JP2018024698A - Masp−2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 - Google Patents
Masp−2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018024698A JP2018024698A JP2017209894A JP2017209894A JP2018024698A JP 2018024698 A JP2018024698 A JP 2018024698A JP 2017209894 A JP2017209894 A JP 2017209894A JP 2017209894 A JP2017209894 A JP 2017209894A JP 2018024698 A JP2018024698 A JP 2018024698A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- masp
- inhibitor
- subject
- composition
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/12—Antidiarrhoeals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/02—Antidotes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/54—F(ab')2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
Abstract
Description
本願は、2011年4月8日に出願された米国特許仮出願第61/473,698号の恩典を主張する。米国特許仮出願第61/473,698号は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本願に関連する配列表はハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により組み入れられる。配列表を含むテキストファイルの名前は、MP_1__0126_US2 _SequenceListingasFiled.txtである。このテキストファイルは110 KBであり、2012年3月30日に作成され、本明細書の出願と共にEFS-Webを介して提出されている。
補体系は、ヒトおよび他の脊椎動物において微生物感染および他の急性傷害に対する免疫応答を開始、増幅、および組織化するための初期作用機構を提供する(M.K. Liszewski and J. P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, W.E, Paul編, Raven Press, Ltd., New York)。補体活性化は潜在的な病原体に対する有益な第一線の防御を提供するが、防御免疫応答を促進する補体の活性は宿主にとって潜在的な脅威となることもある(K.R, Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994)。例えば、C3およびC5タンパク質分解産物は好中球を動員および活性化する。活性化好中球は宿主防御に不可欠であるが見境なく破壊酵素を放出し、臓器損傷を引き起こすことがある。さらに、補体活性化によって、近くの宿主細胞ならびに微生物標的の表面に溶解性補体成分が沈着し、その結果、宿主細胞が溶解することがある。
本概要は、以下の詳細な説明においてさらに説明される幅広い概念を簡単な形で紹介するために提供される。本概要は、請求された保護対象(subject matter)の重要な特徴を特定することを目的とせず、請求された保護対象の範囲の決定を助けるものとして用いられることも目的としない。
[本発明1001]
MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、発作性夜間血色素尿症(PNH)に罹患している該対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法。
[本発明1002]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記組成物が前記対象における赤血球の生存を向上させる、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記対象が、(i)正常より低いレベルのヘモグロビン;(ii)正常より低いレベルの血小板;(iii)正常より高いレベルの網状赤血球;および(iv)正常より高いレベルのビリルビンからなる群より選択される1つまたは複数の症状を示す、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記対象が、補体タンパク質C5の切断を阻害する終末補体阻害体による治療を以前に受けたことがあるかまたは現在受けている、本発明1001の方法。
[本発明1007]
補体タンパク質C5の切断を阻害する終末補体阻害体を前記対象に投与する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記終末補体阻害体がヒト化抗C5抗体またはその抗原結合断片である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記終末補体阻害体がエクリズマブである、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記抗体またはその断片が、組換え抗体、エフェクター機能が低下した抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、本発明1002の方法。
[本発明1011]
前記組成物が、皮下投与されるか、筋肉内投与されるか、動脈内投与されるか、静脈内投与されるか、または吸入剤として投与される、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記組成物が皮下投与される、本発明1011の方法。
[本発明1013]
MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、非H因子依存的非定型溶血性***症候群(aHUS)に罹患しているかまたは非H因子依存的aHUSを発症するリスクのある該対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法。
[本発明1014]
前記組成物の投与前に、前記対象が、(i)貧血、(ii)血小板減少、(iii)腎機能不全、および(iv)クレアチニン上昇からなる群より選択される1つまたは複数の症状を示すと判定され、かつ、該組成物が、該1つまたは複数の症状を改善するのに有効な量でかつ十分な時間投与される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記対象が、I因子、B因子、またはメンブレンコファクターCD46に関連したaHUSに罹患している、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、本発明1013の方法。
[本発明1017]
前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、本発明1013の方法。
[本発明1018]
(a)非定型溶血性***症候群(aHUS)に関連することが公知の遺伝子マーカーの、対象における存在を判定する工程;
(b)貧血、血小板減少、腎機能不全、およびクレアチニン上昇からなる群より選択される少なくとも1つの症状の有無を判定するために該対象を定期的にモニタリングする工程;ならびに
(c)貧血、血小板減少、腎機能不全、またはクレアチニン上昇の少なくとも1つの存在が判定されると、MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を該対象に投与する工程であって、該組成物が、1つまたは複数の該症状を改善するのに有効な量でかつ十分な時間投与される、工程
を含む、aHUSを発症するリスクのある該対象がaHUSに関連する臨床症状に罹患する可能性を低下させるための方法。
[本発明1019]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、本発明1019の方法。
[本発明1021]
工程(a)が、前記対象から得られた試料に対して遺伝子スクリーニング試験を実施すること、ならびに、補体因子H(CFH)、I因子(CFI)、B因子(CFB)、メンブレンコファクターCD46、C3、補体因子H関連タンパク質(CFHR1)、抗凝固タンパク質トロンボジュリン(THBD)、補体因子H関連タンパク質3(CFHR3)、および補体因子H関連タンパク質4(CFHR4)からなる群より選択される、遺伝子中のaHUSに関連した少なくとも1種類の遺伝子マーカーの存在を特定することを含む、本発明1018の方法。
[本発明1022]
aHUS臨床症状の誘発に関連することが公知の事象の発生について、前記対象をモニタリングする工程、および、誘発事象の発生前、発生中、または発生後に、前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物を該対象に投与する工程をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1023]
aHUS臨床症状の誘発に関連する前記事象が、薬物曝露、感染、悪性腫瘍、損傷、臓器移植または組織移植、および妊娠からなる群より選択される、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記感染が細菌感染である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記組成物が皮下投与される、本発明1018の方法。
[本発明1026]
MASP-2補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、感染に続発する非定型溶血性***症候群(aHUS)に罹患しているかまたは感染に続発するaHUSを発症するリスクのある該対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法。
[本発明1027]
前記対象が、肺炎連鎖球菌(S.pneumonia)感染に関連した非腸性aHUSに罹患しているか、または、肺炎連鎖球菌感染に関連した非腸性aHUSを発症するリスクがある、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、本発明1026の方法。
[本発明1029]
前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、本発明1028の方法。
[本発明1030]
MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含み、該MASP-2阻害物質の投与が、静脈内カテーテル送達法または他のカテーテル送達法によって実施される、非定型溶血性***症候群(aHUS)に罹患している該対象を治療する方法。
[本発明1031]
プラスマフェレーシスで患者を治療する工程をさらに含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物がプラスマフェレーシスの非存在下で投与される、本発明1030の方法。
[本発明1033]
前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物を第2の期間投与する工程をさらに含み、該組成物が該第2の期間中に皮下投与される方法であって、該MASP-2阻害物質を含む該組成物が、カテーテルを介して第1の期間投与される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
少なくとも1種類の補体因子のレベルを定期的に決定する工程をさらに含み、標準値または健常対象と比較して低下した該少なくとも1種類の補体因子のレベルの決定が、前記組成物による継続治療の必要性を示す、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、本発明1030の方法。
[本発明1036]
前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、本発明1035の方法。
[本発明1037]
MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、溶血性***症候群(HUS)を発症するリスクのある該対象において腎機能障害を発症する可能性を低下させるための方法。
[本発明1038]
HUSを発症するリスクのある前記対象が、下痢、血管内赤血球破壊のスミア証拠を伴う30%未満のヘマトクリットレベル、血小板減少、およびクレアチニンレベル上昇からなる群より選択される症状の少なくとも1つまたは複数を示す、本発明1037の方法。
[本発明1039]
抗生物質の使用が禁忌となる腸原性(enterogenic)大腸菌(E. coli)に前記対象が感染している、本発明1037の方法。
[本発明1040]
前記対象が赤痢菌属(shigella)またはサルモネラ属(salmonella)に感染している、本発明1037の方法。
[本発明1041]
前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物が、第1の期間中に抗生物質の非存在下で前記対象に投与される、本発明1039の方法。
[本発明1042]
前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物が、第1の期間中に抗生物質の存在下で前記対象に投与される、本発明1040の方法。
[本発明1043]
前記MASP-2阻害物質が、前記第1の期間中に静脈内カテーテル送達法または他のカテーテル送達法によって前記対象に投与される、本発明1037、1041、または1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物を第2の期間投与する工程をさらに含み、該組成物が該第2の期間中に皮下投与される、本発明1041、本発明1042、または本発明1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
少なくとも1種類の補体因子のレベルを定期的に決定する工程をさらに含み、標準値または健常対象と比較して低下した該少なくとも1種類の補体因子のレベルの決定が、前記組成物による継続治療の必要性を示す、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、本発明1037の方法。
[本発明1047]
前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、本発明1046の方法。
[本発明1048]
MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含み、該MASP-2阻害物質の投与が、静脈内カテーテル送達法または他のカテーテル送達法によって該対象に実施される、溶血性***症候群(HUS)に罹患している該対象を治療する方法。
[本発明1049]
プラスマフェレーシスで患者を治療する工程をさらに含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物がプラスマフェレーシスの非存在下で投与される、本発明1048の方法。
[本発明1051]
前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物を第2の期間投与する工程をさらに含み、該組成物が該第2の期間中に皮下投与される方法であって、該MASP-2阻害物質を含む該組成物が、カテーテルを介して第1の期間投与される、本発明1048の方法。
[本発明1052]
少なくとも1種類の補体因子のレベルを定期的に決定する工程をさらに含み、標準値または健常対象と比較して低下した該少なくとも1種類の補体因子のレベルの決定が、前記組成物による継続治療の必要性を示す、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、本発明1048の方法。
[本発明1054]
前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、本発明1053の方法。
[本発明1055]
MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含み、該MASP-2阻害物質の投与が、静脈内カテーテル送達法または他のカテーテル送達法によって該対象に実施される、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)に罹患しているかまたはTTPの診断と一致する症状を示す該対象を治療する方法。
[本発明1056]
前記対象が、中枢神経系合併症、血小板減少、重篤な心臓合併症、重篤な肺合併症、胃腸管梗塞、および壊疽からなる群より選択される少なくとも1つまたは複数の症状を示す、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記対象に免疫抑制剤を投与する工程をさらに含む方法であって、かつ、該対象が、ADAMTS13の阻害体の存在についての試験で陽性と判定される、本発明1055の方法。
[本発明1058]
前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物が、プラスマフェレーシスの非存在下で第1の期間投与される、本発明1055の方法。
[本発明1059]
ADAMTS-13を投与する工程をさらに含む方法であって、かつ、前記対象が、ADAMTS-13の阻害体の存在についての試験で陽性と判定される、本発明1055の方法。
[本発明1060]
プラスマフェレーシスで患者を治療する工程をさらに含む、本発明1055の方法。
[本発明1061]
前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物がプラスマフェレーシスの存在下で投与される、本発明1055の方法。
[本発明1062]
前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物を第2の期間投与する工程をさらに含み、該組成物が該第2の期間中に皮下投与される方法であって、該MASP-2阻害物質を含む該組成物が、カテーテルを介して第1の期間投与される、本発明1055の方法。
[本発明1063]
少なくとも1種類の補体因子のレベルを定期的に決定する工程をさらに含み、標準値または健常対象と比較して低下した該少なくとも1種類の補体因子のレベルの決定が前記組成物による継続治療の必要性を示す、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、本発明1055の方法。
[本発明1065]
前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、本発明1054の方法。
[本発明1066]
MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、難治性血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)に罹患している該対象を治療する方法。
[本発明1067]
前記組成物が皮下投与される、本発明1066の方法。
[本発明1068]
少なくとも1種類の補体因子のレベルを定期的に決定する工程をさらに含み、標準値または健常対象と比較して低下した該少なくとも1種類の補体因子のレベルの決定が前記組成物による継続治療の必要性を示す、本発明1066の方法。
[本発明1069]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、本発明1066の方法。
[本発明1070]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、本発明1069の方法。
[本発明1071]
MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、クリオグロブリン血症に罹患している該対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法。
[本発明1072]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、本発明1071の方法。
[本発明1073]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片である、本発明1072の方法。
[本発明1074]
MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、寒冷凝集素症に罹患している該対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法。
[本発明1075]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、本発明1074の方法。
[本発明1076]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片である、本発明1075の方法。
[本発明1077]
MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、緑内障に罹患している該対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法。
[本発明1078]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、本発明1077の方法。
[本発明1079]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片である、本発明1078の方法。
[本発明1080]
MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、急性放射線症候群を発症するリスクのあるまたは急性放射線症候群に罹患している該対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法。
[本発明1081]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、本発明1080の方法。
[本発明1082]
前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片である、本発明1081の方法。
[本発明1083]
放射線曝露前に、前記MASP-2阻害物質が予防的に前記対象に投与される、本発明1081の方法。
[本発明1084]
放射線曝露後24時間〜48時間以内に、前記MASP-2阻害物質が前記対象に投与される、本発明1081の方法。
[本発明1085]
放射線曝露後に、前記MASP-2阻害物質が前記対象に投与される、本発明1081の方法。
SEQ ID NO:1 ヒトMAp19 cDNA
SEQ ID NO:2 ヒトMAp19タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:3 ヒトMAp19タンパク質(成熟)
SEQ ID NO:4 ヒトMASP-2 cDNA
SEQ ID NO:5 ヒトMASP-2タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:6 ヒトMASP-2タンパク質(成熟)
SEQ ID NO:7 ヒトMASP-2 gDNA(エキソン1-6)
SEQ ID NO:8 CUBI配列(aa1〜121)
SEQ ID NO:9 CUBEGF配列(aa1〜166)
SEQ ID NO:10 CUBEGFCUBII(aa1〜293)
SEQ ID NO:11 EGF領域(aa122〜166)
SEQ ID NO:12 セリンプロテアーゼドメイン(aa429〜671)
SEQ ID NO:13 セリンプロテアーゼドメイン不活性(Ser618からAlaへの変異があるaa610〜625)
SEQ ID NO:14
(CUBIペプチド)
SEQ ID NO:15
(CUBIペプチド)
SEQ ID NO:16 TFRSDYSN(MBL結合領域コア)
SEQ ID NO:17
(MBL結合領域)
SEQ ID NO:18 IDECQVAPG(EGFペプチド)
SEQ ID NO:19
(セリンプロテアーゼ結合コア) 詳細な説明
SEQ ID NO:20 MBL完全長cDNA
SEQ ID NO:21 MBL完全長タンパク質
SEQ ID NO:22 OGK-X-GP(コンセンサス結合)
SEQ ID NO:23 OGKLG
SEQ ID NO:24
SEQ ID NO:25
SEQ ID NO:26
SEQ ID NO:27
(ヒトh-フィコリン)
SEQ ID NO:28
(ヒトフィコリンp35)
SEQ ID NO:29
(C4切断部位)
SEQ ID NO:30 CUBI-EGFドメインのcDNA(SEQ ID NO:4のヌクレオチド22〜680)
SEQ ID NO:31
MASP-2翻訳開始点を含むSEQ ID NO:4のヌクレオチド12〜45(センス)
SEQ ID NO:32
MASP-2 MBL結合部位を含む領域をコードするSEQ ID NO:4のヌクレオチド361〜396(センス)
SEQ ID NO:33
CUBIIドメインを含む領域をコードするSEQ ID NO:4のヌクレオチド610〜642
SEQ ID NO:34
(CUB用の5'PCR)
SEQ ID NO:35
(CUB用の3'PCR)
SEQ ID NO:36
(CUBIEGF用の3'PCR)
SEQ ID NO:37
(CUBIEGFCUBII用の3'PCR)
SEQ ID NO:38-47は、ヒト化抗体用のクローニングプライマーである。
SEQ ID NO:48は、9aaペプチド結合である。
SEQ ID NO:49は、MASP-2ミニ遺伝子インサートである。
SEQ ID NO:50は、マウスMASP-2 cDNAである。
SEQ ID NO:51は、マウスMASP-2タンパク質(w/リーダー)である。
SEQ ID NO:52は、成熟マウスMASP-2タンパク質である。
SEQ ID NO:53は、ラットMASP-2 cDNAである。
SEQ ID NO:54は、ラットMASP-2タンパク質(w/リーダー)である。
SEQ ID NO:55は、成熟ラットMASP-2タンパク質である。
SEQ ID NO:56-59は、ヒトMASP-2Aを生成するために用いられるヒトMASP-2の部位特異的変異誘発用オリゴヌクレオチドである。
SEQ ID NO:60-63は、マウスMASP-2Aを生成するために用いられるマウスMASP-2の部位特異的変異誘発用オリゴヌクレオチドである。
SEQ ID NO:64-65は、ラットMASP-2Aを生成するために用いられるラットMASP-2の部位特異的変異誘発用オリゴヌクレオチドである。
本発明は、古典経路を完全な状態のままにしておきながら、レクチンによって媒介されるMASP-2経路を阻害することが可能だという本発明者らによる驚くべき発見に基づく。本発明はまた、免疫系の古典的(C1q依存性)経路成分を完全な状態のままにしておきながら、レクチンによって媒介される補体経路活性化に関連した細胞障害を阻害するための治療標的としてのMASP-2の使用について説明する。
本明細書において特に定義がない限り、本明細書において用いられる全ての用語は、本発明の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本発明を説明するために明細書および特許請求の範囲において用いられる用語をわかりやすくするために、以下の定義が提供される。
レクチン(MBL、M-フィコリン、H-フィコリン、L-フィコリン、およびCL-11)は先天的補体系を誘発する特異的認識分子であり、この系は、レクチン開始経路、およびレクチンによって開始される終末補体エフェクター分子活性化を増幅する関連する終末経路増幅ループを含む。C1qは後天的補体系を誘発する特異的認識分子であり、この系は、古典的開始経路、およびC1qによって開始される終末補体エフェクター分子活性化を増幅する関連する終末経路増幅ループを含む。本発明者らは、これらの2つの主要な補体活性化系を、それぞれ、レクチン依存性補体系およびC1q依存性補体系と呼ぶ。
腎臓状態
補体系活性化は、メサンギウム増殖性糸球体腎炎(IgA腎症、ベルジェ病)(Endo, M., et al., Clin. Nephrology 55:185-191, 2001)、膜性糸球体腎炎(Kerjashki, D., Arch B Cell Pathol. 58:253-71, 1990; Brenchley, P.E., et al., Kidney Int., 41:933-7, 1992; Salant, D.J., et al., Kidney Int. 55:976-84, 1989)、膜性増殖性糸球体腎炎(メサンギウム毛細管性糸球体腎炎)(Bartlow, B.G.. et al., Kidney Int. 15:294-300, 1979; Meri, S. et al., J. Exp. Med. 175:939-50, 1992)、急性感染後糸球体腎炎(連鎖球菌感染後糸球体腎炎)、クリオグロブリン血症糸球体腎炎(Ohsawa, I., et al., Clin Immunol, 101:59-66, 2001)、ループス腎炎(Gatenby, P.A., Autoimmunity 11:61-6, 1991)、およびヘーノホ・シェーンライン紫斑病腎炎(Endo, M., et al., Am. J. Kidney Dis. 35:401-407, 2000)を含む多種多様な腎臓病の発生に結び付けられてきた。数十年間にわたって腎臓病における補体の関与が認められてきたが、腎臓病の発生期、発症期、および回復期におけるその正確な役割については、いまだに重大な議論となっている。正常条件下での補体の寄与は宿主にとって有益であるが、補体の不適切な活性化および沈着が組織損傷の一因となる場合がある。
敗血症は、侵入微生物に対する患者の抑えきれないほど激しい反応によって引き起こされる。補体系の主な機能は、侵入細菌および他の病原体に対する炎症反応を組織化することである。この生理学的役割と一致して、非常に多くの研究において、補体活性化は敗血症の発生において主要な役割を有することが示されている(Bone, R.C., Annals. Internal, Med. 115:457-469, 1991)。敗血症の臨床発現の定義は絶えず発展している。敗血症は、通常、感染に対する全身宿主反応と定義される。しかしながら、何度も、敗血症症状のある患者において感染の臨床証拠(例えば、陽性の細菌血液培養)は発見されていない。この矛盾は、1992年にConsensus Conferenceにおいて初めて考慮に入れられた。この時、「全身炎症反応症候群」(SIRS)という用語が確立され、細菌感染の定義可能な存在が必要とされなくなった(Bone, R.C., et al., Crit. Care Med. 20:724-726, 1992)。現在、敗血症およびSIRSには炎症反応の調節不能が伴うという一般的な合意がある。これを簡単に見直すために、本発明者らは、敗血症の臨床上の定義を、重篤な敗血症、敗血症ショック、およびSIRSも含むと考える。
PNHの概略
