JP2018033362A - Method for predicting idiosyncratic drug toxicity using hla introduced cell - Google Patents

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Shigeki Aoki
重樹 青木
惣大 藤森
Sodai Fujimori
惣大 藤森
彬彬 宋
Binbin Song
彬彬 宋
晃成 伊藤
Kosei Ito
晃成 伊藤
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for predicting idiosyncratic drug toxicity.SOLUTION: The present invention provides a method for predicting the expression of idiosyncratic toxicity due to a test drug, characterized in that: in the presence of the test drug, a natural immunity-responsive animal cell having a gene polymorphism of human leukocyte antigen (HLA) introduced thereto is cultured, and changes in the expression level of HLA and the expression level of inflammatory cytokine are measured.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の遺伝子多型を導入した自然免疫応答性動物細胞を用いた特異体質薬物毒性の発現予測方法に関する。   The present invention relates to a method for predicting the expression of idiosyncratic drug toxicity using innate immune responsive animal cells into which a human leukocyte antigen (HLA) gene polymorphism has been introduced.

薬物毒性は、中毒性と特異体質性に大別される。中毒性の薬物毒性は、薬物自体の性質に起因して用量依存的に発現するため、前臨床段階での毒性評価が可能である一方、特異体質薬物毒性は、発症率が低く、既知の薬理学的作用とは無関係で用量依存的ではないとされ、前臨床段階での発見は困難である。   Drug toxicity is roughly divided into addictive and idiosyncratic. Because addictive drug toxicity occurs in a dose-dependent manner due to the nature of the drug itself, toxicity evaluation at the preclinical stage is possible, while idiosyncratic drug toxicity has a low incidence and is known It is not related to physical effects and is not dose-dependent, and is difficult to find at the preclinical stage.

近年、薬物による特異体質毒性とＨＬＡ遺伝子多型の関連性に注目が集まっており、例えば、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１多型と抗ウイルス薬アバカビルの服用による薬剤性過敏症や肝障害の発症、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０２多型と抗てんかん薬カルバマゼピン服用によるスティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）／中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）の発症に相関が認められている（非特許文献１、２）。特異体質薬物毒性とＨＬＡ遺伝子多型との関連性は、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）などから多数示唆されているが、そのどれもが事後報告であって、臨床において実際に生じた毒性被害に基づき関連ＨＬＡ遺伝子多型が特定されたものである。特異体質毒性に関連するＨＬＡ遺伝子多型が特定された薬物については、例えば、患者が当該ＨＬＡ遺伝子多型を保因するか否かを判定し、特異体質薬物毒性発現のリスクを評価することも考えられている（非特許文献３）。しかしながら、これは、臨床で毒性被害が生じた後に初めて可能となる後ろ向きな方法であり、ＧＷＡＳなどの情報に基づいているため、十分な症例が得られないと検出力をもたない、正確性に欠けるといった問題点がある。 In recent years, attention has been focused on the relationship between idiosyncratic toxicity caused by drugs and polymorphisms of the HLA gene. For example, drug-induced hypersensitivity and onset of liver damage by taking the HLA-B * 57 : 01 polymorphism and the antiviral drug abacavir , HLA-B * 15 : 02 polymorphism is correlated with the onset of Stevens-Johnson syndrome (SJS) / toxic epidermal necrosis (TEN) by taking the antiepileptic drug carbamazepine (Non-patent Documents 1 and 2) ). Many associations between idiosyncratic drug toxicity and HLA gene polymorphisms have been suggested by genome-wide association analysis (GWAS). Based on this, the related HLA gene polymorphism was identified. For drugs for which an HLA gene polymorphism related to idiosyncratic toxicity has been identified, for example, it may be determined whether or not the patient carries the HLA gene polymorphism and the risk of developing idiosyncratic drug toxicity may be evaluated. It is considered (Non-patent Document 3). However, this is a backward-facing method that is only possible after clinical toxicological damage has occurred and is based on information such as GWAS, so it cannot be detected unless sufficient cases are obtained. There is a problem that it lacks.

毒性被害が生じる前に薬物の危険性を予測しようという試みも行われており、ＨＬＡの関与する薬物毒性の主要因とされる「ＨＬＡ分子と薬物分子との結合」をｉｎ ｓｉｌｉｃｏでシミュレーションすることによりリスクを評価する方法が報告されている（非特許文献４）。この評価法により、前臨床段階で特異体質薬物毒性を予測できる可能性がある一方、シミュレーション条件の設定によって結果が左右されやすい、シミュレーション上でのＨＬＡ分子と薬物の結合が実際にヒトにおいて免疫応答を惹起するか不明であるなど、予測精度の点で問題が残されている。   Attempts have been made to predict the risk of drugs before toxic damage occurs, and in silico simulates the “binding of HLA molecules to drug molecules”, which is a major factor in drug toxicity involving HLA. A method for evaluating risk is reported (Non-patent Document 4). While this evaluation method may be able to predict idiosyncratic drug toxicity in the preclinical stage, the results are likely to be affected by the setting of simulation conditions. The binding of HLA molecules and drugs on the simulation is actually an immune response in humans. It is unclear whether or not it will cause a problem.

したがって、特異体質薬物毒性の発現を未然に防ぐため、毒性被害が生じる前に薬物による特異体質毒性の危険性を予測する新たな方法の構築が望まれている。   Therefore, in order to prevent the development of idiosyncratic drug toxicity, it is desired to construct a new method for predicting the risk of idiosyncratic toxicity due to drugs before toxic damage occurs.

Pavlos R, Mallal S, Ostrov D, Buus S, Metushi I, Peters B, Phillips E, T Cell-Mediated Hypersensitivity Reactions to Drugs, Annu. Rev. Med., 2015, 66: 439-454.Pavlos R, Mallal S, Ostrov D, Buus S, Metushi I, Peters B, Phillips E, T Cell-Mediated Hypersensitivity Reactions to Drugs, Annu. Rev. Med., 2015, 66: 439-454. Filippo EK, Ripamonti D, Rizzi M, Abacavir-induced liver toxicity in an HIV-infected patient, AIDS, 2014, 28: 613-617.Filippo EK, Ripamonti D, Rizzi M, Abacavir-induced liver toxicity in an HIV-infected patient, AIDS, 2014, 28: 613-617. Niihara H, Kohno K, Taketani T, Kaneko S, Ito T, Sugamori T, Takahashi N, Miyaoka T, Okazaki S, Yasuda H, Furuya M, Nagahama M, Morita E, Simple and rapid detection of HLA-A*31:01 for prediction of carbamazepine-induced hypersensitivity using loop-mediated isothermal amplification method, J Dermatol Sci. 2014; 74(1): 88-92.Niihara H, Kohno K, Taketani T, Kaneko S, Ito T, Sugamori T, Takahashi N, Miyaoka T, Okazaki S, Yasuda H, Furuya M, Nagahama M, Morita E, Simple and rapid detection of HLA-A * 31: 01 for prediction of carbamazepine-induced hypersensitivity using loop-mediated isothermal amplification method, J Dermatol Sci. 2014; 74 (1): 88-92. Luo H, Du T, Zhou P, Yang L, Mei H, Ng H, Zhang W, Shu M, Tong W, Shi L, Mendrick DL, Hong H, Molecular Docking to Identify Associations Between Drugs and Class I Human Leukocyte Antigens for Predicting Idiosyncratic Drug Reactions, Comb Chem High Throughput Screen, 2015; 18(3): 296-304.Luo H, Du T, Zhou P, Yang L, Mei H, Ng H, Zhang W, Shu M, Tong W, Shi L, Mendrick DL, Hong H, Molecular Docking to Identify Associations Between Drugs and Class I Human Leukocyte Antigens for Predicting Idiosyncratic Drug Reactions, Comb Chem High Throughput Screen, 2015; 18 (3): 296-304.

本発明の課題は、薬物による特異体質毒性の発現を予測できる新たな方法を提供することにある。   An object of the present invention is to provide a new method capable of predicting the development of idiosyncratic toxicity due to a drug.

そこで、本発明者は、抗ウイルス薬アバカビルと結合し、アバカビルによる特異体質毒性発現と関連することが知られているヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子多型ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１、及びアバカビルと結合せず、アバカビルによる特異体質毒性発現と関連しないことが知られているＨＬＡ遺伝子多型ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３に注目し、当該ＨＬＡ遺伝子多型を導入したマウスより表皮細胞（ケラチノサイト）を単離し、アバカビルを曝露したところ、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１導入マウス由来のケラチノサイト特異的に、細胞表面ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量が上昇したことを見出した。また、予想外に、この発現量上昇は、ケラチノサイトといった自然免疫応答性動物細胞ではみられるものの、非自然免疫応答性動物細胞ではみられないことも見出した。 Therefore, the present inventor binds to the antiviral drug abacavir and human leukocyte antigen (HLA) gene polymorphism HLA-B * 57:01, which is known to be associated with the expression of idiosyncratic toxicity by abacavir, and abacavir and Focusing on the HLA gene polymorphism HLA-B * 57 : 03, which is known not to be bound and related to the expression of idiosyncratic toxicity due to abacavir, epidermal cells (keratinocytes) were removed from mice into which the HLA gene polymorphism was introduced. When isolated and exposed to abacavir, it was found that the expression level of cell surface HLA and the expression level of inflammatory cytokines increased specifically in keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 01-introduced mice. In addition, unexpectedly, this increase in the expression level was found in innate immune responsive animal cells such as keratinocytes but not in non-innate immune responsive animal cells.

本発明者は、かかる知見に基づき、さらに検討した結果、ＨＬＡ遺伝子多型を導入した自然免疫応答性動物細胞に被験薬物を曝露した際のＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量の変化を指標とすれば、導入したＨＬＡ遺伝子多型と被験薬物との相互作用により生じる特異体質毒性を予め予測でき、予期しない特異体質薬物毒性の発現を防ぐのに有用であることを見出し、本発明を完成した。   As a result of further investigation based on such findings, the present inventor showed changes in the expression level of HLA and the expression level of inflammatory cytokines when the test drug was exposed to innate immune responsive animal cells into which the HLA gene polymorphism was introduced. As an index, it has been found that idiosyncratic toxicity caused by the interaction between the introduced HLA gene polymorphism and the test drug can be predicted in advance, and is useful for preventing the occurrence of unexpected idiosyncratic drug toxicity. completed.

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔６〕を提供するものである。   That is, the present invention provides the following [1] to [6].

