JP2017538715A - アルファ9インテグリンアンタゴニストを用いるhscの骨髄幹細胞ニッチからの除去および放出 - Google Patents
アルファ9インテグリンアンタゴニストを用いるhscの骨髄幹細胞ニッチからの除去および放出 Download PDFInfo
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Abstract
Description
Xは、結合手および−SO2−からなる群より選択され;
R1は、H、アルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R2は、Hおよび置換基からなる群より選択され;
R3は、HおよびC1−C4アルキルからなる群より選択され;
R4は、Hおよび−OR6からなる群より選択され;
R5は、Hおよび−OR7からなる群より選択される;
ただし、R4がHである場合、R5は−OR7であり、R4が−OR6である場合、R5はHであり;
R6は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R8、−C(O)R9および−C(O)NR10R11からなる群より選択され;
R7は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R8は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R9は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R10およびR11は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;
R12は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R13は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15は、各々、C1−C4アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nは、各々、1〜3の範囲にある整数である]
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩である。
G−CSFの存在または不在下で、有効量のα9インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を対象に投与し、ここで該有効量がBM幹細胞ニッチにおけるHSCおよびその前駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のBM幹細胞結合リガンドからの移動を強化し;
その移動したHSCをPBに動員し;および
HSCをPBから採取する、ことを含む方法が提供される。
α9インテグリンアンタゴニストを対象に投与し、HSCをBM幹細胞結合リガンドから移動させ;
そのHSCを放出させてBMからPBに動員させ;
HSCを患者から由来のPBより採取し;および
該HSCを該患者に移植する、ことを含む方法が提供される。
Xは、結合手および−SO2−からなる群より選択され;
R1は、H、アルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R2は、Hおよび置換基からなる群より選択され;
R3は、HおよびC1−C4アルキルからなる群より選択され;
R4は、Hおよび−OR6からなる群より選択され;
R5は、Hおよび−OR7からなる群より選択される;
ただし、R4がHである場合、R5は−OR7であり、R4が−OR6である場合、R5はHであり;
R6は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R8、−C(O)R9および−C(O)NR10R11からなる群より選択され;
R7は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R8は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R9は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R10およびR11は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;
R12は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R13は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15は、各々、C1−C4アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nは、各々、1〜3の範囲にある整数である]
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩を含む。
R4がHであり;
R5が−OR7であり; および
X、R1、R2、R3およびR7が式(I)について定義されるとおりである。
Xは、結合手および−SO2−からなる群より選択され;
R1は、H、アルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R2は、Hおよび置換基からなる群より選択され;
R3は、HおよびC1−C4アルキルからなる群より選択され;
R7は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R12は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R13は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15は、各々、C1−C4アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nは、各々、1ないし3の範囲にある整数である]
で示される構造を有してもよい。
R7は、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R12は、−CN、−O(C1−C4アルキル)および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R13は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15は、各々、C1−C4アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nは1または2である。
R12は−OCH3であり、nは2であるか、または
R12は所望により置換されてもよいテトラゾリル(好ましくは、5−テトラゾリル)であり、nは1である。
R7は、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R12は、C1−C4アルキル、−CN、−O(C1−C4アルキル)および5−テトラゾリルからなる群より選択され;
R13は2−ピロリルであり;
R14およびR15は、各々独立して、C1−C4アルキルであるか、または
R14およびR15は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいピロリジニルまたはモルホリニル環を形成し;および
nは1または2である。
R1は、H、アルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R2は、Hおよび置換基からなる群より選択され;
R3は、HおよびC1−C4アルキルからなる群より選択され;
R4は、Hおよび−OR6からなる群より選択され;
R5は、Hおよび−OR7からなる群より選択される;
ただし、R4がHである場合、R5は−OR7であって、R4が−OR6である場合、R5はHであり;
R6は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R8、−C(O)R9および−C(O)NR10R11からなる群より選択され;
R7は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R8は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R9は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R10およびR11は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;
R12は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R13は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15は、各々、C1−C4アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nは、各々、1〜3の範囲の整数である]
で示される構造を有する。
R1、R2およびR3は、式(III)にて定義されるとおりであり;
R7は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R12は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R13は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15は、各々、C1−C4アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nは、各々、1〜3の範囲にある整数である]
で示される化合物を提供する。
R12は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R13は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15は、各々、C1−C4アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nは1、2および3からなる群より選択される整数である。
で示される構造を有してもよい。
で示される構造を有してもよい。
R7は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R12は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R13は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリールおよび所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15は、各々、C1−C4アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nは、各々、1〜3の範囲にある整数である。
Xは、結合手および−SO2−からなる群より選択され;
R1は、H、アルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R2は、Hおよび置換基からなる群より選択され;
R4は、Hおよび−OR6からなる群より選択され;
R5は、Hおよび−OR7からなる群より選択される:
ただし、R4がHの場合、R5は−OR7であり、およびR4が−OR6である場合、R5はHであり;
R6は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R8、−C(O)R9、および−C(O)NR10R11からなる群より選択され;
R7は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R8は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R9は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R10およびR11は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;
R12は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)、および−CNからなる群より選択され;
R13は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15は、各々、C1−C4アルキル、および所望により置換されてもよいアリールからなる群より選択されるか、または