発作性夜間血色素尿症(PNH)は、時としてマルキアファーヴァ・ミケーリ症候群とも呼ばれ、後天的な、潜在的に命にかかわる血液疾患である。PNHは自然発症することがあり、これは「一次PNH」と呼ばれる、または再生不良性貧血などの他の骨髄障害の状況では「二次PNH」と呼ばれる。症例の大半は一次PNHである。PNHは、補体誘導性の赤血球破壊(溶血)、少ない赤血球数(貧血)、血栓症、および骨髄機能不全を特徴とする。実験室におけるPNHの所見は、考えられる原因として自己反応性RBC結合抗体の非存在下で、血管内溶血性貧血:低ヘモグロビン、多量の乳酸デヒドロゲナーゼ、多数の網状赤血球数(破壊された細胞を交換するために未熟血球が骨髄によって放出される)、高ビリルビン(ヘモグロビンの破壊産物)と一致する変化を示す。
PNHにおける負の補体制御因子CD55およびCD59の不完全な発現の間の因果関係と、血管内溶血の阻止におけるエクリズマブの有効性の組み合わせから、PNHは、補体系によって引き起こされる状態であるとはっきりと定義される。このパラダイムは広く受け入れられているが、補体活性化を開始する事象、および関与する補体活性化経路がどういったものであるかは未解決のままである。CD55およびCD59は、全ての補体開始経路に共通する補体カスケード中の終末増幅段階を負に調節するので、補体活性化がレクチン経路によって開始されるか、古典経路によって開始されるか、第二経路の自発的代謝回転によって開始されるかに関係なく、これらの分子が欠損すると終末補体活性化が悪化する。従って、PNH患者では、RBC表面上でのC3b沈着につながる、全ての補体活性化事象が、その後の増幅ならびに病理学的溶血(血管内溶血および/または血管外溶血)を誘発し、溶血発作を突然引き起こすことができる。PNH患者における溶血発作を誘発する分子事象のはっきりとした機構理解はまだなされていない。溶血発作を起こしているPNH患者における補体開始事象はまったく明らになってないので、PNHにおける補体活性化は低レベルの第二経路アイドリング活性化により自然発生する可能性があり、その後に、CD55およびCD59の欠如による不適切な終末補体活性化制御によって増大するというのが主流となっている見解である。
本セクションは、インビトロPNHモデルにおける溶血に対するMASP-2阻害物質の阻害作用について述べる。この知見は、PNHの局面に罹患している対象を治療するためのMASP-2遮断物質(MASP-2に結合し、MASP-2の機能を遮断する抗体を含むが、これに限定されない)の有用性を支持し、エクリズマブなどのC5阻害体を用いた療法を受けているPNH患者におけるC3断片を介した血管外溶血の作用を寛解させるためのMASP-2阻害体の使用も支持する。
本明細書において示されたデータは、PNHにおけるRBCクリアランスおよび貧血の2つの発病機構:少なくとも部分的にMASP-2依存性補体活性化によって開始され、従って、MASP-2-阻害物質によって効果的に阻害されると予想される血管内溶血、およびMASP-2によって動かされるC3bオプソニン化によるものであり、従って、MASP-2-阻害物質によって効果的に阻止される血管外溶血を詳細に説明する。
実施例30〜32に記載のように、および図33〜37に示したように、MASP-2阻害は髄膜炎菌感染後の生存性を低下させない。それとは反対に、驚いたことに、MASP-2阻害は、これらの研究において生存(図33および図34)ならびに疾病スコア(図36)を有意に改善することが発見された。抗MASP2抗体の投与によって同じ結果が得られた(図37)。これにより、考えられる原因としてノックアウトマウス系における二次効果または代償効果が無くなった。MASP-2除去動物における、これらの好ましいアウトカムは血液からのナイセリア属(Neisseria)の迅速な排出に関連した(図35)。また、本明細書に記載のように、ナイセリア属をヒト血清とインキュベートするとナイセリア属が死滅した(図38)。さらに、MASP-2依存性レクチン経路補体活性化を遮断する、ヒトMASP-2に特異的な機能的モノクローナル抗体を添加すると、この死滅反応は増強したが、アイソタイプ対照モノクローナル抗体を添加しても増強しなかった。ナイセリア属によるレクチン依存性補体活性化の状況において、インビトロでのMASP-2によって増強される生物の溶解性破壊の遮断(図38)。ナイセリア属の溶解はナイーブ宿主における主な保護機構であるので、インビボでのMASP-2遮断はナイセリア属のクリアランスを増大させ、死滅を増強する。これらの結果は驚くべきことであり、命にかかわる、かつ致死的な髄膜炎菌感染に対する感受性を向上させることが示されているエクリズマブ治療より大きな利点をもたらす(Dmytrijuk A., et al., The Oncologist 13:993-1000(2008))。
概説
血栓性微小血管症(TMA)は小さな血管の中にある血餅を特徴とする病態である(Benz. K.; et al., Curr Opin Nephrol Hypertens 19(3):242-7(2010))。基礎をなす血管内皮に対するストレスまたは損傷が一次ドライバー(primary driver)であると考えられている。TMAの臨床および実験室での所見には、血小板減少、貧血、紫斑病、および腎不全が含まれる。古典的なTMAは溶血性***症候群(HUS)および血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)である。TMAの特徴的な基礎をなす病理学的特徴は、細動脈および細静脈における血小板活性化および微小血栓形成である。
非定型溶血性***症候群(aHUS)は、「血栓性微小血管症」と呼ばれる一群の状態の一部である。非定型HUS(aHUS)において、この疾患は不完全な補体調節に関連し、散発性または家族性であり得る。家族性aHUS症例は、補体因子H、I因子、B因子、メンブレンコファクターCD46、ならびに補体因子H関連タンパク質1(CFHR1)および補体因子H関連タンパク質3(CFHR3)を含む、補体活性化タンパク質または補体調節タンパク質をコードする遺伝子の変異に関連する(Zipfel, P.F., et al., PloS Genetics 3(3):e41(2007))。aHUSに関連する、この広範な遺伝子変異の統合的な特徴は、細胞表面または組織表面における補体活性化の増強の素因である。従って、本発明の一局面は、有効量のMASP-2阻害物質を投与することによって、H因子欠損に関連したaHUSに罹患している患者を治療することを含む。本発明の別の局面は、有効量のMASP-2阻害物質を投与することによって、I因子、B因子、メンブレンコファクターCD46、CFHR1、またはCFHR3の欠損に関連したHUSに罹患している患者を治療することを含む。
非定型HUSと同様に、定型HUSは、TMAの臨床および実験室での所見を全て示す。しかしながら、定型HUSは、多くの場合、小児疾患であり、通常、家族要素も、補体遺伝子変異との直接的な関連性もない。定型HUSの原因は、ある特定の腸病原体の感染と密接に結び付けられている。患者は、典型的には、急性腎不全、ヘモグロビン尿症、および血小板減少を呈し、典型的には、血性下痢のエピソードをたどる。この状態は、志賀赤痢菌(Shigella dissenteria)、サルモネラ属(Salmonella)、または志賀毒素様産生腸管出血性大腸菌株、例えば、大腸菌O157:H7の腸感染によって引き起こされる。これらの病原体は、汚染された食品または水供給から得られる。HUSは医学的緊急事態であり、死亡率は5〜10%である。生存者のかなりの部分が慢性腎臓疾患を発症し(Corrigan and Boineau, Pediatr Rev 22(11):365-9(2011))、腎臓移植を必要とする場合がある。
血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)は、凝固カスケードまたは補体系を活性化する自己免疫または遺伝性機能不全によって引き起こされる、命にかかわる血液凝固系障害である(George, JN, N Engl J Med; 354:1927-35(2006))。これは、体中の小さな血管の中にある非常に多くの微少な血塊、すなわち血栓症の原因となる。赤血球は、赤血球膜を傷つける、ずり応力に供され、これは血管内溶血を引き起こす。結果として生じる血流減少および内皮損傷は、脳、心臓、および腎臓を含む臓器損傷の原因となる。TTPは、臨床的に、血小板減少、微小血管障害性溶血性貧血、神経学的変化、腎不全、および発熱を特徴とする。血漿交換前の時代、急性エピソード中の死亡率は90%であった。血漿交換を用いても6ヶ月における生存は約80%である。
播種性血管内凝固(「DIC」)、例えば、著しい身体外傷に続発するDICにおける補体系の役割について証拠が得られてきた。
補体系活性化はまた悪性腫瘍の発生にも結び付けられ得る。最近、C5b-9補体複合体のネオ抗原、IgG、C3、C4、Sタンパク質/ビトロネクチン、フィブロネクチン、およびマクロファージが、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体ならびにストレプトアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ法を用いて、17の乳癌試料および6つの良性乳腺腫瘍試料において局在化された。それぞれのTNMステージの癌腫をもつ全ての組織試料が、腫瘍細胞膜上にC5b-9沈着、細胞残遺物上に薄い顆粒、および壊死領域内の拡散沈着を呈した(Niculescu, F., et al., Am. J. Pathol. 140:1039-1043, 1992)。
加齢黄斑変性(AMD)は数百万人の成人を苦しめる失明病であるが、AMDの発症につながる生化学的事象、細胞事象、および/または分子事象の続発症は十分に理解されていない。AMDは、黄斑の中および周囲、網膜の裏側、ならびに網膜色素上皮(RPE)と脈絡膜との間に位置するドルーゼンと呼ばれる細胞外沈着の形成と相関付けられてきた進行性の黄斑破壊をもたらす。最近の研究から、ドルーゼン関連構成要素の中で、炎症および免疫を介したプロセスに関連したタンパク質が優勢なことが明らかになっている。多数のこれらの分子をコードする転写物が、網膜、RPE、および脈絡膜細胞において検出されている。これらのデータから、強力な抗原提示細胞である樹状細胞がドルーゼン発症と密接に関連し、補体活性化が、ドルーゼン内で、およびRPE-脈絡膜境界面に沿って活発な重要な経路であることも証明されている(Hageman, G.S., et al., Prog. Retin. Eye Res. 20:705-732, 2001)。
一局面において、本発明は、MASP-2依存性補体活性化の副作用を阻害する方法を提供する。MASP-2阻害物質は、生きている対象においてMASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量で投与される。本発明のこの局面の実施において、代表的なMASP-2阻害物質には、MASP-2の生物学的活性を阻害し、それによって、MASP-2がレクチン補体経路を活性化しないようにする分子(例えば、低分子阻害体、抗MASP-2抗体、またはMASP-2と相互作用する、もしくはタンパク質間相互作用を妨害する遮断ペプチド)、ならびにMASP-2発現を減少させ、それによって、MASP-2がレクチン補体経路を活性化しないようにする分子(例えば、MASP-2アンチセンス核酸分子、MASP-2特異的RNAi分子、およびMASP-2リボザイム)が含まれる。MASP-2阻害物質は一次療法として単独で用いられてもよく、他の医学的処置の治療利益を向上させる補助療法として他の治療剤と併用されてもよい。
本発明のこの局面の一部の態様において、MASP-2阻害物質は、MASP-2依存性補体活性化系を阻害する抗MASP-2抗体を含む。本発明のこの局面において有用な抗MASP-2抗体は、任意の抗体産生哺乳動物に由来するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組換え抗体を含み、多重特異的、キメラ、ヒト化、抗イディオタイプ、および抗体断片でもよい。抗体断片には、本明細書においてさらに説明されるように、Fab、Fab'、F(ab) 2、F(ab') 2、Fv断片、scFv断片、および単鎖抗体が含まれる。
本発明のこの局面の一部の態様では、古典的補体経路の活性化から生じ得る炎症を低減するために、抗MASP-2抗体はエフェクター機能が低下している。IgG分子が古典的補体経路を誘発する能力は、この分子のFc部分の中にあることが示されている(Duncan, A.R.. et al., Nature 332:738-740 1988)。この分子のFc部分が酵素切断によって除去されているIgG分子には、このエフェクター機能がない(Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988を参照されたい)。従って、エフェクター機能を最小化する遺伝子操作Fc配列を有することによって、またはヒトIgG2もしくはIgG4アイソタイプにすることによって、この分子のFc部分を欠いた結果としてエフェクター機能が低下した抗体を作製することができる。
抗MASP-2抗体は、MASP-2ポリペプチド(例えば、完全長MASP-2)または抗原性MASP-2エピトープ含有ペプチド(例えば、MASP-2ポリペプチドの一部)を用いて作製することができる。免疫原性ペプチドは5アミノ酸残基と小さくてもよい。例えば、本発明の方法において有用な抗MASP-2抗体を誘導するために、SEQ ID NO:6の全アミノ酸配列を含むMASP-2ポリペプチドが用いられてもよい。タンパク質間相互作用に関与することが公知の特定のMASP-2ドメイン、例えば、CUBIおよびCUBIEGFドメイン、ならびにセリン-プロテアーゼ活性部位を含む領域が、実施例3に記載のように組換えポリペプチドとして発現され、抗原として用いられてもよい。さらに、MASP-2ポリペプチド(SEQ ID NO:6)の少なくとも6アミノ酸の部分を含むペプチドもまた、MASP-2抗体を誘導するのに有用である。MASP-2抗体を誘導するのに有用なMASP-2由来抗原のさらなる例を以下の表2に示した。抗体を産生させるのに用いられるMASP-2ペプチドおよびポリペプチドは、実施例5〜7においてさらに述べられるように、天然ポリペプチドまたは組換えペプチドもしくは合成ペプチドおよび触媒的に不活性な組換えポリペプチド、例えば、MASP-2Aとして単離されてもよい。本発明のこの局面の一部の態様において、抗MASP-2抗体は、実施例8および9に記載のように、ならびに以下でさらに述べられるようにトランスジェニックマウス系統を用いて得られる。
MASP-2に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて、動物をMASP-2ポリペプチドまたはその免疫原性部分で免疫することによって調製することができる。例えば、Green et al.,「Production of Polyclonal Antisera」, Immunochemical Protocols(Manson, ed.), 105頁を参照されたい。実施例6においてさらに述べられる。MASP-2ポリペプチドの免疫原性は、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウムまたはフロイントアジュバント(完全もしくは不完全)、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールを含むアジュバントを用いて高まることができる。ポリクローナル抗体は、典型的には、動物、例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、またはヒツジにおいて産生される。または、本発明において有用な抗MASP-2抗体はまた、ヒトに近い霊長類に由来してもよい。ヒヒにおいて診断および治療に有用な抗体を産生するための一般的な技法は、例えば、Goldenberg et al.,国際特許公報WO91/11465、およびLosman, M.J., et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990において見られ得る。次いで、免疫学的に活性な抗体を含有する血清が、当技術分野において周知の標準的な手順を用いて、このような免疫動物の血液から生成される。
一部の態様において、MASP-2阻害物質は抗MASP-2モノクローナル抗体である。抗MASP-2モノクローナル抗体は、1つのMASP-2エピトープに対して作られているので高度に特異的である。本明細書で使用する「モノクローナル」という修飾語は、抗体が実質的に均一な抗体集団から得られているという特徴を示し、特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈してはならない。モノクローナル抗体は、連続培養細胞株による抗体分子の作製を提供する任意の技法、例えば、Kohler, G., et al., Nature 256:495, 1975に記載のハイブリドーマ法を用いて得ることができる。または、モノクローナル抗体は、組換えDNA法(例えば、Cabillyに対する米国特許第4,816,567号を参照されたい)によって作られてもよい。モノクローナル抗体は、Clackson, T., et al., Nature 352:624-628, 1991、およびMarks, J.D., et al., J. Mol Biol. 222:581-597, 1991に記載の技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含む任意の免疫グロブリンクラスおよびその任意のサブクラスの抗体でよい。
本発明の方法において有用なモノクローナル抗体には、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるキメラ抗体、ならびにこのような抗体の断片が含まれる(Cabillyに対する米国特許第4,816,567号;およびMorrison, S.L., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984)。
抗MASP-2抗体は組換え法を用いて作ることもできる。例えば、ヒト抗体断片(VH、VL、Fv、Fd、Fab、またはF(ab') 2)を作製するようにヒト免疫グロブリン発現ライブラリー(例えば、Stratagene, Corp., La Jolla, CAから入手可能)を用いてヒト抗体を作ることができる。次いで、キメラ抗体の作製法に類似した技法を用いて、これらの断片を用いてヒト抗体全体を構築する。
望ましい阻害活性を有する抗MASP-2抗体が特定されたら、これらの抗体を用いて、当技術分野において周知の技法を用いてMASP-2の一部に似ている抗イディオタイプ抗体を生成することができる。例えば、Greenspan, N.S., et al., FASEB J. 7:437, 1993を参照されたい。例えば、MASP-2に結合し、補体活性化に必要とされるMASP-2タンパク質相互作用を完全に阻害する抗体を用いて、MASP-2タンパク質上のMBL結合部位に似ている、従って、MASP-2の結合リガンド、例えば、MBLに結合し、これを中和する抗イディオタイプを生成することができる。
本発明の方法において有用なMASP-2阻害物質は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、抗体断片から形成された、Fab、Fab'、F(ab) 2、F(ab') 2、およびFv断片、scFv断片、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ならびに多重特異性抗体を含む周知の断片も包含する。
または、重鎖Fv領域および軽鎖Fv領域がつながっている、MASP-2に特異的なペプチド単鎖結合分子を作り出すことができる。Fv断片は、単鎖抗原結合タンパク質(scFv)を形成するようにペプチドリンカーでつながれてもよい。これらの単鎖抗原結合タンパク質は、オリゴヌクレオチドでつながれた、VHドメインをコードするDNAおよびVLドメインをコードするDNAを含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、その後に、大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する1本のポリペプチド 鎖を合成する。scFvを作製するための方法は、例えば、Whitlow, et al.,「Methods:A Companion to Methods in Enzymology」2:97, 1991; Bird, et al., Science 242:423, 1988; Ladnerに対する米国特許第4,946,778号; Pack, P., et al., Bio/Technology 11:1271, 1993に記載されている。
本発明のこの局面の一部の態様において、MASP-2阻害物質は、MASP-2依存性補体活性化系を阻害する、単離された天然ペプチド阻害体および合成ペプチド阻害体を含む単離されたMASP-2ペプチド阻害体を含む。本明細書で使用する「単離されたMASP-2ペプチド阻害体」という用語は、レクチン経路の別の認識分子(例えば、MBL、H-フィコリン、M-フィコリン、もしくはL-フィコリン)に結合する、これらとの結合においてMASP-2と競合する、および/またはMASP-2と直接相互作用してMASP-2依存性補体活性化を阻害することによって、MASP-2依存性補体活性化を阻害し、実質的に純粋であり、天然で見られ得る他の物質を現実的な、かつ目的の用途に適した程度まで本質的に含まない、ペプチドを指す。
本発明のこの局面の方法において有用なMASP-2阻害ペプチドは、MASP-2機能に重要な標的領域を模倣するアミノ酸配列によって例示される。本発明の方法の実施において有用な阻害ペプチドはサイズが約5アミノ酸〜約300アミノ酸に及ぶ。表3は、本発明のこの局面の実施において有用であり得る例示的な阻害ペプチドのリストを提供する。例えば、レクチン特異的C4切断アッセイ法(実施例2に記載)およびC3b沈着アッセイ法(実施例2に記載)を含む、いくつかのアッセイ法の1つにおいて、候補MASP-2阻害ペプチドがMASP-2阻害物質として機能する能力を試験することができる。
の中にあることを特定した(Wallis, R. et al., J. Biol Chem. 279:14065, 2004)。このMASP-2結合部位領域はまたヒトH-フィコリンおよびヒトL-フィコリンにおいても高度に保存されている。アミノ酸配列「OGK-X-GP」(SEQ ID NO:22)を含む、3種類全てのレクチンタンパク質において存在するコンセンサス結合部位が述べられている。式中、文字「O」はヒドロキシ-プロリンを表し、文字「X」は疎水残基である(Wallis et al., 2004, 前記)。従って、一部の態様において、本発明のこの局面において有用なMASP-2阻害ペプチドは長さが少なくとも6個のアミノ酸であり、SEQ ID NO:22を含む。アミノ酸配列
を含む、MBLに由来するペプチドは、インビトロでMASP-2に結合することが示されている(Wallis, et al., 2004, 前記)。MASP-2との結合を増強するために、天然のMBLタンパク質において見られるような三重らせんの形成を増強する、各末端に2個のGPOトリプレットが隣接するペプチドを合成することができる
(Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004においてさらに説明される)。
を含む、ヒトH-フィコリンに由来してもよい。L-フィコリンのコンセンサスMASP-2結合領域に由来する配列
を含む、ヒトL-フィコリン由来ペプチドも含まれる。
などのC4切断部位に由来してもよい(Glover, G.I., et al., Mol. Immunol. 25:1261(1988))。
MASP-2の重要な結合領域の分子構造を模倣し、MASP-2の補体活性を阻害するペプチドを生成およびスクリーニングするために、分子モデリングおよび合理的分子設計も使用することができる。以前に述べられたように、モデリングに用いられる分子構造には、抗MASP-2モノクローナル抗体のCDR領域、ならびに二量体化に必要な領域、MBLとの結合に関与する領域、およびセリンプロテアーゼ活性部位を含む、MASP-2機能に重要なことが公知の標的領域が含まれる。ある特定の標的に結合するペプチドを特定する方法は当技術分野において周知である。例えば、ある特定の分子に結合する巨大分子構造、例えば、ペプチドの新規構築のために分子インプリンティングを使用することができる。例えば、Shea, K.J.,「Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers:The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties」, TRIP 2(5) 1994を参照されたい。
MASP-2阻害ペプチドは、当技術分野において周知の技法、例えば、J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963においてMerrifieldによって最初に述べられた固相合成技法を用いて調製することができる。自動合成は、例えば、Applied Biosystems 431 A Peptide Synthesizer(Foster City, Calif.)を用いて、製造業者により提供される説明書に従って実現することができる。他の技法は、例えば、Bodanszky, M., et al., Peptide Synthesis, 第二版, John Wiley & Sons, 1976ならびに当業者に公知の他の参照文献において見られ得る。
一部の態様において、MASP-2阻害物質は、低分子量を有する天然物質および合成物質を含む低分子阻害体、例えば、ペプチド、ペプチドミメティック、および非ペプチド阻害体(オリゴヌクレオチドおよび有機化合物を含む)である。MASP-2低分子阻害体は、抗MASP-2抗体の可変領域の分子構造に基づいて作製することができる。
他の適切なMASP-2阻害物質はMASP-2可溶性受容体を含むと考えられる。MASP-2可溶性受容体は当業者に公知の技法を用いて作製することができる。
本発明のこの局面の別の態様において、MASP-2阻害物質は、MASP-2依存性補体活性化を阻害することができるMASP-2発現阻害体である。本発明のこの局面の実施において、代表的なMASP-2発現阻害体には、MASP-2アンチセンス核酸分子(例えば、アンチセンスmRNA、アンチセンスDNA、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド)、MASP-2リボザイム、およびMASP-2 RNAi分子が含まれる。
投薬
別の局面において、本発明は、治療的有効量のMASP-2阻害物質および薬学的に許容される担体を含む組成物を対象に投与することを含む、本明細書において開示された疾患または状態に罹患している対象におけるMASP-2依存性補体活性化の副作用を阻害するための組成物を提供する。MASP-2依存性補体活性化に関連した状態を治療または寛解させるために、MASP-2阻害物質を、治療上有効な用量で、それを必要とする対象に投与することができる。治療上有効な用量は、疾患または状態に関連した症状を寛解させるのに十分なMASP-2阻害物質の量を指す。
MASP-2阻害物質を含む組成物および方法は、任意で、MASP-2阻害物質の活性を増大し得る、または関連する治療機能を相加的もしくは相乗的に提供する1種類または複数種のさらなる治療剤を含んでもよい。例えば、ADAM-TS13の阻害体が陽性である、TTPに罹患している対象を治療する状況において、1種類または複数種のMASP-2阻害物質は1種類または複数種の免疫抑制剤と組み合わせて(同時投与を含めて)投与されてもよい。適切な免疫抑制剤には、コルチコステロイド、リツキサン、シクロスポリンなどが含まれる。HUSもしくはaHUSに罹患しているかまたはHUSもしくはaHUSを発症するリスクのある対象を治療する状況において、1種類または複数種のMASP-2阻害物質は適切な抗生物質と組み合わせて(同時投与を含めて)投与されてもよい。aHUSに罹患しているかまたはaHUSを発症するリスクのある対象を治療する状況において、1種類または複数種のMASP-2阻害物質は、他の補体阻害物質、例えば、エクリズマブ(Soliris)、TT-30、B因子に対する抗体、または終末補体成分もしくは第二経路増幅を阻害する他の作用物質と組み合わせて(同時投与を含めて)投与されてもよい。
一般的に、他の任意の選択された治療剤と組み合わされた本発明のMASP-2阻害物質組成物は、適宜、薬学的に許容される担体中に含まれる。担体は、無毒で、生体適合性があり、MASP-2阻害物質(およびMASP-2阻害物質と組み合わされた他の任意の治療剤)の生物学的活性に悪影響を及ぼさないように選択される。ペプチド用の例示的な薬学的に許容される担体は、Yamadaに対する米国特許第5,211,657号に記載されている。本発明において有用な抗MASP-2抗体および阻害ペプチドは、経口投与、非経口投与、または外科的投与を可能にする、固体、半固体、ゲル、液体、または気体の形をした調製物、例えば、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶液、デポジトリ(depository)、吸入剤、および注射剤に処方されてもよい。本発明はまた、医療装置などをコーティングすることによる組成物の局所投与も意図する。
抗MASP-2抗体および阻害ペプチドに関してより具体的には、例示的な製剤を、水、油、食塩水、グリセロール、またはエタノールなどの滅菌液体でもよい薬学的担体と共に、生理学的に許容される希釈剤に溶解した化合物の注射投与量の溶液または懸濁液として非経口投与することができる。さらに、抗MASP-2抗体および阻害ペプチドを含む組成物中には、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、pH緩衝物質などが存在してもよい。薬学的組成物のさらなる成分には、石油(例えば、動物由来、野菜由来、または合成由来の石油)、例えば、ダイズ油および鉱油が含まれる。一般的に、グリコール、例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが注射液に好ましい液体担体である。
本発明の方法において有用な発現阻害体に関してより具体的には、前記の発現阻害体および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物が提供される。前記組成物はコロイド分散系をさらに含んでもよい。
MASP-2阻害物質を含む薬学的組成物は、局所投与方法または全身投与方法が、治療されている状態に最も適しているかどうかに応じて多くのやり方で投与することができる。さらに、体外再灌流法に関して本明細書において前述したように、MASP-2阻害物質は、本発明の組成物の導入を介して再循環血液または血漿に投与することができる。さらに、本発明の組成物を移植可能な医療装置の表面に、または移植可能な医療装置の中にコーティングまたは組み込むことによって、本発明の組成物を送達することができる。
本明細書で使用する「全身送達」および「全身投与」という用語は、筋肉内(IM)投与経路、皮下投与経路、静脈内(IV)投与経路、動脈内投与経路、吸入投与経路、舌下投与経路、頬投与経路、局部投与経路、経皮投与経路、鼻投与経路、直腸投与経路、腟投与経路、および送達作用物質を1つまたは複数の目的の治療作用部位に効果的に分散させる他の投与経路を含む、経口経路および非経口経路を含むが、これに限定されないことが意図される。本組成物の好ましい全身送達経路には、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、および吸入経路が含まれる。本発明の特定の組成物において用いられる選択された作用物質の正確な全身投与経路は、一つには、ある特定の投与経路に関連した代謝変換経路に対する作用物質感受性を説明するように決定されることが理解されると考えられる。例えば、ペプチド物質は、最も適切には、経口以外の経路によって投与することができる。
