JP2018029488A - Annular culture vessel, cell culture system, and cell culture method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、閉鎖系容器において細胞を大量に培養するための細胞培養方法に関する。 The present invention relates to a cell culture method for culturing a large amount of cells in a closed container.
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような状況において、培養容器(培養バッグ)に細胞と培養液を充填して、閉鎖系で自動的に細胞を大量培養することが行われている。
In recent years, in the fields of pharmaceutical production, gene therapy, regenerative medicine, immunotherapy, and the like, it has been required to efficiently culture a large amount of cells, tissues, microorganisms, and the like in an artificial environment.
In such a situation, it is performed that a culture vessel (culture bag) is filled with cells and a culture solution, and a large number of cells are automatically cultured in a closed system.
閉鎖系容器においてiPS細胞などの接着細胞を、凝集塊を形成させて培養する場合、凝集塊が沈降して底面に接着しないように、容器内の培養液を撹拌する必要がある。
しかしながら、培養バッグなどの閉鎖系容器を用いて細胞を培養する場合、撹拌された細胞がランダムに動くため、凝集塊同士がぶつかってダメージを受けたり、あるいは凝集塊のサイズが大きくなったり、小さくなったりし、結果として凝集塊サイズが大きくばらつくという問題点があった。
このような問題を解消し得る技術として、培養バッグをドーナツ形状に製袋し、回転振動台上で振動させ、バッグ内において培養液をよく混ざるようにすることによって、細胞を培養する培養容器が提案されている。
When culturing adherent cells such as iPS cells in a closed container while forming an aggregate, it is necessary to stir the culture solution in the container so that the aggregate does not settle and adhere to the bottom surface.
However, when culturing cells using a closed container such as a culture bag, the agitated cells move randomly, so the agglomerates collide with each other and are damaged, or the size of the agglomerates increases or decreases. As a result, there is a problem that the aggregate size varies greatly.
As a technology that can solve such a problem, a culture container for culturing cells is manufactured by making a culture bag into a donut shape, vibrating on a rotary vibration table, and mixing the culture solution well in the bag. Proposed.
しかしながら、このようなドーナツ形状に製袋された培養バッグを用いる場合、培養バッグにシワが発生することによって細胞が滞留することがあり、また、細胞を大量に培養するための容量の大きい培養容器を製造することは、困難であるという問題があった。 However, when using a culture bag made in such a donut shape, cells may accumulate due to wrinkles occurring in the culture bag, and a large-capacity culture container for culturing cells in large quantities There was a problem that it was difficult to manufacture.
そこで、本発明者らは鋭意研究して、可撓性部材を用いて形成された細長のチューブを用いて、当該チューブの端部を接続部材により接続し、形成されたチューブ内の密閉空間に細胞及び培養液を封入した状態で、細胞を一方向に送流しながら細胞を培養することによって、上記問題を解消できることを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、このようなチューブを用いて形成された環状培養容器に、凝集塊を形成させて培養できる接着細胞や浮遊細胞を培養液と共に封入し、ポンプを取り付けてこれを駆動させることによって、チューブ内の培養液と細胞を一方向に送流しながら細胞を培養できる。このような環状培養容器を用いてチューブ内の培養液と細胞を一方向へ流すことで、細胞の凝集塊が互いにぶつかり合うことを抑止でき、より均一な凝集塊を得ることが可能となる。また、このようなチューブからなる環状培養容器によれば、容量の大きい培養容器を容易に製造することも可能となる。
Therefore, the present inventors have intensively studied, using an elongated tube formed using a flexible member, connecting the ends of the tube with a connecting member, and forming a sealed space in the formed tube. The inventors have found that the above problems can be solved by culturing the cells while feeding the cells in one direction in a state where the cells and the culture solution are enclosed, and the present invention has been completed.
In other words, in an annular culture container formed using such a tube, adherent cells and floating cells that can be cultured by forming aggregates are sealed together with the culture solution, and a pump is attached to drive this to drive the tube. The cells can be cultured while feeding the culture medium and cells in one direction. By flowing the culture solution and the cells in the tube in one direction using such an annular culture vessel, it is possible to prevent the cell aggregates from colliding with each other and obtain a more uniform aggregate. Moreover, according to the annular culture container which consists of such a tube, it becomes possible to manufacture a culture container with a large capacity | capacitance easily.
ここで、チューブを用いて形成された培養容器としては、特許文献1に記載の連続培養装置や、特許文献2に記載の培養・回収装置を挙げることができる。
しかしながら、特許文献1に記載の連続培養装置では、チューブ内の培養液と細胞を一方向に送流しながら細胞を培養することが可能なものではなかった。また、特許文献2に記載の培養・回収装置は、チューブの内面に細胞を付着させて培養し、チューブを変形させることによって培養した細胞を剥離させて回収するものであり、細胞を容器に付着させることなく、チューブ内の培養液と細胞を一方向に送流しながら細胞を培養することが可能なものではなかった。
Here, examples of the culture container formed using a tube include the continuous culture apparatus described in
However, the continuous culture apparatus described in
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、チューブ内の培養液と細胞を一方向に効率的に送流することができ、これによって細胞の凝集塊が互いにぶつかり合うことを抑止して均一な凝集塊を得ることができ、また容量の大きい培養容器を容易に製造することが可能な環状培養容器、細胞培養システム、及び細胞培養方法の提供を目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and can efficiently flow the culture solution and cells in the tube in one direction, thereby preventing the cell agglomerates from colliding with each other. An object of the present invention is to provide an annular culture vessel, a cell culture system, and a cell culture method capable of obtaining a uniform aggregate and easily producing a culture vessel having a large capacity.
上記目的を達成するため、本発明の環状培養容器は、可撓性部材を用いて形成された細長のチューブからなり、前記チューブの端部が一又は二以上の接続部材で接続されて前記チューブ内で細胞を培養する環状の密閉空間が形成された構成としてある。 In order to achieve the above object, the annular culture container of the present invention is composed of an elongated tube formed using a flexible member, and ends of the tube are connected by one or more connecting members. An annular sealed space in which cells are cultured is formed.
また、本発明の細胞培養システムは、上記環状培養容器と、ペリスタルティック方式のポンプとを備え、前記チューブに前記ポンプが取り付けられ、前記ポンプを駆動させることにより、前記チューブ内の培養液と細胞が、前記チューブ内において一方向に送流されながら培養される構成としてある。 The cell culture system of the present invention includes the annular culture container and a peristaltic pump, and the pump is attached to the tube, and the culture medium and cells in the tube are driven by driving the pump. However, the culture is performed while being fed in one direction in the tube.
また、本発明の細胞培養方法は、上記細胞培養システムを用いた細胞培養方法であって、前記チューブに、凝集塊を形成させて培養できる接着細胞又は浮遊細胞を培養液と共に封入し、前記ポンプを駆動させることにより、前記チューブ内の培養液と細胞を、前記チューブ内において一方向に送流しながら培養する方法としてある。 The cell culturing method of the present invention is a cell culturing method using the above cell culturing system, wherein an adherent cell or a floating cell that can be cultured by forming an aggregate is formed in the tube together with a culture solution, and the pump By driving the culture medium, the culture solution and cells in the tube are cultured while being fed in one direction in the tube.
本発明によれば、チューブ内の培養液と細胞を一方向に効率的に送流することができ、これによって細胞の凝集塊が互いにぶつかり合うことを抑止して均一な凝集塊を得ることができ、また容量の大きい培養容器を容易に製造することが可能となる。 According to the present invention, the culture solution and cells in the tube can be efficiently fed in one direction, thereby preventing the cell aggregates from colliding with each other and obtaining a uniform aggregate. In addition, a culture container having a large capacity can be easily produced.
以下、本発明の環状培養容器、細胞培養システム、及び細胞培養方法の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態の具体的な内容に限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments of the annular culture container, the cell culture system, and the cell culture method of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the specific contents of the following embodiments.
本実施形態の環状培養容器は、可撓性部材を用いて形成された細長のチューブからなり、チューブの端部が一又は二以上の接続部材で接続されてチューブ内で細胞を培養する環状の密閉空間が形成されたことを特徴とする。
また、本実施形態の細胞培養システムは、このような環状培養容器と、ペリスタルティック方式のポンプとを備え、チューブにポンプが取り付けられ、ポンプを駆動させることにより、チューブ内の培養液と細胞が、チューブ内において一方向に送流されながら培養されることを特徴とする。
また、本実施形態の細胞培養方法は、このような細胞培養システムを用いた細胞培養方法であって、チューブに、凝集塊を形成させて培養できる接着細胞又は浮遊細胞を培養液と共に封入し、ポンプを駆動させることにより、チューブ内の培養液と細胞を、前記チューブ内において一方向に送流しながら培養することを特徴とする。
The annular culture container of this embodiment is composed of an elongated tube formed using a flexible member, and the end of the tube is connected by one or more connecting members to culture cells in the tube. A sealed space is formed.
Further, the cell culture system of this embodiment includes such an annular culture container and a peristaltic pump, and the pump is attached to the tube. By driving the pump, the culture medium and cells in the tube are The culture is performed while being fed in one direction in the tube.
Further, the cell culture method of the present embodiment is a cell culture method using such a cell culture system, and encloses adherent cells or floating cells that can be cultured by forming aggregates in a tube together with a culture solution, By driving the pump, the culture medium and the cells in the tube are cultured while being fed in one direction in the tube.
具体的には、本実施形態の環状培養容器は、図1に示すように、可撓性部材からなる細長のチューブ1が接続部材11により接続されて環状構造を形成し、チューブ1内に密閉空間が形成されている。
環状とは、チューブ1が環を形成するように繋がれていることを意味し、円形に繋がれることに限定するものではなく、図2に示すように矩形やその他の形状となるように繋がれていても良い。また、本実施形態の環状培養容器におけるチューブ1は、接続部材等を用いて材質や剛性などが異なるチューブを複数組み合わせて形成されていても良い。
Specifically, as shown in FIG. 1, the annular culture container of the present embodiment has an
The term “annular” means that the
チューブ1は、ガス透過性を有する部材からなるものであることが好ましい。具体的には、酸素透過係数が400ml・mm/m2・day・atm(37℃−80%RH)以上、二酸化炭素透過係数が1200ml・mm/m2・day・atm(37℃−80%RH)以上のものであることが好ましく、酸素透過係数が1000ml・mm/m2・day・atm(37℃−80%RH)以上、二酸化炭素透過係数が3000ml・mm/m2・day・atm(37℃−80%RH)以上のものであることがより好ましい。チューブ1がこのようなガス透過性を有すれば、優れた細胞増殖効率を得ることができる。
The
また、チューブ1は、一部又は全部が弾性変形性を有する部材からなるものであることが好ましい。チューブ1の少なくとも一部が弾性変形性を有することで、ペリスタルティック方式のポンプ(チューブポンプ、ローラーポンプ、しごきポンプとも称する)を用いて、チューブ1内の培養液と細胞を効率的に送流することができる。また、チューブ1を自由に曲げることができるため、環状培養容器を優れたスペース効率で配置することが可能となる。さらに、環状培養容器内のエアを抜いて真空状態としてから培養液を充填することで、ポンプなどのエア排出手段を用いることが不要であり、各部材点数を少なくすることが可能となる。
Moreover, it is preferable that the
さらに、チューブ1は、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有することが好ましい。
チューブ1の材料としては、例えばシリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー、例えば、SBS(スチレン・ブタジエン・スチレン)、SIS(スチレン・イソプレン・スチレン)、SEBS(スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン)、SEPS(スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン)、ポリオレフィン樹脂、フッ素系樹脂等を用いることができる。
すなわち、チューブ1の材料としてこれらを用いると共に、上記のようなガス透過性、弾性変形性、及び透明性を有するものとすることが好ましい。
Furthermore, it is preferable that part or all of the
Examples of the material of the
That is, it is preferable to use these as the material of the
また、チューブ1の内面を、低接着表面とすることが好ましい。これにより、凝集塊を形成させて培養できる接着細胞などを好適に培養することができる。具体的には、例えばMPC(2-Methacryloylethyl Phosphoryl Choline)ポリマーや、ハイドロゲル等を用いて、チューブ1の内面に細胞低接着処理を施すことが可能である。
The inner surface of the
さらに、チューブ1内に、細胞の凝集塊のサイズを調節するためのサイズ調節フィルターを備えることも好ましい。これにより、大きくなり過ぎた凝集塊を一定のサイズ以下に分解することができ、凝集塊を一定のサイズに均一に揃えることが可能となる。
Furthermore, it is also preferable to provide a size adjusting filter for adjusting the size of the cell aggregate in the
接続部材11は、チューブ1の端部を接続することで、チューブ1内に環状の密閉空間を形成させる。図1では、接続部材11としてT型のチューブコネクタを用い、対向する開口部にチューブ1の端部を挿入して接続している。また、チューブ1に垂直な開口部はポート12として用いられ、他のチューブを介して外部のバッグなどに接続可能にされている。なお、接続部材11としては、このようなT型のチューブコネクタに限定されず、Y型、I型、X型等のチューブコネクタや、その他のチューブ接続器具を用いても良い。
The connecting
このように、チューブ1には、当該環状培養容器の外部と物質の出し入れをするための一又は二以上のポート12を備えることが好ましい。この物質には、培養液などの液体の他、空気などの気体や、細胞などの固形物等が含まれる。
具体的には、図2に示すように、ポート12には、チューブ1内に培養液を供給するための培養液バッグ5や、チューブ1内の空気を取り除いてチューブ1内を培養液で満注させるためのエア排気バッグ6やエアベントフィルター等を接続することができる。また、ポート12には、サンプリング用のチューブを接続することもできる。
Thus, it is preferable that the
Specifically, as shown in FIG. 2, the
また、図2において、チューブ1と培養液バッグ5、チューブ1とエア排気バッグ6をそれぞれ接続するチューブには、チューブクランプが取り付けられている。チューブ1内に培養液を充填する時に、チューブ1と培養液バッグ5の間のチューブクランプを取り外してポンプ4を駆動させ、培養液バッグ5内の培養液をチューブ1内に充填する。また、チューブ1内にエアが存在している場合、チューブ1とエア排気バッグ6の間のチューブクランプを取り外し、ポンプ4を駆動させて、チューブ1内のエアをエア排気バッグ6へ排出する。そして、エアの排出が完了すると、チューブ1とエア排気バッグ6の間にチューブクランプを取り付ける。また、チューブ1内に細胞2と培養液3が満注となるように充填されると、チューブ1と培養液バッグ5の間にチューブクランプを取り付ける。
In FIG. 2, tube clamps are attached to the tubes connecting the
このように、チューブ1内の密閉空間には、細胞2と培養液3が充填され、これらをチューブ1内において一方向に送流させながら、細胞2を培養することができる。なお、図1において、細胞2は、凝集塊として模式的に大きく表されている。
Thus, the sealed space in the
チューブ1内における細胞2と培養液3の送流は、ポンプ4を駆動させることで行うことができる。ポンプ4としては、チューブ1をしごくことによってチューブ1内の細胞2と培養液3を送流できるペリスタルティック方式のポンプを好適に用いることができる。
The flow of the cells 2 and the culture solution 3 in the
細胞2としては、凝集塊(スフェロイド)を形成させて培養できる接着細胞又は浮遊細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えばiPS細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、肝細胞、膵島細胞、心筋細胞、角膜内皮細胞等の接着細胞や、リンパ球、単球、赤血球、巨核球などの浮遊細胞を挙げることができる。
本実施形態の環状培養容器を用いてこれらの細胞を培養することにより、細胞の凝集塊が互いにぶつかり合うことを抑止することができ、均一なサイズの凝集塊を効率的に得ることが可能となる。
また、本実施形態の環状培養容器は、細長のチューブ1を接続部材11で接続することによって簡単に製造でき、容量の大きい培養容器を容易に製造することが可能である。
As the cell 2, an adherent cell or a floating cell that can be cultured by forming an aggregate (spheroid) can be preferably used. Specific examples include adherent cells such as iPS cells, neural stem cells, embryonic stem cells, hepatocytes, pancreatic islet cells, cardiomyocytes, corneal endothelial cells, and floating cells such as lymphocytes, monocytes, erythrocytes, and megakaryocytes. be able to.
By culturing these cells using the annular culture container of the present embodiment, it is possible to prevent the cell aggregates from colliding with each other, and it is possible to efficiently obtain uniform size aggregates. Become.
Moreover, the annular culture container of this embodiment can be easily manufactured by connecting the
また、本実施形態の環状培養容器を、二以上のチューブ1が接続部材11で接続され、複数の環状空間が連結して形成されたものとすることも好ましい。
具体的には、例えば、図3に示すように、3個の環状空間が連結して形成されたものとすることができるが、環状空間の個数はこれに限定されず、2個であっても4個以上であっても良い。
同図の例では、図2と同様の環状培養容器に、接続部材11を介して、2個の環状空間を構成するチューブ1が接続されている。便宜上、左から順に第一の環状空間、第二の環状空間、及び第三の環状空間と称する。第一の環状空間にのみ培養液バッグ5が接続され、またポンプ4が取り付けられているが、これらの両方又は片方を第二の環状空間及び/又は第三の環状空間に接続又は取り付けることもできる。
Moreover, it is also preferable that the annular culture container of this embodiment is formed by connecting two or
Specifically, for example, as shown in FIG. 3, three annular spaces may be connected and formed, but the number of annular spaces is not limited to this, and is two. May be four or more.
In the example of the figure, the
本実施形態の複数の環状空間が連結して形成された環状培養容器を用いて、例えば、図4に示す方法により、細胞培養を行うことができる。
まず、第一の環状空間と第二の環状空間を接続する接続部材11に取り付けられたチューブクランプを取り外し、また培養液バッグ5とエア排気バッグ6のチューブクランプを取り外して、ポンプ4を駆動する。そして、第一の環状空間を形成するチューブ1に、図2を用いて前述したように、細胞と培養液を充填し、これらをチューブ1内において一方向に送流することによって、細胞培養を行う。
Cell culture can be performed by, for example, the method shown in FIG. 4 using the annular culture vessel formed by connecting a plurality of annular spaces of the present embodiment.
First, the tube clamp attached to the connecting
第一の環状空間において、細胞が一定の密度になるまで増殖すると、次に、第二の環状空間のチューブ1に取り付けられたチューブクランプと、第二の環状空間のエア排気バッグ6に取り付けられたチューブクランプを取り外し、また培養液バッグ5のチューブクランプを取り外す。また、第一の環状空間と第二の環状空間を接続する接続部材11にチューブクランプを取り付けて、ポンプ4を駆動する。そして、第一の環状空間と第二の環状空間を形成するチューブ1に、細胞と培養液を充填し、これらをチューブ1内において一方向に送流することによって、細胞培養を行う。
When the cells grow in the first annular space to a certain density, they are then attached to the tube clamp attached to the
第一の環状空間と第二の環状空間において、細胞が一定の密度になるまで増殖すると、次に、第三の環状空間のチューブ1に取り付けられたチューブクランプと、第三の環状空間のエア排気バッグ6に取り付けられたチューブクランプを取り外し、また培養液バッグ5のチューブクランプを取り外す。また、第二の環状空間と第三の環状空間を接続する接続部材11にチューブクランプを取り付けて、ポンプ4を駆動する。そして、第一の環状空間と第二の環状空間と第三の環状空間を形成するチューブ1に、細胞と培養液を充填し、これらをチューブ1内において一方向に送流することによって、細胞培養を行う。環状空間が4以上ある場合は、同様の工程を繰り返す。
本実施形態の複数の環状空間が連結して形成された環状培養容器を用いて、このように細胞を培養することによって、細胞の増殖に併せて適切に培養空間を増やして培養液を追加し、細胞を効率的に増殖させることが可能となる。
Once the cells have grown to a certain density in the first and second annular spaces, then the tube clamp attached to the
By culturing cells in this way using an annular culture vessel formed by connecting a plurality of annular spaces of this embodiment, the culture space is appropriately increased in accordance with the proliferation of the cells and a culture solution is added. The cells can be efficiently propagated.
また、このような複数の環状空間が連結して形成された環状培養容器は、図5に示すように、支持柱7に環状空間を積み重ねて配置することができる。同図には、4個の環状空間が連結して形成された環状培養容器が示されている。
このように、本実施形態の複数の環状空間が連結して形成された環状培養容器によれば、環状培養容器を立体的に配置することができ、高いスペース効率を得ることが可能となる。すなわち、数多くの環状空間を有する環状培養容器を製造することで、容量が大きく、またスペース効率に優れた培養容器を容易に製造することが可能となる。
Moreover, the annular culture container formed by connecting a plurality of such annular spaces can be arranged by stacking the annular spaces on the
Thus, according to the annular culture container formed by connecting a plurality of annular spaces of the present embodiment, the annular culture container can be three-dimensionally arranged, and high space efficiency can be obtained. That is, by producing an annular culture vessel having a large number of annular spaces, it is possible to easily produce a culture vessel having a large capacity and excellent space efficiency.
以上説明したように、本実施形態の環状培養容器、細胞培養システム、及び細胞培養方法によれば、チューブ内の培養液と細胞を一方向に効率的に送流することができ、これによって細胞の凝集塊が互いにぶつかり合うことを抑止して均一な凝集塊を得ることができ、また容量の大きい培養容器を容易に製造することが可能となる。
また、数多くの環状空間を有する環状培養容器を製造することで、容量が大きく、スペース効率に優れた培養容器を容易に製造することが可能となる。
As described above, according to the annular culture container, the cell culture system, and the cell culture method of the present embodiment, the culture solution and the cells in the tube can be efficiently fed in one direction, whereby the cells The agglomerates can be prevented from colliding with each other to obtain a uniform agglomerate, and a large-capacity culture vessel can be easily produced.
In addition, by producing an annular culture vessel having a large number of annular spaces, it is possible to easily produce a culture vessel having a large capacity and excellent space efficiency.
本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、環状培養容器に複数の培養液バッグを接続したり、細胞回収バッグを接続するなど適宜変更することが可能である。
It goes without saying that the present invention is not limited to the above embodiment, and that various modifications can be made within the scope of the present invention.
For example, it is possible to appropriately change such as connecting a plurality of culture solution bags to the annular culture container or connecting a cell collection bag.
本発明は、凝集塊を形成させて培養可能な細胞を、大量に培養する場合に好適に利用することが可能である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be suitably used when cells that can be cultured by forming aggregates are cultured in large quantities.
1 チューブ
11 接続部材
12 ポート
2 細胞
3 培養液
4 ポンプ
5 培養液バッグ
6 エア排気バッグ
7 支持柱
DESCRIPTION OF
Claims (11)
前記チューブに前記ポンプが取り付けられ、前記ポンプを駆動させることにより、前記チューブ内の培養液と細胞が、前記チューブ内において一方向に送流されながら培養される
ことを特徴とする細胞培養システム。 The annular culture container according to any one of claims 1 to 7, and a pump,
The cell culture system, wherein the pump is attached to the tube, and the culture medium and cells in the tube are cultured while being fed in one direction in the tube by driving the pump.
前記チューブに、凝集塊を形成させて培養できる接着細胞又は浮遊細胞を培養液と共に封入し、
前記ポンプを駆動させることにより、前記チューブ内の培養液と細胞を、前記チューブ内において一方向に送流しながら培養する
ことを特徴とする細胞培養方法。 A cell culture method using the cell culture system according to claim 8,
In the tube, encapsulated adherent cells or floating cells that can be cultured by forming an aggregate, together with a culture solution,
A cell culture method comprising culturing the culture solution and cells in the tube while feeding the pump in one direction by driving the pump.
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