimated was shown. As can be seen from FIG. 3, the macro contact angle β is measured as a contact angle strongly dependent on the tilt angle θ. However, if the micro contact angle α is not low, the measured macro contact angle β is not small. For this reason, the macro contact angle β preferable for significantly improving the passing speed of the dispersion medium as an object of the present invention is 55 degrees or less under the virtually estimated conditions.

このとき、第２面側内壁１３ｂの親水性は、第１面側内壁１３ａの親水性より高いか、または、第１面側内壁１３ａの親水性と同等であることが好ましい。なお、本明細書において、親水性が同等とは、その接触角の差が±１０％の範囲内であることをいう。   At this time, the hydrophilicity of the second surface side inner wall 13b is preferably higher than the hydrophilicity of the first surface side inner wall 13a or equivalent to the hydrophilicity of the first surface side inner wall 13a. In the present specification, “equal hydrophilicity” means that the difference in contact angle is within a range of ± 10%.

さらに、第２面側内壁１３ｂだけでなく、基板の主面である第２面１２も親水化処理面とすることが好ましい。具体的には、第２面が純水の滴下直後の動的接触角が３０度以下となる親水化処理面であることが好ましい。このように、第２面側内壁１３ｂおよび第２面１２が共に良好な親水性を有する場合、さらに、細胞懸濁液の通過を促進し、通過速度を向上できる。第２面１２の親水性は、第２面側内壁１３ｂの親水性と同等または第２面側内壁１３ｂの親水性の方が高いことが好ましい。   Furthermore, it is preferable that not only the second surface side inner wall 13b but also the second surface 12 which is the main surface of the substrate is a hydrophilic treatment surface. Specifically, it is preferable that the second surface is a hydrophilized surface where the dynamic contact angle immediately after dropping pure water is 30 degrees or less. Thus, when both the 2nd surface side inner wall 13b and the 2nd surface 12 have favorable hydrophilicity, passage of a cell suspension is further accelerated | stimulated and a passage speed can be improved. The hydrophilicity of the second surface 12 is preferably equal to the hydrophilicity of the second surface side inner wall 13b or higher in the hydrophilicity of the second surface side inner wall 13b.

また、基板の主面である第１面１１も親水化処理面としてもよい。このとき、第１面１１ａの親水性は、第２面１２の親水性と同等または第２面１２の親水性の方が高いことが好ましい。   The first surface 11 that is the main surface of the substrate may also be a hydrophilic treatment surface. At this time, the hydrophilicity of the first surface 11a is preferably equal to the hydrophilicity of the second surface 12, or the hydrophilicity of the second surface 12 is higher.

このような親水化処理面としては、プラズマ照射により表面が改質されたプラズマ処理面、親水性の良好なシリカ膜等をコーティングしたシリカコート面、等が挙げられる。   Examples of such a hydrophilic treatment surface include a plasma treatment surface whose surface has been modified by plasma irradiation, a silica-coated surface coated with a silica film having good hydrophilicity, and the like.

そして、このような細胞捕捉チップ１０は、第２面側内壁１３ｂが上記動的接触角を満たす親水化処理面（すなわち、動的接触角が３０度以下）であることが好ましく、この動的接触角としては、２０度以下がより好ましく、１５度以下がさらに好ましい。この動的接触角を３０度以下とすることで、くびれ部１３ｃのような小さな径を有する貫通孔であっても、細胞懸濁液の通過速度を向上させることができる。   Such a cell trapping chip 10 is preferably a hydrophilic treatment surface (that is, the dynamic contact angle is 30 degrees or less) in which the second surface side inner wall 13b satisfies the dynamic contact angle. As a contact angle, 20 degrees or less is more preferable, and 15 degrees or less is further more preferable. By setting the dynamic contact angle to 30 degrees or less, the passage speed of the cell suspension can be improved even for a through hole having a small diameter such as the constricted portion 13c.

ここで、本実施形態における細胞捕捉チップ１０においては、純水を滴下すると経時的に接触角が変化していくため、ここで測定される接触角は動的接触角である。そして、本明細書においては、動的接触角として、純水を滴下した直後の動的接触角を所望の範囲とすることで、通液速度が良好な細胞捕捉チップが得られる。動的接触角の測定は、基板の側面にＣＣＤカメラ等の撮像装置を設置し、基板上に滴下された純水の状態を経時的に観察して行う。具体的には、撮影された画像において、変化する接触角を画像処理により所望のタイミングでの動的接触角を算出できる。
なお、親水化処理面がプラズマ処理面である場合、経時的に接触角が大きくなる（親水性が低下していく）方に変化していくため、上記動的接触角はプラズマ処理後３分以内に測定して決定する。 Here, in the cell trapping chip 10 in the present embodiment, when pure water is dropped, the contact angle changes with time, so the contact angle measured here is a dynamic contact angle. And in this specification, the cell capture chip | tip with a favorable liquid flow rate is obtained by making the dynamic contact angle immediately after dripping pure water into a desired range as a dynamic contact angle. The dynamic contact angle is measured by installing an imaging device such as a CCD camera on the side of the substrate and observing the state of pure water dropped on the substrate over time. Specifically, the dynamic contact angle at a desired timing can be calculated by image processing of the contact angle that changes in the captured image.
When the hydrophilized surface is a plasma-treated surface, the contact angle increases over time (hydrophilicity decreases), so the dynamic contact angle is 3 minutes after the plasma treatment. Determine by measuring within.

