JP2018033419A - Cell culture device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞を培養するための細胞培養装置に関する。 The present invention relates to a cell culture apparatus for culturing cells.
幹細胞は臓器や組織を形成し得る細胞であり、成体であってもほとんどの臓器や組織に存在していると考えられている。幹細胞のうち胚細胞（ＥＳ細胞）は万能細胞であり全ての組織や臓器に分化する能力を持っている。一方、体性幹細胞は全ての臓器や組織に分化できるわけでなく特定の組織や臓器に分化する。ヒト組織から採取できる体性幹細胞は、患者自身から採取でき拒絶反応の恐れがないため再生医療に対する移植材料として注目されている。 Stem cells are cells that can form organs and tissues, and are considered to be present in most organs and tissues even in adults. Among stem cells, embryonic cells (ES cells) are all-purpose cells and have the ability to differentiate into all tissues and organs. On the other hand, somatic stem cells cannot differentiate into all organs and tissues, but differentiate into specific tissues and organs. Somatic stem cells that can be collected from human tissues are attracting attention as transplant materials for regenerative medicine because they can be collected from patients themselves and there is no fear of rejection.
ヒトにおける体性幹細胞は、現在までに間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、心筋幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、骨髄幹細胞、網膜幹細胞、角膜内皮幹細胞などが知られている。しかし、幹細胞が組織に含まれる割合は極めて微量である。 Somatic stem cells in humans are known to date, such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, cardiac muscle stem cells, pancreatic stem cells, skin stem cells, bone marrow stem cells, retinal stem cells, corneal endothelial stem cells, and the like. However, the proportion of stem cells contained in the tissue is extremely small.
体外で培養した体性幹細胞を、同一人又は他人の治療に使用するという再生医療が発達し、一部では実用化され始めている。このような再生医療に於いては、人体から採取した少量の細胞を体外において移植に必要な細胞数にまで増やす作業が必要となる。また、体外において培養する際は、培養細胞の汚染を防止することが重要である。 Regenerative medicine has been developed in which somatic stem cells cultured outside the body are used for the treatment of the same person or others, and some have begun to be put into practical use. In such regenerative medicine, it is necessary to increase the number of cells collected from the human body to the number of cells necessary for transplantation outside the body. In addition, when culturing outside the body, it is important to prevent contamination of cultured cells.
再生医療に用いる細胞の培養は現在、細胞プロセシングセンタ（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ：ＣＰＣ）という細胞培養用クリーンルームの中で、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）に準拠して行われている（非特許文献１）。 Culture of cells used for regenerative medicine is currently performed in accordance with GMP (Good Manufacturing Practice) in a cell culture clean room called a cell processing center (CPC) (Non-patent Document 1).
この場合の課題として、幹細胞の培養は技術者の手によって行われるために、患者１名分の細胞の調製に対して労力とコストが非常にかかるという点と、手動で操作することによる生物学的汚染リスクがあるという点である。 In this case, stem cells are cultivated by an engineer's hand, so that it takes much labor and cost to prepare cells for one patient, and biology by manual operation. There is a risk of global contamination.
そのため、再生医療の実用化には安全で低コストの幹細胞培養が求められており、インキュベーション、培地交換作業、継代操作等を細胞培養完了まで繰り返し自動で行う自動化装置の開発が急務である。 Therefore, safe and low-cost stem cell culture is required for practical use of regenerative medicine, and there is an urgent need to develop an automated apparatus that automatically repeats incubation, medium exchange work, passage operation, and the like until cell culture is completed.
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、特定の範囲のガス透過性を有する材料を用いることにより、ガス交換装置を追加することなく細胞培養を行うことができる装置を提供するものである。 The present invention has been made to solve the above-described problems, and provides an apparatus capable of performing cell culture without adding a gas exchange device by using a material having gas permeability in a specific range. To do.
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１）少なくとも細胞培養容器、培養液貯留容器、前記細胞培養容器と前記培養液貯留容器とを接続するための流路管をＣＯ２インキュベーター内に設置して細胞の培養を行う細胞培養装置であって、前記培養液貯留容器および前記流路管がガス透過性であることを特徴とする装置。
（２）前記培養液貯留容器の３７℃における酸素透過度が１５０×１０−１０ｃｍ３／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上、二酸化炭素透過度が７００×１０−１０ｃｍ３／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上である、（１）に記載の装置。
（３）前記流路管の３７℃における酸素透過度が１５０×１０−１０ｃｍ３／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上であり、二酸化炭素透過度が４５０×１０−１０ｃｍ３／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上である、（１）または（２）に記載の装置。
（４）前記細胞培養容器は、中空糸膜が複数本内挿され、中空糸膜内腔側と中空糸膜外腔側が区画されたものである、（１）〜（３）のいずれかに記載の装置。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の装置を用いる幹細胞の培養方法。
That is, this invention consists of the following structures.
(1) A cell culture apparatus for culturing cells by installing at least a cell culture container, a culture solution storage container, and a channel tube for connecting the cell culture container and the culture solution storage container in a CO 2 incubator The culture medium storage container and the flow path tube are gas permeable.
(2) The culture medium storage container has an oxygen permeability at 37 ° C. of 150 × 10 −10 cm 3 / (cm 2 · sec · cmHg) or more and a carbon dioxide permeability of 700 × 10 −10 cm 3 / (cm 2). (Sec) cmHg) The apparatus according to (1).
(3) The oxygen permeability at 37 ° C. of the channel tube is 150 × 10 −10 cm 3 / (cm 2 · sec · cmHg) or more, and the carbon dioxide permeability is 450 × 10 −10 cm 3 / (cm The apparatus according to (1) or (2), which is 2 · sec · cmHg) or more.
(4) In the cell culture container, any one of (1) to (3), wherein a plurality of hollow fiber membranes are inserted and the hollow fiber membrane lumen side and the hollow fiber membrane outer lumen side are partitioned. The device described.
(5) A method for culturing a stem cell using the apparatus according to any one of (1) to (4).
本発明の構成により、雑多な細胞集団の中に極少数しか存在しない間葉系幹細胞などの各種細胞を、従来法と比較して、安全、簡便かつ高効率に培養することのできる細胞培養装置の提供を可能にする。 By the configuration of the present invention, a cell culture apparatus capable of culturing various cells such as mesenchymal stem cells, which are present in a very small number in a diverse cell population, in a safe, simple and highly efficient manner as compared with conventional methods. Enables the provision of
本発明の装置は、少なくとも細胞培養容器、培養液貯留容器、前記細胞培養容器と前記培養液貯留容器とを接続するための流路管をＣＯ２インキュベーター内に設置して細胞の培養を行う細胞培養装置であって、前記培養液貯留容器および前記流路管がガス透過性であることを特徴とする。 The apparatus of the present invention is a cell in which cells are cultured by installing in a CO 2 incubator at least a cell culture container, a culture solution storage container, and a channel tube for connecting the cell culture container and the culture solution storage container. In the culture apparatus, the culture medium storage container and the flow path tube are gas permeable.
前記培養装置全体の大きさについては、特に制限はないが、好ましくはＣＯ２インキュベーター内に設置可能な小型のものである。培養装置は小型のため、複数台同時にＣＯ２インキュベーター内に設置することも可能である。また、培養装置全体の重量については、特に制限はないが、好ましくはＣＯ２インキュベーター内に設置可能な程度の軽量なものである。 The size of the entire culture apparatus is not particularly limited, but is preferably a small one that can be installed in a CO 2 incubator. Since the culture apparatus is small, a plurality of culture apparatuses can be installed in the CO 2 incubator at the same time. The weight of the entire culture apparatus is not particularly limited, but is preferably light enough to be installed in a CO 2 incubator.