本明細書で使用する「局所」という用語は、目的の限局作用の部位の中に、または目的の限局作用の部位の周囲に薬物を適用することを包含し、例えば、皮膚または他の患部組織への局部送達、眼送達、くも膜下腔内(IT)、脳室内(ICV)、関節内、洞内、頭蓋内、もしくは小胞内の投与、留置、または灌注を含んでもよい。局所投与は、低用量の投与が全身副作用を回避するために、ならびに局所送達部位に活性物質を送達および濃縮するタイミングをより正確に制御するために好ましい場合がある。局所投与は、代謝、血流などの患者間のばらつきに関係なく標的部位において既知濃度を供給する。改善された投与量制御は直接的な送達方法によっても提供される。
MASP-2阻害物質、例えば、抗体および阻害ペプチドは、移植可能なまたは取り付け可能な医療装置の表面上(表面の中)に固定化されてもよい。改変された表面は典型的には動物身体への移植後に生組織と接触する。「移植可能なまたは取り付け可能な医療装置」とは、装置(例えば、ステントおよび移植可能な薬物送達装置)の通常の手術中に動物身体の組織に移植される、または動物身体の組織に取り付けられる任意の装置が意図される。このような移植可能なまたは取り付け可能な医療装置は、例えば、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、Sepharose、寒天、デンプン、ナイロン、ステンレス鋼、チタン、ならびに生分解性および/または生体適合性ポリマーから作ることができる。タンパク質と装置との連結は、連結されたタンパク質の生物学的活性を破壊しない任意の技法によって、例えば、タンパク質のN末端残基-C末端残基の一方または両方を装置に取り付けることによって実現することができる。タンパク質の1つまたは複数の内部部位において取り付けが行われてもよい。複数の取り付け(タンパク質の内部および末端)も使用することができる。タンパク質固定化のために官能基(例えば、カルボキシル、アミド、アミノ、エーテル、ヒドロキシル、シアノ、ニトリド、スルファナミド(sulfanamido)、アセチリニック(acetylinic)、エポキシド、シラニック(silanic)、アンヒドリック(anhydric)、スクシニミック(succinimic)、アジド)を含めるように、移植可能なまたは取り付け可能な医療装置の表面を改変することができる。カップリング化学には、MASP-2抗体または阻害ペプチド上において利用可能な官能基とのエステル、エーテル、アミド、アジドおよびスルファナミド誘導体、シアナート(cyanate)、ならびに他の連結の形成が含まれるが、これに限定されない。MASP-2抗体または阻害性断片はまた、アフィニティタグ配列を、タンパク質、例えば、GST(D.B. Smith and K.S. Johnson, Gene 67:31, 1988)、ポリヒスチジン(E. Hochuli et al., J. Chromatog. 411:77, 1987)、またはビオチンに付加することによって非共有結合によって取り付けることもできる。このようなアフィニティタグは、タンパク質と装置とを可逆的に取り付けるために用いられてもよい。
予防用途では、薬学的組成物は、MASP-2依存性補体活性化に関連した状態にかかりやすいか、またはそうでなければMASP-2依存性補体活性化に関連した状態のリスクのある対象に、状態の症状を発症するリスクを排除または低減するのに十分な量で投与される。治療用途では、薬学的組成物は、MASP-2依存性補体活性化に関連した状態に罹患していると疑われるか、またはMASP-2依存性補体活性化に関連した状態に既に罹患している対象に、状態の症状を軽減する、または少なくとも部分的に低減するのに十分な治療的有効量で投与される。予防レジメンおよび治療レジメンの両方において、MASP-2阻害物質を含む組成物は、対象において十分な治療アウトカムが得られるまで、いくつかの投与量に分けて投与されてもよい。本発明のMASP-2阻害性組成物の適用は、急性状態、例えば、再灌流傷害もしくは他の外傷の治療の場合は、組成物の単回投与によって、または限定された一連の投与によって行われてもよい。または、組成物は、慢性状態、例えば、関節炎または乾癬の治療の場合は、長期間にわたって定期的な間隔で投与されてもよい。
以下の実施例は、本発明の実施について意図された最良の態様(best mode)の単なる例示であり、本発明を限定すると解釈してはならない。本明細書中の全ての文献引用が明確に参照により組み入れられる。
本実施例は、MASP-2が欠損しているが(MASP-2-/-)、MAp19は十分にある(MAp19+/+)マウス系統の生成について述べる。
図3に示したように、セリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを含む、マウスMASP-2のC末端をコードする3つのエキソンを破壊するために、ターゲティングベクターpKO-NTKV1901を設計した。pKO-NTKV1901を用いて、マウスES細胞株E14.1a(SV129Ola)をトランスフェクトした。ネオマイシン耐性およびチミジンキナーゼ感受性のクローンを選択した。600個のESクローンをスクリーニングした。このうち4個の異なるクローンが特定され、図3に示したように、サザンブロットによって、予想された選択的標的化および組換え事象を含むことが立証された。胚移植によって、これらの4個の陽性クローンからキメラを生成した。次いで、キメラを遺伝的バックグラウンドC57/BL6において戻し交配して、トランスジェニック雄を作り出した。トランスジェニック雄を雌と交配させてF1を得た。子孫の50%は、破壊されたMASP-2遺伝子についてヘテロ接合性を示した。ヘテロマウスを交雑させて、ホモMASP-2欠損子孫、ヘテロマウス、および野生型マウスをそれぞれ1:2:1の比で得た。
結果として生じたホモMASP-2-/-欠損マウスは生存可能であり、生殖能力があることが見出され、正しい標的化事象を確認するためにサザンブロットによって、MASP-2 mRNAの非存在を確認するためにノザンロットによって、MASP-2タンパク質の非存在を確認するためにウエスタンブロットによって、MASP-2欠損であることが立証された(データ示さず)。LightCyeler装置による時間分解型RT-PCRを用いて、MAp19 mRNAの存在およびMASP-2 mRNAの非存在がさらに確認された。MASP-2-/-マウスは、予想通り、MAp19、MASP-1、およびMASP-3のmRNAおよびタンパク質を発現し続ける(データ示さず)。MASP-2-/-マウスにおけるプロペルジン、B因子、D因子、C4、C2、およびC3のmRNAの存在および量をLightCycler分析によって評価し、野生型同腹仔対照のものと同一であることが見出された(データ示さず)。ホモMASP-2-/-マウスに由来する血漿は、実施例2にさらに記載のように、レクチン経路を介した補体活性化が完全に欠損している。
MASP-2-/-マウスをC57BL6純系と9世代にわたって戻し交配した後に、MASP-2-/-系統を実験動物モデルとして使用した。
図4に示したように、最初の3つのエキソン(エキソン1〜エキソン3)を含むヒトMASP2遺伝子のプロモーター領域の後に、次の8つのエキソンからなるコード配列に相当するcDNA配列を含み、それによって、その内因性プロモーターによって駆動される完全長MASP-2タンパク質をコードする「ミニhMASP-2」と呼ばれるヒトMASP-2をコードするミニ遺伝子(SEQ ID NO:49)を構築した。欠損マウスMASP2遺伝子を、遺伝子導入により発現されるヒトMASP-2で置換するために、ミニhMASP-2構築物をMASP-2-/-受精卵に注入した。
本実施例は、レクチン経路を介した補体活性化にはMASP-2が必要であることを証明する。
レクチン経路特異的C4切断アッセイ法:
C4切断アッセイ法は、Petersen, S.V., et al., J. Immunol Methods 257:107(2001)によって述べられており、L-フィコリンに結合する黄色ブドウ球菌由来リポテイコ酸(LTA)に起因するレクチン経路活性化を測定する。下記のようにプレートをLPSおよびマンナンまたはザイモサンでコーティングした後に、MASP-2-/-マウスに由来する血清を添加することによって、Petersen et al., (2001)に記載のアッセイ法がMBLを介したレクチン経路活性化を測定するように適合化された。このアッセイ法を、古典経路によるC4切断の可能性を取り除くようにも変更した。これは、レクチン経路認識成分とそのリガンドとの高親和性結合を可能にするが、内因性C4の活性化を阻止し、それによって、C1複合体を解離することによって古典経路の関与を排除する、1M NaClを含有する試料希釈緩衝液を使用することによって達成された。簡単に述べると、変更されたアッセイ法では、血清試料(高塩(1M NaCl)緩衝液で希釈した)をリガンドコーティングプレートに添加した後に、生理学的濃度の塩を含む緩衝液に溶解した一定量の精製C4を添加した。MASP-2を含有する結合した認識複合体はC4を切断し、その結果、C4bが沈着する。
(1)Nunc Maxisorbマイクロタイタープレート(Maxisorb, Nunc, カタログ番号442404, Fisher Scientific)を、コーティング緩衝液(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH9.6)で希釈した1μg/mlマンナン(M7504 Sigma)または他の任意のリガンド(例えば、以下の列挙したリガンド)でコーティングした。
a.マンナン(100μlコーティング緩衝液中に1μg/ウェルのマンナン(M7504 Sigma));
b.ザイモサン(100μlコーティング緩衝液中に1μg/ウェルのザイモサン(Sigma));
c.LTA(100μlコーティング緩衝液中に1μg/ウェルまたは20μlメタノール中に2μg/ウェル);
d.コーティング緩衝液中に1μgのH-フィコリン特異的Mab 4H5;
e.エロコッカス・ビリダンス(Aerococcus viridans)に由来するPSA(100μlコーティング緩衝液中に2μg/ウェル);
f.コーティング緩衝液中に100μl/ウェルのホルマリン固定黄色ブドウ球菌DSM20233(OD550=0.5)。
図5A〜Bは、MASP-2+/+(十字)、MASP-2+/-(黒丸)、およびMASP-2-/-(黒三角)からの血清希釈液中でのマンナン(図5A)およびザイモサン(図5B)におけるC4b沈着の量を示す。図5Cは、野生型血清に対して基準化されたC4b沈着量の測定に基づく、野生型マウス(n=5)と比較した、MASP-2-/+マウス(n=5)およびMASP-2-/-マウス(n=4)からの、ザイモサン(白色の棒)またはマンナン(影付きの棒)でコーティングされたプレート上での相対的C4コンバターゼ活性を示す。エラーバーは標準偏差を示す。図5A〜Cに示したように、MASP-2-/-マウスに由来する血漿は、マンナンコーティングプレート上およびザイモサンコーティングプレート上でのレクチン経路を介した補体活性化が完全に欠損している。これらの結果から、MASP-2はレクチン経路のエフェクター成分であることがはっきりと証明される。
MASP-2の非存在がMASP-2-/-マウスにおけるレクチン経路依存性C4活性化消失の直接の原因であることを証明するために、血清試料への組換えMASP-2タンパク質の添加の効果を前記のC4切断アッセイ法において調べた。機能的に活性なマウスMASP-2組換えタンパク質および触媒不活性マウスMASP-2A(セリンプロテアーゼドメイン中の活性部位セリン残基がアラニン残基で置換された)組換えタンパク質を以下の実施例3に記載のように産生および精製した。4匹のMASP-2-/-マウスからプールされた血清を、漸増タンパク質濃度の組換えマウスMASP-2または不活性組換えマウスMASP-2Aとプレインキュベートし、C4コンバターゼ活性を前記のようにアッセイした。
図6に示したように、機能的に活性なマウス組換えMASP-2タンパク質(白三角として示した)をMASP-2-/-マウスから得られた血清に添加すると、レクチン経路依存性C4活性化がタンパク質濃度依存的に回復したのに対して、触媒不活性マウスMASP-2Aタンパク質(星として示した)はC4活性化を回復しなかった。図6に示した結果は、プールされた野生型マウス血清を用いて観察されたC4活性化(点線として示した)に対して基準化されている。
本実施例は、組換え完全長ヒトMASP-2、ラットMASP-2、およびマウスMASP-2、MASP-2由来ポリペプチド、ならびに触媒不活化変異型MASP-2の組換え発現およびタンパク質産生について述べる。
ヒトMASP-2の完全長cDNA配列(SEQ ID NO:4)を、CMVエンハンサー/プロモーター領域の制御下で真核生物発現を駆動する哺乳動物発現ベクターpCI-Neo(Promega)にもサブクローニングした(Kaufman R.J. et al.,Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Emymology, 185:537-66(1991)に記載)。完全長マウスcDNA(SEQ ID NO:50)およびラットMASP-2 cDNA(SEQ ID NO:53)をそれぞれpED発現ベクターにサブクローニングした。次いで、Maniatis et al., 1989に記載の標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション手順を用いて、MASP-2発現ベクターを、付着性のチャイニーズハムスター卵巣細胞株DXB1にトランスフェクトした。これらの構築物でトランスフェクトされた細胞は非常にゆっくりと増殖した。このことは、コードされたプロテアーゼが細胞傷害性であることを意味する。
原理:
認識小成分MBLまたはフィコリン(L-フィコリン、H-フィコリン、もしくはM-フィコリンのいずれか)がそれぞれの炭水化物パターンに結合した後に、MASP-2は自己触媒切断によって活性化される。血清からのMASP-2の単離手順中に、または組換え発現後の精製中に、MASP-2を活性化する自己触媒切断が起こることが多い。抗原として使用するための、より安定したタンパク質調製物を得るために、ラットではプロテアーゼドメインの触媒三残基(catalytic triad)に存在するセリン残基をアラニン残基で(SEQ ID NO:55 Ser617からAla617)、マウスでは(SEQ ID NO:52 Ser617からAla617)で;ヒトでは(SEQ ID NO:3 Ser618からAla618)で置換することによって、MASP-2Aと呼ばれる触媒不活性型MASP-2を作り出した。
MASP-2の様々なドメインを分泌させるために、MASP-2シグナルペプチド(SEQ ID NO:5の残基1-15)を用いて以下の構築物を作製する。MASP-2(SEQ ID NO:6)の残基1-121をコードする領域(N末端CUB1ドメインに対応する)を増幅するPCRによって、ヒトMASP-2 CUB1ドメイン(SEQ ID NO:8)を発現する構築物を作る。MASP-2(SEQ ID NO:6)の残基1-166をコードする領域(N末端CUB1EGFドメインに対応する)を増幅するPCRによって、ヒトMASP-2 CUBIEGFドメイン(SEQ ID NO:9)を発現する構築物を作る。MASP-2(SEQ ID NO:6)の残基1-293をコードする領域(N末端CUBIEGFCUBIIドメインに対応する)を増幅するPCRによって、ヒトMASP-2 CUBIEGFCUBIIドメイン(SEQ ID NO:10)を発現する構築物を作る。確立されたPCR法に従って、VentRポリメラーゼおよび鋳型としてpBS-MASP-2を用いたPCRによって前述のドメインを増幅する。センスプライマーの5'プライマー配列
は、PCR産物の5'末端にBamHI制限部位(下線)を導入する。以下の表5に示した、それぞれのMASP-2ドメインのアンチセンスプライマーは、それぞれのPCR産物の末端に停止コドン(太字体)の後にEcoRI部位(下線)を導入するように設計されている。DNA断片を増幅したら、BamHIおよびEcoRIで消化し、pFastBac1ベクターの対応する部位にクローニングする。結果として生じた構築物を制限酵素マッピングによって特徴付け、dsDNA配列決定によって確認する。
標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション手順(Maniatis et al., 1989)を用いて、前記のMASP-2発現構築物およびMASP-2A発現構築物をDXB1細胞にトランスフェクトした。調製物が他の血清タンパク質で確実に汚染されないようにするために、MASP-2Aを無血清培地中で産生させた。1日おきに(計4回)、培地をコンフルエント細胞から回収した。組換えMASP-2Aレベルの平均は、3種類の種それぞれについて培地1リットルにつき約1.5mgであった。
MASP-2A(前記のSer-Ala変異体)を、MBP-A-アガロースカラムでのアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。この戦略によって、外部タグを使用することなく迅速な精製が可能になった。MASP-2A(等量のローディングバッファー(150mM NaClおよび25mM CaCl2を含有する50mM Tris-Cl, pH7.5で希釈した培地100〜200ml)を、10mlのローディングバッファーで予め平衡状態にしたMBP-アガロースアフィニティカラム(4ml)にロードした。さらに10mlのローディングバッファーで洗浄した後に、1.25M NaClおよび10mM EDTAを含有する50mM Tris-Cl, pH7.5を用いて、タンパク質を1ml画分中に溶出させた。MASP-2Aを含有する画分をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって特定した。必要に応じて、MASP-2Aを、MonoQカラム(HR5/5)でのイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。タンパク質を、50mM NaClを含有する50mM Tris-Cl pH7.5を用いて透析し、同じ緩衝液で平衡状態にしたカラムにロードした。洗浄後、結合しているMASP-2Aを、10mlにわたって0.05〜1MのNaCl勾配で溶出させた。
収量0.25〜0.5mgのMASP-2Aタンパク質を培地200mlから得た。MALDI-MSによって求められた分子量77.5kDaは、グリコシル化のために非修飾ポリペプチドの算出値(73.5kDa)より大きい。それぞれのN-グリコシル化部位におけるグリカンの付着が、観察された質量の原因となっている。MASP-2AはSDS-ポリアクリルアミドゲル上でシングルバンドとして移動する。このことから、MASP-2Aは生合成中にタンパク質分解処理されないことが証明される。平衡超遠心分離によって求められた重量平均分子量はグリコシル化ポリペプチドのホモ二量体の算出値と一致する。
組換えMASP-2およびMASP2A由来ポリペプチドを産生するための別の方法は、Thielens, N.M., et al., J. Immunol 166:5068-5077, 2001に記載されている。簡単に述べると、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)昆虫細胞(Novagen, Madison, WIから入手したReady-Plaque Sf9細胞)を、50IU/mlペニシリンおよび50mg/mlストレプトマイシン(Life Technologies)を添加したSf900II無血清培地(Life Technologies)中で増殖および維持する。イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)(High Five)昆虫細胞(Jadwiga Chroboczek, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, Franceにより提供された)を、50 IU/mlペニシリンおよび50mg/mlストレプトマイシンで添加した、10%FCS(Dominique Dutscher, Brumath, France)を含有するTC100培地(Life Technologies)中で維持する。組換えバキュロウイルスを、Bac-to-Bacシステム(Life Technologies)を用いて生成する。バクミドDNAを、Qiagen midiprep精製系(Qiagen)を用いて精製し、製造業者のプロトコールに記載のようにSf900 II SFM培地(Life Technologies)に溶解したセルフェクション(cellfectin)を用いてSf9昆虫細胞をトランスフェクトするのに使用する。組換えウイルス粒子を4日後に収集し、ウイルスプラークアッセイ法によって滴定し、King and Possee, The Baculovirus Expression System:A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., London, pp.111-114, 1992に記載のように増幅する。
本実施例は、MASP-2ポリペプチドに対するポリクローナル抗体を作製する方法について述べる。
MASP-2抗原:
以下の単離されたMASP-2ポリペプチド:血清から単離されたヒトMASP-2(SEQ ID NO:6);実施例3に記載の組換えヒトMASP-2(SEQ ID NO:6)、不活性プロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:13)を含有するMASP-2A;ならびに前記の実施例3に記載のように発現された、組換えCUBI(SEQ ID NO:8)、CUBEGFI(SEQ ID NO:9)、およびCUBEGFCUBII(SEQ ID NO:10)を用いてウサギを免疫することによって、ポリクローナル抗ヒトMASP-2抗血清を作製する。
BCG(カルメット・ゲラン杆菌ワクチン)で初回刺激を受けた6週齢ウサギを、滅菌食塩水に溶解した100μgのMASP-2ポリペプチド100μg/mlの注射によって免疫する。注射を4週間ごとに行い、実施例5に記載のようにELISAアッセイ法によって抗体価をモニタリングする。プロテインAアフィニティクロマトグラフィーによる抗体精製のために、培養上清を収集する。
本実施例は、ラットMASP-2ポリペプチドまたはヒトMASP-2ポリペプチドに対するマウスモノクローナル抗体を作製するための方法について述べる。
雄A/Jマウス(Harlan, Houston, Tex.)、8〜12週齢に、完全フロイントアジュバント(Difco Laboratories, Detroit, Mich.)を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)pH7.4 200μlに溶解したヒトまたはラットのrMASP-2またはrMASP-2Aポリペプチド(実施例3に記載のように作った)100μgを皮下注射する。2週間の間隔で2回、マウスに、不完全フロイントアジュバントに溶解したヒトまたはラットのrMASP-2またはrMASP-2Aポリペプチド50μgを皮下注射する。4週目に、マウスに、PBSに溶解したヒトまたはラットのrMASP-2またはrMASP-2Aポリペプチド50μgを注射し、4日後に融合する。
50ng/mlの精製hMASP-2 50μlまたはラットrMASP-2(もしくはrMASP-2A)を室温で一晩、添加することによって、Immulon2(Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.)マイクロテストプレートのウェルをコーティングする。コーティング用のMASP-2濃度が低いので、高親和性抗体の選択が可能である。プレートをパチンとはじくことによって、コーティング溶液を除去した後に、非特異的部位をブロックするために、PBSに溶解した200μlのBLOTTO(無脂肪ドライミルク)を各ウェルに1時間、添加する。次いで、1時間後、ウェルを緩衝液PBST(0.05%Tween20を含有するPBS)で洗浄する。それぞれの融合ウェルから50マイクロリットルの培養上清を収集し、50μlのBLOTTOと混合し、次いで、マイクロテストプレートの個々のウェルに添加する。1時間のインキュベーション後に、ウェルをPBSTで洗浄する。次いで、結合したマウス抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗マウスIgG(Fc特異的)(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.)との反応によって検出し、BLOTTOで1:2,000に希釈する。発色させるために、0.1%3,3,5,5テトラメチルベンジジン(Sigma, St. Louis, Mo.)および0.0003%過酸化水素(Sigma)を含有するペルオキシダーゼ基質溶液をウェルに30分間、添加する。反応を50μlの2M H2SO4/ウェルを添加することによって止める。反応混合物の450nmでの光学密度をBioTek ELISA Reader(BioTek Instruments, Winooski, Vt.)で読み取る。
前記のMASP-2 ELISAアッセイ法の試験において陽性と判定された培養上清を、MASP-2に対するMASP-2阻害物質の結合親和性を決定するために結合アッセイ法において試験することができる。阻害物質が補体系の他の抗原に結合するかどうか判定するために類似アッセイ法も使用することができる。
本実施例は、ヒト化マウス抗MASP-2抗体および抗体断片の生成および作製について述べる。
RNAzolを用いて製造業者のプロトコール(Biotech, Houston, Tex.)に従って、総RNAを、抗MASP-2 MoAbを分泌するハイブリドーマ細胞(実施例7に記載のように入手した)から単離する。プライマーとしてオリゴdTを用いて第一鎖cDNAを総RNAから合成する。免疫グロブリン定常C領域に由来する3'プライマー、および5'プライマーとしてリーダーペプチドまたはマウスVH遺伝子もしくはVK遺伝子の最初のフレームワーク領域に由来する縮重プライマーセットを用いてPCRを行う。アンカーPCRは、Chen and Platsucas(Chen, P.F., Scand. J. Immunol. 35:539-549, 1992)に記載のように行う。VK遺伝子をクローニングするために、NotI-MAK1プライマー
を用いて二本鎖cDNAを調製する。アニーリングされたアダプターAD1
およびAD2
を二本鎖cDNAの5'末端および3'末端の両方に連結する。3'末端にあるアダプターをNotI消化によって除去する。次いで、消化産物を、5'プライマーとしてAD1オリゴヌクレオチドおよび3'プライマーとしてMAK2
を使用するPCRにおける鋳型として使用する。約500bpのDNA断片をpUC19にクローニングする。クローニングされた配列が、予想されたマウス免疫グロブリン定常領域を含むことを確認するために、配列分析用に、いくつかのクローンを選択する。NotI-MAK1およびMAK2オリゴヌクレオチドはVK領域に由来し、それぞれ、Cκ遺伝子の最初の塩基対から182bpおよび84bp下流にある。完全なVKおよびリーダーペプチドを含むクローンを選択する。
を用いて二本鎖cDNAを調製する。アニーリングされたアダプターAD1およびAD2を、二本鎖cDNAの5'末端および3'末端の両方に連結する。3'末端にあるアダプターをNotI消化によって除去する。消化産物を、プライマーとしてAD1オリゴヌクレオチドおよびMAG2
を使用するPCRにおける鋳型として使用する。長さが500〜600bpのDNA断片をpUC19にクローニングする。NotI-MAG1およびMAG2オリゴヌクレオチドはマウスCγ.7.1領域に由来し、それぞれ、マウスCγ.7.1遺伝子の最初のbpから180bpおよび93bp下流にある。完全なVHおよびリーダーペプチドを含むクローンを選択する。
Kozakコンセンサス配列をヌクレオチド配列の5'末端に加え、スプライスドナーを3'末端に添加するためのPCR反応の鋳型として、前記のクローニングされたVH遺伝子およびVK遺伝子を使用する。PCRエラーが存在しないことを確認するために配列を分析した後に、VH遺伝子およびVK遺伝子を、それぞれ、ヒトC.γ1を含有する発現ベクターカセットおよびヒトC.κを含有する発現ベクターカセットに挿入して、pSV2neoVH-huCγ1およびpSV2neoV-huCγを得る。重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターのCsCl勾配精製プラスミドDNAを用いて、エレクトロポレーションによってCOS細胞をトランスフェクトする。48時間後に、約200ng/mlのキメラIgGの存在を確認するために、培養上清をELISAによって試験する。細胞を回収し、総RNAを調製する。プライマーとしてオリゴdTを用いて、総RNAから第一鎖cDNAを合成する。Fd DNA断片およびκDNA断片を生成するために、このcDNAをPCRにおける鋳型として使用する。Fd遺伝子の場合、5'プライマーとして
およびCH1由来3'プライマー
を用いてPCRを行う。DNA配列は、ヒトIgG1の完全なVHドメインおよびヒトCH1ドメインを含有することが確認される。適切な酵素で消化した後に、Fd DNA断片を、発現ベクターカセットpSV2dhfr-TUSのHindIII制限部位およびBamHI制限部位に挿入して、pSV2dhfrFdを得る。pSV2プラスミドは市販されており、様々な供給源に由来するDNAセグメントからなる。pBR322DNA(薄い線)は、pBR322のDNA複製起点(pBRori)およびラクタマーゼアンピシリン耐性遺伝子(Amp)を含有する。幅広のハッチングによって表され、印が付けられているSV40 DNAは、SV40 DNA複製起点(SV40ori)、初期プロモーター(dhfr遺伝子およびneo遺伝子の5'側)、ならびにポリアデニル化シグナル(dhfr遺伝子およびneo遺伝子の3'側)を含有する。SV40由来ポリアデニル化シグナル(pA)もFd遺伝子の3'末端に配置される。
およびCK由来3'プライマー
を用いてPCRを行う。DNA配列は、完全なVK領域およびヒトCK領域を含有することが確認される。適切な制限酵素を用いた消化後に、κDNA断片を発現ベクターカセットpSV2neo-TUSのHindIII制限部位およびBamHI制限部位に挿入して、pSV2neoKを得る。Fd遺伝子およびκ遺伝子の発現は、HCMV由来エンハンサーおよびプロモーターエレメントによって駆動される。Fd遺伝子は、鎖間ジスルフィド結合に関与するシステインアミノ酸残基を含まないので、この組換えキメラFabは、非共有結合により連結された重鎖および軽鎖を含有する。このキメラFabはcFabと呼ばれる。
キメラ抗MASP-2 IgGを分泌する細胞株を生成するために、NSO細胞を、エレクトロポレーションによってpSV2neoVH-huC.γ1およびpSV2neoV-huCκの精製プラスミドDNAでトランスフェクトする。トランスフェクト細胞を、0.7mg/ml G418の存在下で選択する。細胞を、血清含有培地を用いて250mlスピナーフラスコ中で増殖させる。