〔１〕被験薬物の存在下に、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の遺伝子多型を導入した自然免疫応答性動物細胞を培養し、ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量の変化を測定することを特徴とする、被験薬物による特異体質毒性の発現予測方法。
〔２〕ＨＬＡの遺伝子多型が、毒性発現性遺伝子多型である、〔１〕記載の方法。
〔３〕自然免疫応答性動物細胞が、皮膚細胞（ケラチノサイト）、樹状細胞及び肝細胞から選ばれる動物細胞である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕炎症性サイトカインが、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）から選ばれる１種又は２種以上である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量が、ＨＬＡの遺伝子多型を導入していない自然免疫応答性動物細胞を用いた場合と対比して上昇している場合に、被験薬物による特異体質毒性発現の可能性があると予測するものである、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕被験薬物による特異体質毒性の発現予測に用いるためのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の遺伝子多型を導入した自然免疫応答性動物細胞。 [1] Culturing innate immune-responsive animal cells into which human leukocyte antigen (HLA) gene polymorphism has been introduced in the presence of a test drug, and measuring changes in the expression level of HLA and the expression level of inflammatory cytokines A method for predicting the expression of idiosyncratic toxicity caused by a test drug.
[2] The method according to [1], wherein the HLA gene polymorphism is a toxicity-expressing gene polymorphism.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the innate immune responsive animal cell is an animal cell selected from skin cells (keratinocytes), dendritic cells and hepatocytes.
[4] Inflammatory cytokine is interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), interleukin-12 (IL-12), interleukin [1] to [3], which is one or more selected from -18 (IL-18), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interferon-γ (IFN-γ) The method described.
[5] When the expression level of HLA and the expression level of inflammatory cytokines are increased compared to the case of using innate immune responsive animal cells into which HLA gene polymorphism has not been introduced, The method according to any one of [1] to [4], which predicts that there is a possibility of idiosyncratic toxicity.
[6] An innate immune responsive animal cell into which a human leukocyte antigen (HLA) gene polymorphism has been introduced for use in predicting the expression of idiosyncratic toxicity by a test drug.

本発明によれば、自然免疫応答性動物細胞に導入したＨＬＡ遺伝子多型と被験薬物との相互作用による炎症反応、すなわちＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量の変化を捉え、ＨＬＡ遺伝子多型と被験薬物の相互作用により起こる特異体質毒性を毒性被害が生じる前に予め予測し、予期しない特異体質薬物毒性の発現を防ぐことができる。また、医薬品候補化合物を被験薬物として、様々なＨＬＡ遺伝子多型を導入した自然免疫応答性動物細胞群を用いれば、前臨床段階での医薬品候補化合物の安全性スクリーニングも可能となる。さらに、特定のＨＬＡ遺伝子多型と結合しやすいが炎症反応を惹起することはない被験薬物を判別できるため、特異体質毒性の偽陽性評価の可能性を大幅に下げることができる。   According to the present invention, an HLA gene polymorphism introduced into an innate immune-responsive animal cell and an inflammatory reaction caused by an interaction between a test drug, that is, changes in the expression level of HLA and inflammatory cytokine are detected, and the polymorphism of the HLA gene is detected. The idiosyncratic toxicity caused by the interaction between the mold and the test drug can be predicted in advance before toxic damage occurs, thereby preventing the occurrence of unexpected idiosyncratic drug toxicity. In addition, if a group of innate immune responsive animal cells into which various HLA gene polymorphisms are introduced using a drug candidate compound as a test drug, the safety screening of the drug candidate compound at the preclinical stage is possible. Furthermore, since it is possible to discriminate a test drug that easily binds to a specific HLA gene polymorphism but does not cause an inflammatory reaction, the possibility of false positive evaluation of idiosyncratic toxicity can be greatly reduced.

ＨＬＡ遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトにおける導入ＨＬＡの発現を示す図である。It is a figure which shows the expression of introduction | transduction HLA in the keratinocyte derived from a HLA gene transfer mouse | mouth. ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う炎症性サイトカインの発現量増加を示す図であるIt is a figure which shows the expression level increase of the inflammatory cytokine accompanying the abacavir exposure with respect to the keratinocyte derived from a HLA-B * 57 : 01 transgenic mouse. ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴うＨＬＡ関連因子の発現量の増加を示す図である。Ａは、内因性ＭＨＣ発現量とβ２−マイクログロブリン（β２ｍ）の発現量の増加を、Ｂは、導入ＨＬＡ発現量の増加を示す。It is a figure which shows the increase in the expression level of the HLA related factor accompanying the abacavir exposure with respect to the keratinocyte derived from a HLA-B * 57 : 01 transgenic mouse. A shows an increase in the expression level of endogenous MHC and β 2 -microglobulin (β 2 m), and B shows an increase in the expression level of introduced HLA. ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う細胞毒性の有無を示す図である。It is a figure which shows the presence or absence of the cytotoxicity accompanying the abacavir exposure with respect to the keratinocyte derived from a HLA-B * 57 : 01 transgenic mouse. ケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う免疫応答のＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１特異性を示す図である。Ａは、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するジドブジン曝露に伴う導入ＨＬＡ発現量の変化を、Ｂは、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う導入ＨＬＡ発現量の変化を示す。FIG. 5 shows the HLA-B * 57 : 01 specificity of the immune response associated with abacavir exposure to keratinocytes. A is a change in the expression level of introduced HLA accompanying exposure to zidovudine to keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 01 transgenic mice, and B is associated with abacavir exposure to keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 03 transgenic mice. The change of the introduced HLA expression level is shown. ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来の肝細胞に対するアバカビル曝露に伴う免疫応答を示す図である。Ａは、炎症性サイトカイン発現量と導入ＨＬＡ発現量の増加を、Ｂは、導入ＨＬＡ発現量の増加を示す。It is a figure which shows the immune response accompanying the abacavir exposure with respect to the hepatocyte derived from a HLA-B * 57 : 01 transgenic mouse. A shows an increase in inflammatory cytokine expression level and introduced HLA expression level, and B shows an increase in introduced HLA expression level. ＨＬＡ遺伝子導入肝細胞に対するアバカビル曝露に伴う免疫応答のＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１特異性を示す図である。It is a figure which shows the HLA-B * 57: 01 specificity of the immune response accompanying the abacavir exposure with respect to an HLA gene introduction | transduction hepatocyte. ＨＬＡ遺伝子導入非免疫細胞ＨｅＬａ細胞に対するアバカビル曝露に伴う導入ＨＬＡ発現量の変化を示す図である。It is a figure which shows the change of the introduced HLA expression level accompanying the abacavir exposure with respect to the HLA gene transfer non-immune cell HeLa cell.

本発明におけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とは、ヒト第６染色体短腕上に存在する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の産物である。ＨＬＡはクラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原の２群に大別され、クラスＩ抗原としてはＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ及びＧが、クラスＩＩ抗原としてはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ及びＤＰが知られている。ＨＬＡには数多くの遺伝子多型が存在するが、本発明で用いられるＨＬＡの遺伝子多型は特に限定されず、好ましくは薬物による特異体質毒性との関連性が知られている毒性発現性の遺伝子多型が挙げられる（例えば、非特許文献１）。より具体的には、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０５、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０２：０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６：０２などが挙げられる。各多型の遺伝子配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）の遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋより入手できる。 The human leukocyte antigen (HLA) in the present invention is a product of a major histocompatibility complex (MHC) existing on the short arm of human chromosome 6. HLA is roughly divided into two groups, class I antigens and class II antigens. Class I antigens are HLA-A, B, C, E, F and G, and class II antigens are HLA-DR, DQ and DP. Are known. There are many gene polymorphisms in HLA, but the gene polymorphism of HLA used in the present invention is not particularly limited, and preferably a toxic expression gene known to be associated with idiosyncratic toxicity due to drugs. A polymorphism is mentioned (for example, nonpatent literature 1). More specifically, HLA-A * 02: 01, HLA-A * 31: 01, HLA-B * 13: 01, HLA-B * 15: 02, HLA-B * 35: 05, HLA-B * 57:01, HLA-B * 58: 01, HLA-C * 04: 01, HLA-DRB1 * 01: 01, HLA-DRB1 * 15: 01, HLA-DQA1 * 02: 01, HLA-DQB1 * 06: 02 and the like. The gene sequence of each polymorphism can be obtained from the gene database GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).

本発明の自然免疫応答性動物細胞は、自然免疫応答を示す動物細胞であれば特に限定されず、例えば表皮細胞（ケラチノサイト）、樹状細胞及び肝細胞が挙げられる。このうち、細胞の取り扱いやすさの観点から、ケラチノサイト及び肝細胞が好ましい。細胞の由来となる動物としては、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、サルなどが挙げられ、なかでもヒト又はマウスが好ましい。   The innate immune responsive animal cell of the present invention is not particularly limited as long as it is an animal cell exhibiting an innate immune response, and examples thereof include epidermal cells (keratinocytes), dendritic cells, and hepatocytes. Among these, keratinocytes and hepatocytes are preferable from the viewpoint of easy handling of cells. Examples of the animal from which the cells are derived include humans, mice, rats, guinea pigs, hamsters, cows, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, monkeys, etc. Among them, humans or mice are preferable.

本発明の自然免疫応答性動物細胞には、ＨＬＡの遺伝子多型が導入されている（以下、ＨＬＡ導入細胞とも称す）。ここで、導入されるＨＬＡの遺伝子多型は、導入される動物細胞内で機能し得るように改変してもよく、例えば、導入される動物のＭＨＣクラスＩ遺伝子とのキメラ型遺伝子とすることもできる。また、ＨＬＡタンパク質と、ＭＨＣクラスＩ分子の共役タンパク質であるβ２−マイクログロブリン（β２ｍ）とが等量発現されるように改変してもよい。さらに、ＨＬＡ発現量の測定の利便性を上げるため、ＨＬＡ遺伝子末端にＦＬＡＧタグなどのタンパク質タグを導入してもよい。
上記ＨＬＡ遺伝子多型は発現ベクターにクローニングすることができる。発現ベクターのプロモーターや選択マーカーは、導入細胞の種類等に応じて適宜選択すればよい。
かくして得られたＨＬＡ遺伝子多型を含む発現ベクターは、公知の手段を用いて、ヒトを含む哺乳動物細胞又は非ヒト哺乳動物個体に導入することができる。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、サルなどが挙げられ、なかでもマウスが好ましい。
ＨＬＡ遺伝子多型を含む発現ベクターを動物細胞又は動物個体に導入する方法としては、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ウイルスベクターを利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、導入細胞種、発現効率、発現期間などを考慮して適宜選択すればよい。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。導入したＨＬＡ遺伝子多型の発現は、一過性発現であってもよく安定発現であってもよい。 An HLA gene polymorphism has been introduced into the innate immune responsive animal cell of the present invention (hereinafter also referred to as HLA-introduced cell). Here, the introduced HLA gene polymorphism may be modified so as to function in the introduced animal cell, for example, a chimeric gene with the MHC class I gene of the introduced animal. You can also. Alternatively, the HLA protein and β 2 -microglobulin (β 2 m), which is a conjugate protein of MHC class I molecules, may be modified so that they are expressed in equal amounts. Furthermore, a protein tag such as a FLAG tag may be introduced at the end of the HLA gene in order to increase the convenience of measuring the HLA expression level.
The HLA gene polymorphism can be cloned into an expression vector. The promoter and selectable marker of the expression vector may be appropriately selected according to the type of introduced cell.
The expression vector containing the HLA gene polymorphism thus obtained can be introduced into mammalian cells including humans or non-human mammal individuals using known means. Examples of non-human mammals include mice, rats, guinea pigs, hamsters, cows, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, monkeys, etc. Among them, mice are preferred.
Examples of a method for introducing an expression vector containing an HLA gene polymorphism into an animal cell or an animal individual include, but are not limited to, a lipofection method, an electroporation method, a microinjection method, and a method using a viral vector. However, it may be appropriately selected in consideration of the introduced cell type, expression efficiency, expression period, and the like. Examples of viral vectors include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, and lentivirus vectors. Expression of the introduced HLA gene polymorphism may be transient expression or stable expression.

本発明におけるＨＬＡ導入細胞は、例えば、ＨＬＡ遺伝子多型を動物細胞に導入し確立したトランスジェニック動物から自然免疫応答性動物細胞を単離する方法によって得ることができる。具体的には、ＨＬＡ遺伝子多型をクローニングした発現ベクターを非ヒト哺乳動物の前核期受精卵にマイクロインジェクション法により導入し、当該受精卵を当該動物の雌に着床させ、うまれた子の中から目的遺伝子を発現している個体を選別し、当該個体から自然免疫応答性細胞を単離する方法が挙げられる。
あるいは、本発明におけるＨＬＡ導入細胞は、ＨＬＡ遺伝子多型をクローニングしたウイルスベクター（例えばアデノウイルスベクター）を用いて、当該遺伝子多型を自然免疫応答性動物細胞に直接導入する方法によっても得ることができる。 The HLA-introduced cells in the present invention can be obtained, for example, by a method for isolating innate immune responsive animal cells from a transgenic animal established by introducing an HLA gene polymorphism into an animal cell. Specifically, an expression vector in which an HLA gene polymorphism is cloned is introduced into a pronuclear fertilized egg of a non-human mammal by a microinjection method, the fertilized egg is implanted into a female of the animal, A method of selecting an individual expressing a target gene from among them and isolating innate immune responsive cells from the individual can be mentioned.
Alternatively, the HLA-introduced cell in the present invention can also be obtained by a method of directly introducing the gene polymorphism into an innate immune responsive animal cell using a viral vector (for example, an adenovirus vector) in which the HLA gene polymorphism is cloned. it can.

自然免疫応答性細胞にＨＬＡ遺伝子多型が導入されたか否かは、フローサイトメトリー、免疫染色法、ウェスタンブロッティング法、リアルタイムＰＣＲなどの手法により導入ＨＬＡの発現を検出することで確認できる。
フローサイトメトリーを用いる場合には、例えば、ＨＬＡ導入細胞を培養、回収し、標識抗ＨＬＡ抗体とインキュベーションした後、フローサイトメーターを用いて細胞の蛍光強度を測定する。蛍光強度が非ＨＬＡ導入細胞の蛍光強度と比較して高くシフトしていれば、表面ＨＬＡが発現しており、ＨＬＡ遺伝子多型が導入されたと判断できる。細胞の培養、回収、抗体との反応、フローサイトメトリーの条件は、用いる細胞、抗体等に応じて適宜設定すればよい。抗ＨＬＡ抗体の標識としては、蛍光標識又はビオチン標識が好ましい。蛍光標識としてはＰＥ、ＦＩＴＣ、ＡＰＣ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５などが例示されるが、これらに限定されるものではない。ビオチン標識の場合は、さらに蛍光標識アビジンを用いる。
ウェスタンブロッティング法を用いる場合には、例えば、ＨＬＡ導入細胞を培養、回収し、細胞を可溶化し、得られたタンパク質を電気泳動の後メンブレンに転写し、抗ＨＬＡ抗体あるいはＨＬＡにタンパク質タグを導入していた場合は当該タグに対する一次抗体を反応させ、次いで対応する標識二次抗体を反応させ、標識に応じて化学発光法又は発色法により検出を行うことで、導入ＨＬＡの発現を確認することができる。細胞の培養、回収、細胞可溶化、電気泳動、転写、抗原抗体反応、検出の条件は、用いる細胞、抗体等に応じて適宜設定すればよい。
リアルタイムＰＣＲを用いる場合には、例えば、後述の炎症性サイトカインのｍＲＮＡの発現量測定の場合と同様にして、ＨＬＡ遺伝子多型のｍＲＮＡの発現を確認することができる。 Whether or not the HLA gene polymorphism has been introduced into the innate immune responsive cells can be confirmed by detecting the expression of the introduced HLA by techniques such as flow cytometry, immunostaining, Western blotting, and real-time PCR.
In the case of using flow cytometry, for example, HLA-introduced cells are cultured and collected, incubated with a labeled anti-HLA antibody, and then the fluorescence intensity of the cells is measured using a flow cytometer. If the fluorescence intensity is higher than the fluorescence intensity of the non-HLA-introduced cells, it can be determined that surface HLA is expressed and that the HLA gene polymorphism has been introduced. The conditions for cell culture, recovery, reaction with antibodies, and flow cytometry may be appropriately set according to the cells to be used, antibodies, and the like. As a label of the anti-HLA antibody, a fluorescent label or a biotin label is preferable. Examples of the fluorescent label include PE, FITC, APC, PE-Cy5, PE-Cy7, and PerCP-Cy5, but are not limited thereto. In the case of biotin labeling, fluorescently labeled avidin is further used.
When using Western blotting, for example, culture and recovery of HLA-introduced cells, solubilize the cells, transfer the obtained protein to the membrane after electrophoresis, and introduce a protein tag into the anti-HLA antibody or HLA If so, react with the primary antibody against the tag, then react with the corresponding labeled secondary antibody, and confirm the expression of the introduced HLA by detecting by the chemiluminescence method or the color development method according to the label. Can do. Cell culture, recovery, cell solubilization, electrophoresis, transcription, antigen-antibody reaction, and detection conditions may be appropriately set according to the cells, antibodies, etc. used.
In the case of using real-time PCR, for example, the expression of HLA gene polymorphism mRNA can be confirmed in the same manner as in the measurement of the expression level of inflammatory cytokine mRNA described below.

導入ＨＬＡの発現量は、フローサイトメトリー、免疫組織染色法、ウェスタンブロット、リアルタイムＰＣＲなどの手法により測定した蛍光強度、発光強度又は発色強度をもとに算出することができ、例えば、被験薬物存在下で培養したＨＬＡ導入細胞における蛍光強度等を、被験薬物非存在下で培養したＨＬＡ導入細胞における蛍光強度等で除して、相対発現量として表すことができる。   The expression level of introduced HLA can be calculated based on fluorescence intensity, luminescence intensity or color intensity measured by techniques such as flow cytometry, immunohistochemical staining, Western blot, real-time PCR, etc. The fluorescence intensity or the like in the HLA-introduced cells cultured under the above can be divided by the fluorescence intensity or the like in the HLA-introduced cells cultured in the absence of the test drug, and expressed as a relative expression level.

本発明において、炎症性サイトカインは、細菌やウイルス感染、腫瘍、組織損傷などに伴う炎症反応に深く関わるサイトカインであればいずれでもよい。例えば、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）などが挙げられ、好ましくはＩＬ−１β、ＩＬ−６又はＩＦＮ−γであり、さらに好ましくはＩＬ−１β又はＩＦＮ−γである。これら炎症性サイトカインは、１種又は２種以上を組み合わせて指標とすることができる。   In the present invention, the inflammatory cytokine may be any cytokine as long as it is deeply involved in an inflammatory reaction accompanying bacterial or viral infection, tumor, tissue damage or the like. For example, interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), interleukin-12 (IL-12), interleukin-18 (IL-18) ), Interferon-γ (IFN-γ), tumor necrosis factor-α (TNF-α), etc., preferably IL-1β, IL-6 or IFN-γ, more preferably IL-1β or IFN. -Γ. These inflammatory cytokines can be used as an index by combining one kind or two or more kinds.

炎症性サイトカインの発現量は、測定対象の炎症性サイトカインに応じて適宜公知の方法により測定すればよく、例えば、リアルタイムＰＣＲ、フローサイトメトリー、ＤＮＡマイクロアレイなどの手法により測定することができる。このうち、迅速性と定量性の観点から、リアルタイムＰＣＲを利用して炎症性サイトカインのｍＲＮＡの発現量を測定するのが好ましい。リアルタイムＰＣＲとしては、当技術分野で通常用いられる方法、例えばインターカレーター法、ＴａｑＭａｎプローブ法及びサイクリングプローブ法等が挙げられるが、簡便性の点からインターカレーター法を用いるのが特に好ましい。
インターカレーター法では、二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発するインターカレーターをＰＣＲ反応系に加える。インターカレーターとしては、好ましくはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉが用いられる。
リアルタイムＰＣＲは、サーマルサイクラーと分光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲ専用装置、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−Ｎａｎｏ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行うことができる。変性、アニーリング、伸長の各ステップの温度及び時間、サイクル数等のＰＣＲ条件、ＤＮＡポリメラーゼの種類及び濃度、プライマーの配列及び濃度、バッファーの種類、ｄＮＴＰ濃度、塩化マグネシウム濃度等のＰＣＲ反応液の組成は、測定対象に応じて適宜選択及び設定すればよい。 The expression level of the inflammatory cytokine may be appropriately measured by a known method depending on the inflammatory cytokine to be measured, and can be measured by a technique such as real-time PCR, flow cytometry, DNA microarray, etc. Among these, from the viewpoint of rapidity and quantitativeness, it is preferable to measure the expression level of inflammatory cytokine mRNA using real-time PCR. Examples of real-time PCR include methods commonly used in the art, such as the intercalator method, TaqMan probe method, and cycling probe method, and the intercalator method is particularly preferable from the viewpoint of simplicity.
In the intercalator method, an intercalator that binds to double-stranded DNA and emits fluorescence when irradiated with excitation light is added to the PCR reaction system. As the intercalator, SYBR Green I is preferably used.
Real-time PCR can be performed using a dedicated device for real-time PCR in which a thermal cycler and a spectrophotometer are integrated, for example, LightCycler-Nano instrument (Roche Diagnostics). PCR reaction conditions such as temperature and time for each step of denaturation, annealing and extension, number of cycles, etc., DNA polymerase type and concentration, primer sequence and concentration, buffer type, dNTP concentration, magnesium chloride concentration, etc. May be appropriately selected and set according to the measurement target.

炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現量は、例えば、リアルタイムＰＣＲを用いた以下の方法により測定できる。被験薬物存在下で培養したＨＬＡ導入細胞から抽出したトータルＲＮＡ用いて逆転写によりｃＤＮＡを調製し、得られたｃＤＮＡを鋳型として測定対象の炎症性サイトカインに特異的なプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、増幅産物量をモニターする。また、被験薬物非存在下で培養したＨＬＡ導入細胞についても同様にリアルタイムＰＣＲを行う。各ｍＲＮＡ発現量をハウスキーピング遺伝子（例えば、β−アクチン）のｍＲＮＡ発現量で補正する。その後、被験薬物存在下での炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現量を、被験薬物非存在下での炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現量で除して、相対発現量を算出する。ｍＲＮＡの発現量は、あらかじめ濃度の分かっているｍＲＮＡ又はＤＮＡを段階希釈してリアルタイムＰＣＲを行い作成した検量線を利用して、絶対発現量として算出することもできる。   The mRNA expression level of inflammatory cytokine can be measured, for example, by the following method using real-time PCR. CDNA is prepared by reverse transcription using total RNA extracted from HLA-introduced cells cultured in the presence of the test drug, and real-time PCR is performed using the obtained cDNA as a template and a primer set specific for the inflammatory cytokine to be measured. And monitor the amount of amplification product. Similarly, real-time PCR is performed on HLA-introduced cells cultured in the absence of the test drug. Each mRNA expression level is corrected by the mRNA expression level of a housekeeping gene (for example, β-actin). Thereafter, the relative expression level is calculated by dividing the mRNA expression level of the inflammatory cytokine in the presence of the test drug by the mRNA expression level of the inflammatory cytokine in the absence of the test drug. The expression level of mRNA can also be calculated as an absolute expression level using a calibration curve prepared by serially diluting mRNA or DNA whose concentration is known in advance and performing real-time PCR.

本発明におけるＨＬＡ導入細胞を培養するための培地は、細胞種に応じて適宜選択すればよい。ＨＬＡ導入細胞がケラチノサイトの場合、例えば、市販のＣｎＴ−ＰＲ培地、ＥｐｉＬｉｆｅ培地などを使用することができる。ＨＬＡ導入細胞が肝細胞の場合、例えば、市販のＷｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）などを使用することができる。培地には、必要に応じて、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の血清、グルタミン、抗生物質、抗真菌剤、細胞増殖促進因子（ホルモン、成長因子等）など、通常細胞培養に用いられる添加物を加えてもよい。培地のｐＨは、７．０〜７．７が好ましく、７．２〜７．４がさらに好ましい。
ＨＬＡ導入細胞は、プレート、フラスコ等の培養容器に播種して培養すればよい。当該培養容器は、コラーゲンコートされた培養容器が好ましい。播種する細胞数は、細胞種、培養容器の大きさに応じて適宜決定すればよいが、６ウェルプレートを用いる場合、０．１×１０６〜３×１０６個／ウェル程度、１２ウェルプレートを用いる場合、１×１０５〜６×１０５個／ウェル程度を例示できる。
ＨＬＡ導入細胞の培養温度は特に限定されないが、３５〜４０℃が好ましく、３６−３７℃がさらに好ましい。培養時間は、１０時間〜４日間が好ましく、１２時間〜３日間がさらに好ましい。被験物質添加後の培養時間は、１〜２４時間が好ましく、３〜１８時間がさらに好ましく、１２時間が特に好ましい。培養方法は特に限定されないが、静置培養が好ましい。ＣＯ２濃度は４〜１０％が好ましく、５−７％がさらに好ましい。 The medium for culturing HLA-introduced cells in the present invention may be appropriately selected according to the cell type. When the HLA-introduced cells are keratinocytes, for example, a commercially available CnT-PR medium, EpiLife medium or the like can be used. When the HLA-introduced cell is a hepatic cell, for example, commercially available William's E Medium, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), or the like can be used. In the medium, additives such as serum such as fetal bovine serum (FBS), glutamine, antibiotics, antifungal agents, cell growth promoting factors (hormones, growth factors, etc.), which are usually used for cell culture, are added as necessary. May be added. The pH of the medium is preferably 7.0 to 7.7, and more preferably 7.2 to 7.4.
The HLA-introduced cells may be seeded and cultured in a culture container such as a plate or flask. The culture vessel is preferably a collagen-coated culture vessel. The number of cells to be seeded may be appropriately determined according to the cell type and the size of the culture vessel, but when a 6-well plate is used, about 0.1 × 10 6 to 3 × 10 6 cells / well, 12-well plate In the case of using, for example, about 1 × 10 5 to 6 × 10 5 / well can be exemplified.
The culture temperature of the HLA-introduced cell is not particularly limited, but is preferably 35 to 40 ° C, more preferably 36 to 37 ° C. The culture time is preferably 10 hours to 4 days, more preferably 12 hours to 3 days. The culture time after addition of the test substance is preferably 1 to 24 hours, more preferably 3 to 18 hours, and particularly preferably 12 hours. The culture method is not particularly limited, but stationary culture is preferable. The CO 2 concentration is preferably 4 to 10%, more preferably 5 to 7%.

本発明における被験薬物は、特異体質薬物毒性発現の危険性を予測したい薬物であればよく、特に限定されない。被験薬物は、ＨＬＡ導入細胞の培地に直接加えるか、予め水又はＤＭＳＯなどの有機溶媒で溶解してから培地に加えればよく、被験薬物の試験濃度は、薬物の種類に応じて適宜設定すればよい。   The test drug in the present invention is not particularly limited as long as it is a drug for which it is desired to predict the risk of development of idiosyncratic drug toxicity. The test drug may be added directly to the medium of HLA-introduced cells or dissolved in water or an organic solvent such as DMSO in advance and then added to the medium. The test concentration of the test drug may be set appropriately according to the type of drug. Good.

本発明の特異体質毒性の発現予測方法は、ＨＬＡ導入細胞、ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量を測定するためのプロトコール、ＨＬＡ及び炎症性サイトカインの測定試薬、測定試薬の使用方法等を含むキットを用いて実施してもよい。   The method for predicting the expression of idiosyncratic toxicity according to the present invention includes an HLA-introduced cell, a protocol for measuring the expression level of HLA and the expression level of inflammatory cytokine, a measuring reagent for HLA and inflammatory cytokine, a method for using the measuring reagent, etc. You may implement using the kit containing.

被験薬物による特異体質毒性の発現を予測するには、被験薬物存在下において、ＨＬＡ導入細胞を培養し、ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量の変化を測定すればよい。被験薬物存在下において、ＨＬＡ導入細胞のＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量が、当該ＨＬＡ遺伝子多型を導入していない非ＨＬＡ導入細胞のＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量に比して上昇していれば、その被験薬物と当該特定ＨＬＡ遺伝子多型による特異体質毒性の発現の可能性があると判定でき、発現量に変化がない又は発現量が低下していれば、その被験薬物と当該特定ＨＬＡ遺伝子多型による特異体質毒性の発現の可能性はないと判定できる。あるいは、被験薬物存在下において、ＨＬＡ導入細胞のＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量が、被験薬物非存在下のＨＬＡ導入細胞のＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量に比して上昇していれば、その被験薬物と当該特定ＨＬＡ遺伝子多型による特異体質毒性の発現の可能性があると判定でき、発現量に変化がない又は発現量が低下していれば、その被験薬物と当該特定ＨＬＡ遺伝子多型によるによる特異体質毒性の発現の可能性はないと判定できる。   In order to predict the development of idiosyncratic toxicity by the test drug, HLA-introduced cells may be cultured in the presence of the test drug, and changes in the expression level of HLA and the expression level of inflammatory cytokines may be measured. In the presence of the test drug, the expression level of HLA and the expression level of inflammatory cytokines in the HLA-introduced cells are the same as the expression level of HLA and the expression level of inflammatory cytokines in non-HLA-introduced cells into which the HLA gene polymorphism has not been introduced. If it is higher than that, it can be determined that there is a possibility of development of idiosyncratic toxicity due to the test drug and the specific HLA gene polymorphism, and if there is no change in the expression level or the expression level is reduced, It can be determined that there is no possibility of development of idiosyncratic toxicity due to the test drug and the specific HLA gene polymorphism. Alternatively, in the presence of the test drug, the expression level of HLA and the expression level of inflammatory cytokines in the HLA-introduced cells are higher than the expression level of HLA and the expression level of inflammatory cytokines in the HLA-introduced cells in the absence of the test drug. If it is elevated, it can be determined that there is a possibility of development of idiosyncratic toxicity due to the test drug and the specific HLA gene polymorphism, and if there is no change in the expression level or the expression level is decreased, the test drug It can be determined that there is no possibility of manifestation of idiosyncratic toxicity due to the specific HLA gene polymorphism.

本発明の方法によれば、自然免疫応答性動物細胞に導入したＨＬＡ遺伝子多型と被験薬物との相互作用による炎症反応、すなわちＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量の変化を捉え、ＨＬＡ遺伝子多型と被験薬物の相互作用により起こる特異体質毒性を毒性被害が生じる前に予め予測し、予期しない特異体質薬物毒性の発現を防ぐことができる。
本発明の方法によれば、特定のＨＬＡ遺伝子多型には結合しやすいが炎症反応を惹起することはない被験薬物を判別できるため、特異体質毒性の偽陽性評価の可能性を大幅に下げることができる。
臨床段階では、被験薬物と特定のＨＬＡ遺伝子多型との関連性が知られていない場合、本発明の方法により、被験薬物と特定のＨＬＡ遺伝子多型による特異体質毒性の発現の可能性があると判定されれば、当該ＨＬＡ遺伝子多型を保因するヒトに対する当該被験薬物の投与を回避することで毒性被害の発生を防ぐことができる。
前臨床段階では、本発明の方法により、医薬品候補化合物と種々のＨＬＡ遺伝子多型による特異体質毒性の発現の可能性を予測できるため、安全性スクリーニングが可能となる。被験薬物と特定のＨＬＡ遺伝子多型による特異体質毒性の発現の可能性があると判定されれば、被験薬物の修飾、対象患者の選別等の医薬品開発方針の変更が可能となり、ひいては毒性被害の発生を防ぐことができる。 According to the method of the present invention, an inflammatory reaction caused by the interaction between an HLA gene polymorphism introduced into an innate immune responsive animal cell and a test drug, that is, changes in the expression level of HLA and the expression level of inflammatory cytokines are captured. The idiosyncratic toxicity caused by the interaction between the gene polymorphism and the test drug can be predicted in advance before toxic damage occurs, thereby preventing the occurrence of unexpected idiosyncratic drug toxicity.
According to the method of the present invention, it is possible to discriminate a test drug that easily binds to a specific HLA gene polymorphism but does not cause an inflammatory reaction, thereby greatly reducing the possibility of false positive evaluation of idiosyncratic toxicity. Can do.
In the clinical stage, when the relationship between the test drug and the specific HLA gene polymorphism is not known, the method of the present invention may cause idiosyncratic toxicity due to the test drug and the specific HLA gene polymorphism. If it is determined, it is possible to prevent the occurrence of toxic damage by avoiding administration of the test drug to humans carrying the HLA gene polymorphism.
In the preclinical stage, the method of the present invention can predict the possibility of the development of idiosyncratic toxicity due to the drug candidate compound and various HLA gene polymorphisms, thus enabling safety screening. If it is determined that there is a possibility of the development of idiosyncratic toxicity due to the test drug and the specific HLA gene polymorphism, it is possible to change the drug development policy such as modification of the test drug, selection of the target patient, etc. Occurrence can be prevented.

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated still in detail, the technical scope of this invention is not limited to these Examples.

実施例１ ＨＬＡ遺伝子発現ベクターの構築
ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子を有する不死化Ｂ細胞（ＥＣＡＣＣ、Ｎｏ.８８０５２００７）から、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法によってＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１全長を増幅し、ｐＤＯＮＲ２２１ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。また、その中の２０７〜２９８アミノ酸に相当する部分はマウスＭＨＣ Ｈ２−Ｋの２０４〜２９５アミノ酸に置換し、キメラ型ＨＬＡ遺伝子とした。次に、キメラ型ＨＬＡ遺伝子のＣ末に３×ＦＬＡＧタグ（DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK）（配列番号１）を部位特異的変異導入法によって挿入した。
ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子と２塩基多型（４１２番目：Ｇ→Ａ、４１９番目：Ｃ→Ａ）のＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子は、キメラ型ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子を導入したｐＤＯＮＲ２２１ベクターより、部位特異的変異導入法によって構築した。
β２−マイクログロブリン（β２ｍ）遺伝子も同様に不死化Ｂ細胞よりＰＣＲ法によって増幅し、キメラ型ＨＬＡ遺伝子を導入したｐＤＯＮＲ２２１ベクターにクローニングした。
次に、キメラ型ＨＬＡ遺伝子とβ２ｍとの間に２Ａペプチド配列（ggc agt gga gag ggc aga gga agt ctg cta aca tgc ggt gac gtc gag gag aat cct ggc cca）（配列番号２）を挿入し、キメラ型ＨＬＡタンパク質とβ２ｍタンパク質を一細胞内に等量発現できるように設計した。
２Ａペプチド配列を介して挟んだキメラ型ＨＬＡ遺伝子とβ２ｍ遺伝子は、ｐＣＡＧＧＳベクター（大阪大学の宮崎純一先生より譲渡）とｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴアデノウイルスベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にそれぞれサブクローニングし、発現ベクターとした。 Example 1 Construction of HLA gene expression vector A full-length HLA-B * 57 : 01 was amplified from immortalized B cells (ECACC, No. 88052007) having the HLA-B * 57 : 01 gene by the polymerase chain reaction (PCR) method. And cloned into the pDONR221 vector (Life Technologies). In addition, a portion corresponding to 207 to 298 amino acids was substituted with 204 to 295 amino acids of mouse MHC H2-K to obtain a chimeric HLA gene. Next, a 3 × FLAG tag (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK) (SEQ ID NO: 1) was inserted into the C-terminal of the chimeric HLA gene by site-directed mutagenesis.
HLA-B * 57:01 gene 2 nucleotide polymorphism (412 th: G → A, 419 th: C → A) HLA-B * 57:03 gene is a chimeric HLA-B * 57:01 gene It was constructed from the introduced pDONR221 vector by site-directed mutagenesis.
The β 2 -microglobulin (β 2 m) gene was similarly amplified from immortalized B cells by PCR and cloned into the pDONR221 vector into which the chimeric HLA gene was introduced.
Next, a 2A peptide sequence (ggc agt gga gag ggc aga gga agt ctg cta aca tgc ggt gac gtc gag gag aat cct ggc cca) (SEQ ID NO: 2) is inserted between the chimeric HLA gene and β 2 m, The chimeric HLA protein and β 2 m protein were designed to be expressed in equal amounts in one cell.
The chimeric HLA gene and β 2 m gene sandwiched via the 2A peptide sequence were subcloned into the pCAGGS vector (assigned from Dr. Junichi Miyazaki, Osaka University) and the pAd / CMV / V5-DEST adenovirus vector (Life Technologies), respectively. An expression vector was used.

実施例２ ＨＬＡ遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトの単離及び培養
（１）ＨＬＡ遺伝子導入マウスの作出及び維持
実施例１で構築したキメラ型ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１及び５７：０３遺伝子のｐＣＡＧＧＳ発現ベクターをユニーテック株式会社に渡し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の遺伝子導入マウスを作出し、ＨＬＡ遺伝子導入マウスとした。
マウスの維持及び繁殖は、千葉大学薬学部内の実験動物飼育室において行い、千葉大学動物実験委員会の承認の下、実施した。 Example 2 Isolation and culture of keratinocytes derived from HLA transgenic mice (1) Production and maintenance of HLA transgenic mice Chimeric HLA-B * 57: 01 and 57:03 gene pCAGGS expression vectors constructed in Example 1 Was transferred to Unitec Co., Ltd., and C57BL / 6J strain transgenic mice were created and used as HLA transgenic mice.
Mice were maintained and bred in a laboratory animal breeding room in the Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chiba University, and approved by the Animal Experiment Committee of Chiba University.

（２）マウス初代培養ケラチノサイトの単離及び培養
ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス（Ｔｇ）、そのリッターメイト（同腹子）、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子導入マウス（Ｔｇ）またはそのリッターメイトの新生児（それぞれ１〜３日齢）の皮膚を剥離した後、ＣｎＴ−ＰＲ培地（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）で調製した５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼ（合同酒精株式会社）溶液中で、４℃において１６〜１８時間インキュベーションを行った。
次に、１ｍＬのＣｎＴ−ＰＲ培地で皮膚切片を洗い、ピンセットを用いて真皮から表皮を剥離した後、１０ｃｍシャーレ上に滴下した１ｍＬのアキュターゼ溶液（ナカライテスク株式会社）上に乗せ、室温で３０分間インキュベーションを行った。アキュターゼ溶液上で表皮を揺らし、ケラチノサイトを分離させ、２ｍＬのＣｎＴ−ＰＲ培地で２回洗い、１５ｍＬの遠心チューブに回収した。２００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した後に４ｍＬのＣｎＴ−ＰＲ培地で細胞ペレットを懸濁し、細胞数を測定した。
ＣｎＴ−ＰＲ培地を用いて細胞密度が２．８×１０５個／ｍＬとなるように懸濁し、１２ウェルプレートに１ｍＬずつ播種した（７．５×１０４個／ｃｍ２）。１２ウェルプレートには予めコラーゲン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をコートした。２４時間後に培養液を除去し、５００μＬのＰＢＳで洗い、新しいＣｎＴ−ＰＲ培地を１ｍＬ加えた。３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３日間培養を行い、培養液を除去した後に、５００μＬのＰＢＳで洗い、以下の試験に供した。 (2) Isolation and culture of primary mouse cultured keratinocytes HLA-B * 57 : 01 transgenic mouse (Tg), its litermate (littermate), HLA-B * 57 : 03 transgenic mouse (Tg) or its liter After exfoliating the skin of mate neonates (1 to 3 days of age each), in a 5 mg / mL dispase solution (Kodosei Co., Ltd.) prepared in CnT-PR medium (CELLnTEC), 16 to 18 hours at 4 ° C. Incubation was performed.
Next, the skin slice was washed with 1 mL of CnT-PR medium, and the epidermis was peeled off from the dermis using tweezers, and then placed on 1 mL of acutase solution (Nacalai Tesque, Inc.) dropped on a 10 cm petri dish at room temperature. Incubation was performed for a minute. The epidermis was shaken on the actase solution, keratinocytes were separated, washed twice with 2 mL of CnT-PR medium, and collected in a 15 mL centrifuge tube. After centrifugation at 200 × g for 5 minutes and removing the supernatant, the cell pellet was suspended in 4 mL of CnT-PR medium, and the number of cells was measured.
The cells were suspended using CnT-PR medium so that the cell density was 2.8 × 10 5 cells / mL, and 1 mL each was seeded in a 12-well plate (7.5 × 10 4 cells / cm 2 ). The 12-well plate was coated with collagen (Corning) in advance. After 24 hours, the culture solution was removed, washed with 500 μL of PBS, and 1 mL of fresh CnT-PR medium was added. After culturing at 37 ° C. under 5% CO 2 for 3 days and removing the culture solution, the plate was washed with 500 μL of PBS and subjected to the following test.

実施例３ ＨＬＡ遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトにおけるＨＬＡの発現の評価
実施例２で得たＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス（Ｔｇ）とそのリッターメイト、またはＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子導入マウス（Ｔｇ）とそのリッターメイト由来のケラチノサイトに、ＰＥ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（６／３２）（ソニー株式会社）を用いて染色を行い、フローサイトメトリーによって、表面ＨＬＡ発現を確認した（図１）。具体的には、ケラチノサイトに３００μＬのアキュターゼを加えて３７℃で１０〜２０分間インキュベーションを行った。培養プレートを氷上に移して細胞を１．５ｍＬのサンプルチューブに回収し、さらに各ウェルに５００μＬのＰＢＳを加えて細胞を十分に回収した。４℃において３００×ｇで５分間遠心した後に上清を除去し、５００μＬのＰＢＳで懸濁して再度遠心した。上清を除去した後にＰＢＳで調製したＰＥ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｗ６／３２）溶液５０μＬで細胞ペレットを懸濁し、４℃において２０分間インキュベーションを行った。インキュベーション後に６０μＬのＰＢＳを加えて、フローサイトメーター（セルアナライザーＥＣ８００、ソニー株式会社）を用いて、蛍光強度から細胞表面ＨＬＡ発現量を測定した。解析には、付属のソフトウェアを用いた。
その結果、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１および５７：０３どちらについても、ＨＬＡ遺伝子の導入されたケラチノサイトでは、その細胞の表面にＨＬＡが発現していることが確認された。 Example 3 Evaluation of HLA expression in keratinocytes derived from HLA transgenic mice HLA-B * 57 : 01 transgenic mouse (Tg) obtained in Example 2 and its litermate, or HLA-B * 57 : 03 transgenic Mice (Tg) and keratinocytes derived from their litermates were stained with PE Anti-human HLA-A, B, C Antibody (6/32) (Sony Corporation), and surface HLA expression was detected by flow cytometry. Was confirmed (FIG. 1). Specifically, 300 μL of accutase was added to keratinocytes and incubated at 37 ° C. for 10 to 20 minutes. The culture plate was transferred onto ice, and the cells were collected in a 1.5 mL sample tube. Further, 500 μL of PBS was added to each well to sufficiently collect the cells. After centrifuging at 300 × g for 5 minutes at 4 ° C., the supernatant was removed, suspended in 500 μL of PBS, and centrifuged again. After removing the supernatant, the cell pellet was suspended in 50 μL of PE Anti-human HLA-A, B, C Antibody (W6 / 32) solution prepared in PBS, and incubated at 4 ° C. for 20 minutes. After the incubation, 60 μL of PBS was added, and the cell surface HLA expression level was measured from the fluorescence intensity using a flow cytometer (Cell Analyzer EC800, Sony Corporation). The attached software was used for the analysis.
As a result, for both HLA-B * 57:01 and 57:03, it was confirmed that HLA was expressed on the surface of the cells in the keratinocytes into which the HLA gene was introduced.

実施例４ ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う炎症性サイトカインの発現量増加
実施例２で得たＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス（Ｔｇ）とそのリッターメイト由来のケラチノサイトを、最終濃度が０、１０、１００または５００μＭとなるようにアバカビル（超純水で溶解）（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）を加えたＣｎＴ−ＰＲ−Ｄ培地（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）にて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。培養液を除去した後に細胞を５００μＬのＰＢＳで洗い、Ｓｅｐａｓｏｌ−ＲＮＡ Ｉ Ｓｕｐｅｒ Ｇ（ナカライテスク株式会社）を用いてトータルＲＮＡを回収し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡株式会社）を用いて逆転写を行いｃＤＮＡを得た。作製したｃＤＮＡに対して、Ｔｈｕｎｄｅｒ Ｂｉｒｄ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡株式会社）と表１記載の各プライマーセットを用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−Ｎａｎｏ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により定量的リアルタイムＰＣＲ反応を行い、炎症性サイトカインであるＩＬ−１βとＩＦＮ−γのｍＲＮＡの定量を行った。各ｍＲＮＡの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンのｍＲＮＡ発現量で補正した後に、アバカビルを添加していないサンプルのｍＲＮＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図２）。 Example 4 HLA-B * 57:01 transgenic mice expression of inflammatory cytokines associated with abacavir exposure to keratinocytes derived from increased obtained in Example 2 HLA-B * 57:01 transgenic mice (Tg) and its liter Mate-derived keratinocytes in CnT-PR-D medium (CELLnTEC) supplemented with abacavir (dissolved in ultrapure water) (Carboynth) at a final concentration of 0, 10, 100 or 500 μM at 37 ° C., 5% They were cultured for 12 hours in CO 2. After removing the culture solution, the cells were washed with 500 μL of PBS, and total RNA was collected using Sepasol-RNA I Super G (Nacalai Tesque), and reversed using ReverseTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo). A copy was made to obtain cDNA. The prepared cDNA was subjected to quantitative real-time PCR reaction using LightCycler-Nano instrument (Roche Diagnostics) using Thunder Bird SYBR qPCR Mix (Toyobo Co., Ltd.) and each primer set shown in Table 1, and using inflammatory cytokines. Quantification of certain IL-1β and IFN-γ mRNAs was performed. The expression level of each mRNA is shown as a relative value obtained by correcting the mRNA expression level of β-actin, which is a housekeeping gene, and then dividing by the mRNA expression level of a sample not added with abacavir. It was expressed as an average value ± standard deviation (FIG. 2).

その結果、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトにアバカビルを曝露した際には、濃度依存的に炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現量が上昇することが認められた。 As a result, it was observed that when abacavir was exposed to keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 01 transgenic mice, the mRNA expression level of inflammatory cytokines increased in a concentration-dependent manner.

実施例５ ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う内因性ＭＨＣ発現量と導入ＨＬＡ発現量の増加
（１）実施例４と同様に、最終濃度０、１０、１００または５００μＭのアバカビルを曝露したＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトより取得したｃＤＮＡと表２記載の各プライマーセットを用いて、マウス内因性のＭＨＣクラスＩとβ２ｍのｍＲＮＡ発現量の定量を行った。各ｍＲＮＡの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンのｍＲＮＡ発現量で補正した後に、アバカビルを添加していないサンプルのｍＲＮＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図３Ａ）。 Example 5 Increase in endogenous MHC expression level and introduced HLA expression level with abacavir exposure to keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 01 transgenic mice (1) As in Example 4, final concentrations 0, 10, 100 Alternatively, by using cDNA obtained from keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 01 transgenic mice exposed to 500 μM abacavir and each primer set shown in Table 2, endogenous MHC class I and β 2 m mRNA expression The quantity was quantified. The expression level of each mRNA is shown as a relative value obtained by correcting the mRNA expression level of β-actin, which is a housekeeping gene, and then dividing by the mRNA expression level of a sample not added with abacavir. The average value ± standard deviation was expressed (FIG. 3A).

その結果、アバカビルを曝露したＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトでは、濃度依存的に内因性ＭＨＣクラスＩ及びβ２ｍのｍＲＮＡ発現量が上昇することが認められた。 As a result, in keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 01 transgenic mice exposed to abacavir, it was confirmed that endogenous MHC class I and β 2 m mRNA expression levels increased in a concentration-dependent manner.

（２）実施例４と同様に、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトを、最終濃度０、１０または１００μＭのアバカビルを加えた培地にて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。次いで、実施例３と同様に、ＰＥ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｗ６／３２）を用いて染色を行い、フローサイトメトリーによって、表面ＨＬＡ発現量を評価した。表面ＨＬＡの発現量は、アバカビルを添加していないサンプルの表面ＨＬＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図３Ｂ）。
その結果、アバカビルを曝露したＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトでは、アバカビルの濃度依存的にケラチノサイトの表面ＨＬＡの発現量が上昇することが認められた。 (2) In the same manner as in Example 4, keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 01 transgenic mice were added at a final concentration of 0, 10 or 100 μM abacavir at 37 ° C., 5% CO 2 for 12 hours. Cultured. Subsequently, in the same manner as in Example 3, staining was performed using PE Anti-human HLA-A, B, C Antibody (W6 / 32), and the surface HLA expression level was evaluated by flow cytometry. The expression level of the surface HLA is shown as a relative value divided by the expression level of the surface HLA of the sample to which no abacavir was added, and the data was expressed as an average value ± standard deviation of three samples (FIG. 3B).
As a result, in the keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 01 transgenic mice exposed to abacavir, it was confirmed that the expression level of the surface HLA of keratinocytes increased depending on the concentration of abacavir.

実施例６ ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う細胞毒性の有無の確認
実施例４と同様に、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス（Ｔｇ）またはそのリッターメイト由来のケラチノサイトを、最終濃度０、１０、１００または５００μＭのアバカビルを加えた培地にて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。次いで、アバカビルの細胞毒性を、ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて、細胞外に漏出される乳酸脱水素酵素の量によって評価した。データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図４）。
その結果、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイト及びそのリッターメイト由来のケラチノサイトのどちらにおいても、アバカビル曝露に伴う細胞毒性は認められなかった。よって、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトにアバカビルを曝露した際に観察される炎症性サイトカインや表面ＨＬＡ発現量の上昇は、細胞毒性による応答ではなく、免疫反応として惹起されたものであることが示唆された。 Example 6 Confirmation of the presence or absence of cytotoxicity associated with abacavir exposure to keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 01 transgenic mice As in Example 4, HLA-B * 57 : 01 transgenic mice (Tg) or liters thereof Mate-derived keratinocytes were cultured for 12 hours at 37 ° C., 5% CO 2 in a medium supplemented with a final concentration of 0, 10, 100 or 500 μM abacavir. Subsequently, the cytotoxicity of abacavir was evaluated by the amount of lactate dehydrogenase leaked out of the cells using LDH Cytotoxicity Detection Kit (Takara Bio Inc.). Data were expressed as the mean value ± standard deviation of three samples (FIG. 4).
As a result, cytotoxicity associated with abacavir exposure was not observed in either keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 01 transgenic mice and keratinocytes derived from the litermate. Therefore, the increase in the expression level of inflammatory cytokines and surface HLA observed when abacavir was exposed to keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 01 transgenic mice was induced not as a response due to cytotoxicity but as an immune response. It was suggested that

実施例７ ケラチノサイトに対するアバカビル曝露に伴う免疫応答のＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１特異性の評価
（１）実施例４と同様に、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス（Ｔｇ）由来のケラチノサイトを、アバカビルと同様の核酸アナログであるジドブジン（和光純薬工業株式会社）を超純水で溶解して最終濃度が０、１００または５００μＭとなるように加えた培地中で、３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。次いで、実施例３と同様にＰＥ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｗ６／３２）を用いて染色を行い、フローサイトメトリーによって、表面ＨＬＡ発現量を評価した。表面ＨＬＡの発現量は、ジドブジンを添加していないサンプルの表面ＨＬＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図５Ａ）。
その結果、ジドブジンの曝露の場合には、アバカビル曝露の時に認められていた表面ＨＬＡの発現量の上昇は観察されなかった。 Example 7 Evaluation of HLA-B * 57 : 01 Specificity of Immune Response Associated with Abacavir Exposure to Keratinocytes (1) In the same manner as in Example 4, keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 01 transgenic mice (Tg) were obtained. In a medium containing zidovudine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), a nucleic acid analog similar to abacavir, dissolved in ultrapure water to a final concentration of 0, 100 or 500 μM, 37 ° C., 5% CO 2 for 12 hours. Subsequently, staining was performed using PE Anti-human HLA-A, B, C Antibody (W6 / 32) in the same manner as in Example 3, and the surface HLA expression level was evaluated by flow cytometry. The expression level of the surface HLA is shown as a relative value divided by the expression level of the surface HLA of the sample to which zidovudine was not added, and the data was expressed as an average value ± standard deviation of three samples (FIG. 5A).
As a result, in the case of zidovudine exposure, no increase in the expression level of surface HLA observed at the time of abacavir exposure was observed.

（２）実施例４と同様に、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子導入マウス（Ｔｇ）由来のケラチノサイトを、最終濃度０、１００または５００μＭのアバカビルを加えた培地にて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。次いで、実施例３と同様にＰＥ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｗ６／３２）を用いて染色を行い、フローサイトメトリーによって、表面ＨＬＡ発現を評価した。表面ＨＬＡの発現量は、アバカビルを添加していないサンプルの表面ＨＬＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図５Ｂ）。
その結果、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子導入マウス由来のケラチノサイトにアバカビルを曝露した場合には、表面ＨＬＡの発現量の上昇は観察されなかった。したがって、アバカビル曝露に伴う免疫応答は、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３に特異的であることが示唆された。 (2) As in Example 4, keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 03 transgenic mice (Tg) were added at 37 ° C., 5% CO 2 in a medium supplemented with a final concentration of 0, 100 or 500 μM abacavir. For 12 hours. Subsequently, staining was performed using PE Anti-human HLA-A, B, C Antibody (W6 / 32) in the same manner as in Example 3, and surface HLA expression was evaluated by flow cytometry. The expression level of the surface HLA is shown as a relative value divided by the expression level of the surface HLA of the sample to which no abacavir was added, and the data was expressed as an average value ± standard deviation of three samples (FIG. 5B).
As a result, when abacavir was exposed to keratinocytes derived from HLA-B * 57 : 03 transgenic mice, no increase in the expression level of surface HLA was observed. Therefore, it was suggested that the immune response accompanying abacavir exposure is specific for HLA-B * 57 : 03.

実施例８ ＨＬＡ遺伝子導入マウス由来の肝細胞の単離及び培養
８〜１２週齢のキメラ型ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス、または野生型のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ペントバルビタール（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して麻酔し、開腹した。門脈にシュアシールドを挿入して、クレンメで挟み、ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（０．４ｇ／Ｌ ＫＣｌ、６０ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、４８ｍｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、９８ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４、２．３８ｇ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、２２８ｍｇ／Ｌ ＥＧＴＡ、１ｇ／Ｌ グルコース、１．２９ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ ７．２）で灌流した。次に、下大静脈を切断して灌流液を流出させた。ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで１０分間、続いてコラゲナーゼ溶液（ＥＧＴＡ不含のｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １２０ｍＬ、１００ｍＭ ＣａＣｌ２ ４．８ｍＬ、コラゲナーゼ（和光純薬工業株式会社）３５ｍｇ、ｐＨ ７．４）で１０分間灌流した。灌流の完了した肝臓を滅菌済みの１００ｍＬビーカーに移し、そこにコラゲナーゼ溶液を約２０ｍＬ加えた。ピンセットを用いて肝臓に切り込みを入れ、肝臓内部を露出させた。目開き１２５μｍのメッシュで濾過後、目開き７４μｍのメッシュで５０ｍＬの遠心チューブに濾した。
４℃において７００ｒｐｍで３分間の遠心後に上清を除去し、２４ｍＬのＷｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２１．６ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、 ２．４ｍＬの１０倍濃縮ＨＢＳＳ溶液（８０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、４ｇ／Ｌ ＫＣｌ、２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．７７２ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．６ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、３．５ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３）で再懸濁した。続いて、４℃において７００ｒｐｍで１５分間の遠心の後、上清を除去し、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ Ｍｅｄｉｕｍで再懸濁した。目開き７４μｍのメッシュで再度濾過し、４℃において７００ｒｐｍで３分間の遠心を行い、上清を除去した。
約１０ｍＬの播種用培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ Ｍｅｄｉｕｍ ５００ｍＬ、ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５ｍＭ デキサメタゾン（和光純薬工業株式会社）１００μＬ、抗生物質−抗真菌剤混合溶液 ５ｍＬ、ＧｌｕｔａＭＡＸTM（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ５ｍＬ、１Ｍ ＨＥＰＥＳ ７．５ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬのインスリン溶液（和光純薬工業株式会社）５００μＬ）で再懸濁した。細胞数を測定した後、６ウェルプレートに１ウェルあたり１．２×１０６個、または１２ウェルプレートに１ウェルあたり４．３７５×１０５個となるように播き、その２４時間後に培養用培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ Ｍｅｄｉｕｍ ５００ｍＬ、５ｍＭ デキサメタゾン １０μＬ、抗生物質−抗真菌剤混合溶液 ２．５ｍＬ、ＧｌｕｔａＭＡＸTM ５ｍＬ、ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ） ５００μＬ）に置換した。ウェルプレートには予めコラーゲンをコートした。 Example 8 Isolation and culture of hepatocytes derived from HLA transgenic mice 8-12 weeks old chimeric HLA-B * 57 : 01 transgenic mice or wild type C57BL / 6J mice were treated with pentobarbital (1 mg / mg). kg) was intraperitoneally administered and anesthetized and opened. Insert a Sure Shield into the portal vein and sandwich it with a clamp. Perfusion buffer (0.4 g / L KCl, 60 mg / L KH 2 PO 4 , 8 g / L NaCl, 48 mg / L Na 2 HPO 4 , 98 mg / L MgSO 4 2.38 g / L HEPES, 228 mg / L EGTA, 1 g / L glucose, 1.29 g / L NaHCO 3 , pH 7.2). Next, the inferior vena cava was cut and the perfusate was allowed to flow out. The mixture was perfused with a perfusion buffer for 10 minutes, followed by a collagenase solution (perfusion buffer 120 mL without EGTA, 4.8 mL of 100 mM CaCl 2 , collagenase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 35 mg, pH 7.4) for 10 minutes. The perfused liver was transferred to a sterilized 100 mL beaker, to which about 20 mL of collagenase solution was added. The liver was cut using tweezers to expose the inside of the liver. After filtration with a mesh having a mesh opening of 125 μm, the mixture was filtered through a mesh with a mesh opening of 74 μm into a 50 mL centrifuge tube.
After centrifugation at 700 rpm for 3 minutes at 4 ° C., the supernatant was removed, 24 mL of William's E Medium (Thermo Fisher Scientific), 21.6 mL of Percoll (GE Healthcare), 2.4 mL of 10 × concentrated HBSS solution (80 g) / L NaCl, 4 g / L KCl, 2 g / L MgSO 4 .7H 2 O, 0.772 g / L Na 2 HPO 4 · 12H 2 O, 0.6 g / L KH 2 PO 4 , 3.5 g / L NaHCO 3 ) And resuspended. Subsequently, after centrifugation at 700 rpm for 15 minutes at 4 ° C., the supernatant was removed and resuspended in William's E Medium. The mixture was filtered again with a mesh having an opening of 74 μm, centrifuged at 700 rpm for 3 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed.
About 10 mL of seeding medium (William's E Medium 500 mL, FBS (Life Technologies), 5 mM dexamethasone (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 μL, antibiotic-antimycotic mixed solution 5 mL, GlutaMAX ™ 1 M HEPES 7.5 mL, 5 mg / mL insulin solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 500 μL) was resuspended. After measuring the number of cells, seed 6-well plate at 1.2 × 10 6 per well, or 12-well plate at 4.375 × 10 5 per well, and culture medium for culture 24 hours later (William's E Medium 500 mL, 5 mM dexamethasone 10 μL, antibiotic-antifungal mixed solution 2.5 mL, GlutaMAX ™ 5 mL, ITS + Premix (Corning) 500 μL). The well plate was previously coated with collagen.

実施例９ ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来の肝細胞に対するアバカビル曝露に伴う免疫応答の評価
（１）実施例８で得たＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来の肝細胞を、最終濃度０、１００または５００μＭのアバカビルを加えた培地にて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。その後、実施例４と同様にトータルＲＮＡを回収してｃＤＮＡを作製し、表３の各プライマーセットを用いて、炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γと導入したＨＬＡのｍＲＮＡ発現量の定量を行った。各ｍＲＮＡの発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンのｍＲＮＡ発現量で補正した後に、アバカビルを添加していないサンプルのｍＲＮＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図６Ａ）。 Example 9 Evaluation of immune response accompanying abacavir exposure to hepatocytes derived from HLA-B * 57 : 01 transgenic mice (1) HLA-B * 57 : 01 hepatocytes derived from transgenic mice obtained in Example 8 The cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 12 hours in a medium supplemented with a final concentration of 0, 100 or 500 μM abacavir. Thereafter, total RNA was collected in the same manner as in Example 4 to prepare cDNA, and using each primer set in Table 3, the amount of mRNA expression of IFN-γ, which is an inflammatory cytokine, and introduced HLA was quantified. . The expression level of each mRNA is shown as a relative value obtained by correcting the mRNA expression level of β-actin, which is a housekeeping gene, and then dividing by the mRNA expression level of a sample not added with abacavir. The average value ± standard deviation was expressed (FIG. 6A).

その結果、アバカビルの曝露によってＩＦＮ−γと導入したＨＬＡのｍＲＮＡ発現量がいずれも上昇することが認められた。   As a result, it was recognized that the mRNA expression level of IFN-γ and the introduced HLA increased by abacavir exposure.

（２）実施例８で得たＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子導入マウス由来の肝細胞を、最終濃度０、１００、５００μＭのアバカビルを加えた培地にて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。その後、細胞を可溶化し、その可溶化液をウェスタンブロッティングにかけ、導入したＨＬＡの発現量をＨＬＡのＣ末側に付加したＦＬＡＧタグに対する抗体によって評価した（図６Ｂ）。コントロールには、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量を用いた。具体的には、培養液を除去した後に細胞を５００μＬのＰＢＳで２回洗い、可溶化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を３００μＬ加えて可溶化した。氷上で１０分インキュベーションした後に、４℃において１０分間１２，０００×ｇで遠心し、その上清を回収した。その細胞可溶化液のタンパク質濃度をＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した後に、タンパク質量として５μｇ相当を１５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて展開した。電気泳動後、ゲル上のタンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。このメンブレンを５％ ＢＳＡを含む０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０入りＴＢＳ（ＴＴＢＳ）でブロッキングし、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と４℃で１２時間反応させた。その後、対応する二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と室温で１時間インキュベーションを行い、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出した。検出器はＬＡＳ４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。
その結果、アバカビルの濃度依存的に細胞内ＨＬＡ発現量が上昇することが認められた。 (2) HLA-B * 57 : 01 transgenic mouse-derived hepatocytes obtained in Example 8 were cultured in a medium supplemented with abacavir at final concentrations of 0, 100, and 500 μM at 37 ° C. and 5% CO 2 for 12 hours. Cultured. Thereafter, the cells were solubilized, the solubilized solution was subjected to Western blotting, and the expression level of the introduced HLA was evaluated by an antibody against the FLAG tag added to the C-terminal side of HLA (FIG. 6B). For the control, the expression level of GAPDH, which is a housekeeping gene, was used. Specifically, after removing the culture medium, the cells were washed twice with 500 μL of PBS, solubilized buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, protease inhibitors (Roche Diagnostics). )) Was added and solubilized. After 10 minutes of incubation on ice, the mixture was centrifuged at 12,000 × g for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected. After measuring the protein concentration of the cell lysate using BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific), 5 μg equivalent of the protein amount was developed using 15% SDS-polyacrylamide gel. After electrophoresis, the protein on the gel was transferred to a PVDF membrane (Merck Millipore). This membrane was blocked with TBS (TTBS) containing 0.05% Tween 20 containing 5% BSA, and reacted with an anti-FLAG antibody (Sigma-Aldrich) or an anti-GAPDH antibody (Cell Signaling Technology) at 4 ° C. for 12 hours. Then, it incubated with the corresponding secondary antibody (GE Healthcare) at room temperature for 1 hour, and detected using ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare). The detector used was LAS4000 (GE Healthcare).
As a result, it was confirmed that the intracellular HLA expression level increased depending on the concentration of abacavir.

実施例１０ ＨＬＡ遺伝子導入マウス肝細胞の調製
（１）ＨＬＡ遺伝子導入アデノウイルスの作製
実施例１で構築したキメラ型ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１及び５７：０３のｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴアデノウイルスベクターは、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて２９３Ａ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に導入し、ＶｉｒａＰｏｗｅｒTM Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、アデノウイルスを含む培養上清を得た。得られたアデノウイルスは、Ｖｉｖａｐｕｒｅ ＡｄｅｎｏＰＡＣＫTM ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇoｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、Ａｄｅｎｏ−Ｘ Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）に従いＨＥＫ２９３細胞（独立行政法人理化学研究所）を用いてウイルスの力価を決定した。
２９３Ａ細胞及びＨＥＫ２９３細胞はいずれもＤＭＥＭ培地（ナカライテスク株式会社）に１０％のＦＢＳと抗生物質−抗真菌剤混合溶液を加えて培養した。 Example 10 Preparation of HLA Gene-Introduced Mouse Hepatocytes (1) Preparation of HLA Gene-Introduced Adenovirus Chimeric HLA-B * 57:01 and 57:03 pAd / CMV / V5-DEST adenovirus constructed in Example 1 The vector was introduced into 293A cells (Life Technologies) using Lipofectamine ™ 2000 (Life Technologies), and ViraPower ™ Adenoviral Expression System (Life Technologies) was obtained. The obtained adenovirus was purified using Vivapure AdenoPACK ™ 20 (Sartorius, Gottingen, Germany), and using HEK293 cells (RIKEN), Adeno-X Rapid Titer Kit (Takara Bio Inc.). Viral titer was determined.
Both 293A cells and HEK293 cells were cultured in DMEM medium (Nacalai Tesque, Inc.) by adding 10% FBS and an antibiotic-antimycotic mixed solution.

（２）野生型マウス由来の肝細胞へのアデノウイルス導入
野生型のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の肝細胞を単離し、上記（１）で得たアデノウイルスを用いてＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１またはＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子を導入した。アデノウイルス導入時には、力価が２５ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）となるように培養液中にウイルス溶液を添加し、その２４時間後に培地交換を行って培養液中のウイルスを除いた。 (2) Adenovirus introduction into hepatocytes derived from wild-type mice Hepatocytes derived from wild-type C57BL / 6J mice were isolated and HLA-B * 57 : 01 or the adenovirus obtained in (1) above was used. The HLA-B * 57 : 03 gene was introduced. At the time of adenovirus introduction, the virus solution was added to the culture solution so that the titer was 25 multiplicity of infection (MOI), and the medium was changed 24 hours later to remove the virus in the culture solution.

実施例１１ 肝細胞に対するアバカビル曝露に伴う免疫応答のＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１特異性の評価
実施例１０で得たＨＬＡ遺伝子導入肝細胞を、最終濃度０または１００μＭのアバカビルを加えた培地にて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養し、実施例３と同様にＰＥ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｗ６／３２）を用いて染色を行い、フローサイトメトリーによって、表面ＨＬＡ発現量を評価した。表面ＨＬＡの発現量は、アバカビルを添加していないサンプルの表面ＨＬＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図７）。
その結果、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子を導入した肝細胞においては、アバカビルの曝露によって表面ＨＬＡの発現量が増加することが観察された。一方、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０３遺伝子を導入した肝細胞においては、表面ＨＬＡの発現量増加は観察されなかった。 Example 11 Evaluation of HLA-B * 57 : 01 Specificity of Immune Response Associated with Abacavir Exposure to Hepatocytes The HLA gene-introduced hepatocytes obtained in Example 10 were cultured in a medium supplemented with a final concentration of 0 or 100 μM abacavir. The cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 12 hours, stained with PE Anti-human HLA-A, B, C Antibody (W6 / 32) in the same manner as in Example 3, and surface HLA was obtained by flow cytometry. The expression level was evaluated. The expression level of the surface HLA is shown as a relative value divided by the expression level of the surface HLA of the sample to which no abacavir was added, and the data was expressed as an average value ± standard deviation of three samples (FIG. 7).
As a result, it was observed that the expression level of surface HLA increased in hepatocytes introduced with the HLA-B * 57 : 01 gene by exposure to abacavir. On the other hand, no increase in the expression level of surface HLA was observed in the hepatocytes into which the HLA-B * 57 : 03 gene was introduced.

参考例１ ＨＬＡを導入した非免疫細胞であるＨｅＬａ細胞を用いたアバカビル応答性の評価
ＨｅＬａ細胞（独立行政法人理化学研究所）は、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地（ナカライテスク株式会社）に１０％のＦＢＳ、抗生物質−抗真菌剤混合溶液を加えた培養液中にて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。３．０×１０３個／ｃｍ２で１２ウェルプレート（１ｍＬ）に播種し、２４時間後に培養液を除去し９００μＬの新しいＭＥＭ培地を加えた。
実施例１で構築したキメラ型ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子のｐＣＡＧＧＳ発現ベクターまたはｐＣＡＧＧＳコントロールベクターを１μｇ、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM ２０００を２μＬ、それぞれ５０μＬのＭＥＭ培地に加えて室温で５分間インキュベーションし、続いて両者を混合して室温で２０分間インキュベーションを行った。それを、培養中のＨｅＬａ細胞に添加し、その２４時間後に培養液を除去して最終濃度０、１０、１００または５００μＭのアバカビルを含むＭＥＭ培地を加えて３７℃、５％ＣＯ２で１２時間培養した。その後、実施例３と同様にＰＥ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｗ６／３２）を用いて染色を行い、フローサイトメトリーによって、表面ＨＬＡ発現量を評価した。表面ＨＬＡの発現量は、アバカビルを添加していないサンプルの表面ＨＬＡ発現量で除した相対値で示しており、データは３試料の平均値±標準偏差で表した（図８）。
その結果、非免疫細胞であるＨｅＬａ細胞においては、ＨＬＡ−Ｂ＊５７：０１遺伝子を導入しても、アバカビルの曝露に伴う表面ＨＬＡの発現量の増加は認められなかった。 Reference Example 1 Evaluation of Abacavir Responsibility Using HeLa Cells, Non-Immune Cells Introduced with HLA HeLa cells (RIKEN) are 10% in Minimum Essential Medium (MEM) medium (Nacalai Tesque, Inc.) The culture was performed at 37 ° C. and 5% CO 2 in a culture solution to which FBS and an antibiotic-antifungal mixed solution were added. It seed | inoculated to 12 well plate (1 mL) at 3.0 * 10 < 3 > piece / cm < 2 >, the culture solution was removed 24 hours afterward, and 900 microliters fresh MEM culture medium was added.
1 μg of the pCAGGS expression vector or pCAGGS control vector of the chimeric HLA-B * 57 : 01 gene constructed in Example 1 and 2 μL of Lipofectamine ™ 2000 were added to 50 μL of MEM medium, respectively, followed by incubation at room temperature for 5 minutes. Both were mixed and incubated at room temperature for 20 minutes. It is added to HeLa cells in culture, and after 24 hours, the culture medium is removed and MEM medium containing abacavir at a final concentration of 0, 10, 100, or 500 μM is added, and then at 37 ° C., 5% CO 2 for 12 hours. Cultured. Thereafter, staining was carried out using PE Anti-human HLA-A, B, C Antibody (W6 / 32) in the same manner as in Example 3, and the surface HLA expression level was evaluated by flow cytometry. The expression level of the surface HLA is shown as a relative value divided by the expression level of the surface HLA of the sample to which no abacavir was added, and the data was expressed as an average value ± standard deviation of three samples (FIG. 8).
As a result, in HeLa cells, which are non-immune cells, even when the HLA-B * 57 : 01 gene was introduced, an increase in the expression level of surface HLA accompanying abacavir exposure was not observed.

Claims (5)

被験薬物の存在下に、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の遺伝子多型を導入した自然免疫応答性動物細胞を培養し、ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量の変化を測定することを特徴とする、被験薬物による特異体質毒性の発現予測方法。   It is characterized by culturing innate immune responsive animal cells into which a human leukocyte antigen (HLA) gene polymorphism has been introduced in the presence of a test drug, and measuring changes in HLA expression level and inflammatory cytokine expression level. A method for predicting the expression of idiosyncratic toxicity by a test drug. ＨＬＡの遺伝子多型が、毒性発現性遺伝子多型である、請求項１記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the HLA gene polymorphism is a toxicity-expressing gene polymorphism. 自然免疫応答性動物細胞が、表皮細胞（ケラチノサイト）、樹状細胞及び肝細胞から選ばれる動物細胞である、請求項１又は２記載の方法。   The method according to claim 1 or 2, wherein the innate immune responsive animal cell is an animal cell selected from epidermal cells (keratinocytes), dendritic cells and hepatocytes. 炎症性サイトカインが、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。   Inflammatory cytokines include interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), interleukin-12 (IL-12), interleukin-18 ( The method according to any one of claims 1 to 3, which is one or more selected from IL-18), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interferon-γ (IFN-γ). ＨＬＡの発現量及び炎症性サイトカインの発現量が、ＨＬＡの遺伝子多型を導入していない自然免疫応答性動物細胞を用いた場合と対比して上昇している場合に、被験薬物による特異体質毒性発現の可能性があると予測するものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。   Specific constitutional toxicity due to the test drug when the expression level of HLA and the expression level of inflammatory cytokines are increased compared to the case of using innate immune responsive animal cells into which HLA gene polymorphism has not been introduced The method according to any one of claims 1 to 4, wherein it is predicted that there is a possibility of expression.
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