R14およびR15は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nは、各々、1〜3の範囲にある整数である]
で示される構造を有してもよい。
R7は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13、および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R12は、所望により置換されてもよいアルキル、所望により置換されてもよいアリール、所望により置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)、および−CNからなる群より選択され;
R13は、所望により置換されてもよいシクロアルキル、所望により置換されてもよいアリール、および所望により置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15は、各々、C1−C4アルキルおよび所望により置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15は、それらが結合する窒素と一緒になって、所望により置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nは、各々、1〜3の範囲にある整数である。
Yは、所望により置換されてもよいヘテロアリールまたは所望により置換されてもよいヘテロアリール−(O)NH−であり;
リンカーは、−(CH2)p−および−(CH2CH2O)p−からなる群より選択されるか、またはそのいずれかの組み合わせであり;
pは、各々、1〜4の範囲にある整数であり;および
Zはフルオロフォール(好ましくは、ロダミン基)である]
で示される構造の置換基である。
Yは、所望により置換されてもよいヘテロアリール、または所望により置換されてもよいヘテロアリール−C(O)NH−であり;
リンカーは、−(CH2)p−および−(CH2CH2O)p−からなる群より選択されるか、またはそのいずれかの組み合わせであり;
pは、各々、1〜4の範囲にある整数であり;および
Zはフルオロフォール(好ましくは、ロダミン基)である]
で示される構造の置換基である。
ここで、ReおよびRf、RgおよびRhは、各々、H、C1−C4アルキル、C1−C12ハロアルキル、C2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、C1−C10ヘテロアルキル、C3−C6シクロアルキル、C3−C12シクロアルケニル、C5−C6ヘテロシクロアルキル、C1−C12ヘテロシクロアルケニル、C6アリール、およびC1−C5ヘテロアリールからなる群より独立して選択されるか、あるいはReおよびRfは、それらが結合する原子と一緒になる場合には、環原子が3ないし12個の環式またはヘテロ環式環系を形成する。
効果的な量の本明細書に記載のα9インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を対象に投与し、ここでその効果的な量はHSCおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のBM幹細胞ニッチにあるBM幹細胞結合リガンドからの除去を強化し;
その除去されたHSCをPBに動員し;および
該HSCをPBから採取する、ことを含む方法が提供される。
α9インテグリンアンタゴニストを対象に投与し、HSCをBM幹細胞結合リガンドから除去し;
そのHSCをBMから放出させて、PBに動員させ;
HSCをその対象のPBより採取し;および
そのHSCを患者に移植する、ことを含む方法が提供される。
方法
(i)フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析は、J. Grassingerら、Blood, 2009, 114, 49-59において以前に記載されるように、LSRII(BD Biosciences)を用いて実施された。R−BC154を585nmで検出し、黄緑レーザー(561nm)で励起した。BMおよびPB分析については、5x106個までの細胞を10−20k細胞イベント/秒の速度で分析した。PB LSKSLAMの分析については、1x106までのイベントをセーブした。細胞分類は、J. Grassingerらにより以前に記載されるように、C ytopeia Influx(BD)で行われた。
インテグリンα4β1(LN18 α4β1)またはα9β1(LN18 α9β1)を過剰発現する安定したLN18細胞(ATCC番号:CRL−2610)を、J. Grassingerら、Blood, 2009, 114, 49-59において以前に記載されるように、pMSCV−hITGA4−IRES−hITGB1およびpMSCV−hITGA9−IRES−hITGB1ベクターを用いるレトロウイルス形質導入により生成し、10%FBS中2mM L−グルタマートを補充したDMEMに維持した。形質導入した細胞をPBS−2%FBS中2.5μg/mlのPE−Cy5−コンジュゲートマウス−抗ヒトα4抗体(BD Bioscience)または20μg/mlのマウス−抗ヒトα9β1抗体(Millipore)を用い、つづいて0.5μg/mlのPE−コンジュゲートヤギ−抗マウスIgG(BD Bio-science)を用いる、FACS(2ラウンド)で選別した。LN18およびLN18 α9β1細胞でのα4発現のサイレンシングをpSM2c−shITGA4(Open Biosystems)を用いて上記されるように行った。α4−サイレンスのLN18細胞(対照細胞株;LN18 SiA4)およびLN18 α9β1(LN18 α9β1SiA4)を、FACSを用いてα4発現についてネガティブに選別した。
(a)抗体染色
LN18 SiA4(対照細胞株)、LN18 α4β1およびLN18 α9β1細胞をPBS−2%FBS中2.5μg/mlのマウス−抗ヒトα4抗体(BD Bioscience)、4μg/mlのマウス−抗ヒトα9β1抗体(Millipore)または4μg/mlのマウスイソ型対照(BD Bio-science)で1時間、つづいて5μg/mlのアレキシア・フロアー(Alexa Fluor)594コンジュゲートヤギ−抗マウスIgG1で1時間染色に供し、次にPBS−2%FBSで3回洗浄した。
ネズミ祖先細胞(LSK;リニージ−Sca−1+c−kit+)およびHSC(LSKSLAM;LSKCD150+CD48−)に結合するR−BC154を分析するために、BMおよびPB細胞をリニージカクテル(抗−Ter119、抗−B220、抗−CD3、抗−Gr−1、抗−Mac−1)、抗−Sca−1、抗−c−kit、抗−CD48および抗−CD150で免疫標識に供した。リニージ分析では、細胞をT−細胞については抗−CD3を用い、B−細胞については抗−B220を用い、マクロファージについては抗−Mac−1を用い、顆粒球については抗−Gr−1を用いて別々に染色した。別法として、リニージ分析はまた、抗−CD3/B220(PBコンジュゲート)および抗−B220/Gr1/Mac−1(AF647コンジュゲート)を含有するカクテルを用いて行われ、それによればB220+細胞は+/+細胞と、CD3+細胞は+/−と、Gr1/Mac−1+細胞は−/+の集団と同定された。臍帯血のMNCからのヒトWBCおよびヒト化NSGマウスからのBMおよびPBの分析には、細胞を抗−huCD3/CD14/CD15(すべてAF488コンジュゲート)、抗−CD14/CD15/CD19/CD20(すべてAF647コンジュゲート)、抗−huCD45−PB、抗−muCD45−BV510および抗huCD34−PECy7を含有するリニージカクテルで免疫標識に供された。使用したコンジュゲート抗体の一覧を表1および2に詳細に示す。
培養したLN18 SiA4(対照細胞株)、LN18 α4β1、およびLN18 α9β1細胞を、1mM CaCl2−MgCl2または1mM MnCl2を含有するTBS−2%FBS(50mM トリスHCl、150mM NaCl、2mMグルコース、10mM Hepes、pH7.4)中のR−BC154(50nM)で処理し、37℃で20分間インキュベートし、次にTBS−2%FBSで3回洗浄した。染色した細胞をPBS中4%パラホルムアルデヒドで5分間固定し、水で3回洗浄し、ついで2.5μg/mlのDAPIで染色した。その細胞をベクターシールド(Vectorshield)にのせ、水で洗浄し、カバースリップで覆い、4℃で一夜貯蔵し、その後で蛍光顕微鏡(オリンパスBX51)を用いて画像処理に付した。
培養したα4β1、α9β1および対照のLN18細胞(0.5x106細胞)を、TBS−2%FBS(カチオン不含、1mM CaCl2−MgCl2または1mM MnCl2のいずれかを含有する)中0、1、3、10、30および100nMの化合物22または25(R−BC154)のいずれかを100μlで用いて処理した。細胞を37℃で60分間インキュベートし、TBS−2%FBSで1回洗浄し、乾燥させてペレット状にし、フローサイトメトリー分析と関連付けられる結合バッファーに再懸濁させた。平均チャネル蛍光強度を濃度に対してプロットし、グラフパッド・プリズム6(GraphPad Prism 6)を用いてワン−サイト飽和リガンド結合曲線に適合させた。解離定数Kdをその曲線から決定した。
α4β1またはα9β1 LN18細胞(0.5x106細胞)を含有するエッペンドルフバイアルを、50nMのR−BC154(1mM CaCl2−MgCl2または1mM MnCl2のいずれかを含有するTBS−2%FBS中100μl)を用いて37℃で30分間まで処理し、関連する結合バッファーで1回洗浄し、乾燥させてペレット状にした。その細胞を500nMの標識化されていない競合阻害剤(1mM CaCl2−MgCl2または1mM MnCl2のいずれかを含有するTBS−2%FBS中100μl)を用いて37℃で指摘される時間(0、2.5、5、15、30、45、60分間)処理した。その細胞を冷却TBS−2%FBS(関連するカチオンを含有する)で希釈し、遠心分離に付してペレット状にし、フローサイトメトリー分析用の結合バッファーで1回洗浄し、該バッファー(約200μl)に再懸濁させた。平均チャネル蛍光強度を時間に対してプロットし、データをグラフパッド・プリズム6を用いて一相または二相のいずれかの指数的減衰関数に適合させた。オフ−レート、koffは該曲線より推定した。
α4β1またはα9β1 LN18細胞(0.5x106細胞)をTBS−2%FBS(1mM CaCl2−MgCl2または1mM MnCl2のいずれかを含有する)(50μl)中に含有するエッペンドルフバイアルをヒーティングブロックにて37℃で20分間予め活性化させた。100nM R−BC154(50μl−最終濃度=50nM)/関連するTBS−2%FBS(関連カチオンを含む)を各チューブに加え、37℃で0、0.5、1、2、3、5、10、15および20分間インキュベーションした後に、該チューブに3mlのTBS−2%FBS(関連カチオンを含む)を添加してクエンチさせた。該細胞をTBS−2%FBS(関連カチオンを含む)で1回洗浄し、遠心分離に付してペレット状にし、サイトメトリー分析用の関連する結合バッファー(200μl)に再び懸濁させた。平均チャネル蛍光強度を時間に対してプロットし、データをグラフパッド・プリズム6を用いて一相または二相のいずれかの結合関数に適合させた。観察されたオン−レート、kobsを該曲線より推定し、konを
(kobs−koff)/[R−BC154=50nM]
より推定した。
C57BI/6マウスをモナッシュ・アニマル・サービス(Monash Animal Services(Monash University, Clayton, Australia)で繁殖させた。6−8週齢のマウスを実験のために性適合させた。実験はすべてモナッシュ・アニマル・リサーチ・プラットフォーム(Monash Animal Research Platform)倫理委員会(MARP/2012/128)によって承認された。
PBS中R−BC154(25)(10mg/kg)をC57マウスに静脈内注射した。5分後、骨髄細胞をD. N. Haylockら、Stem Cells, 2007, 25, 1062-1069およびJ. Grassingerら、Cytokine, 2012, 58, 218-225において以前に記載されるように単離した。簡単には、1の大腿骨、脛骨および腸骨稜を摘出し、筋肉をきれいに取り除いた。骨端および骨幹端領域を除去した後、骨をPBS−2%FBSでフラッシュさせて全骨髄を得、それをPBS−2%FBSで洗浄し、次にフローサイトメトリーのために免疫標識に供した。R−BC154結合の分析の場合、発光スペクトルの重なりを最小にするために次の抗体の組み合わせを選択した。祖先細胞(LSK;リニージ−Sca−1+c−kit+)およびHSC(LSKSLAM;LSKCD150+CD48−)を染色する場合には、細胞をリニージカクテル(CD3、Ter−119、Gr−1、Mac−1、B220;すべての抗体 APC−Cy7とのコンジュゲートに付す)、抗−Sca−1−PB、抗−c−kit−AF647、抗−CD48−FITCおよび抗−CD150−BV650で標識化した。
骨内膜および中心ネズミ骨髄細胞の集団を、J. Grassingerら、Cytokine, 2012, 58, 218-225およびD. N. Haylockら、Stem Cells, 2007, 25, 1062-1069にて以前に記載されるように単離した。簡単には、1の大腿骨、脛骨および腸骨稜を摘出し、筋肉をきれいに取り除いた。骨端および骨幹端領域を除去した後、骨をPBS−2%FBSでフラッシュさせて中心骨髄細胞を得た。フラッシュに付した長骨、および骨端および骨幹端フラグメントをプールし、乳鉢および乳棒を用いて粉砕した。骨フラグメントをコラゲナーゼI(3mg/ml)およびジスパーゼII(4mg/ml)と一緒に37℃でオービタル振盪器にて750rpmで消化させた。5分後、骨フラグメントをPBSで1回、PBS2%FBSで1回洗浄し、骨内膜骨髄細胞を集めた。末梢血をレトロオービタルパンクチャーにより集め、NH4Cl溶解バッファーを室温で5分間用いて赤血球を溶解させた。単離した細胞集団をPBS2%FBSで洗浄し、次に上記の抗体カクテルにて記載されるようにフローサイトメトリーのために染色させた。
単核細胞(MNC)をNilsson, S. K.ら、Blood, 106, 1232-1239(2005)およびGrassinger, J.ら、Blood, 114, 49-59(2009)にて以前に記載されるように臍帯血より単離した。MNCをマウス抗−ヒトCD3、CD11b、CD14、CD16、CD20、CD24およびCD235a(BD)を含有するリニージ抗体カクテルと一緒にインキュベートし、次に細胞に付き2ビーズの割合で5分間2ラウンドのダイナル(Dynal)のヒツジ抗マウスIgGビーズ(Invitrogen, Carlsbad, CA)で処理し、ついで一定の回転速度で4℃にて10分間処理した。濃縮されたMNCをFACSで精製したCD34−フルオレセインイソチオシアナート(FITC)CD34+細胞で染色した。
インビトロでの標識実験の場合、C57マウス、条件付きα4 −/−/α9 −/−マウスおよびヒト化NODSCIDIL2Rγ−/−マウスおよびヒト臍帯血MNCから由来の5x106個のBM細胞を、40x106個の細胞/mlで4℃で20分間にわたって1mM CaCl2/MgCl2(活性化剤)または10mM EDTA(不活性化剤)のいずれかを含有するR−BC154(100nMまで)/PBS(0.5%BSA)で処理した。細胞をPBS(2%FBS)で洗浄し、次にフローサイトメトリー分析に付す前に「抗体カクテル」に記載されるように免疫標識に供した。インビボ実験の場合、C57BL/6マウス、α4 −/−/α9 −/−vav−creマウスおよびヒト化NODSCIDIL2Rγ−/−マウスは、R−BC154(10mg/kg)を100μl/10gのマウス体重で静脈内または皮下注射のいずれかで投与され、上記されるように分析された。
α4β1およびα9β1 LN18細胞(1−2x105個の細胞)を50nMのR−BC154(80μl、1mM CaCl2/MgCl2を含有するPBS−2%FBS中)で37℃にて10分間処理し、PBSで洗浄し、遠心分離に付してペレット状にし、次にBOP(80μl、1mM CaCl2/MgCl2を願有するPBS−2%FBS)を用いて0、0.01、0.1、0.3、1、10、100および300nMで処理した。細胞を37℃で90分間インキュベートし、PBSで洗浄し、遠心分離に付してペレット状にし、フローサイトメトリー分析用のPBS(200μl)に再懸濁させた。%最大平均蛍光強度(MFI)をBOPの対数濃度に対してプロットし、データをリガンド結合のS字型用量応答曲線に適合させ、IC50値をグラフより得た。LSKおよびLSKSLAM細胞に結合するR−BC154の競合的置換については、フローサイトメトリー分析に付す前に、R−BC154を注射したマウスより単離したWBM細胞を、PBS中500nM BOP(0.5%BSAおよび1mM CaCl2/MgCl2を含有する)で45分間にわたって37℃で処理した。
動員実験については、すべてのマウスを100μl/10gの体重で皮下注射し、咽喉部の出血操作によりEDTA被覆のシリンジを用いてPBを採取した。
ヒト化NSGマウスが、新たに選別された臍帯血CD34+細胞(>150k)を2x106個の放射線照射された単核支持細胞と一緒に尾静脈注射することにより作製された。移植した4−5週間後に、NSGマウスを眼出血に供し、huCD45およびmuCD45について評価した。これらの条件下、CD45の合計%に対するhuCD45の%に基づき、フローサイトメトリー分析により測定した場合に>90%のヒト化が達成された。ヒト化NSGマウスは回復するのに実験まで少なくとも1週間を要した。マウスを「動員プロトコル」にて特定される関連する条件下で動員させ、その後でPBを咽喉部出血により集め、溶解させ、「抗体カクテル」に記載されるように免疫標識に供した。
低−および高−増殖能コロニー形成細胞(各々、LPP−CFCおよびHPP−CFC)を、J. Grassingerら、Cytokine, 2012, 58, 218-225およびBartelmez, S. H.ら、Experimental Hematology 17, 240-245(1989)において以前に記載されるようにアッセイした。簡単には、動員したPBを溶解させ、4000WBCを35mm径ペトリ皿に入れた二層のニュートリエント寒天培養系(組換えマウス幹細胞因子および組換えヒトコロニー刺激因子−1、インターロイキン−1α(IL−1α)およびIl−3を含有する)に置いた。培養物をヒト化インキュベーター中の5%O2、10%CO2、85%N2にて37℃でインキュベートした。LPP−CFCおよびHPP−CFCをJ. Grassingerら(2012)において以前に記載されるように14日間のインキュベーションで列挙した。
(a)限界希釈分析
RFPマウスをBOP(n=15)で処理し、1時間後にPBを採取した。処理群当たりの各ドナーのマウスからのPBをプールし、溶解させ、PBS中に最初の血液容量の1/3を占めるようにした。放射線照射したWBMフィラー細胞(2x105/マウス)を特定された移植片容量で溶解したPBのアリコートに加え、次にPBSをいっぱいになるまで注ぎ足し、200μl/マウスとした。放射線照射したC57BL/6マウスに尾静脈注射を介して投与し、多リニージRFP生着を移植した6、12および20週間後に評価した。
RFP(n=5)およびGFP(n=5)マウスを、「動員プロトコル」に記載されるように、各々、BOP(1時間)およびG−CSF(1日に2回、4日間)で処理した。次に、PBを採取し、RFPおよびGFP群内にある血液をプールし、溶解させ、洗浄し、PBS中に最初の血液容量の1/3まで再懸濁させた。等容量のRFPおよびGFPの血液を混合し、マウス当たり500μlのRFPおよびGFPの血液を移植させた。放射線照射に付したWBMフィラー細胞(2x105/マウス)を加え、その混合物にPBSをいっぱいになるまで注ぎ足し、200μlの注射液/マウスとした。放射線照射したC57BL/6受容者(n=5)に尾静脈注射を介して投与し、RFPおよびGFP生着を移植した6、12および20週間後に評価した。20週間のテイクダウンで、各一次受容者(n=5)からのWBM細胞(大腿骨の10分の1)を放射線照射したC57二次受容者(n=4/一次受容者)に移植し、多リニージ生着について移植した6、12および20週間後に評価した。
データを、そのデータセットに適する、スチューデントt−試験、一方向または二方向ANOVAを用いて分析した。幹細胞の再生頻度の測定については、L−CALCソフトウェア(Stem Cell Technologies)を用いるポアソン解析が行われた。対数ランク(Mantel-Cox)試験は生存曲線と比べるのに使用された。p<0.05は有意であると考えられた。
(a)アンタゴニスト化合物の合成
種々の実施態様の試剤は以下に記載の反応経路および合成スキームを用いて調製され得る。実施態様の特定の化合物の調製は、以下の実施例において詳細に記載されるが、当業者であれば、その記載される化学反応が種々の実施態様の多数の他の試剤を調製するのに容易に適合され得ることを理解するであろう。例えば、例示されていない化合物の合成は、当業者に明らかな修飾により、例えば、干渉基を適宜保護することにより、当該分野にて公知の他の適切な試薬と交換することにより、あるいは反応条件を慣用的に修飾することにより、うまく行うことができる。有機合成における適切な保護基の一覧をT.W. Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, 1991に見ることができる。あるいはまた、本明細書に記載の、または当該分野にて公知の他の反応は、種々の実施態様の他の化合物を調製するのに適用性のあることが理解されよう。
TFA(1.27mL、16.6ミリモル)をN−(ベンジルオキシカルボニル)−L−プロリル−L−O−(tert−ブチルエーテル)チロシンメチルエステル26(0.80g、1.66ミリモル;Genscriptからカスタムしたペプチド合成)の乾燥CH2Cl2(10mL)中0℃での懸濁液に滴下して加えた。その混合物をゆっくりと室温にまで加温し、3時間攪拌した。その時点でTLC(70:30 EtOAc/石油スピリット)は出発材料が完全に消費されたことを示した。その混合物をEtOAcで希釈し、H2O、ブラインで洗浄し、乾燥(MgSO4)させて、減圧下で濃縮した。残渣をトルエンと一緒に濃縮し(x3)、粗N−(ベンジルオキシカルボニル)−L−プロリル−L−O−チロシンメチルエステル27(700mg)を無色の油状物として得、それをさらに精製することなく、次工程に用いた。
1−ピロリジンカルボニルクロリド(147μL、1.38ミリモル)を粗フェノール27(393mg、0.922ミリモル)およびK2CO3(256mg、1.84ミリモル)のDMF(5mL)中混合物に添加した。その混合物を50℃で一夜攪拌し、EtOAc/H2Oで希釈し、有機相を分離した。有機層を5%HCl、飽和水性NaHCO3、ブラインで洗浄し、乾燥(MgSO4)させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(70%EtOAc/石油スピリット)に付して精製し、カルバマート28(355mg、74%)を無色の泡沫体として得、それをさらに精製することなく、次工程に用いた。
Cbz保護のジペプチド28(356mg、0.681ミリモル)および10%Pd/C(50%H2O、150mg)のMeOH(30mL)中混合物をH2で3回パージした。該混合物をH2雰囲気下で3時間攪拌し、その時点でTLC(10%MeOH/CH2Cl2)は出発材料が完全に消費されたことを示した。該混合物をセライト層を通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(5%→10%MeOH/CH2Cl2)に付して精製し、アミン29(224mg、85%)を無色の油状物として得た。δH(400MHz、CDCl3):1.64−1.78(2H,m)、1.82−1.92(5H,m)、2.16−2.25(1H,m)、2.97−3.15(4H,m)、3.39(2H,t,J=6.5Hz)、3.49(2H,t,J=6.5Hz)、3.65(3H,s)、4.03(1H,dd,J=5.7、8.3Hz)、4.72(1H,dd,J=7.8、13.3Hz)、5.69(1H,brs)、6.99(2H,d,J=8.3Hz)、7.13(2H,d,J=8.3Hz)、8.41(1H,d,J=7.9Hz)
DIPEA(95μL、0.546ミリモル)をアミンD(71mg、0.182ミリモル)、PhSO2Cl(35μL、0.273ミリモル)およびDMAP(2.2mg、0.018ミリモル)のCH2Cl2(3mL)中攪拌溶液に添加した。その混合物を室温で4時間攪拌し、減圧下で濃縮した、残渣をフラッシュクロマトグラフィー(2.5%MeOH/CH2Cl2)に付して精製し、生成物E(93mg、96%)を無色の泡沫体として得た。δH(400MHz、CDCl3):1.42−1.56(3H,m)、1.90−2.05(5H,m)、3.03(1H,dd,J=7.6、14.0Hz)、3.10−3.16(1H,m)、3.26(1H,dd,J=5.6、14.0Hz)、3.35−3.40(1H,m)、3.45(2H,t,J=6.5Hz)、3.54(2H,t,J=6.5Hz)、3.77(3H,s)、4.08(1H,dd,J=2.0、8.0Hz)、4.82(1H,dt,J=5.7、11.6Hz)、7.06(2H,d,J=8.7Hz)、7.13(2H,d,J=8.7Hz)、7.25(1H,d,J=7.5Hz;溶媒のピークにより遮蔽されている)、7.52−7.57(2H,m)、7.61−7.65(1H,m)、7.83−7.85(2H,m)
0.1M NaOH(3.2mL、0.162ミリモル)をそのエステル30(86mg、0.162ミリモル)のMeOH(10mL)中溶液に加え、該混合物を室温で一夜攪拌した。該反応物をアンバーライト樹脂(H+形態)でクエンチさせ、濾過し、その濾液を減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(10%MeOH/CH2Cl2)に付して精製し、生成物のBOP(68mg、81%)を無色のガラス状物として得た。δH(400MHz、d4−MeOH):1.47−1.55(1H,m)、1.59−1.72(2H,m)、1.77−1.85(1H,m)、1.93−2.00(4H,m)、3.11(1H,dd,J=7.8、13.7Hz)、3.18−3.24(1H,m)、3.27(1H,dd,J=5.0、13.7Hz)、3.35−3.44(3H,m)、3.56(2H,d,J=6.5Hz)、4.14(1H,dd,J=4.0、8.5Hz)、4.69(1H,m)、7.04(2H,d,J=8.5Hz)、7.27(2H,d,J=8.5Hz)、7.60(2H,t,J=7.6Hz)、7.69(1H,t,J=7.4Hz)、7.86(2H,d,J=7.4Hz)
ジイソプロピルアゾカルボキシラート(1.87mL、9.48ミリモル)を、N−フェニルスルホニル−トランス−4−ヒドロキシ−L−プロリン(2.45g、9.03ミリモル)およびトリフェニルホスフィン(2.49g、9.48ミリモル)のCH2Cl2(150mL)中攪拌懸濁液に0℃のN2下にて20分間にわたって滴下して加えた。反応物を室温にまで加温させ、一夜攪拌し、減圧下で濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー(50:50 EtOAc/石油スピリット)に付して精製し、ラクトン4(1.77g、78%)を無色の固体として得た。分光データは前に報告されている値と同じである。
1−ピロリジンカルボニルクロリド(336μL、3.04ミリモル)をチロシン5(500mg、1.52ミリモル)およびK2CO3(420mg、3.04ミリモル)のCH3CN(9mL)中混合物を含有するバイオタージ(Biotage)(登録商標)マイクロ波バイアルに加えた。該混合物をマイクロ波反応器中にて100℃で45分間加熱し、H2Oで希釈し、ついで30分間攪拌した。水層をEtOAc(2x20mL)で抽出し、有機相を合わせ、飽和水性NaHCO3で洗浄し、乾燥(MgSO4)させ、減圧下で濃縮した。残渣を再結晶(EtOAc/石油スピリット)に供し、カルバマート6(484mg、75%)を無色の結晶として得た。融点:116−117℃;[α]D +42.5(c 0.81 CHCl3中);δH(400MHz、CDCl3) 1.94(4H,m,(CH2)2)、3.09(2H,m)、3.47(2H,t,J=6.5Hz)、3.55(2H,t,J=6.5Hz)、3.71(3H,s)、4.64(1H,m)、5.10(2H,s)、5.22(1H,d,J=8.0Hz)、7.03−7.38(9H,m);δC(100MHz、CDCl3) 25.0、25.8、37.5、46.3、46.4、52.3、54.8、67.00、121.9(2C)、128.1(2C)、128.1、128.5(2C)、130.0(2C)、132.4、136.2、150.6、153.0、155.6、171.9;ν/cm−1 3331、2954、1719、1698、1511、1402、1345、1216、1061、1020、866、754、699;HRMS(ESI+) m/z 449.1686(C23H26N2NaO6として、[M+Na]+:計算値 449.1689)
保護チロシン6(950mg、1.13ミリモル)およびPd/C(10%、50mg)のMeOH(40mL)中混合物をH2で3回パージした。その混合物をH2雰囲気下で2時間攪拌し、その時点でTLCは出発材料が完全に消費されたことを示した。該混合物をセライト層を通して濾過し、濾液を減圧下で濃縮し、粗アミン7(637mg、98%)を無色の油状物として得、放置して固体とした。少量部を特徴付けのためにフラッシュクロマトグラフィー(5:95→10:90 MeOH/CH2Cl2)に付してさらに精製した。[α]D −11.6(c 1.09 MeOH中);δH(400MHz、CDCl3) 1.97(4H,m)、2.91(1H,dd,J=7.1、13.6Hz)、3.02(1H,dd,J=6.1、13.6Hz)、3.42(2H,t,J=6.5Hz)、3.43(2H,t,J=6.5Hz)、3.68(3H,s)、4.84(2H,brs)、3.70(1H,dd,J=6.2、7.1Hz)、7.05(2H,m)、7.21(2H,m);δC(100MHz、CDCl3) 25.9、26.7、41.1、47.5、47.5、52.4、56.7、123.0(2C)、131.2(2C)、135.6、151.6、155.1、176.1;ν/cm−1 3311、2954、2878、1714、1510、1399、1344、1214、1168、1086、1062、1020、864、755;HRMS(ESI+) m/z 293.1497(C15H20N2O4SHとして、[M+H]+:計算値 293.1496)
ラクトン4(466mg、1.84ミリモル)およびアミン7(510mg、1.76ミリモル)のトルエン/H2O(5:1、6mL)中混合物を80℃で2日間加熱し、次にEtOAcで希釈し、1M HCl、飽和水性NaHCO3、ブラインで洗浄し、乾燥(MgSO4)させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(100%EtOAc→5%MeOH/EtOAc)に付して精製し、アルコール8(851mg、89%)を無色の泡沫体として得た。[α]D −31.4(c 1.66 MeOH中);δH(400MHz、CDCl3) 1.57(1H,m)、1.89−2.00(5H,m)、2.94(1H,dd,J=9.5、14.0Hz)、3.13(1H,dd,J=4.0、10.5Hz)、3.23(1H,d,J=10.5Hz)、3.35(1H,dd,J=5.0、14.0Hz)、3.40(2H,t,J=6.5Hz)、3.51−3.56(3H,m)、3.78(3H,s)、4.03(1H,m)、4.12(1H,d,J=9.0Hz)、4.75(1H,m)、6.99(2H,d,J=8.3Hz)、7.07(1H,d,J=7.5Hz)、7.19(2H,8.3Hz)、7.51−7.63(3H,m)、7.83(2H,d,J=7.5Hz);δC(100MHz、CDCl3) 25.1、25.9、37.0、37.6、46.5、46.6、52.6、53.3、57.8、61.7、69.7、122.5(2C)、127.9(2C)、129.4(2C)、130.5(2C)、133.4、133.8、136.3、150.2、154.1、171.6、171.7;ν/cm−1 3408、1743、1718、1701、1663;HRMS(ESI+) m/z 568.1723(C26H31NaN3O8Sとして、[M+Na]+:計算値 568.1730)
アルコール8(105mg、0.19ミリモル)をN2下の−20℃で乾燥CH2Cl2(2mL)に溶かした。DIPEA(99μL、0.57ミリモル)を加え、つづいてTf2O(50μL、0.57ミリモル)を30分間にわたって滴下して加えた。反応物を−20℃で2時間攪拌し、次に飽和水性NaHCO3でクエンチさせ、EtOAcで希釈し、有機相を分離した。その有機相をH2O、2%クエン酸、飽和水性NaHCO3、ブラインで洗浄した。水相をEtOAc(2回)で抽出し、有機相を合わせ、乾燥(MgSO4)させ、残渣を減圧下で濃縮し、粗トリフラート9を得た。この残渣にPEGアミン10(141mg、0.39ミリモル)/乾燥THF(200μL)を加え、反応物を室温で一夜攪拌した。その混合物を10%ブタン−2−オール/EtOAc(20mL)で希釈し、有機相を飽和水性NaHCO3、ブラインで洗浄し、乾燥(MgSO4)させ、減圧下で濃縮した。粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー(2%→3% MeOH/CH2Cl2)に付して精製し、11(46mg、2工程にわたって27%)を無色の油状物として得た。少量部を特徴付けのためにC18−シリカゲルクロマトグラフィー(40%H2O/MeCN)に付してさらに精製した。δH(400MHz、CDCl3) 1.40(1H,m)、1.55(2H,m)、1.77(2H,m)、1.93(4H,m)、2.12(1H,m)、2.43(2H,m)、2.82(1H,dd,J=7.8、9.2Hz)、2.94(1H,m)、3.02(1H,dd,J=7.8、14.0Hz)、3.23−3.32(4H,m)、3.38(2H,t,J=6.1Hz)、3.44(2H,t,J=6.6Hz)、3.46−3.60(14H,m)、3.76(3H,s)、4.09(1H,dd,J=3.0、8.9Hz)、4.85(1H,td,J=5.7、7.8Hz)、5.07(2H,s)、5.42(1H,brs)、7.05(2H,d,J=8.6Hz)、7.14(2H,d,J=8.6Hz)、7.21(1H,d,J=7.8Hz)、7.28−7.35(5H,brm)、7.53(2H,t,J=7.5Hz)、7.60(1H,brt,J=7.04)、7.81(1H,brd,J=7.05Hz);δC(100MHz、CDCl3) 25.1、25.9、29.6、30.1、36.5、37.5、39.4、45.9、46.5、46.6、52.6、53.3、54.7、56.5、61.6、66.6、69.8、69.7、70.3、70.3、70.67、70.72、122.0(2C)、128.1(2C)、128.2(2C)、128.6(3 C)、129.4(2C)、130.2(2C)、133.0、133.5、136.0、137.0、150.7、153.2、156.6、170.9、171.6;ν/cm−1 3334、2877、2341、1706、1521;HRMS(ESI+) m/z 904.3770(C44H59NaN5O12Sとして、[M+Na]+:計算値 904.3779)
ラクトン4(1.74g、6.88ミリモル)およびNa2CO3(3.65g、34.4ミリモル)のMeOH(50mL)中混合物を室温で一夜攪拌した。残渣を濃縮し、EtOAc(100mL)に溶かし、H2Oおよび有機相を分離した。水相をEtOAc(2x30mL)で抽出し、有機相を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥(MgSO4)させて減圧下で濃縮し、メチルエステル12(1.57g、80%)を無色の固体として得た。分光データは報告されている値と一致し、その材料をさらに精製することなく用いた。
MsCl(304μL、3.93ミリモル)を、アルコール12(934mg、3.27ミリモル)およびトリエチルアミン(620μL、4.48ミリモル)の乾燥CH2Cl2(20mL)中混合物にN2下の0℃で添加した。その混合物を2時間攪拌し、CH2Cl2で希釈し、5%HCl、飽和水性NaHCO3、ブラインで連続して洗浄し、乾燥(MgSO4)させ、減圧下で濃縮し、粗メシラートを淡黄色の油状物として得た。この残渣をDMSO(13ml)に溶かし、NaN3(638mg、9.81ミリモル)で処理し、該混合物80℃で一夜攪拌した。反応物をEtOAcで希釈し、H2O、ブラインで洗浄し、乾燥(MgSO4)させて濃縮した。その残渣を再結晶(MeOH)により精製して、16(874mg、2工程にわたって86%)を無色の針状晶として得た。融点:98−100℃、[α]D −33.4(c 1.02 CHCl3中);δH(400MHz、CDCl3) 2.17−2.21(2H,m)、3.43(1H,ddd,J=0.7、3.0、11.0Hz)、3.71(1H,dd,J=5.0、11.0Hz)、3.76(3H,s)、4.18−4.22(1H,m)、4.30(1H,t,J=7.5Hz)、7.53−7.58(2H,m)、7.61−7.65(1H,m)、7.87−7.89(2H,m);δC(100MHz、CDCl3) 36.5、52.9、53.2、59.45、59.51、127.6(2C)、129.3(2C)、133.3、137.6、171.9;ν/cm−1 2101、1747、1445、1345、1207、1158、1095、1017、758、722、696;HRMS(ESI+) m/z 311.0808(C12H14N4O4SHとして、[M+H]+:計算値 311.0809);m/z 328.1073(C12H14N4O4S・NH4として、[M+NH4]+:計算値 328.1074
3:1 EtOH/THF(40mL)中のメチルエステル16(586mg、1.89ミリモル)を0.2M NaOH(12.3mL、2.45ミリモル)で処理した。混合物を室温で3時間攪拌し、次に減圧下で濃縮した。その粗材料をジエチルエーテルで希釈し、水相を分離した。有機層を0.2M NaOH(2x10mL)で抽出し、水性抽出液を合わせ、10%HClで酸性にした。水層をCHCl3(4x30mL)で抽出し、有機相を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥(MgSO4)させ、減圧下で濃縮した。その粗材料をフラッシュクロマトグラフィー(5%MeOH/CH2Cl2+0.5%AcOH)に付して精製し、酸17(492mg、88%)を無色の油状物として得た。[α]D −34.4(c 0.82 MeOH中);δH(400MHz、CDCl3) 2.18−2.32(2H,m)、3.40(1H,m)、3.73(1H,dd,J=4.8、11.5Hz、H5’)、4.22(1H,m,H4)、4.29(1H,t,J=7.7Hz)、7.56(2H,m)、7.64(1H,m)、7.88(2H,m)、10.72(1H,brs);δC(100MHz、CDCl3) 36.1、53.4、59.5、127.6(2C)、129.4(2C)、133.6、136.9、176.6;ν/cm−1 3500−2500、2107、1731;HRMS(ESI+) m/z 319.0472(C11H12N4NaO4Sとして、[M+Na]+:計算値 319.0472)
O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスファート(HBTU)(693mg、1.83ミリモル)を酸17(491mg、1.66ミリモル)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(578μL、3.32ミリモル)のDMF(6mL)中攪拌混合物に0℃で添加し、N2下で10分間攪拌した。次に、アミン7(484mg、1.66ミリモル)/DMF(6mL)を滴下して加え、混合物を合わせ、室温に加温して一夜攪拌した。該混合物をEtOAcで希釈し、5%HCl、飽和水性NaHCO3、ブラインで連続して洗浄し、乾燥(MgSO4)させ、減圧下で濃縮した。その残渣をフラッシュクロマトグラフィー(3%MeOH/CH2Cl2)に付して精製し、ジペプチド7(928mg、98%)を淡黄色の泡沫体として得た。[α]D −4.6(c 0.85 CHCl3中);δH(400MHz、CDCl3) 1.67(1H,m)、1.86−1.98(4H,m)、2.04(1H,dt,J=5.5、13.2Hz)、2.99(1H,dd,J=8.5、14.0Hz)、3.19(1H,dd,J=4.5、10.9Hz)、3.30(1H,dd,J=5.5、14.0Hz)、3.44(2H,t,J=6.5Hz)、3.48(1H,dd,J=5.5、11.5Hz)、3.53(2H,t,J=6.5Hz)、3.78(3H,s)、3.82(1H,m)、4.09(1H,dd,J=5.5、8.4Hz)、4.87(1H,dt,J=8.3、8.3、5.5Hz)、7.05、7.15(4H,2xd,J=8.5Hz)、7.19(1H,d,J=8.2Hz)、7.53−7.57(2H,m)、7.62−7.66(1H,m)、7.83−7.86(2H,m);δC(100MHz、CDCl3) 25.1、25.9、35.6、37.5、46.4、46.6、52.7、53.1、53.8、58.9、61.1、122.1(2C)、128.0(2C)、129.5(2C)、130.2(2C)、132.9、133.7、136.0、150.7、153.1、169.9、171.5;ν/cm−1 3316、2975、2880、2105、1716、1682;HRMS(ESI+) m/z 593.1789(C26H30N6NaO7Sとして、[M+Na]+:計算値 593.1789)
メタンスルホニルクロリド(92μL、1.18ミリモル)をアルコール8(251mg、0.394ミリモル)およびトリエチルアミン(170μL、1.22ミリモル)の乾燥CH2Cl2中攪拌混合物にN2下の0℃で添加した。該反応物を0℃で1時間攪拌し、次に室温に加温し、さらに1時間攪拌した。その反応物をCH2Cl2で希釈し、5%HCl、飽和水性NaHCO3およびブラインで続けて洗浄した。有機相を乾燥(MgSO4)させ、減圧下で濃縮し、中間体のメシラート、(4−((S)−3−メトキシ−2−((2S,4S)−4−((メチルスルホニル)オキシ)−1−(フェニルスルホニル)ピロリジン−2−カルボキシアミド)−3−オキソプロピル)フェニル ピロリジン−1−カルボキシラート)(270mg、定量的収量)を無色の泡沫体として得、それをさらに精製することなく用いた。[α]D −13.5(c 1.0 CHCl3中);δH(400MHz、CDCl3) 1.81(1H,m)、1.89−1.96(4H,m)、2.63(1H,brd)、2.82(3H,s)、3.06−3.18(2H,m)、3.44(2H,t,J=6.4Hz)、3.50−3.55(3H,m)、3.68(1H,dt,J=1.3、12.5Hz)、3.71(3H,s)、4.63(1H,dd,J=2.0、10.1Hz)、4.73(1H,dd,J=6.7、13.4Hz)、5.02(1H,tt,J=1.4、4.7Hz)、7.07(2H,d,J=8.6)、7.16(2H,d,J=8.6Hz)、7.39(1H,d,J=7.5Hz)、7.56(2H,t,J=7.6Hz)、7.64−7.68(1H,m)、7.81−7.84(2H,m);δC(100MHz、CDCl3) 25.1、25.9、35.5、37.4、38.9、46.5、46.5、52.5、54.0、55.4、61.0、78.0、122.1(2C)、128.0(2C)、129.8(2C)、130.1(2C)、132.8、134.1、135.4、150.7、153.1、169.8、171.3;ν/cm−1 3409、2954、2880、1715、1678、1511;HRMS(ESI+) m/z 646.1497(C27H33NaN3O10S2として、[M+Na]+:計算値 646.1505)
アスコルビン酸ナトリウム(4.4mg、22.2マイクロモル)、CuSO4(224μL、2.24マイクロモル、H2O中0.01M)およびTBTA(281μL、2.81マイクロモル、THF中0.01M)を、アジド18(32mg、56.1マイクロモル)およびアルキン15(25mg、61.8マイクロモル)のDMF(1mL)中混合物に続けて添加した。反応物を60℃で2時間攪拌し、次にEtOAc(20mL)で希釈した。有機相を飽和水性NaHCO3、ブラインで洗浄し、乾燥(MgSO4)させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(21:2:1:1 EtOAc/アセトン/MeOH/H2O)に付して精製し、トリアゾール生成物19(54mg、99%)を無色の油状物として得た。[α]D +10.7(c 1.0 CHCl3中);δH(400MHz、CDCl3) 1.72−1.94(8H,m)、2.14(1H,dt,J=12.8、13.9Hz)、2.54(1H,ddd,J=2.3、6.5、12.9Hz)、2.92(1H,dd,J=10.0、13.9Hz)、3.29(2H,dd,J=6.0、12.3Hz)、3.38(1H,dd,J=4.8Hz、13.9Hz)、3.41−3.63(19H,m)、3.80(3H,s)、3.83(1H,m)、4.29(1H,dd,J=2.0、8.7Hz)、4.65(1H,m)、4.94(1H,dt,J=4.9、9.8Hz)、5.06(2H,brs)、5.44(1H、brt、J=5.7Hz)、7.04(2H,d,J=8.5Hz)、7.23(2H,d,J=8.5Hz)、7.28−7.33(5H,m)、7.38−7.43(2H,m)、7.52(2H,t,J=7.7Hz)、7.62(1H,t,J=7.5Hz)、7.79(2H,d,J=7.3Hz)、8.18(1H,s);δC(100MHz、CDCl3) 25.1、25.9、29.4、29.5、33.7、37.2、37.9、39.4、46.4、46.6、52.7、53.2、53.6、57.9、60.7、66.5、69.7、69.7、70.3、70.5、70.6、70.7、122.2(2C)、126.1、127.7(2C)、128.1、128.2、128.5(3 C)、129.7(2C)、130.3(2C)、133.1、133.9、135.5、136.9、143.2、150.6、153.3、156.6、159.8、169.0、171.5;ν/cm−1 3331、2951、2875、1714、1667、1575、1512;HRMS(ESI+) m/z 999.3891(C47H60NaN8O13Sとして、[M+Na]+:計算値 999.3893)
水性NaOH(1.13mL、0.225ミリモル、0.2M)をメチルエステル19(110mg、0.113ミリモル)のEtOH/THF(2:1、3mL)中攪拌混合物に添加し、室温で一夜攪拌した。反応物を1M HClでクエンチし、EtOAcで希釈し、有機相を分離した。水相をCHCl3で2回抽出し、有機相を合わせ、乾燥(MgSO4)させ、減圧下で濃縮し、粗酸20(100mg)を得た。その粗酸および10%Pd/C(50mg、50%H2O)のMeOH/H2O(5:1、12mL)中混合物をH2雰囲気下にて室温で2時間攪拌した。該混合物をセライト層を通して濾過し、減圧下で濃縮し、残渣をC18逆相カートリッジ(100%H2O→50%MeOH/H2O)を用いて精製した。その精製した材料を凍結乾燥させ、アミン21(81.3mg、2工程にわたって87%)を綿毛のようにフワッとした無色の粉末として得た。[α]D −16.0(c 0.49 MeOH中);δH(400MHz、D2O) 1.81(4H,m)、1.91(4H,m)、2.38(1H,m)、2.98−3.09(4H,m)、3.21−3.30(3H,m)、3.30(2H,m)、3.45(2H,t,J=6.8Hz)、3.59−3.66(12H,m)、3.89(1H,d,J=12.9Hz)、4.04(1H,dd,J=4.8、12.9Hz)、4.41(1H,t,J=8.2Hz)、4.53(1H,dd,J=5.3、7.4Hz)、5.00(1H,brs)、6.99(2H,d,J=8.5Hz)、7.306−7.356(4H,m)、7.43−7.50(3H,m)、7.99(1H,s);δC(100MHz、D2O+アセトン) 25.2、25.8、27.2、29.1、35.5、36.9、37.2、38.3、47.1、47.1、49.5、55.1、56.7、60.4、61.7、68.9、69.3、70.1、70.2、70.3、122.6(2C)、125.8、127.5(2C)、130.2(2C)、131.2(2C)、134.5、135.1、135.6、142.9、150.4、155.6、161.9、173.2、175.8;ν/cm−1 3382、3064、2950、2878、1706、1658、1511;HRMS(ESI+) m/z 829.3550(C38H52N8O11Sとして、[M+H]+:計算値 829.3549)
アミン21(9.5mg、11.3マイクロモル)の0.2M NaHCO3(1mL)中混合物を5(6)−カルボキシテトラメチルロダミン N−スクシンイミジルエステル(NHS−ロダミン、Thermo Scientific)(8.9mg、16.9マイクロモル)で処理し、その混合物を室温で一夜攪拌させた。該反応物を酢酸でクエンチさせ、濃縮し、残渣を逆相クロマトグラフィー(50%MeOH/H2O→100%MeOH)に付して精製し、ロダミン標識の化合物22(5.3mg、38%)を凍結乾燥後に紫色粉末として得た。化合物22を位置異性体の混合物(5:1)として得た。δH(400MHz、d4−メタノール) 主たる異性体:1.80−1.99(9H,m)、2.37(1H,dt,J=6.6、13.5Hz)、2.70(1H,m)、3.08(1H,dd,J=7.5、13.9Hz)、3.22−3.26(1H,m)、3.26(6H,s)、3.27(6H,s)、3.35(2H,t,J=6.3Hz)、3.43(2H,t,J=6.3Hz)、3.48−3.66(17H,m)、3.74(1H,dd,J=3.7、12.0Hz)、3.91(1H,dd,J=6.0、12.0Hz)、4.45(1H,t,J=7.1Hz)、4.61(1H,t,J=5.6Hz)、4.94(1H,m)、6.86(2H,brs)、6.95−6.99(4H,m)、7.16(2H,d,J=9.5Hz)、7.28(2H,d,J=8.1Hz)、7.35−7.42(3H,m)、7.51(1H,t,J=7.3Hz)、7.60−7.63(2H,m)、8.06−8.08(2H,m)、8.56(1H,s);δC(100MHz、d4−メタノール) 従たる異性体:25.9、26.7、30.4、36.6、38.0、38.1、38.9、40.9(4C)、47.47、47.53、55.9、60.3、62.3、70.3、70.5、71.35、71.4、71.6(2C)、97.3(2C)、114.8(2C)、115.2(2C)、122.7(4C)、126.3、128.6(2C)、130.0、130.1、130.5(2C)、131.1、131.7(4C)、132.5(2C)、134.4(2C)、136.0、137.2、137.3、138.1、144.0、151.6、155.1、158.7(2C)、159.0(2C)、161.6、162.0、168.7、172.6;HRMS(ESI+) m/z 1241.4970(C63H72N10O15SHとして、[M+H]+:計算値 1241.4972)
PEG−スペーサーを欠く、化合物25(R−BC154)はまた、以下のスキーム5に示されるように合成された:
メチルエステル18(420mg、0.737ミリモル)/EtOH(10mL)を0.2M NaOH(4.05mL、0.811ミリモル)で処理し、室温で1時間攪拌した。その混合物を減圧下で濃縮し、EtOHを除去し、水相を10%HClで酸性にした。水相をCHCl3(4x10mL)で抽出し、有機相を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥(MgSO4)させ、減圧下で濃縮した。その粗材料をフラッシュクロマトグラフィー(10%MeOH/CH2Cl2+0.5%AcOH)に付して精製し、酸23(384mg、94%)を淡黄色の泡沫体として得た。[α]D −0.7(c 1.00 CHCl3中);δH(400MHz、CDCl3) 1.67−1.73(1H,m)、1.89−1.96(5H,m)、3.10(1H,dd,J=8.0、13.8Hz)、3.21(1H,dd,J=4.0、11.5Hz)、3.38(1H,dd,J=5.3、14.0Hz)、3.44−3.55(5H,m)、3.81(1H,m)、4.11(1H,t,J=6.5Hz)、4.89(1H,m)、7.05、7.22(4H、2xd,J=8.0Hz)、7.41(1H,d,J=6.8Hz)、7.53−7.64(3H,m)、7.85(2H,d,J=7.5Hz);δC(100MHz、CDCl3) 25.0、25.8、36.1、36.8、46.5、46.6、53.2、53.9、58.9、61.2、122.0(2C)、128.0(2C)、129.4(2C)、130.5(2C)、133.6、133.7、136.0、150.5、153.6、170.9、173.7;ν/cm−1 3329、2977、2881、2105、1706、1672;HRMS(ESI+) m/z 557.1817(C25H29N7O6Sとして、[M+H]+:計算値 557.1813)
アジド23(12mg、22マイクロモル)およびN−プロピニルスルホロダミンB24(14mg、24マイクロモル)/DMF(2mL)をCuSO4(86μL、0.86マイクロモル、H2O中0.01M)、アスコルビン酸ナトリウム(430μL、4.3マイクロモル、H2O中0.01M)およびトリス[(1−ベンジル−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)メチル]アミン(TBTA)(108μL、1.08マイクロモル、DMF中0.01M)で処理した。その混合物を60℃で2時間攪拌し、その時点でTLCは新たな蛍光性生成物の形成を示した。該混合物を減圧下で濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー(40:10:1 CHCl3/MeOH/H2O+0.5%AcOH)に付して一部精製した。この材料をHPLC(15分間にわたって50%−98%勾配のMeCN/H2O(TFA中0.1%);Rt=14.9分間)に付してさらに精製し、純生成物25(10.6mg、43%)を紫色のガラス状物として得た。δH(400MHz、d4−メタノール) 1.27−1.31(12H,dt,J=7.0、3.5Hz)、1.91−1.98(4H,m)、2.29−2.35(1H,m)、2.71−2.78(1H,m)、3.08(1H,dd,J=7.5、13.8Hz)、3.22(1H,dd,J=5.3、13.8Hz)、3.41(2H,t,J=6.5Hz)、3.54(2H,t,J=6.5Hz)、3.63−3.70(8H,m)、3.85(1H,dd,J=3.5、12.0Hz)、3.97(1H,dd,J=5.6、11.6Hz)、4.21(2H,d,J=1.4Hz)、4.41(1H,t,J=7.3Hz)、4.72(1H,dd,J=5.4、7.5Hz)、5.08(1H,m)、6.91(2H,t,J=2.2Hz)、6.98−7.04(4H,m)、7.11(2H,t,J=9.0Hz)、7.30(2H,d,J=8.6Hz)、7.40(1H,d,J=8.0Hz)、7.44(2H,t,J=7.5Hz)、7.58−7.68(4H,m)、8.00(1H,dd,J=1.9、8.0Hz)、8.37(1H,d,J=1.8Hz);δC(100MHz、d4−メタノール) 12.9(4C)、25.9、26.7、37.1、37.6、39.0、46.8(4C)、47.5、47.6、54.8、55.7、60.3、62.1、97.0(2C)、115.0(2C)、115.26、115.29、122.9(2C)、123.9、127.5、128.6(2C)、129.3、130.5(2C)、131.6(2C)、132.3、133.8、133.9、134.4、135.26、135.34、138.3、144.1、144.8、146.9、151.7、155.2、157.16、157.17、157.2、157.8、159.4、173.1、173.8;ν/cm−1 3088−3418、2977、2876、1711、1649、1588;HRMS(ESI+) m/z 1174.3447(C55H61N9NaO13S3として、[M+Na]+;計算値 1174.3443)。インビトロおよびインビボ試験のために、25の遊離酸(11.7mg、9.97マイクロモル)を0.01M NaOH(997μL、9.97マイクロモル)に溶かし、その暗紫色溶液0.45μmのシリンジフィルターユニットを通して濾過した。生成物を凍結乾燥に供し、25のナトリウム塩(11.6mg、99%)を綿毛のようにフワッとした紫色の粉末として得た。
R−BC154の祖先細胞(LSK細胞)の選別集団との結合を評価するために、全骨髄を未処理および処理(R−BC154;10mg/kg)マウス(一群に付き3匹のマウス)より採取した。リニージ陽性細胞をリニージカクテル(B220、Gr−1、Mac−1およびTer−119)を用いて免疫標識に付し、次に製造業者の指示に従って、ヒツジ抗ラットのコンジュゲートしたダイナビーズ(Dynabead)(Invitrogen)との免疫磁気選択法により取り出した。得られたリニージ枯渇細胞を抗−Sca−1−PBおよび抗−c−kit−FITCを用いて染色した。免疫標識した細胞をCytopeiaインフラックス(BD Biosciences)細胞分別装置を用いてSca−1−c−kit+について選別し,オリンパス(Olympus)BX51顕微鏡を用いて画像処理に付した。
b:図5cにおいて表される解離実験から由来のデータを(特記されない限り)1相の指数関数的に減衰する関数に適合させ、その曲線から解離速度定数(koff)を推定した。
c:R−BC154のCa2+/Mg2+の存在下でのα4β1 LN18細胞との結合についての解離データを2相解離曲線に適合させ、koffを解離の>60%を占める、その曲線の急速相から決定した。
d:Mn2+活性化の下では、R−BC154−α9β1インテグリン複合体の解離は遅すぎ(120分後でもなおも>55%が結合したまま;データは示さず)、オフ−レートを正確に算定できなかった;koff値はおよそ100分間の半減期を基礎に推定された。
e:結合速度定数(kon)は式:(kobs−koff)/[R−BC154濃度=50nM]を用いて算定された。
インビトロでの結合データは、R−BC154がα4β1およびα9β1インテグリンアンタゴニストと高いアフィニティを示し、その結合活性はインテグリンの活性化に大きく依存することを示した。この実施例の試験は、R−BC154がインビボでの結合実験に使用され、HSCの限定された集団でα9β1/α4β1インテグリン活性を研究することができるかどうかを試験する。今日まで、インテグリンのHSCに対する活性の評価は、主に、骨髄細胞または生成されたHSCの蛍光標識された抗体の、インビトロまたはエクスビボでの染色に依存してきた。エクスビボでの染色はHSCによるインテグリンの発現の確認を提供し、複雑な骨髄の微小環境はインビトロにて正確に再構築できないため、骨髄内のその天然状態のインテグリン活性化の研究はインビボでの結合実験を通してのみ決定され得る。
上記した実施例において、R−BC154(図7a)は、Ca2+、Mg2+またはMn2+などの二価の金属カチオンの存在下においてのみ、ヒトα9β1およびα4β1インテグリンを過剰発現するヒトグリア芽腫LN18細胞と結合し(図7b)、それがインビトロにおいて高アフィニティでインテグリン結合するのに必要とされる構造変化を誘発するように作用することが明らかにされた。中心および骨内膜のBM祖先細胞(Lin−Sca−1+ckit+細胞;LSK)およびHSC(LSKCD150+CD48−細胞;LSKSLAM)の両方に結合するのにインテグリンの活性化が必要とされるかどうかを決定するのに(図7c)、R−BC154結合を1mM Ca2+/Mg2+の存在下で評価した(図7d)。これらの条件下にて、中心のLSKおよびLSKSLAMとの結合が、そお骨内膜のカウンターパートとの関連で、より大きいことが観察された(p<0.005)(図7e)。EDTAと共同して処置することにより表面にあるインテグリンを不活性化することで、R−BC154とHSCおよび祖先細胞との効率的な結合のために、インテグリンの活性化の要件を示す活動を完全に除去した(図7e)。活性化カチオンおよびEDTAの両方の不存在下では、R−BC154と骨内膜LSK細胞とが結合していることは明らかであったが、中心LSKではそうではなかった(図7f)。これらの結果は、骨内膜BMより単離されたHSCおよび祖先細胞より発現されたインテグリンが、採取後も活性化されたままであったことを示唆する。
インテグリンは複数の活性化状態で存在し、幹細胞ニッチによるその調節は複雑であり、インビトロにて正確に模倣または再現できない。BMの範囲内でHSCおよび祖先細胞により発現されるα9β1/α4β1インテグリンが、インサイチュにて本質的かつ示差的に活性化されるかどうかを評価するために、LSKSLAMについて免疫標識を施す前に、C57Bl/6マウスにR−BC154を注射した。中心および骨内膜の両方のBM領域から由来のLSK細胞は,静脈内投与の後で、R−BC154で効果的に標識された(図9a)。しかしながら、骨内膜BMの範囲内にあるLSKおよびLSKSLAMの両方の細胞は、その中心BMカウンターパートと比べてR−BC154hi細胞の割合が大きく(図9b)、活性化二価金属カチオンの不在下で行われたインビトロ実験と一致する(図7fを参照のこと)。リンパ球(B220+およびCD3+)および骨髄細胞(Gr1+およびMac1+)の子孫もまた、骨内膜BMの範囲内でR−BC154hi細胞の割合が大きく、これはインテグリン活性化の強化が原始的造血集団に限定されないことを示唆する(図9c)。R−BC154の結合のないことはα4 −/−/α9 −/−LSK細胞で明らかであり、これはインビボで活性させるためにα4およびα9インテグリンが要件であることを確認する(図9d)。これらのデータはα9β1/α4β1インテグリンが必要とされるだけでなく、骨内膜BM領域内にある細胞に対してインサイチュにて本質的かつ示差的に活性化されることを示唆する。
Herbert, K. E.、Biol Blood Marrow Tr 14, 603-621,(2008)に記載されるように、新規な動員剤のHSCのPBへの放出を誘発しうるその能力について該動員剤を評価するのに数種のネズミアッセイが存在する。正常なPB中のLSKおよびLSKSLAM細胞は、各々、循環WBCの約0.005%および約0.0005%を構成するに過ぎないが、PBより選別されたLSKおよびLSKSLAMは、コロニー形成細胞(CFC)の起源であり、かくして造血再構築能を有する細胞を含むことが分かった。従って、PB中で測定されたLSKおよびLSKSLAMの含量は、最初は、幹細胞および祖先細胞の含量の代理尺度として使用された。
1. J. Grassinger, D. N. Haylock, M. J. Storan, G. O. Haines, B. Williams, G. A. Whitty, A. R. Vinson, C. L. Be, S. H. Li, E. S. Sorensen, P. P. L. Tam, D. T. Denhardt, D. Sheppard, P. F. ChoongおよびS. K. Nilsson, Blood, 2009, 114, 49-59
2. D. N. Haylock, B. Williams, H. M. Johnston, M. C. P. Liu, K. E. Rutherford, G. A. Whitty, P. J. Simmons, I. BertoncelloおよびS. K. Nilsson, Stem Cells, 2007, 25, 1062-1069
3. J. Grassinger, B. Williams, G. H. Olsen, D. N. HaylockおよびS. K. Nilsson, Cytokine, 2012, 58, 218-225
4. Nilsson, S. K.ら、Osteopontin, a key component of the haematopoietic stem cell niche and regulator of primitive haematopoietic progenitor cells. Blood 106, 1232-1239, doi:10.1182/blood-2004-11-4422 (2005)
5. Grassinger, J.ら、Thrombin-cleaved osteopontin regulates haematopoietic stem and progenitor cell functions through interactions with alpha(9)beta(1) and alpha(4)beta(1) integrins. Blood 114, 49-59, doi:DOI 10.1182/blood-2009-01-197988 (2009)
6. Bartelmez, S. H.ら、Interleukin-1 Plus Interleukin-3 Plus Colony-Stimulating Factor-I Are Essential for Clonal Proliferation of Primitive Myeloid Bone-Marrow Cells. Experimental Hematology 17, 240-245 (1989)
7. Herbert, K. E., Levesque, J. P., Haylock, D. N. & Princes, M.、The use of experimental murine models to assess novel agents of haematopoietic stem and progenitor cell mobilization. Biol Blood Marrow Tr 14, 603-621, doi:DOI 10.1016/j.bbmt.2008.02.003 (2008)
8. Cao, B.ら、Design, synthesis and binding properties of a fluorescent alpha(9)beta(1)/alpha(4)beta(1) integrin antagonist and its application as an in vivo probe for bone marrow haemopoietic stem cells. Org. Biomol. Chem. 12, 965-978, doi:Doi 10.1039/C3ob42332h (2014)
9. Pepinsky, R. B.ら、Comparative assessment of the ligand and metal ion binding properties of integrins alpha 9 beta 1 and alpha 4 beta 1. Biochemistry 41, 7125-7141, doi:Doi 10.1021/Bi020024d (2002)
10. Schofield, R.、Relationship between Spleen Colony-Forming Cell and Haematopoietic Stem-Cell - Hypothesis. Blood Cells 4, 7-25 (1978)
Claims (71)
- HSCおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のBM幹細胞結合リガンドからのインビボまたはエクスビボでの除去を強化する方法であって、効果的な量のα9インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分をBM幹細胞ニッチにインビボまたはエクスビボにて投与することを含む、方法。
- HSCおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のBM幹細胞ニッチからの放出をさらに強化する、請求項1に記載の方法。
- HSCのBM幹細胞ニッチからの動員をさらに強化する、請求項1または2に記載の方法。
- α9インテグリンが、α9β1インテグリンまたはその活性な部分である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- α4インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を投与することをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- α4インテグリンが、α4β1のアンタゴニストまたはその活性な部分である、請求項5に記載の方法。
- アンタゴニストがα9およびα4と交差反応し、望ましくはα9β1およびα4β1と交差反応してもよい、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- アンタゴニストが、式(I):
Xは、結合手および−SO2−からなる群より選択され;
R1は、H、アルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R2は、Hおよび置換基からなる群より選択され;
R3は、HおよびC1−C4アルキルからなる群より選択され;
R4は、Hおよび−OR6からなる群より選択され;
R5は、Hおよび−OR7からなる群より選択される;
ただし、R4がHである場合、R5は−OR7であり、R4が−OR6である場合、R5はHであり;
R6は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R8、−C(O)R9および−C(O)NR10R11からなる群より選択され;
R7は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R8は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R9は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいヘテロシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R10およびR11は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;
R12は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R13は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15は、各々、C1−C4アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nは、各々、1〜3の範囲にある整数である]
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。 - R4がHであり;および
R5が−OR7である、請求項8に記載の方法。 - R7が、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R12が、C1−C4アルキル、−CN、−O(C1−C4アルキル)および置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R13が、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15が、各々、C1−C4アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nが1または2である、請求項8または請求項9に記載の方法。 - R7が、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R12が、C1−C4アルキル、−CN、−O(C1−C4アルキル)および5−テトラゾリルからなる群より選択され;
R13が2−ピロリルであり;
R14およびR15が、各々独立して、C1−C4アルキルであるか、または
R14およびR15が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいピロリジニルまたはモルホリニル環を形成し;および
nが1または2である、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。 - R1が置換されてもよいフェニルである、請求項8〜12のいずれか一項に記載の方法。
- フェニルが、少なくとも1個のハロゲン基で置換されてもよい、請求項13に記載の方法。
- アンタゴニストがG−CSFの不在下で投与される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- α9インテグリンアンタゴニストが、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、経粘膜、または腹腔内に投与される;該アンタゴニストは、静脈内または皮下投与されることが望ましい、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- α9インテグリンアンタゴニストが、α4インテグリンアンタゴニストと同時に、連続して、または組み合わせて投与される、請求項5〜18のいずれか一項に記載の方法。
- HSCが骨髄より誘導される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- HSCが、幹細胞ニッチ、望ましくは骨髄の中心または骨内膜ニッチより誘導される、請求項20に記載の方法。
- HSCが、CD34+細胞、CD38+細胞、CD90+細胞、CD133+細胞、CD34+CD38−細胞、リニージ委任のCD34−細胞またはCD34+CD38+細胞からなる群より選択される、骨内膜先祖細胞である、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- HSCのBM幹細胞結合リガンドからの除去を強化するための組成物であって、α9インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を含む、組成物。
- HSCのBM幹細胞結合リガンドからの放出をさらに強化する、請求項23に記載の組成物。
- HSCのBM幹細胞ニッチからPBへの動員をさらに強化する、請求項24に記載の組成物。
- α9インテグリンがα9β1インテグリンまたはその活性な部分である、請求項23〜25のいずれか一項に記載の組成物。
- α4インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を含む、請求項23ないし26項のいずれか一項に記載の組成物。
- α4インテグリンがα4β1またはその活性な部分のアンタゴニストである、請求項27に記載の組成物。
- アンタゴニストがα9およびα4と交差反応し、望ましくはα9β1およびα4β1と交差反応する、請求項23〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- α9インテグリンアンタゴニストが、式(I):
Xは、結合手および−SO2−からなる群より選択され;
R1は、H、アルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R2は、Hおよび置換基からなる群より選択され;
R3は、HおよびC1−C4アルキルからなる群より選択され;
R4は、Hおよび−OR6からなる群より選択され;
R5は、Hおよび−OR7からなる群より選択される;
ただし、R4がHである場合、R5は−OR7であり、R4が−OR6である場合、R5はHであり;
R6は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R8、−C(O)R9および−C(O)NR10R11からなる群より選択され;
R7は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R8は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R9は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいヘテロシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R10およびR11は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;
R12は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R13は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15は、各々、C1−C4アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nは、各々、1〜3の範囲にある整数である]
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項23〜29のいずれか一項に記載の組成物。 - R4がHであり;および
R5が−OR7である、請求項30に記載の組成物。 - R7が、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R12が、−CN、−O(C1−C4アルキル)および置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R13が、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15が、各々、C1−C4アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nが1または2である、請求項23または31に記載の組成物。 - R7が、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R12が、C1−C4アルキル、−CN、−O(C1−C4アルキル)および5−テトラゾリルからなる群より選択され;
R13が2−ピロリルであり;
R14およびR15が、各々独立して、C1−C4アルキルであるか、または
R14およびR15が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいピロリジニルまたはモルホリニル環を形成し;および
nが1または2である、請求項23〜32のいずれか一項に記載の組成物。 - R1が置換されてもよいフェニルである、請求項23〜34のいずれか一項に記載の組成物。
- フェニルが少なくとも1個のハロゲン基で置換されてもよい、請求項35に記載の組成物。
- G−CSFの不在下で投与される、請求項30〜38のいずれか一項に記載の組成物。
- 静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、経粘膜、または腹腔内に投与され;静脈内または皮下投与されることが望ましい、請求項30〜39のいずれか一項に記載の組成物。
- α9インテグリンアンタゴニストが、α4インテグリンアンタゴニストと同時に、連続して、または組み合わせて投与される、請求項30〜40のいずれか一項に記載の組成物。
- HSCが骨髄より誘導される、請求項30〜41のいずれか一項に記載の組成物。
- HSCが、幹細胞ニッチ、望ましくは骨髄の中心または骨内膜ニッチより誘導される、
請求項30〜42のいずれか一項に記載の組成物。 - HSCが、CD34+細胞、CD38+細胞、CD90+細胞、CD133+細胞、CD34+CD38−細胞、リニージ委任のCD34−細胞またはCD34+CD38+細胞からなる群より選択される、骨内膜先祖細胞である、請求項30〜43のいずれか一項に記載の組成物。
- HSCを対象から採取する方法であって、
効果的な量のα9インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を対象に投与し、ここで該効果的な量で、HSCおよびその先駆細胞ならびにそれらの祖先細胞のBM幹細胞ニッチにおけるBM幹細胞結合リガンドからの除去が強化され;
その除去されたHSCをPBに動員し;
そのHSCをPBから採取する
ことを含む、方法。 - α9インテグリンアンタゴニストがG−CSFの不在下で投与される、請求項45に記載の方法。
- HSCが、インターロイキン−17、シクロホスファミド(Cy)、ドセタキセルおよび顆粒球−コロニー刺激因子(G−CSF)などであるが、これらに限定されない、他のHSC動員剤の使用によってさらに動員される、請求項45に記載の方法。
- インテグリンアンタゴニストの効果的な量が、25−1000μg/kg体重、より好ましくは50−500μg/kg体重、最も好ましくは50−250μg/kg体重の範囲にある、請求項45または46に記載の方法。
- 請求項45〜48のいずれか一項に記載の方法より得られるHSCを含む、細胞組成物。
- 血液疾患の治療方法であって、請求項22〜44に記載の組成物または請求項49に記載の細胞組成物を投与することを含む、方法。
- 対象における血液障害を治療するための方法であって、該対象に治療的に効果的な量のα9インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分を投与し、HSCの、BMからPBへの除去、放出または動員を強化する、方法。
- α9インテグリンがα9β1インテグリンまたはその活性な部分である、請求項51に記載の方法。
- α4インテグリンのアンタゴニストまたはその活性な部分の投与をさらに含む、請求項51または52に記載の方法。
- α4インテグリンがα4β1のアンタゴニストまたはその活性な部分である、請求項53に記載の方法。
- アンタゴニストがα9およびα4と交差反応し、望ましくはα9β1およびα4β1と交差反応してもよい、請求項51〜54のいずれか一項に記載の方法。
- アンタゴニストが、式(I):
Xは、結合手および−SO2−からなる群より選択され;
R1は、H、アルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R2は、Hおよび置換基からなる群より選択され;
R3は、HおよびC1−C4アルキルからなる群より選択され;
R4は、Hおよび−OR6からなる群より選択され;
R5は、Hおよび−OR7からなる群より選択される;
ただし、R4がHである場合、R5は−OR7であり、R4が−OR6である場合、R5はHであり;
R6は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R8、−C(O)R9および−C(O)NR10R11からなる群より選択され;
R7は、H、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R8は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R9は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいヘテロシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R10およびR11は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;
R12は、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、−O(C1−C4アルキル)、−C(O)−(C1−C4アルキル)、−C(O)O−(C1−C4アルキル)および−CNからなる群より選択され;
R13は、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15は、各々、C1−C4アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nは、各々、1〜3の範囲にある整数である]
で示される化合物またはその医薬的に許容される塩である、請求項50〜55のいずれか一項に記載の方法。 - R4がHであり;および
R5が−OR7である、請求項56に記載の方法。 - R7が、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R12が、−CN、−O(C1−C4アルキル)および置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R13が、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアリールおよび置換されてもよいヘテロアリールからなる群より選択され;
R14およびR15が、各々、C1−C4アルキルおよび置換されてもよいアリールからなる群より独立して選択されるか、または
R14およびR15が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいヘテロシクロアルキル環を形成し;および
nが1または2である、請求項56または請求項57に記載の方法。 - R7が、C1−C4アルキル、−(CH2)n−R12、−C(O)R13および−C(O)NR14R15からなる群より選択され;
R12が、C1−C4アルキル、−CN、−O(C1−C4アルキル)および5−テトラゾリルからなる群より選択され;
R13が2−ピロリルであり;
R14およびR15が、各々独立して、C1−C4アルキルであるか、または
R14およびR15が、それらが結合する窒素と一緒になって、置換されてもよいピロリジニルまたはモルホリニル環を形成し;および
nが1または2である、請求項56〜58のいずれか一項に記載の方法。 - R1が置換されてもよいフェニルである、請求項56〜60のいずれか一項に記載の方法。
- フェニルが、少なくとも1個のハロゲン基で置換されてもよい、請求項61に記載の方法。
- アンタゴニストがG−CSFの不在下で投与される、請求項51〜64のいずれか一項に記載の方法。
- α9インテグリンアンタゴニストが、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経皮、または経粘膜に投与される;該アンタゴニストは、静脈内または皮下投与されることが望ましい、請求項51〜64のいずれか一項に記載の方法。
- α9インテグリンアンタゴニストが、α4インテグリンアンタゴニストと同時に、連続して、または組み合わせて投与される、請求項51〜66のいずれか一項に記載の方法。
- 血液障害が、免疫抑制、慢性病、外傷、変性疾患、感染またはそれらの組み合わせ;皮膚、消化器系、神経系、リンパ系、心血管系、内分泌系またはその組み合わせの疾患または症状;骨粗鬆症、アルツハイマー病、心筋梗塞、パーキンソン病、外傷性脳損傷、多発性硬化症、肝硬変またはその組み合わせ;神経芽腫、骨髄異形成、骨髄線維症、乳がん、腎細胞がん、または多発性骨髄腫;造血系新生物障害、自己免疫疾患;または悪性でない障害からなる群より選択される、請求項51〜67のいずれか一項に記載の方法。
- 血液障害が、B−リニージALLおよびT−リニージALLからなる群より選択される急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、前リンパ球性白血病(PLL)、ヘアリー細胞白血病(HLL)およびワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症(WM)である、請求項68に記載の方法。
- HSCを患者に移植する方法であって、
α9インテグリンアンタゴニストを対象に投与し、HSCをBM幹細胞結合リガンドから除去し;
そのHSCをBMから放出させて、PBに動員させ;
HSCをその対象のPBより採取し;および
そのHSCを患者に移植する、ことを含む方法。 - HSCが骨内膜祖先細胞であり、CD34+、CD38+、CD90+、CD133+、CD34+CD38−細胞、リニージ委任のCD34−細胞、またはCD34+CD38+細胞からなる群より選択される、請求項70に記載の方法。
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