キメラ抗MASP-2 Fabを分泌する細胞株を生成するために、CHO細胞を、エレクトロポレーションによってpSV2dhfrFd(またはpSV2dhfrFd/9aa)およびpSV2neoκの精製プラスミドDNAでトランスフェクトする。トランスフェクト細胞をG418およびメトトレキセートの存在下で選択する。選択された細胞株を漸増濃度のメトトレキセートの中で増幅する。細胞を限界希釈によってシングルセルサブクローニングする。次いで、高産生シングルセルサブクローニング細胞株を、無血清培地を用いて100mlスピナーフラスコ中で増殖させる。
本実施例は、L-フィコリン/P35、H-フィコリン、M-フィコリン、またはマンナンを介したMASP-2依存性補体活性化を遮断することができるMASP-2阻害物質を特定するための機能スクリーニングとして用いられるインビトロC4切断アッセイ法について述べる。
C4切断アッセイ法は、Petersen, S.V., et al., J. Immunol. Methods 257:107, 2001によって述べられており、L-フィコリンに結合する黄色ブドウ球菌由来リポテイコ酸(LTA)に起因するレクチン経路活性化を測定する。
ホルマリン固定黄色ブドウ球菌(DSM20233)を以下のように調製する。細菌をトリプティックソイ血液培地中で37℃で一晩増殖させ、PBSで3回洗浄し、次いで、PBS/0.5%ホルマリン中で室温で1時間固定し、PBSでさらに3回洗浄した後に、コーティング緩衝液(15mM Na2Co3、35mM NaHCO3、pH9.6)に再懸濁する。
Nunc MaxiSorbマイクロタイタープレート(Nalgene Nunc International, Rochester, NY)のウェルを、コーティング緩衝液に溶解した1ugのL-フィコリンと共に、コーティング緩衝液に溶解した100μlのホルマリン固定黄色ブドウ球菌DSM20233(OD550=0.5)でコーティングする。一晩のインキュベーション後、ウェルを、TBS(10mM Tris-HCl、140mM NaCl pH7.4)に溶解した0.1%ヒト血清アルブミン(HSA)でブロックし、次いで、0.05%Tween20および5mM CaCl2を含有するTBS(洗浄液緩衝液)で洗浄する。ヒト血清試料を、内因性C4の活性化を阻止し、C1複合体(C1q、C1r、およびC1sからなる)を解離する、20mM Tris-HCl、1M NaCl、10mM CaCl2、0.05%Triton X-100、0.1%HSA、pH7.4で希釈する。抗MASP-2 MoAbおよび阻害ペプチドを含むMASP-2阻害物質を様々な濃度で血清試料に添加する。希釈試料をプレートに添加し、4℃で一晩インキュベートする。24時間後、プレートを洗浄緩衝液で徹底的に洗浄する。次いで、100μlの4mMバルビタール、145mM NaCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、pH7.4に溶解した、0.1μgの精製ヒトC4(Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993に記載のように入手した)を各ウェルに添加する。37℃で1.5時間後に、プレートを再洗浄し、C4b沈着をアルカリホスファターゼ結合ニワトリ抗ヒトC4c(Immunsystem, Uppsala, Swedenから入手した)を用いて検出し、比色分析基質p-ニトロフェニルリン酸を用いて測定する。
MBLを介したレクチン経路活性化を測定するために、プレートをLSPおよびマンナンでコーティングした後に、様々なMASP-2阻害物質と混合した血清を添加することによって、前記のアッセイ法を適合化させる。
H-フィコリンを介したレクチン経路活性化を測定するために、プレートをLSPおよびH-フィコリンでコーティングした後に、様々なMASP-2阻害物質と混合した血清を添加することによって、前記のアッセイ法を適合化させる。
以下のアッセイ法は、野生型マウスおよびMASP-2-/-マウスにおける古典経路活性化の存在を証明する。
マイクロタイタープレート(Maxisorb, Nunc, カタログ番号442404, Fisher Scientific)を、10mM Tris、140mM NaCl、pH7.4に溶解した0.1%ヒト血清アルブミンで室温で1時間コーティングした後に、TBS/tween/Ca2+で1:1000に希釈したヒツジ抗全血清(whole serum)抗血清(Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Scotland)と4℃で一晩インキュベートすることによって、免疫複合体をインサイチューで生成した。血清試料を野生型およびMASP-2-/-マウスから入手し、コーティングされたプレートに添加した。野生型血清試料およびMASP-2-/-血清試料からC1qを枯渇させた対照試料を調製した。C1q枯渇マウス血清は、ウサギ抗ヒトC1q IgG(Dako, Glostrup, Denmark)でコーティングされたプロテインA結合Dynabeads(Dynal Biotech, Oslo, Norway)を用いて供給業者の説明書に従って調製した。プレートを37℃で90分間インキュベートした。結合しているC3bを、TBS/tw/Ca++で1:1000に希釈したポリクローナル抗ヒトC3c抗体(DakoA062)を用いて検出した。二次抗体はヤギ抗ウサギIgGである。
図7は、野生型血清、MASP-2-/-血清、C1q枯渇野生型血清、およびC1q枯渇MASP-2-/-血清中のIgGでコーティングされたプレート上の相対的C3b沈着レベルを示す。これらの結果から、MASP-2-/-マウス系統において古典経路は損なわれていないことが証明される。
以下のアッセイ法を用いて、免疫複合体によって古典経路が開始する条件下でMASP-2阻害物質の効果を分析することによって、MASP-2阻害物質が古典経路を遮断するかどうか試験する。
免疫複合体によって古典経路が開始する補体活性化の状態に対するMASP-2阻害物質の効果を試験するために、90%NHSを含有する試料50μlを3つ、10μg/ml免疫複合体(IC)またはPBSの存在下で37℃でインキュベートする。37℃でのインキュベーション中に、200nM抗プロペルジンモノクローナル抗体を含有する類似試料(+/-IC)も3つ含める。37℃で2時間のインキュベーション後に、さらなる補体活性化を止めるために、13mM EDTAを全ての試料に添加し、すぐに、試料を5℃まで冷却する。次いで、試料を-70℃で保管した後に、ELISAキット(Quidelカタログ番号A015およびA009)を用いて製造業者の説明書に従って補体活性化産物(C3aおよびsC5b-9)をアッセイする。
本実施例は、MASP-2活性を遮断する高親和性抗MASP-2 Fab2抗体断片の特定について述べる。
MASP-2は、MBLおよびフィコリンの結合部位、セリンプロテアーゼ触媒部位、タンパク質分解基質C2の結合部位、タンパク質分解基質C4の結合部位、MASP-2酵素前駆体自己活性化のためのMASP-2切断部位、ならびに2つのCa++結合部位を含む、多くの別個の機能ドメインを有する複合タンパク質である。高親和性でMASP-2に結合するFab2抗体断片を特定し、特定されたFab2断片がMASP-2機能活性を遮断できるかどうか判定するために機能アッセイ法において試験した。
ヒト軽鎖抗体可変配列および重鎖抗体可変配列のファージディスプレイライブラリー、ならびに関心対象の選択されたリガンドと反応するFab2を特定するための自動抗体選択技術を用いて、ラットMASP-2タンパク質(SEQ ID NO:55)に対する高親和性Fab2を作り出した。抗体スクリーニングのために、既知量のラットMASP-2(約1mg、>85%純粋)タンパク質を利用した。親和性が最も高い抗体を選択するために3回の増幅を利用した。ELISAスクリーニングのために、抗体断片を発現する約250個の異なるヒットを選んだ。この後に、異なる抗体のユニークさ(uniqueness)を決定するために高親和性ヒットを配列決定した。
1.レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定するためのアッセイ法:
背景:
レクチン経路C3コンバターゼは、C3を2つの強力な炎症誘発断片であるアナフィラトキシンC3aおよびオプソニンC3bにタンパク分解によって切断する酵素複合体(C4bC2a)である。C3コンバターゼの形成は、炎症を媒介する点でレクチン経路の重要な段階であるように思われる。MASP-2はレクチン経路C3コンバターゼ(C4bC2a)の構造成分ではない。従って、抗MASP-2抗体(またはFab2)は、既にあるC3コンバターゼの活性を直接阻害しない。しかしながら、レクチン経路C3コンバターゼを構成する2つのタンパク質成分(C4b、C2a)を生成するために、MASP-2セリンプロテアーゼ活性が必要とされる。従って、MASP-2機能活性を阻害する抗MASP-2 Fab2(すなわち、遮断抗MASP-2 Fab2)はレクチン経路C3コンバターゼの新規形成を阻害する。C3は、その構造の一部として、珍しく、かつ高反応性のチオエステル基を含有する。このアッセイ法ではC3がC3コンバターゼによって切断されると、C3b上のチオエステル基は、エステル結合またはアミド結合を介してプラスチックウェルの底に固定化された巨大分子上のヒドロキシル基またはアミノ基と共有結合を形成することができ、従って、ELISAアッセイ法におけるC3bの検出が容易になる。
96ウェルCostar Medium Bindingプレートを、1ug/50Tl/ウェルで、50mM炭酸緩衝液、pH9.5で希釈したマンナンと5℃で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、200Tl PBSで各ウェルを3回洗浄した。次いで、ウェルを、PBSに溶解した100Tl/ウェルの1%ウシ血清アルブミンでブロックし、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。次いで、各ウェルを200TlのPBSで3回洗浄した。抗MASP-2 Fab2試料を、5Cで、Ca++およびMg++を含有するGVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1%ゼラチン、pH7.4)で選択された濃度まで希釈した。0.5%ラット血清を5Cで前記試料に添加し、100Tlを各ウェルに移した。プレートに蓋をし、補体活性化を可能にするために37C水浴中で30分間インキュベートした。37C水浴から、氷と水の混合物を含む容器にプレートを移すことによって、反応を止めた。各ウェルを、PBS-Tween20(0.05%Tween20を含むPBS)で200Tlで5回洗浄し、次いで、200TlのPBSで2回洗浄した。2.0mg/mlウシ血清アルブミンを含有するPBSに溶解した100Tl/ウェルの一次抗体(ウサギ抗ヒトC3c、DAKO A0062)1:10,000希釈液を添加し、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを5x200TlのPBSで洗浄した。2.0mg/mlウシ血清アルブミンを含有するPBSに溶解した、100Tl/ウェルの二次抗体(ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG, American Qualex A102PU)1:10,000希釈液を添加し、シェーカーに載せて穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルをPBSで200Tlで5回洗浄した。100Tl/ウェルのペルオキシダーゼ基質TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加し、室温で10分間インキュベートした。100Tl/ウェルの1.0M H3PO4を添加することによってペルオキシダーゼ反応を止め、OD450を測定した。
背景:
MASP-2のセリンプロテアーゼ活性は高度に特異的であり、MASP-2のタンパク質基質はC2およびC4の2種類しか特定されていない。C4の切断によってC4aおよびC4bが生成される。抗MASP-2 Fab2は、C4切断に直接関与するMASP-2上の構造エピトープ(例えば、C4のMASP-2結合部位;MASP-2セリンプロテアーゼ触媒部位)に結合し、それによって、MASP-2のC4切断機能活性を阻害する可能性がある。
96ウェルCostar Medium Bindingプレートを、1.0Tg/50Tl/ウェルで、50mM炭酸緩衝液、pH9.5で希釈したマンナンと5Cで一晩インキュベートした。200Tl PBSで各ウェルを3回洗浄した。次いで、ウェルを、PBSに溶解した100Tl/ウェルの1%ウシ血清アルブミンでブロックし、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200TlのPBSで3回洗浄した。抗MASP-2 Fab2試料を、5Cで、Ca++およびMg++を含有するGVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1%ゼラチン、pH7.4)で選択された濃度まで希釈した。これらの試料に1.0Tg/ml/ヒトC4(Quidel)も含めた。前記試料に0.5%ラット血清を5Cで添加し、100Tlを各ウェルに移した。プレートに蓋をし、補体を活性化するために37C水浴中で30分間インキュベートした。37C水浴から、氷と水の混合物を含む容器にプレートを移すことによって、反応を止めた。各ウェルを、PBS-Tween20(0.05%Tween20を含むPBS)で200Tlで5回洗浄した。次いで、各ウェルを200TlのPBSで2回洗浄した。2.0mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBSに溶解した、100Tl/ウェルのビオチン結合ニワトリ抗ヒトC4c(Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)1:700希釈液を添加し、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200TlのPBSで5回洗浄した。2.0mg/ml BSAを含有するPBSに溶解した、100Tl/ウェルの0.1Tg/mlのペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(Pierce Chemical#21126)を添加し、シェーカーに載せて穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200TlのPBSで5回洗浄した。100Tl/ウェルのペルオキシダーゼ基質TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加し、室温で16分間インキュベートした。100Tl/ウェルの1.0M H3PO4を添加することによってペルオキシダーゼ反応を止め、OD450を測定した。
背景:
MASP-2は、通常、特異的レクチン分子(マンノース結合タンパク質(MBL)およびフィコリン)も含むMASP-2二量体複合体として血漿中に存在する。従って、抗MASP-2 Fab2と生理学的に関連する形態のMASP-2との結合の研究に興味があるのであれば、精製組換えMASP-2ではなく、Fab2と血漿中の「天然」MASP-2との相互作用が用いられる結合アッセイ法を開発することが重要である。この結合アッセイ法では、最初に、10%ラット血清に由来する「天然」MASP-2-MBL複合体をマンナンコーティングウェルに固定化した。次いで、標準的なELISA法を用いて、固定化「天然」MASP-2に対する様々な抗MASP-2 Fab2の結合親和性を研究した。
96ウェルCostar High Bindingプレートを、1Tg/50Tl/ウェルで、50mM炭酸緩衝液、pH9.5で希釈したマンナンと5℃で一晩インキュベートした。200TlのPBSで各ウェルを3回洗浄した。ウェルを100Tl/ウェルの、PBST(0.05%Tween20を含むPBS)に溶解した0.5%無脂肪ドライミルクでブロックし、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200TlのTBS/Tween/Ca++洗浄緩衝液(5.0mM CaCl2を含有するTris緩衝食塩水、0.05%Tween20、pH7.4)で3回洗浄した。High Salt Binding Buffer(20mM Tris、1.0M NaCl、10mM CaCl2、0.05%Triton-X100、0.1%(w/v)ウシ血清アルブミン、pH7.4)に溶解した10%ラット血清を氷上で調製した。100Tl/ウェルを添加し、5℃で一晩インキュベートした。ウェルを200TlのTBS/Tween/Ca++洗浄緩衝液で3回洗浄した。次いで、ウェルを200TlのPBSで2回洗浄した。Ca++およびMg++を含有するGVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1%ゼラチン、pH7.4)で希釈した100Tl/ウェルの選択された濃度の抗MASP-2 Fab2を添加し、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200TlのPBSで5回洗浄した。2.0mg/mlウシ血清アルブミンを含むPBSで1:5000に希釈した100Tl/ウェルのHRP結合ヤギ抗Fab2(Biogenesisカタログ番号0500-0099)を添加し、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200TlのPBSで5回洗浄した。100Tl/ウェルのペルオキシダーゼ基質TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加し、室温で70分間インキュベートした。100Tl/ウェルの1.0M H3PO4を添加することによってペルオキシダーゼ反応を止め、OD450を測定した。
ELISAスクリーニングのために、高親和性でラットMASP-2タンパク質と反応した約250個の異なるFab2を選んだ。異なる抗体のユニークさを決定するために、これらの高親和性Fab2を配列決定した。さらなる分析のために、50個のユニークな抗MASP-2抗体を精製した。それぞれの精製Fab2抗体250μgを、MASP-2結合親和性の特徴付けおよび補体経路の機能試験に使用した。この分析の結果を以下の表6に示した。
本実施例は、実施例10に記載のように生成された遮断抗ラットMASP-2 Fab2抗体のいくつかのエピトープマッピングについて述べる。
図10に示したように、全てN末端6XHisタグを有する以下のタンパク質を、pED4ベクターを用いてCHO細胞において発現させた:
ラットMASP-2A、活性中心にあるセリンをアラニンに変えることによって不活性化された完全長MASP-2タンパク質(S613A):
ラットMASP-2K、自己活性化を低減するように変えられた完全長MASP-2タンパク質(R424K);
CUBI-II、CUBIドメイン、EGF様ドメイン、およびCUBIIドメインしか含まないラットMASP-2 N末端断片;ならびに
CUBI/EGF様、CUBIドメインおよびEGF様ドメインしか含まないラットMASP-2 N末端断片。
前述した、および図10に示した5個の組換えMASP-2ポリペプチドの段階希釈液(ならびにCCPII-セリンプロテアーゼポリペプチドの陰性対照としてチオレドキシンポリペプチド)をニトロセルロース膜上にスポットした。スポットされたタンパク質の量は5倍段階で100ng〜6.4pgであった。後の実験において、スポットされたタンパク質の量は、再度、5倍段階で50ng〜16pgであった。膜を、TBS(ブロッキング緩衝液)に溶解した5%スキムミルク粉末でブロックし、次いで、ブロッキング緩衝液(5.0mM Ca2+を含有する)に溶解した1.0μg/mlの抗MASP-2 Fab2とインキュベートした。結合しているFab2を、HRP結合抗ヒトFab(AbD/Serotec;1/10,000に希釈した)およびECL検出キット(Amersham)を用いて検出した。1枚の膜を、陽性対照としてポリクローナルウサギ抗ヒトMASP-2 Ab(Stover et al., J Immunol 163:6848-59(1999)に記載)とインキュベートした。この場合、結合しているAbを、HRP結合ヤギ抗ウサギIgG(Dako; 1/2,000に希釈した)を用いて検出した。
ELISAプレートを、炭酸緩衝液(pH9.0)に溶解した1.0μg/ウェルの組換えMASP-2AまたはCUBI-IIポリペプチドで4℃で一晩コーティングした。ウェルを、TBSに溶解した1%BSAでブロックし、次いで、5.0mM Ca2+を含有するTBSに溶解した抗MASP-2 Fab2の段階希釈液を添加した。プレートをRTで1時間インキュベートした。TBS/tween/Ca2+で3回洗浄した後、TBS/Ca2+で1/10,000に希釈したHRP結合抗ヒトFab(AbD/Serotec)を添加し、プレートをRTでさらに1時間インキュベートした。結合している抗体を、TMBペルオキシダーゼ基質キット(Biorad)を用いて検出した。
Fab2と様々なMASP-2ポリペプチドとの反応性を証明したドットブロット分析の結果を以下の表7に示した。表7に示した数値は、ほぼ最大半量のシグナル強度を得るのに必要とされる、スポットされたタンパク質の量を示す。示したように、(チオレドキシン融合パートナー単独を除く)全てのポリペプチドが、陽性対照Ab(ポリクローナル抗ヒトMASP-2血清、ウサギにおいて産生された)によって認識された。
本実施例は、マウス腎臓虚血/再灌流モデルにおけるMASP-2-/-マウスの分析について述べる。
体温での腎臓における虚血-再灌流(I/R)損傷は、血液量減少性ショック、腎臓動脈閉塞、およびクロスクランピング(cross-clamping)法を含む多数の臨床状態において関連がある。
MASP-2(-/-)マウスを実施例1に記載のように生成し、少なくとも10世代にわたってC57B1/6と戻し交配した。6匹の雄MASP-2(-/-)および6匹の野生型(+/+)マウス、体重22〜25gに、Hypnovel(6.64 mg/kg; Roche products Ltd. Welwyn Garden City, UK)の腹腔内注射を投与し、その後に、イソフルラン(Abbott Laboratories Ltd., Kent, UK)吸入によって麻酔をかけた。イソフルランは、肝毒性がほとんどない穏やかな吸入麻酔薬であるので選択された。濃度は正確に作製され、長期麻酔の後でも動物は速やかに回復する。Hypnovelは動物において神経遮断性鎮痛の状態を生じ、少量のイソフルランが投与される必要があることを意味するので投与された。一定の体温を維持するために動物の真下に暖かいパッドを敷いた。次に、腹部縦切開を行い、一対の開創器を用いて体腔を開いた。右腎および左腎の腎静脈および腎動脈の上部および下部にある結合組織を取り除き、毛細血管瘤鉗子を55分間、適用することによって腎茎をきつく締めた。この虚血期間は、当初、この研究室で行われた先行研究に基づいた(Zhou et al., J. Clin. Invest. 105:1363-71(2000))。さらに、虚血滴定(ischemic titration)後に55分の標準的な虚血時間が選択され、55分で、5%未満の低い死亡率で、可逆的でもある損傷が一貫して得られることが見出された。閉塞後、0.4mlの暖かい食塩水(37℃)を腹腔に入れ、次いで、虚血期間に腹部を閉じた。毛細血管瘤鉗子を取り外した後、腎臓に血液が再び流れ始めたことを示す色の変化まで腎臓を観察した。さらに0.4mlの暖かい食塩水を腹腔に入れ、開口部を縫合した。その後、動物をケージに戻した。鉗子を取り外して24時間後に尾血液試料を採取し、48時間でマウスを屠殺し、さらなる血液試料を収集した。
6匹の雄MASP-2(-/-)および6匹のWT(+/+)マウスにおいて、再灌流して24時間後および48時間後の腎機能を評価した。血中クレアチニン測定値を質量分析によって求めた。血中クレアチニン測定値は、再現性のある腎機能指数(感度<1.0μmol/L)を提供する。図12は、再灌流して24時間後および48時間後の野生型C57B1/6対照およびMASP-2(-/-)の血中尿素窒素クリアランスを図示する。図12に示したように、MASP-2(-/-)マウスは、24時間および48時間で野生型対照マウスと比較して血中尿素量の有意な低下を示した。このことから、虚血再灌流傷害モデルにおける腎臓損傷からの保護機能効果が示された。
本実施例は、マウス黄斑変性モデルにおけるMASP-2-/-の結果について述べる。
加齢黄斑変性(AMD)は、先進国における55歳以降の失明の第1位の原因である。AMDは、2つの主な型:新生血管型(ウェット)AMDおよび萎縮型(ドライ)AMDで発生する。新生血管型(ウェット)型はAMDに関連した重篤な失明の90%を占めるが、AMD個体の約20%しかウェット型を発症しない。AMDの臨床上の顕著な特徴には、複数のドルーゼン、地図状萎縮、および脈絡膜血管新生(CNV)が含まれる。2004年12月に、FDAは、ウェット(新生血管)型AMDを治療するための、血管内皮増殖因子(VEGF)を特異的な標的とし、その作用を遮断する新種の眼用薬物であるMacugen(ペガプタニブ)を認可した(Ng et al., Nat Rev. Drug Discov 5:123-32(2006))。Macugenは、AMD患者サブグループを対象とした有望な新しい治療選択肢であるが、依然として、この複雑な疾患のさらなる治療法を開発することが差し迫って必要とされている。複数の独立した研究分野が、補体活性化の中心的な役割をAMD発生に結びつけている。最も重篤な型のAMDである脈絡膜血管新生(CNV)の発生には補体経路の活性化が関与している可能性がある。
MASP-2-/-マウスを実施例1に記載のように生成し、10世代にわたってC57B1/6と戻し交配した。本研究では、新生血管AMDの促進モデルであるレーザー誘導性CNVの経過においてMASP-2(-/-)雄マウスおよびMASP-2(+/+)雄マウスを評価した場合の結果を、組織損傷の尺度としての走査型レーザー共焦点顕微鏡観察によるレーザー誘導性CNVの体積、ならびにレーザー損傷後のELISAによる網膜色素上皮(RPE)/脈絡膜におけるCNVに関与する強力な血管新生因子であるVEGFレベルの決定に焦点を当てて比較した。
0日目に、薬物群の割り付けが知らされていない一人の人が、それぞれの動物の両眼に対してレーザー光凝固(532nm、200mW、100ms、75μm; Oculight GL, Iridex, Mountain View, CA)を行った。標準的なやり方で、スリットランプ送達系およびコンタクトレンズとしてカバーガラスを用いて視神経周囲にレーザースポットを適用した。レーザー損傷の形態エンドポイントは、ブルッフ膜の破壊と相関すると考えられている兆候であるキャビテーションバルブ(cavitation bubble)の出現であった。詳細な方法および評価されたエンドポイントは以下の通りである。
レーザー光凝固の1週間後に、フルオレセイン血管造影をカメラおよびイメージングシステム(TRC501Aカメラ; ImageNet 2.01システム; Topcon, Paramus, NJ)を用いて行った。0.1mlの2.5%フルオレセインナトリウムを腹腔内注射した後に、写真を、眼底カメラレンズと接触している20-Dレンズによって取り込んだ。レーザー光凝固または血管造影に関与していない網膜の専門家がフルオレセイン血管造影図を盲検形式で一気に評価した。
レーザー損傷の1週間後に、眼を摘出し、4%パラホルムアルデヒドで4℃で30分間、固定した。前区を取り出すことによって眼杯を入手し、PBSで3回洗浄した後に、メタノール系列で脱水および再水和した。緩衝液(1%ウシ血清アルブミンおよび0.5%TritonX-100を含有するPBS)で2回、室温で30分間ブロッキングした後に、眼杯を、0.2%BSAおよび0.1%TritonX-100を含有するPBSで希釈した、0.5%FITC-イソレクチンB4(Vector laboratories, Burlingame, CA)と4℃で一晩インキュベートした。0.5%FITC-イソレクチンB4は内皮細胞の表面にある末端β-D-ガラクトース残基に結合し、マウス脈管構造を選択的に標識する。0.1%TritonX-100を含有するPBSで2回、洗浄した後に、神経感覚網膜をそっと剥がし、視神経から切り離した。4つの弛緩放射状切開(relaxing radial incision)を作り、残っているRPE-脈絡膜-強膜複合体を、antifade培地(Immu-Mount Vectashieid Mounting Medium; Vector Laboratories)に入れてフラットマウント(flatmount)し、カバーガラスをかけた。
12個のレーザースポットによる損傷の3日後に、RPE-脈絡膜複合体を、溶解緩衝液(20mMイミダゾールHCl、10mM KCl、1mM MgCL2、10mM EGTA、1%Triton X-100、10mM NaF、1mMモリブデン酸Na、および1mM EDTAとプロテアーゼインヒビター)に入れて氷上で15分間、超音波処理した。上清中のVEGFタンパク質レベルを、450〜570nm(Emax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で全てのスプライスバリアントを認識するELISAキット(R&D Systems, Minneapolis, MN)によって求め、総タンパク質に対して基準化した。光凝固にもイメージングにも血管造影にも関与しなかった作業者が、2回同じ測定を盲検形式で行った。VEGF数を少なくとも3回の独立した実験の平均+/-SEMとして表し、マン・ホイットニーU検定を用いて比較した。P<0.05で帰無仮説を棄却した。
VEGFレベルの評価:
図13Aは、0日目にC57B16野生型マウスおよびMASP-2(-/-)マウスから単離されたRPE-脈絡膜複合体におけるVEGFタンパク質レベルを図示する。図13Aに示したように、VEGFレベルの評価は、C57b1野生型対照マウスに対するMASP-2(-/-)マウスにおけるVEGFベースラインレベルの減少を示す。図13Bは、レーザー誘導性損傷の3日後に測定されたVEGFタンパク質レベルを図示する。図13Bに示したように、VEGFレベルはレーザー誘導性損傷の3日後に野生型(+/+)マウスでは有意に増加し、発表された研究(Nozaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:2328-33(2006))と一致する。しかしながら、驚いたことに、MASP-2(-/-)マウスでは非常に低レベルのVEGFが見られた。
レーザー誘導性黄斑変性後のVEGFレベルの低下に加えて、レーザー損傷の前後にCNV面積が求められた。図14は、レーザー誘導性損傷後7日目にC57b1野生型マウスおよびMASP-2(-/-)マウスにおいて測定されたCNV体積を図示する。図14に示したように、MASP-2(-/-)マウスは、レーザー誘導性損傷後7日目に野生型対照マウスと比較してCNV面積の約30%の縮小を示した。
本実施例は、トロンビン活性化が生理学的条件下でレクチン経路活性化後に起こることを証明し、MASP-2が関与する程度を証明する。正常ラット血清中で、レクチン経路が活性化されると、補体が活性化されると同時に(C4沈着として評価される)、トロンビンが活性化される(トロンビン沈着として評価される)。図15Aおよび図15Bから分かるように、この系におけるトロンビン活性化はMASP-2遮断抗体(Fab2形式)によって阻害され、補体活性化の阻害濃度反応曲線(図15A)と一致する阻害濃度反応曲線(図15B)を示す。これらのデータから、外傷において発生するようにレクチン経路が活性化されると、MASP-2に完全に依存するプロセスにおいて補体系および凝固系が活性化されることが示唆される。推論によって、MASP2遮断抗体は、過度の全身凝固、例えば、重大な外傷症例における死亡につながる顕著な特徴の1つである播種性血管内凝固の症例の緩和において有効だと分かる可能性がある。