（細胞培養容器）
本発明において、細胞培養容器に用いる培養基材の形態は特に限定されないが、好ましくは比表面積の大きい形態である。比表面積の大きい培養基材を用いることにより、市販のＣＯ２インキュベーター内に設置することが可能な小型培養装置を実現することができる。前記比表面積の大きい形態としては、例えば、中空糸膜、不織布、ナノファイバーなどが挙げられる。
(Cell culture vessel)
In the present invention, the form of the culture substrate used for the cell culture vessel is not particularly limited, but is preferably a form having a large specific surface area. By using a culture substrate having a large specific surface area, a small culture device that can be installed in a commercially available CO 2 incubator can be realized. Examples of the form having a large specific surface area include hollow fiber membranes, nonwoven fabrics, and nanofibers.
本発明において、細胞培養容器の大きさは、必要細胞数に応じて、選択することができる。一般に、必要細胞数が多いほど大きな細胞培養容器を用いることが好ましい。また、細胞の保有量と必要量との差が大きい場合は適宜段階的にスケールアップしても良い。例えば、中空糸膜の内表面において細胞を培養する際は、細胞数は、中空糸膜の内表面積に比例するので、体性幹細胞のように初期の細胞数が少ない場合は、培養初期は比較的小型のモジュールを用い、段階的にモジュールを大きくすることにより、大量の体性幹細胞を得ることができる。 In the present invention, the size of the cell culture container can be selected according to the required number of cells. In general, it is preferable to use a larger cell culture container as the required number of cells increases. In addition, when the difference between the amount of cells held and the required amount is large, it may be scaled up as appropriate. For example, when culturing cells on the inner surface of the hollow fiber membrane, the number of cells is proportional to the inner surface area of the hollow fiber membrane. A large amount of somatic stem cells can be obtained by gradually increasing the size of the module using a small-sized module.
本発明において、培養基材として中空糸膜を用いる場合、細胞を中空糸膜表面に保持でき、溶液や低分子の物質を透過させるような構造をとることができるものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、セルロースアセテート、再生セルロースなどのセルロース系樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、フッ素系樹脂、ポリアミド、ポリエーテルスルホン、ポリフッ化ビニリデン等が好適に利用できる。また、これらの誘導体が主成分であっても良い。また、これらの素材に化学的に修飾を加えたものであっても良い。例えば、使用する中空糸膜は、親水化処理されていることが好ましい。中空糸膜を親水化処理することにより、培養細胞への培養液等の液体成分の供給が容易になる。さらに、中空糸膜への細胞の接着性向上のため、コラーゲンやフィブロネクチン等をコートしても良い。 In the present invention, when a hollow fiber membrane is used as a culture substrate, it is particularly limited as long as it can hold cells on the surface of the hollow fiber membrane and can take a structure that allows a solution or a low-molecular substance to permeate. For example, cellulose resin such as cellulose acetate and regenerated cellulose, polyethylene, polypropylene, polysulfone, polystyrene, polyvinyl alcohol, polymethyl methacrylate, polyacrylonitrile, fluorine resin, polyamide, polyethersulfone, polyvinylidene fluoride, etc. Can be suitably used. These derivatives may be the main component. Further, these materials may be chemically modified. For example, the hollow fiber membrane to be used is preferably hydrophilized. By hydrophilizing the hollow fiber membrane, it becomes easy to supply a liquid component such as a culture solution to the cultured cells. Furthermore, collagen, fibronectin, or the like may be coated to improve the adhesion of cells to the hollow fiber membrane.
本発明において、培養基材として中空糸膜を用いる場合、内径は好ましくは２０〜５００μｍ、より好ましくは５０〜３００μｍ程度のものが利用される。膜厚は、適度な強度を保ち、かつ物質の透過性が良好な範囲で設定すればよく、１０〜１００μｍ程度が好ましい。 In the present invention, when a hollow fiber membrane is used as the culture substrate, the inner diameter is preferably 20 to 500 μm, more preferably about 50 to 300 μm. The film thickness may be set in a range that maintains an appropriate strength and the permeability of the substance is good, and is preferably about 10 to 100 μm.
本発明において、中空糸膜の細孔径は、細胞は通過しないが水、塩類、蛋白質などの培養液成分は通過するものであれば、特に限定されるものでなく、１ｎｍ〜１００ｎｍ程度が好ましく、５ｎｍ〜５０ｎｍ程度がより好ましい。 In the present invention, the pore diameter of the hollow fiber membrane is not particularly limited as long as cells do not pass through but culture fluid components such as water, salts and proteins pass through, and are preferably about 1 nm to 100 nm. About 5 nm to 50 nm is more preferable.
本発明において、細胞培養容器は、例えば図６に示されるように、４つの開口部（端部導管および側部導管）を有し、培養基材である中空糸膜３２の両端においてモジュールケース３１に接着固定されている。２つの端部導管３３ａ、３３ｂはそれぞれ中空糸膜の内腔（中空部）と連通しており、例えば前記端部導管３３ａから導入された流体が中空糸膜の内腔を移動して端部導管３３ｂから導出されるように構成されている。一方、側部導管３４ａ、３４ｂは、前記モジュールケース３１の内側かつ前記中空糸膜の外側である空間（以下、単に「外腔側」とも呼ぶ。）と連通しており、例えば前記側部導管３４ａから導入された流体がモジュール１７の外腔側を移動して側部導管３４ｂから導出されるように構成されている。 In the present invention, as shown in FIG. 6, for example, the cell culture container has four openings (end conduit and side conduit), and module cases 31 at both ends of the hollow fiber membrane 32 as a culture substrate. It is fixed to the adhesive. The two end conduits 33a and 33b communicate with the lumen (hollow portion) of the hollow fiber membrane, respectively. For example, the fluid introduced from the end conduit 33a moves through the lumen of the hollow fiber membrane to end the end portion. It is comprised so that it may derive | lead-out from the conduit | pipe 33b. On the other hand, the side conduits 34a and 34b communicate with a space inside the module case 31 and outside the hollow fiber membrane (hereinafter also simply referred to as “external cavity side”). The fluid introduced from 34a is configured to move out of the outer space side of the module 17 and be led out from the side conduit 34b.
前記モジュールを用いる場合、細胞培養は、中空糸膜の内腔側または外腔側のいずれにおいて行っても良いが、内腔側で培養を行う方が好ましい。例えば、内腔側にて細胞を培養する際は、細胞縣濁液を端部導管より注入して内腔側に充填することにより細胞を中空糸膜内表面に播種した後、細胞懸濁液を培地に切り換えて灌流させ、一定期間培養を行う。この間、同時に、外腔側へも、培地を側部導管より注入し灌流させることが好ましい。培養期間中、ガス交換、細胞への栄養供給および老廃物除去のため、内腔側、外腔側ともに培地を一方向に供給し続けることが好ましい。なお、内腔側および外腔側に灌流させる培地は、並流でも良いし向流でも良い。その際、後述のポンプ等を用いることにより、適切な速度で循環させたり、供給・排出したりする。 When the module is used, cell culture may be performed on either the lumen side or the outer lumen side of the hollow fiber membrane, but it is preferable to perform the culture on the lumen side. For example, when culturing cells on the lumen side, a cell suspension is injected into the inner surface of the hollow fiber membrane by injecting a cell suspension from the end conduit and filling the lumen side, and then the cell suspension The medium is perfused by switching to a medium and cultured for a certain period of time. During this time, it is preferable that the culture medium is also injected into the outer space side from the side conduit and perfused. During the culture period, it is preferable to continuously supply the medium in one direction on both the lumen side and the outer lumen side in order to exchange gas, supply nutrients to cells, and remove waste products. In addition, the culture medium to be perfused toward the lumen side and the outer lumen side may be a parallel flow or a counter flow. At that time, it is circulated at an appropriate speed or supplied / discharged by using a pump or the like described later.
培養容器に中空糸モジュールを用いることにより、細胞へ常に新鮮な培地を供給することができ、培養基材にシャーレや多段フラスコ等を用いる際に必要な交換作業は不要となり、作業者の拘束時間を減らすことができる。 By using a hollow fiber module in the culture vessel, it is possible to always supply fresh medium to the cells, eliminating the need for replacement work when using a petri dish or a multistage flask as the culture substrate, and restraining the operator Can be reduced.
（液体培地貯留容器）
本発明において、液体培地貯留容器の素材は、特に限定されないが、成形加工性に優れ、ガンマ線滅菌等に耐えうるものであり、かつ内部の様子を観察することができる透明性の高い材料であることが好ましい。具体的には、液体培地貯留容器のガス透過度は、３７℃における酸素透過度が１５０×１０−１０ｃｍ３／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上、二酸化炭素透過度が７００×１０−１０ｃｍ３／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上であることが好ましい。このような材料としては、ポリプロピレン（ＰＰ）（酸素透過係数：２．５×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：１１．３×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）（酸素透過係数：３．０×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：１２．６×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））、ポリスチレン（ＰＳｔ）（酸素透過係数：３．１×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：１４．１×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））などが挙げられる。また、これら複数の材料を使用した積層体であってもよい。前記材料を用いて、酸素透過度および二酸化炭素透過度が所望の値になるように、大きさや厚みを調整して培養液貯留容器を作製すればよいが、強度やガス透過性を両立する上で、容器の厚みは３０〜３００μｍが好ましく、６０〜２００μｍがより好ましい。
(Liquid medium storage container)
In the present invention, the material of the liquid medium storage container is not particularly limited, but it is excellent in molding processability, can withstand gamma ray sterilization and the like, and is a highly transparent material capable of observing the inside. It is preferable. Specifically, the gas permeability of the liquid medium storage container is such that the oxygen permeability at 37 ° C. is 150 × 10 −10 cm 3 / (cm 2 · sec · cmHg) or more, and the carbon dioxide permeability is 700 × 10 −10. It is preferably cm 3 / (cm 2 · sec · cmHg) or more. As such a material, polypropylene (PP) (oxygen permeability coefficient: 2.5 × 10 −10 cm 3 (STP) · cm / (cm 2 · sec · cmHg), carbon dioxide permeability coefficient: 11.3 × 10 6 −10 cm 3 (STP) · cm / (cm 2 · sec · cmHg)), low density polyethylene (LDPE) (oxygen permeability coefficient: 3.0 × 10 −10 cm 3 (STP) · cm / (cm 2 · sec · cmHg), carbon dioxide permeability coefficient: 12.6 × 10 −10 cm 3 (STP) · cm / (cm 2 · sec · cmHg)), polystyrene (PSt) (oxygen permeability coefficient: 3.1 × 10 − 10 cm 3 (STP) · cm / (cm 2 · sec · cmHg), carbon dioxide permeability coefficient: 14.1 × 10 −10 cm 3 (STP) · cm / (cm 2 · sec · cmHg)), etc. It is done. Moreover, the laminated body using these several materials may be sufficient. A culture medium storage container may be prepared by adjusting the size and thickness so that the oxygen permeability and the carbon dioxide permeability become desired values using the above materials. However, in order to achieve both strength and gas permeability. The thickness of the container is preferably 30 to 300 μm, more preferably 60 to 200 μm.
本発明において、液体培地貯留容器の形態は特に限定されないが、液体培地を外部に供給できる開口部を少なくとも１つ有している必要がある。前記開口部は、培地を前記細胞培養容器に供給できるように、後述の流路網に接続可能に構成されていることが好ましい。また、液体培地の蒸発を防止し、汚染の危険性を低減できるように、前記開口部は、未使用時は密栓でき、使用時は培地が外部と接触できない状態で流路に接続（例えば、無菌コネクターによる相互接続）できるよう構成されていることが好ましい。また、前記開口部以外の部分は、容器内の培地が外部と接触できないよう構成されていることが好ましい。 In the present invention, the form of the liquid medium storage container is not particularly limited, but it is necessary to have at least one opening that can supply the liquid medium to the outside. The opening is preferably configured to be connectable to a channel network described later so that a culture medium can be supplied to the cell culture container. In addition, the opening can be sealed when not in use and connected to the flow path in a state where the medium cannot be in contact with the outside when in use so as to prevent evaporation of the liquid medium and reduce the risk of contamination (for example, It is preferable to be configured so that it can be interconnected by a sterile connector. Moreover, it is preferable that parts other than the said opening part are comprised so that the culture medium in a container cannot contact the exterior.
（流路管）
本発明において、細胞培養容器と培養液貯留容器とを接続するための流路管は、３７℃における酸素透過度が１５０×１０−１０ｃｍ３／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上、二酸化炭素透過度が４５０×１０−１０ｃｍ３／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上であることが好ましい。このような材料としては、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）（酸素透過係数：４．９×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：１５×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））、テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）（酸素透過係数：６．３×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：１８×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）（酸素透過係数：６．７×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：１８．３×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））、ポリ４メチルペンテン−１（ＰＭＰ）（酸素透過係数：２４．４×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：７２．３×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））、シリコーン（酸素透過係数：６０５×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）、二酸化炭素透過係数：３０００×１０−１０ｃｍ３（STP）・ｃｍ／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ））などが挙げられる。また、これらを使用した積層体であってもよいが、これらに限定されるものではない。これらの材料を用いて、酸素透過度および二酸化炭素透過度が所望の値になるように、大きさや厚みを調整して流路管（チューブ）を作製すればよいが、強度やガス透過性を両立する上で、チューブの厚みは０．５ｍｍ〜５ｍｍが好ましい。なお、ガス透過性が高すぎる場合は、チューブ内に気泡が発生し、培養液（培地）の流れを阻害することがあるので、培養液を適度に加圧するなどして気泡の発生を抑制することが好ましい。しかし、培養液を加圧しすぎると、培地流速をコントロールできなくなるので、チューブは、３７℃における酸素透過度が１０００×１０−１０ｃｍ３／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以下、二酸化炭素透過度が５０００×１０−１０ｃｍ３／（ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以下であることが好ましい。
(Channel pipe)
In the present invention, the channel tube for connecting the cell culture container and the culture solution storage container has an oxygen permeability of 150 × 10 −10 cm 3 / (cm 2 · sec · cmHg) or more at 37 ° C., carbon dioxide The transmittance is preferably 450 × 10 −10 cm 3 / (cm 2 · sec · cmHg) or more. Examples of such a material include tetrafluoroethylene / hexafluoropropylene copolymer (FEP) (oxygen permeability coefficient: 4.9 × 10 −10 cm 3 (STP) · cm / (cm 2 · sec · cmHg), Carbon permeability coefficient: 15 × 10 −10 cm 3 (STP) · cm / (cm 2 · sec · cmHg)), tetrafluoroethylene / perfluoroalkyl vinyl ether copolymer (PFA) (oxygen permeability coefficient: 6.3 × 10 −10 cm 3 (STP) · cm / (cm 2 · sec · cmHg), carbon dioxide permeability coefficient: 18 × 10 −10 cm 3 (STP) · cm / (cm 2 · sec · cmHg)), polytetra fluoroethylene (PTFE) (oxygen permeability coefficient: 6.7 × 10 -10 cm 3 ( STP) · cm / (cm 2 · sec · cmHg), carbon dioxide permeability coefficient: 8.3 × 10 -10 cm 3 (STP ) · cm / (cm 2 · sec · cmHg)), poly 4-methylpentene -1 (PMP) (oxygen permeability coefficient: 24.4 × 10 -10 cm 3 ( STP ) · Cm / (cm 2 · sec · cmHg), carbon dioxide permeability coefficient: 72.3 × 10 −10 cm 3 (STP) · cm / (cm 2 · sec · cmHg)), silicone (oxygen permeability coefficient: 605) × 10 −10 cm 3 (STP) · cm / (cm 2 · sec · cmHg), carbon dioxide permeability coefficient: 3000 × 10 −10 cm 3 (STP) · cm / (cm 2 · sec · cmHg)) Can be mentioned. Moreover, although the laminated body using these may be sufficient, it is not limited to these. Using these materials, it is sufficient to adjust the size and thickness so that the oxygen permeability and carbon dioxide permeability become the desired values, and the flow path tube (tube) can be produced. In order to achieve both, the thickness of the tube is preferably 0.5 mm to 5 mm. If the gas permeability is too high, bubbles may be generated in the tube, which may impede the flow of the culture medium (medium). It is preferable. However, since the culture medium flow rate cannot be controlled if the culture medium is excessively pressurized, the tube has an oxygen permeability at 37 ° C. of 1000 × 10 −10 cm 3 / (cm 2 · sec · cmHg) or less, and a carbon dioxide permeability. Is preferably 5000 × 10 −10 cm 3 / (cm 2 · sec · cmHg) or less.
（ＣＯ２インキュベーター）
本発明において、少なくとも細胞培養容器、培養液貯留容器、前記細胞培養容器と前記培養液貯留容器とを接続するための流路管をＣＯ２インキュベーター内に設置して細胞の培養を行うのが好ましい。ＣＯ２インキュベーターは、ＣＯ２の濃度を一定に維持する機能だけでなく、恒温機としての役割も有しており、少なくとも細胞培養容器、培養液貯留容器、および前記流路管をＣＯ２インキュベーター内に設置することにより、必要な培養環境を整えることができる。ＣＯ２の濃度や温度は培養する細胞に合わせて適宜設定すればよい。このようなＣＯ２インキュベーターとしては、例えば、Ｐａｎａｓｏｎｉｃ株式会社、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ヤマト科学株式会社などより入手可能である。
(CO 2 incubator)
In the present invention, it is preferable to perform cell culture by installing in a CO 2 incubator at least a cell culture container, a culture solution storage container, and a flow channel tube for connecting the cell culture container and the culture solution storage container. . CO 2 incubator, not only the ability to maintain the concentration of CO 2 at a constant, has a role as thermostat, at least a cell culture vessel, the culture fluid reservoir, and the passage tube the CO 2 incubator The necessary culture environment can be prepared by installing in the above. The concentration and temperature of the CO 2 may be set as appropriate depending on the cells to be cultured. Such a CO 2 incubator can be obtained from, for example, Panasonic Corporation, Thermo Fisher Scientific Inc., Yamato Science Co., Ltd.
（液体の供給、排出などを制御する手段）
細胞懸濁液や培地などの液体の供給方法の形態は、特に限定されるものではないが、流路内に設置したポンプを用いて送液する方法や、液体培地貯留容器が培養バッグなど軟質のものである場合には前記容器をローラー間に挟んで培地を絞り出す方法等を採用できる。ポンプの設置場所は特に限定されないが、液体がポンプ部分を通過する際にゴミが混入する等のリスクを避けるため、排出側に設置することが好ましい。
(Means for controlling liquid supply and discharge)
The form of supplying a liquid such as a cell suspension or a medium is not particularly limited, but a method of feeding liquid using a pump installed in the flow path, or a liquid medium storage container is soft such as a culture bag. For example, a method of squeezing the culture medium by sandwiching the container between rollers can be adopted. The installation location of the pump is not particularly limited, but it is preferable to install the pump on the discharge side in order to avoid the risk of contamination of liquid when the liquid passes through the pump portion.
（培養の対象となる細胞）
本発明において、対象となる細胞は、接着性の動物細胞が好適である。細胞の由来も特に限定されず、ヒト、マウス、ラット等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、初代培養細胞及び株化細胞の双方を対象とすることができる。例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｌ９２９細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＫＧ−１ａ細胞などの株化細胞あるいは、各種ハイブリドーマ細胞株などが挙げられる。また、神経細胞、角質化細胞、繊維芽細胞、肺上皮細胞、肝細胞、血液細胞などのプライマリー細胞などが挙げられる。さらに、ＥＳ細胞、造血幹細胞、肝幹細胞、間葉系幹細胞などの幹細胞、前駆細胞でもよい。また、これらの細胞は、培養前に外来遺伝子を導入した細胞であってもよいし、抗体やリガンドなどの刺激因子などで予め刺激、加工されている細胞であっても良い。
(Cells to be cultured)
In the present invention, the target cell is preferably an adherent animal cell. The origin of the cell is not particularly limited, and those derived from any animal such as human, mouse, rat and the like can be used. Moreover, both primary culture cells and established cells can be targeted. Examples include cell lines such as NIH3T3 cells, Hela cells, COS cells, HEK cells, L929 cells, Daudi cells, Jurkat cells, KG-1a cells, and various hybridoma cell lines. Moreover, primary cells such as nerve cells, keratinocytes, fibroblasts, lung epithelial cells, hepatocytes, blood cells and the like can be mentioned. Furthermore, stem cells and progenitor cells such as ES cells, hematopoietic stem cells, hepatic stem cells, and mesenchymal stem cells may be used. In addition, these cells may be cells into which a foreign gene has been introduced before culturing, or may be cells that have been previously stimulated and processed with stimulating factors such as antibodies and ligands.
（細胞の播種）
本発明において、細胞培養容器に細胞を播種する手段は、特に限定されない。一例として、前記液体培地貯留容器を利用する方法が挙げられる。この方法は、液体培地貯留容器に播種したい細胞を懸濁した溶液を入れ、細胞培養容器に流し込み灌流させる方法である。播種終了後、液体培地貯留容器を細胞を含まない培地が入ったものに切り換えて灌流させ培養を行えばよい。この方法は、播種したい細胞を含む溶液の液量が多いときに用いるのが好適である。液量（細胞数）が少ない場合は、前記液体培地貯留容器と細胞培養容器を接続する流路の途中にシリンジ等を用いて細胞懸濁液を注入できる手段を設けても良い。
(Cell seeding)
In the present invention, the means for seeding the cells in the cell culture container is not particularly limited. As an example, a method using the liquid medium storage container can be mentioned. This method is a method in which a solution in which cells to be seeded are suspended is placed in a liquid medium storage container, and poured into a cell culture container for perfusion. After the seeding is completed, the liquid medium storage container may be switched to a medium containing a medium not containing cells and perfused for culturing. This method is preferably used when the amount of the solution containing cells to be seeded is large. When the amount of liquid (number of cells) is small, a means for injecting the cell suspension using a syringe or the like may be provided in the middle of the flow path connecting the liquid medium storage container and the cell culture container.
（細胞の培養）
本発明において、細胞培養容器として中空糸膜を内挿したモジュールを用いる場合、細胞培養容器への培地の供給は、内腔側および外腔側の２ルートが必要である。その際、培地の供給にあたり、液体培地貯留容器は内腔側および外腔側で別々のものを用いても良いし、１つの容器から内腔側および外腔側の両方に培地を供給しても良い。この場合、内腔側の培地組成と外腔側の培地組成は同一であっても異なっていても良い。また、内腔側の流速と外腔側の流速は同一であっても異なっていても良いが、外腔側の流速を早めるのが好ましい。細胞が播種された側（内腔側）に通液する培地の好ましい平均流速は、０．１〜１ｍｍ／ｍｉｎである。一方、細胞が播種されていない側（外腔側）に通液する培地の好ましい平均流速は、２〜５ｍｍ／ｍｉｎである。なお、培養に用いられる培地は、培養細胞の種類に応じて決定され、当該細胞の培地として通常用いられるものであればよい。
(Cell culture)
In the present invention, when a module in which a hollow fiber membrane is inserted is used as a cell culture container, the medium supply to the cell culture container requires two routes on the lumen side and the outer lumen side. At that time, liquid medium storage containers may be used separately on the lumen side and the outer lumen side in supplying the medium, or the medium is supplied from one container to both the lumen side and the outer lumen side. Also good. In this case, the medium composition on the lumen side and the medium composition on the outer lumen side may be the same or different. The flow rate on the lumen side and the flow rate on the outer lumen side may be the same or different, but it is preferable to increase the flow rate on the outer lumen side. A preferable average flow rate of the medium passing through the cell-seeded side (lumen side) is 0.1 to 1 mm / min. On the other hand, a preferable average flow rate of the medium passing through the side not seeded with cells (external space side) is 2 to 5 mm / min. In addition, the culture medium used for culture | cultivation is determined according to the kind of cultured cell, and should just be normally used as a culture medium of the said cell.
細胞の播種および／または培養中は、細胞培養容器の振とうやローリング等を行っても良い。このような操作を行うことは、細胞培養容器内に均一に細胞を播種することができる、気泡が発生した場合に取り除くことができる、培養細胞に満遍なく培地の栄養が行き渡る、などの点で好ましい。 During cell seeding and / or culture, the cell culture vessel may be shaken or rolled. It is preferable to perform such an operation in that the cells can be uniformly seeded in the cell culture container, can be removed when bubbles are generated, and the culture medium is evenly distributed to the cultured cells. .
（モニタリング装置等）
本発明の細胞培養装置は、ｐＨ、グルコース、乳酸塩、酸素等といった細胞代謝物質の成分や濃度等を経時的にモニタリングする手段や分析手段を含んでも良い。例えば、検知のためのセンサーを含むことができる。センサーは、中空糸膜内側の出入り口または中空糸膜外側の出入り口のチューブの任意の位置に取り付けることができる。また、中空糸内側や中空糸外側の出口に、フラクションコレクターを取り付けることにより、定期的に培地を採取することもできる。
(Monitoring equipment, etc.)
The cell culture device of the present invention may include means for monitoring the components and concentrations of cellular metabolites such as pH, glucose, lactate, oxygen, etc., and analysis means over time. For example, a sensor for detection can be included. The sensor can be attached to any position of the tube inside or outside the hollow fiber membrane or the tube outside the hollow fiber membrane. Moreover, a culture medium can also be extract | collected regularly by attaching a fraction collector to the exit of a hollow fiber inner side or a hollow fiber outer side.
（作業コントローラー（作業パネル））
本発明において、細胞培養装置は、上記の操作や工程を行うため、またモニタリングを行うために、それらをコントロールするための作業コントローラー（作業パネル）を備えていても良い。
(Work controller (work panel))
In the present invention, the cell culture apparatus may be provided with a work controller (work panel) for controlling them in order to perform the above operations and processes and to perform monitoring.
（細胞の回収）
本発明において、培養した細胞を回収するための手段は、特に限定されない。例えば、培養容器として中空糸膜モジュールを用いる場合、培地の灌流を停止し、中空糸膜内側および外側に存在する培地を除去するため、二価陽イオンフリーのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を一定時間灌流させ、培地がＰＢＳに置換されたら、さらにＰＢＳを一定時間灌流した後、ＰＢＳを除去し、トリプシン等のプロテアーゼを中空糸内側と外側へ充填する。トリプシン処理により、培養細胞を中空糸膜表面から剥離させた後、培地等を用いて中空糸膜モジュールから押出し、回収する。
(Recovery of cells)
In the present invention, the means for collecting the cultured cells is not particularly limited. For example, when a hollow fiber membrane module is used as a culture container, bivalent cation-free phosphate buffered saline (PBS) is used to stop the perfusion of the medium and remove the medium existing inside and outside the hollow fiber membrane. When the medium is replaced with PBS for a certain period of time, PBS is further perfused for a certain period of time, and then PBS is removed and a protease such as trypsin is filled inside and outside the hollow fiber. The cultured cells are detached from the surface of the hollow fiber membrane by trypsin treatment, and then extruded from the hollow fiber membrane module using a medium or the like and collected.
（その他の構成）
本発明において、細胞培養装置は、必要により細胞回収容器、廃液回収容器を有していてもよい。細胞回収容器や廃液回収容器の形態は、特に限定されない。例えば、ガラス製ボトル、プラスチック製ボトル、培養バッグなどが挙げられる。
(Other configurations)
In the present invention, the cell culture device may have a cell collection container and a waste liquid collection container as necessary. The form of the cell collection container or the waste liquid collection container is not particularly limited. For example, a glass bottle, a plastic bottle, a culture bag, etc. are mentioned.
本発明の細胞培養装置及びその使用方法について、図面を参照しながら以下に説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。 The cell culture device and the method of using the same according to the present invention will be described below with reference to the drawings, but the present invention is not limited to the following description.
図１は本発明の細胞培養装置の構成例の一つを示す。図１において、１および２はそれぞれ、ガス透過性を有する液体培地貯留容器（培養バッグなど）である。液体培地貯留容器１からは、無菌接続コネクター１３およびバルブ４を経由して、細胞培養容器１７（中空糸モジュール。図６にその構成例を示す。）の端部導管３３ａに、流路が接続され、液体培地貯留容器１に入っている培地が細胞培養容器１７の内腔側に移送できるようになっている。他方、液体培地貯留容器２からは、無菌接続コネクター１４およびバルブ５を経由して、細胞培養容器（中空糸モジュール）１７の側部導管３４ａに、流路が接続され、液体培地貯留容器２に入っている培地が細胞培養容器１７の外腔側に移送できるようになっている。 FIG. 1 shows one configuration example of the cell culture apparatus of the present invention. In FIG. 1, reference numerals 1 and 2 denote gas-permeable liquid medium storage containers (such as culture bags), respectively. A flow path is connected from the liquid culture medium storage container 1 to the end conduit 33a of the cell culture container 17 (hollow fiber module, an example of which is shown in FIG. 6) via the aseptic connection connector 13 and the valve 4. Thus, the medium contained in the liquid medium storage container 1 can be transferred to the lumen side of the cell culture container 17. On the other hand, a flow path is connected from the liquid medium storage container 2 to the side conduit 34 a of the cell culture container (hollow fiber module) 17 via the aseptic connection connector 14 and the valve 5. The contained medium can be transferred to the outer cavity side of the cell culture container 17.
細胞培養容器１７の内腔側からは、バルブ７、バルブ１１、送液ポンプ２０、バルブ１２、無菌接続コネクター１６を経由して、廃液回収容器１８まで流路が接続され、細胞培養容器１７を通過した培地が廃棄できるようになっている。なお、前記流路に設けられた送液ポンプ２０により、液体培地貯留容器１から細胞培養容器１７への液体（培地など）の供給、前記細胞培養容器からの前記液体の排出、および前記液体の廃棄などにおける流速等を制御することができる。他方、細胞培養容器１７の外腔側からは、バルブ６、バルブ９、送液ポンプ１９、バルブ１０、無菌接続コネクター１６を経由して、廃液回収容器１８まで流路が接続され、細胞培養容器１７を通過した培地が廃棄できるようになっている。なお、前記流路に設けられた送液ポンプ１９により、液体培地貯留容器２から細胞培養容器１７への液体（培地など）の供給、前記細胞培養容器からの前記液体の排出、および前記液体の廃棄などにおける流速等を制御することができる。 From the lumen side of the cell culture container 17, a flow path is connected to the waste liquid collection container 18 via the valve 7, the valve 11, the liquid feeding pump 20, the valve 12, and the aseptic connection connector 16. The passed medium can be discarded. The liquid feed pump 20 provided in the flow path supplies a liquid (such as a medium) from the liquid medium storage container 1 to the cell culture container 17, discharges the liquid from the cell culture container, and the liquid. It is possible to control the flow rate and the like during disposal. On the other hand, from the outer cavity side of the cell culture container 17, a flow path is connected to the waste liquid collection container 18 via the valve 6, the valve 9, the liquid feeding pump 19, the valve 10, and the aseptic connection connector 16. The medium that has passed 17 can be discarded. In addition, the liquid feed pump 19 provided in the flow path supplies liquid (such as a medium) from the liquid medium storage container 2 to the cell culture container 17, discharges the liquid from the cell culture container, It is possible to control the flow rate and the like during disposal.
図１において、細胞回収容器３は、バルブ７、８および無菌接続コネクター１５を介して細胞培養容器１７の内腔側と連通している。必要により、この流路にさらにポンプ等を設けて、細胞を回収してもよい。なお、細胞の回収は、細胞培養容器１７を細胞培養装置から取り外して行ってもよく、その場合は、内腔側の廃棄系の流路の分岐から細胞回収容器３までの構成は無くてもよい。 In FIG. 1, the cell collection container 3 communicates with the lumen side of the cell culture container 17 through valves 7 and 8 and a sterile connection connector 15. If necessary, a pump or the like may be further provided in this flow path to collect cells. The cell may be collected by removing the cell culture container 17 from the cell culture device. In this case, there is no configuration from the branch of the waste-side flow path on the lumen side to the cell collection container 3. Good.
図１において、ＣＯ２インキュベーター４１は、前記の構成のほとんどをカバーしているが、ガス透過性を有する液体培地貯留容器１、２および細胞培養容器１７がカバーされていれば、その他の部分についてはＣＯ２インキュベーター４１の外側に配置されていても構わない。 In FIG. 1, the CO 2 incubator 41 covers most of the above-described configuration. However, if the liquid culture medium storage containers 1 and 2 and the cell culture container 17 having gas permeability are covered, the other parts are covered. May be arranged outside the CO 2 incubator 41.
図１において、作業コントローラー２１（作業パネル）は、上記の操作や工程を行うため、またモニタリングを行うため等の便宜のために設定してもよい。 In FIG. 1, the work controller 21 (work panel) may be set for convenience such as performing the above-described operations and processes and monitoring.
（中空糸膜の作製）
ポリエーテルスルホン（４８００Ｐ、住友化学社製）２０質量％、ポリビニルピロリドン（Ｋ−９０、ＢＡＳＦ社製）０．２質量％、Ｎ−メチルピロリドン３５．９１質量％、トリエチレングリコール４３．８９質量％を混合溶解し、脱泡したものを製膜溶液として、Ｎ−メチルピロリドン１３．５質量％、トリエチレングリコール１６．５質量％、水７０質量％水溶液を芯液として使用し、これを７０℃に加温した２重管オリフィスの外側、内側より同時に吐出し、３０ｃｍの空走部を経て、７５℃の水中（凝固浴中）に導き中空糸膜を形成し、水洗後巻き取った。糸束は切断後、６０℃にて通風乾燥させた。中空糸膜は、概ね内径２００μｍ、外径３００μｍ、膜厚５０μｍとなるように吐出量を調整した。
(Production of hollow fiber membrane)
20% by mass of polyethersulfone (4800P, manufactured by Sumitomo Chemical Co., Ltd.), 0.2% by mass of polyvinylpyrrolidone (K-90, manufactured by BASF), 35.91% by mass of N-methylpyrrolidone, 43.89% by mass of triethylene glycol As a film-forming solution, a solution obtained by mixing and dissolving is used as a core solution, and 13.5% by mass of N-methylpyrrolidone, 16.5% by mass of triethylene glycol, and 70% by mass of water are used as a core solution. The hollow fiber membrane was discharged simultaneously from the outside and inside of the double-tube orifice heated to 30 cm, and led to 75 ° C. water (in the coagulation bath) through a 30 cm idling portion. After cutting, the yarn bundle was dried by ventilation at 60 ° C. The discharge amount of the hollow fiber membrane was adjusted so that the inner diameter was approximately 200 μm, the outer diameter was 300 μm, and the film thickness was 50 μm.
（中空糸膜モジュールの作製）
本発明において、細胞培養容器である中空糸膜モジュールは以下のように作製した。直径１ｃｍ、長さ１０ｃｍの円筒状のポリカーボネート製モジュールケース内に中空糸膜を１００本充填した後、中空糸膜の中空部を閉塞しないようにポリウレタン系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、図６に示すような形状のモジュールを作製した。
(Production of hollow fiber membrane module)
In the present invention, a hollow fiber membrane module as a cell culture container was produced as follows. After filling 100 hollow fiber membranes into a cylindrical polycarbonate module case with a diameter of 1 cm and a length of 10 cm, both ends are fixed to the module case with a polyurethane potting agent so as not to block the hollow part of the hollow fiber membrane. A module having a shape as shown in FIG. 6 was produced.
（実施例１）
図２に、本実施例で用いた細胞培養装置の構成を簡略化して示す。培養液貯留容器は、中空糸内腔側および外腔側いずれも平均厚み７０μｍのポリエチレン製の培養バッグを使用した。また、培養液貯留容器と細胞培養容器とを接続する流路管は、中空糸内腔側および外腔側いずれも平均厚み１．５ｍｍのＰＭＰ製の流路管を使用した。
Example 1
FIG. 2 shows a simplified configuration of the cell culture apparatus used in this example. As the culture solution storage container, a polyethylene culture bag having an average thickness of 70 μm was used on both the hollow fiber lumen side and the outer lumen side. In addition, as the channel tube connecting the culture solution storage container and the cell culture vessel, a PMP channel tube having an average thickness of 1.5 mm was used on both the hollow fiber lumen side and the outer lumen side.
（実施例２）
実施例１と同様構成の細胞培養装置を用いた。培養液貯留容器は、中空糸内腔側および外腔側いずれも平均厚み１５０μｍのＰＥ製の培養バッグを使用した。また、培養液貯留容器と細胞培養容器とを接続する流路管は、中空糸内腔側および外腔側いずれも平均厚み１ｍｍのＰＭＰ製の流路管を使用した。
(Example 2)
A cell culture apparatus having the same configuration as in Example 1 was used. As the culture solution storage container, a PE culture bag having an average thickness of 150 μm was used for both the hollow fiber lumen side and the outer lumen side. In addition, as the channel tube connecting the culture solution storage container and the cell culture vessel, a PMP channel tube having an average thickness of 1 mm was used on both the hollow fiber lumen side and the outer lumen side.
（実施例３）
実施例１と同様構成の細胞培養装置を用いた。培養液貯留容器は、中空糸内腔側および外腔側いずれも平均厚み１５０μｍのＰＳｔ製の培養バッグを使用した。また、培養液貯留容器と細胞培養容器とを接続する流路管は、中空糸内腔側および外腔側いずれも実施例２と同様の流路管を使用した。
(Example 3)
A cell culture apparatus having the same configuration as in Example 1 was used. As the culture solution storage container, a culture bag made of PSt having an average thickness of 150 μm was used on both the hollow fiber lumen side and the outer lumen side. In addition, as the flow path pipe connecting the culture solution storage container and the cell culture container, the same flow path pipe as in Example 2 was used on both the hollow fiber lumen side and the outer lumen side.
（実施例４）
実施例１と同様構成の細胞培養装置を用いた。培養液貯留容器は、中空糸内腔側および外腔側いずれも実施例１と同様の培養バッグを使用した。また、培養液貯留容器と細胞培養容器とを接続する流路管は、中空糸内腔側および外腔側いずれも平均厚み３ｍｍのシリコーン製の流路管を使用した。
Example 4
A cell culture apparatus having the same configuration as in Example 1 was used. As the culture solution storage container, the same culture bag as in Example 1 was used for both the hollow fiber lumen side and the outer lumen side. The channel tube connecting the culture solution storage container and the cell culture vessel was a silicone channel tube having an average thickness of 3 mm on both the hollow fiber lumen side and the outer lumen side.
（比較例１）
実施例１と同様構成の細胞培養装置を用いた。培養液貯留容器は、中空糸内腔側および外腔側いずれもガス不透過性のガラス製ボトルを使用した。また、培養液貯留容器と細胞培養容器とを接続する流路管は、中空糸内腔側および外腔側いずれも実施例１と同様の流路管を使用した。
(Comparative Example 1)
A cell culture apparatus having the same configuration as in Example 1 was used. As the culture solution storage container, a gas-impermeable glass bottle was used for both the hollow fiber lumen side and the outer lumen side. In addition, as the channel tube connecting the culture solution storage container and the cell culture container, the same channel tube as in Example 1 was used on both the hollow fiber lumen side and the outer lumen side.
（比較例２）
実施例１と同様構成の細胞培養装置を用いた。培養液貯留容器は、中空糸内腔側および外腔側いずれもガス不透過性のガラス製ボトルを使用した。また、培養液貯留容器と細胞培養容器とを接続する流路管は、中空糸内腔側および外腔側いずれもガス不透過性の流路管（ポリウレタン製、厚み１．５ｍｍ）を使用した。
(Comparative Example 2)
A cell culture apparatus having the same configuration as in Example 1 was used. As the culture solution storage container, a gas-impermeable glass bottle was used for both the hollow fiber lumen side and the outer lumen side. In addition, as the channel tube connecting the culture solution storage container and the cell culture vessel, a gas-impermeable channel tube (made of polyurethane, thickness 1.5 mm) was used on both the hollow fiber lumen side and the outer lumen side. .
（細胞培養実験１：一般培養液使用）
図２に、細胞培養実験に用いた細胞培養装置の構成の概略を示す。培養液貯留容器と流路管は、実施例１から５および比較例１から３に記載の組合せを使用した。
細胞は、タカラバイオ株式会社より購入したプライマリーのヒト間葉系幹細胞を用いた。細胞播種密度は、１９００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２とした。培養液の流速は、中空糸内腔側は０．３３ｍｍ／ｍｉｎ、中空糸外腔側は３．４６ｍｍ／ｍｉｎとした。培養液はウシ胎児血清を１０％（ｖ／ｖ）添加したダルベッコ改変イーグル培地を用いた。培養液灌流用ポンプとして、中空糸内腔側灌流用と外腔側灌流用に計２台のペリスタ・バイオミニポンプ（アトー社製）（図２の２０（内腔側）および１９（外腔側））を用い、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、７日間培養した。培養液供給方法は、中空糸内腔側、中空糸外腔側ともに一方向とした。中空糸内腔側に間葉系幹細胞を播種し、２日間静置した後に中空糸内腔側の灌流を開始した。７日間培養後、培養液灌流を停止し、細胞培養容器内にて増殖した細胞を回収した。細胞回収時は、細胞解離試薬である０．２５％トリプシン溶液（ライフテクノロジーズ社製）を用いた。
(Cell culture experiment 1: Using general culture medium)
FIG. 2 shows an outline of the configuration of the cell culture apparatus used in the cell culture experiment. For the culture solution storage container and the channel tube, the combinations described in Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 to 3 were used.
The cells used were primary human mesenchymal stem cells purchased from Takara Bio Inc. The cell seeding density was 1900 cells / cm 2 . The flow rate of the culture solution was 0.33 mm / min on the hollow fiber lumen side and 3.46 mm / min on the hollow fiber outer lumen side. As the culture solution, Dulbecco's modified Eagle medium supplemented with 10% (v / v) fetal bovine serum was used. As a culture medium perfusion pump, a total of two peristal biomini pumps (manufactured by Ato) for hollow fiber lumen perfusion and outer lumen perfusion (20 (lumen side) and 19 (lumen side) in FIG. 2 )) And cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 7 days. The culture solution supply method was unidirectional on both the hollow fiber lumen side and the hollow fiber outer lumen side. Mesenchymal stem cells were seeded on the hollow fiber lumen side and allowed to stand for 2 days, and then perfusion on the hollow fiber lumen side was started. After culturing for 7 days, the culture medium perfusion was stopped and the cells grown in the cell culture vessel were collected. At the time of cell recovery, a cell dissociation reagent, 0.25% trypsin solution (manufactured by Life Technologies) was used.
（細胞培養実験２：低血清培養液使用）
細胞培養実験１と同様の細胞培養装置を用い、細胞培養実験２を行った。細胞は、タカラバイオ株式会社より購入したプライマリーのヒト間葉系幹細胞を用いた。この実験では、培養液として、ウシ胎児血清を１％（ｖ／ｖ）添加したＭＦ−ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡社製）を用いた。細胞播種密度は、１９００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２とした。培養液の流速は、中空糸内腔側は０．３３ｍｍ／ｍｉｎ、中空糸外腔側は３．４６ｍｍ／ｍｉｎとした。培養液灌流用ポンプに、中空糸内腔側灌流用と外腔側灌流用に計２台のペリスタ・バイオミニポンプ（アトー社製）（図２の２０（内腔側）および１９（外腔側））を使用した。ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、７日間培養した。培養液供給方法は、中空糸内腔側、中空糸外腔側ともに一方向とした。中空糸内腔側に間葉系幹細胞を播種し、２日間静置した後に中空糸内腔側の灌流を開始した。７日間培養後、培養液灌流を停止し、細胞培養容器内にて増殖した細胞を回収した。細胞回収時は、細胞解離試薬である０．２５％トリプシン溶液（ライフテクノロジーズ社製）を用いた。
(Cell culture experiment 2: Use of low serum medium)
Cell culture experiment 2 was performed using the same cell culture apparatus as cell culture experiment 1. The cells used were primary human mesenchymal stem cells purchased from Takara Bio Inc. In this experiment, MF-medium (registered trademark) mesenchymal stem cell growth medium (Toyobo Co., Ltd.) supplemented with 1% (v / v) fetal calf serum was used as the culture solution. The cell seeding density was 1900 cells / cm 2 . The flow rate of the culture solution was 0.33 mm / min on the hollow fiber lumen side and 3.46 mm / min on the hollow fiber outer lumen side. Two peristalum biomini pumps (manufactured by Ato) (for the hollow fiber lumen side perfusion and for the outer lumen side perfusion) (20 (lumen side) and 19 (lumen side) in FIG. 2) ))It was used. The cells were cultured at 37 ° C. for 7 days in a CO 2 incubator. The culture solution supply method was unidirectional on both the hollow fiber lumen side and the hollow fiber outer lumen side. Mesenchymal stem cells were seeded on the hollow fiber lumen side and allowed to stand for 2 days, and then perfusion on the hollow fiber lumen side was started. After culturing for 7 days, the culture medium perfusion was stopped and the cells grown in the cell culture vessel were collected. At the time of cell recovery, a cell dissociation reagent, 0.25% trypsin solution (manufactured by Life Technologies) was used.
（細胞培養実験３：無血清培養液使用）
細胞培養実験１と同様の細胞培養装置を用い、細胞培養実験３を行った。細胞は、タカラバイオ株式会社より購入したプライマリーのヒト間葉系幹細胞を用いた。この実験では、培養液として、血清無添加のＭＦ-ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡社製）を用いた。細胞播種密度は、１９００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２とした。培養液の流速は、中空糸内腔側は０．３３ｍｍ／ｍｉｎ、中空糸外腔側は３．４６ｍｍ／ｍｉｎとした。培養液灌流用ポンプに、中空糸内腔側灌流用と外腔側灌流用に計２台のペリスタ・バイオミニポンプ（アトー社製）（図２の２０（内腔側）および１９（外腔側））を使用した。ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、７日間培養した。培養液供給方法は、中空糸内腔側、中空糸外腔側ともに一方向とした。中空糸内腔側に間葉系幹細胞を播種し、２日間静置した後に中空糸内腔側の灌流を開始した。培養７日後、培養液灌流を停止し、細胞培養容器内にて増殖した細胞を回収した。細胞回収時は、細胞解離試薬である０．２５％トリプシン溶液（ライフテクノロジーズ社製）を用いた。
(Cell culture experiment 3: using serum-free medium)
Using the same cell culture apparatus as in cell culture experiment 1, cell culture experiment 3 was performed. The cells used were primary human mesenchymal stem cells purchased from Takara Bio Inc. In this experiment, serum-free MF-medium (registered trademark) mesenchymal stem cell growth medium (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used as the culture solution. The cell seeding density was 1900 cells / cm 2 . The flow rate of the culture solution was 0.33 mm / min on the hollow fiber lumen side and 3.46 mm / min on the hollow fiber outer lumen side. Two peristalum biomini pumps (manufactured by Ato) (for the hollow fiber lumen side perfusion and for the outer lumen side perfusion) (20 (lumen side) and 19 (lumen side) in FIG. 2) ))It was used. The cells were cultured at 37 ° C. for 7 days in a CO 2 incubator. The culture solution supply method was unidirectional on both the hollow fiber lumen side and the hollow fiber outer lumen side. Mesenchymal stem cells were seeded on the hollow fiber lumen side and allowed to stand for 2 days, and then perfusion on the hollow fiber lumen side was started. After 7 days of culture, the culture medium perfusion was stopped and the cells grown in the cell culture vessel were collected. At the time of cell recovery, a cell dissociation reagent, 0.25% trypsin solution (manufactured by Life Technologies) was used.
細胞培養実験の結果を表１にまとめて示す。実施例の結果から明らかなように、特定の範囲のガス透過性を有する培養液貯留容器および流路管（チューブ）を用いたものでは、比較例に比較して細胞増殖率（性）が明らかに高い結果となった。ただし、実施例４においては、チューブのガス透過性が高いためか、培養中、チューブ内に少量の気泡が確認された。
一方、ガス不透過性の培養液貯留容器とガス透過性チューブを用いた場合（比較例１）には、細胞増殖率が低い結果となった。また、ガス不透過性の培養液貯留容器とガス不透過性の流路管を用いた比較例２では、細胞培養装置内への酸素および炭酸ガスの供給ができないため、さらに細胞増殖率が低い結果となった。
The results of cell culture experiments are summarized in Table 1. As is clear from the results of the examples, the cell growth rate (sex) is clearer in comparison with the comparative example in the case of using the culture solution storage container and the channel tube (tube) having a gas permeability in a specific range. The result was very high. However, in Example 4, a small amount of bubbles was confirmed in the tube during the culture, probably because the gas permeability of the tube was high.
On the other hand, when a gas-impermeable culture medium storage container and a gas-permeable tube were used (Comparative Example 1), the cell growth rate was low. Further, in Comparative Example 2 using a gas-impermeable culture solution storage container and a gas-impermeable channel tube, oxygen and carbon dioxide cannot be supplied into the cell culture apparatus, so that the cell growth rate is lower. As a result.
本発明により、幹細胞をはじめとする各種細胞を、従来法と比較して、安全、簡便かつ高効率に培養することのできる細胞培養装置の提供を可能にする。 According to the present invention, it is possible to provide a cell culture apparatus capable of culturing various cells including stem cells in a safe, simple and highly efficient manner as compared with conventional methods.
１、２ 液体培地貯留容器
３ 細胞回収容器
４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ バルブ
１３、１４、１５、１６ 無菌接続コネクター
１７ 細胞培養容器
１８ 廃液回収容器
１９、２０ 送液ポンプ
２１ 作業コントローラー（作業パネル）
３１ モジュールケース
３２ 多孔質中空糸膜
３３ａ，ｂ 端部導管
３４ａ，ｂ 側部導管
４１ ＣＯ２インキュベーター
1, 2, Liquid medium storage container 3 Cell collection container 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 Valve 13, 14, 15, 16 Aseptic connection connector 17 Cell culture container 18 Waste liquid collection container 19, 20 Liquid feed pump 21 Work controller (work panel)
31 Module Case 32 Porous Hollow Fiber Membrane 33a, b End Conduit 34a, b Side Conduit 41 CO 2 Incubator
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