また、貫通孔１３は、基板に複数個を設けることが好ましい。複数個の貫通孔１３を設けるにあたっては、これらを整列して設けることが好ましい。このように整列し、貫通孔１３の基板上における位置を特定しておくことで、捕捉された細胞を特定でき、その後の観察、評価等を円滑に行うことができる。貫通孔１３は、基板の表面に２次元的に配列すればよく、例えば、格子状配置としたり、千鳥配置としたり、すればよい。図１Ａは、格子状配置の一例である。   Moreover, it is preferable to provide a plurality of through holes 13 in the substrate. In providing a plurality of through holes 13, it is preferable to arrange these through holes. By aligning in this way and specifying the position of the through-hole 13 on the substrate, the captured cells can be specified, and subsequent observation, evaluation, and the like can be performed smoothly. The through holes 13 may be two-dimensionally arranged on the surface of the substrate. For example, the through holes 13 may be arranged in a lattice pattern or in a staggered arrangement. FIG. 1A is an example of a grid arrangement.

この細胞捕捉チップの形状は、板状であれば特に限定されるものではなく、例えば、その平面視形状が三角形、四角形等の多角形や、真円、楕円等の円形等、様々な形状とできる。   The shape of the cell trapping chip is not particularly limited as long as it is a plate shape. For example, the shape in plan view may be various shapes such as a polygon such as a triangle and a quadrangle, and a circle such as a perfect circle and an ellipse. it can.

また、この基板は、耐熱性、耐薬品性を有することが好ましい。細胞懸濁液を通液させるにあたって熱処理を行ったり、使用する懸濁液が酸性又はアルカリ性であったり、する場合においても、このような物理的及び化学的耐久性が良好であることで、安定して分離、捕捉操作を行うことができる。   Moreover, it is preferable that this board | substrate has heat resistance and chemical resistance. Even when heat treatment is performed before passing the cell suspension, or when the suspension to be used is acidic or alkaline, it is stable due to such good physical and chemical durability. Thus, separation and capture operations can be performed.

＜細胞捕捉チップの製造方法＞
本発明の細胞捕捉チップは、例えば、平板状の基板に対して、レーザ照射や機械的処理により所望の孔形状を有する貫通孔を形成して孔あき基板とした後、孔あき基板の表面を親水化処理することで製造できる。以下、ガラス製の基板を用いた場合を例に説明する。 <Method for producing cell capture chip>
The cell trapping chip of the present invention, for example, forms a through-hole having a desired hole shape by laser irradiation or mechanical treatment on a flat substrate to form a perforated substrate, and then the surface of the perforated substrate is changed. It can be produced by a hydrophilic treatment. Hereinafter, a case where a glass substrate is used will be described as an example.

〈貫通孔の形成〉
まず、ガラス製の基板、例えば、無アルカリガラスを用意する。そして、このガラス基板に対して、貫通孔を設けたい箇所にレーザ照射、または、レーザ照射後フッ酸エッチングして貫通孔を形成する。貫通孔１３は、本発明においては特徴的な形状となっているため、例えば、次のように形成して所望の孔あき基板を得る。なお、ここで用いることができるガラスは、ソーダガラス、ホウ珪酸ガラス、石英ガラス、化学強化用ガラス等が挙げられる。 <Formation of through holes>
First, a glass substrate, for example, an alkali-free glass is prepared. And a through-hole is formed in this glass substrate by laser irradiation or a hydrofluoric acid etching after laser irradiation at a place where a through-hole is to be provided. Since the through-hole 13 has a characteristic shape in the present invention, for example, it is formed as follows to obtain a desired perforated substrate. Examples of the glass that can be used here include soda glass, borosilicate glass, quartz glass, and glass for chemical strengthening.

貫通孔１３の形成についてはこのガラス製の基板に、次のようにレーザ照射とフッ酸エッチングを用いて行うことができる。レーザには、例えば、Ｙｂ-ＫＧＷレーザ装置から出射されるパルス幅２３０ｆｓ〜１０ｐｓのレーザ（波長１０３０ｎｍ若しくは５１５ｎｍ、１５Ｗ）を用いることができる。レーザ照射は、例えば、レーザ装置から出射されたビーム径約４ｍｍのレーザパルスを、５倍〜２０倍の対物レンズでガラス基板１０に集光させ、１つの貫通孔１３当たりの照射を１パルス（２３０ｆｓ〜１０ｐｓ）とし、それによりガラス内部に改質ラインが板厚方向に形成させる。ガラスをＸＹステージに固定して、ＸＹステージを任意に動かしながら、貫通孔の形成箇所のそれぞれに上記レーザ照射を繰り返し行うことによって二次元配列された板厚方向に伸びる改質ライン群を得ることができる。   The through-hole 13 can be formed on the glass substrate by laser irradiation and hydrofluoric acid etching as follows. As the laser, for example, a laser having a pulse width of 230 fs to 10 ps (wavelength: 1030 nm or 515 nm, 15 W) emitted from a Yb-KGW laser device can be used. For laser irradiation, for example, a laser pulse with a beam diameter of about 4 mm emitted from a laser device is condensed on the glass substrate 10 by an objective lens of 5 to 20 times, and irradiation per one through-hole 13 is performed by one pulse ( 230 fs to 10 ps), thereby forming a reforming line in the thickness direction inside the glass. By fixing the glass to the XY stage and moving the XY stage arbitrarily, the above-mentioned laser irradiation is repeatedly performed on each of the through-hole formation points to obtain a two-dimensionally arranged modified line group extending in the thickness direction. Can do.

その後、改質ライン群が形成されたガラスを１％〜４５％フッ酸によりエッチングする。このエッチングを行うことで、改質ライン群が選択的にエッチングされるとともに、基板表面近傍と基板内部におけるエッチング速度及びエッチング量の差により、二次元配列された砂時計型の貫通孔を有する孔あき基板を作成できる。この時、フッ酸には塩酸や硝酸を添加物として加えてもよい。   Thereafter, the glass on which the modified line group is formed is etched with 1% to 45% hydrofluoric acid. By performing this etching, the modified line group is selectively etched, and holes having two-dimensionally arranged hourglass-shaped through holes are formed due to the difference in etching rate and etching amount in the vicinity of the substrate surface and inside the substrate. A board can be created. At this time, hydrochloric acid or nitric acid may be added to hydrofluoric acid as an additive.

なお、レーザ装置は上記以外にも同様のパルス幅、波長、出力を得られるものであればよく、また、対象となる基板の種類や貫通孔の大きさ等を変更した場合には、それに応じてレーザ照射の条件を所望の砂時計型の貫通孔が形成できるように適宜変更すればよく、これに限定されるものではない。さらに、エッチングについてもアルカリエッチング（ＮａＯＨ）等で行ってもよい。   In addition to the above, the laser device only needs to be able to obtain the same pulse width, wavelength, and output. In addition, if the type of the target substrate or the size of the through hole is changed, the laser device is changed accordingly. The laser irradiation conditions may be changed as appropriate so that a desired hourglass-shaped through hole can be formed, and the present invention is not limited to this. Further, etching may be performed by alkali etching (NaOH) or the like.

〈親水化処理〉
本実施形態において、親水化処理は、上記得られた孔あき基板の表面において、親水性を高める処理である。ここで、親水化処理としては、公知の処理を特に限定せずに用いることができ、例えば、プラズマ照射、シリカコーティング、等が挙げられる。また、このとき親水化処理は、上記親水化処理面で説明したのと同様に、純水の滴下直後の動的接触角が３０度以下となる処理であることが好ましい。 <Hydrophilic treatment>
In the present embodiment, the hydrophilic treatment is a treatment for increasing hydrophilicity on the surface of the perforated substrate obtained above. Here, as the hydrophilization treatment, a known treatment can be used without particular limitation, and examples thereof include plasma irradiation and silica coating. Further, at this time, the hydrophilic treatment is preferably a treatment in which the dynamic contact angle immediately after dropping pure water is 30 degrees or less, as described in the hydrophilic treatment surface.

本実施形態において、プラズマ照射による親水化処理は、ラジカル（酸素ラジカルなど）による表面洗浄による表面からの疎水基の離脱、付着した不純物の除去、表面への親水基の付着、表面改質などの概念を含む処理である。したがって、基板として、ガラス基板を例に説明するが、それ以外の材質からなる基板であっても、親水化表面とできる。   In this embodiment, the hydrophilization treatment by plasma irradiation includes removal of hydrophobic groups from the surface by surface cleaning with radicals (oxygen radicals, etc.), removal of attached impurities, attachment of hydrophilic groups to the surface, surface modification, etc. It is a process that includes a concept. Therefore, although a glass substrate will be described as an example of the substrate, even a substrate made of other materials can be made hydrophilic.

プラズマの照射条件としては、例えば、大気圧、グロー放電、パワー３〜１８Ｗ、電流７ｍＡ、圧力１０Ｐａで１０分間処理を行うことで親水化処理できる。   As plasma irradiation conditions, for example, a hydrophilic treatment can be performed by performing a treatment for 10 minutes at atmospheric pressure, glow discharge, power 3 to 18 W, current 7 mA, and pressure 10 Pa.

また、コーティングによる親水化処理は、親水性を有するように孔あき基板の表面を被覆する処理である。ここで用いられる材料としては、基板を被覆できるものであれば特に限定されず、無機系被覆材、有機系被覆材等が挙げられる。無機系被覆材料としては、シリカ、チタニア等が好ましく挙げられるが、シリカがより好ましい。被覆材料がシリカであれば、長期的に親水性を付与できる。シリカコートは、加水分解性基を有するシラン化合物の加水分解物またはケイ酸の加水分解物であるのが好ましく、アルコキシシラン化合物の加水分解物またはケイ酸のアルカリ金属塩からアルカリ金属の一部を除去した脱塩ケイ酸の加水分解物がより好ましい。なお、これらの加水分解物は、未反応のシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）基を有していてもよい。   The hydrophilic treatment by coating is a treatment for covering the surface of the perforated substrate so as to have hydrophilicity. The material used here is not particularly limited as long as it can cover the substrate, and examples thereof include inorganic coating materials and organic coating materials. As the inorganic coating material, silica, titania and the like are preferably mentioned, and silica is more preferable. If the coating material is silica, hydrophilicity can be imparted in the long term. The silica coat is preferably a hydrolyzate of a silane compound having a hydrolyzable group or a hydrolyzate of silicic acid, and a part of the alkali metal is removed from the hydrolyzate of an alkoxysilane compound or an alkali metal salt of silicic acid. A hydrolyzate of the demineralized silicic acid removed is more preferred. These hydrolysates may have an unreacted silanol group (Si—OH) group.

有機系被覆材としては、ポリエチレングリコールのような親水性高分子化合物や２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー（ＭＰＣポリマー）のような生体膜模倣材料、ポリエチレングリコール変性アルコキシシラン等が挙げられる。このような被覆材を溶剤に溶解させてコーティング用の溶液を用意し、これを孔あき基板の表面に塗布した後、乾燥させて、コート膜を形成すればよい。溶液の塗布は、孔あき基板の表面にディップコーティング、スピンコーティング、等の公知の塗布方法を用いればよい。   Examples of the organic coating material include hydrophilic polymer compounds such as polyethylene glycol, biological membrane mimic materials such as 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer (MPC polymer), polyethylene glycol-modified alkoxysilanes, and the like. Such a coating material may be dissolved in a solvent to prepare a coating solution, which is applied to the surface of the perforated substrate and then dried to form a coating film. The solution may be applied by using a known application method such as dip coating or spin coating on the surface of the perforated substrate.

本実施形態において、第２面側内壁１３ｂだけでなく、第２面１２も親水化処理が施されていることが好ましい。このとき、第２面側内壁１３ｂの親水性と第２面１２の親水性との協働作用により、細胞懸濁液の貫通孔１３への流入と、分散媒の貫通孔１３からの排出を促進でき、細胞懸濁液における分散媒の通過速度を向上させることができる。   In the present embodiment, not only the second surface side inner wall 13b but also the second surface 12 is preferably subjected to a hydrophilic treatment. At this time, due to the cooperative action of the hydrophilicity of the second surface side inner wall 13b and the hydrophilicity of the second surface 12, the inflow of the cell suspension into the through hole 13 and the discharge of the dispersion medium from the through hole 13 are prevented. It can be promoted and the passing speed of the dispersion medium in the cell suspension can be improved.

［細胞捕捉方法］
本実施形態の細胞捕捉方法は、上記したような本実施形態の細胞捕捉チップの第１面１１に、細胞懸濁液を滴下して、貫通孔１３に単一細胞を捕捉させるものである。 [Cell capture method]
The cell capturing method of the present embodiment is a method in which a cell suspension is dropped onto the first surface 11 of the cell capturing chip of the present embodiment as described above, and a single cell is captured by the through-hole 13.

ここで用いる細胞懸濁液は、単一細胞が分散媒中に分散して含有するものであれば特に限定されずに用いられる。なお、含有する単一細胞としては、血球系細胞、がん細胞等が挙げられ、細胞の直径がφ１０〜２０μｍ程度のものが好ましい。また、分散媒としては、水、生理的食塩水、等が挙げられる。   The cell suspension used here is not particularly limited as long as single cells are dispersed and contained in a dispersion medium. Examples of the single cells to be contained include blood cells and cancer cells, and those having a diameter of about 10 to 20 μm are preferable. Examples of the dispersion medium include water and physiological saline.

このような細胞懸濁液を、細胞捕捉チップ１０の第１面１１に滴下、供給することで、細胞懸濁液中の分散媒は貫通孔１３を通過して第２面１２から排出され、その際、目的とする細胞は貫通孔１３のくびれ部に捕捉される。   By dropping and supplying such a cell suspension to the first surface 11 of the cell trapping chip 10, the dispersion medium in the cell suspension passes through the through-hole 13 and is discharged from the second surface 12. At that time, the target cell is captured by the constricted portion of the through-hole 13.

このとき、本実施形態の細胞捕捉チップ１０においては、細胞懸濁液の滴下後にポンプ等で吸引する等の外力を加えなくても、細胞懸濁液が細胞捕捉チップ１０の貫通孔１３を通過する方向に自律的に駆動する力が働き、簡便な操作で容易に単一細胞を１つの貫通孔１３に捕捉できる。   At this time, in the cell trapping chip 10 of the present embodiment, the cell suspension passes through the through-hole 13 of the cell trapping chip 10 without applying an external force such as sucking with a pump after dropping the cell suspension. The force which drives autonomously in the direction to work works, and a single cell can be easily captured in one through-hole 13 by a simple operation.

以下、本発明について実施例を参照しながらより詳細に説明する。
［細胞捕捉チップの製造］
（例１）
旭硝子（株）社製無アルカリガラス（０．２ｍｍ厚）を用意した。このガラス製の基板に、次のようにレーザ照射とフッ酸エッチングを用いて行った。レーザにはＹｂ−ＫＧＷレーザ装置から出射されるパルス幅１０ｐｓのレーザ（波長１０３０ｎｍ）を用いた。レーザ装置から出射されたビーム径約４ｍｍのレーザパルスを、５倍の対物レンズでガラス基板１０の表面に集光させた。１つの貫通孔１３あたりの照射は１パルス（パルスエネルギ１７０μＪ）であり、それによりガラス内部に改質ラインが板厚方向に形成される。ガラスをＸＹステージに固定して、ＸＹステージを任意に動かすことによって二次元配列された改質ライン群を得ることができる。その後、改質ライン群が形成されたガラスを約２．５時間５％フッ酸エッチングすることで、改質ライン群が選択的にエッチングされることで二次元配列された砂時計型の孔を作成した。その後、円状に外径を切断して、φ１３ｍｍとした。このようにして孔あき基板Ａを得た。この貫通孔は、第１面および第２面の開口径がφ８０μｍ、くびれ部の径がφ８μｍであり、図１Ｃに示したように２つの円錐状の頂点部分が重なった砂時計型の形状であり、１００μｍピッチで８９個×８９個（７９２１個）設けた。
なお、この時の傾斜角度θは４０度であった。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
[Manufacture of cell capture chip]
(Example 1)
Non-alkali glass (0.2 mm thick) manufactured by Asahi Glass Co., Ltd. was prepared. This glass substrate was subjected to laser irradiation and hydrofluoric acid etching as follows. As the laser, a laser (wavelength 1030 nm) having a pulse width of 10 ps emitted from a Yb-KGW laser apparatus was used. A laser pulse having a beam diameter of about 4 mm emitted from the laser device was condensed on the surface of the glass substrate 10 by a 5 × objective lens. Irradiation per one through-hole 13 is one pulse (pulse energy 170 μJ), whereby a reforming line is formed in the thickness direction in the glass. By fixing the glass to the XY stage and arbitrarily moving the XY stage, a two-dimensionally arranged reforming line group can be obtained. After that, the glass in which the modified line group is formed is etched with 5% hydrofluoric acid for about 2.5 hours, so that the modified line group is selectively etched to create a two-dimensionally arranged hourglass hole. did. Thereafter, the outer diameter was cut into a circular shape to obtain a diameter of 13 mm. In this way, a perforated substrate A was obtained. This through hole has an opening diameter of φ80 μm on the first surface and the second surface, a diameter of the constricted portion is φ8 μm, and has an hourglass shape in which two conical apex portions overlap as shown in FIG. 1C. , 89 × 89 (7921) are provided at a pitch of 100 μm.
At this time, the inclination angle θ was 40 degrees.

孔あき基板Ａに対して、その両面にプラズマ照射により親水化処理を行い、細胞捕捉チップ１を得た。このとき、プラズマ照射は、大気圧、グロー放電、パワー３〜１８Ｗ、電流７ｍＡ、圧力１０Ｐａで１０分間処理を行った。   The cell-capturing chip 1 was obtained by subjecting the perforated substrate A to hydrophilic treatment by plasma irradiation on both sides thereof. At this time, the plasma irradiation was performed for 10 minutes at atmospheric pressure, glow discharge, power of 3 to 18 W, current of 7 mA, and pressure of 10 Pa.

（例２）
例１で得られた孔あき基板Ａに対し、一方の面にプラズマ照射を行い、他方の面にはプラズマ照射を行わなかった以外は、例１と同一の操作により細胞捕捉チップ２を得た。 (Example 2)
A cell trapping chip 2 was obtained by the same operation as in Example 1 except that the perforated substrate A obtained in Example 1 was irradiated with plasma on one side and not irradiated on the other side. .

（例３）
例１で得られた孔あき基板Ａに対し、プラズマ照射を行わなかった。すなわち、孔あき基板Ａを用意し、そのまま本例の細胞捕捉チップ３とした。 (Example 3)
No plasma irradiation was performed on the perforated substrate A obtained in Example 1. That is, a perforated substrate A was prepared and used as it is as the cell trapping chip 3 of this example.

（例４）
例１で得られた孔あき基板Ａに対し、親水性シリカコート液を用いたディップコーティングにより親水性シリカコート処理をして両面にシリカコート膜を形成し、室温にて乾燥させ、厚さ５０ｎｍのシリカコート膜を有する細胞捕捉チップ４を得た。
親水性シリカコート液は、以下のように作成した。
蒸留水２３７．５ｇを撹拌しながら、これにケイ酸ソーダ４号（日本化学工業社製、（ＳｉＯ_２：２４．０質量％、Ｎａ_２Ｏ：７．０質量％。ＳｉＯ_２／Ｎａ_２Ｏのモル比：３．５／１）を６２．５ｇ、陽イオン交換樹脂（三菱化学社製、ダイヤイオンＳＫ１ＢＨ）を１８０ｇ加え、１０分以上撹拌した後、吸引ろ過により陽イオン交換樹脂を分離し、酸化ケイ素換算の固形分濃度が５質量％の脱塩ケイ酸の加水分解物を得た。
２−プロパノールの９４ｇを撹拌しながら、これに前述の脱塩ケイ酸の加水分解物を６ｇ加え、酸化ケイ素換算固形分が０．３質量％、親水性シリカコーティング液を調製した。 (Example 4)
The porous substrate A obtained in Example 1 was subjected to hydrophilic silica coating treatment by dip coating using a hydrophilic silica coating solution to form a silica coating film on both sides, dried at room temperature, and a thickness of 50 nm. A cell capture chip 4 having a silica-coated film was obtained.
The hydrophilic silica coating solution was prepared as follows.
While stirring 237.5 g of distilled water, sodium silicate No. 4 (manufactured by Nippon Chemical Industry Co., Ltd., (SiO ₂ : 24.0% by mass, Na ₂ O: 7.0% by mass. SiO ₂ / Na ₂ O 62.5 g of a molar ratio of 3.5 / 1) and 180 g of a cation exchange resin (Diaion SK1BH, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) were added and stirred for 10 minutes or more, and then the cation exchange resin was separated by suction filtration. A hydrolyzate of demineralized silicic acid having a solid content concentration of 5% by mass in terms of silicon oxide was obtained.
While stirring 94 g of 2-propanol, 6 g of the hydrolyzate of the aforementioned desalted silicic acid was added thereto to prepare a hydrophilic silica coating liquid having a solid content in terms of silicon oxide of 0.3% by mass.

（例５）
７５ｍｍ×２５ｍｍの旭硝子（株）社製無アルカリガラスの基板（厚さ０．１ｍｍ）を用意した。このガラス製の基板に、次のようにレーザ照射をしてアブレーション加工により孔あけを行った。レーザにはＹｂ−ＫＧＷレーザ装置から出射されるパルス幅６００ｆｓのレーザ（波長５１５ｎｍ）を用いた。レーザ装置から出射されたビーム径約４ｍｍのレーザパルスを、５倍の対物レンズでガラス基板１０の表面に集光させた。１つの貫通孔１３あたりの照射は４００パルス（パルスエネルギ５６μＪ、周波数７．５ｋＨｚ）であり、ＸＹステージを任意に動かすことによって二次元配列された孔を得ることができる。今回は貫通孔を格子状に配列するように形成して、孔あき基板Ｂを得た。この貫通孔は、第１面から第２面に向かってほぼ径が同等のストレート形状であり（詳細には、第１面の開口径がφ１３〜φ１４μｍ、第２面の開口径がφ１０〜φ１１μｍで、板厚内部における孔径の極端な変化はない）、１００μｍピッチで８９個×８９個（７９２１個）設けた。その後、円状に外形を切断して、φ１３ｍｍとした。 (Example 5)
A 75 mm × 25 mm non-alkali glass substrate (thickness 0.1 mm) manufactured by Asahi Glass Co., Ltd. was prepared. This glass substrate was subjected to laser irradiation as described below and drilled by ablation. A laser (wavelength 515 nm) having a pulse width of 600 fs emitted from a Yb-KGW laser apparatus was used as the laser. A laser pulse having a beam diameter of about 4 mm emitted from the laser device was condensed on the surface of the glass substrate 10 by a 5 × objective lens. Irradiation per one through-hole 13 is 400 pulses (pulse energy 56 μJ, frequency 7.5 kHz), and two-dimensionally arranged holes can be obtained by arbitrarily moving the XY stage. This time, through-holes were formed so as to be arranged in a lattice pattern to obtain a perforated substrate B. The through hole has a straight shape with substantially the same diameter from the first surface to the second surface (specifically, the opening diameter of the first surface is φ13 to φ14 μm, and the opening diameter of the second surface is φ10 to φ11 μm). Thus, there was no extreme change in the hole diameter inside the plate thickness), and 89 × 89 (7921) were provided at a pitch of 100 μm. Thereafter, the outer shape was cut into a circular shape to obtain a diameter of 13 mm.

孔あき基板Ｂに対して、その両面にプラズマ照射により親水化処理を行い、細胞捕捉チップ５を得た。このとき、プラズマ照射は、例１と同一の、大気圧、グロー放電、パワー３〜１８Ｗ、電流７ｍＡ、圧力１０Ｐａの条件で行った。   The porous substrate B was subjected to a hydrophilization treatment by plasma irradiation on both surfaces thereof, whereby a cell trapping chip 5 was obtained. At this time, plasma irradiation was performed under the same conditions as in Example 1, atmospheric pressure, glow discharge, power 3 to 18 W, current 7 mA, and pressure 10 Pa.

（例６）
例５で得られた孔あき基板Ｂに対し、一方の面にプラズマ照射を行い、他方の面にはプラズマ照射を行わなかった以外は、例５と同一の操作により細胞捕捉チップ６を得た。 (Example 6)
A cell trapping chip 6 was obtained by the same operation as in Example 5 except that the perforated substrate B obtained in Example 5 was irradiated with plasma on one side and not irradiated with plasma on the other side. .

（例７）
例５で得られた孔あき基板Ｂに対し、プラズマ照射を行わなかった。すなわち、孔あき基板Ｂを用意し、そのまま本例の細胞捕捉チップ７とした。 (Example 7)
No plasma irradiation was performed on the perforated substrate B obtained in Example 5. That is, a perforated substrate B was prepared and used as it is as the cell trapping chip 7 of this example.

以上、例１〜例７で得られた細胞捕捉チップについて表１にまとめて示した。ここで、例１，２，４が実施例、例３，５〜７が比較例である。

The cell capture chips obtained in Examples 1 to 7 are collectively shown in Table 1. Here, Examples 1, 2, and 4 are examples, and Examples 3, 5 to 7 are comparative examples.

＜水浸透試験＞
例１〜７で得られた細胞捕捉チップ１〜７を用いて、水浸透試験を行った。水浸透試験は、２４ｍｍ×６０ｍｍ×０．１２〜０．１７ｍｍの松浪硝子工業（株）社製のスライドガラス上に、細胞捕捉チップ１〜７を載置した状態で、細胞捕捉チップの上面（第１面）に純水３μＬ滴下したときの浸透状態を観察し、浸透の有無を評価した。浸透の有無は、純水を滴下した後６０秒間観察して、滴下した純水が細胞捕捉チップ上面に残っている場合を「浸透せず」と、滴下した純水が貫通孔を通過し、スライドガラス上に広がった場合を「浸透」と評価した。なお、浸透試験は３回行い（試験例５は２回）、そのうち「浸透」と評価された割合を浸透率として算出した。 <Water penetration test>
A water penetration test was performed using the cell capture chips 1 to 7 obtained in Examples 1 to 7. The water permeation test was performed by placing the cell trapping chips 1 to 7 on a slide glass manufactured by Matsunami Glass Industry Co., Ltd. having a size of 24 mm × 60 mm × 0.12 to 0.17 mm. The penetration state when 3 μL of pure water was dropped on the first surface) was observed, and the presence or absence of penetration was evaluated. Presence of permeation is observed for 60 seconds after dropping pure water, and when the dropped pure water remains on the upper surface of the cell trapping chip, “does not penetrate”, the dropped pure water passes through the through-hole, The case of spreading on a slide glass was evaluated as “penetration”. The penetration test was performed three times (twice in Test Example 5), and the ratio evaluated as “penetration” was calculated as the penetration rate.

これらの結果を表２〜４にまとめて示した。表中、親水化処理については、親水化処理をしている面を○、親水化処理をしていない面を×、として示している。   These results are summarized in Tables 2 to 4. In the table, regarding the hydrophilic treatment, the surface subjected to the hydrophilic treatment is indicated by ◯, and the surface not subjected to the hydrophilic treatment is indicated by ×.

以上より、第２面を親水化処理している場合、第１面やスライドガラス板表面の親水化処理に関わらず浸透が良好に行えていることがわかる。また、例６〜７に示したように、同じ細胞捕捉チップを用いても、親水化処理された面をフィルター上面（第１面）とし、親水化処理されていない面をフィルター下面（第２面）として使用すると、浸透がしづらいことがわかる。   From the above, it can be seen that when the second surface is hydrophilized, the permeation is good regardless of the hydrophilization treatment of the first surface or the slide glass plate surface. Further, as shown in Examples 6 to 7, even when the same cell trapping chip is used, the surface subjected to hydrophilic treatment is the upper surface of the filter (first surface), and the surface not subjected to hydrophilic treatment is the lower surface of the filter (second surface). When used as a surface), it can be seen that penetration is difficult.

また、試験例１〜２では、純水の滴下後、一瞬で浸透し、試験例３〜４では、純水の滴下後、１秒以内で浸透し、非常に良好な浸透状態であった。また、試験例５では、純水の滴下後５秒程度で浸透し、良好な浸透状態であった。一方、フィルター下面（第２面）が親水化処理されていない試験例６〜９では、なかなか浸透がしづらかった。   Moreover, in Test Examples 1 and 2, it permeated instantaneously after dropping pure water, and in Test Examples 3 and 4 it permeated within 1 second after dropping pure water, which was a very good permeation state. Moreover, in Test Example 5, the infiltration occurred in about 5 seconds after the addition of pure water, and was in a good infiltration state. On the other hand, in Test Examples 6 to 9 in which the lower surface (second surface) of the filter was not hydrophilized, it was difficult to penetrate.

また、試験例１０〜１３のストレート型の貫通孔を有する細胞捕捉チップでは、親水化処理の有無に関わらず、浸透しなかった。   Moreover, in the cell capture chip | tip which has the straight type through-hole of Test Examples 10-13, it did not osmose | permeate irrespective of the presence or absence of a hydrophilic treatment.

＜接触角測定＞
上記例１〜７で使用した親水化処理における接触角について以下の通り試験を行い、評価した。 <Contact angle measurement>
The contact angle in the hydrophilization treatment used in Examples 1 to 7 was tested and evaluated as follows.

試験の対象基板として貫通孔のあいていない７５ｍｍ×２５ｍｍ×０．２ｍｍの旭硝子（株）社製無アルカリガラスの基板を用意した。この基板に対して、表面にプラズマ処理、シリカコート処理の親水化処理をした基板、親水化処理を行わなかった基板の３種類を用意した。なお、親水化処理は、上記例と同一条件で行った。
次いで、得られた基板の測定対象面に純水１μＬを滴下したときの接触角を測定した。このとき、接触角の測定は、対象基板の側面からＣＣＤカメラにより撮影し、画像処理によって接触角を算出した。なお、測定に際して、純水の滴下から経時的に接触角が低下する傾向にあり、滴下直後（０ｓ）の接触角（すなわち動的接触角）を表５に示した。この接触角は、３回測定した平均値である。また、プラズマ照射による親水化処理は、親水性が経時的に変化する傾向（親水性が劣化する方向）にあるため、プラズマ照射後、３分以内に測定した。 A non-alkali glass substrate manufactured by Asahi Glass Co., Ltd. having a size of 75 mm × 25 mm × 0.2 mm without a through hole was prepared as a target substrate for the test. For this substrate, three types were prepared: a substrate whose surface was subjected to hydrophilic treatment by plasma treatment and silica coating treatment, and a substrate which was not subjected to hydrophilic treatment. The hydrophilic treatment was performed under the same conditions as in the above example.
Subsequently, the contact angle when 1 μL of pure water was dropped onto the measurement target surface of the obtained substrate was measured. At this time, the contact angle was measured by photographing from the side surface of the target substrate with a CCD camera and calculating the contact angle by image processing. During the measurement, the contact angle tended to decrease over time after dropping pure water, and the contact angle (that is, the dynamic contact angle) immediately after dropping (0 s) is shown in Table 5. This contact angle is an average value measured three times. Moreover, since the hydrophilic treatment by plasma irradiation has a tendency that the hydrophilicity changes with time (in the direction in which the hydrophilicity deteriorates), the measurement was performed within 3 minutes after the plasma irradiation.

以上、説明したように、本発明によると、基板の第１面の捕捉領域に細胞懸濁液を滴下するだけで、貫通孔の第２面の開口（吐出口）から吸引することなく、目的とする細胞を単位細胞毎に貫通孔に捕捉することができる。この結果、細胞に損傷を与えることがない。特に、くびれ部を有する貫通孔において細胞懸濁液を滴下する面とは反対側の第２面側内壁の親水度を向上させることで、細胞懸濁液における分散媒の通過速度が向上されたものと想定される。   As described above, according to the present invention, the object can be obtained by simply dropping the cell suspension into the capture region of the first surface of the substrate without sucking it from the opening (discharge port) of the second surface of the through hole. Can be trapped in the through-hole for each unit cell. As a result, the cells are not damaged. In particular, the passage speed of the dispersion medium in the cell suspension was improved by improving the hydrophilicity of the inner wall of the second surface opposite to the surface on which the cell suspension was dropped in the through-hole having the constricted portion. It is assumed.

本発明の細胞捕捉チップは、細胞毎の性状、機能の分析に用いることができる。   The cell capture chip of the present invention can be used for analysis of properties and functions of each cell.

１０…細胞捕捉チップ、１１…第１面、１２…第２面、１３…貫通孔、１３ａ…第１面側内壁、１３ｂ…第２面側内壁、１３ｃ…くびれ部   DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Cell capture chip | tip, 11 ... 1st surface, 12 ... 2nd surface, 13 ... Through-hole, 13a ... 1st surface side inner wall, 13b ... 2nd surface side inner wall, 13c ... Constriction part

Claims (17)

主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通する、単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板からなり、
前記貫通孔は、その内部において、前記第１面の開口径および前記第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有し、かつ、前記くびれ部を境界とする第２面側内壁が、前記第１面側から前記第２面側に液体の通過を促進させる親水化処理面であることを特徴とする細胞捕捉チップ。 Comprising a substrate having a first surface and a second surface as main surfaces, and a through-hole penetrating from the first surface toward the second surface and capable of capturing a single cell;
The through-hole has a constricted portion having a diameter smaller than the opening diameter of the first surface and the opening diameter of the second surface, and a second surface side inner wall having the constricted portion as a boundary. The cell-trapping chip, which is a hydrophilic treatment surface that promotes the passage of liquid from the first surface side to the second surface side. 主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通する、単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板からなり、
前記貫通孔は、その内部において、前記第１面の開口径および前記第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有し、かつ、前記くびれ部を境界とする第２面側内壁が、純水の滴下直後の動的接触角が３０度以下となる親水化処理面であることを特徴とする細胞捕捉チップ。 Comprising a substrate having a first surface and a second surface as main surfaces, and a through-hole penetrating from the first surface toward the second surface and capable of capturing a single cell;
The through-hole has a constricted portion having a diameter smaller than the opening diameter of the first surface and the opening diameter of the second surface, and a second surface side inner wall having the constricted portion as a boundary. A cell-trapping chip characterized by being a hydrophilic treatment surface having a dynamic contact angle of 30 degrees or less immediately after dropping pure water. 前記くびれ部を境界とする第２面側内壁の親水性が、前記第１面側内壁の親水性より高いまたは同等である請求項１または２に記載の細胞捕捉チップ。   The cell trapping chip according to claim 1 or 2, wherein the hydrophilicity of the second surface side inner wall with the constricted portion as a boundary is higher or equivalent to the hydrophilicity of the first surface side inner wall. 前記第２面側内壁が、純水の滴下直後の動的接触角が１５度以下となる親水処理面である請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。   The cell trapping chip according to any one of claims 1 to 3, wherein the inner wall on the second surface side is a hydrophilic treatment surface having a dynamic contact angle of 15 degrees or less immediately after dropping pure water. 前記第２面が純水の滴下直後の動的接触角が３０度以下となる親水化処理面である請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。   The cell trapping chip according to any one of claims 1 to 4, wherein the second surface is a hydrophilic treatment surface having a dynamic contact angle of 30 degrees or less immediately after dropping pure water. 前記親水化処理面がプラズマ処理面である請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。   The cell trapping chip according to claim 1, wherein the hydrophilic treatment surface is a plasma treatment surface. 前記親水化処理面がシリカコート膜を有してなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。   The cell trapping chip according to any one of claims 1 to 5, wherein the hydrophilic treatment surface has a silica coat film. 前記基板の板厚が、５０〜５００μｍである請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。   The cell capture chip according to any one of claims 1 to 7, wherein a thickness of the substrate is 50 to 500 µm. 前記貫通孔が、前記第１面から前記くびれ部に向かっておよび前記第２面から前記くびれ部に向かって、それぞれ所定の傾斜角度を有して径が小さくなっており、該傾斜角度が２０〜６０度である請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。   The through-holes have a predetermined inclination angle from the first surface toward the constricted portion and from the second surface toward the constricted portion, respectively, and the diameter decreases, and the inclination angle is 20 It is -60 degree | times, The cell capture chip of any one of Claims 1-8. 前記くびれ部の径が１〜３０μｍである請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。   The cell trapping chip according to any one of claims 1 to 9, wherein a diameter of the constricted portion is 1 to 30 µm. 前記貫通孔が、格子状配置または千鳥配置として、整列して形成されている請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。   The cell trapping chip according to any one of claims 1 to 10, wherein the through-holes are formed in an array such as a lattice arrangement or a staggered arrangement. 前記基板が、ガラス基板である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップ。   The cell capture chip according to claim 1, wherein the substrate is a glass substrate. 主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通し、その内部において、前記第１面の開口径および前記第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有する単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板に対し、
前記貫通孔の前記くびれ部を境界とする第２面側内壁に、前記第１面側から前記第２面側に液体の通過を促進させる親水化処理を施すことを特徴とする細胞捕捉チップの製造方法。 The first surface and the second surface as main surfaces, and penetrates from the first surface toward the second surface, and in the inside thereof, the diameter is larger than the opening diameter of the first surface and the opening diameter of the second surface A substrate having a through-hole capable of capturing a single cell having a small constriction,
A cell trapping chip characterized in that a second surface side inner wall having the constricted portion of the through hole as a boundary is subjected to a hydrophilization treatment that promotes the passage of liquid from the first surface side to the second surface side. Production method. 主面として第１面および第２面と、前記第１面から前記第２面に向けて貫通し、その内部において、前記第１面の開口径および前記第２面の開口径よりも径の小さいくびれ部を有する単一細胞を捕捉可能な貫通孔と、を有する基板に対し、
前記貫通孔の前記くびれ部を境界とする第２面側内壁に、純水の滴下直後の動的接触角が３０度以下となる親水化処理を施すことを特徴とする細胞捕捉チップの製造方法。 The first surface and the second surface as main surfaces, and penetrates from the first surface toward the second surface, and in the inside thereof, the diameter is larger than the opening diameter of the first surface and the opening diameter of the second surface A substrate having a through-hole capable of capturing a single cell having a small constriction,
A method for producing a cell trapping chip, comprising subjecting a second surface side inner wall of the through hole as a boundary to a second surface side inner wall so that a dynamic contact angle immediately after dropping pure water is 30 degrees or less. . 前記親水化処理が、プラズマ照射である請求項１３または１４に記載の細胞捕捉チップの製造方法。   The method for producing a cell trapping chip according to claim 13 or 14, wherein the hydrophilization treatment is plasma irradiation. 前記親水化処理が、シリカコートである請求項１３または１４に記載の細胞捕捉チップの製造方法。   The method for producing a cell-trapping chip according to claim 13 or 14, wherein the hydrophilization treatment is silica coating. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞捕捉チップの前記第１面に、細胞懸濁液を滴下して、前記貫通孔に単一細胞を捕捉させることを特徴とする細胞捕捉方法。   A cell trapping method, wherein a cell suspension is dropped onto the first surface of the cell trapping chip according to any one of claims 1 to 12, and a single cell is trapped in the through-hole. .

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