本実施例は、播種性血管内凝固(「DIC」)におけるレクチン経路の役割を評価するために、MASP-2-/-欠損マウスおよびMASP-2+/+十分マウスにおけるDICの限局性シュワルツマン反応モデルを用いて得られた結果を提供する。
前記のように、MASP-2の遮断はレクチン経路活性化を阻害し、アナフィラトキシンであるC3aおよびC5aの生成を低減する。C3aアナフィラトキシンはインビトロでは強力な血小板凝集因子であることが分かっているが、インビボにおいて、これらの関与はあまり明確でなく、創傷治癒における血小板物質およびプラスミンの放出は二次的にしか補体C3を必要としない可能性がある。本実施例では、播種性血管内凝固を生成するためにはC3活性化の長期増大が必要かどうかを取り扱うために、レクチン経路の役割をMASP-2(-/-)マウスおよびWT(+/+)マウスにおいて分析した。
この研究において用いられるMASP-2(-/-)マウスを実施例1に記載のように生成し、少なくとも10世代にわたってC57B1/6と戻し交配した。
本実施例は、マウス腎臓移植モデルにおけるMASP-2(-/-)マウスの分析について述べる。
腎臓移植の機能的転帰におけるMASP-2の役割をマウスモデルを用いて評価した。
腎臓移植の機能的転帰を、6匹のWT(+/+)移植レシピエント(B6)および6匹のMASP-2(-/-)移植レシピエントを用いた一側性腎摘出レシピエントマウスへの単一腎臓同系移植を用いて評価した。移植された腎臓の機能を評価するために、移植して5日後に、残っている元からある腎臓をレシピエントから取り出し、24時間後に血中尿素窒素(BUN)レベルを測定することによって腎機能を評価した。
図17は、WT(+/+)レシピエントおよびMASP-2(-/-)レシピエントにおける腎臓移植6日後の腎臓の血中尿素窒素(BUN)レベルを図示する。図17に示したように、腎不全を示すBUNレベルの強い上昇がWT(+/+)(B6)移植レシピエントにおいて観察された(マウスの正常BUNレベルは<5mMである)。対照的に、MASP-2(-/-)同系移植レシピエントマウスは実質的に低いBUNレベルを示した。このことは腎機能の改善を示唆している。これらの結果はWT(+/+)腎臓ドナーからの移植片を用いて得られたことに注目する。このことから、治療利益を実現するためには、移植レシピエントだけに機能的レクチン経路が存在しないことで十分であることが示唆される。
本実施例は、MASP-2(-/-)マウスがマウス多菌性敗血症腹膜炎(Polymicrobial Septic Peritonitis)モデルにおける敗血症ショックに対して耐性があることを証明する。
感染におけるMASP-2(-/-)の潜在的な効果を評価するために、多菌性敗血症腹膜炎モデルである腸管穿孔(CLP)モデルを評価した。このモデルは、ヒト敗血症腹膜炎の経過を最も正確に模倣すると考えられている。腸管穿孔(CLP)モデルは、盲腸を結紮し、針で穴を開け、細菌が腹腔に連続して漏出し、リンパドレナージを通って血液に到達し、次いで、全ての腹部臓器に分配され、多臓器不全および敗血症ショックを引き起こすモデルである(Eskandari et al.,J Immunol 148(9):2724-2730(1992))。CLPモデルは患者において観察される敗血症の経過を模倣し、初期の超炎症反応の後に顕著な低炎症期を誘導する。この期間、動物は細菌曝露に対して高感受性になる(Wichterman et al., J. Surg. Res. 29(2):189-201(1980))。
腸管穿孔(CLP)モデルを用いた多菌性感染の死亡率をWT(+/+)(n=18)およびMASP-2(-/-)(n=16)マウスにおいて測定した。簡単に述べると、MASP-2欠損マウスおよびその野生型同腹仔に麻酔をかけ、盲腸を体外に出し、遠位端の30%上側で結紮した。その後に、盲腸に0.4mm直径の針で1回、穴を開けた。次いで、盲腸を腹腔の元の場所に戻し、皮膚を鉗子で閉じた。CLPに供されたマウスの生存を、CLP後、14日間にわたってモニタリングした。細菌量を測定するために、CLPの16時間後にマウスにおいて腹膜洗浄液を収集した。腹膜洗浄液の段階希釈液をPBSで調製し、ミュラー・ヒントンプレートに接種し、その後に、嫌気条件下で37℃で24時間インキュベートした。この後に細菌量を求めた。
図18は、CLP手順後の日数の関数としてのCLP処置動物の生存率(%)を図示する。図18に示したように、MASP-2(-/-)マウスにおけるレクチン経路欠損は、腸管穿孔モデルを用いた多菌性感染後のマウス死亡率をWT(+/+)マウスと比較して向上させない。しかしながら、図19に示したように、MASP-2(-/-)マウスは、WT(+/+)同腹仔と比較した場合にCLP後に腹膜洗浄液中に有意に多い細菌量(細菌数の約1000倍の増加)を示した。これらの結果から、MASP-2(-/-)欠損マウスは敗血症ショックに対して耐性があることが分かる。C3沈着がMASP-2依存性であると証明されたので、このモデルにおけるMASP-2欠損マウスの細菌クリアランスの低下は、C3bによって媒介される食作用の障害が原因である可能性がある。
本実施例は、マウス鼻腔内感染モデルにおけるMASP-2(-/-)マウスの分析について述べる。
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は、広範囲の感染、特に、免疫無防備状態の個体における広範囲の感染の原因となるグラム陰性日和見性ヒト細菌病原体である。緑膿菌は、後天的な院内感染、特に、院内感染肺炎の主な原因である。緑膿菌はまた嚢胞性線維症(CF)患者における高い罹病率および死亡率の原因でもある。緑膿菌肺感染は、広範囲の組織損傷をもたらす強力な好中球動員および激しい肺炎症を特徴とする(Palanki M.S. et al., J. Med. Chem 51:1546-1559(2008))。
22匹のWT(+/+)マウス、22匹のMASP-2(-/-)マウス、および11匹のC3(-/-)マウスに緑膿菌細菌株が鼻腔内投与された。マウスを感染後6日にわたってモニタリングし、生存率(%)を示すカプラン・マイヤープロットを構築した。
図20は、感染6日後のWT(+/+)、MASP-2(-/-)、またはC3(-/-)マウスの生存率(%)のカプラン・マイヤープロットである。図20に示したように、MASP-2(-/-)マウス対WT(+/+)マウスにおいて差違は観察されなかった。しかしながら、C3(-/-)マウスにおいて古典的(C1q)経路を除去すると、細菌感染に対する重篤な感受性が生じた。これらの結果から、MASP-2阻害は細菌感染に対する感受性を向上させないことが証明される。このことから、古典的補体経路を用いて感染と闘う患者の能力を損なうことなく、MASP-2を阻害することによって、外傷患者における望ましくない炎症性合併症を低減することが可能であると分かる。
本実施例は、実施例10に記載のように特定された代表的な高親和性抗MASP-2 Fab2抗体の薬力学的分析について述べる。
実施例10に記載のように、ラットレクチン経路を遮断する高親和性抗体を特定するために、ラットMASP-2タンパク質を用いてファージディスプレイライブラリーをパンニングした。このライブラリーは大きな免疫学的多様性を提供するように設計され、完全ヒトイムノグロビン(immunoglobin)遺伝子配列を用いて構築された。実施例10に記載のように、ラットMASP-2タンパク質と高親和性で結合する約250個の個々のファージクローンをELISAスクリーニングによって特定した。これらのクローンの配列決定によって、50個のユニークなMASP-2抗体コードファージが特定された。これらのクローンからFab2タンパク質を発現させ、精製し、MASP-2結合親和性およびレクチン補体経路機能阻害について分析した。
実施例10に記載のように、ラットMASP-2タンパク質を用いてFabファージディスプレイライブラリーをパンニングした。これから、Fab2#11を特定した。ラットIgG2cおよびマウスIgG2a完全長抗体アイソタイプ変種はFab2#11から得られた。ラットIgG2cおよびマウスIgG2a完全長抗体アイソタイプを、以下の通り薬力学パラメータについてインビボで特徴付けた。
インビボでの血漿レクチン経路活性に対する抗MASP-2抗体投与の効果を調べるために、マウスにおいて薬力学的研究を行った。この研究では、0.3mg/kgまたは1.0mg/kgのマウス抗MASP-2 MoAb(Fab2#11に由来するマウスIgG2a完全長抗体アイソタイプ)の皮下(sc)投与後および腹腔内(ip)投与後の様々な時点で、C4沈着をレクチン経路アッセイ法においてエクスビボで測定した。
本実施例は、加齢黄斑変性のマウスモデルにおける有効性についてのFab2#11に由来するマウス抗MASP-2 Moabの分析について述べる。
実施例10に記載のように、ラットMASP-2タンパク質を用いてFabファージディスプレイライブラリーをパンニングした。これから、Fab2#11を機能的に活性な抗体として特定した。ラットIgG2cおよびマウスIgG2aアイソタイプの完全長抗体はFab2#11から得られた。実施例19に記載のように、マウスIgG2aアイソタイプの完全長抗MASP-2抗体の薬力学パラメータを特徴付けた。本実施例では、Fab2#11に由来するマウス抗MASP-2完全長抗体を、Bora P.S. et al., J Immunol 174:491-497(2005)に記載の加齢黄斑変性(AMD)のマウスモデルにおいて分析した。
実施例19に記載のようにFab2#11に由来するマウスIgG2a完全長抗MASP-2抗体アイソタイプを、以下の変更を加えて実施例13に記載のように加齢黄斑変性(AMD)のマウスモデルにおいて試験した。
アイソタイプ対照MoAb処置と一緒に、2つの異なる用量(0.3mg/kgおよび1.0mg/kg)のマウス抗MASP-2 MoAbをCNV誘導の16時間前にWT(+/+)マウス(n=8マウス/群)にip注射した。
実施例13に記載のように、脈絡膜血管新生(CNV)の誘導およびCNV体積の測定をレーザー光凝固を用いて行った。
図23は、アイソタイプ対照MoAbまたはマウス抗MASP-2 MoAb(0.3mg/kgおよび1.0mg/kg)で処置されたマウスにおけるレーザー損傷の7日後に測定されたCNV面積を図示する。図23に示したように、1.0mg/kg抗MASP-2 MoAbで前処置されたマウスでは、レーザー処置の7日後に統計的に有意な(p<0.01)約50%のCNV縮小が観察された。図23にさらに示したように、0.3mg/kg用量の抗MASP-2 MoAbがCNV縮小において有効でないことが観察された。実施例19に記載のように、およびに図21に示したように、0.3mg/kg用量の抗MASP-2 MoAbは、皮下投与後に部分的および一過的なC4b沈着阻害を有すると示されたことに注目する。
本実施例は、MASP-2欠損マウスが髄膜炎菌感染後の髄膜炎菌誘導死から保護され、野生型対照マウスと比較して菌血症のクリアランスを増強したことを証明する。
髄膜炎菌は、髄膜炎および他の形態の髄膜炎菌性疾患、例えば、髄膜炎菌血症における役割で知られている従属栄養グラム陰性双球菌細菌である。髄膜炎菌は、小児期における罹病および死亡の主な原因の一つである。重篤な合併症には、敗血症、ウォーターハウス・フリーデリクセン症候群、副腎不全、および播種性血管内凝固(DIC)が含まれる。例えば、Rintala E. et al., Critical Care Medicine 28(7):2373-2378(2000)を参照されたい。本実施例では、MASP-2欠損マウスが髄膜炎菌誘導死にかかりやすいかどうか取り扱うために、MASP-2(-/-)マウスおよびWT(+/+)マウスにおいてレクチン経路の役割を分析した。
MASP-2ノックアウトマウスを実施例1に記載のように生成し、少なくとも10世代にわたってC57B1/6と戻し交配した。400mg/kgの鉄デキストランに溶解した投与量5×108cfu/100μl、2×108cfu/100μl、または3×107cfu/100μlの髄膜炎菌血清群A Z2491を用いた静脈内注射によって、10週齢MASP-2 KOマウス(n=10)および野生型C57/B6マウス(n=10)に接種した。感染後のマウスの生存を、72時間の期間にわたってモニタリングした。感染を検証し、血清からの細菌クリアランスの割合を決定するために、感染後1時間おきにマウスから血液試料を採取し、分析して、髄膜炎菌の血清レベル(log cfu/ml)を求めた。
図24Aは、感染用量5×108/100μl cfuの髄膜炎菌を投与した後のMASP-2 KOマウスおよびWTマウスの生存率(%)を図示する。図24Aに示したように、最高用量5×108/100μl cfuの髄膜炎菌に感染させた後、感染後72時間の期間全体を通じてMASP-2 KO マウスの100%が生存した。対照的に、感染24時間後にWTマウスのうち20%しか生存していなかった。これらの結果から、MASP-2欠損マウスは髄膜炎菌誘導死から保護されることが証明される。
これらの結果から、MASP-2欠損マウスは髄膜炎菌誘導死から保護され、WTマウスと比較して菌血症のクリアランスを増強したことが分かる。従って、これらの結果を考慮して、MASP-2 MoAbなどのMASP-2阻害体の治療適用は、髄膜炎菌細菌への感染(すなわち、敗血症およびDIC)を治療する、予防する、またはその影響を軽減するのに有効であると予想される。さらに、これらの結果から、MASP-2 MoAbなどのMASP-2阻害体の治療適用は、対象に髄膜炎菌感染にかかるリスクを増大させないことが分かる。
本実施例は、新規のレクチン経路によって媒介され、かつMASP-2依存性のC4バイパス補体C3活性化の発見について述べる。
補体活性化阻害体を用いて心筋虚血/再灌流傷害(MIRI)を制限する主な治療利益は、20年前に、心筋梗塞の実験ラットモデルにおいて説得力をもって証明された。細胞表面補体受容体1型(CR1)の可溶性切断型誘導体である組換えsCR1が静脈内投与され、その効果がMIRIのラットインビボモデルにおいて評価された。sCR1による治療は梗塞体積を40%超縮小させた(Weisman, H.F., et al., Science 249:146-151(1990))。その後、この組換え阻害体の治療可能性は臨床試験において証明され、MI患者にsCR1を投与すると虚血後心臓における収縮不全が阻止されることが示された(Shandelya, S., et al., Circulation 87:536-546(1993))。しかしながら、虚血組織における補体活性化につながる主な機構は、適切な実験モデルが無く、酸素欠乏細胞の補体活性化つながる分子プロセスならびに異なる補体活性化経路間のクロストークおよび相乗作用が十分に理解されていないことが主な原因で最終的に明確にされていない。
MASP-2欠損マウスは肉眼的異常を示さない
MASP-2欠損マウスを実施例1に記載のように生成した。ヘテロ(+/-)MASP-2欠損マウスおよびホモ(-/-)MASP-2欠損マウスはいずれも健康であり、かつ生殖能力があり、肉眼的異常を示さない。MASP-2欠損マウスの平均余命はWT同腹仔の平均余命(>18ヶ月)とほぼ同じである。疾患実験モデルにおいてこれらのマウスの表現型を試験する前に、本発明者らのMASP-2-/-系統を11世代にわたってC57B1/6バックグラウンドと戻し交配した。MASP-2 mRNAが全く存在しないことが、ポリA+で選択された肝臓RNA調製物のノザンブロッティングによって確認されたのに対して、MAp19またはsMAP(MASP2遺伝子の切断型オルタナティブスプライシング産物)をコードする1.2kb mRNAは豊富に発現していた。
MASP-2はレクチン経路機能活性に不可欠である
実施例2に記載のように、および図5に示したように、MASP-2-/-血漿のインビトロ分析から、C4活性化のためにマンナンコーティング表面およびザイモサンコーティング表面を活性化した場合に、レクチン経路機能活性が全く存在しないことが分かった。同様に、MASP-2-/-血漿中には、N-アセチルグルコサミンでコーティングされた表面上においてレクチン経路依存性のC4切断もC3切断も検出できなかった。N-アセチルグルコサミンはMBL A、MBL C、およびフィコリンAに結合し、これらを介して活性化を誘発する(データ示さず)。
MIRIへのレクチン経路機能活性の寄与を研究するために、本発明者らは、冠状動脈左前下行枝(LAD)の一過的な結紮および再灌流後のMIRIモデルにおいてMASP-2-/-マウスおよびWT同腹仔対照を比較した。補体C4の有無はMIRIにおける虚血組織消失の程度に影響を及ぼさない。本発明者らは、実験MIRI後の心筋壊死域に対するC4欠損の影響を評価した。図27Aおよび図27Bに示したように、C4欠損マウスおよびそのWT同腹仔の両方において同一の心筋壊死域が観察された。図27Aは、C4-/-マウス(n=6)および対応するWT同腹仔対照(n=7)におけるLAD結紮および再灌流後のMIRI誘導性組織消失を図示する。図27BはAARの関数としてのINFを図示し、C4-/-マウスがWT対照(破線)と同程度にMIRIを受けやすいことをはっきりと証明する。
C4欠損モルモット血清中にC4バイパス活性化経路が存在することを示した歴史的報告に勇気づけられて(May, J.E., and M Frank, J. Immunol. 111:1671-1677(1973))、本発明者らは、C4欠損マウスに、残存する古典経路機能活性またはレクチン経路機能活性があり得るかどうかを分析し、第二経路の寄与を排除する経路特異的アッセイ条件下でC3活性化をモニタリングした。
本実施例に記載の結果から、MASP-2機能活性は、C4存在下およびC4非存在下の両方でレクチン経路を介したC3活性化に不可欠なことが強く示唆される。さらに、この新規のレクチン経路特異的なC4バイパスC3活性化経路が働くためにはC2およびMASP-1が必要とされる。MASP-2-/-血漿ならびにC4-/-血漿におけるレクチン経路機能活性の比較分析から、以前は認められていなかった、C4非依存性であるが、MASP-2依存性の補体C3活性化経路の存在が明らかになり、C4が全く存在しなくてもレクチン経路依存形式でC3を活性化できることが分かった。この新規のMASP-2依存性C3コンバターゼの詳細な分子組成および活性化事象の順序はまだ解明されていないが、本発明者らの結果は、このC4バイパス活性化経路がさらに補体C2ならびにMASP-1の存在を必要とすることを意味する。C4およびMASP-1/3複合欠損のあるマウスの血漿中で、レクチン経路を介したC3切断活性が失われたのは、MASP-1がMASP-2を直接切断し、活性化することによってMASP-2依存性補体活性化を増強するという、ごく最近、述べられた役割から説明がつく可能性がある(Takahashi, M., et al., J. Immunol. 180:6132-6138(2008))。同様に、MASP-1は、C2を切断する能力によってMASP-2機能活性を助ける可能性がある(Moller-Kristensen, et al., Int. Immunol. 19:141-149(2007))。両活性が、MASP-1/3欠損血漿がレクチン活性化経路を介してC3を切断する速度の低下と、C4バイパス活性化経路を介してC3変換を維持するのにMASP-1が必要とされ得る理由の説明となる可能性がある。
本実施例は、WT(+/+)、MASP-2(-/-)、F11(-/-)、F11/C4(-/-)、およびC4(-/-)マウスにおけるトロンビン基質によるC3活性化およびマンナン上へのC3沈着について述べる。
実施例14に記載のように、トロンビン活性化は生理学的条件下でレクチン経路活性化後に起こり、MASP-2が関与する程度を証明することが判明した。C3は補体系活性化において中心的な役割を果たす。C3活性化は古典補体活性化経路および第二補体活性化経路の両方に必要とされる。C3がトロンビン基質によって活性化されるかどうかを判定するために、実験を行った。
トロンビン基質によるC3活性化
C3活性化を、以下の活性化型トロンビン基質:ヒトFCXIa、ヒトFVIIa、ウシFXa、ヒトFXa、ヒト活性化タンパク質C、およびヒトトロンビンの存在下で測定した。C3を様々なトロンビン基質とインキュベートし、次いで、10%SDS-ポリアクリルアミドゲル上で還元条件下で分離した。セルロース膜を用いた電気泳動移動後に、膜をモノクローナルビオチン結合ラット抗マウスC3とインキュベートし、ストレプトアビジン-HRPキットを用いて検出し、ECL試薬を用いて発色させた。
C3活性化には、インタクトなa鎖が切断型a'鎖および可溶性C3aに切断されることが必要である(図30に示していない)。図30は、トロンビン基質によるヒトC3活性化に関するウエスタンブロット分析の結果を示す。切断されていないC3α鎖および活性化産物a'鎖を矢印で示した。図30に示したように、インビトロで、C3を活性化型ヒト凝固因子XIおよび第X因子ならびに活性化ウシ凝固因子Xとインキュベートすると、補体プロテアーゼの非存在下でC3を切断することができる。
WT、MASP-2(-/-)、F11(-/-)、F11(-/-)/C4(-/-)、およびC4(-/-)から得られた血清試料に対してC3沈着アッセイ法を行った。F11は、凝固因子XIをコードする遺伝子である。C3活性化を測定するために、マイクロタイタープレートをマンナン(1μg/ウェル)でコーティングし、次いで、TBS/tween/Ca2+に溶解したヒツジ抗HSA血清(2μg/ml)を添加した。プレートを、TBSに溶解した0.1%HSAでブロックし、前記のように洗浄した。血漿試料を、4mMバルビタール、145mM NaCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、pH7.4で希釈し、プレートに添加し、37℃で1.5時間インキュベートした。洗浄後、結合しているC3bを、ウサギ抗ヒトC3c(Dako)を用いて、その後にアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギIgGおよびpNPPを用いて検出した。
図31は、WT、MASP-2(-/-)、F11(-/-)、F11(-/-)/C4(-/-)、およびC4(-/-)から得られた血清試料に対するC3沈着アッセイ法の結果を示す。図31に示したように、C4が全く存在しなくても機能的レクチン経路がある。さらに図31に示したように、この新規のレクチン経路依存性補体活性化は凝固因子XIを必要とする。
この実験において得られた結果の前に、補体のレクチン経路は活性のためにC4を必要とすると当業者に考えられていた。従って、C4ノックアウトマウス(およびC4欠損ヒト)からのデータは、このような生物が(古典経路欠損に加えて)レクチン経路を欠損していると仮定して解釈された。本結果から、この考えは間違っていると証明された。従って、C4欠損動物の表現型に基づいて、ある特定の疾患状況においてレクチン経路が重要でないことを示唆した過去の研究の結論は間違っている可能性がある。本実施例に記載のデータから、全血清の生理学的な文脈の中で、レクチン経路は凝固カスケードの成分を活性化できることも分かる。従って、MASP-2が関与する、補体と凝固との間のクロストークがあることが証明される。
本実施例は、発作性夜間血色素尿症(PNH)患者から得られた血液試料に由来する赤血球の溶解に対する抗MASP-2抗体の効果を評価する方法について述べる。
発作性夜間血色素尿症(PNH)はマルキアファーヴァ・ミケーリ症候群とも呼ばれ、補体誘導性の血管内溶血性貧血を特徴とする、後天的な、潜在的に命にかかわる血液疾患である。PNHの顕著な特徴は、補体第二経路が無秩序に活性化した結果である慢性的な血管内溶血である。Lindorfor, M.A., et al., Blood 115(11)(2010)。PNHにおける貧血は血流中の赤血球の破壊が原因である。PNHの症状には、尿中のヘモグロビンの出現による赤色尿、および血栓症が含まれる。PNHは自然発症することがあり、これは「一次PNH」と呼ばれる、または再生不良性貧血などの他の骨髄障害の状況では「二次PNH」と呼ばれる。PNHの治療には、貧血の場合は輸血、血栓症の場合は血液凝固阻止、および補体系を阻害することによって免疫破壊から血球を保護するモノクローナル抗体エクリズマブ(Soliris)の使用(Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med. 350(6) 552-9(2004))が含まれる。しかしながら、エクリズマブで治療されたPNH患者のかなりの部分には、臨床的に意義のある免疫を介した溶血性貧血が残る。なぜなら、この抗体は補体第二経路の活性化を遮断しないからである。
試薬:
正常ドナーに由来する赤血球およびPNHに罹患している患者(Solirisで治療されていない)に由来する赤血球を静脈穿刺によって入手し、本明細書に参照により組み入れられる、Wilcox, L.A., et al., Blood 78:820-829(1991)に記載のように調製する。レクチン経路の機能遮断活性を有する抗MASP-2抗体は、実施例10に記載のように生成することができる。
PNH患者に由来する赤血球の溶血を遮断する能力に対する抗MASP-2抗体の効果を判定するための方法は、Lindorfer, M.A., et al., Blood 15(11):2283-91(2010)およびWilcox, L.A., et al., Blood 78:820-829(191)に記載の方法を用いて行われる。両参照文献とも本明細書に参照により組み入れられる。Lindorfer et al.に記載のように、PNH患者試料に由来する赤血球を遠心分離し、バフィーコートを吸引し、それぞれの実験の前に細胞をゼラチンベロナール緩衝液(GVB)で洗浄する。以下のように、赤血球を、APCを介した溶解に対する感受性について試験する。ABO型が同じ正常ヒト血清を、0.15mM CaCl2および0.5mM MgCl2を含有するGVB(GVB+2)で希釈し、pH6.4まで酸性化し(酸性化NHS、aNHS)、これを用いて、赤血球を50%aNHSに溶解して1.6%のヘマトクリットまで再構成する。次いで、混合物を37℃でインキュベートし、1時間後、赤血球を遠心分離によってペレット化する。回収された上清のアリコートの光学密度を405nMで測定し、これを用いて溶解率(%)を算出する。酸性化血清-EDTA中で再構成された試料を同様に処理し、これを用いて、バックグラウンドの補体によって媒介されなかった溶解(典型的には、3%未満)を規定する。完全溶解(100%)は、赤血球を蒸留水中でインキュベートした後に求められる。
本実施例は、クリオグロブリン血症に罹患している患者から得られた血液試料中のクリオグロブリンによる補体活性化に対する抗MASP-2遮断抗体の効果を評価する方法について述べる。
クリオグロブリン血症は血清中のクリオグロブリンの存在を特徴とする。クリオグロブリンは、低温で可逆的に凝集する1種類または混合性の免疫グロブリン(典型的にはIgM抗体)である。凝集は、古典経路の補体活性化および血管床、特に、周辺部における炎症につながる。クリオグロブリン血症の臨床症状には脈管炎および糸球体腎炎が含まれる。
クリオグロブリン血症の副作用を遮断する能力に対する抗MASP-2抗体の効果を判定するための方法は、本明細書に参照により組み入れられるNg Y.C. et al., Arthritis and Rheumatism 31(1):99-107(1988)に記載のように液相C3変換アッセイ法を用いて行われる。Ng et al.,に記載のように、本態性混合型クリオグロブリン血症(EMC)では、モノクローナルリウマチ因子(mRF)、通常、IgMはポリクローナルIgGと複合体を形成して、特徴的な寒冷沈降物免疫複合体(IC)(II型クリオグロブリン)を形成する。免疫グロブリンおよびC3は、皮膚、神経、および腎臓などの患部組織の血管壁にあることが証明されている。Ng et al.,に記載のように、125I標識mRFを、血清(正常ヒト血清およびクリオグロブリン血症に罹患している患者から得られた血清)に添加し、37℃でインキュベートし、赤血球との結合を測定する。
本実施例は、貧血として発現した寒冷凝集素症患者から得られた血液試料に対する抗MASP-2抗体の効果を評価する方法について述べる。
寒冷凝集素症(CAD)は自己免疫性溶血性貧血の一種である。寒冷凝集素抗体(通常、IgM)は低温によって活性化され、赤血球に結合し、赤血球を凝集させる。寒冷凝集素抗体は補体と一緒になって、赤血球の表面にある抗原を攻撃する。これは、細網内皮系による赤血球クリアランスを誘発する赤血球オプソニン化(opsoniation)(溶血)を引き起こす。凝集が起こる温度は患者ごとに異なる。
試薬:
正常ドナーに由来する赤血球およびCADに罹患している患者を静脈穿刺によって入手する。レクチン経路の機能遮断活性を有する抗MASP-2抗体は実施例10に記載のように生成することができる。
本実施例は、非定型溶血性***症候群(aHUS)マウスから得られた血液試料中の赤血球の溶解に対する抗MASP-2抗体の効果を評価する方法について述べる。
非定型溶血性***症候群(aHUS)は、溶血性貧血、血小板減少、ならびに腎臓および他の臓器の微小循環中の血小板血栓によって引き起こされる腎不全を特徴とする。aHUSは不完全な補体調節に関連し、散発性または家族性であり得る。aHUSは、補体因子H、メンブレンコファクターBおよびI因子、ならびに補体因子H関連1(CFHR1)および補体因子H関連3(CFHR3)を含む補体活性化をコードする遺伝子の変異に関連する。Zipfel, P.F., et al., PloS Genetics 3(3):e41(2007)。本実施例は、aHUSマウスから得られた血液試料に由来する赤血球の溶解に対する抗MASP-2抗体の効果を評価する方法について述べる。
内因性マウスfH遺伝子が、aHUS患者においてよく見られる変異体型fHをコードするヒトホモログで置換されている、この疾患のマウスモデルにおいて、抗MASP-2抗体がaHUSを治療する効果を判定することができる。本明細書に参照により組み入れられる、Pickering M.C. et al., J. Exp. Med. 204(6):1249-1256(2007)を参照されたい。Pickering et al.,に記載のように、このようなマウスはaHUS様の病態を発症する。aHUS治療のための抗MASP-2抗体の効果を評価するために、抗MASP-2抗体を変異aHUSマウスに投与し、抗MASP-2 ab処置対照および未処置対照から得られた赤血球の溶解を比較する。抗MASP-2抗体は、レクチン経路活性化を遮断することが示されている事実を考慮して、aHUSに罹患している哺乳動物対象における赤血球の溶解の遮断において有効だと予想される。
本実施例は、緑内障治療のために抗MASP-2抗体の効果を評価する方法について述べる。
制御されていない補体活性化は、緑内障における網膜神経節細胞(RGC)、そのシナプスおよび軸索への変性損傷の進行の一因となることが示されている。Tezel G. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 51:5071-5082(2010)を参照されたい。例えば、ヒト組織の病理組織学的研究および様々な動物モデルを用いたインビボ研究から、緑内障網膜においてC1qおよびC3を含む補体成分が合成され、終末補体複合体が形成されることが証明されている(Stasi K. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 47:1024-1029(2006)、Kuehn M.H. et al., Exp Eye Res 83:620-628(2006)を参照されたい)。Kuehn M.H. et al., Experimental Eye Research 87:89-95(2008)においてさらに記載されるように、補体の合成および沈着は網膜I/Rによって誘導され、補体カスケードの破壊はRGC変性を遅延する。この研究において、補体成分C3が標的破壊されたマウスは、正常動物と比較した場合に一過的な網膜I/R後にRGC変性の遅延を示すことが見出された。
RGC変性に対する抗MASP-2抗体の効果を判定するための方法は、本明細書に参照により組み入れられる、Kuehn M.H. et al., Experimental Eye Research 87:89-95(2008)に記載のように網膜I/Rの動物モデルにおいて行われる。Kuehn et al.,に記載のように、網膜虚血は、動物に麻酔をかけ、次いで、リン酸緩衝食塩水を含有するリザーバーとつながっている30ゲージ針を角膜に通して眼の前眼房に挿入することによって誘導される。次いで、網膜脈管構造を通る循環を完全に阻止するのに十分な104mmHgの眼内圧となるように、食塩水リザーバーを持ち上げる。眼内虚血の増大は虹彩および網膜の脱色(blanching)によって確認され、虚血は左眼のみで45分間維持される。右目は対照として役立ち、カニューレ処置を受けない。次いで、虚血発作の1週間後または3週間後にマウスを安楽死させる。虚血発作前に投与される抗MASP抗体の効果を評価するために、抗MASP-2抗体をマウスの眼に局所投与するか、全身投与する。
Kuehn et al.,に記載のように、正常対照マウスでは、一過的な網膜虚血が、視神経の変成変化ならびに免疫組織化学により検出可能なC1qおよびC3の網膜沈着をもたらす。対照的に、C3欠損マウスは軸索変性の著しい低減を示し、誘導の1週間後に、ごくわずかなレベルの視神経損傷しか示さなかった。これらの結果に基づいて、このアッセイ法がMASP-2ノックアウトマウスにおいて行われた場合、および抗MASP-2抗体が虚血発作前に正常マウスに投与された場合には同様の結果が観察されると予想される。
本実施例は、抗MASP-2抗体などのMASP-2阻害体が放射線曝露の治療および/または急性放射線症候群の治療、寛解、もしくは予防に有効であることを証明する。
高線量の電離放射線に曝露されると、2つの主な機構:骨髄に対する毒性および胃腸症候群によって死が引き起こされる。骨髄毒性は全ての血液細胞を減少させ、生物は感染および出血によって死亡しやすくなる。胃腸症候群の方がひどく、消化管上皮層が破壊され、腸内分泌機能が失われることが原因で腸のバリア機能が失われることで誘導される。これは、死を招き得る敗血症および関連する全身炎症反応症候群につながる。
材料
この研究において用いられた試験物品は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞において産生されたレクチン補体経路のMASP-2タンパク質成分を遮断する、(i)高親和性抗マウスMASP-2抗体(mAbM11)および(ii)高親和性抗ヒトMASP-2抗体(mAbH6)であった。投与濃度は、1mg/kgの抗マウスMASP-2抗体(mAbM11)、5mg/kgの抗ヒトMASP-2抗体(mAbH6)、または滅菌食塩水であった。それぞれの投与セッションのために、十分な量の新鮮な投与溶液を調製した。
若い成獣雄Swiss-WebsterマウスをHarlan Laboratories(Houston, TX)から入手した。動物を、Alpha-Dri床敷を入れたソリッドボトムケージに収容し、保証されたPMI 5002 Rodent Diet(Animal Specialties, Inc., Hubbard OR)および水を自由に与えた。温度をモニタリングし、動物飼育室を12時間明/12時間暗の光周期で稼働した。
マウスを施設内で2週間、順化させた後に、320kV高安定X線発生装置、金属セラミックX線管、可変X線ビームコリメータ、およびフィルターを備えたTherapax X-RAD 320システム(Precision X-ray Incorporated, East Haven, CT)を用いて、10匹からなる群における線量率0.78Gy/minの全身曝露によって6.5Gyおよび7.0Gyの放射線を照射した。線量レベルは、LD50/30が6.5Gy〜7.0Gyであることを示した、同じ系統のマウスを用いて行われた以前の研究(データ示さず)に基づいて選択された。
プロトコールに従って、適切な体積の濃縮原液を氷冷食塩水で希釈して0.2mg/mlの抗マウスMASP-2抗体(mAbM11)または0.5mg/mlの抗ヒトMASP-2抗体(mAbH6)の投与溶液を調製した。抗MASP-2抗体mAbM11およびmAbH6の投与は、動物体重に基づいて1mg/kgのmAbM11、5mg/kgのmAbH6、または食塩水ビヒクルを送達するように25ゲージ針を用いてIP注射を介して行った。
表8に記載のように、マウスを群に無作為に割り当てた。体重および温度を毎日、測定および記録した。照射後7日目に群7、群11、および群13のマウスを屠殺し、血液を深麻酔下での心臓穿刺によって収集した。照射後30日目に生存している動物を同様に屠殺し、血液を収集した。収集された血液試料から、プロトコールに従って血漿を調製し、分析のためにスポンサーに返した。
カプラン・マイヤー生存曲線を作成し、ログランク法およびウィルコクソン法を用いて処置群間の平均生存期間を比較するのに使用した。平均と標準偏差、または平均と平均の標準誤差を報告する。統計比較は、照射された対照動物と個々の処置群との間で両側独立t検定(two-tailed unpaired t-test)を用いて行った。
7.0Gy曝露群および6.5Gy曝露群のカプラン・マイヤー生存プロットを、それぞれ、図32Aおよび図32Bに示し、以下の表9にまとめた。全体的に見て、照射前に抗マウスMASP-2 ab(mAbM11)で処置すると、ビヒクル処置された照射対照動物と比較して照射マウスの生存が6.5Gy(20%向上)および7.0Gy(30%向上)曝露レベルの両方において向上した。6.5Gy曝露レベルでは、照射後に抗マウスMASP-2 abで処置すると、ビヒクル対照照射動物と比較して生存が中程度に(15%) 向上した。
急性放射線症候群は、3つの規定された亜症候群(subsyndrome)からなる:造血亜症候群、胃腸亜症候群、および脳血管亜症候群。観察される症候群は放射線線量によって決まり、造血影響は、1Gyを超える著しい部分的放射線曝露または全身放射線曝露を受けたヒトにおいて観察される。造血症候群は、免疫系への損傷と同時に発生する、血球数、赤血球および白血球ならびに血小板の変化を伴う汎血球減少につながる重篤な骨髄機能低下を特徴とする。底が発生した場合に、末梢血に好中球および血小板はほとんど存在せず、好中球減少、発熱、敗血症の合併症、および制御できない出血が死につながる。
本実施例は、MASP-2欠損マウスが、髄膜炎菌血清群Aまたは髄膜炎菌血清群Bに感染した後に髄膜炎菌誘導死から保護されることを証明する。
MASP-2ノックアウトマウス(MASP-2 KOマウス)を実施例1に記載のように生成した。100μl体積で投与量2.6×107CFUの髄膜炎菌血清群A Z2491を腹腔内(i.p.)注射することによって、10週齢MASP-2 KOマウス(n=10)および野生型(WT)C57/BL6マウス(n=10)に接種した。感染用量を、最終濃度400mg/kgの鉄デキストランと一緒にマウスに投与した。72時間の期間にわたって感染後のマウスの生存をモニタリングした。
図33は、感染用量2.6×107cfuの髄膜炎菌血清群A Z2491を投与させた後のMASP-2 KOマウスおよびWTマウスの生存率(%)を図示したカプラン・マイヤープロットである。図33に示したように、感染後72時間の期間全体を通じて100%のMASP-2 KOマウスが生存した。対照的に、感染24時間後、WTマウスの80%しか生存しておらず(p=0.012)、感染72時間後、WTマウスの50%しか生存していなかった。これらの結果から、MASP-2欠損マウスは髄膜炎菌血清群A Z2491誘導死から保護されることが証明される。
本実施例は、髄膜炎菌感染後の抗MASP-2抗体投与が髄膜炎菌に感染したマウスの生存を向上させることを証明する。
実施例10に記載のように、ラットMASP-2タンパク質を用いてFabファージディスプレイライブラリーをパンニングした。これから、Fab2#11を、機能的に活性な抗体として特定した。ラットIgG2cおよびマウスIgG2aアイソタイプの完全長抗体はFab2#11から生成された。(実施例19に記載のように)マウスIgG2aアイソタイプの完全長抗MASP-2抗体の薬力学パラメータを特徴付けた。
前記のように生成された、Fab2#11に由来するマウスIgG2a完全長抗MASP-2抗体アイソタイプを、以下のように髄膜炎菌感染のマウスモデルにおいて試験した。
高用量(4×106cfu)の髄膜炎菌血清群B MC58株によるi.p.注射の3時間後に、9週間齢C57/BL6 Charles Riverマウスを、阻害性マウス抗MASP-2抗体(1.0mg/kg)(n=12)または対照アイソタイプ抗体(n=10)で処置した。
図37は、感染用量4×106cfuの髄膜炎菌血清群B MC58株を投与した後、感染3時間後に阻害性抗MASP-2抗体(1.0mg/kg)または対照アイソタイプ抗体を投与したマウスの生存率(%)を図示したカプラン・マイヤーである。図37に示したように、感染後72時間の期間全体を通じて抗MASP-2抗体で処置されたマウスの90%は生存した。対照的に、感染後72時間の期間全体を通じてアイソタイプ対照抗体で処置されたマウスの50%しか生存しなかった。記号「*」は、2つの生存曲線の比較によって求められた場合、p=0.0301を示す。
本実施例は、抗MASP-2抗体の投与がヒト血清中の髄膜炎菌感染を治療するのに有効であることを証明する。
機能的MBLの血清レベルが低い患者は反復性の細菌感染および真菌感染に対して高い感受性を示す(Kilpatrick et al., Biochim Biophys Acta 1572:401-413(2002))。髄膜炎菌はMBLによって認識されることが公知であり、MBL欠損血清はナイセリア属を溶解しないことが示されている。
1.様々な補体欠損ヒト血清におけるおよびヒト抗MASP-2抗体で処理されたヒト血清における血清殺菌活性
図38は、表11に示したヒト血清試料中にある様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B-MC58の生菌数のlog cfu/mLを図示する。表12は図38のスチューデントt検定結果を示す。
この実験では、以下の補体欠損マウス血清および対照マウス血清を使用した。
図39は、表13に示したマウス血清試料中にある様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B-MC58の生菌数のlog cfu/mLを図示する。図39に示したように、MASP-2-/-マウス血清の髄膜炎菌に対する殺菌活性レベルはWTマウス血清より高い。記号「**」はp=0.0058を示す。記号「***」はp=0.001を示す。表14は図39のスチューデントt検定結果を示す。
本実施例は、発作性夜間血色素尿症(PNH)のマウスモデルから得られた血液試料に由来する赤血球の溶解に対するMASP-2欠損の阻害作用を証明する。
発作性夜間血色素尿症(PNH)はマルキアファーヴァ・ミケーリ症候群とも呼ばれ、補体誘導性の血管内溶血性貧血を特徴とする、後天的な、潜在的に命にかかわる血液疾患である。PNHの顕著な特徴は、補体制御因子CD55およびCD59がPNH赤血球上に存在しないために補体第二経路が無秩序に活性化した結果である慢性的な補体媒介性血管内溶血と、その後に起こるヘモグロビン尿症および貧血である。Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11)(2010)、Risitano, A.M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535(2011)。PNHにおける貧血は血流中の赤血球の破壊が原因である。PNHの症状には、尿中のヘモグロビンの出現による赤色尿、背部痛、疲労、息切れ、および血栓症が含まれる。PNHは自然発症することがあり、これは「一次PNH」と呼ばれる、または再生不良性貧血などの他の骨髄障害の状況では「二次PNH」と呼ばれる。PNHの治療には、貧血の場合は輸血、血栓症の場合は血液凝固阻止、および補体系を阻害することによって免疫破壊から血球を保護するモノクローナル抗体エクリズマブ(Soliris(登録商標))の使用(Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med. 350(6) 552-9(2004))が含まれる。エクリズマブ(Soliris(登録商標))は、補体成分C5を標的とし、C5コンバターゼによるC5切断を遮断し、それによって、C5aの産生およびMACの集合を阻止するヒト化モノクローナル抗体である。エクリズマブによるPNH患者の治療は、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によって測定されるように血管内溶血を低減し、そのため、患者の約半分におけるヘモグロビン安定化および輸血非依存性につながった(Hillmen P, et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol11(6)(2013))。エクリズマブ療法を受けているほぼ全員の患者においてLDHレベルが正常またはほぼ正常になったが(血管内溶血の管理のため)、患者の約1/3しか11gr/dLを超えるヘモグロビン値に達せず、エクリズマブを服用した残りの患者は中程度から重度の(すなわち、輸血依存性)貧血をほぼ同じ割合で示し続ける(Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100(2009))。Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535(2011)に記載のように、エクリズマブを服用しているPNH患者は、PNH赤血球のかなりの部分に結合しているC3断片を含んだ(が、未治療患者は含んでいなかった)ことが証明された。このことから、膜に結合しているC3はPNH赤血球に対してオプソニンとして働き、その結果、特異的C3受容体を介して細網内皮細胞内に閉じ込められ、その後に、血管外溶血が起こるという結論が導かれた。従って、C3断片を介した血管外溶血を発症している患者は赤血球輸血を必要とし続けるので、これらの患者には、エクリズマブの使用の他に治療方針が必要とされる。
PNH動物モデル:
血液試料を、CrryおよびC3が欠損している遺伝子ターゲティングマウス(Crry/C3-/-)ならびにCD55/CD59欠損マウスから入手した。これらのマウスには、それぞれの表面補体制御因子がなく、従って、これらのマウスの赤血球はPNHヒト血球と同様に自発的に補体自己融解しやすい。
1日目、マウスRBC(±マンナンコーティング)の調製
含めた材料:
新鮮なマウス血液、BBS/Mg2+/Ca2+(4.4mMバルビツール酸、1.8mMナトリウムバルビトン、145mM NaCl、pH7.4、5mM Mg2+、5mM Ca2+)、塩化クロム、CrCl3-6H2O(BBS/Mg2+/Ca2+に溶解して0.5mg/mL)、およびマンナン、BBS/Mg2+/Ca2+に溶解して100μg/mL。
材料には、BBS/ゼラチン/Mg2+/Ca2+(前記)、試験血清、96ウェル丸底プレートおよび96ウェル平底プレート、ならびに410〜414nmで96ウェルプレートを読み取る分光光度計を含めた。
CD55/CD59二重欠損マウスおよびCrry/C3二重欠損マウスの血液から新鮮血を入手し、前記のプロトコールに詳述したように赤血球を調製した。細胞を分け、細胞の半分をマンナンでコーティングし、もう半分を処理せずにしておき、最終濃度を1×108/mLまで調整した。このうち100μlを溶血アッセイ法において使用した。溶血アッセイ法は前記のように行った。
初期実験において、非コーティングWTマウス赤血球は、いかなるマウス血清中でも溶解されないことが判明した。さらに、マンナンコーティングCrry-/-マウス赤血球はWTマウス血清中ではゆっくりと溶解されるが(37℃で3時間超)、MBLヌル血清中では溶解されないことが判明した(データ示さず)。
マンナンコーティングCrry-/-マウス赤血球は、MBLを含まない高度に希釈したヒト血清ではなく、MBLを含む高度に希釈したヒト血清の中で非常によく溶解される。試験した全ての血清濃度における効率的な溶解は、第二経路がこの溶解に関与せず、必要もされないことを意味している。MBL欠損マウス血清およびヒト血清がマンナンコーティングCrry-/-マウス赤血球を溶解できないことから、古典経路も、観察された溶解と全く関係がないことが分かる。レクチン経路認識分子(すなわち、MBL)が必要とされるので、この溶解はレクチン経路によって媒介される。
Crry/C3二重欠損マウスおよびCD55/CD59二重欠損マウスから新鮮血を入手し、マンナンコーティングCrry-/-マウス赤血球を、前記のように溶血アッセイ法において以下の血清の存在下で分析した:MBLヌル;WT;ヒト抗MASP-2抗体で前処理されたNHS;および対照として熱失活NHS。
マンナンコーティングCrry-/-マウス赤血球と共にNHSを、1/640まで(すなわち、1/40、1/80、1/160、1/320、および1/640に)希釈された希釈液、ヒトMBL-/-血清、抗MASP-2mAbで前処理されたNHS、および対照として熱失活NHSの中でインキュベートした。
非コーティングCrry-/-マウス赤血球における、Crry/C3二重欠損マウスおよびCD55/CD59二重欠損マウスから得られた新鮮血を、前記のように溶血アッセイ法において、以下の血清の存在下で分析した:MBL-/-;WT血清;抗MASP-2抗体で前処理されたNHS、および対照として熱失活NHS。
図41は、熱失活(HI)NHS、MBL-/-、抗MASP-2抗体で前処理されたNHS、およびNHS対照からの血清における、ある範囲の血清濃度のヒト血清による非コーティングマウス赤血球の溶血(溶解WTマウス赤血球から上清へのヘモグロビン放出によって測定した。測光法によって測定した)を図示する。図41に示したように、阻害性MASP-2は非感作WTマウス赤血球の補体媒介性溶解を阻害することが証明された。
本実施例は、実施例29において前述された研究に対する後続の研究について述べ、MASP-2抗体などのMASP-2阻害体が、放射線曝露の治療および/または急性放射線症候群の治療、寛解、もしくは予防に有効であるという、さらなる証拠を提供する。
実施例29に記載の初期研究では、6.5Gy曝露レベルおよび7.0Gy曝露レベルの両方において、照射前にマウスに抗MASP-2抗体で処置すると、ビヒクル処置された照射対照動物と比較して照射マウスの生存が向上することが証明された。実施例29において、6.5Gy曝露レベルでは、照射後に抗MASP-2抗体で処置すると、ビヒクル対照照射動物と比較して生存が中程度に向上することがさらに証明された。本実施例は、最初の研究の結果を確認するために行われた別の放射線研究について述べる。
研究Aのデザイン:
Swiss Websterマウス(n=50)を電離放射線(8.0Gy)に曝露させた。放射線曝露の18時間前および2時間後に実施され、その後、毎週、実施された抗MASP-2抗体療法(mAbH6 5mg/kg)の死亡率に対する効果を評価した。
図43に示したように、抗MASP-2抗体mAbH6の投与によって、8.0Gyに曝露されたマウスの生存が向上し、調整された生存率中央値はビヒクル対照を与えたマウスと比較して4日から6日へと増加し、死亡率はビヒクル対照を与えたマウスと比較して12%低減した(ログランク検定、p=0.040)。
Swiss Websterマウス(n=50)を、以下の群において、電離放射線(8.0Gy)に曝露させた:(I:ビヒクル)食塩水対照;(II:低)抗MASP-2抗体mAbH6(5mg/kg)を照射18時間前および照射2時間後に投与;(III;高)mAbH6(10mg/kg)を照射18時間前および照射2時間後に投与;ならびに(IV:高、照射後)mAbH6(10mgkg)を照射2時間後のみ投与。
照射前および照射後の抗MASP-2抗体の投与は、ビヒクル対照を与えた動物と比較して生存平均を4日から5日に調節した。抗MASP-2抗体処置マウスにおける死亡率はビヒクル対照マウスと比較して6〜12%低減した。さらに、重大で有害な治療効果は観察されなかったことに注目する(データ示さず)。
この研究は、LPS(リポ多糖)誘導性血栓症のマウスモデルにおいてMASP-2-欠損の効果を調べる。
溶血性***症候群(HUS)は、志賀毒素を産生する大腸菌に感染することによって引き起こされ、小児における急性腎不全の第1位の原因である。本実施例では、MASP-2阻害が血管内血栓の形成を阻害または予防するのに有効であるかどうか判定するために、MASP-2-/-(KO)マウスにおいてLPS誘導性血栓症(微小血管凝固)のシュワルツマンモデルを行った。
MASP-2-/-(n=9)およびWT(n=10)マウスをLPS誘導性血栓症(微小血管凝固)のシュワルツマンモデルにおいて分析した。マウスにセラチアLPSを投与し、ある期間にわたって血栓形成をモニタリングした。微小血栓およびLPS誘導性微小血管凝固の発生率の比較を行った。
とりわけ、セラチアLPS後に、試験された全てのMASP-2-/-マウス(9/9)が血管内血栓を形成しなかった。対照的に、同時に試験された10匹のWTマウスのうち7匹に微小血栓が検出された(p=0.0031、フィッシャー直接確率法)。図44に示したように、MASP-2-/-マウスおよびWTマウスにおいてLPS感染後の微小血管閉塞の発症までの時間を測定した。60分にわたって測定された血栓形成を伴うWTマウスのパーセントを示し、血栓形成が約15分と早い段階で検出された。WTマウスの80%までが60分で血栓形成を示した。対照的に、図44に示したように、どのMASP-2-/-にも60分で血栓形成がなかった(ログランク:p=0.0005)。
本実施例は、精製志賀毒素2(STX2)+LPSの腹腔内同時注射を用いたHUSマウスモデルにおける抗MASP-2抗体の効果について述べる。
精製志賀毒素2(STX2)+LPSの腹腔内同時注射を用いてHUSマウスモデルを開発した。マウス腎臓の生化学分析およびマイクロアレイ分析から、STX2+LPS曝露は、どちらか一方の作用物質単独の効果とは異なることが明らかになった。これらのマウスの血液分析および血清分析から、好中球増加、血小板減少、赤血球溶血、ならびに血清クレアチニンおよび血中尿素窒素の増加が示された。さらに、マウス腎臓の組織学分析および電子顕微鏡から、糸球体フィブリン沈着、赤血球うっ血、微小血栓形成、および糸球体の超微細変化が証明された。このHUSモデルは、C57BL/6マウスにおいて、ヒト疾患を規定する血小板減少、溶血性貧血、および腎不全を含むヒトHUS病態の全ての臨床症状を誘導することが証明された(J. Immunol. 187(1):172-80(2011))。
体重が18〜20gのC57BL/6雌マウスをCharles River Laboratoriesから購入し、2つの群に分けた(各群に5匹のマウス)。一方のマウス群を、総体積150μl食塩水で希釈した組換え抗MASP-2抗体mAbM11(100μg/マウス;5mg/kg体重の最終濃度に相当する)による腹腔内(i.p.)注射によって前処置した。対照群には、いかなる抗体も含まない食塩水を与えた。抗MASP-2抗体 mAbM11のi.p注射の6時間後に、全てのマウスに、総体積150μlに溶解した、致死未満量(3μg/動物;150μg/kg体重に相当する)の霊菌(Serratia marcescens)LPS(L6136; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)および4.5ng/動物の用量の(225ng/kgに相当する)のSTX2(LD50用量の2倍)の複合i.p.注射を与えた。対照には食塩水注射を使用した。
それぞれのマウス腎臓の1/3を4%パラホルムアルデヒドで24時間、固定し、処理し、パラフィン包埋した。厚さが3マイクロメートルの切片を切断し、後でH&E染色液で染色するために帯電スライドの上に置いた。
腎臓の中央部分を約1〜2mm3のブロックに切断し、1xPBSに溶解した2.5%グルタルアルデヒドで4℃で一晩固定した。その後、レスター大学電子顕微鏡施設(University of Leicester Electron Microscopy Facility)が固定組織を処理した。
腎臓の残りの1/3を約1〜2mm3のブロックに切断し、液体窒素で瞬間凍結し、クリオスタット切片用およびmRNA分析用に-80℃に保った。
図45は、STX/LPSによって誘導されるモデルにおける、ある期間にわたる(時間)、食塩水処置対照マウス(n=5)および抗MASP-2抗体処置マウス(m=5)の生存率(%)を図示する。とりわけ、図45に示したように、全ての対照マウスが42時間までに死亡した。きわだって対照的に、100%の抗MASP-2抗体処置マウスが実験の時間経過全体を通じて生存した。図45に示した結果と一致して、死亡した、または重篤な疾患の徴候により間引かなければならなかった未処置マウスの全てに重大な糸球体損傷があったのに対して、全ての抗MASP-2処置マウスの糸球体は正常にみえたことが観察された(データ示さず)。これらの結果から、血栓性微小血管症(TMA)、例えば、溶血性***症候群(HUS)、非定型HUS(aHUS)、もしくは血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)に罹患しているか、またはTMA、例えば、HUS、aHUS、もしくはTTPを発症するリスクのある対象を治療するために、抗MASP-2抗体などのMASP-2阻害体が使用できることが証明される。
Claims (85)
- MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、発作性夜間血色素尿症(PNH)に罹患している該対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、請求項1記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、請求項2記載の方法。
- 前記組成物が前記対象における赤血球の生存を向上させる、請求項1記載の方法。
- 前記対象が、(i)正常より低いレベルのヘモグロビン;(ii)正常より低いレベルの血小板;(iii)正常より高いレベルの網状赤血球;および(iv)正常より高いレベルのビリルビンからなる群より選択される1つまたは複数の症状を示す、請求項1記載の方法。
- 前記対象が、補体タンパク質C5の切断を阻害する終末補体阻害体による治療を以前に受けたことがあるかまたは現在受けている、請求項1記載の方法。
- 補体タンパク質C5の切断を阻害する終末補体阻害体を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記終末補体阻害体がヒト化抗C5抗体またはその抗原結合断片である、請求項7記載の方法。
- 前記終末補体阻害体がエクリズマブである、請求項8記載の方法。
- 前記抗体またはその断片が、組換え抗体、エフェクター機能が低下した抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体からなる群より選択される、請求項2記載の方法。
- 前記組成物が、皮下投与されるか、筋肉内投与されるか、動脈内投与されるか、静脈内投与されるか、または吸入剤として投与される、請求項1記載の方法。
- 前記組成物が皮下投与される、請求項11記載の方法。
- MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、非H因子依存的非定型溶血性***症候群(aHUS)に罹患しているかまたは非H因子依存的aHUSを発症するリスクのある該対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法。
- 前記組成物の投与前に、前記対象が、(i)貧血、(ii)血小板減少、(iii)腎機能不全、および(iv)クレアチニン上昇からなる群より選択される1つまたは複数の症状を示すと判定され、かつ、該組成物が、該1つまたは複数の症状を改善するのに有効な量でかつ十分な時間投与される、請求項13記載の方法。
- 前記対象が、I因子、B因子、またはメンブレンコファクターCD46に関連したaHUSに罹患している、請求項13記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、請求項13記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、請求項13記載の方法。
- (a)非定型溶血性***症候群(aHUS)に関連することが公知の遺伝子マーカーの、対象における存在を判定する工程;
(b)貧血、血小板減少、腎機能不全、およびクレアチニン上昇からなる群より選択される少なくとも1つの症状の有無を判定するために該対象を定期的にモニタリングする工程;ならびに
(c)貧血、血小板減少、腎機能不全、またはクレアチニン上昇の少なくとも1つの存在が判定されると、MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を該対象に投与する工程であって、該組成物が、1つまたは複数の該症状を改善するのに有効な量でかつ十分な時間投与される、工程
を含む、aHUSを発症するリスクのある該対象がaHUSに関連する臨床症状に罹患する可能性を低下させるための方法。 - 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、請求項18記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、請求項19記載の方法。
- 工程(a)が、前記対象から得られた試料に対して遺伝子スクリーニング試験を実施すること、ならびに、補体因子H(CFH)、I因子(CFI)、B因子(CFB)、メンブレンコファクターCD46、C3、補体因子H関連タンパク質(CFHR1)、抗凝固タンパク質トロンボジュリン(THBD)、補体因子H関連タンパク質3(CFHR3)、および補体因子H関連タンパク質4(CFHR4)からなる群より選択される、遺伝子中のaHUSに関連した少なくとも1種類の遺伝子マーカーの存在を特定することを含む、請求項18記載の方法。
- aHUS臨床症状の誘発に関連することが公知の事象の発生について、前記対象をモニタリングする工程、および、誘発事象の発生前、発生中、または発生後に、前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物を該対象に投与する工程をさらに含む、請求項18記載の方法。
- aHUS臨床症状の誘発に関連する前記事象が、薬物曝露、感染、悪性腫瘍、損傷、臓器移植または組織移植、および妊娠からなる群より選択される、請求項22記載の方法。
- 前記感染が細菌感染である、請求項23記載の方法。
- 前記組成物が皮下投与される、請求項18記載の方法。
- MASP-2補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、感染に続発する非定型溶血性***症候群(aHUS)に罹患しているかまたは感染に続発するaHUSを発症するリスクのある該対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法。
- 前記対象が、肺炎連鎖球菌(S.pneumonia)感染に関連した非腸性aHUSに罹患しているか、または、肺炎連鎖球菌感染に関連した非腸性aHUSを発症するリスクがある、請求項26記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、請求項26記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、請求項28記載の方法。
- MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含み、該MASP-2阻害物質の投与が、静脈内カテーテル送達法または他のカテーテル送達法によって実施される、非定型溶血性***症候群(aHUS)に罹患している該対象を治療する方法。
- プラスマフェレーシスで患者を治療する工程をさらに含む、請求項30記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物がプラスマフェレーシスの非存在下で投与される、請求項30記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物を第2の期間投与する工程をさらに含み、該組成物が該第2の期間中に皮下投与される方法であって、該MASP-2阻害物質を含む該組成物が、カテーテルを介して第1の期間投与される、請求項32記載の方法。
- 少なくとも1種類の補体因子のレベルを定期的に決定する工程をさらに含み、標準値または健常対象と比較して低下した該少なくとも1種類の補体因子のレベルの決定が、前記組成物による継続治療の必要性を示す、請求項33記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、請求項30記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、請求項35記載の方法。
- MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、溶血性***症候群(HUS)を発症するリスクのある該対象において腎機能障害を発症する可能性を低下させるための方法。
- HUSを発症するリスクのある前記対象が、下痢、血管内赤血球破壊のスミア証拠を伴う30%未満のヘマトクリットレベル、血小板減少、およびクレアチニンレベル上昇からなる群より選択される症状の少なくとも1つまたは複数を示す、請求項37記載の方法。
- 抗生物質の使用が禁忌となる腸原性(enterogenic)大腸菌(E. coli)に前記対象が感染している、請求項37記載の方法。
- 前記対象が赤痢菌属(shigella)またはサルモネラ属(salmonella)に感染している、請求項37記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物が、第1の期間中に抗生物質の非存在下で前記対象に投与される、請求項39記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物が、第1の期間中に抗生物質の存在下で前記対象に投与される、請求項40記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が、前記第1の期間中に静脈内カテーテル送達法または他のカテーテル送達法によって前記対象に投与される、請求項37、41、または42のいずれか一項記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物を第2の期間投与する工程をさらに含み、該組成物が該第2の期間中に皮下投与される、請求項41、請求項42、または請求項43のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも1種類の補体因子のレベルを定期的に決定する工程をさらに含み、標準値または健常対象と比較して低下した該少なくとも1種類の補体因子のレベルの決定が、前記組成物による継続治療の必要性を示す、請求項44記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、請求項37記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、請求項46記載の方法。
- MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含み、該MASP-2阻害物質の投与が、静脈内カテーテル送達法または他のカテーテル送達法によって該対象に実施される、溶血性***症候群(HUS)に罹患している該対象を治療する方法。
- プラスマフェレーシスで患者を治療する工程をさらに含む、請求項48記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物がプラスマフェレーシスの非存在下で投与される、請求項48記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物を第2の期間投与する工程をさらに含み、該組成物が該第2の期間中に皮下投与される方法であって、該MASP-2阻害物質を含む該組成物が、カテーテルを介して第1の期間投与される、請求項48記載の方法。
- 少なくとも1種類の補体因子のレベルを定期的に決定する工程をさらに含み、標準値または健常対象と比較して低下した該少なくとも1種類の補体因子のレベルの決定が、前記組成物による継続治療の必要性を示す、請求項51記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、請求項48記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、請求項53記載の方法。
- MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含み、該MASP-2阻害物質の投与が、静脈内カテーテル送達法または他のカテーテル送達法によって該対象に実施される、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)に罹患しているかまたはTTPの診断と一致する症状を示す該対象を治療する方法。
- 前記対象が、中枢神経系合併症、血小板減少、重篤な心臓合併症、重篤な肺合併症、胃腸管梗塞、および壊疽からなる群より選択される少なくとも1つまたは複数の症状を示す、請求項55記載の方法。
- 前記対象に免疫抑制剤を投与する工程をさらに含む方法であって、かつ、該対象が、ADAMTS13の阻害体の存在についての試験で陽性と判定される、請求項55記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物が、プラスマフェレーシスの非存在下で第1の期間投与される、請求項55記載の方法。
- ADAMTS-13を投与する工程をさらに含む方法であって、かつ、前記対象が、ADAMTS-13の阻害体の存在についての試験で陽性と判定される、請求項55記載の方法。
- プラスマフェレーシスで患者を治療する工程をさらに含む、請求項55記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物がプラスマフェレーシスの存在下で投与される、請求項55記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質を含む前記組成物を第2の期間投与する工程をさらに含み、該組成物が該第2の期間中に皮下投与される方法であって、該MASP-2阻害物質を含む該組成物が、カテーテルを介して第1の期間投与される、請求項55記載の方法。
- 少なくとも1種類の補体因子のレベルを定期的に決定する工程をさらに含み、標準値または健常対象と比較して低下した該少なくとも1種類の補体因子のレベルの決定が前記組成物による継続治療の必要性を示す、請求項62記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、請求項55記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が、抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、請求項54記載の方法。
- MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、難治性血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)に罹患している該対象を治療する方法。
- 前記組成物が皮下投与される、請求項66記載の方法。
- 少なくとも1種類の補体因子のレベルを定期的に決定する工程をさらに含み、標準値または健常対象と比較して低下した該少なくとも1種類の補体因子のレベルの決定が前記組成物による継続治療の必要性を示す、請求項66記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、請求項66記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片がSEQ ID NO:6の一部に特異的に結合する、請求項69記載の方法。
- MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、クリオグロブリン血症に罹患している該対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、請求項71記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片である、請求項72記載の方法。
- MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、寒冷凝集素症に罹患している該対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、請求項74記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片である、請求項75記載の方法。
- MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、緑内障に罹患している該対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、請求項77記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片である、請求項78記載の方法。
- MASP-2依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む、急性放射線症候群を発症するリスクのあるまたは急性放射線症候群に罹患している該対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害する方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2抗体またはその断片である、請求項80記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質が抗MASP-2モノクローナル抗体またはその断片である、請求項81記載の方法。
- 放射線曝露前に、前記MASP-2阻害物質が予防的に前記対象に投与される、請求項81記載の方法。
- 放射線曝露後24時間〜48時間以内に、前記MASP-2阻害物質が前記対象に投与される、請求項81記載の方法。
- 放射線曝露後に、前記MASP-2阻害物質が前記対象に投与される、請求項81記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019160040A JP6893539B2 (ja) | 2011-04-08 | 2019-09-03 | Masp−2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161473698P | 2011-04-08 | 2011-04-08 | |
US61/473,698 | 2011-04-08 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016095034A Division JP6239030B2 (ja) | 2011-04-08 | 2016-05-11 | Masp−2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019160040A Division JP6893539B2 (ja) | 2011-04-08 | 2019-09-03 | Masp−2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018024698A true JP2018024698A (ja) | 2018-02-15 |
JP6584476B2 JP6584476B2 (ja) | 2019-10-02 |
Family
ID=46966283
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014504058A Active JP5937197B2 (ja) | 2011-04-08 | 2012-04-06 | Masp−2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 |
JP2016095034A Active JP6239030B2 (ja) | 2011-04-08 | 2016-05-11 | Masp−2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 |
JP2017209894A Active JP6584476B2 (ja) | 2011-04-08 | 2017-10-31 | Masp−2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 |
JP2019160040A Active JP6893539B2 (ja) | 2011-04-08 | 2019-09-03 | Masp−2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014504058A Active JP5937197B2 (ja) | 2011-04-08 | 2012-04-06 | Masp−2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 |
JP2016095034A Active JP6239030B2 (ja) | 2011-04-08 | 2016-05-11 | Masp−2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019160040A Active JP6893539B2 (ja) | 2011-04-08 | 2019-09-03 | Masp−2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US8951522B2 (ja) |
EP (3) | EP2694108B1 (ja) |
JP (4) | JP5937197B2 (ja) |
KR (6) | KR102217658B1 (ja) |
CN (3) | CN110075294A (ja) |
AU (1) | AU2012239889B2 (ja) |
BR (1) | BR112013025917A2 (ja) |
CA (4) | CA2977009C (ja) |
CL (1) | CL2013002874A1 (ja) |
DK (2) | DK3287142T3 (ja) |
ES (2) | ES2683307T3 (ja) |
HK (1) | HK1250342A1 (ja) |
IL (3) | IL228758B (ja) |
MX (2) | MX355648B (ja) |
NZ (5) | NZ746139A (ja) |
PL (1) | PL3287142T3 (ja) |
RU (2) | RU2662563C2 (ja) |
WO (1) | WO2012139081A2 (ja) |
Families Citing this family (51)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090010920A1 (en) | 2003-03-03 | 2009-01-08 | Xencor, Inc. | Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb |
WO2012139081A2 (en) | 2011-04-08 | 2012-10-11 | University Of Leicester | Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation |
US9644035B2 (en) | 2011-04-08 | 2017-05-09 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
KR102159843B1 (ko) | 2011-12-21 | 2020-09-24 | 노파르티스 아게 | 인자 p를 표적화하는 항체에 대한 조성물 및 방법 |
PL3366307T3 (pl) * | 2012-04-06 | 2022-03-07 | Omeros Corporation | Kompozycje i sposoby hamowania masp-1 i/lub masp-2 i/lub masp-3 do leczenia napadowej nocnej hemoglobinurii |
RS61755B1 (sr) * | 2012-06-18 | 2021-05-31 | Omeros Corp | Kompozicije i postupci za inhibiciju masp-1 i/ili masp-2 i/ili masp-3 za tretman različitih bolesti i poremećaja |
WO2014066744A2 (en) | 2012-10-25 | 2014-05-01 | True North Therapeutics, Inc. | Anti-complement c1s antibodies and uses thereof |
GB2509260B (en) | 2012-11-02 | 2016-05-04 | True North Therapeutics Inc | Anti-complement C1s antibodies and uses thereof |
US20140363433A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-12-11 | Omeros Corporation | Methods of Generating Bioactive Peptide-bearing Antibodies and Compositions Comprising the Same |
NZ629682A (en) * | 2013-03-15 | 2017-03-31 | Omeros Corp | Methods of generating bioactive peptide-bearing antibodies and compositions comprising the same |
IL283373B1 (en) * | 2013-10-17 | 2024-04-01 | Omeros Corp | Pharmaceutical preparations containing MASP-2 suppressors to suppress MASP-2-dependent complement activation and related diseases |
WO2015070041A1 (en) * | 2013-11-08 | 2015-05-14 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Methods for monitoring kidney dysfunction |
RS59353B1 (sr) | 2014-06-12 | 2019-10-31 | Ra Pharmaceuticals Inc | Modulacija aktivnosti komplementa |
EP3250230B9 (en) | 2015-01-28 | 2022-02-23 | RA Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of complement activity |
US10729767B2 (en) | 2015-04-06 | 2020-08-04 | Bioverativ Usa Inc. | Humanized anti-C1s antibodies and methods of inhibiting C1s cleavage |
AU2016354117B2 (en) | 2015-11-09 | 2019-11-28 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
AU2016370210A1 (en) | 2015-12-16 | 2018-06-21 | Ra Pharmaceuticals, Inc. | Modulators of complement activity |
EP3394089B1 (en) | 2015-12-23 | 2021-07-28 | eleva GmbH | Polypeptides for inhibiting complement activation |
UA127339C2 (uk) * | 2016-01-05 | 2023-07-26 | Юніверсіті Оф Лестер | СПОСІБ ПРОФІЛАКТИКИ АБО ЗМЕНШЕННЯ УРАЖЕННЯ НИРОК У СУБ'ЄКТА, ЩО СТРАЖДАЄ НА СТЕРОЇДЗАЛЕЖНУ ІМУНОГЛОБУЛІН-А-НЕФРОПАТІЮ (IgAN) |
SG10202009886SA (en) | 2016-03-31 | 2020-11-27 | Omeros Corp | Methods for inhibiting angiogenesis in a subject in need thereof |
JOP20170170B1 (ar) * | 2016-08-31 | 2022-09-15 | Omeros Corp | صيغ لجسم مضاد تثبيطية لـ masp-2 بتركيز عالي ولزوجة منخفضة وأطقم، وطرق |
JOP20190068A1 (ar) * | 2016-10-13 | 2019-04-01 | Omeros Corp | طرق لتقليل البول البروتيني في خاضع بشري يعاني من الاعتلال الكلوي a الناتج عن الجلوبيولين المناعي |
KR20190093196A (ko) | 2016-12-07 | 2019-08-08 | 라 파마슈티컬스 인코포레이티드 | 보체 활성의 조절인자 |
WO2018124132A1 (ja) * | 2016-12-26 | 2018-07-05 | 日本ビーシージー製造株式会社 | 細菌細胞壁骨格成分を含有する水中油型エマルション製剤 |
JPWO2018164186A1 (ja) * | 2017-03-09 | 2020-01-09 | 協和キリン株式会社 | Masp2の発現を抑制する核酸 |
US20210093654A1 (en) * | 2017-07-28 | 2021-04-01 | Lemonex Inc. | Pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer |
BR112020010916A2 (pt) | 2017-12-04 | 2020-11-17 | Ra Pharmaceuticals, Inc | moduladores da atividade do complemento |
GB201800620D0 (en) | 2018-01-15 | 2018-02-28 | Univ Manchester | C3b Binding Polypeptide |
EP3802489A4 (en) * | 2018-05-29 | 2022-04-13 | Omeros Corporation | MASP -2 INHIBITORS AND METHODS OF USE |
RU2699040C1 (ru) * | 2018-07-23 | 2019-09-03 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Уральский научно-практический центр радиационной медицины Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России) | Способ экстренной профилактики и лечения острой лучевой болезни (варианты) |
US11918600B2 (en) | 2018-08-21 | 2024-03-05 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | Nucleic acid, pharmaceutical composition and conjugate containing nucleic acid, and use thereof |
EP3628735A1 (en) | 2018-09-25 | 2020-04-01 | Centre National De La Recherche Scientifique | Antisense rna targeting pmp22 for the treatment of charcot-marie-tooth 1a disease |
EP3862024A4 (en) | 2018-09-30 | 2022-08-17 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | SHORT INTERFERENT RNA CONJUGATE, METHOD FOR PREPARATION AND USE THEREOF |
JP2022509059A (ja) * | 2018-11-15 | 2022-01-20 | アイオーニス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッド | Irf5発現の調節因子 |
CA3124730A1 (en) * | 2018-12-25 | 2020-07-02 | Institute Of Basic Medical Sciences Chinese Academy Of Medical Sciences | Small rna medicament for prevention and treatment of inflammation-related diseases and combinations thereof |
JP2022524078A (ja) | 2019-03-08 | 2022-04-27 | ラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 深部組織浸透性c5阻害剤としてのジルコプラン |
EP3981431A4 (en) * | 2019-03-14 | 2023-06-28 | Rena Therapeutics Inc. | Nucleic acid complex for modulating ihh expression |
EP3947352A1 (en) | 2019-03-29 | 2022-02-09 | RA Pharmaceuticals, Inc. | Complement modulators and related methods |
WO2020219822A1 (en) | 2019-04-24 | 2020-10-29 | Ra Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulating complement activity |
TW202111119A (zh) * | 2019-05-22 | 2021-03-16 | 大陸商蘇州瑞博生物技術股份有限公司 | 核酸、藥物組合物與綴合物及製備方法和用途 |
CN111024947A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-04-17 | 江苏美克医学技术有限公司 | 白色念珠菌荧光免疫层析测定试剂盒及其制备方法 |
JP7227401B2 (ja) | 2019-11-27 | 2023-02-21 | 京セラ株式会社 | 通信制御方法及びユーザ装置 |
BR112022010881A2 (pt) | 2019-12-04 | 2022-08-23 | Omeros Corp | Composto, composição farmacêutica, e, método para tratar uma doença ou distúrbio associado a serina protease-2 associada à lectina de ligação ao manan |
EP4069676A1 (en) | 2019-12-04 | 2022-10-12 | Omeros Corporation | Masp-2 inhibitors and methods of use |
JP2023504543A (ja) | 2019-12-04 | 2023-02-03 | オメロス コーポレーション | Masp-2阻害剤および使用方法 |
BR112022010890A2 (pt) | 2019-12-04 | 2022-08-16 | Omeros Corp | Composto, composição farmacêutica, e, método para tratar uma doença ou distúrbio associado a serina protease-2 associada à lectina de ligação ao manan |
WO2021168148A1 (en) * | 2020-02-19 | 2021-08-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Mannan binding lectin serine peptidase 2 (masp2) irna compositions and methods of use thereof |
KR102314642B1 (ko) * | 2020-04-17 | 2021-10-20 | 재단법인 아산사회복지재단 | 파브리 병 진단용 바이오 마커 및 이의 용도 |
CN113674860B (zh) * | 2020-05-15 | 2024-05-17 | 北京大学人民医院 | 一种难治性iTTP风险预测装置、***及其应用 |
AU2022263683A1 (en) * | 2021-04-25 | 2023-11-23 | Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. | Anti-masp2 antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof |
WO2024026258A2 (en) * | 2022-07-25 | 2024-02-01 | Amgen Inc. | Rnai constructs and methods for inhibiting fam13a expression |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009532493A (ja) * | 2006-04-03 | 2009-09-10 | ユニバーシティ オブ レスター | Masp−2依存性の補体活性化に関連する状態を処置するための方法 |
Family Cites Families (73)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4331647A (en) | 1980-03-03 | 1982-05-25 | Goldenberg Milton David | Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers |
US4394370A (en) | 1981-09-21 | 1983-07-19 | Jefferies Steven R | Bone graft material for osseous defects and method of making same |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4526909A (en) | 1984-01-09 | 1985-07-02 | Regents Of The University Of California | Polymethylmethacrylate delivery system for bone morphogenetic protein |
US4563489A (en) | 1984-02-10 | 1986-01-07 | University Of California | Biodegradable organic polymer delivery system for bone morphogenetic protein |
JPH0662679B2 (ja) | 1985-06-21 | 1994-08-17 | 新田ゼラチン株式会社 | 組織親和性コラ−ゲンとその製法 |
US5453566A (en) | 1986-03-28 | 1995-09-26 | Calgene, Inc. | Antisense regulation of gene expression in plant/cells |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US4987071A (en) | 1986-12-03 | 1991-01-22 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods |
RO114469B1 (ro) | 1987-12-15 | 1999-04-30 | Gene Shears Pty Ltd | Compus oligoribonucleotidic, procedeu de preparare si metoda de inactivare |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
GB8822492D0 (en) | 1988-09-24 | 1988-10-26 | Considine J | Apparatus for removing tumours from hollow organs of body |
US5211657A (en) | 1988-11-07 | 1993-05-18 | The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Laminin a chain deduced amino acid sequence, expression vectors and active synthetic peptides |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5549910A (en) | 1989-03-31 | 1996-08-27 | The Regents Of The University Of California | Preparation of liposome and lipid complex compositions |
US6075181A (en) * | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
EP0438803B1 (en) | 1990-01-26 | 1997-03-12 | Immunomedics, Inc. | Vaccines against cancer and infectious diseases |
JP3218637B2 (ja) | 1990-07-26 | 2001-10-15 | 大正製薬株式会社 | 安定なリポソーム水懸濁液 |
US5789573A (en) | 1990-08-14 | 1998-08-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2 |
JP2958076B2 (ja) | 1990-08-27 | 1999-10-06 | 株式会社ビタミン研究所 | 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法 |
CA2103059C (en) | 1991-06-14 | 2005-03-22 | Paul J. Carter | Method for making humanized antibodies |
IL108367A0 (en) | 1993-01-27 | 1994-04-12 | Hektoen Inst For Medical Resea | Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells |
US5801154A (en) | 1993-10-18 | 1998-09-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein |
US5856121A (en) | 1994-02-24 | 1999-01-05 | Case Western Reserve University | Growth arrest homebox gene |
JPH07238100A (ja) | 1994-02-25 | 1995-09-12 | Sumitomo Electric Ind Ltd | ヒトのmaspに対するモノクローナル抗体 |
US5741516A (en) | 1994-06-20 | 1998-04-21 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Sphingosomes for enhanced drug delivery |
US5795587A (en) | 1995-01-23 | 1998-08-18 | University Of Pittsburgh | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production |
US5738868A (en) | 1995-07-18 | 1998-04-14 | Lipogenics Ltd. | Liposome compositions and kits therefor |
BR9509985A (pt) | 1995-12-12 | 1998-11-03 | Omeros Med Sys Inc | Solução para irrigação e método para inibição de dor inflamação e esparmo |
US5739119A (en) | 1996-11-15 | 1998-04-14 | Galli; Rachel L. | Antisense oligonucleotides specific for the muscarinic type 2 acetylcholine receptor MRNA |
US7083786B2 (en) | 1997-04-03 | 2006-08-01 | Jensenius Jens Chr | MASP-2, a complement-fixing enzyme, and uses for it |
US6297024B1 (en) | 1998-10-15 | 2001-10-02 | Cell Activation, Inc. | Methods for assessing complement activation |
US7273925B1 (en) | 1998-12-15 | 2007-09-25 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and products for regulating lectin complement pathway associated complement activation |
WO2000035483A1 (en) | 1998-12-15 | 2000-06-22 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and products for regulating lectin complement pathway associated complement activation |
US6235494B1 (en) | 1999-02-08 | 2001-05-22 | The Scripps Research Institute | Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates |
CA2378880C (en) | 1999-07-21 | 2010-02-23 | Omeros Medical Systems, Inc. | Solutions and methods for inhibition of pain, inflammation and cartilage degradation |
US6794132B2 (en) | 1999-10-02 | 2004-09-21 | Biosite, Inc. | Human antibodies |
US20030186419A1 (en) | 1999-12-02 | 2003-10-02 | Jensenius Jens Christian | Masp-3, a complement-fixing enzyme, and uses for it |
US6649592B1 (en) | 2000-01-14 | 2003-11-18 | Science & Technology Corporation @ Unm | Peptide inhibitors of LFA-1/ICAM-1 interaction |
SG98393A1 (en) | 2000-05-19 | 2003-09-19 | Inst Materials Research & Eng | Injectable drug delivery systems with cyclodextrin-polymer based hydrogels |
DK1303591T3 (da) | 2000-07-13 | 2009-11-02 | Helion Biotech Aps | MASP-2, et komplementfikserende enzym, og anvendelser af det |
WO2003009803A2 (en) | 2001-07-26 | 2003-02-06 | Alexion Pharmaceuticals Inc. | Method of improving cognitive function |
WO2003063799A2 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-07 | Omeros Corporation | Compositions and methods for systemic inhibition of cartilage degradation |
US20050221382A1 (en) | 2002-03-18 | 2005-10-06 | Rother Russell P | Stratification of patient populations having or suspected of having rheumatoid arthritis |
JP4723244B2 (ja) | 2002-07-19 | 2011-07-13 | オメロス コーポレイション | 生分解性トリブロックコポリマー、その合成方法、ならびにそれから作製されるヒドロゲルおよび生体材料 |
PT1534313E (pt) | 2002-07-30 | 2013-01-25 | Omeros Corp | Soluções e método de irrigação oftalmológica |
ITRM20020511A1 (it) * | 2002-10-09 | 2004-04-10 | Santa Anna Acuto | Uso dell'insulator sns di riccio di mare per la terapia genica di malattie delle cellule eritroidi. |
US20060275764A1 (en) | 2002-12-03 | 2006-12-07 | Aarhus Universitet | Method for determining predisposition to manifestation of immune system related diseases |
CN101897969B (zh) | 2003-02-21 | 2014-04-02 | 健泰科生物技术公司 | 补体抑制剂在制备用于预防或抑制组织损伤的药物中的用途 |
AU2004221982B2 (en) * | 2003-03-17 | 2011-10-13 | Km Biologics Co., Ltd. | Construct comprising recognition domain of antibody against von Willebrand factor-specific cleaving enzyme |
PL1625166T3 (pl) | 2003-05-12 | 2015-08-31 | Helion Biotech Aps | Przeciwciała przeciwko masp-2 |
US20050169921A1 (en) * | 2004-02-03 | 2005-08-04 | Leonard Bell | Method of treating hemolytic disease |
GB0412966D0 (en) | 2004-06-10 | 2004-07-14 | Univ Leicester | Genetically modified non-human mammals and cells |
US8840893B2 (en) | 2004-06-10 | 2014-09-23 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
WO2005123776A1 (en) | 2004-06-10 | 2005-12-29 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with lectin-dependent complement activation |
ES2601497T3 (es) * | 2004-06-10 | 2017-02-15 | Omeros Corporation | Métodos para tratar afecciones asociadas con la activación del complemento dependiente de MASP-2 |
ES2382104T3 (es) * | 2005-06-17 | 2012-06-05 | Baxter International Inc. | Composiciones con actividad trombolítica que comprenden ADAMTS13 |
DE602007010246D1 (de) | 2006-01-27 | 2010-12-16 | Rappaport Family Inst For Res | Verfahren zur blutgerinnungsbestimmung |
MX2008011323A (es) | 2006-03-08 | 2008-11-18 | Archemix Corp | Aptameros que se unen al complemento y agentes anti-c5 utiles en el tratamiento de trastornos oculares. |
SI2894165T1 (sl) * | 2008-11-10 | 2023-04-28 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Postopki in sestavki za zdravljenje motenj povezanih s komplementom |
NZ597259A (en) * | 2009-06-23 | 2014-04-30 | Alexion Pharma Inc | Bispecific antibodies that bind to complement proteins |
WO2011006982A2 (en) | 2009-07-17 | 2011-01-20 | Rigshospitalet | Inhibitors of complement activation |
CA2777845C (en) | 2009-10-16 | 2017-08-01 | Omeros Corporation | Methods for treating disseminated intravascular coagulation by inhibiting masp-2 dependent complement activation |
EA201290286A1 (ru) * | 2009-11-05 | 2013-01-30 | Алексион Кембридж Корпорейшн | Лечение пароксизмальной ночной гемоглобинурии, гемолитических анемий и патологических состояний с вовлечением внутрисосудистого и внесосудистого гемолиза |
RU2015145543A (ru) | 2010-03-01 | 2019-01-11 | Алексион Фармасьютикалз Инк. | Способы и композиции для лечения болезни дего |
US9644035B2 (en) | 2011-04-08 | 2017-05-09 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
WO2012139081A2 (en) | 2011-04-08 | 2012-10-11 | University Of Leicester | Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation |
US20150166676A1 (en) | 2011-04-08 | 2015-06-18 | Omeros Corporation | Methods for Treating Conditions Associated with MASP-2 Dependent Complement Activation |
US9011860B2 (en) | 2011-05-04 | 2015-04-21 | Omeros Corporation | Compositions for inhibiting MASP-2 dependent complement activation |
RS61755B1 (sr) | 2012-06-18 | 2021-05-31 | Omeros Corp | Kompozicije i postupci za inhibiciju masp-1 i/ili masp-2 i/ili masp-3 za tretman različitih bolesti i poremećaja |
IL283373B1 (en) | 2013-10-17 | 2024-04-01 | Omeros Corp | Pharmaceutical preparations containing MASP-2 suppressors to suppress MASP-2-dependent complement activation and related diseases |
AU2016354117B2 (en) | 2015-11-09 | 2019-11-28 | Omeros Corporation | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
WO2018070521A1 (ja) * | 2016-10-14 | 2018-04-19 | 公立大学法人福島県立医科大学 | 補体の活性化経路を阻害する融合ポリペプチド |
-
2012
- 2012-04-06 WO PCT/US2012/032650 patent/WO2012139081A2/en active Application Filing
- 2012-04-06 KR KR1020197037437A patent/KR102217658B1/ko active IP Right Grant
- 2012-04-06 CN CN201910000825.6A patent/CN110075294A/zh active Pending
- 2012-04-06 ES ES12767899T patent/ES2683307T3/es active Active
- 2012-04-06 RU RU2013149792A patent/RU2662563C2/ru active
- 2012-04-06 EP EP12767899.3A patent/EP2694108B1/en active Active
- 2012-04-06 EP EP21188935.7A patent/EP3964233A1/en active Pending
- 2012-04-06 PL PL17191208T patent/PL3287142T3/pl unknown
- 2012-04-06 MX MX2016006039A patent/MX355648B/es unknown
- 2012-04-06 NZ NZ746139A patent/NZ746139A/en unknown
- 2012-04-06 JP JP2014504058A patent/JP5937197B2/ja active Active
- 2012-04-06 KR KR1020177007747A patent/KR101870915B1/ko active IP Right Grant
- 2012-04-06 NZ NZ731596A patent/NZ731596A/en unknown
- 2012-04-06 BR BR112013025917A patent/BR112013025917A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-04-06 KR KR1020187017317A patent/KR20180072851A/ko active Application Filing
- 2012-04-06 KR KR1020137029501A patent/KR101720562B1/ko active IP Right Grant
- 2012-04-06 KR KR1020227010108A patent/KR20220044616A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-04-06 KR KR1020217004368A patent/KR20210021101A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-04-06 CA CA2977009A patent/CA2977009C/en active Active
- 2012-04-06 NZ NZ617298A patent/NZ617298A/en unknown
- 2012-04-06 EP EP17191208.2A patent/EP3287142B1/en active Active
- 2012-04-06 NZ NZ717517A patent/NZ717517A/en unknown
- 2012-04-06 DK DK17191208.2T patent/DK3287142T3/da active
- 2012-04-06 CA CA2832187A patent/CA2832187C/en active Active
- 2012-04-06 MX MX2013011721A patent/MX339002B/es active IP Right Grant
- 2012-04-06 CA CA3076975A patent/CA3076975A1/en active Pending
- 2012-04-06 US US13/441,827 patent/US8951522B2/en active Active
- 2012-04-06 CN CN201280028263.2A patent/CN103781492A/zh active Pending
- 2012-04-06 CN CN201710646474.7A patent/CN107638565B/zh active Active
- 2012-04-06 DK DK12767899.3T patent/DK2694108T3/en active
- 2012-04-06 AU AU2012239889A patent/AU2012239889B2/en active Active
- 2012-04-06 ES ES17191208T patent/ES2894342T3/es active Active
- 2012-04-06 CA CA3237802A patent/CA3237802A1/en active Pending
- 2012-04-06 NZ NZ709997A patent/NZ709997A/en unknown
- 2012-04-06 RU RU2018125514A patent/RU2743409C2/ru active
-
2013
- 2013-10-06 IL IL228758A patent/IL228758B/en active IP Right Grant
- 2013-10-07 CL CL2013002874A patent/CL2013002874A1/es unknown
-
2014
- 2014-12-23 US US14/581,191 patent/US20150239985A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-05-11 JP JP2016095034A patent/JP6239030B2/ja active Active
- 2016-12-07 US US15/371,726 patent/US10202465B2/en active Active
-
2017
- 2017-10-31 JP JP2017209894A patent/JP6584476B2/ja active Active
-
2018
- 2018-07-30 HK HK18109793.0A patent/HK1250342A1/zh unknown
- 2018-12-17 US US16/222,188 patent/US20190292272A1/en not_active Abandoned
-
2019
- 2019-01-09 IL IL264172A patent/IL264172B/en unknown
- 2019-09-03 JP JP2019160040A patent/JP6893539B2/ja active Active
-
2020
- 2020-04-23 IL IL274206A patent/IL274206A/en unknown
-
2021
- 2021-09-09 US US17/470,386 patent/US20220089781A1/en active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009532493A (ja) * | 2006-04-03 | 2009-09-10 | ユニバーシティ オブ レスター | Masp−2依存性の補体活性化に関連する状態を処置するための方法 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6584476B2 (ja) | Masp−2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 | |
JP7397037B2 (ja) | Masp-2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 | |
US20220002439A1 (en) | Methods for Treating Conditions Associated with MASP-2 Dependent Complement Activation | |
JP6814802B2 (ja) | Masp−2依存性補体活性化に関連した状態を治療するための方法 | |
AU2020201271A1 (en) | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation | |
AU2013201627B2 (en) | Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171121 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171121 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171225 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180827 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20181115 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190219 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190718 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190816 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190903 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6584476 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |