JP2017536092A - Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子発現をサイレンシングするための組成物及び方法 - Google Patents

Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子発現をサイレンシングするための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）遺伝子発現を標的とするｓｉＲＮＡ等の治療用核酸を含む組成物、かかる治療用核酸を１つ以上（例えば、組み合わせ）含む脂質粒子、ならびに該脂質粒子を（例えば、ヒトにおけるＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染を治療するために）送達かつ／または投与する方法を提供する。本明細書でより詳細に記載されるように、一態様では、本発明は、単離された二本鎖のｓｉＲＮＡ分子を提供し、各分子にセンス鎖及び該センス鎖にハイブリダイズされたアンチセンス鎖が含まれる。

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１４年１０月０２日に出願された米国出願第６２／０５９，０５６，号、及び２０１５年２月２４日に出願された米国出願第６２／１２０，１４９，号の優先権を主張するものであり、該出願は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
Ｂ型肝炎ウイルス（「ＨＢＶ」と略称される）はヘパドナウイルス科に属するウイルスである。ウイルス粒子（ビリオンとも呼ばれる）は、外側の脂質のエンベロープ及びタンパク質で構成される正二十面体のヌクレオカプシドのコアを含む。ヌクレオカプシドはウイルスのＤＮＡ及び逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを取り囲んでいる。外側のエンベロープは、ウイルスの感受性細胞、典型的には肝臓肝細胞への結合及び侵入に関与する、埋め込まれたタンパク質を含有する。感染性のウイルス粒子のほか、感染性の個体の血清には、コアのない、フィラメント状及び球状の粒子体が見られ得る。これらの粒子は感染性ではなく、脂質とビリオン表面部を形成するタンパク質とで構成され、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）と呼ばれるが、これはウイルスのライフサイクルの間に過剰に産生される。
ＨＢＶのゲノムは環状ＤＮＡでできているが、ＤＮＡが完全二本鎖ではないため、独特である。完全長鎖の一方の末端はウイルスのＤＮＡポリメラーゼに連結している。ゲノムは３０２０〜３３２０ヌクレオチド長（完全長鎖）及び１７００〜２８００ヌクレオチド長（より短い鎖）である。マイナス−センス鎖（非コード鎖）はウイルスのｍＲＮＡに相補的である。ウイルスのＤＮＡは、細胞の感染後にすぐに核内に見られる。ゲノムによりコードされる遺伝子は、Ｃ、Ｘ、Ｐ、及びＳと呼ばれる４種類が知られている。コアタンパク質は遺伝子Ｃ（ＨＢｃＡｇ）によりコードされ、その開始コドンには上流インフレームのＡＵＧ開始コドンが先行し、これによりプレコアタンパク質が産生される。ＨＢｅＡｇは、プレコアタンパク質のタンパク質分解性プロセシングにより産生される。ＤＮＡポリメラーゼは遺伝子Ｐによりコードされる。遺伝子Ｓは表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードする遺伝子である。ＨＢｓＡｇ遺伝子は１つの長いオープンリーディングフレームであるが、３つのインフレーム「開始」コドン（ＡＴＧ）を含んでおり、これにより遺伝子はｐｒｅ−Ｓ１、ｐｒｅ−Ｓ２、及びＳの３領域に分けられる。複数の開始コドンがあるため、ラージ、ミドル、及びスモールと呼ばれる大きさの異なる３種のポリペプチドが産生される。遺伝子Ｘによりコードされるタンパク質の機能は十分に解明されていないが、肝癌の発症に関連している。ＨＢＶの複製は複雑な工程である。肝臓で複製が行われるにもかかわらず、ウイルスは血液に広がり、ウイルスタンパク質及びそれに対する抗体が感染者の血液に見られる。ＨＢＶの構造、複製、及び生物学はＤ．Ｇｌｅｂｅ ａｎｄ Ｃ．Ｍ．Ｂｒｅｍｅｒ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．２，１０３〜１１２頁（２０１３）に概説されている。
ヒトがＨＢＶに感染すると、肝臓の感染性炎症性の疾病を引き起こす。感染した個体は、何年も症状を示さないことがある。世界の人口の約３分の１が生涯のある時点で感染しており、そのうち３億５０００万人が慢性保有者であると推定される。
ウイルスは、感染性の血液または体液への曝露により伝播する。周産期感染も重要な感染経路になり得る。急性疾患により肝臓の炎症、嘔吐、黄疸を引き起こし、死亡する可能性もある。慢性Ｂ型肝炎により、最終的に肝硬変及び肝癌を引き起こす場合がある。
ＨＢＶに感染した人のほとんどは、自身の免疫系の働きによって感染を排除するが、中には侵襲性の感染（劇症肝炎）経過をたどる人もいれば、慢性的に感染しているために肝臓疾患の可能性が高くなっている人もいる。現在、いくつかの薬剤がＨＢＶ感染の治療薬として承認されているが、感染した個体がこれらの薬剤に応答して成功する程度はさまざまであり、またこれらの薬剤のいずれによっても感染者からウイルスは排除されない。
Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）は、エンベロープを持つ小さな環状ＲＮＡウイルスであり、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）が存在する時のみ増殖できる。特に、ＨＤＶが増殖するためにはＨＢＶ表面の抗原タンパク質を必要とする。ＨＢＶとＨＤＶの両方に感染すると、ＨＢＶのみに感染した場合より重篤な合併症を引き起こす。これらの合併症には、急性感染では肝不全発症の可能性が高くなること、また慢性感染では肝硬変への進行が急速になり、それに伴い肝癌発症の可能性が高くなることが含まれる。Ｂ型肝炎ウイルスと組み合わせられると、Ｄ型肝炎は、すべての肝炎感染のうちで最も死亡率が高い。ＨＤＶの伝播経路は、ＨＢＶの伝播経路と同様である。感染は、ＨＢＶ感染のリスクが高い人、特に注射による薬物使用者及び凝固因子濃縮製剤の服薬者に主に限られる。
したがって、ヒトのＨＢＶ感染の治療、ならびにヒトのＨＢＶ／ＨＤＶ感染の治療のための組成物及び方法が現在も必要とされている。
Ｄ．Ｇｌｅｂｅ ａｎｄ Ｃ．Ｍ．Ｂｒｅｍｅｒ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．２，１０３〜１１２頁（２０１３）
本明細書でより詳細に記載されるように、一態様では、本発明は、単離された二本鎖のｓｉＲＮＡ分子を提供し、各分子にセンス鎖及び該センス鎖にハイブリダイズされたアンチセンス鎖が含まれる。本発明のこの態様のｓｉＲＮＡは、ＨＢＶゲノムの１つ以上の遺伝子及び／または転写産物を標的とする。本発明のこの態様のｓｉＲＮＡ分子例は本明細書の表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子である。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、ＨＢＶまたはＨＢＶ／ＨＤＶに感染したヒト対象に治療量で投与すると、例えば、ＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染の治療に有用である。より一般的には、本発明は、インビトロ及びインビボでＨＢＶ遺伝子の発現を阻害またはサイレンシングできるｓｉＲＮＡ分子を提供する。
別の態様では、本発明は、単離された一本鎖の核酸分子、例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子の単離されたセンス鎖及びアンチセンス鎖を提供する。前述の単離されたセンス鎖及びアンチセンス鎖は本明細書の表Ｂに記載されている。本明細書でより詳細に記載されるように、本発明のｓｉＲＮＡ及び一本鎖核酸分子は修飾されて、１つ以上のＵＮＡ部分及び／または１つ以上の２'Ｏ−メチル修飾（例えば、表Ａ及びＢを参照されたい）を含む。
本発明はまた、本発明の１つ以上のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子を参照されたい）のような医薬組成物を含む組成物も提供する。一実施形態では、本発明は、異なる２つの本発明のｓｉＲＮＡ分子（例えば、本明細書の表Ａに開示のｓｉＲＮＡ分子から選択される異なる２つのｓｉＲＮＡ分子）を含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、異なる３つの本発明のｓｉＲＮＡ分子（例えば、本明細書の表Ａに開示のｓｉＲＮＡ分子から選択される異なる３つのｓｉＲＮＡ分子）を含む組成物を提供する。本明細書の表Ａに開示のｓｉＲＮＡ分子から選択される２つの異なるｓｉＲＮＡ（「双方向組合わせ」）の想定されるすべての組合せを本明細書の実施例２に記載している。本明細書の表Ａに開示のｓｉＲＮＡ分子から選択される３つの異なるｓｉＲＮＡ（「３方向組合わせ」）の想定されるすべての組合せを本明細書の実施例３に記載している。したがって、一態様では、本発明は、表Ａに記載のｓｉＲＮＡを上記の双方向または３方向で組み合わせたうちの１つを含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
本発明はまた、核酸−脂質粒子、及びその処方物も提供し、かかる脂質粒子各々は、本明細書に記載するｓｉＲＮＡ、カチオン性脂質、及び非カチオン性脂質のうち１つ以上（例えば、カクテル）、ならびに任意選択で粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む。本発明の脂質粒子に含まれ得るｓｉＲＮＡ分子の例は、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子、及び前述のｓｉＲＮＡの組み合わせ（例えば、本明細書に記載の双方向及び３方向の組み合わせ）である。典型的に、ｓｉＲＮＡは脂質粒子内に完全に封入されている。本発明の脂質粒子は、例えば、治療有効量のｓｉＲＮＡを、ＨＢＶまたはＨＢＶ／ＨＤＶに感染した人体の細胞（例えば、肝細胞）に送達し、これによりＨＢＶ感染及び／もしくはＨＤＶ感染を治療すること、ならびに／またはＨＢＶ感染及び／もしくはＨＤＶ感染の１つ以上の症状を改善することに有用である。
本発明はまた、ＨＢＶ遺伝子の発現を標的とするｓｉＲＮＡ分子の１つまたはカクテル、及び薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。例えば、本発明は、各々がＨＢＶ遺伝子の発現を標的とする表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子を１つ、２つ、または３つ含む複数の医薬組成物を提供する。脂質粒子内に封入されたｓｉＲＮＡのカクテルを含む処方物に関しては、異なるｓｉＲＮＡ分子を同一の脂質粒子内に共封入しても、またはカクテルに存在するｓｉＲＮＡ種ごとに単独で粒子内に封入しても、または処方物中の一部のｓｉＲＮＡ種を同一粒子内に共封入し、その他のｓｉＲＮＡ種を別の粒子内に封入してもよい。典型的に、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、脂質粒子内に完全に封入されている。
本発明の核酸−脂質粒子は、ＨＢＶまたはＨＢＶ／ＨＤＶに感染したヒトに、１つ以上のＨＢＶ遺伝子の発現をサイレンシングするｓｉＲＮＡ分子を予防または治療として送達することにより、ヒトのＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染の少なくとも１つの症状を改善するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するｓｉＲＮＡ分子の１つ以上を核酸−脂質粒子内に処方し、その粒子を、このような治療を必要とする哺乳類（例えば、ヒト）に投与する。特定の場合には、治療有効量の核酸−脂質粒子を哺乳類に投与することができる（例えば、ヒトのＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染の治療のため）。本発明の核酸−脂質粒子は、ＨＢＶ遺伝子発現の最も多い部位であるヒトの肝細胞を標的にするために特に有用である。核酸−脂質粒子の投与は、当技術分野で公知の任意の経路、例えば、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、または皮内等により実行可能である。特定の実施形態では、核酸−脂質粒子を、例えば、経腸または非経口の投与経路を介して全身投与する。
いくつかの実施形態では、哺乳類の生体試料において核酸−脂質粒子を投与した後のＨＢＶのＲＮＡまたはタンパク質の量を検出することにより、ＨＢＶ遺伝子発現の下方制御を決定する。他の実施形態では、哺乳類の生体試料において核酸−脂質粒子を投与した後のＨＢＶのｍＲＮＡまたはタンパク質の量を検出することにより、ＨＢＶ遺伝子発現の下方制御を決定する。ある実施形態では、粒子投与後、哺乳類のＨＢＶ感染に関連する症状を監視することにより、ＨＢＶ遺伝子発現の下方制御を検出する。
別の実施形態では、本発明は、ＨＢＶ遺伝子発現をサイレンシングするｓｉＲＮＡを生細胞内に導入するための方法を提供し、かかる方法は、該生細胞と、ＨＢＶを標的とするｓｉＲＮＡを含む本発明の核酸−脂質粒子とを、ｓｉＲＮＡが細胞に入って細胞内のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする条件下で接触させるステップを含む。
別の実施形態では、本発明は、ヒトにおいてＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染に関連する１つ以上の症状を改善する方法を提供し、かかる方法は、治療有効量の本発明の核酸−脂質粒子をヒトに投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、本発明のこの態様の方法で使用する核酸−脂質粒子には、表Ａに記載のｓｉＲＮＡから独立して選択される１つ、２つもしくは３つまたはそれ以上の異なるｓｉＲＮＡが含まれる。
別の実施形態では、本発明は、ＨＢＶ遺伝子発現のサイレンシングを必要とする哺乳類（例えば、ヒト）においてＨＢＶ遺伝子発現をサイレンシングする方法を提供し、かかる方法はそれぞれ、本発明の核酸−脂質粒子を該哺乳類に投与するステップを含む。
別の態様では、本発明は、ヒトにおいてＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染に関連する１つ以上の症状を治療及び／または改善する方法を提供し、かかる方法はそれぞれ、治療有効量の本発明の核酸−脂質粒子をヒトに投与するステップを含む。
特定の本発明の実施形態は、ＨＢＶ表面抗原の合成を阻害するの治療有効量の本発明の組成物もしくは核酸−粒子の１つ以上をＨＤＶに感染した個体に投与することによって、ＨＤＶの複製を阻害し、かつ／またはＨＤＶ感染の１つ以上の症状を改善するための組成物及び方法を提供する。
別の態様では、本発明は、ＨＢＶの発現阻害を必要とする哺乳類（例えば、ＨＢＶまたはＨＢＶ／ＨＤＶに感染したヒト）においてＨＢＶの発現を阻害する方法を提供し、かかる方法はそれぞれ、治療有効量の本発明の核酸−脂質粒子を哺乳類に投与するステップを含む。
さらなる態様では、本発明は、ヒトのＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染を治療する方法を提供し、かかる方法はそれぞれ、治療有効量の本発明の核酸−脂質粒子をヒトに投与するステップを含む。
さらなる態様では、本発明は、生細胞でのＢ型肝炎ウイルスの遺伝子発現を阻害するための本発明のｓｉＲＮＡ分子の使用を提供する。
さらなる態様では、本発明は、生細胞でのＢ型肝炎ウイルスの遺伝子発現を阻害するための本発明の医薬組成物の使用を提供する。
本発明の組成物（例えば、ｓｉＲＮＡ分子、ならびに単離されたセンス鎖及びそのアンチセンス鎖、ならびに核酸−脂質粒子）は、例えば、バイオアッセイ（例えば、インビボまたはインビトロアッセイ）において、１つ以上のＨＢＶ遺伝子及び／もしくは転写産物の発現を阻害して、ＨＢＶ及び／もしくはＨＤＶの複製ならびに生物学を調査し、かつ／または１つ以上のＨＢＶ遺伝子もしくは転写産物の機能を調査もしくは調節するためにも有用である。例えば、バイオアッセイを使用して本発明のｓｉＲＮＡ分子のスクリーニングを行い、ＨＢＶ及び／またはＨＤＶの複製を阻害するｓｉＲＮＡ分子、ならびにヒトのＨＢＶ及び／もしくはＨＤＶ感染を治療し、かつ／またはヒトのＨＢＶ及び／もしくはＨＤＶ感染に関連する少なくとも１つの症状を改善するための治療剤候補であるｓｉＲＮＡ分子を同定することができる。
本発明の他の課題、特徴、及び利点は、以下の発明を実施するための形態及び図面から当業者には明らかであろう。
導入
本明細書に記載するｓｉＲＮＡ薬物療法は、ヒトにおけるＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染ならびにそれに関連する症状を治療する有意な新規の組成物及び方法を有利に提供する。本発明の実施形態は、例えば、１日１回、週１回、または数週間に１回（例えば、２週間、３つ週間、４週間、５週間または６週間に１回）投与可能である。
さらに、本明細書に記載する核酸−脂質粒子により、体内の標的組織及び標的細胞内にｓｉＲＮＡ等の核酸医薬を効果的に送達することが可能になる。脂質粒子の存在により、血流中でのヌクレアーゼによる分解に対する保護が付与され、標的組織内での選択的蓄積が可能となり、また、ｓｉＲＮＡが、その目的とする機能のＲＮＡ干渉を実行可能な細胞質内への医薬侵入手段が提供される。
定義
本発明において、以下の用語は、他に明記しない限り、それらに与えられている意味を有する。
用語「Ｂ型肝炎ウイルス」（ＨＢＶと略称される）とは、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに属し、ヒトに肝臓の炎症を引き起こし得る、オルソヘパドナウイルス属のウイルス種を指す。
用語「Ｄ型肝炎ウイルス」（ＨＤＶと略称される）とは、ヒトに肝臓の炎症を引き起こし得る、Ｄｅｌｔａｖｉｒｉｄａｅ属のウイルス種を指す。
本明細書で使用する「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ｓｉＲＮＡが、標的とする遺伝子または配列と同一細胞内にある場合に、標的とする遺伝子もしくは配列の発現を（例えば、ｓｉＲＮＡ配列に相補的なｍＲＮＡの翻訳を分解または阻害することにより）抑制または阻害することができる二本鎖ＲＮＡ（すなわち、二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）ＲＮＡ）を指す。ｓｉＲＮＡは、標的とする遺伝子または配列に対して実質的なまたは完全な同一性を有していても、またはミスマッチ領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含んでいてもよい。ある実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１９〜２５（二重鎖）ヌクレオチドの長さであってよく、好ましくは、約２０〜２４、２１〜２２、または２１〜２３（二重鎖）ヌクレオチドの長さである。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１〜約４ヌクレオチドまたは約２〜約３ヌクレオチドの３'オーバーハング及び５'リン酸基末端を含んでよい。ｓｉＲＮＡの例には、限定することなく、一方の鎖はセンス鎖、他方はそれに相補的なアンチセンス鎖である別個の２本の鎖から組み立てられる、二本鎖ポリヌクレオチド分子が含まれる。
好ましくは、ｓｉＲＮＡを化学的に合成する。ｓｉＲＮＡは、長鎖ｄｓＲＮＡ（例えば、約２５ヌクレオチド長より大きいｄｓＲＮＡ）を大腸菌のＲＮａｓｅ ＩＩＩまたはダイサーを用いて切断することにより作製することもできる。これらの酵素は、ｄｓＲＮＡを生物学的に活性なｓｉＲＮＡにするプロセスを行う（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：９９４２−９９４７（２００２）；Ｃａｌｅｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４２３６（２００２）；Ｂｙｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｂｉｏｎ ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ，１０（１）：４−６（２００３）；Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１：９８１−９８７（２００３）；Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：２２６９−２２７１（２００１）；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：８２（１９６８）を参照されたい）。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、少なくとも５０ヌクレオチド〜約１００，２００，３００，４００、または５００ヌクレオチドの長さである。ｄｓＲＮＡは、１０００，１５００，２０００，５０００ヌクレオチドの長さ、またはそれ以上の長さであってよい。かかるｄｓＲＮＡは、遺伝子転写全体または遺伝子転写の一部をコードすることができる。特定の場合には、ｓｉＲＮＡは、プラスミドによりコードされてよい（例えば、ヘアピンループを有する二重鎖に自動的に折り畳まれる配列として転写される）。
語句「標的遺伝子の発現を阻害する」とは、本発明のｓｉＲＮＡが標的遺伝子（例えば、ＨＢＶゲノム内の遺伝子）の発現をサイレンシングする、抑制する、または阻害する能力を指す。遺伝子サイレンシングの程度を調べるため、被験試料（例えば、標的遺伝子を発現している対象生物から得た生体試料または標的遺伝子を発現している培養細胞試料）と、標的遺伝子の発現をサイレンシングする、抑制する、または阻害するｓｉＲＮＡとを接触させる。被験試料における標的遺伝子の発現を、ｓｉＲＮＡと接触させていない対照試料（例えば、標的遺伝子を発現している対象生物から得た生体試料または標的遺伝子を発現している培養細胞試料）における標的遺伝子の発現と比較する。対照試料（例えば、標的遺伝子を発現している試料）に値１００％を割り当ててよい。特定の実施形態では、標的遺伝子の発現のサイレンシング、阻害、または抑制は、対照試料（例えば、緩衝液のみ、異なる遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ配列、スクランブルｓｉＲＮＡ配列等）に対する被験試料の値が約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または０％の場合に達成される。好適なアッセイには、限定することなく、当業者に公知の技術、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、酵素機能等、及び当業者に公知の表現型アッセイを使用した、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルの検査法が含まれる。ｓｉＲＮＡ等の治療用核酸の「有効量」または「治療有効量」とは、所望の効果、例えば、ｓｉＲＮＡ非存在下で検出される通常発現レベルと比較して標的配列の発現阻害を引き起こすのに十分な量のことである。特定の実施形態では、標的遺伝子または標的配列の発現阻害は、ｓｉＲＮＡを用いて得られた値が対照（例えば、緩衝液のみ、異なる遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ配列、スクランブルｓｉＲＮＡ配列等）に対して約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または０％の場合に達成される。標的遺伝子の発現または標的配列を測定する好適なアッセイには、当業者に公知の技術、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、酵素機能等、及び当業者に公知の表現型アッセイを使用する、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルの検査法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用する用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖の形態の、少なくとも２ヌクレオチドを含有しているポリマー（すなわち、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）を指し、これにはＤＮＡ及びＲＮＡが挙げられる。「ヌクレオチド」は、糖であるデオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、及びリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を介して互いに連結されている。「塩基」には、プリン及びピリミジンが含まれ、これにはさらに、天然化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、ならびに天然類似体、ならびにプリン及びピリミジンの合成誘導体が含まれ、かかる合成誘導体には、限定するわけではないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、及びハロゲン化アルキルのような新たな反応性基を配する修飾が含まれるが、これに限定されるものではない。核酸には、既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは結合を含有する核酸が含まれ、それらは合成核酸、天然に生じる核酸、及び天然には生じない核酸であり、参照核酸と同様の結合特性を有する。このような類似体及び／または修飾された残基の例には、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホルアミダート、メチルホスホナート、キラル−メチルホスホナート、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。さらに、核酸には、１つ以上のＵＮＡ部分が含まれ得る。
用語「核酸」には、最大６０ヌクレオチドを含む一般にオリゴヌクレオチドと呼ばれる断片、及び、ポリヌクレオチドと呼ばれるより長い断片を有する、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが含まれる。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、デオキシリボースと呼ばれる五炭糖から構成され、この五炭糖は、この糖の５'位及び３'位の炭素でリン酸基に共有結合で結ばれ、それが交互に並ぶ非分岐ポリマーを形成する。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、予備縮合（ｐｒｅ−ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）ＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、または誘導体及びこれらの群の組み合わせの形態であってよい。リボオリゴヌクレオチドは、五炭糖がリボースである同様の繰り返し構造からなる。ＲＮＡは、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー−基質ｄｓＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、及びその組み合わせの形態であってよい。したがって、本発明において、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に生じる塩基、糖及び糖間（ｉｎｔｅｒｓｕｇａｒ）（骨格）結合で構成されるヌクレオチドもしくはヌクレオシドの単量体のポリマーもしくはオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語には、同様に機能する、天然には生じない単量体を含むポリマーもしくはオリゴマー、またはそれらの一部も含まれる。こうした修飾または置換されたオリゴヌクレオチドが天然型より好ましいことが多いのは、例えば、細胞内への取り込みが向上している、免疫原性が低い、またヌクレアーゼ存在下での安定性が高いといった特性を有するためである。
特に明記しない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその多様体（例えば、縮重コドンの置換）、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰ、ならびに相補配列及び明示されている配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドンの置換は、選択した１つ以上（またはすべて）のコドンの３番目が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１−９８（１９９４））。
本発明は、単離されたまたは実質的に精製された核酸分子及びそれらの分子を含有する組成物を包含する。本発明において、「単離された」または「精製された」ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、その天然の環境から離れて存在するＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。単離されたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、精製された形態で存在しても、または、例えばトランスジェニック宿主細胞のような、天然ではない環境に存在してもよい。例えば、「単離された」または「精製された」核酸分子またはその生物学的に活性な部分は、他の細胞材料を実質的に含んでいないか、または組換え技術で産生した場合は培地であるか、または化学的に合成した場合は化学的前駆体もしくは他の化学薬品を実質的に含んでいない。一実施形態では、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて天然では該核酸に隣接している配列（すなわち、核酸の５’末端及び３’末端に位置する配列）は含まない。例えば、さまざまな実施形態では、単離された核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて天然では該核酸分子に隣接しているヌクレオチド配列を約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満含有し得る。
用語「遺伝子」とは、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドの産生に必要な部分長または全長のコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。
本発明において、「遺伝子産物」とは、ＲＮＡ転写産物またはポリペプチド等の遺伝子産物を指す。
用語「アンロックト（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）核酸塩基類似体」（「ＵＮＡ」と略称される）とは、リボース環のＣ２'とＣ３'の原子が共有結合で連結されていない非環状型核酸塩基を指す。用語「アンロックト核酸塩基類似体」には、構造Ａとして識別される以下の構造：
構造Ａ
Figure 2017536092
 を有する核酸塩基類似体が含まれ、
式中、Ｒはヒドロキシル基であり、塩基は例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）及びチミン（Ｔ）のような天然または非天然の任意の塩基である。本発明の実施に有用なＵＮＡには、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，３１４，２２７号の非環状型２'−３'−セコ−ヌクレオチド単量体として同定された分子が含まれる。
用語「脂質」とは、水には不溶性だが多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とし、脂肪酸のエステルを非限定的に含む一群の有機化合物を指す。それらは、通常、少なくとも３つのクラス、すなわち（１）脂肪及び油ならびにロウが含まれる「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質が含まれる「複合脂質」、及び（３）ステロイド等の「誘導脂質」に分けられる。
用語「脂質粒子」には、治療用核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）を対象標的部位（例えば、細胞、組織、臓器等）に送達するために使用できる脂質処方物が含まれる。好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、典型的に、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び任意選択で、粒子の凝集を阻害する複合脂質から形成される。核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）を含む脂質粒子を核酸−脂質粒子と呼ぶ。典型的には、核酸を脂質粒子内に完全に封入することにより、核酸を酵素分解から保護している。
特定の場合には、核酸−脂質粒子は、静脈内に（ｉ．ｖ．）注射した後に、より長い循環寿命を示すことができ、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積でき、かつ遠位部位での標的遺伝子発現のサイレンシングを仲介できるため、全身投与には極めて有用である。核酸は、あらゆる目的のために参照によりその開示内容全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号第ＷＯ００／０３６８３号に記載のように、縮合剤との複合体にして脂質粒子内に封入してよい。
本発明の脂質粒子は、典型的に、平均直径が約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍであり、実質的に非毒性である。さらに、核酸は、本発明の脂質粒子中に存在する場合、水溶液中ではヌクレアーゼで分解されにくい。核酸−脂質粒子及びその調製方法は、例えば、米国特許公開第２００４０１４２０２５号及び同第２００７００４２０３１号に開示されており、それらの開示内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明において、「封入脂質」とは、ｓｉＲＮＡ等の治療用核酸を完全に封入して、一部を封入して、またはその両方で提供する脂質粒子を意味し得る。好ましい実施形態では、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、脂質粒子内に完全に封入されている（例えば、核酸−脂質粒子を形成する）。
用語「脂質複合体」とは、脂質粒子の凝集を阻害する複合脂質を指す。このような脂質複合体には、例えば、ジアルキルオキシプロピルと結合させたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体）、ジアシルグリセロールと結合させたＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−ＤＡＧ複合体）、コレステロールと結合させたＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンと結合させたＰＥＧ、及びセラミドと複合体を形成したＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質複合体（例えば、ＰＯＺ−ＤＡＡ複合体）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ−脂質複合体）、及びそれらの混合物のようなＰＥＧ−脂質複合体が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＰＯＺ−脂質複合体のさらなる例は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧまたはＰＯＺは、脂質と直接複合体を形成できるか、またはリンカー部分を介して脂質に連結してもよい。ＰＥＧまたはＰＯＺの脂質への結合に好適な任意のリンカー部分を使用することができ、これには例えば、エステル非含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分が含まれる。特定の好ましい実施形態では、アミドまたはカルバメートのようなエステル非含有リンカー部分を使用する。
用語「両親媒性脂質」とは、部分的に、脂質材料の疎水性部分は疎水性相に適応し、親水性部分は水相に適応する任意の好適な材料を指す。親水性特性は、炭水化物、リン酸基、カルボキシル基、スルファート（ｓｕｌｆａｔｏ）基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、及び他の同等の基等の極性基または荷電基の存在から生じる。疎水性は、長鎖の飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基、ならびにそのような基であって、１つ以上の芳香族基、脂環式基、または複素環基（複数可）で置換された基を含むが、これらに限定されない無極性基を含ませることにより付与することができる。両親媒性化合物の例には、リン脂質、アミノ脂質、及びスフィンゴ脂質が挙げられるが、これに限定されるものではない。
リン脂質の代表的例として、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、及びジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、及びβ−アシルオキシ酸（ａｃｙｌｏｘｙａｃｉｄ）のようなリンを欠く他の化合物もまた、両親媒性脂質として示される群に入る。さらに、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリド及びステロール等他の脂質と混合可能である。
用語「中性脂質」とは、選択ｐＨで非荷電または中性いずれかの両性イオン型で存在する多数の脂質種のうち任意のものを指す。生理的ｐＨにおける、このような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、及びジアシルグリセロールが挙げられる。
用語「非カチオン性脂質」とは、任意の両親媒性脂質及び他の任意の中性脂質またはアニオン性脂質を指す。
用語「アニオン性脂質」とは、生理的ｐＨで負に荷電している任意の脂質を指す。これらの脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎグルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイオル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｙｏｌ）ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質に結合している他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これに限定されるものではない。
用語「疎水性脂質」とは、長鎖の飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基、ならびにそのような基で、任意選択で、１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環基（複数可）で置換されているものを含むが、これに限定されない極性基を有する化合物を指す。好適な例には、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン、及び１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
「カチオン性脂質」及び「アミノ脂質」という用語は、本明細書において、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の脂肪酸もしくは脂肪族アルキル鎖及びｐＨ滴定可能なアミノ頭基（例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ頭基）を有する脂質ならびにその塩を含むように同義で使用される。カチオン性脂質は、典型的には、カチオン性脂質のｐＫａを下回るｐＨでプロトン化され（すなわち、正に荷電され）、ｐＫａを上回るｐＨで実質的に中性である。本発明のカチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質と称される場合もある。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、プロトン化可能な三級アミン（例えば、ｐＨ滴定可能な）頭基；それぞれが独立して０〜３（例えば、０、１つ、２つ、または３つ）の二重結合を有するＣ１８アルキル鎖；及び頭基とアルキル鎖の間にあるエーテル結合、エステル結合、またはケタール結合を含む。このようなカチオン性脂質には、ＤＳＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、γ−ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ（ＤＬｉｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＸＴＣ２、及びＣ２Ｋとしても知られる）、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ、ＤＬｅｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、γ−ＤＬｅｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ（ＭＣ２としても知られる）、及びＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（ＭＣ３としても知られる）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
用語「塩」には、カチオン性脂質と１つ以上の陰イオンとの間で形成された複合体等の、任意のアニオン性及びカチオン性の複合体が含まれる。陰イオンの非限定的な例には、無機及び有機の陰イオン、例えば、水素化物イオン、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、シュウ酸イオン（例えば、ヘミシュウ酸塩（ｈｅｍｉｏｘａｌａｔｅ））イオン、リン酸イオン、ホスホン酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、酸化物イオン、炭酸イオン、重炭酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、窒化物イオン、重亜硫酸イオン、硫化物イオン、亜硫酸イオン、重硫酸イオン、硫酸イオン、チオ硫酸イオン、硫酸水素イオン、ホウ酸イオン、ギ酸イオン、酢酸イオン、安息香酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、乳酸イオン、アクリル酸イオン、ポリアクリル酸イオン、フマル酸イオン、マレイン酸イオン、イタコン酸イオン、グリコール酸イオン、グルコン酸イオン、リンゴ塩酸イオン、マンデル酸イオン、チグリン酸イオン、アスコルビン酸イオン、サリチル酸イオン、ポリメタクリル酸イオン、過塩素イオン、塩素酸イオン、亜塩素酸イオン、次亜塩素酸イオン、臭素酸イオン、次亜臭素酸イオン、ヨウ素酸イオン、スルホン酸アルキルイオン、アリールスルホン酸イオン、ヒ酸イオン、亜ヒ酸イオン、クロム酸イオン、重クロム酸イオン、シアン化物イオン、シアン酸イオン、チオシアン酸イオン、水酸化物イオン、過酸化物イオン、過マンガン酸イオン、及びそれらの混合物が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に開示するカチオン性脂質の塩は結晶塩である。
用語「アルキル」には、１〜２４個の炭素原子を含有する、直鎖または分岐の、非環状または環状の脂肪族飽和炭化水素が含まれる。代表的な直鎖飽和アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等が挙げられるが、これらに限定されず、また、分岐飽和アルキルには、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル等が挙げられるが、これに限定されるものではない。代表的な環状飽和アルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が含まれるが、これらに限定されず、また環状不飽和アルキルには、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
用語「アルケニル」には、上記で定義されるように、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含んでいるアルキルが含まれる。アルケニルには、ｃｉｓ異性体とｔｒａｎｓ異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖及び分岐のアルケニルには、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
用語「アルキニル」には、上記で定義した任意のアルキルまたはアルケニルであって、隣接する炭素間に少なくとも１つの三重結合をさらに含むものが含まれる。代表的な直鎖及び分岐のアルキニルは、限定することなく、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニル等を含む。
用語「アシル」には、下記に定義するように、結合点の炭素がオキソ基で置換された任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルが含まれる。以下は、アシル基の非限定的な例である。−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、及び−Ｃ（＝Ｏ）アルキニル。
用語「複素環」には、飽和、不飽和、もしくは芳香族のいずれかであり、窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される１個または２個のヘテロ原子を含有する、５〜７員単環式または７〜１０員二環式の複素環であって、窒素ヘテロ原子及び硫黄ヘテロ原子を任意選択で酸化させることができ、また窒素ヘテロ原子を任意選択で四級化することができ、上記の複素環のいずれかがベンゼン環に縮合する二環式環を含む、該複素環が含まれる。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合されてよい。複素環には、下記に定義するヘテロアリール、及びモルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
「任意選択で置換されたアルキル」、「任意選択で置換されたアルケニル」、「任意選択で置換されたアルキニル」、「任意選択で置換されたアシル」、及び「任意選択で置換された複素環」という用語は、置換された場合に、少なくとも１つの水素原子が置換基で置き換えられていることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２個の水素原子が置き換えられている。これに関し、置換基には、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ 、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、ここで、ｎは０、１、または２であり、ＲｘとＲｙは同一であるかまたは異なり、互いに独立して水素、アルキル、または複素環であり、かつかかるアルキル置換基及び複素環置換基の各々はさらに、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、複素環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ 、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ、及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙの１つ以上で置換されてよい。「任意選択で置換された」という用語が、一覧にある置換基の前で使用されている場合、一覧中の置換基の各々が任意選択で本明細書に記載のように置換されてよいことを意味する。
用語「ハロゲン」には、フルオロ、クロロ、ボロモ、及びヨードが含まれる。
用語「膜融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）」とは、脂質粒子が細胞の膜と融合する能力を指す。膜は、形質膜、または細胞小器官、例えば、エンドソーム、細胞核等を取り囲む膜のいずれでもあり得る。
本発明において、用語「水溶液」とは、全部、または一部に水を含む組成物を指す。
本発明において、用語「有機脂質溶液」とは、全部、または一部に脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指す。
用語「高電子密度の核」とは、本発明の脂質粒子の説明に使用する場合、クライオ透過型電子顕微鏡（「ｃｙｒｏＴＥＭ」）を使用して可視化させたときに脂質粒子内部で濃く見える部分を指す。本発明のいくつかの脂質粒子は、高エルクトロン（ｅｌｃｔｒｏｎ）密度の核を有し、脂質二重層構造を欠いている。本発明のいくつかの脂質粒子は、高電子密度の核を有し、脂質二重層構造を欠き、かつ逆六方晶相（ｉｎｖｅｒｓｅ Ｈｅｘａｇｏｎａｌ）構造または立方相構造を有する。理論に束縛されることは望まないが、非二重層の脂質のパッキングにより、脂質のシリンダーと、その内側の水及び核酸との３次元ネットワーク、すなわち、本質的に、核酸を含有する水性チャネルが浸透した脂質滴が提供されると考えられる。
本発明において「遠位部位」は、物理的に別個の部位を指し、隣接する毛細血管床に限定することなく、ある生物の全体に広く分布する部位を含む。
核酸−脂質粒子に関して「血清安定である」とは、遊離のＤＮＡまたはＲＮＡを有意に分解する血清またはヌクレアーゼのアッセイに曝露した後に、粒子が有意に分解されないことを意味する。好適なアッセイには、例えば、標準血清アッセイ、ＤＮＡｓｅアッセイ、またはＲＮＡｓｅアッセイが挙げられる。
本発明において「全身送達」とは、生物体内にｓｉＲＮＡ等の活性薬剤の広い生体内分布をもたらす脂質粒子の送達を指す。投与技術の中には、特定の薬剤を全身送達するが、それ以外の薬剤を送達しないものがある。全身送達とは、有用な量、好ましくは治療量の薬剤が体の大部分に曝露されることを意味する。広い生体内分布を得るためには、一般に、投与部位から遠位の疾患部位に到達する前に、（初回通過器官（肝臓、肺等）または急速な非特異的細胞結合等により）薬剤が短時間で分解または消失しないような血中寿命を必要とする。脂質粒子の全身送達は、例えば、静脈内、皮下、及び腹腔内等当技術分野で公知の任意の手段によるものであってよい。好ましい実施形態では、脂質粒子の全身送達は静脈内送達によるものである。
本発明において「局所送達」とは、ｓｉＲＮＡ等の活性薬剤を生物体内の標的部位に直接送達することを指す。例えば、薬剤は、疾患部位、他の標的部位、または標的臓器、例えば肝臓、心臓、膵臓、腎臓等の中に直接注射することにより局所的に送達され得る。
本発明において、用語「ウイルス粒子量」とは、血液等の体液中に存在するウイルス粒子（例えば、ＨＢＶ及び／またはＨＤＶ）の数の測定値を指す。例えば、粒子量は、例えば血液の、１ミリリットルあたりのウイルス粒子数として表してよい。粒子量検査を、核酸増幅を用いる検査、ならびに核酸を用いない検査（例えば、Ｐｕｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１：Ｓ２７−３６（２０１０）を参照されたい）を使用して実施してよい。
用語「哺乳類」とは、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜等の任意の哺乳類種を指す。
特定の実施形態の説明
本発明は、１つ以上のＨＢＶ遺伝子の発現を標的とするｓｉＲＮＡ分子、該ｓｉＲＮＡを１つ以上（例えば、カクテル）含む核酸−脂質粒子、及び該核酸−脂質粒子を（例えば、ヒトのＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染の治療のために）送達かつ／または投与する方法を提供する。
一態様では、本発明は、１つ以上のＨＢＶ遺伝子の発現を標的とするｓｉＲＮＡ分子を提供する。特定の場合には、本発明は、ＨＢＶゲノムの異なる領域を標的とするｓｉＲＮＡの組み合わせ（例えば、カクテル、プール、または混合物）を含む組成物を提供する。特定の場合には、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、インビトロまたはインビボでＨＢＶ及び／もしくはＨＤＶの複製を阻害することができる。
特定の実施形態では、本発明は、表Ａに示すｓｉＲＮＡ分子を提供し、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子それぞれの上鎖は、５'から３'の方向へ左から右に進行するセンス鎖であり、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子それぞれの下鎖は、５'から３'の方向へ右から左に進行するアンチセンス鎖である。表Ａに示すように、ｓｉＲＮＡ分子は、２'−Ｏ−メチル修飾を有する１つ以上のリボヌクレオチド及び／または１つ以上のＵＮＡ部分を含んでよい。下記表Ａに示すＩＣ５０値は、実施例１に記載のアッセイを使用して測定したものである。
Figure 2017536092
Figure 2017536092
他の実施形態では、本発明は、本明細書の表Ｂに記載のように、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子の単離されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（すなわち、単離された一本鎖核酸分子）を提供する。表Ｂに記載の核酸配列は、配列対として配されており、各対は、センス鎖及びその相補的アンチセンス鎖を含む。配列の各対（センス鎖及びアンチセンス鎖）は特定の名称で識別され、表Ａに示す名称に対応している。
表Ｂに示すこれらの単離されたセンス鎖及びアンチセンス鎖は、例えば、インビボまたはインビトロで１つ以上のＨＢＶ遺伝子の発現を抑制するのに有用なｓｉＲＮＡ分子の作製に有用である。これらの単離されたセンス鎖及びアンチセンス鎖はまた、例えば、ＨＢＶまたはＨＢＶ／ＨＤＶに感染したヒトから得た組織または血液の試料等の生物学的材料においてＨＢＶゲノムの量を同定及び測定するためのハイブリダイゼーションプローブとしても有用である。
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド（表Ｂに記載のＲＮＡセンス鎖及びアンチセンス鎖等）は、標的ポリヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズするか、または該配列に相補的である。本明細書で使用する「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「相補的」という用語は、ＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドとの間に安定かつ特異的な結合が生じるような相補性の程度が十分であることを指す。特異的にハイブリダイズできるために、オリゴヌクレオチドがその標的核酸配列に対して１００％相補的である必要はないことが理解される。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズ可能であるのは、オリゴヌクレオチドが標的配列に結合することで、標的配列の正常機能が干渉されてその有用性または発現を喪失し、かつ特異的結合が所望される条件下、すなわち、インビボアッセイまたは治療的処置の場合は生理的な条件下、または、インビトロアッセイの場合はアッセイを実施する条件下で、非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的な結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合である。したがって、オリゴヌクレオチドには、標的とする遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列の領域または特異的ハイブリダイズの対象領域と比較して１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の塩基置換が含まれ得る。
Figure 2017536092
したがって、本発明の特定の実施形態は、１ｍ（配列番号１及び２）、２ｍ（配列番号３及び４）、３ｍ（配列番号５及び６）、４ｍ（配列番号７及び８）、５ｍ（配列番号９及び１０）、６ｍ（配列番号１１及び１２）、７ｍ（配列番号１３及び１４）、８ｍ（配列番号１５及び１６）、９ｍ（配列番号１７及び１８）、１０ｍ（配列番号１９及び２０）、１１ｍ（配列番号２１及び２２）、１２ｍ（配列番号２３及び２４）、１３ｍ（配列番号２５及び２６）、１４ｍ（配列番号２７及び２８）、１５ｍ（配列番号２９及び３０）からなる群から選択される単離された二本鎖のｓｉＲＮＡ分子を提供する。
本発明の特定の実施形態はまた、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７及び配列番号２９からなる群から選択される単離された核酸分子も提供する。
本発明の特定の実施形態はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８及び配列番号３０からなる群から選択される単離された核酸分子も提供する。
本発明はまた、本明細書に記載する単離された二本鎖のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）の１つ以上を含む組成物も提供する。
ある実施形態では、組成物は、１ｍ（配列番号１及び２）、２ｍ（配列番号３及び４）、３ｍ（配列番号５及び６）、４ｍ（配列番号７及び８）、５ｍ（配列番号９及び１０）、６ｍ（配列番号１１及び１２）、７ｍ（配列番号１３及び１４）、８ｍ（配列番号１５及び１６）、９ｍ（配列番号１７及び１８）、１０ｍ（配列番号１９及び２０）、１１ｍ（配列番号２１及び２２）、１２ｍ（配列番号２３及び２４）、１３ｍ（配列番号２５及び２６）、１４ｍ（配列番号２７及び２８）、１５ｍ（配列番号２９及び３０）からなる群から選択される２つの異なる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む。ある実施形態では、２つの異なる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。
ある実施形態では、組成物は、１ｍ（配列番号１及び２）、２ｍ（配列番号３及び４）、３ｍ（配列番号５及び６）、４ｍ（配列番号７及び８）、５ｍ（配列番号９及び１０）、６ｍ（配列番号１１及び１２）、７ｍ（配列番号１３及び１４）、８ｍ（配列番号１５及び１６）、９ｍ（配列番号１７及び１８）、１０ｍ（配列番号１９及び２０）、１１ｍ（配列番号２１及び２２）、１２ｍ（配列番号２３及び２４）、１３ｍ（配列番号２５及び２６）、１４ｍ（配列番号２７及び２８）、１５ｍ（配列番号２９及び３０）からなる群から選択される３つの異なる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む。ある実施形態では、３つの異なる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。
本発明はまた、本明細書に記載のｓｉＲＮＡの１つ以上（例えば、カクテル）及び薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
ある実施形態では、本明細書に記載する組成物は、１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含み、これがＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする。
別の態様では、本発明は、ＨＢＶ遺伝子発現を標的とする核酸−脂質粒子を提供する。核酸−脂質粒子は、典型的に、本明細書に記載する（例えば、表Ａに記載のような）単離された二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の１つ以上（例えば、カクテル）、カチオン性脂質、及び非カチオン性脂質を含む。特定の場合には、核酸−脂質粒子は、粒子の凝集を阻害する複合脂質をさらに含む。好ましくは、核酸−脂質粒子は、本明細書に記載する単離された二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の１つ以上（例えば、カクテル）、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む。
ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、１ｍ（配列番号１及び２）、２ｍ（配列番号３及び４）、３ｍ（配列番号５及び６）、４ｍ（配列番号７及び８）、５ｍ（配列番号９及び１０）、６ｍ（配列番号１１及び１２）、７ｍ（配列番号１３及び１４）、８ｍ（配列番号１５及び１６）、９ｍ（配列番号１７及び１８）、１０ｍ（配列番号１９及び２０）、１１ｍ（配列番号２１及び２２）、１２ｍ（配列番号２３及び２４）、１３ｍ（配列番号２５及び２６）、１４ｍ（配列番号２７及び２８）、１５ｍ（配列番号２９及び３０）からなる群から選択される２つの異なる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む。ある実施形態では、２つの異なる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。
ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、１ｍ（配列番号１及び２）、２ｍ（配列番号３及び４）、３ｍ（配列番号５及び６）、４ｍ（配列番号７及び８）、５ｍ（配列番号９及び１０）、６ｍ（配列番号１１及び１２）、７ｍ（配列番号１３及び１４）、８ｍ（配列番号１５及び１６）、９ｍ（配列番号１７及び１８）、１０ｍ（配列番号１９及び２０）、１１ｍ（配列番号２１及び２２）、１２ｍ（配列番号２３及び２４）、１３ｍ（配列番号２５及び２６）、１４ｍ（配列番号２７及び２８）、１５ｍ（配列番号２９及び３０）からなる群から選択される３つの異なる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む。ある実施形態では、３つの異なる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。
いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡは、核酸−脂質粒子内に完全に封入されている。ｓｉＲＮＡカクテルを含む処方物に関して、カクテル中に存在する種類の異なるｓｉＲＮＡ種（例えば、配列の異なるｓｉＲＮＡ化合物）は、同一粒子内に共封入しても、またはカクテル中に存在するｓｉＲＮＡ種ごとに、別々の粒子内に封入してもよい。ｓｉＲＮＡカクテルは、２つ、３つまたはそれ以上の別個のｓｉＲＮＡ（それぞれ独自配列を有する）混合物を同一の、類似の、または異なる濃度またはモル比で使用して本明細書に記載の粒子内に処方してよい。一実施形態では、ｓｉＲＮＡカクテル（配列の異なる複数のｓｉＲＮＡに相当する）を、同一の、類似の、または異なる濃度またはモル比のｓｉＲＮＡ各種を使用して処方し、種類の異なるｓｉＲＮＡを同一粒子内に共封入する。別の実施形態では、カクテル中に存在する各ｓｉＲＮＡ種は、同一の、類似の、または異なるｓｉＲＮＡ濃度またはモル比で異なる粒子内に封入され、こうして形成された粒子（それぞれに異なるｓｉＲＮＡペイロードを含む）は、別々に（例えば、治療的レジメンに従い異なる時間に）投与されるか、または、合わせて単一単位用量として一緒に（例えば、薬理学的に許容される担体と共に）投与される。本明細書に記載する粒子は、血清安定であり、ヌクレアーゼによる分解に耐性があり、かつ、ヒト等の哺乳類に対し実質的に非毒性である。
本発明の核酸−脂質粒子中のカチオン性脂質は、例えば、本明細書に記載する式Ｉ〜ＩＩＩの１つ以上のカチオン性脂質または他の任意のカチオン性脂質種を含んでよい。一実施形態では、カチオン性脂質はジアルキル脂質である。別の実施形態では、カチオン性脂質はトリアルキル脂質である。特定の一実施形態では、カチオン性脂質は、１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ（ｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ；化合物（１５））、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ジリノレイルメチル（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｍｅｔｈｙｌ）−３−ジメチルアミノプロピオナート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ；化合物（７））、その塩、及びその混合物からなる群から選択される。
別の特定の実施形態では、カチオン性脂質は、１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ（ｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ；化合物（１５））、３−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミン（ＤＬｉｎ−ＭＰ−ＤＭＡ；化合物（８））、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート）（化合物（７））、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノアート（化合物（１３））、その塩、またはその混合物からなる群から選択される。
ある実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約４８ｍｏｌ％〜約６２ｍｏｌ％を占める。
本発明の核酸−脂質粒子中の非カチオン性脂質は、例えば、１つ以上のアニオン性脂質及び／または中性脂質を含んでよい。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、以下の中性脂質成分、すなわち、（１）リン脂質とコレステロールもしくはその誘導体との混合物、（２）コレステロールもしくはその誘導体、または（３）リン脂質のうち１つを含む。特定の好ましい実施形態では、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、またはその混合物を含む。好ましい実施形態では、非カチオン性脂質はＤＰＰＣとコレステロールの混合物である。好ましい実施形態では、非カチオン性脂質はＤＳＰＣとコレステロールの混合物である。
ある実施形態では、非カチオン性脂質は、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含み、リン脂質は、粒子中に存在する総脂質の約７ｍｏｌ％〜約１７ｍｏｌ％を占め、コレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％を占める。
本発明の核酸−脂質粒子中の脂質複合体は、粒子の凝集を阻害し、例えば、本明細書に記載する脂質複合体を１つ以上含んでよい。特定の一実施形態では、脂質複合体は、ＰＥＧ−脂質複合体を含む。ＰＥＧ−脂質複合体の例には、ＰＥＧ−ＤＡＧ複合体、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体、及びその混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。ある実施形態では、ＰＥＧ−脂質複合体は、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＡＡ）複合体、ＰＥＧ−リン脂質複合体、ＰＥＧ−セラミド（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）複合体、及びその混合物からなる群から選択される。ある実施形態では、ＰＥＧ−脂質複合体はＰＥＧ−ＤＡＡ複合体である。ある実施形態では、脂質粒子中のＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）複合体、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）複合体、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）複合体、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）複合体、ＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）複合体、またはその混合物を含んでよい。ある実施形態では、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体はＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）複合体である。別の実施形態では、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は化合物（６６）（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）複合体である。別の実施形態では、脂質複合体は、ＰＯＺ−ＤＡＡ複合体のようなＰＯＺ−脂質複合体を含む。
ある実施形態では、粒子の凝集を阻害する複合脂質は、粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％を占める。
ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が約５：１〜約１５：１である。
ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、中位径が約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍである。
ある実施形態では、核酸−脂質粒子は高電子密度の核を有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａを参照されたい）の１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％を占める、１つ以上のカチオン性脂質またはその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約１３ｍｏｌ％〜約４９．５ｍｏｌ％を占める、１つ以上の非カチオン性脂質と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を占める、粒子の凝集を阻害する１つ以上の複合脂質とを含む核酸−脂質粒子を提供する。
本実施形態の一態様では、核酸−脂質粒子は、（ａ）本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａを参照されたい）の１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５２ｍｏｌ％〜約６２ｍｏｌ％を占める、カチオン性脂質またはその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３６ｍｏｌ％〜約４７ｍｏｌ％を占める、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を占める、ＰＥＧ−脂質複合体とを含む。特定の一実施形態では、処方物は、ＰＥＧ−脂質複合体（例えば、ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）を約１．４ｍｏｌ％、カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩を約５７．１ｍｏｌ％、ＤＰＰＣ（またはＤＳＰＣ）を約７．１ｍｏｌ％、及びコレステロール（またはその誘導体）を約３４．３ｍｏｌ％含む４成分系である。
本実施形態の別の態様では、核酸−脂質粒子は、（ａ）本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子の１つ以上（例えば、カクテル）（例えば、表Ａを参照されたい）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５６．５ｍｏｌ％〜約６６．５ｍｏｌ％を占める、カチオン性脂質またはその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３１．５ｍｏｌ％〜約４２．５ｍｏｌ％を占める、コレステロールまたはその誘導体と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％を占める、ＰＥＧ−脂質複合体とを含む。特定の一実施形態では、処方物は、リン脂質を含まず、かつ、ＰＥＧ−脂質複合体（例えば、ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）を約１．５ｍｏｌ％、カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩を約６１．５ｍｏｌ％、及びコレステロール（またはその誘導体）を約３６．９ｍｏｌ％含む３成分系である。
さらなる処方物は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ０９／１２７０６０号及び公開済み米国特許出願公開番号第２０１１／００７１２０８Ａ１号に記載されており、それらの開示内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
他の実施形態では、本発明は、（ａ）本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａを参照されたい）の１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約２ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を占める、１つ以上のカチオン性脂質またはその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％を占める１つ以上の非カチオン性脂質と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％を占める、粒子の凝集を阻害する１つ以上の複合脂質とを含む核酸−脂質粒子を提供する。
本実施形態の一態様では、核酸−脂質粒子は、（ａ）本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａを参照されたい）の１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％を占める、カチオン性脂質またはその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約４７ｍｏｌ％〜約６９ｍｏｌ％を占める、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％を占めるＰＥＧ−脂質複合体とを含む。特定の一実施形態では、処方物は、ＰＥＧ−脂質複合体（例えば、ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）を約２ｍｏｌ％、カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩を約４０ｍｏｌ％、ＤＰＰＣ（またはＤＳＰＣ）を約１０ｍｏｌ％、及びコレステロール（またはその誘導体）を約４８ｍｏｌ％含む４成分系である。
さらなる実施形態では、本発明は、（ａ）本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａを参照されたい）の１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％を占める、１つ以上のカチオン性脂質またはその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％を占める、１つ以上の非カチオン性脂質と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％を占める、粒子の凝集を阻害する１つ以上の複合脂質とを含む核酸−脂質粒子を提供する。
本実施形態の一態様では、核酸−脂質粒子は、（ａ）本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａを参照されたい）の１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％を占める、カチオン性脂質またはその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％を占める、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％を占めるＰＥＧ−脂質複合体とを含む。特定の場合には、処方物中の非カチオン性脂質混合物は、（ｉ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％のリン脂質と、（ｉｉ）粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体とを含む。特定の一実施形態では、処方物は、ＰＥＧ−脂質複合体（例えば、ＰＥＧ７５０−Ｃ−ＤＭＡ）を約７ｍｏｌ％、カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩を約５４ｍｏｌ％、ＤＰＰＣ（またはＤＳＰＣ）を約７ｍｏｌ％、及びコレステロール（またはその誘導体）を約３２ｍｏｌ％含む４成分系である。
本実施形態の別の態様では、核酸−脂質粒子は、（ａ）本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａを参照されたい）の１つ以上（例えば、カクテル）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５５ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％を占める、カチオン性脂質またはその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％を占める、コレステロールまたはその誘導体と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％を占めるＰＥＧ−脂質複合体とを含む。特定の一実施形態では、処方物は、リン脂質を含まず、かつ、ＰＥＧ−脂質複合体（例えば、ＰＥＧ７５０−Ｃ−ＤＭＡ）を約７ｍｏｌ％、カチオン性脂質（例えば、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ）またはその塩を約５８ｍｏｌ％、及びコレステロール（またはその誘導体）を約３５ｍｏｌ％含む３成分系である。
有用な処方物のさらなる実施形態は、公開済み米国特許出願公開番号第ＵＳ２０１１／００７６３３５Ａ１号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明のある実施形態では、核酸−脂質粒子は、（ａ）本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子の１つ以上（例えば、カクテル）（例えば、表Ａを参照されたい）と、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約４８ｍｏｌ％〜約６２ｍｏｌ％を占める、カチオン性脂質またはその塩と、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約７ｍｏｌ％〜約１７ｍｏｌ％を占めるリン脂質と、粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％を占めるコレステロールまたはその誘導体との混合物と、（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約３．０ｍｏｌ％を占めるＰＥＧ−脂質複合体と、を含む。本発明のこの態様の例示的な脂質処方物Ａ〜Ｚを以下に記載する。
例示的な脂質処方物Ａには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（１．２％）、カチオン性脂質（５３．２％）、リン脂質（９．３％）、コレステロール（３６．４％）が含まれ、ここで、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（１．２％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）（５３．２％）であり、リン脂質はＤＰＰＣ（９．３％）であり、かつ、コレステロールは３６．４％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ａに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ａに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ａに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｂには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（０．８％）、カチオン性脂質（５９．７％）、リン脂質（１４．２％）、コレステロール（２５．３％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（化合物（６７））（０．８％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）（５９．７％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（１４．２％）であり、かつ、コレステロールは２５．３％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｂに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｂに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｂに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｃには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（１．９％）、カチオン性脂質（５２．５％）、リン脂質（１４．８％）、コレステロール（３０．８％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（化合物（６７））（１．９％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ（ｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ；化合物（１５））（５２．５％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（１４．８％）であり、かつ、コレステロールは３０．８％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｃに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｃに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｃに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｄには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（０．７％）、カチオン性脂質（６０．３％）、リン脂質（８．４％）、コレステロール（３０．５％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（０．７％）であり、カチオン性脂質は３−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミン（ＤＬｉｎ−ＭＰ−ＤＭＡ；化合物（８）（６０．３％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（８．４％）であり、かつ、コレステロールは３０．５％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｄに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｄに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｄに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｅには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（１．８％）、カチオン性脂質（５２．１％）、リン脂質（７．５％）、コレステロール（３８．５％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（１．８％）であり、カチオン性脂質は（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート）（化合物（７））（５２．１％）であり、リン脂質はＤＰＰＣ（７．５％）であり、かつ、コレステロールは３８．５％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｅに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｅに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｅに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な処方物Ｆには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（０．９％）、カチオン性脂質（５７．１％）、リン脂質（８．１％）、コレステロール（３３．８％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（化合物（６７））（０．９％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジリノレニルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ（ｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ；化合物（１５））（５７．１％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（８．１％）であり、かつ、コレステロールは３３．８％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｆに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｆに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、ここで、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｆに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｇには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（１．７％）、カチオン性脂質（６１．６％）、リン脂質（１１．２％）、コレステロール（２５．５％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（化合物（６７））（１．７％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジリノレニルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ（ｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ；化合物（１５））（６１．６％）であり、リン脂質はＤＰＰＣ（１１．２％）であり、かつ、コレステロールは２５．５％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｇに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｇに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｇに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｈには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（１．１％）、カチオン性脂質（５５．０％）、リン脂質（１１．０％）、コレステロール（３３．０％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（１．１％）であり、カチオン性脂質は（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノアート（化合物（１３））（５５．０％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（１１．０％）であり、かつ、コレステロールは３３．０％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｈに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｈに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｈに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｉには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（２．６％）、カチオン性脂質（５３．１％）、リン脂質（９．４％）、コレステロール（３５．０％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（２．６％）であり、カチオン性脂質は（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノアート（化合物（１３））（５３．１％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（９．４％）であり、かつ、コレステロールは３５．０％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｉに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｉに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｉに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｊには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（０．６％）、カチオン性脂質（５９．４％）、リン脂質（１０．２％）、コレステロール（２９．８％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（０．６％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）（５９．４％）であり、リン脂質はＤＰＰＣ（１０．２％）であり、かつ、コレステロールは２９．８％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｊに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｊに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｊに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｋには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（０．５％）、カチオン性脂質（５６．７％）、リン脂質（１３．１％）、コレステロール（２９．７％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（化合物（６７））（０．５％）であり、カチオン性脂質は（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート）（化合物（７））（５６．７％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（１３．１％）であり、かつ、コレステロールは２９．７％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｋに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｋに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｋに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｌには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（２．２％）、カチオン性脂質（５２．０％）、リン脂質（９．７％）、コレステロール（３６．２％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（化合物（６７））（２．２％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ（ｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ；化合物（１５））（５２．０％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（９．７％）であり、かつ、コレステロールは３６．２％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｌに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｌに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｌに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｍには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（２．７％）、カチオン性脂質（５８．４％）、リン脂質（１３．１％）、コレステロール（２５．７％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（２．７％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）（５８．４％）であり、リン脂質はＤＰＰＣ（１３．１％）であり、かつ、コレステロールは２５．７％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｍに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｍに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｍに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｎには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（３．０％）、カチオン性脂質（５３．３％）、リン脂質（１２．１％）、コレステロール（３１．５％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（３．０％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）（５３．３％）であり、リン脂質はＤＰＰＣ（１２．１％）であり、かつ、コレステロールは３１．５％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｎに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｎに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｎに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｏには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（１．５％）、カチオン性脂質（５６．２％）、リン脂質（７．８％）、コレステロール（３４．７％）が含まれ、ここで、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（１．５％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）（５６．２％）であり、リン脂質はＤＰＰＣ（７．８％）であり、かつ、コレステロールは３４．７％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｏに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｏに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｏに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｐには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（２．１％）、カチオン性脂質（４８．６％）、リン脂質（１５．５％）、コレステロール（３３．８％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（化合物（６７））（２．１％）であり、カチオン性脂質は３−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミン（ＤＬｉｎ−ＭＰ−ＤＭＡ；化合物（８））（４８．６％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（１５．５％）であり、かつ、コレステロールは３３．８％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｐに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｐに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｐに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｑには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（２．５％）、カチオン性脂質（５７．９％）、リン脂質（９．２％）、コレステロール（３０．３％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（２．５％）であり、カチオン性脂質は（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノアート（化合物（１３））（５７．９％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（９．２％）であり、かつ、コレステロールは３０．３％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｑに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｑに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｑに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｒには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（１．６％）、カチオン性脂質（５４．６％）、リン脂質（１０．９％）、コレステロール（３２．８％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（１．６％）であり、カチオン性脂質は３−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミン（化合物（８））（５４．６％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（１０．９％）であり、かつ、コレステロールは３２．８％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｒに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｒに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｒに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｓには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（２．９％）、カチオン性脂質（４９．６％）、リン脂質（１６．３％）、コレステロール（３１．３％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（２．９％）であり、カチオン性脂質は（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノアート（化合物（１３））（４９．６％）であり、リン脂質はＤＰＰＣ（１６．３％）であり、かつ、コレステロールは３１．３％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｓに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｓに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｓに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｔには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（０．７％）、カチオン性脂質（５０．５％）、リン脂質（８．９％）、コレステロール（４０．０％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（化合物（６７））（０．７％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）（５０．５％）であり、リン脂質はＤＰＰＣ（８．９％）であり、かつ、コレステロールは４０．０％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｔに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｔに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｔに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｕには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（１．０％）、カチオン性脂質（５１．４％）、リン脂質（１５．０％）、コレステロール（３２．６％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（化合物（６７））（１．０％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）（５１．４％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（１５．０％）であり、かつ、コレステロールは３２．６％で存在し、ここで、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｕに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｕに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｕに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｖには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（１．３％）、カチオン性脂質（６０．０％）、リン脂質（７．２％）、コレステロール（３１．５％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（化合物（６７））（１．３％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジリノレニルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）（６０．０％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（７．２％）であり、かつ、コレステロールは３１．５％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｖに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｖに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｖに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｗには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（１．８％）、カチオン性脂質（５１．６％）、リン脂質（８．４％）、コレステロール（３８．３％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（１．８％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）（５１．６％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（８．４％）であり、かつ、コレステロールは３８．３％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｗに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｗに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｗに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｘには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（２．４％）、カチオン性脂質（４８．５％）、リン脂質（１０．０％）、コレステロール（３９．２％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（２．４％）であり、カチオン性脂質は１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ（ｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ；化合物（１５））（４８．５％）であり、リン脂質はＤＰＰＣ（１０．０％）であり、かつ、コレステロールは３９．２％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｘに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｘに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｘに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｙには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（２．６％）、カチオン性脂質（６１．２％）、リン脂質（７．１％）、コレステロール（２９．２％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ（化合物（６６））（２．６％）であり、カチオン性脂質は（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノアート（化合物（１３））（６１．２％）であり、リン脂質はＤＳＰＣ（７．１％）であり、かつ、コレステロールは２９．２％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｙに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｙに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｙに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
例示的な脂質処方物Ｚには、以下の成分（成分のパーセンテージ値はモルパーセントである）、すなわち、ＰＥＧ−脂質（２．２％）、カチオン性脂質（４９．７％）、リン脂質（１２．１％）、コレステロール（３６．０％）が含まれ、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。例えば、代表的な一実施形態では、ＰＥＧ−脂質はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（化合物（６７））（２．２％）であり、カチオン性脂質は（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート）（化合物（７））（４９．７％）であり、リン脂質はＤＰＰＣ（１２．１％）であり、かつ、コレステロールは３６．０％で存在し、存在する脂質の実際量は、例えば、±５％（または例えば、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．１ｍｏｌ％）異なってよい。したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を含む、処方物Ｚに基づく核酸−脂質粒子を提供する。例えば、ある実施形態では、処方物Ｚに基づく核酸脂質粒子は、２つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる異なる２つのｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。他の特定の実施形態では、処方物Ｚに基づく核酸脂質粒子は、３つの異なるｓｉＲＮＡ分子を含んでよく、かかる３つの異なるｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約５：１〜約１５：１、または約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその任意の分数もしくはその中の範囲である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が、約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
したがって、本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載の核酸−脂質粒子を提供し、かかる脂質は、処方物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、ＹまたはＺのいずれか１つで説明されるように処方される。
本発明はまた、核酸−脂質粒子及び薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
本発明の核酸−脂質粒子は、例えば、１つ以上のＨＢＶ遺伝子の発現をサイレンシングするｓｉＲＮＡを治療用に送達するのに有用である。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ遺伝子の異なる領域（例えば、重複配列及び／または非重複配列）または転写を標的とするｓｉＲＮＡカクテルを同一または異なった核酸−脂質粒子内に処方し、かかる粒子を、そのような治療を必要とする哺乳類（例えば、ヒト）に投与する。特定の場合には、治療有効量の核酸−脂質粒子を、哺乳類に、例えば、ヒトのＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染を治療するために投与することができる。
ある実施形態では、本発明は、細胞と、本明細書に記載の核酸−脂質粒子とを接触させることにより、本明細書に記載する１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を細胞内に導入する方法を提供する。
ある実施形態では、本発明は、細胞と、本明細書に記載の核酸−脂質粒子とを、ｓｉＲＮＡが細胞に入り、その細胞内のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする条件下で接触させることにより、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする１つ以上のｓｉＲＮＡ分子を細胞内に導入する方法を提供する。ある実施形態では、細胞はヒト等の哺乳類の細胞である。ある実施形態では、ヒトは、Ｂ型肝炎ウイルス感染またはＢ型肝炎ウイルス／Ｄ型肝炎ウイルス感染と診断されている。ある実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子発現のサイレンシングにより、哺乳類のＢ型肝炎ウイルス及び／またはＤ型肝炎ウイルスの粒子量が、核酸−脂質粒子が存在しない場合のＢ型肝炎ウイルス及び／またはＤ型肝炎ウイルスの粒子量より少なくとも約５０％（例えば、約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）抑制される。
ある実施形態では、本発明は、細胞内のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする方法を提供し、かかる方法は、発現したＢ型肝炎ウイルス遺伝子を含む細胞と、本明細書に記載の核酸−脂質粒子または組成物（例えば、医薬組成物）とを、ｓｉＲＮＡが細胞に入り、細胞内のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする条件下で接触させるステップを含む。ある実施形態では、細胞はヒト等の哺乳類の細胞である。ある実施形態では、ヒトは、Ｂ型肝炎ウイルス感染またはＢ型肝炎ウイルス／Ｄ型肝炎ウイルス感染と診断されている。ある実施形態では、ヒトは、Ｂ型肝炎ウイルス感染またはＢ型肝炎ウイルス／Ｄ型肝炎ウイルス感染が原因の肝臓疾患と診断されている。ある実施形態では、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子発現のサイレンシングにより、哺乳類のＢ型肝炎ウイルス及び／またはＤ型肝炎ウイルスの粒子量が、核酸−脂質粒子が存在しない場合のＢ型肝炎ウイルス及び／またはＤ型肝炎ウイルスの粒子量より少なくとも約５０％（例えば、約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）抑制される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する核酸−脂質粒子または組成物（例えば、医薬組成物）を、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、及び皮内の投与経路うちの１つの経路で投与する。特定の実施形態では、核酸−脂質粒子を、例えば、経腸または非経口の投与経路を介して全身に投与する。
特定の態様では、本発明は、ＨＢＶ遺伝子発現のサイレンシングを必要とする哺乳類（例えば、ヒト）において、ＨＢＶ遺伝子発現をサイレンシングする方法を提供し、かかる方法は、該哺乳類に、本明細書に記載の１つ以上のｓｉＲＮＡ（例えば、表Ａに示すｓｉＲＮＡの１つ以上）を含む治療有効量の核酸−脂質粒子を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のｓｉＲＮＡを含む核酸−脂質粒子の投与により、ＨＢＶのＲＮＡレベルが、ｓｉＲＮＡが存在しない場合（例えば、緩衝液対照またはＨＢＶを標的としない無関係のｓｉＲＮＡ対照）に検出されるＨＢＶのＲＮＡレベルより少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその中の任意の範囲）抑制される。他の実施形態では、ＨＢＶを標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡを含む核酸−脂質粒子の投与により、陰性対照、例えば、緩衝液対照またはＨＢＶを標的としない無関係のｓｉＲＮＡ対照等よりも、ＨＢＶのＲＮＡレベルが少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日、６５日、７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、もしくは１００日またはそれ以上の間（またはその中の任意の範囲）にわたって抑制される。
他の態様では、本発明は、ＨＢＶ遺伝子発現のサイレンシングを必要とする哺乳類（例えば、ヒト）において、ＨＢＶ遺伝子発現をサイレンシングする方法を提供し、かかる方法は、該哺乳類に、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ）の１つ以上を含む、治療有効量の核酸−脂質粒子を投与することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＨＢＶ ｓｉＲＮＡを含む核酸−脂質粒子の投与により、ＨＢＶのｍＲＮＡレベルが、ｓｉＲＮＡが存在しない場合（例えば、緩衝液対照またはＨＢＶを標的としない無関係のｓｉＲＮＡ対照）に検出されるＨＢＶのｍＲＮＡレベルより少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその中の任意の範囲）抑制される。他の実施形態では、ＨＢＶを標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡを含む核酸−脂質粒子の投与により、陰性対照、例えば、緩衝液対照またはＨＢＶを標的としない無関係のｓｉＲＮＡ対照等よりも、ＨＢＶのｍＲＮＡレベルが少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日、６５日、７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、もしくは１００日またはそれ以上の間（またはその中の任意の範囲）にわたって抑制される。
本発明の特定の実施形態は、哺乳類（例えば、ヒト）の細胞内のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする際に使用するための、本明細書に記載の核酸−脂質粒子または組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
本発明の特定の実施形態は、哺乳類（例えば、ヒト）の細胞内のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする医薬品を調製するための、本明細書に記載の核酸−脂質粒子または組成物（例えば、医薬組成物）の使用を提供する。
他の態様では、本発明は、ＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染を治療する、予防する、その発症のリスクもしくは可能性を低減する（例えば、該感染に対する感受性を抑制する）、その発症を遅延する、かつ／またはそれに関連する１つ以上の症状を改善する方法を、それを必要とする哺乳類（例えば、ヒト）に提供し、かかる方法は、該哺乳類に、ＨＢＶ遺伝子の発現を標的とする本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載されるもの）を１つ以上含む、治療有効量の核酸−脂質粒子を投与することを含む。ヒトのＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染に関連する症状の例としては、発熱、腹痛、暗色尿、関節痛、食欲不振、悪心、嘔吐、脱力、疲労及び皮膚の黄変（黄疸）が挙げられる。
本発明の特定の実施形態は、哺乳類のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染を治療するための方法を提供し、かかる方法は、該哺乳類に、本明細書に記載の治療有効量の核酸−脂質粒子または組成物（例えば、医薬組成物）を投与するステップを含む。
本発明の特定の実施形態は、哺乳類（例えば、ヒト）のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染の治療において使用するための核酸−脂質粒子または組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
本発明の特定の実施形態は、哺乳類（例えば、ヒト）のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染を治療する医薬品を調製するための、核酸−脂質粒子または組成物（例えば、医薬組成物）の使用を提供する。
本発明の特定の実施形態は、哺乳類のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染に関連する１つ以上の症状を改善する方法を提供し、かかる方法は、該哺乳類に、本明細書に記載するｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載されるもの）の１つ以上を含む、本明細書に記載の治療有効量の核酸−脂質粒子または組成物（例えば、医薬組成物）を投与するステップを含む。ある実施形態では、粒子を全身経路により投与する。ある実施形態では、核酸−脂質粒子のｓｉＲＮＡは、哺乳類のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を阻害する。ある実施形態では、哺乳類はヒトである。ある実施形態では、ヒトは肝臓疾患を有する。
本発明の特定の実施形態は、哺乳類（例えば、ヒト）のＢ型肝炎ウイルス及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染に関連する１つ以上の症状の改善に使用するための、本明細書に記載の核酸−脂質粒子または組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
本発明の特定の実施形態は、哺乳類（例えば、ヒト）のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染に関連する１つ以上の症状を改善する医薬品を調製するための、本明細書に記載する核酸−脂質粒子または組成物（例えば、医薬組成物）の使用を提供する。
特定の本発明の実施形態は、ＨＤＶの複製を阻害し、かつ／または哺乳類（例えば、ヒト）のＨＤＶ感染の１つ以上の症状を改善するための方法を提供し、かかる方法は、該哺乳類に、本明細書に記載の治療有効量の核酸−脂質粒子または組成物（例えば、医薬組成物）を投与するステップを含み、該核酸−脂質粒子または組成物はＨＢＶ表面抗原の合成を阻害する。
本発明の特定の実施形態は、ＨＤＶの複製を阻害し、かつ／または哺乳類（例えば、ヒト）のＨＤＶ感染の１つ以上の症状を改善する際に使用するための、本明細書に記載の核酸−脂質粒子または組成物（例えば、医薬組成物）を提供し、該核酸−脂質粒子または組成物は、ＨＢＶ表面抗原の合成を阻害する。
本発明の特定の実施形態は、ＨＤＶの複製を阻害し、かつ／または哺乳類（例えば、ヒト）のＨＤＶ感染の１つ以上の症状を改善する医薬品を調製するための、本明細書に記載する核酸−脂質粒子または組成物（例えば、医薬組成物）の使用を提供し、該核酸−脂質粒子または組成物はＨＢＶ表面抗原の合成を阻害する。
本発明の特定の実施形態は、内科的治療に使用するための、本明細書に記載の核酸−脂質粒子または組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
さらなる態様では、本発明は、ＨＢＶ及び／またはＨＤＶの不活化を必要とする哺乳類（例えば、ヒト）（例えば、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ／ＨＤＶ感染に罹患したヒト）のＨＢＶ及び／またはＨＤＶを不活化する方法を提供し、かかる方法は、該哺乳類に、ＨＢＶ遺伝子の発現を標的とする本明細書に記載のｓｉＲＮＡを１つ以上含む、治療有効量の核酸−脂質粒子を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＨＢＶを標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡを含む核酸−脂質粒子の投与により、ＨＢＶタンパク質レベル（例えば、ＨＢＶ表面抗原タンパク質）を、ｓｉＲＮＡが存在しない場合（例えば、緩衝液対照またはＨＢＶを標的としない無関係のｓｉＲＮＡ対照）に検出されるＨＢＶタンパク質レベルよりも、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその中の任意の範囲）低下、抑制、または減少させる。
例として、ＨＢＶのｍＲＮＡは、分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して測定できる。分岐ＤＮＡアッセイは、捕捉した標的ＲＮＡからのシグナルを増幅させるためにｂＤＮＡ分子を使用する核酸サンドイッチハイブリダイゼーション法である。
本明細書に記載するｓｉＲＮＡは、ＨＢＶ遺伝子のいずれかの発現をサイレンシングする際のその治療上の有用性に加え、研究開発の用途、ならびに、診断、予防、予後、臨床、及び他の医療の用途でも有用である。非限定的な例として、ＨＢＶ遺伝子ファミリーの特定のメンバーが治療標的となる可能性の有無に関する試験を対象とする標的バリデーション試験にｓｉＲＮＡを使用できる。
ｓｉＲＮＡ分子の作製
ｓｉＲＮＡは、いくつかの形態、例えば、１つ以上の単離された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖として、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）として、またはＤＮＡプラスミドの転写カセットから転写されたｓｉＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡとして提供され得る。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡを、酵素を用いて、または部分的／全体的な有機合成により産生してよく、修飾されたリボヌクレオチドを、インビトロでの酵素を用いた合成または有機合成により導入できる。特定の場合には、各鎖を化学的に調製する。ＲＮＡ分子の合成方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９８）により説明されるまたは本明細書により説明される化学合成法がある。
ＲＮＡの単離、ＲＮＡの合成、核酸ハイブリダイズ、ｃＤＮＡライブラリーの作製及びスクリーニング、ならびにＰＣＲの実施の方法は、ＰＣＲ法（米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０）を参照されたい）と同様に、当技術分野において周知である（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２５：２６３−２６９（１９８３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前掲）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前掲）を参照されたい）。発現ライブラリーもまた、当業者に周知である。本発明での一般的使用方法を開示しているさらなる基礎テキストには、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）が挙げられる。これらの参考文献の開示内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
好ましくは、ｓｉＲＮＡを化学的に合成する。本発明のｓｉＲＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の多種多様な技術、例えばＵｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：７８４５（１９８７）；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：５４３３（１９９０）；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３：２６７７−２６８４（１９９５）；及びＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４：５９（１９９７）に記載のような技術のいずれを使用して合成することができる。オリゴヌクレオチドの合成では、５'末端におけるジメトキシトリチル及び３'末端におけるホスホラミダイト等の一般的な核酸保護基及び結合基を使用する。非限定的な例として、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ合成装置で０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを使用して小規模合成を行うことができる。別法として、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）の９６ウェルプレート合成装置で０．２μｍｏｌスケールでの合成を実施することができる。ただし、より大規模または小規模のスケールの合成もまた、本発明の範囲内である。オリゴヌクレオチド合成用の好適な試薬、ＲＮＡの脱保護方法、及びＲＮＡの精製方法は、当業者に公知である。
ｓｉＲＮＡ分子は、２つの別個のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、この場合、一方のオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡのセンス鎖を含み、もう一方はアンチセンス鎖を含む。例えば、各鎖を別々に合成し、合成及び／または脱保護の後、ハイブリダイゼーションまたはライゲーションによりつなぎ合わせることができる。
治療用核酸を含有する担体系
Ａ．脂質粒子
特定の態様では、本発明は、１つ以上のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載の１つ以上のｓｉＲＮＡ分子）及び１つ以上のカチオン性（アミノ）脂質またはその塩を含む脂質粒子を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子は、１つ以上の非カチオン性脂質をさらに含む。他の実施形態では、脂質粒子は、粒子の凝集を抑制または阻害できる複合脂質の１つ以上をさらに含む。
本発明の脂質粒子は、好ましくは、１つ以上のｓｉＲＮＡ（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質粒子中のｓｉＲＮＡ分子が水溶液中でヌクレアーゼによる分解に耐性を示すように、ｓｉＲＮＡ分子は脂質粒子の脂質部分内に完全に封入されている。他の実施形態では、本明細書に記載する脂質粒子は、ヒト等の哺乳類に対し実質的に非毒性である。本発明の脂質粒子は、典型的に、平均直径が約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、または約７０〜約９０ｎｍである。ある実施形態では、本発明の脂質粒子は中位径が約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍである。本発明の脂質粒子はまた、脂質：核酸の比（例えば、脂質：ｓｉＲＮＡの比）（質量／質量比）が、典型的に、約１：１〜約１００：１、約１：１〜約５０：１、約２：１〜約２５：１、約３：１〜約２０：１、約５：１〜約１５：１、または約５：１〜約１０：１である。ある実施形態では、核酸−脂質粒子は、脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が約５：１〜約１５：１である。
好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、１つ以上のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）、カチオン性脂質（例えば、本明細書に記載する式Ｉ〜ＩＩＩの１つ以上のカチオン性脂質またはその塩）、非カチオン性脂質（例えば、１つ以上のリン脂質とコレステロールとの混合物）、及び粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、１つ以上のＰＥＧ−脂質複合体）を含む、血清安定である核酸−脂質粒子である。脂質粒子は、本明細書に記載する遺伝子の１つ以上を標的とするｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上含んでよい。核酸−脂質粒子及びその調製方法は、例えば、米国特許第５，７５３，６１３号；同第５，７８５，９９２号；同第５，７０５，３８５号；同第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，１１０，７４５号；及び同第６，３２０，０１７号；ならびにＰＣＴ公開番号第ＷＯ９６／４０９６４号に記載されており、それらの開示内容の各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の核酸−脂質粒子では、１つ以上のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）を粒子の脂質部分内に完全に封入し、これによりｓｉＲＮＡをヌクレアーゼによる分解から保護してよい。特定の場合には、核酸−脂質粒子中のｓｉＲＮＡは、粒子をヌクレアーゼに３７℃で少なくとも約２０分、３０分、４５分、または６０分曝露させた後、実質的に分解されない。他の特定の場合には、核酸−脂質粒子中のｓｉＲＮＡは、粒子を血清中で３７℃にて少なくとも約３０分、４５分、もしくは６０分または少なくとも約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、もしくは３６時間インキュベーションした後、実質的に分解されない。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡと粒子の脂質部分とで複合体を形成させる。本発明の処方物の利点の一つは、核酸−脂質粒子組成物は、ヒト等の哺乳類に対し実質的に非毒性であることである。
「完全に封入された」という用語は、核酸−脂質粒子中のｓｉＲＮＡ（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）が、遊離のＤＮＡまたはＲＮＡを有意に分解する血清またはヌクレアーゼのアッセイに曝露した後、有意に分解されないことを指す。完全に封入された系では、好ましくは、通常なら遊離のｓｉＲＮＡの１００％が分解される処理において、粒子中のｓｉＲＮＡの約２５％未満が分解され、より好ましくは、粒子中のｓｉＲＮＡの約１０％未満、最も好ましくは約５％未満が分解される。「完全に封入された」とは、核酸−脂質粒子が血清安定である、すなわち、インビボ投与時、その成分部分に短時間で分解しないことも指す。
核酸に関連して、核酸と会合した場合の蛍光が増強された色素を使用する、膜不透過蛍光色素排除アッセイを実施することにより完全封入を決定してよい。プラスミドＤＮＡ、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、及び／または一本鎖もしくは二本鎖のリボヌクレオチドの定量的測定に、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）及びＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のような特定の色素が利用可能である。封入は、リポソーム処方物に色素を添加して、得られる蛍光を測定し、かつそれと少量の非イオン性界面活性剤の添加時に観察される蛍光とを比較することにより決定する。界面活性剤によるリポソーム二重層の破壊により、封入された核酸が放出され、それにより核酸が膜不透過色素と相互作用できる。核酸の封入は、Ｅ＝（Ｉｏ−Ｉ）／Ｉｏとして計算してよく、式中、Ｉ及びＩｏは、界面活性剤添加の前及び後の蛍光強度を指す（Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６：２７１−２８１（１９９９）を参照されたい）。
他の実施形態では、本発明は、複数の核酸−脂質粒子を含む核酸−脂質粒子組成物を提供する。
ある場合には、核酸−脂質粒子組成物は、粒子の約３０％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％、または少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）の中に、ｓｉＲＮＡが封入されるように、粒子の脂質部分内に完全に封入されたｓｉＲＮＡ分子を含む。
他の場合には、核酸−脂質粒子組成物は、インプットｓｉＲＮＡの約３０％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約３０％〜約９５％、約４０％〜約９５％、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％、または少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）が粒子内に封入されるように、粒子の脂質部分内に完全に封入されているｓｉＲＮＡを含む。
本発明の脂質粒子の使用意図に応じ、成分の割合を変えることができ、特定の処方物の送達効率を、例えば、エンドソーム放出パラメータ（ＥＲＰ）アッセイを使用して測定することができる。
１．カチオン性脂質
さまざまなカチオン性脂質またはその塩のいずれかを、単独で、または他の１つ以上のカチオン性脂質種もしくは非カチオン性脂質種と組み合わせて本発明の脂質粒子に使用してよい。カチオン性脂質には、その（Ｒ）型及び／または（Ｓ）型の鏡像異性体が含まれる。
本発明の一態様では、カチオン性脂質はジアルキル脂質である。例えば、ジアルキル脂質として、２本の飽和または不飽和のアルキル鎖を含む脂質が含まれてよく、各アルキル鎖は、置換されても、または置換されなくてもよい。ある実施形態では、２本のアルキル鎖はそれぞれ、少なくとも、例えば、８個の炭素原子、１０個の炭素原子、１２個の炭素原子、１４個の炭素原子、１６個の炭素原子、１８個の炭素原子、２０個の炭素原子、２２個の炭素原子または２４個の炭素原子を含む。
本発明の一態様では、カチオン性脂質はトリアルキル脂質である。例えば、トリアルキル脂質として、３本の飽和または不飽和のアルキル鎖を含む脂質が含まれてよく、各アルキル鎖は、置換されても、または置換されなくてもよい。ある実施形態では、３本のアルキル鎖はそれぞれ、少なくとも、例えば、８個の炭素原子、１０個の炭素原子、１２個の炭素原子、１４個の炭素原子、１６個の炭素原子、１８個の炭素原子、２０個の炭素原子、２２個の炭素原子または２４個の炭素原子を含む。
一態様では、以下の構造：
Figure 2017536092
 を有する式Ｉのカチオン性脂質、
またはその塩は、本発明において有用であり、式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一であるかまたは異なっており、互いに独立して水素（Ｈ）または任意選択で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、もしくはＣ２−Ｃ６アルキニルであるか、または、Ｒ１とＲ２とが結合して、炭素原子４〜６個、ならびに窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、及びその混合物からなる群から選択されるヘテロ原子１個もしくは２個からなる、任意選択で置換された複素環を形成してよく、
Ｒ３は、存在しないかまたは水素（Ｈ）もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであり、四級アミンを与え、
Ｒ４及びＲ５は、同一であるかまたは異なっており、互いに独立して任意選択で置換されたＣ１０−Ｃ２４アルキル、Ｃ１０−Ｃ２４アルケニル、Ｃ１０−Ｃ２４アルキニル、またはＣ１０−Ｃ２４アシルであり、式中、Ｒ４及びＲ５の少なくとも一方は、少なくとも２つ不飽和部位を含み、かつ
ｎは０、１、２、３、または４である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、独立して任意選択で置換されたＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、またはＣ２−Ｃ４アルキニルである。好ましい一実施形態では、Ｒ１及びＲ２はいずれもメチル基である。他の好ましい実施形態では、ｎは１または２である。他の実施形態では、Ｒ３は、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａを上回る場合は存在せず、また、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａを下回り、それによりアミノ頭基がプロトン化される場合は、Ｒ３は水素である。代替の実施形態では、Ｒ３は任意選択で置換されたＣ１−Ｃ４アルキルであり、四級アミンを与える。さらなる実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、独立して任意選択で置換されたＣ１２−Ｃ２０もしくはＣ１４−Ｃ２２アルキル、Ｃ１２−Ｃ２０もしくはＣ１４−Ｃ２２アルケニル、Ｃ１２−Ｃ２０もしくはＣ１４−Ｃ２２アルキニル、またはＣ１２−Ｃ２０もしくはＣ１４−Ｃ２２アシルであり、式中、Ｒ４及びＲ５の少なくとも一方は、少なくとも２つの不飽和部位を含む。
ある実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、独立して、ドデカジエニル部分、テトラデカジエニル部分、ヘキサデカジエニル部分、オクタデカジエニル部分、イコサジエニル部分、ドデカトリエニル部分、テトラデクトリエニル（ｔｅｔｒａｄｅｃｔｒｉｅｎｙｌ）部分、ヘキサデカトリエニル部分、オクタデカトリエニル部分、イコサトリエニル部分、アラキドニル部分、及びドコサヘキサエノイル部分、ならびに、そのアシル誘導体（例えば、リノレオイル、リノレノイル、γ−リノレノイル等）からなる群から選択される。ある場合には、Ｒ４及びＲ５の一方は、分岐アルキル基（例えば、フィタニル部分）またはそのアシル誘導体（例えば、フィタノイル部分）を含む。特定の場合には、オクタデカジエニル部分はリノレイル部分である。他の特定の場合には、オクタデカトリエニル部分はリノレニル部分またはγ−リノレニル部分である。ある実施形態では、Ｒ４及びＲ５はいずれも、リノレイル部分、リノレニル部分、またはγ−リノレニル部分である。特定の実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質は、１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−ブチル−４−アミン（Ｃ２−ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレオイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）−ブチル−４−アミン（Ｃ２−ＤＬｉｎＤＡＰ）、またはその混合物である。
いくつかの実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質は、１つ以上の陰イオンとともに塩（好ましくは結晶塩）を形成する。特定の一実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質は、そのシュウ酸塩（例えば、ヘミシュウ酸塩（ｈｅｍｉｏｘａｌａｔｅ））であり、好ましくは結晶塩である。
ＤＬｉｎＤＭＡ及びＤＬｅｎＤＭＡ等のカチオン性脂質、ならびにさらなるカチオン性脂質の合成は、米国特許公開第２００６００８３７８０号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｃ２−ＤＬｉｎＤＭＡ及びＣ２−ＤＬｉｎＤＡＰ等のカチオン性脂質、ならびにさらなるカチオン性脂質の合成は、国際特許出願番号第ＷＯ２０１１／０００１０６号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
別の態様では、以下の構造を有する式ＩＩのカチオン性脂質（またはその塩）は、本発明において有用である。
Figure 2017536092
上式中、Ｒ１及びＲ２は、同一であるかまたは異なっており、独立して任意選択で置換されたＣ１２−Ｃ２４アルキル、Ｃ１２−Ｃ２４アルケニル、Ｃ１２−Ｃ２４アルキニル、またはＣ１２−Ｃ２４アシルであり；Ｒ３及びＲ４は、同一であるかまたは異なっており、互いに独立して任意選択で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、またはＣ２−Ｃ６アルキニルであるか、またはＲ３とＲ４とが結合して、炭素原子４〜６個、ならびに窒素及び酸素から選択されるヘテロ原子１個もしくは２個からなる、任意選択で置換された複素環を形成してよく；Ｒ５は、存在しないかまたは水素（Ｈ）もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであり、四級アミンを与え；ｍ、ｎ、及びｐは、同一であるかまたは異なっており、互いに独立して０、１、または２であるが、但し、ｍ、ｎ、及びｐが同時に０ではないことを条件とし；ｑは０、１、２、３、または４であり；かつＹ及びＺは、同一であるかまたは異なっており、独立してＯ、Ｓ、またはＮＨである。好ましい実施形態では、ｑは２である。
いくつかの実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ；「ＸＴＣ２」または「Ｃ２Ｋ」）、２，２−ジリノレイル−４−（３−ジメチルアミノプロピル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ；「Ｃ３Ｋ」）、２，２−ジリノレイル−４−（４−ジメチルアミノブチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ；「Ｃ４Ｋ」）、２，２−ジリノレイル−５−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキサン（ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−Ｎ−メチルペピアジノ（ｍｅｔｈｙｌｐｅｐｉａｚｉｎｏ）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジオレオイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＯ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジステアロイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＳ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−Ｎ−モルホリノ−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−トリメチルアミノ−［１，３］−ジオキソランクロリド（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、２，２−ジリノレイル−４、５−ビス（ジメチルアミノメチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−メチルピペルジン（ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｚｉｎｅ）−［１，３］−ジオキソラン（Ｄ−Ｌｉｎ−Ｋ−Ｎ−メチルピペルジン（ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｚｉｎｅ））、またはその混合物である。好ましい実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡである。
いくつかの実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は、１つ以上の陰イオンとともに塩（好ましくは結晶塩）を形成する。特定の一実施形態では、式ＩＩのカチオン性脂質は、そのシュウ酸塩（例えば、ヘミシュウ酸塩（ｈｅｍｉｏｘａｌａｔｅ））であり、好ましくは結晶塩である。
ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ等のカチオン性脂質、ならびにさらなるカチオン性脂質の合成は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ０９／０８６５５８号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−Ｃ４−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ６−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＰＺ、ＤＯ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＳ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−Ｋ２−ＤＭＡ、及びＤ−Ｌｉｎ−Ｋ−Ｎ−メチルピペルジン（ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｚｉｎｅ）等のカチオン性脂質、ならびにさらなるカチオン性脂質の合成は、２００９年１０月９日に出願された「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｍｉｎｏ Ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題するＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６０２５１号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
さらなる態様では、以下の構造を有する式ＩＩＩのカチオン性脂質
Figure 2017536092
またはその塩は、本発明において有用であり、式中、Ｒ１及びＲ２は、同一であるかまたは異なっており、独立して任意選択で置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、またはＣ２−Ｃ６アルキニルであるが、またはＲ１とＲ２とが結合して、炭素原子４〜６個、ならびに窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、及びその混合物からなる群から選択されるヘテロ原子１個もしくは２個からなる、任意選択で置換された複素環を形成してよく；Ｒ３は、存在しないかまたは水素（Ｈ）もしくはＣ１−Ｃ６アルキルであり、四級アミンを与え；Ｒ４及びＲ５は、存在しないか、または存在するが、存在する場合は、同一であるかまたは異なっており、独立して任意選択で置換されたＣ１−Ｃ１０アルキルまたはＣ２−Ｃ１０アルケニルであり；かつｎは０、１、２、３、または４である。
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、独立して任意選択で置換されたＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ２−Ｃ４アルケニル、またはＣ２−Ｃ４アルキニルである。好ましい実施形態では、Ｒ１及びＲ２はいずれもメチル基である。別の好ましい実施形態では、Ｒ４及びＲ５はいずれもブチル基である。さらに別の好ましい実施形態では、ｎは１である。他の実施形態では、Ｒ３は、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａを上回る場合は存在せず、また、ｐＨがカチオン性脂質のｐＫａを下回り、それによりアミノ頭基がプロトン化される場合は水素である。代替の実施形態では、Ｒ３は任意選択で置換されたＣ１−Ｃ４アルキルであり、四級アミンを与える。さらなる実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、独立して任意選択で置換されたＣ２−Ｃ６もしくはＣ２−Ｃ４アルキルまたはＣ２−Ｃ６もしくはＣ２−Ｃ４アルケニルである。
代替の実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、アミノ頭基と、アルキル鎖の一方もしくは両方との間にエステル結合を含む。いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、１つ以上の陰イオンとともに塩（好ましくは結晶塩）を形成する。特定の一実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、そのシュウ酸塩（例えば、ヘミシュウ酸塩（ｈｅｍｉｏｘａｌａｔｅ））であり、好ましくは結晶塩である。
式ＩＩＩのアルキル鎖はそれぞれ、６位、９位、及び１２位にｃｉｓ二重結合を含む（すなわち、ｃｉｓ、ｃｉｓ、ｃｉｓ−Δ６、Δ９、Δ１２）が、代替の実施形態では、アルキル鎖の一方または両方にあるこれらの二重結合の１つ、２つ、または３つは、ｔｒａｎｓ配置であってよい。
特に好ましい実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、以下の構造を有する。
Figure 2017536092
γ−ＤＬｅｎＤＭＡ（１５）等のカチオン性脂質、ならびにさらなるカチオン性脂質の合成は、２００９年７月１日に出願された「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題する米国仮特許出願第６１／２２２，４６２号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（「ＭＣ３」）等のカチオン性脂質、ならびにさらなるカチオン性脂質（例えば、ＭＣ３の特定の類似体）の合成は、２００９年６月１０日に出願された「Ｎｏｖｅｌ Ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」と題する米国仮特許出願第６１／１８５，８００号、及び２００９年１２月１８日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題する米国仮特許出願第６１／２８７，９９５号に記載されており、それらの開示内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の脂質粒子に含まれてよい他のカチオン性脂質またはその塩の例には、あらゆる目的のために参照によりその開示全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０００１０６に記載のようなカチオン性脂質、及びカチオン性脂質、例えばＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジステアリルオキシ（ｄｉｓｔｅａｒｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３−（Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｏｇｌｙｃｙｌ ｓｐｅｒｍｉｎｅ）（ＤＯＧＳ）、３−ジメチルアミノ−２−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカジエンオキシ（ｏｃｔａｄｅｃａｄｉｅｎｏｘｙ））プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２−［５'−（コレスタ−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３'−オキサペントキシ（ｏｘａｐｅｎｔｏｘｙ））−３−ジメチ（ｄｉｍｅｔｈｙ）−１−（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９'，１−２'−オクタデカジエンオキシ（ｏｃｔａｄｅｃａｄｉｅｎｏｘｙ））プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミン（ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｅ）（ＤＭＯＢＡ）、１，２−Ｎ，Ｎ'−ジオレイルカルバミル（ｄｉｏｌｅｙｌｃａｒｂａｍｙｌ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２−Ｎ，Ｎ'−ジリノレイルカルバミル（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｃａｒｂａｍｙｌ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｔｈｉｏ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ（ｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌａｍｉｎｏ））−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ（ｄｉｏｌｅｙｌａｍｉｎｏ））−１，２−プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｏ）−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジオエイルカルバモイルオキシ（ｄｉｏｅｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＯ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジミリストレオイル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＭＤＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ）、ジリノレイルメチル（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｍｅｔｈｙｌ）−３−ジメチルアミノプロピオナート（ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ；ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｋ−ＤＭＡまたはＤＬｉｎ−Ｍ−ＤＭＡとしても知られる）、ならびにその混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の脂質粒子に含まれてよいさらなるカチオン性脂質またはその塩は、米国特許公開第２００９００２３６７３号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＣＬｉｎＤＭＡ等のカチオン性脂質、ならびにさらなるカチオン性脂質の合成は、米国特許公開第２００６０２４０５５４号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＣ、ＤＬｉｎＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、及びＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ等のカチオン性脂質、ならびにさらなるカチオン性脂質の合成は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ０９／０８６５５８号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＯ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＭＤＡＰ、ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ等のカチオン性脂質、ならびにさらなるカチオン性脂質の合成は、２００９年１０月９日に出願された「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｍｉｎｏ Ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」と題するＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６０２５１号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。他の多数のカチオン性脂質及び関連類似体の合成は、米国特許第５，２０８，０３６号；同第５，２６４，６１８号；同第５，２７９，８３３号；同第５，２８３，１８５号；同第５，７５３，６１３号；及び同第５，７８５，９９２号；ならびにＰＣＴ公開番号第ＷＯ９６／１０３９０号に記載されており、それらの開示内容の各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、市販されている多数のカチオン性脂質調製物、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含む）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含む）；及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から入手可能なＤＯＧＳを含む）を使用することができる。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約８０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約７５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約７０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、または約５５ｍｏｌ％〜約７０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）を占める。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％、５１ｍｏｌ％、５２ｍｏｌ％、５３ｍｏｌ％、５４ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、５６ｍｏｌ％、５７ｍｏｌ％、５８ｍｏｌ％、５９ｍｏｌ％、６０ｍｏｌ％、６１ｍｏｌ％、６２ｍｏｌ％、６３ｍｏｌ％、６４ｍｏｌ％、または６５ｍｏｌ％（またはその任意の分数）を占める。
他の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、または約４０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）を占める。
本発明の脂質粒子での使用に好適なカチオン性脂質のさらなるパーセンテージ及び範囲は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ０９／１２７０６０号、米国公開出願第ＵＳ２０１１／００７１２０８号、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２０１１／０００１０６号、及び米国公開出願第ＵＳ２０１１／００７６３３５号に記載されており、それらの開示内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の脂質粒子内に存在するカチオン性脂質のパーセンテージは目標量であること、及び処方物に存在するカチオン性脂質の実際量は、例えば±５ｍｏｌ％異なり得ることを理解されるべきである。例えば、例示的な１つの脂質粒子処方物では、カチオン性脂質の目標量は５７．１ｍｏｌ％であるが、カチオン性脂質の実際量は、その目標量の±５ｍｏｌ％、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％であってよく、処方物の残部は他の脂質成分で構成される（粒子に存在する総脂質が合計１００ｍｏｌ％なる。ただし、当業者は、総ｍｏｌ％は例えば９９．９ｍｏｌ％または１００．１ｍｏｌ％を四捨五入するため１００％からわずかにずれる場合があることを理解されるであろう）。本発明で使用する脂質粒子に含めるために有用なカチオン性脂質のさらなる例を以下に示す。
Figure 2017536092
 Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）プロパン−１−アミン（５）
Figure 2017536092
 ２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（６）
Figure 2017536092
 （６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート（７）
Figure 2017536092
 ３−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミン（８）
Figure 2017536092
 （Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−１６−エン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノアート（５３）
Figure 2017536092
 （６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル６−（ジメチルアミノ）ヘキサノアート（１１）
Figure 2017536092
 （６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノアート（１３）
Figure 2017536092
 １２−デシルドコサン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノアート（１４）。
２．非カチオン性脂質
本発明の脂質粒子に使用する非カチオン性脂質は、安定な複合体を形成できる中性非荷電性、両性イオン型、またはアニオン性の多種多様な脂質のいずれでもあり得る。
非カチオン性脂質の非限定的な例には、リン脂質、例えば、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスファート（ｄｉｃｅｔｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレイオル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｙｏｌ）−ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びその混合物が挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンのリン脂質も使用することができる。これらの脂質のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０−Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸類、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルから誘導されるアシル基である。
非カチオン性脂質のさらなる例には、コレステロール等のステロール及びその誘導体が挙げられる。コレステロール誘導体の非限定的な例には、極性類似体、例えば５α−コレスタノール、５β−コプロスタノール、コレステリル−（２'−ヒドロキシ）−エチルエーテル、コレステリル−（４'−ヒドロキシ）−ブチルエーテル、及び６−ケトコレスタノール、非極性類似体、例えば５α−コレスタン、コレステノン、５α−コレスタノン、５β−コレスタノン、及びコレステリルデカノアート、ならびにその混合物が挙げられる。好ましい実施形態では、コレステロール誘導体はコレステリル−（４'−ヒドロキシ）−ブチルエーテルのような極性類似体である。コレステリル−（２'−ヒドロキシ）−エチルエーテルの合成は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ０９／１２７０６０号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、脂質粒子に存在する非カチオン性脂質は、１つ以上のリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含むか、またはそれで構成される。他の実施形態では、脂質粒子に存在する非カチオン性脂質は、１つ以上のリン脂質、例えば、コレステロールを含まない脂質粒子処方物を含むか、またはそれで構成される。さらに別の実施形態では、脂質粒子に存在する非カチオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体、例えば、リン脂質を含まない脂質粒子処方物を含むか、またはそれで構成される。
本発明での使用に好適な非カチオン性脂質の他の例には、非リン含有脂質、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミタート（ａｃｅｔｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、グリセロールリシノレアート（ｇｌｙｃｅｒｏｌｒｉｃｉｎｏｌｅａｔｅ）、ヘキサデシルステアラート（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｓｔｅｒｅａｔｅ）、イソプロピルミリスタート、両性アクリルポリマー、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルアリールスルホン酸塩ポリエチルオキシル化（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｏｘｙｌａｔｅｄ）脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド、セラミド、スフィンゴミエリン等等が挙げられる。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３７ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％、３６ｍｏｌ％、３７ｍｏｌ％、３８ｍｏｌ％、３９ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４１ｍｏｌ％、４２ｍｏｌ％、４３ｍｏｌ％、４４ｍｏｌ％、または４５ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）を占める。
脂質粒子にリン脂質とコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物が含有される実施形態では、混合物は、粒子中に存在する総脂質の最大約４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％を占め得る。
いくつかの実施形態では、混合物のリン脂質成分は、粒子中に存在する総脂質の約２ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、または約４ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）を占め得る。特定の実施形態では、混合物のリン脂質成分は、粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約１７ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％〜約１７ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約８ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、または約８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％、または１５ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）を占める。非限定的な例として、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む脂質粒子処方物は、ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質を、例えば、粒子中に存在する総脂質の約３４ｍｏｌ％（またはその任意の分数）を占めるコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物に、約７ｍｏｌ％（またはその任意の分数）含んでよい。別の非限定的な例として、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む脂質粒子処方物は、ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質を、例えば、粒子中に存在する総脂質の約３２ｍｏｌ％（またはその任意の分数）のコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物に、総脂質の約７ｍｏｌ％（またはその任意の分数）含んでよい。
さらなる例として、本発明の実施に有用な脂質処方物は、脂質対薬物（例えば、ｓｉＲＮＡ）比が約１０：１（例えば、脂質：薬物の比が９．５：１〜１１：１、または９．９：１〜１１：１、または１０：１〜１０．９：１）である。他の特定の実施形態では、本発明の実施に有用な脂質処方物は、脂質薬物（例えば、ｓｉＲＮＡ）比が約９：１である（例えば、脂質：薬物の比が８．５：１〜１０：１、または８．９：１〜１０：１、または９：１〜９．９：１であり、９．１：１、９．２：１、９．３：１、９．４：１、９．５：１、９．６：１、９．７：１、及び９．８：１が含まれる）。
他の実施形態では、混合物中のコレステロール成分は、粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％〜約３７ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）を占め得る。特定の好ましい実施形態では、混合物中のコレステロール成分は、粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約２９ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３４ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％〜約３３ｍｏｌ％、または約３０ｍｏｌ％、３１ｍｏｌ％、３２ｍｏｌ％、３３ｍｏｌ％、３４ｍｏｌ％、または３５ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）を占める。
脂質粒子がリン脂質を含まない実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する総脂質の最大約２５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、４５ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、５５ｍｏｌ％、または６０ｍｏｌ％を占め得る。
いくつかの実施形態では、リン脂質を含まない脂質粒子処方物中のコレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％〜約３９ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％〜約３８ｍｏｌ％、約３３ｍｏｌ％〜約３７ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％、または約３０ｍｏｌ％、３１ｍｏｌ％、３２ｍｏｌ％、３３ｍｏｌ％、３４ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％、３６ｍｏｌ％、３７ｍｏｌ％、３８ｍｏｌ％、３９ｍｏｌ％、もしくは４０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）を占め得る。非限定的な例として、脂質粒子処方物は、コレステロールを、粒子中に存在する総脂質の約３７ｍｏｌ％（またはその任意の分数）含んでよい。別の非限定的な例として、脂質粒子処方物は、コレステロールを、粒子中に存在する総脂質の約３５ｍｏｌ％（またはその任意の分数）含んでよい。
他の実施形態では、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％〜約８５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％〜約８０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％（例えば、リン脂質のみ）、または約６０ｍｏｌ％（例えば、リン脂質及びコレステロールもしくはその誘導体）（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）を占める。
本発明の脂質粒子での使用に好適な非カチオン性脂質のさらなるパーセンテージ及び範囲は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ０９／１２７０６０号、米国公開出願第ＵＳ２０１１／００７１２０８号、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２０１１／０００１０６号、及び米国公開出願第ＵＳ２０１１／００７６３３５号に記載されており、それらの開示内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の脂質粒子内に存在する非カチオン性脂質のパーセンテージは目標量であること、及び処方物に存在する非カチオン性脂質の実際量は、例えば、±５ｍｏｌ％、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％異なり得ることを理解されるべきである。
３．脂質複合体
本発明の脂質粒子は、カチオン性及び非カチオン性の脂質のほか、脂質複合体をさらに含んでよい。複合脂質は、粒子の凝集を防ぐ上で有用である。好適な複合脂質には、ＰＥＧ−脂質複合体、ＰＯＺ−脂質複合体、ＡＴＴＡ−脂質複合体、カチオン性−ポリマー−脂質複合体（ＣＰＬ）、及びその混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。ある実施形態では、粒子はＰＥＧ−脂質複合体またはＡＴＴＡ−脂質複合体いずれかをＣＰＬと共に含む。
好ましい実施形態では、脂質複合体はＰＥＧ−脂質である。ＰＥＧ−脂質の例には、ジアルキルオキシプロピルと結合させたＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＡ）（例えば、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ０５／０２６３７２号に記載）、ジアシルグリセロールと結合させたＰＥＧ（ＰＥＧ−ＤＡＧ）（例えば、米国特許公開第２００３００７７８２９号及び第２００５００８６８９号に記載）、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質と結合させたＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）、セラミドと複合体を形成したＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号に記載）、コレステロールまたはその誘導体と複合体を形成したＰＥＧ、及びその混合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの特許文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明での使用に好適なさらなるＰＥＧ−脂質には、限定することなく、ｍＰＥＧ２０００−１，２−ジ−Ｏ−アルキル−ｓｎ３−カルボモイルグリセリド（ｃａｒｂｏｍｏｙｌｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）が挙げられる。ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧの合成は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ０９／０８６５５８号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに別の好適なＰＥＧ−脂質複合体には、限定することなく、１−［８'−（１，２−ジミリストイル−３−プロパノキシ）−カルボキサミド−３'，６'−ジオキサオクタニル（ｄｉｏｘａｏｃｔａｎｙｌ）］カルバモイル−ω−メチル−ポリ（エチレングリコール）（２ＫＰＥＧ−ＤＭＧ）が含まれる。２ＫＰＥＧ−ＤＭＧの合成は、米国特許第７，４０４，９６９号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＰＥＧは、直鎖で水溶性の、エチレンＰＥＧ繰り返し単位のポリマーであり、２つの末端ヒドロキシル基を有する。ＰＥＧは、その分子量によって分類され、例えば、ＰＥＧ２０００は、平均分子量が約２，０００ダルトンであり、ＰＥＧ５０００は平均分子量が約５，０００ダルトンである。ＰＥＧは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．等の企業から市販されており、それらとしては、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ−ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール−コハク酸塩（ＭｅＰＥＧ−Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール−コハク酸スクシンイミジル（ＭｅＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−アミン（ＭｅＰＥＧ−ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール−トレシラート（ＭｅＰＥＧ−ＴＲＥＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール−イミダゾリル−カルボニル（ＭｅＰＥＧ−ＩＭ）、ならびに、このような化合物で、末端メトキシ基の代わりに末端ヒドロキシル基を含むもの（例えば、ＨＯ−ＰＥＧ−Ｓ、ＨＯ−ＰＥＧ−Ｓ−ＮＨＳ、ＨＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２等）が挙げられるが、これに限定されるものではない。米国特許第６，７７４，１８０号及び第７，０５３，１５０号に記載されているような他のＰＥＧ（例えば、ｍＰＥＧ（２０ｋＤａ）アミン）も、本発明のＰＥＧ−脂質複合体の調製に有用である。これらの特許の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、モノメトキシポリエチレングリコール−酢酸（ＭｅＰＥＧ−ＣＨ２ＣＯＯＨ）は、例えば、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体等のＰＥＧ−脂質複合体を調製するために特に有用である。
本明細書に記載するＰＥＧ−脂質複合体のＰＥＧ部分は、約５５０ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を含んでよい。特定の場合には、ＰＥＧ部分は、平均分子量が、約７５０ダルトン〜約５，０００ダルトン（例えば、約１，０００ダルトン〜約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約２，０００ダルトン等）である。好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分は、平均分子量が約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンである。
特定の場合には、ＰＥＧは、任意選択でアルキル基、アルコキシ基、アシル基、またはアリール基で置換され得る。ＰＥＧは、脂質と直接複合体化させることができるが、または、リンカー部分を介して脂質に連結してよい。例えば、エステル非含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分等の、ＰＥＧを脂質に結合させるために好適なリンカー部分を使用することができる。好ましい実施形態では、リンカー部分はエステル非含有リンカー部分である。本発明において、用語「エステル非含有リンカー部分」とは、カルボン酸のエステル結合（−ＯＣ（Ｏ）−）を含まないリンカー部分を指す。好適なエステル非含有リンカー部分には、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）、アミノ（−ＮＲ−）、カルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）、カルバマート（−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−）、尿素（−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、スクシニル（−（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−）、スクシンアミジル（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｄｙｌ）（−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）、エーテル、ジスルフィド、ならびに、その組み合わせ（カルバマートリンカー部分及びアミドリンカー部分の両方を含有するリンカー等）が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい実施形態では、カルバマートリンカーを使用してＰＥＧを脂質に結合させる。
他の実施形態では、エステル含有リンカー部分を使用してＰＥＧを脂質に結合させる。好適なエステル含有リンカー部分は、例えば、炭酸塩（−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−）、スクシノイル、リン酸エステル（−Ｏ−（Ｏ）ＰＯＨ−Ｏ−）、スルホン酸エステル、及びその組み合わせを含む。
鎖長及び飽和度の異なる多様なアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンをＰＥＧに結合させて脂質複合体を形成することができる。このようなホスファチジルエタノールアミンは市販のものであるか、当業者に公知の従来技術を使用して単離または合成することができる。炭素鎖長がＣ１０〜Ｃ２０の範囲の飽和または不飽和の脂肪酸を含有するホスファチジル−エタノールアミンが好ましい。一価または二価の不飽和脂肪酸ならびに飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸との混合物を有するホスファチジルエタノールアミンを使用することもできる。好適なホスファチジルエタノールアミンには、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
用語「ＡＴＴＡ」または「ポリアミド」には、限定することなく、米国特許第６，３２０，０１７号及び同第６，５８６，５５９号に記載の化合物が含まれ、それらの開示内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの化合物には、式：
Figure 2017536092
 を有する化合物が含まれる。
上式中、Ｒは、水素、アルキル及びアシルからなる群から選択されるメンバーであり；Ｒ１は、水素及びアルキルからなる群から選択されるメンバーであるか；または任意選択で、Ｒ及びＲ１、ならびにこれらが結合している窒素でアジド部分を形成し；Ｒ２は、水素、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアリール及びアミノ酸の側鎖から選択される群のメンバーであり；Ｒ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノ及びＮＲ４Ｒ５からなる群から選択されるメンバーであり、ここで、Ｒ４及びＲ５は、独立して水素またはアルキルであり；ｎは４〜８０であり；ｍは２〜６であり；ｐは１〜４であり；かつｑは０または１である。本発明の化合物に他のポリアミドを使用できることは当業者に明らかであろう。
用語「ジアシルグリセロール」または「ＤＡＧ」には、２本の脂肪酸アシル鎖、Ｒ１及びＲ２を有し、これらの鎖が独立してグリセロールの１位及び２位にエステル結合で結合した２〜３０個の炭素を有する化合物が含まれる。アシル基は、飽和であるか、または不飽和度がさまざまであり得る。好適なアシル基には、ラウロイル（Ｃ１２）、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）、ステアロイル（Ｃ１８）、及びイコソイル（ｉｃｏｓｏｙｌ）（Ｃ２０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい実施形態では、Ｒ１及びＲ２は同一である、すなわち、Ｒ１及びＲ２はいずれもミリストイル（すなわち、ジミリストイル）であり、Ｒ１及びＲ２はいずれもステアロイル（すなわち、ジステアロイル）等である。ジアシルグリセロール以下の一般式：
Figure 2017536092
 を有する。
用語「ジアルキルオキシプロピル」または「ＤＡＡ」には、２本のアルキル鎖Ｒ１及びＲ２を有し、これらの鎖が互いに独立して２〜３０個の炭素を有する化合物が含まれる。アルキル基は、飽和であるか、または不飽和度がさまざまであり得る。ジアルキルオキシプロピルは以下の一般式：
Figure 2017536092
 を有する。
好ましい実施形態では、ＰＥＧ−脂質は以下の式：
Figure 2017536092
 を有するＰＥＧ−ＤＡＡ複合体である。
ここで、Ｒ１及びＲ２は、独立して選択され、かつ約１０〜約２２個の炭素原子を有する長鎖アルキル基であり；ＰＥＧはポリエチレングリコールであり；Ｌは、前述のようなエステル非含有リンカー部分またはエステル含有リンカー部分である。長鎖アルキル基は、飽和または不飽和であり得る。好適なアルキル基には、デシル（Ｃ１０）、ラウリル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）、及びイコシル（Ｃ２０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい実施形態では、Ｒ１及びＲ２は同一である、すなわち、Ｒ１及びＲ２はいずれもミリスチル（すなわち、ジミリスチル）であり、Ｒ１及びＲ２はいずれもステアリル（すなわち、ジステアリル）等である。
上記式ＶＩＩでは、ＰＥＧは、平均分子量が約５５０ダルトン〜約１０，０００ダルトンの範囲である。特定の場合には、ＰＥＧは、平均分子量が約７５０ダルトン〜約５，０００ダルトン（例えば、約１，０００ダルトン〜約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン〜約２，０００ダルトン等）である。好ましい実施形態では、ＰＥＧは、平均分子量が約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンである。ＰＥＧは、任意選択でアルキル基、アルコキシ基、アシル基、またはアリール基で置換され得る。ある実施形態では、末端ヒドロキシル基をメトキシ基またはメチル基で置換する。
好ましい実施形態では、「Ｌ」はエステル非含有リンカー部分である。好適なエステル非含有リンカーには、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバマートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分、スクシンアミジル（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｄｙｌ）リンカー部分、及びその組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい実施形態では、エステル非含有リンカー部分はカルバマートリンカー部分（すなわち、ＰＥＧ−Ｃ−ＤＡＡ複合体）である。別の好ましい実施形態では、エステル非含有リンカー部分はアミドリンカー部分（すなわち、ＰＥＧ−Ａ−ＤＡＡ複合体）である。さらに別の好ましい実施形態では、エステル非含有リンカー部分はスクシンアミジル（ｓｕｃｃｉｎａｍｉｄｙｌ）リンカー部分（すなわち、ＰＥＧ−Ｓ−ＤＡＡ複合体）である。
特定の実施形態では、ＰＥＧ−脂質複合体は以下の
Figure 2017536092
Figure 2017536092
 から選択される。
ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体を、当業者に公知の標準的な技術及び試薬を使用して合成する。ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体には、さまざまなアミド結合、アミン結合、エーテル結合、チオ結合、カルバマート結合、及び尿素結合が含まれることになることを認識されよう。当業者は、これらの結合を形成させるための方法及び試薬は周知であり、容易に利用可能であることを認識するであろう。例えば、Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（Ｗｉｌｅｙ １９９２）； Ｌａｒｏｃｋ，ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＯＲＧＡＮＩＣ ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ（ＶＣＨ １９８９）；及びＦｕｒｎｉｓｓ，ＶＯＧＥＬ'Ｓ ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，５ｔｈ ｅｄ．（Ｌｏｎｇｍａｎ １９８９）を参照されたい。存在する任意の官能基は、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体の合成時の異なる時点で保護及び脱保護が必要となる場合があることも理解されるであろう。当業者は、このような技術が周知であることを認識するであろう。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｗｉｌｅｙ １９９１）を参照されたい。
好ましくは、ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体はＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）複合体、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）複合体、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）複合体、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）複合体、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）複合体である。これらの実施形態では、ＰＥＧは、好ましくは、平均分子量が約７５０または約２，０００ダルトンである。特に好ましい一実施形態では、ＰＥＧ−脂質複合体は、ＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡを含み、ここで、「２０００」はＰＥＧの平均分子量を指し、「Ｃ」はカルバマートリンカー部分を指し、「ＤＭＡ」はジミリスチルオキシプロピルを指す。特に好ましい別の実施形態では、ＰＥＧ−脂質複合体は、ＰＥＧ７５０−Ｃ−ＤＭＡを含み、ここで、「７５０」はＰＥＧの平均分子量を指し、「Ｃ」はカルバマートリンカー部分を指し、「ＤＭＡ」はジミリスチルオキシプロピルを指す。特定の実施形態では、ＰＥＧの末端ヒドロキシル基をメチル基で置換する。当業者は、他のジアルキルオキシプロピルを本発明のＰＥＧ−ＤＡＡ複合体に使用できることを容易に理解するであろう。
上記のもののほか、ＰＥＧに代えて他の親水性ポリマーを使用できることは当業者にすぐに明らかとなるであろう。ＰＥＧに代えて使用できる好適なポリマーの例には、ポルビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド及びポリジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロース等の誘導体化セルロースが挙げられるが、これに限定されるものではない。
上述の成分に加え、本発明の脂質粒子は、カチオン性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質またはＣＰＬをさらに含むことができる（例えば、あらゆる目的のために参照によりその開示内容全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１１：４３３−４３７（２０００）；米国特許第６，８５２，３３４号；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ００／６２８１３号を参照されたい）。
好適なＣＰＬとして、式ＶＩＩＩ：
Ａ−Ｗ−Ｙ（ＶＩＩＩ）
の化合物が含まれる。
上式中、Ａ、Ｗ、及びＹは、以下に記載のとおりである。
式ＶＩＩＩに関し、「Ａ」は、脂質アンカーとして機能する、両親媒性脂質、中性脂質、または疎水性脂質等の脂質部分である。好適な脂質例には、ジアシルグリセロリル（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｙｌ）、ジアルキルグリセロリル（ｄｉａｌｋｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｙｌ）、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン、及び１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
「Ｗ」は、親水性のポリマーまたはオリゴマーのようなポリマーまたはオリゴマーである。好ましくは、親水性ポリマーは、非免疫原性であるかまたは本質的な免疫原性が低い生体適合性ポリマーである。代替として、親水性ポリマーは、適切なアジュバントと共に使用する場合は弱抗原性であり得る。好適な非免疫原性ポリマーには、ＰＥＧ、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸共重合体、及びその組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい実施形態では、ポリマーは、分子量が約２５０〜約７，０００ダルトンである。
「Ｙ」はポリカチオン性部分である。ポリカチオン性部分という用語は、選択ｐＨ、好ましくは生理的ｐＨにおいて、正電荷、好ましくは少なくとも２つの正電荷を有する化合物、誘導体、または官能基を指す。好適なポリカチオン性部分には、塩基性アミノ酸及びその誘導体、例えば、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、及びヒスチジン；スペルミン；スペルミジン；カチオン性デンドリマー；ポリアミン；ポリアミン糖；及びアミノ多糖類が挙げられる。ポリカチオン性部分は、直鎖テトラリジンのような直鎖、分岐またはデンドリマーの構造であり得る。ポリカチオン性部分は、選択ｐＨ値で約２〜約１５の正電荷、好ましくは約２〜約１２の正電荷、より好ましくは約２〜約８の正電荷を有する。どのポリカチオン性部分を用いるかの選択は、所望される粒子用途の種類により決定してよい。
ポリカチオン性部分の電荷は、粒子部分全体に分布していても、または代替として、粒子部分の特定の一領域に離散して集中する電荷密度のもの、例えば、荷電スパイクがあってもよい。電荷密度が粒子上に分布している場合、電荷密度は、均等に分布していても、不均等に分布していてもよい。ポリカチオン性部分の荷電分布の種類はすべて本発明により包含される。
脂質「Ａ」及び非免疫原性ポリマー「Ｗ」は、さまざまな方法により結合させることができ、好ましくは共有結合させることができる。「Ａ」と「Ｗ」の共有結合には当業者に公知の方法を使用することができる。好適な結合には、アミド結合、アミン結合、カルボキシル結合、炭酸塩結合、カルバマート結合、エステル結合、及びヒドラゾン結合が挙げられるが、これに限定されるものではない。当業者には、結合を達成するためには、「Ａ」及び「Ｗ」は相補的官能基を有している必要があることは明らかであろう。これらの２基、すなわち、脂質上の１基とポリマー上のもう１基との反応により所望の結合が得られることになる。例えば、脂質がジアシルグリセロールであり、その末端ヒドロキシル基を、例えばＮＨＳ及びＤＣＣで活性化させて活性エステルを形成させ、次いで、アミノ基を含有するポリマー、例えばポリアミド等と反応させると（例えば、あらゆる目的のために参照によりその開示内容全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，３２０，０１７号及び同第６，５８６，５５９号を参照されたい）、２基の間にアミド結合が形成されることになる。
特定の場合には、ポリカチオン性部分には、標的指向リガンドまたはカルシウム錯化のためのキレート化部分のようなリガンドが結合している。好ましくは、リガンド結合後、カチオン性部分は正電荷を維持する。特定の場合には、結合しているリガンドは正電荷を有する。好適なリガンドには、限定されるものではないが、反応性官能基を有する化合物またはデバイスが含まれ、脂質、両親媒性脂質、担体化合物、生物親和性化合物、生体材料、バイオポリマー、生物医学用機器、分析により検出可能な化合物、治療的に活性な化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫刺激物質、放射標識、発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ）、ビオチン、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖類、リポソーム、ビロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、他の標的指向部分、または毒素が挙げられる。
いくつかの実施形態では、脂質複合体（例えば、ＰＥＧ−脂質）は、粒子中に存在する総脂質の約０．１ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％、または約０．６ｍｏｌ％、０．７ｍｏｌ％、０．８ｍｏｌ％、０．９ｍｏｌ％、１．０ｍｏｌ％、１．１ｍｏｌ％、１．２ｍｏｌ％、１．３ｍｏｌ％、１．４ｍｏｌ％、１．５ｍｏｌ％、１．６ｍｏｌ％、１．７ｍｏｌ％、１．８ｍｏｌ％、１．９ｍｏｌ％、２．０ｍｏｌ％、２．１ｍｏｌ％、２．２ｍｏｌ％、２．３ｍｏｌ％、２．４ｍｏｌ％、２．５ｍｏｌ％、２．６ｍｏｌ％、２．７ｍｏｌ％、２．８ｍｏｌ％、２．９ｍｏｌ％もしくは３ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）を占める。
他の実施形態では、脂質複合体（例えば、ＰＥＧ−脂質）は、粒子中に存在する総脂質の約０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％〜約１８ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％〜約１５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約１２ｍｏｌ％、または約２ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）を占める。
さらなる実施形態では、脂質複合体（例えば、ＰＥＧ−脂質）は、粒子中に存在する総脂質の約４ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％〜約８ｍｏｌ％、または約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、もしくは１０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）を占める。
本発明の脂質粒子内に存在する脂質複合体のパーセンテージは目標量であること、及び処方物に存在する脂質複合体の実際量は、例えば、±５ｍｏｌ％、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．７５ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．１ｍｏｌ％異なり得ることを理解されるべきである。
本発明の脂質粒子での使用に好適な脂質複合体のさらなるパーセンテージ及び範囲は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ０９／１２７０６０号、米国公開出願第ＵＳ２０１１／００７１２０８号、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２０１１／０００１０６号、及び米国公開出願第ＵＳ２０１１／００７６３３５号に記載されており、それらの開示内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
当業者は、脂質複合体の濃度は、用いる脂質複合体、及び脂質粒子が膜融合性になる速度に応じて異なり得ることを理解するであろう。
脂質複合体の組成及び濃度を制御することにより、脂質複合体が脂質粒子の外部で交換を行う速度を制御することができ、ひいては、脂質粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。例えば、脂質複合体としてＰＥＧ−ＤＡＡ複合体を使用する場合、脂質粒子が膜融合性になる速度は、例えば、脂質複合体の濃度の変更、ＰＥＧ分子量の変更、または鎖長及びＰＥＧ−ＤＡＡ複合体上のアルキル基の飽和度の変更を行うことにより、変化させることができる。さらに、脂質粒子が膜融合性になる速度を変化させる、かつ／またはそれを制御するために、他の変数、例えば、ｐＨ、温度、イオン強度等を使用することができる。脂質粒子が膜融合性になる速度の制御に使用できる他の方法は、当業者が本開示を読むと明らかとなるであろう。また、脂質複合体の組成及び濃度を制御することにより、脂質粒径を制御することができる。
Ｂ．さらなる担体系
本発明での使用に好適な脂質を用いたさらなる担体系の非限定的な例には、リポプレックス（例えば、米国特許公開第２００３０２０３８６５号；及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，１００：１６５−１８０（２００４）を参照されたい）、ｐＨ感受性リポプレックス（例えば、米国特許公開第２００２０１９２２７５号を参照されたい）、可逆的にマスキングした（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ ｍａｓｋｅｄ）リポプレックス（例えば、米国特許公開第２００３０１８０９５０号を参照されたい）、カチオン性脂質を用いた組成物（例えば、米国特許第６，７５６，０５４号；及び米国特許公開第２００５０２３４２３２号）、カチオン性リポソーム（例えば、米国特許公開第２００３０２２９０４０号、同第２００２０１６００３８号、及び同第２００２００１２９９８号；米国特許第５，９０８，６３５号；ならびにＰＣＴ公開番号第ＷＯ０１／７２２８３号を参照されたい）、アニオン性リポソーム（例えば、米国特許公開第２００３００２６８３１号を参照されたい）、ｐＨ感受性リポソーム（例えば、米国特許公開第２００２０１９２２７４号；及びＡＵ２００３２１０３０３号）、抗体で被覆したリポソーム（例えば、米国特許公開第２００３０１０８５９７号；及びＰＣＴ公開番号第ＷＯ００／５０００８号）、細胞型特異的リポソーム（例えば、米国特許公開第２００３０１９８６６４号を参照されたい）、核酸及びペプチドを含有するリポソーム（例えば、米国特許第６，２０７，４５６号を参照されたい）、放出可能な親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含有するリポソーム（例えば、米国特許公開第２００３００３１７０４号を参照されたい）、脂質に内包された（ｌｉｐｉｄ−ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）核酸（例えば、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ０３／０５７１９０号及び同第ＷＯ０３／０５９３２２号を参照されたい）、脂質に封入された核酸（例えば、米国特許公開第２００３０１２９２２１号；及び米国特許第５，７５６，１２２号を参照されたい）、他のリポソーム組成物（例えば、米国特許公開第２００３００３５８２９号及び同第２００３００７２７９４号；ならびに米国特許第６，２００，５９９号を参照されたい）、リポソームとエマルジョンの安定化された混合物（例えば、ＥＰ１３０４１６０を参照されたい）、エマルジョン組成物（例えば、米国特許第６，７４７，０１４号を参照されたい）、及び核酸マイクロエマルジョン（例えば、米国特許公開第２００５００３７０８６号を参照されたい）が挙げられる。
本発明での使用に好適な、ポリマーを用いた担体系の例には、カチオン性ポリマー−核酸複合体（すなわち、ポリプレックス）が挙げられるが、これに限定されるものではない。ポリプレックスを形成するために、典型的には、細胞表面のアニオン性プロテオグリカンと相互作用してエンドサイトーシスによって細胞内に入ることが可能な正に荷電した粒子に核酸を濃縮する、直鎖、分岐、星形、または樹状の高分子構造を有するカチオン性ポリマーを用いて、核酸（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子のようなｓｉＲＮＡ分子）との複合体を形成させる。いくつかの実施形態では、ポリプレックスは、カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（例えば、米国特許第６，０１３，２４０号；Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からＩｎ ｖｉｖｏ ｊｅｔＰＥＩ（商標）として市販されている直鎖型ＰＥＩを参照されたい）、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、ポルビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＡＥ）ポリマー（例えば、Ｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：８１５５−８１５６（２００１）を参照されたい）、キトサン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー（例えば、Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：４８９７−４９０２（１９９６）を参照されたい）、ポルフィリン（例えば、米国特許第６，６２０，８０５号を参照されたい）、ポリビニルエーテル（例えば、米国特許公開第２００４０１５６９０９号を参照されたい）、多環式アミジニウム（例えば、米国特許公開第２００３０２２０２８９号を参照されたい）、第一級アミン、イミン、グアニジン、及び／またはイミダゾール基を含む他のポリマー（例えば、米国特許第６，０１３，２４０号；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ／９６０２６５５号；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９５／２１９３１号；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，１００：１６５−１８０（２００４）；及びＴｉｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６：５９−７１（２００６）を参照されたい）、ならびにその混合物と複合体を形成している核酸（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子のようなｓｉＲＮＡ分子）を含む。他の実施形態では、ポリプレックスは、米国特許公開第２００６０２１１６４３号、同第２００５０２２２０６４号、同第２００３０１２５２８１号、及び同第２００３０１８５８９０号、ならびにＰＣＴ公開番号第ＷＯ０３／０６６０６９号に記載のようなカチオン性ポリマー−核酸複合体；米国特許公開第２００４００７１６５４号に記載のような生分解性ポリ（β−アミノエステル）ポリマー−核酸複合体；米国特許公開第２００４０１４２４７５号に記載のような、高分子基質を含有する微小粒子；米国特許公開第２００３０１５７０３０号に記載のような他の微小粒子組成物；米国特許公開第２００５０１２３６００号に記載のような濃縮された核酸複合体；ならびにＡＵ２００２３５８５１４及びＰＣＴ公開番号第ＷＯ０２／０９６５５１号に記載のようなナノカプセル組成物及びマイクロカプセル組成物を含む。
特定の場合には、ｓｉＲＮＡは、シクロデキストリンまたはそのポリマーと複合体を形成してよい。シクロデキストリンを用いた担体系の非限定的な例には、米国特許公開第２００４００８７０２４号に記載のような、シクロデキストリン修飾ポリマー−核酸複合体；米国特許第６，５０９，３２３号、第６，８８４，７８９号、及び第７，０９１，１９２号に記載のような直鎖のシクロデキストリン共重合体−核酸複合体；及び米国特許第７，０１８，６０９号に記載のようなシクロデキストリンポリマー−錯化剤−核酸の複合体が挙げられる。他の特定の場合には、ｓｉＲＮＡは、ペプチドまたはポリペプチドと複合体を形成してよい。タンパク質を用いた担体系の一例として、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９５／２１９３１号に記載のカチオン性オリゴペプチド−核酸複合体が挙げられるが、これに限定されない。
脂質粒子の調製
本発明の核酸−脂質粒子は、核酸（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ）が粒子の脂質部分内に内包され、分解から保護されており、かかる粒子は、連続混合法、直接希釈法、及びインライン希釈法を含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の任意の方法により形成することができる。
特定の実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ〜ＩＩＩの脂質またはその塩を、単独で、または他のカチオン性脂質と組み合わせて含んでよい。他の実施形態では、非カチオン性脂質は、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、１４：０ＰＥ（１，２−ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ））、１６：０ＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ））、１８：０ＰＥ（１，２−ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ））、１８：１ＰＥ（１，２−ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ））、１８：１トランスＰＥ（１，２−ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ））、１８：０〜１８：１ＰＥ（１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ））、１６：０〜１８：１ＰＥ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ））、ポリエチレングリコール系ポリマー（例えば、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、またはＰＥＧ修飾ジアルキルオキシプロピル）、コレステロール、その誘導体、またはその組み合わせである。
ある実施形態では、本発明は、連続混合法、例えば、ｓｉＲＮＡを含む水溶液を第１のレザバーで得ることと、有機脂質溶液を第２のレザバーで得ることと（ここで、有機脂質溶液に存在する脂質は、有機溶媒、例えば、エタノール等の低級アルカノール中に可溶化されている）、有機脂質溶液と水溶液とが混合されて、ｓｉＲＮＡを中に封じ込める脂質小胞（例えば、リポソーム）が実質的に速やかに形成されるように、水溶液と有機脂質溶液とを混合することを含む方法によって作製される核酸−脂質粒子を提供する。この方法及びこの方法を実施するための装置は、米国特許公開第２００４０１４２０２５号に詳述されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
脂質及び緩衝液を混合チャンバー等の混合環境中に連続的に導入する処理により、脂質溶液が緩衝液で連続的に希釈され、これにより混合時に実質的に速やかに脂質小胞が形成される。本発明において、語句「脂質溶液を緩衝液で連続的に希釈する」（及びその変法）は、一般に、小胞生成を達成するのに十分な力のある水和工程で、脂質溶液を十分に急速に希釈することを意味する。核酸を含む水溶液と有機脂質溶液とを混合することにより、有機脂質溶液は、緩衝液（すなわち、水溶液）の存在下で段階的に連続希釈され、核酸−脂質粒子が形成される。
連続混合法を使用して形成された核酸−脂質粒子は、典型的には、大きさが約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１２０ｎｍ未満、約１１０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約９０ｎｍ未満、もしくは約８０ｎｍ未満、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍ（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）である。こうして形成された粒子は凝集せず、均一な粒径を達成するように任意選択でサイズが調整される。
別の実施形態では、本発明は、脂質小胞（例えば、リポソーム）溶液を形成すること、及び脂質小胞溶液を直接かつ速やかに、制御された量の希釈緩衝液が入った採取容器内に導入することを含む直接希釈法によって作製される核酸−脂質粒子を提供する。好ましい態様では、採取容器には、採取容器の内容物を撹拌して希釈を促進するように構成された１つ以上の要素が含まれる。一態様では、採取容器に存在する希釈緩衝液の量は、中に導入される脂質小胞溶液の容量と実質的に等しい。非限定的な例として、４５％エタノール脂質小胞溶液を、等容量の希釈緩衝液を含有する採取容器に導入すると、より小さな粒子が有利に得られる。
さらに別の実施形態では、本発明は、希釈緩衝液を含有する第３のレザバーが第２の混合領域と流体連結しているインライン希釈法によって作製される核酸−脂質粒子を提供する。この実施形態では、第１の混合領域で形成された脂質小胞（例えば、リポソーム）溶液は、第２の混合領域の希釈緩衝液と直接かつ速やかに混合される。好ましい態様では、第２の混合領域には、脂質小胞溶液及び希釈緩衝液の流れが１８０°の対向流として接触するよう配置されたＴ字コネクターが含まれるが、それより小さい角度、例えば、約２７°〜約１８０°（例えば、約９０°）をもたらすコネクターの使用が可能である。ポンプ機構により、制御可能な緩衝液流を第２の混合領域に送達する。一態様では、第２の混合領域に提供される希釈緩衝液の流量は、第１の混合領域からその中に導入される脂質小胞溶液の流量と実質的に等しくなるよう制御される。本実施形態により、有利なことに、第２の混合領域の脂質小胞溶液と混合する希釈緩衝液流のさらなる制御が可能になるため、第２の混合工程全体を通して緩衝液中の脂質小胞溶液の濃度も制御可能になる。このように希釈緩衝液流量を制御することにより、低濃度で小粒径の形成が有利に可能になる。
これらの直接希釈法及びインライン希釈法を実施するためのこれらの方法及び装置は、米国特許公開第２００７００４２０３１号に詳述されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
直接希釈法及びインライン希釈法を使用して形成された核酸−脂質粒子は、典型的に、大きさが約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１２０ｎｍ未満、約１１０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約９０ｎｍ未満、もしくは約８０ｎｍ未満、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、もしくは１５０ｎｍ（またはその任意の分数もしくはその中の任意の範囲）である。こうして形成された粒子は凝集せず、均一な粒径を達成するように任意選択でサイズが調整される。
必要に応じ、リポソームのサイズ調整に利用可能な任意の方法によって本発明の脂質粒子をサイズ調整することができる。サイズ調整は、所望の粒径範囲及び比較的狭い粒径分布を達成するために実施されてよい。
粒子を所望の大きさにサイズ調整するいくつかの技術が利用可能である。リポソームに使用され、本願粒子に同等に適用可能なサイズ調整法の一つは、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。浴またはプローブによる超音波処理によって粒子懸濁液を超音波処理すると、粒子の大きさは次第に小さくなり、粒径が約５０ｎｍ未満に縮小する。均質化は、せん断エネルギーによって大きい粒子をより小さく崩壊させる別の方法である。典型的な均質化手順では、選択粒径、典型的には約６０〜約８０ｎｍが認められるまで、粒子を標準的なエマルジョン・ホモジナイザーを介して再循環させる。いずれの方法においても、従来のレーザービームによる粒径弁別、またはＱＥＬＳにより粒度分布を監視することができる。
細孔ポリカーボネート膜または非対称のセラミック膜を介した粒子の押出し成形もまた、比較的明確に定義された粒度分布まで粒径を縮小する有効な方法である。典型的に、所望の粒度分布が達成されるまで、懸濁液は膜を介して１回以上循環させる。粒子を、順次、より小さい細孔膜を介して押出し、徐々に小さい粒径を達成してよい。
いくつかの実施形態では、粒子に存在する核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）を、例えば、あらゆる目的のために参照によりその開示全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第０９／７４４，１０３号に記載のように予備濃縮させる。
他の実施形態では、本方法は、本願組成物を使用して細胞のリポフェクションを行うのに有用な非脂質ポリカチオンの添加をさらに含んでよい。好適な非脂質ポリカチオンの例には、臭化ヘキサジメトリン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡから商標名ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（登録商標）として販売されている）またはヘキサジメトリンの他の塩が挙げられる。他の好適なポリカチオンには、例えば、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ポリアリルアミン、及びポリエチレンイミンの塩が挙げられる。これらの塩の添加は、粒子が形成された後が好ましい。
いくつかの実施形態では、形成された核酸−脂質粒子における核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）対脂質比（質量／質量比）は、約０．０１〜約０．２、約０．０５〜約０．２、約０．０２〜約０．１、約０．０３〜約０．１、または約０．０１〜約０．０８の範囲となる。出発原料（インプット）の比もこの範囲内となる。他の実施形態では、粒子の調製に、１０ｍｇの総脂質あたり約４００μｇの核酸、または核酸と脂質対質量比を約０．０１〜約０．０８で、より好ましくは、５０μｇの核酸あたり１．２５ｍｇの総脂質に対応する約０．０４で使用する。他の好ましい実施形態では、粒子は、核酸：脂質の質量比が約０．０８である。
他の実施形態では、形成された核酸−脂質粒子における脂質対核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）比（質量／質量比）は、約１（１：１）〜約１００（１００：１）、約５（５：１）〜約１００（１００：１）、約１（１：１）〜約５０（５０：１）、約２（２：１）〜約５０（５０：１）、約３（３：１）〜約５０（５０：１）、約４（４：１）〜約５０（５０：１）、約５（５：１）〜約５０（５０：１）、約１（１：１）〜約２５（２５：１）、約２（２：１）〜約２５（２５：１）、約３（３：１）〜約２５（２５：１）、約４（４：１）〜約２５（２５：１）、約５（５：１）〜約２５（２５：１）、約５（５：１）〜約２０（２０：１）、約５（５：１）〜約１５（１５：１）、約５（５：１）〜約１０（１０：１）、または約５（５：１）、６（６：１）、７（７：１）、８（８：１）、９（９：１）、１０（１０：１）、１１（１１：１）、１２（１２：１）、１３（１３：１）、１４（１４：１）、１５（１５：１）、１６（１６：１）、１７（１７：１）、１８（１８：１）、１９（１９：１）、２０（２０：１）、２１（２１：１）、２２（２２：１）、２３（２３：１）、２４（２４：１）、もしくは２５（２５：１）の範囲、またはその任意の分数もしくはその中の範囲となる。出発原料（インプット）の比もこの範囲内となる。
これまでに考察ように、複合脂質にはＣＰＬがさらに含まれてよい。脂質粒子−ＣＰＬ（ＣＰＬ含有脂質粒子）を作製する多種多様な一般法をここで考察する。２つの一般技術として、「後挿入」法、すなわち、ＣＰＬを、例えば、予め形成した脂質粒子内に挿入する方法、及びＣＰＬを、例えば脂質粒子形成ステップ中に脂質混合物に含有させる「標準」法が挙げられる。後挿入法では、主に脂質粒子二重層膜の外面にＣＰＬを有する脂質粒子が得られ、標準法では、ＣＰＬを内面と外面の両面に有する脂質粒子が得られる。かかる方法は、リン脂質で作製される小胞（これは、コレステロールを含有することができる）に特に有用であり、さらには、ＰＥＧ−脂質を含有する小胞（ＰＥＧ−ＤＡＡ及びＰＥＧ−ＤＡＧ等）にも有用である。脂質粒子−ＣＰＬを作製する方法は、例えば、米国特許第５，７０５，３８５号；同第６，５８６，４１０号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；及び同第６，８５２，３３４号；米国特許公開第２００２００７２１２１号；ならびにＰＣＴ公開番号第ＷＯ００／６２８１３号に教示されており、それらの開示内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
キット
本発明はまた、キット形態の脂質粒子も提供する。いくつかの実施形態では、キットは、脂質粒子のさまざまな要素（例えば、ｓｉＲＮＡ分子及び粒子の個々の脂質成分といった活性薬剤）を保持するために仕切られた容器を含む。好ましくは、キットは、本発明の脂質粒子を保持する容器（例えば、バイアルまたはアンプル）を含み、その場合、本明細書に記載の工程のうち１つの工程により粒子を作製する。ある実施形態では、キットは、エンドソーム膜不安定化因子（例えば、カルシウムイオン）をさらに含んでよい。キットは、典型的に、本発明の粒子組成物を薬理学的に許容される担体中の懸濁液として、または脱水形態で含み、かつそれらを再水和（凍結乾燥されている場合）し投与するための指示書も収容している。
本発明の処方物を調整して、関心対象の特定の細胞、組織、または臓器を選択的に標的とするようにすることができる。脂質粒子自体の組成物を制御することによって核酸−脂質粒子の選択的な標的化を行ってよい。特定の実施形態では、本発明のキットはこれらの脂質粒子を含み、その場合、粒子は、懸濁液として、または脱水形態で容器に入れられている。
特定の場合には、粒子の標的指向をさらに高めるために、脂質粒子の表面に結合している標的指向部分を有することが望ましい場合がある。標的指向部分（例えば、抗体、タンパク質等）を脂質（本願粒子に使用する脂質等）に結合させる方法は当業者に公知である。
脂質粒子の投与
本発明の脂質粒子は、一旦形成されると、細胞内へのｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）の導入に特に有用である。したがって、本発明は、細胞内にｓｉＲＮＡ分子を導入する方法も提供する。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子を感染細胞内に導入する。本方法は、最初に上述のように粒子を形成し、その後、その粒子と細胞とを、細胞へのｓｉＲＮＡ送達が起こるために十分な期間接触させることにより、インビトロまたはインビボいずれで行ってもよい。
本発明の脂質粒子（例えば、核酸脂質粒子）は、混合または接触対象のほとんどすべての細胞型に吸着させることができる。一旦吸着すると、粒子は、細胞の一部分による細胞内への移行、脂質と細胞膜との交換、または細胞との融合のいずれも可能になる。粒子のｓｉＲＮＡ部分の移行または取り込みは、これらの経路のいずれか１つを介しても起こり得る。特に、融合が起こった場合、粒子膜は細胞膜内に組み込まれ、粒子の内容物は細胞内液と混合する。
本発明の脂質粒子（例えば、核酸脂質粒子）は、単独で、または、投与経路及び標準的薬務に従って選択された薬理学的に許容される担体（例えば、生理的食塩液またはリン酸緩衝液）と混合して投与可能である。一般に、薬理学的に許容される担体として通常の緩衝生理食塩水（例えば、１３５〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ）が使用されることになる。他の好適な担体には、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩液、０．３％グリシン等が挙げられ、安定性を高めるための糖タンパク質、例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等が含まれる。さらなる好適な担体は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に記載されている。本明細書中で使用される、「担体」には、あらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌薬と抗真菌薬、等張剤と吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等が含まれる。語句「薬理学的に許容される」とは、分子実体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）及び組成物が、ヒトに投与した場合に、アレルギー反応または同様の有害反応を引き起こさないことを指す。
薬理学的に許容される担体は、一般に、脂質粒子形成後に添加する。したがって、脂質粒子の形成後、通常の緩衝生理食塩水等の薬理学的に許容される担体に粒子を希釈することができる。
医薬処方物中の粒子の濃度は、大きく異なり得る、すなわち、約０．０５重量％未満、通常は約２〜５重量％または少なくとも２〜５重量％から約１０〜９０重量％まで異なり、選択した特定の投与方法に従って、主に流体容量、粘度等により選択されることになる。例えば、治療に関連する流体量を減少させるために濃度を増加させてもよい。これは、アテローム性動脈硬化症関連うっ血性心不全または重度の高血圧症に罹患する患者において特に望ましい場合がある。代替として、刺激性脂質で構成される粒子は、投与部位の炎症を抑えるため低濃度まで希釈してよい。
本発明の医薬組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌してよい。水溶液は、使用のためにパッケージにするか、または無菌条件下でろ過して凍結乾燥し、投与前にその凍結乾燥した調製物と滅菌水溶液とを混合することができる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる薬理学的に許容される助剤、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化カルシウムを含有し得る。さらに、粒子懸濁液は、保管時に脂質をフリーラジカル及び脂質過酸化による損傷から保護する脂質保護剤を含んでよい。アルファトコフェロールのような親油性フリーラジカルクエンチャー、及びフェリオキサミンのような水溶性鉄特異的キレート化剤が好適である。
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子は、１つ以上のｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）の治療用送達方法において特に有用である。特に、１つ以上のＨＢＶ遺伝子の転写及び／または翻訳を下方制御もしくはサイレンシングすることにより、ヒトにおいてＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染を治療するためのインビボでの方法を提供することが本発明の目的である。
Ａ．インビボ投与
インビボ治療のための全身送達、例えば、循環等の身体系を介した遠位標的細胞への本明細書に記載するｓｉＲＮＡ分子（表Ａに記載のｓｉＲＮＡ等）の送達が、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ０５／００７１９６号、第ＷＯ０５／１２１３４８号、第ＷＯ０５／１２０１５２号、及び第ＷＯ０４／００２４５３号に記載のような核酸−脂質粒子を使用して達成されており、それらの開示内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明はまた、ｓｉＲＮＡを血清中でのヌクレアーゼによる分解から保護し、非免疫原性で、粒径が小さく、反復投与に好適な、完全に封入された脂質粒子も提供する。さらに、１つ以上のｓｉＲＮＡ分子は、本発明の脂質粒子に入れて単独投与しても、または従来の薬物のような、ペプチド、ポリペプチド、または低分子を含む脂質粒子と併用投与（例えば、同時投与）しても、いずれでもよい。
インビボ投与の場合、投与は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、注射、経口投与、吸入（例えば、鼻腔内（ｉｎｔｒａｎｓａｌ）または気管内）、経皮投与、または直腸投与によるものであってよい。投与は、単一用量または分割用量により達成できる。医薬組成物は、非経口的に、すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内に投与され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物を、静脈内または腹腔内にボーラス注射により投与する（例えば、米国特許第５，２８６，６３４号を参照されたい）。また、核酸の細胞内送達は、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１：５１２（１９８３）；Ｍａｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８）；Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．，６：２３９（１９８９）；及びＢｅｈｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２６：２７４（１９９３）ですでに考察されている。脂質を用いた治療薬を投与するさらに他の方法は、例えば、米国特許第３，９９３，７５４号；同第４，１４５，４１０号；同第４，２３５，８７１号；同第４，２２４，１７９号；同第４，５２２，８０３号；及び同第４，５８８，５７８号に記載されている。脂質粒子は、疾患部位における直接注射または疾患部位から遠位にある部位における注射により投与され得る（例えば、Ｃｕｌｖｅｒ，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ，ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０−７１（１９９４）を参照されたい）。上記の参考文献の開示内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の脂質粒子を静脈内に投与する実施形態では、粒子の総注射量の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、または２５％が、注射の約８時間、１２時間、２４時間、３６時間、または４８時間後血漿中に存在する。他の実施形態では、脂質粒子の総注射量の約２０％、３０％、４０％超、さらには約６０％、７０％または８０％が、注射の約８時間、１２時間、２４時間、３６時間、または４８時間後に血漿中に存在する。特定の場合には、複数の粒子の約１０％超が、投与の約１時間後に哺乳類の血漿中に存在する。他の特定の場合には、脂質粒子の存在は、粒子の投与の少なくとも約１時間後に検出可能である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の存在は、投与の約８時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間または９６時間後に細胞内で検出可能である。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子による、ウイルスまたは宿主の配列のような標的配列の発現の下方制御は、投与の約８時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２または９６時間後に検出可能である。さらに別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子による、ウイルスまたは宿主の配列のような標的配列の発現の下方制御は、感染細胞及び／または感染し得る細胞で選択的に生じる。さらなる実施形態では、投与部位から近位または遠位にある部位の細胞におけるｓｉＲＮＡ分子の存在または作用は、投与から約１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、もしくは９６時間後、または約６日後、８日後、１０日後、１２日後、１４日後、１６日後、１８日後、１９日後、２０日後、２２日後、２４日後、２６日後、もしくは２８日後に検出可能である。さらなる実施形態では、本発明の脂質粒子を、非経口投与または腹腔内投与する。
本発明の組成物は、単独で、または他の好適な成分と組み合わせて、エアロゾル処方物に作製し（すなわち、「噴霧」可能）、吸入により（例えば、鼻腔内または気管内）投与することができる（Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８（１９８９）を参照されたい）。エアロゾル処方物は、許容される圧縮噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の中に入れることができる。
ある実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、及び／または他のエアロゾル送達ビヒクルにより送達してよい。点鼻エアロゾルスプレーにより核酸組成物を直接肺に送達する方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号及び同第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内微小粒子樹脂及びリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号）を使用する薬物送達もまた製薬分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエテイレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）支持マトリックス形態での経粘膜薬物送達が、米国特許第５，７８０，０４５号に記載されている。上記特許の開示内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
例えば、関節内（関節の中）経路、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、及び皮下経路による非経口投与に好適な処方物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び処方物を投与対象者の血液と等張にする溶質を含有できる、水溶性及び非水溶性の等張性無菌注射液、ならびに、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び防腐剤を含むことができる、水溶性及び非水溶性の無菌懸濁剤が挙げられる。本発明の実施に際し、好ましくは、組成物を、例えば、静脈内注入、経口投与、局所投与、腹腔内投与、膀胱内投与、または髄腔内投与する。
一般に、静脈内に投与する場合、脂質粒子処方物は、好適な医薬担体を用いて処方する。多くの薬理学的に許容される担体を本発明の組成物及び方法において使用してよい。本発明での使用に好適な処方物は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に見出される。例えば、水、緩衝水、０．４％食塩液、０．３％グリシン等の多種多様な水性担体を使用して良く、また、それらには、安定性を高めるための糖タンパク質、例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等が含まれてよい。一般に、薬理学的に許容される担体として通常の緩衝生理食塩水（１３５〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ）が使用されるが、他の好適な担体でも十分である。これらの組成物は、ろ過等の従来のリポソーム滅菌技術により滅菌可能である。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる薬理学的に許容される助剤、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化カルシウム、ソルビタンモノラウラート、オレイン酸トリエタノールアミンを含有してよい。これらの組成物は、上述の技術を使用して滅菌可能であり、または代替として、無菌条件下でそれらを製造することができる。得られた水溶液は、使用のためにパッケージ化しても、または無菌条件下でろ過して凍結乾燥し、投与前にその凍結乾燥した調製物と滅菌水溶液とを混合してもよい。
特定の用途では、本明細書に開示する脂質粒子を、経口投与により個体に送達してよい。粒子を添加物と一体化させ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル、丸剤、薬用ドロップ、エリキシル剤、洗口剤、懸濁液、経口スプレー、シロップ、ウエハース等の形態で使用してよい（例えば、あらゆる目的のために参照によりその開示内容全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６４１，５１５号、同第５，５８０，５７９号、及び同第５，７９２，４５１号を参照されたい）。これらの経口剤は、結合剤、ゼラチン、添加物、滑沢剤、及び／または香味剤も含有してよい。単位剤形がカプセルの場合は、カプセルは上記材料に加えて液状担体を含有してよい。他のさまざまな材料が、コーティング剤として、またはさもなければ投与単位の物理的形態を改変するために存在してよい。もちろん、任意の単位剤形の調製に使用される任意の材料も、薬理学的に純粋であり、かつ使用される量では実質的に非毒性でなければならない。
典型的に、これらの経口処方物は、少なくとも約０．１％またはそれ以上の脂質粒子を含有してよいが、粒子のパーセンテージは、もちろん変化する場合があり、好都合には、処方物の総重量もしくは容量の、約１％もしくは２％〜約６０％もしくは７０％以上であってよい。当然ながら、所与のいかなる単位用量の化合物でも好適な用量が得られるように、治療的に有用な組成物それぞれの粒子量を調製してよい。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製剤有効期間といった諸因子、及び他の薬理学的に考慮事項は、このような医薬処方物を調製する分野の当業者により考慮されることになり、したがって、さまざまな用量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
経口投与に好適な処方物は、（ａ）液剤、例えば、水、食塩液、またはＰＥＧ４００等の希釈剤に懸濁させた有効量のパッケージｓｉＲＮＡ分子（例えば、表Ａに記載のｓｉＲＮＡ分子）；（ｂ）所定量のｓｉＲＮＡ分子を液体、固形、顆粒、またはゼラチンとしてそれぞれ含有する、カプセル、小袋、または錠剤；（ｃ）懸濁剤を含む適切な液体；及び（ｄ）好適なエマルジョンからなり得る。錠剤形態には、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の添加物、着色剤、賦形剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤、染料、崩壊剤、及び薬理学的に適合性のある担体のうち１つ以上が含まれ得る。薬用ドロップ形態は、香味、例えば、スクロース中にｓｉＲＮＡ分子を含むことができ、同様に、香錠は、ｓｉＲＮＡ分子に加えて、当技術分野で公知の担体を含有しているゼラチン及びグリセリンまたはスクロース及びアカシアのエマルジョン、ゲル等のような不活性基剤中に治療用核酸を含む。
それらの別の使用例では、脂質粒子を、広範な局所剤形に組み込むことができる。例えば、核酸−脂質粒子を含有する懸濁液を、ゲル、油剤、エマルジョン、局所クリーム、ペースト、軟膏、ローション、フォーム、ムース等として処方して投与することができる。
本発明の脂質粒子の医薬調製剤を調製する場合、空の粒子またはｓｉＲＮＡ等の治療剤が外部表面と会合した粒子を低減または排除するよう精製された多量の粒子を使用することが好ましい。
本発明の方法は、多種多様な宿主で実施してよい。好ましい宿主には、哺乳類種、例えば、霊長類（例えば、ヒト及びチンパンジー、ならびに他のヒト以外の霊長類）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、げっ歯類（例えば、ラット及びマウス）、ウサギ、及びブタが挙げられる。
投与される粒子量は、ｓｉＲＮＡ分子対脂質比、使用する具体的なｓｉＲＮＡ、治療するＨＢＶの菌株、患者の年齢、体重、及び状態、ならびに臨床医の判断によって決定されることになるが、一般に、体重１キログラムあたり約０．０１〜約５０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり約０．１〜約５ｍｇ、または１投与あたり約１０８〜１０１０粒子（例えば、注射）となる。
Ｂ．インビトロ投与
インビトロ用途の場合、ｓｉＲＮＡ分子は、培養で増殖したあらゆる細胞に対して送達することが可能である。好ましい実施形態では、細胞は動物細胞であり、より好ましくは哺乳類の細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
細胞と脂質粒子との接触は、インビトロの場合は、生物学的に適合性のある培地で行われる。粒子の濃度は、具体的な用途に応じて大きく異なるが、一般に、約１μｍｏｌ〜約１０ｍｍｏｌである。脂質粒子を用いた細胞の処理は、一般に、生理的な温度（約３７℃）で約１〜４８時間、好ましくは約２〜４時間にわたって行われる。
好ましい実施形態の一群では、脂質粒子懸濁液を、細胞密度が約１０３〜約１０５細胞／ｍｌ、より好ましくは約２×１０４細胞／ｍｌの６０〜８０％コンフルエントな状態に播種した細胞に添加する。細胞に添加する懸濁液の濃度は、好ましくは約０．０１〜０．２μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１μｇ／ｍｌである。
細胞の組織培養が必要とされ得る程度は、当技術分野で周知である。例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、３ｒｄ Ｅｄ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、Ｋｕｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄｏｗｄｅｎ，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓ，Ｉｎｃ．（１９７７）、及びその中で引用されている参考文献は、細胞培養の一般指針を提供している。培養された細胞系は、単層形態の細胞となることが多いが、細胞懸濁液も使用される。
エンドソーム放出パラメータ（ＥＲＰ）アッセイを用いて、本発明の核酸−脂質粒子の送達効率を最適化することができる。ＥＲＰアッセイは、米国特許公開第２００３００７７８２９号に詳述されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。より詳細には、ＥＲＰアッセイの目的は、脂質粒子のさまざまなカチオン性脂質及びヘルパー脂質成分が、エンドソーム膜の結合／取り込み、またはエンドソーム膜との融合／エンドソーム膜の不安定化に対して及ぼす相対的効果に基づいて、かかるカチオン性脂質及びヘルパー脂質成分の効果を識別することである。このアッセイにより、脂質粒子の各成分が送達効率にどのように影響を与えるかを定量的に測定することができるため、脂質粒子を最適化することができる。通常、ＥＲＰアッセイでは、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等）の発現を測定するが、場合によっては、発現プラスミドについて最適化された脂質粒子処方物も、ｓｉＲＮＡの封入に適切なものとなる。他の場合には、ＥＲＰアッセイは、ｓｉＲＮＡの存在下または非存在下における標的配列の転写または翻訳の下方制御を測定するよう適応させることができる。各種の脂質粒子それぞれについてのＥＲＰを比較することにより、最適化されている系、例えば、細胞内の取り込みが最大の脂質粒子を容易に決定することができる。
Ｃ．脂質粒子の検出
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子は、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間またはそれ以上の時間、対象において検出可能である。他の実施形態では、本発明の脂質粒子は、粒子の投与約８時間、１２時間、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間、もしくは９６時間、または約６日、８日、１０日、１２日、１４日、１６日、１８日、１９日、２２日、２４日、２５日、もしくは２８日後に対象において検出可能である。粒子の存在は、対象から得た細胞、組織、または他の生体試料において検出され得る。粒子は、例えば、粒子の直接検出、ｓｉＲＮＡ配列の検出、対象標的配列の検出（すなわち、対象配列の発現または発現抑制の検出）、ＥＢＯＶタンパク質（例えば、インターフェロン）で修飾されている化合物の検出、対象におけるウイルス量の検出、またはその組み合わせによって検出されてよい。
１．粒子の検出
本発明の脂質粒子は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて検出され得る。例えば、標識を、当技術分野で周知の方法を使用して直接的にまたは間接的に脂質粒子の成分に結合させることができる。多種多様な標識を使用することができ、必要とされる感度、脂質粒子成分との複合体形成の容易さ、安定性要件、ならびに利用可能な計測器及び廃棄規定に応じて標識を選択する。好適な標識には、スペクトル標識、例えば、蛍光色素（例えば、フルオレセイン及び誘導体、例えばフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）及びＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）；ローダミン及び誘導体、例えば、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、テトラロージミンイソチオシナート（ｔｅｔｒａｒｈｏｄｉｍｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）（ＴＲＩＴＣ）等、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリスリン、ＡＭＣＡ、ＣｙＤｙｅｓ（商標）等；放射標識、例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ等；酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等；スペクトル比色分析標識、例えば、コロイド金もしくは着色ガラスまたはプラスチックビーズ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等が挙げられるが、これに限定されるものではない。標識は、当技術分野で公知の任意の手段を用いても検出され得る。
２．核酸の検出
核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、本明細書では、当業者に周知の多数の手段のうちのいずれかの手段により検出されて定量化される。核酸の検出は、周知の方法、例えばサザン解析、ノーザン解析、ゲル電気泳動、ＰＣＲ、放射標識、シンチレーション計測、及びアフィニティクロマトグラフィにより開始されてもよい。さらなる生化学的分析法、例えば、分光測光法、Ｘ線撮影、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、及び高拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィーを用いてもよい。
核酸ハイブリダイゼーションフォーマットの選択は重要ではない。さまざまな核酸ハイブリダイゼーションフォーマットが当業者に公知である。例えば、一般的なフォーマットには、サンドイッチアッセイ、及び競合または置換アッセイが挙げられる。ハイブリダイゼーション技術は、例えば、“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，” Ｅｄｓ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）に概説されている。
ハイブリダイゼーションアッセイの感度を、検出する標的核酸を増やす核酸増幅システムを使用することにより高めてよい。分子プローブとして使用する配列を増幅させる、またはその後のサブクローニング用の核酸断片を作製するために好適なインビトロでの増幅技術が公知である。そのようなインビトロでの増幅方法によって当業者を導くのに十分な技術の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅、及び他のＲＮＡポリメラーゼを介在させる技術（例えば、ＮＡＳＢＡ（商標））が挙げられるが、これらはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；ならびに、米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ａｒｎｈｅｉｍ ＆ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔｏｂｅｒ １，１９９０），Ｃ＆ＥＮ ３６；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３：８１（１９９１）；Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３（１９８９）；Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４（１９９０）；Ｌｏｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８２６（１９８９）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７（１９８８）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２９１（１９９０）；Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｅ，４：５６０（１９８９）；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９：１１７（１９９０）；及びＳｏｏｋｎａｎａｎ ａｎｄ Ｍａｌｅｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５６３（１９９５）に見出される。インビトロで増幅された核酸をクローニングする改善された方法は、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。当技術分野で説明される他の方法は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ（商標）、Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）及びＱβ−レプリカーゼ系である。ＰＣＲまたはＬＣＲのプライマーは、選択配列が存在する場合にのみ伸長または連結するよう設計されている場合、これらの系を使用して変異体を直接同定することができる。代替として、選択配列を、一般に、例えば非特異的ＰＣＲプライマーを使用して増幅させ、その増幅させた標的領域を、変異を示す特異配列について後でプローブすることができる。上記の参考文献の開示内容は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
例えば、インビトロ増幅法でプローブとして使用する核酸、遺伝子プローブとして使用する核酸、または阻害成分として使用する核酸は、典型的に、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．，２２：１８５９ １８６２（１９８１）により記載されている固相アミド亜リン酸トリエステル法（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｔｒｉｅｓｔｅｒ ｍｅｔｈｏｄ）にしたがって、例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：６１５９（１９８４）に記載のような自動合成装置を使用して化学的に合成される。必要に応じて、ポリヌクレオチドの精製を、典型的には、未変性アクリルアミドゲル電気泳動またはＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，２５５：１３７ １４９（１９８３）に記載のような陰イオン交換ＨＰＬＣのいずれかにより実施する。合成ポリヌクレオチドの配列は、Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８０）ｉｎ Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｌｄａｖｅ（ｅｄｓ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９の化学的分解法を使用して確認することができる。
転写レベルを測定する代替手段はインサイチュハイブリダイゼーションである。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイは周知であり、Ａｎｇｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：６４９（１９８７）に概説されている。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイでは、固体支持体、典型的にはスライドガラスに細胞を固定する。ＤＮＡをプローブする場合は、細胞を熱またはアルカリで変性させる。その後、細胞を中温でハイブリダイゼーション溶液と接触させ、標識された特定のプローブをアニーリングする。好ましくは、プローブを、放射性同位体または蛍光レポーターで標識する。
本発明を、具体的な実施例により詳細に説明する。以下の実施例は、例示のために記載されるものであり、いかなる形においても本発明を限定するものではない。当業者は、変更または修正しても本質的に同一の結果が得られる、重要ではない多種多様なパラメータを容易に理解するであろう。
実施例１．
本実施例では、表Ａに記載されている１５のｓｉＲＮＡ配列のＨＢＶ遺伝子サイレンシング活性を試験するために使用するバイオアッセイについて説明する。
ＨＢＶゲノム配列（受託番号ＥＵ９３９６００．１）を候補ｓｉＲＮＡすべてに完全に一致するよう編集した。具体的には、候補ｓｉＲＮＡの標的部位を含有する、配列領域それぞれの５'及び３'両末端の３０ｂｐの隣接配列を含めた、４配列領域、すなわち、２１２〜８０３、１０６２〜１９２２、２２３７〜２４６０、及び２７８３〜２８６２をインシリコで結合させた。すべての候補ｓｉＲＮＡが、この合成のコンセンサスＨＢＶ標的断片に完全に相補的となるよう、６つの変異を挿入した（ＥＵ９３９６００．１に対し、４５４位 Ｃ＞Ｔ；５９８位 Ｔ＞Ｃ；１２０６位 Ａ＞Ｃ；１２８７位 Ａ＞Ｃ；及び１４６１位 Ｇ＞Ｃ）。合成のコンセンサスＨＢＶ標的断片は、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅベクターに容易にクローニングするため、制限酵素部位ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩをそれぞれ５'及び３'末端に付加して合成した。ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩクローニング部位は、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２ Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅベクターのウミシイタケルシフェラーゼの終止コドンとポリアデニル化シグナルとの間のものである。
Ｄｕａｌ−Ｇｌｏアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）で、ホタルルシフェラーゼ（Ｆ−Ｌｕｃ）活性と比べた、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒ−Ｌｕｃ）活性の低下を測定することにより、候補ｓｉＲＮＡのＨＢＶ遺伝子サイレンシング活性を試験した。簡潔に述べると、Ｃｏｓ−７細胞を、１ウェルあたり２５，０００細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して１ウェルあたり１００ｎｇのレポータープラスミドでトランスフェクトした。３７℃／５％ＣＯ２で４時間のインキュベーションの後、培地を除去し、Ｃｏｓ−７細胞をＨＢＶ ｓｉＲＮＡでさまざまな濃度にて４通りトランスフェクトし、その後、上記の条件でさらに２０時間インキュベーションを行った。発光を検出して両ルシフェラーゼの発現を測定した。ＨＢＶ−ｓｉＲＮＡ処理試料のＲ−Ｌｕｃ／Ｆ−Ｌｕｃの発現を、陰性（標的指向ではない）のｓｉＲＮＡ処理細胞におけるＲ−Ｌｕｃ／Ｆ−Ｌｕｃ発現の平均を基準として正規化した。陽性対照として、Ｒ−Ｌｕｃに対するｓｉＲＮＡを含めた。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）をＸＬｆｉｔ機能（ＩＤＢＳ ＭａｔｈＩＱ）により計算した。
実施例２．
本実施例では、名称１ｍ〜１５ｍ（表Ａを参照されたい）のｓｉＲＮＡ群から選択される２つの異なるｓｉＲＮＡの想定されるすべての「双方向」組み合わせについて説明する。本出願の実施例２及び３で使用する「組み合わせ」という用語は、組み合わされたｓｉＲＮＡ分子が、物質の同一組成物中に共に存在することを意味する（例えば、同一溶液中に共に溶解している；または同一脂質粒子内に共に存在する；または同一の脂質粒子医薬処方物内に共に存在するが、医薬処方物中の各脂質粒子は、そのｓｉＲＮＡ組み合わせの異なる各々のｓｉＲＮＡを含んでも、含まなくてもよい）。組み合わせたｓｉＲＮＡ分子は、通常、互いに共有結合では連結されていない。
個々のｓｉＲＮＡはそれぞれ、表Ａに示すように、名称１ｍ〜１５ｍで識別される。組み合わせ内の各ｓｉＲＮＡ番号はダッシュ（−）で区切られ、例えば、表記「１ｍ−２ｍ」は、ｓｉＲＮＡ番号１ｍとｓｉＲＮＡ番号２ｍとの組み合わせを表す。ダッシュは、組み合わせ内の異なるｓｉＲＮＡ分子が互いに共有結合で結合していることを意味するものではない。ｓｉＲＮＡの各種組み合わせはセミコロンで区切られる。組み合わせ内のｓｉＲＮＡ番号の順序は重要ではない。例えば、組み合わせ１ｍ−２ｍは、組み合わせ２ｍ−１ｍと等しいが、これは、いずれの表記もｓｉＲＮＡ番号１ｍとｓｉＲＮＡ番号２ｍとの同じ組み合わせを表すためである。
本実施例に記載のｓｉＲＮＡの組み合わせは、例えば、ヒトにおいてＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染を治療するため、かつＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染に関連する少なくとも１つの症状を改善するために本発明を実施する際に有用である。
ｓｉＲＮＡ１ｍ〜ｓｉＲＮＡ１５ｍのｓｉＲＮＡの双方向組み合わせは、１ｍ−２ｍ；１ｍ−３ｍ；１ｍ−４ｍ；１ｍ−５ｍ；１ｍ−６ｍ；１ｍ−７ｍ；１ｍ−８ｍ；１ｍ−９ｍ；１ｍ−１０ｍ；１ｍ−１１ｍ；１ｍ−１２ｍ；１ｍ−１３ｍ；１ｍ−１４ｍ；１ｍ−１５ｍ；２ｍ−３ｍ；２ｍ−４ｍ；２ｍ−５ｍ；２ｍ−６ｍ；２ｍ−７ｍ；２ｍ−８ｍ；２ｍ−９ｍ；２ｍ−１０ｍ；２ｍ−１１ｍ；２ｍ−１２ｍ；２ｍ−１３ｍ；２ｍ−１４ｍ；２ｍ−１５ｍ；３ｍ−４ｍ；３ｍ−５ｍ；３ｍ−６ｍ；３ｍ−７ｍ；３ｍ−８ｍ；３ｍ−９ｍ；３ｍ−１０ｍ；３ｍ−１１ｍ；３ｍ−１２ｍ；３ｍ−１３ｍ；３ｍ−１４ｍ；３ｍ−１５ｍ；４ｍ−５ｍ；４ｍ−６ｍ；４ｍ−７ｍ；４ｍ−８ｍ；４ｍ−９ｍ；４ｍ−１０ｍ；４ｍ−１１ｍ；４ｍ−１２ｍ；４ｍ−１３ｍ；４ｍ−１４ｍ；４ｍ−１５ｍ；５ｍ−６ｍ；５ｍ−７ｍ；５ｍ−８ｍ；５ｍ−９ｍ；５ｍ−１０ｍ；５ｍ−１１ｍ；５ｍ−１２ｍ；５ｍ−１３ｍ；５ｍ−１４ｍ；５ｍ−１５ｍ；６ｍ−７ｍ；６ｍ−８ｍ；６ｍ−９ｍ；６ｍ−１０ｍ；６ｍ−１１ｍ；６ｍ−１２ｍ；６ｍ−１３ｍ；６ｍ−１４ｍ；６ｍ−１５ｍ；７ｍ−８ｍ；７ｍ−９ｍ；７ｍ−１０ｍ；７ｍ−１１ｍ；７ｍ−１２ｍ；７ｍ−１３ｍ；７ｍ−１４ｍ；７ｍ−１５ｍ；８ｍ−９ｍ；８ｍ−１０ｍ；８ｍ−１１ｍ；８ｍ−１２ｍ；８ｍ−１３ｍ；８ｍ−１４ｍ；８ｍ−１５ｍ；９ｍ−１０ｍ；９ｍ−１１ｍ；９ｍ−１２ｍ；９ｍ−１３ｍ；９ｍ−１４ｍ；９ｍ−１５ｍ；１０ｍ−１１ｍ；１０ｍ−１２ｍ；１０ｍ−１３ｍ；１０ｍ−１４ｍ；１０ｍ−１５ｍ；１１ｍ−１２ｍ；１１ｍ−１３ｍ；１１ｍ−１４ｍ；１１ｍ−１５ｍ；１２ｍ−１３ｍ；１２ｍ−１４ｍ；１２ｍ−１５ｍ；１３ｍ−１４ｍ；１３ｍ−１５ｍ；及び１４ｍ−１５ｍである。
実施例３．
本実施例では、名称１ｍ〜１５ｍ（表Ａを参照されたい）のｓｉＲＮＡ分子群から選択される異なる３つのｓｉＲＮＡの想定されるすべての「３方向」組み合わせについて説明する。個々のｓｉＲＮＡはそれぞれ、表Ａに示すように、名称１ｍ〜１５ｍで識別される。各ｓｉＲＮＡ番号はダッシュ（−）で区切られ、例えば、表記「１ｍ−２ｍ−３ｍ」は、ｓｉＲＮＡ番号１ｍ、ｓｉＲＮＡ番号２ｍ、及びｓｉＲＮＡ番号３ｍの組み合わせを表す。ダッシュは、組み合わせ内の異なるｓｉＲＮＡ分子が互いに共有結合で結合していることを意味するものではない。ｓｉＲＮＡの各種組み合わせはセミコロンで区切られる。組み合わせ内のｓｉＲＮＡ番号の順序は重要ではない。例えば、組み合わせ１ｍ−２ｍ−３ｍは、組み合わせ３ｍ−２ｍ−１ｍに等しいが、これは、これらの表記のいずれもｓｉＲＮＡ番号１ｍとｓｉＲＮＡ番号２ｍとｓｉＲＮＡ番号３ｍとの同じ組み合わせを表すためである。
本実施例に記載のｓｉＲＮＡの組み合わせは、例えば、ヒトにおいてＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染を治療するため、かつＨＢＶ感染及び／またはＨＤＶ感染に関連する少なくとも１つの症状を改善するために本発明を実施する際に有用である。
ｓｉＲＮＡ１ｍ〜ｓｉＲＮＡ１５ｍのｓｉＲＮＡの３方向組み合わせは、１ｍ−２ｍ−３ｍ；１ｍ−２ｍ−４ｍ；１ｍ−２ｍ−５ｍ；１ｍ−２ｍ−６ｍ；１ｍ−２ｍ−７ｍ；１ｍ−２ｍ−８ｍ；１ｍ−２ｍ−９ｍ；１ｍ−２ｍ−１０ｍ；１ｍ−２ｍ−１１ｍ；１ｍ−２ｍ−１２ｍ；１ｍ−２ｍ−１３ｍ；１ｍ−２ｍ−１４ｍ；１ｍ−２ｍ−１５ｍ；１ｍ−３ｍ−４ｍ；１ｍ−３ｍ−５ｍ；１ｍ−３ｍ−６ｍ；１ｍ−３ｍ−７ｍ；１ｍ−３ｍ−８ｍ；１ｍ−３ｍ−９ｍ；１ｍ−３ｍ−１０ｍ；１ｍ−３ｍ−１１ｍ；１ｍ−３ｍ−１２ｍ；１ｍ−３ｍ−１３ｍ；１ｍ−３ｍ−１４ｍ；１ｍ−３ｍ−１５ｍ；１ｍ−４ｍ−５ｍ；１ｍ−４ｍ−６ｍ；１ｍ−４ｍ−７ｍ；１ｍ−４ｍ−８ｍ；１ｍ−４ｍ−９ｍ；１ｍ−４ｍ−１０ｍ；１ｍ−４ｍ−１１ｍ；１ｍ−４ｍ−１２ｍ；１ｍ−４ｍ−１３ｍ；１ｍ−４ｍ−１４ｍ；１ｍ−４ｍ−１５ｍ；１ｍ−５ｍ−６ｍ；１ｍ−５ｍ−７ｍ；１ｍ−５ｍ−８ｍ；１ｍ−５ｍ−９ｍ；１ｍ−５ｍ−１０ｍ；１ｍ−５ｍ−１１ｍ；１ｍ−５ｍ−１２ｍ；１ｍ−５ｍ−１３ｍ；１ｍ−５ｍ−１４ｍ；１ｍ−５ｍ−１５ｍ；１ｍ−６ｍ−７ｍ；１ｍ−６ｍ−８ｍ；１ｍ−６ｍ−９ｍ；１ｍ−６ｍ−１０ｍ；１ｍ−６ｍ−１１ｍ；１ｍ−６ｍ−１２ｍ；１ｍ−６ｍ−１３ｍ；１ｍ−６ｍ−１４ｍ；１ｍ−６ｍ−１５ｍ；１ｍ−７ｍ−８ｍ；１ｍ−７ｍ−９ｍ；１ｍ−７ｍ−１０ｍ；１ｍ−７ｍ−１１ｍ；１ｍ−７ｍ−１２ｍ；１ｍ−７ｍ−１３ｍ；１ｍ−７ｍ−１４ｍ；１ｍ−７ｍ−１５ｍ；１ｍ−８ｍ−９ｍ；１ｍ−８ｍ−１０ｍ；１ｍ−８ｍ−１１ｍ；１ｍ−８ｍ−１２ｍ；１ｍ−８ｍ−１３ｍ；１ｍ−８ｍ−１４ｍ；１ｍ−８ｍ−１５ｍ；１ｍ−９ｍ−１０ｍ；１ｍ−９ｍ−１１ｍ；１ｍ−９ｍ−１２ｍ；１ｍ−９ｍ−１３ｍ；１ｍ−９ｍ−１４ｍ；１ｍ−９ｍ−１５ｍ；１ｍ−１０ｍ−１１ｍ；１ｍ−１０ｍ−１２ｍ；１ｍ−１０ｍ−１３ｍ；１ｍ−１０ｍ−１４ｍ；１ｍ−１０ｍ−１５ｍ；１ｍ−１１ｍ−１２ｍ；１ｍ−１１ｍ−１３ｍ；１ｍ−１１ｍ−１４ｍ；１ｍ−１１ｍ−１５ｍ；１ｍ−１２ｍ−１３ｍ；１ｍ−１２ｍ−１４ｍ；１ｍ−１２ｍ−１５ｍ；１ｍ−１３ｍ−１４ｍ；１ｍ−１３ｍ−１５ｍ；１ｍ−１４ｍ−１５ｍ；２ｍ−３ｍ−４ｍ；２ｍ−３ｍ−５ｍ；２ｍ−３ｍ−６ｍ；２ｍ−３ｍ−７ｍ；２ｍ−３ｍ−８ｍ；２ｍ−３ｍ−９ｍ；２ｍ−３ｍ−１０ｍ；２ｍ−３ｍ−１１ｍ；２ｍ−３ｍ−１２ｍ；２ｍ−３ｍ−１３ｍ；２ｍ−３ｍ−１４ｍ；２ｍ−３ｍ−１５ｍ；２ｍ−４ｍ−５ｍ；２ｍ−４ｍ−６ｍ；２ｍ−４ｍ−７ｍ；２ｍ−４ｍ−８ｍ；２ｍ−４ｍ−９ｍ；２ｍ−４ｍ−１０ｍ；２ｍ−４ｍ−１１ｍ；２ｍ−４ｍ−１２ｍ；２ｍ−４ｍ−１３ｍ；２ｍ−４ｍ−１４ｍ；２ｍ−４ｍ−１５ｍ；２ｍ−５ｍ−６ｍ；２ｍ−５ｍ−７ｍ；２ｍ−５ｍ−８ｍ；２ｍ−５ｍ−９ｍ；２ｍ−５ｍ−１０ｍ；２ｍ−５ｍ−１１ｍ；２ｍ−５ｍ−１２ｍ；２ｍ−５ｍ−１３ｍ；２ｍ−５ｍ−１４ｍ；２ｍ−５ｍ−１５ｍ；２ｍ−６ｍ−７ｍ；２ｍ−６ｍ−８ｍ；２ｍ−６ｍ−９ｍ；２ｍ−６ｍ−１０ｍ；２ｍ−６ｍ−１１ｍ；２ｍ−６ｍ−１２ｍ；２ｍ−６ｍ−１３ｍ；２ｍ−６ｍ−１４ｍ；２ｍ−６ｍ−１５ｍ；２ｍ−７ｍ−８ｍ；２ｍ−７ｍ−９ｍ；２ｍ−７ｍ−１０ｍ；２ｍ−７ｍ−１１ｍ；２ｍ−７ｍ−１２ｍ；２ｍ−７ｍ−１３ｍ；２ｍ−７ｍ−１４ｍ；２ｍ−７ｍ−１５ｍ；２ｍ−８ｍ−９ｍ；２ｍ−８ｍ−１０ｍ；２ｍ−８ｍ−１１ｍ；２ｍ−８ｍ−１２ｍ；２ｍ−８ｍ−１３ｍ；２ｍ−８ｍ−１４ｍ；２ｍ−８ｍ−１５ｍ；２ｍ−９ｍ−１０ｍ；２ｍ−９ｍ−１１ｍ；２ｍ−９ｍ−１２ｍ；２ｍ−９ｍ−１３ｍ；２ｍ−９ｍ−１４ｍ；２ｍ−９ｍ−１５ｍ；２ｍ−１０ｍ−１１ｍ；２ｍ−１０ｍ−１２ｍ；２ｍ−１０ｍ−１３ｍ；２ｍ−１０ｍ−１４ｍ；２ｍ−１０ｍ−１５ｍ；２ｍ−１１ｍ−１２ｍ；２ｍ−１１ｍ−１３ｍ；２ｍ−１１ｍ−１４ｍ；２ｍ−１１ｍ−１５ｍ；２ｍ−１２ｍ−１３ｍ；２ｍ−１２ｍ−１４ｍ；２ｍ−１２ｍ−１５ｍ；２ｍ−１３ｍ−１４ｍ；２ｍ−１３ｍ−１５ｍ；２ｍ−１４ｍ−１５ｍ；３ｍ−４ｍ−５ｍ；３ｍ−４ｍ−６ｍ；３ｍ−４ｍ−７ｍ；３ｍ−４ｍ−８ｍ；３ｍ−４ｍ−９ｍ；３ｍ−４ｍ−１０ｍ；３ｍ−４ｍ−１１ｍ；３ｍ−４ｍ−１２ｍ；３ｍ−４ｍ−１３ｍ；３ｍ−４ｍ−１４ｍ；３ｍ−４ｍ−１５ｍ；３ｍ−５ｍ−６ｍ；３ｍ−５ｍ−７ｍ；３ｍ−５ｍ−８ｍ；３ｍ−５ｍ−９ｍ；３ｍ−５ｍ−１０ｍ；３ｍ−５ｍ−１１ｍ；３ｍ−５ｍ−１２ｍ；３ｍ−５ｍ−１３ｍ；３ｍ−５ｍ−１４ｍ；３ｍ−５ｍ−１５ｍ；３ｍ−６ｍ−７ｍ；３ｍ−６ｍ−８ｍ；３ｍ−６ｍ−９ｍ；３ｍ−６ｍ−１０ｍ；３ｍ−６ｍ−１１ｍ；３ｍ−６ｍ−１２ｍ；３ｍ−６ｍ−１３ｍ；３ｍ−６ｍ−１４ｍ；３ｍ−６ｍ−１５ｍ；３ｍ−７ｍ−８ｍ；３ｍ−７ｍ−９ｍ；３ｍ−７ｍ−１０ｍ；３ｍ−７ｍ−１１ｍ；３ｍ−７ｍ−１２ｍ；３ｍ−７ｍ−１３ｍ；３ｍ−７ｍ−１４ｍ；３ｍ−７ｍ−１５ｍ；３ｍ−８ｍ−９ｍ；３ｍ−８ｍ−１０ｍ；３ｍ−８ｍ−１１ｍ；３ｍ−８ｍ−１２ｍ；３ｍ−８ｍ−１３ｍ；３ｍ−８ｍ−１４ｍ；３ｍ−８ｍ−１５ｍ；３ｍ−９ｍ−１０ｍ；３ｍ−９ｍ−１１ｍ；３ｍ−９ｍ−１２ｍ；３ｍ−９ｍ−１３ｍ；３ｍ−９ｍ−１４ｍ；３ｍ−９ｍ−１５ｍ；３ｍ−１０ｍ−１１ｍ；３ｍ−１０ｍ−１２ｍ；３ｍ−１０ｍ−１３ｍ；３ｍ−１０ｍ−１４ｍ；３ｍ−１０ｍ−１５ｍ；３ｍ−１１ｍ−１２ｍ；３ｍ−１１ｍ−１３ｍ；３ｍ−１１ｍ−１４ｍ；３ｍ−１１ｍ−１５ｍ；３ｍ−１２ｍ−１３ｍ；３ｍ−１２ｍ−１４ｍ；３ｍ−１２ｍ−１５ｍ；３ｍ−１３ｍ−１４ｍ；３ｍ−１３ｍ−１５ｍ；３ｍ−１４ｍ−１５ｍ；４ｍ−５ｍ−６ｍ；４ｍ−５ｍ−７ｍ；４ｍ−５ｍ−８ｍ；４ｍ−５ｍ−９ｍ；４ｍ−５ｍ−１０ｍ；４ｍ−５ｍ−１１ｍ；４ｍ−５ｍ−１２ｍ；４ｍ−５ｍ−１３ｍ；４ｍ−５ｍ−１４ｍ；４ｍ−５ｍ−１５ｍ；４ｍ−６ｍ−７ｍ；４ｍ−６ｍ−８ｍ；４ｍ−６ｍ−９ｍ；４ｍ−６ｍ−１０ｍ；４ｍ−６ｍ−１１ｍ；４ｍ−６ｍ−１２ｍ；４ｍ−６ｍ−１３ｍ；４ｍ−６ｍ−１４ｍ；４ｍ−６ｍ−１５ｍ；４ｍ−７ｍ−８ｍ；４ｍ−７ｍ−９ｍ；４ｍ−７ｍ−１０ｍ；４ｍ−７ｍ−１１ｍ；４ｍ−７ｍ−１２ｍ；４ｍ−７ｍ−１３ｍ；４ｍ−７ｍ−１４ｍ；４ｍ−７ｍ−１５ｍ；４ｍ−８ｍ−９ｍ；４ｍ−８ｍ−１０ｍ；４ｍ−８ｍ−１１ｍ；４ｍ−８ｍ−１２ｍ；４ｍ−８ｍ−１３ｍ；４ｍ−８ｍ−１４ｍ；４ｍ−８ｍ−１５ｍ；４ｍ−９ｍ−１０ｍ；４ｍ−９ｍ−１１ｍ；４ｍ−９ｍ−１２ｍ；４ｍ−９ｍ−１３ｍ；４ｍ−９ｍ−１４ｍ；４ｍ−９ｍ−１５ｍ；４ｍ−１０ｍ−１１ｍ；４ｍ−１０ｍ−１２ｍ；４ｍ−１０ｍ−１３ｍ；４ｍ−１０ｍ−１４ｍ；４ｍ−１０ｍ−１５ｍ；４ｍ−１１ｍ−１２ｍ；４ｍ−１１ｍ−１３ｍ；４ｍ−１１ｍ−１４ｍ；４ｍ−１１ｍ−１５ｍ；４ｍ−１２ｍ−１３ｍ；４ｍ−１２ｍ−１４ｍ；４ｍ−１２ｍ−１５ｍ；４ｍ−１３ｍ−１４ｍ；４ｍ−１３ｍ−１５ｍ；４ｍ−１４ｍ−１５ｍ；５ｍ−６ｍ−７ｍ；５ｍ−６ｍ−８ｍ；５ｍ−６ｍ−９ｍ；５ｍ−６ｍ−１０ｍ；５ｍ−６ｍ−１１ｍ；５ｍ−６ｍ−１２ｍ；５ｍ−６ｍ−１３ｍ；５ｍ−６ｍ−１４ｍ；５ｍ−６ｍ−１５ｍ；５ｍ−７ｍ−８ｍ；５ｍ−７ｍ−９ｍ；５ｍ−７ｍ−１０ｍ；５ｍ−７ｍ−１１ｍ；５ｍ−７ｍ−１２ｍ；５ｍ−７ｍ−１３ｍ；５ｍ−７ｍ−１４ｍ；５ｍ−７ｍ−１５ｍ；５ｍ−８ｍ−９ｍ；５ｍ−８ｍ−１０ｍ；５ｍ−８ｍ−１１ｍ；５ｍ−８ｍ−１２ｍ；５ｍ−８ｍ−１３ｍ；５ｍ−８ｍ−１４ｍ；５ｍ−８ｍ−１５ｍ；５ｍ−９ｍ−１０ｍ；５ｍ−９ｍ−１１ｍ；５ｍ−９ｍ−１２ｍ；５ｍ−９ｍ−１３ｍ；５ｍ−９ｍ−１４ｍ；５ｍ−９ｍ−１５ｍ；５ｍ−１０ｍ−１１ｍ；５ｍ−１０ｍ−１２ｍ；５ｍ−１０ｍ−１３ｍ；５ｍ−１０ｍ−１４ｍ；５ｍ−１０ｍ−１５ｍ；５ｍ−１１ｍ−１２ｍ；５ｍ−１１ｍ−１３ｍ；５ｍ−１１ｍ−１４ｍ；５ｍ−１１ｍ−１５ｍ；５ｍ−１２ｍ−１３ｍ；５ｍ−１２ｍ−１４ｍ；５ｍ−１２ｍ−１５ｍ；５ｍ−１３ｍ−１４ｍ；５ｍ−１３ｍ−１５ｍ；５ｍ−１４ｍ−１５ｍ；６ｍ−７ｍ−８ｍ；６ｍ−７ｍ−９ｍ；６ｍ−７ｍ−１０ｍ；６ｍ−７ｍ−１１ｍ；６ｍ−７ｍ−１２ｍ；６ｍ−７ｍ−１３ｍ；６ｍ−７ｍ−１４ｍ；６ｍ−７ｍ−１５ｍ；６ｍ−８ｍ−９ｍ；６ｍ−８ｍ−１０ｍ；６ｍ−８ｍ−１１ｍ；６ｍ−８ｍ−１２ｍ；６ｍ−８ｍ−１３ｍ；６ｍ−８ｍ−１４ｍ；６ｍ−８ｍ−１５ｍ；６ｍ−９ｍ−１０ｍ；６ｍ−９ｍ−１１ｍ；６ｍ−９ｍ−１２ｍ；６ｍ−９ｍ−１３ｍ；６ｍ−９ｍ−１４ｍ；６ｍ−９ｍ−１５ｍ；６ｍ−１０ｍ−１１ｍ；６ｍ−１０ｍ−１２ｍ；６ｍ−１０ｍ−１３ｍ；６ｍ−１０ｍ−１４ｍ；６ｍ−１０ｍ−１５ｍ；６ｍ−１１ｍ−１２ｍ；６ｍ−１１ｍ−１３ｍ；６ｍ−１１ｍ−１４ｍ；６ｍ−１１ｍ−１５ｍ；６ｍ−１２ｍ−１３ｍ；６ｍ−１２ｍ−１４ｍ；６ｍ−１２ｍ−１５ｍ；６ｍ−１３ｍ−１４ｍ；６ｍ−１３ｍ−１５ｍ；６ｍ−１４ｍ−１５ｍ；７ｍ−８ｍ−９ｍ；７ｍ−８ｍ−１０ｍ；７ｍ−８ｍ−１１ｍ；７ｍ−８ｍ−１２ｍ；７ｍ−８ｍ−１３ｍ；７ｍ−８ｍ−１４ｍ；７ｍ−８ｍ−１５ｍ；７ｍ−９ｍ−１０ｍ；７ｍ−９ｍ−１１ｍ；７ｍ−９ｍ−１２ｍ；７ｍ−９ｍ−１３ｍ；７ｍ−９ｍ−１４ｍ；７ｍ−９ｍ−１５ｍ；７ｍ−１０ｍ−１１ｍ；７ｍ−１０ｍ−１２ｍ；７ｍ−１０ｍ−１３ｍ；７ｍ−１０ｍ−１４ｍ；７ｍ−１０ｍ−１５ｍ；７ｍ−１１ｍ−１２ｍ；７ｍ−１１ｍ−１３ｍ；７ｍ−１１ｍ−１４ｍ；７ｍ−１１ｍ−１５ｍ；７ｍ−１２ｍ−１３ｍ；７ｍ−１２ｍ−１４ｍ；７ｍ−１２ｍ−１５ｍ；７ｍ−１３ｍ−１４ｍ；７ｍ−１３ｍ−１５ｍ；７ｍ−１４ｍ−１５ｍ；８ｍ−９ｍ−１０ｍ；８ｍ−９ｍ−１１ｍ；８ｍ−９ｍ−１２ｍ；８ｍ−９ｍ−１３ｍ；８ｍ−９ｍ−１４ｍ；８ｍ−９ｍ−１５ｍ；８ｍ−１０ｍ−１１ｍ；８ｍ−１０ｍ−１２ｍ；８ｍ−１０ｍ−１３ｍ；８ｍ−１０ｍ−１４ｍ；８ｍ−１０ｍ−１５ｍ；８ｍ−１１ｍ−１２ｍ；８ｍ−１１ｍ−１３ｍ；８ｍ−１１ｍ−１４ｍ；８ｍ−１１ｍ−１５ｍ；８ｍ−１２ｍ−１３ｍ；８ｍ−１２ｍ−１４ｍ；８ｍ−１２ｍ−１５ｍ；８ｍ−１３ｍ−１４ｍ；８ｍ−１３ｍ−１５ｍ；８ｍ−１４ｍ−１５ｍ；９ｍ−１０ｍ−１１ｍ；９ｍ−１０ｍ−１２ｍ；９ｍ−１０ｍ−１３ｍ；９ｍ−１０ｍ−１４ｍ；９ｍ−１０ｍ−１５ｍ；９ｍ−１１ｍ−１２ｍ；９ｍ−１１ｍ−１３ｍ；９ｍ−１１ｍ−１４ｍ；９ｍ−１１ｍ−１５ｍ；９ｍ−１２ｍ−１３ｍ；９ｍ−１２ｍ−１４ｍ；９ｍ−１２ｍ−１５ｍ；９ｍ−１３ｍ−１４ｍ；９ｍ−１３ｍ−１５ｍ；９ｍ−１４ｍ−１５ｍ；１０ｍ−１１ｍ−１２ｍ；１０ｍ−１１ｍ−１３ｍ；１０ｍ−１１ｍ−１４ｍ；１０ｍ−１１ｍ−１５ｍ；１０ｍ−１２ｍ−１３ｍ；１０ｍ−１２ｍ−１４ｍ；１０ｍ−１２ｍ−１５ｍ；１０ｍ−１３ｍ−１４ｍ；１０ｍ−１３ｍ−１５ｍ；１０ｍ−１４ｍ−１５ｍ；１１ｍ−１２ｍ−１３ｍ；１１ｍ−１２ｍ−１４ｍ；１１ｍ−１２ｍ−１５ｍ；１１ｍ−１３ｍ−１４ｍ；１１ｍ−１３ｍ−１５ｍ；１１ｍ−１４ｍ−１５ｍ；１２ｍ−１３ｍ−１４ｍ；１２ｍ−１３ｍ−１５ｍ；１２ｍ−１４ｍ−１５ｍ；及び１３ｍ−１４ｍ−１５ｍである。
実施例４．
本実施例では、個々のＨＢＶ ｓｉＲＮＡ分子について免疫刺激プロファイルを確立した方法について説明する。
ヒト全血を健常成人ボランティアから採取して個々のヘパリン含有バキュテナーに入れた。凝固を防ぐため、採血管を８回反転させ、滅菌生理食塩水と１：１で混合してから、この混合物１８０マイクロリットル（μＬ）を透明なポリステレン（ｐｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅ）製９６ウェル組織培養プレートに播種した。同時に、ＰＢＳを希釈剤として使用して、ＬＮＰ処方ｓｉＲＮＡ分子それぞれの１０倍希釈溶液を調製した。２０マイクロリットルの１０倍希釈したＬＮＰ処方ｓｉＲＮＡをそれぞれ、血液：食塩液１８０μＬを含有するウェルに添加して、ｓｉＲＮＡの最終濃度を６００ｎＭとした。各ｓｉＲＮＡ分子を各ドナーについてウェルで３通り試験した。単離されたヒト血液を個々のｓｉＲＮＡ分子で３７℃にて５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、インキュベーションプレートを１２００ｒｐｍで２０分回転させて血漿を回収した。各ウェルから少なくとも１２５μＬの血漿を回収して９６ウェル滅菌プレートに移し、透明なアセテート製プレートシールで密封した。
Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ、Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ、ＵＳＡ）で、ＰＢＳ単独でインキュベートしたヒト全血の場合と比較した、ヒトインターフェロンアルファ２（ＩＦＮα２）、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、及び単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の相対的誘導レベルを定量化して、各ｓｉＲＮＡ分子についての免疫刺激プロファイルを作製した。Ｌｕｍｉｎｅｘ２００システムでデータを取得し、ｘＰｏｎｅｎｔ３．１．８７１．０ソフトウェアを使用し、標準曲線に当てはめたロジスティックの５−パラメータ加重を用いて内挿を行った。ヒト全血を３通りプールし、アッセイしてそれを技術的に反復した。表１のデータは、ドナー１２人由来のＰＢＳ処理血液の倍率変化の平均値である。化学的に修飾されていないｓｉＲＮＡ（Ｓ鎖配列５'−３'：ＧＡＡＧＧＣＣＡＧＡＣＧＣＧＡＡＵＵＡＴＴ；配列番号３１）がこの実験の陽性対照として使用され、これにより、示されているサイトカインについての上記ＰＢＳ処理血液の増加倍率は、２５．１（ＩＦＮα２）；１４．３（ＩＬ−１ＲＡ）；１，２２６．５（ＩＬ−６）；及び５１．６（ＭＣＰ−１）となった。
Figure 2017536092
実施例５．
ＨＢＶ ｓｉＲＮＡのセンス（Ｓ）鎖が、ＲＮＡｉ遺伝子ノックダウンを引き起き起こす能力を有するか否かを評価する手段として、Ｓ鎖のサイレンシングに対するセンサーとして機能する、ルシフェラーゼを用いたレポータープラスミドを構築した。Ｓ鎖サイレンシングが及ぼす可能性のある影響としては、本明細書に記載するＨＢＶ ｓｉＲＮＡのＳ鎖に対する相補性を有している内在性遺伝子に及ぼす、意図しない、または望ましくない「オフターゲット」効果が挙げられる。理想的なｓｉＲＮＡは、Ｓ鎖遺伝子サイレンシング能を示さない。
Ｓ鎖センサーのレポータープラスミドを構築するため、実施例１に記載のＨＢＶ標的断片を、ｐｓｉ−ＣＨＥＣＫ２プラスミドベクターの、ウミシイタケルシフェラーゼ終止コドンとポリアデニル化シグナルの間に、逆相補方向にクローニングした。こうして得られる「ｐｓｉ−ＨＢＶ ＢＡＣＫＷＡＲＤ」と命名されるプラスミドは、Ｓ鎖によるＲＮＡｉサイレンシングのみが許容されるが、アンチセンス鎖では許容されない、ウミシイタケルシフェラーゼ−ＨＢＶ ｍＲＮＡの転写を行う。注目すべきことに、ＲＮＡｉ遺伝子サイレンシング効果は、標的ｍＲＮＡと当該ｓｉＲＮＡ鎖との間に完全な相補性が存在する場合に最も頑健であることから、このレポーター設計により、Ｓ鎖の任意のサイレンシング能を観察できる可能性が最も高い機会が提供される。部分的な相補性では、遺伝子サイレンシングが弱いか、または全く起こらないと考えられる。アノテーションされた内在性ヒトｍＲＮＡは、表Ａに列挙したｓｉＲＮＡのＳ鎖に完全に相補的なものはない。
Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（ＤＬＲ）アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）で、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）活性と比べたウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）活性の低下を測定することにより、ＨＢＶ ｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性を試験した。９６ウェルプレートのリバーストランスフェクション法にＣｏｓ−７細胞を使用した。各ウェルに、２５，０００細胞及び４０ｎｇプラスミド、さらに指定濃度のｓｉＲＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００との複合体を含有させた。３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした後、培地を除去し、細胞を発光測定のために処理した。Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒキットから、ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１倍濃縮）５０ｕｌを各ウェルに添加し、遮光し、１００ ｒｐｍで３０分間振盪した。溶解液を、発光の検出により両ルシフェラーゼの発現について評価した。ＲＬｕｃ／ＦＬｕｃ比を計算し、プラスミドのみでトランスフェクトした細胞（「陰性対照」）を基準として正規化した。
報告データは３通りトランスフェクトしたウェルの平均値である（表２）。ＲＬｕｃ／ＦＬｕｃ対陰性対照の％値が１００の場合は、遺伝子サイレンシングがないことを指す。
Figure 2017536092
実験試料と同一用量でウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を直接標的とする陽性対照ｓｉＲＮＡでは、ＲＬｕｃ／ＦＬｕｃ対陰性対照との平均％値はそれぞれ、１６．１、３７．３、及び９１．１であった。
本実施例に開示する細胞型、トランスフェクション方法、及び用量レベルを使用した、示されるｓｉＲＮＡの正確な（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）遺伝子サイレンシング（すなわち、「ｐｓｉ−ＨＢＶ」レポータープラスミドを使用するもの）は、以下のＲＬｕｃ／ＦＬｕｃ対陰性対照の％値を示し、この細胞型及びトランスフェクション条件において、これらのｓｉＲＮＡの正確なサイレンシングが実際に機能的であることを実証している。
３ｍ：用量レベル５０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、及び１ｎｇ／ｍｌそれぞれにおいて９．７、１８．２、５４．７；ならびに
１２ｍ：用量レベル５０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、及び１ｎｇ／ｍｌそれぞれにおいて１１：２、２４．９、５９．５であった。
以上を総合すると、これらの結果は、本明細書に記載するＨＢＶ ｓｉＲＮＡのＳ鎖は、明らかなＲＮＡｉ遺伝子サイレンシング能を示さないことを指している。したがって、Ｓ鎖が、内在性遺伝子の望ましくないサイレンシングを誘発する可能性は低いかまたはごくわずかである。

Claims (77)

  1. 配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７及び配列番号２９からなる群から選択される、単離された核酸分子。
  2. 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８及び配列番号３０からなる群から選択される、単離された核酸分子。
  3. １ｍ（配列番号１及び２）、２ｍ（配列番号３及び４）、３ｍ（配列番号５及び６）、４ｍ（配列番号７及び８）、５ｍ（配列番号９及び１０）、６ｍ（配列番号１１及び１２）、７ｍ（配列番号１３及び１４）、８ｍ（配列番号１５及び１６）、９ｍ（配列番号１７及び１８）、１０ｍ（配列番号１９及び２０）、１１ｍ（配列番号２１及び２２）、１２ｍ（配列番号２３及び２４）、１３ｍ（配列番号２５及び２６）、１４ｍ（配列番号２７及び２８）及び１５ｍ（配列番号２９及び３０）からなる群から選択される、単離された二本鎖のｓｉＲＮＡ分子。
  4. 請求項３に記載の単離された二本鎖のｓｉＲＮＡ分子を含む、組成物。
  5. １ｍ（配列番号１及び２）、２ｍ（配列番号３及び４）、３ｍ（配列番号５及び６）、４ｍ（配列番号７及び８）、５ｍ（配列番号９及び１０）、６ｍ（配列番号１１及び１２）、７ｍ（配列番号１３及び１４）、８ｍ（配列番号１５及び１６）、９ｍ（配列番号１７及び１８）、１０ｍ（配列番号１９及び２０）、１１ｍ（配列番号２１及び２２）、１２ｍ（配列番号２３及び２４）、１３ｍ（配列番号２５及び２６）、１４ｍ（配列番号２７及び２８）及び１５ｍ（配列番号２９及び３０）からなる群から選択される、２つの異なる二本鎖のｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記２つの異なる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される、請求項５に記載の組成物。
  7. １ｍ（配列番号１及び２）、２ｍ（配列番号３及び４）、３ｍ（配列番号５及び６）、４ｍ（配列番号７及び８）、５ｍ（配列番号９及び１０）、６ｍ（配列番号１１及び１２）、７ｍ（配列番号１３及び１４）、８ｍ（配列番号１５及び１６）、９ｍ（配列番号１７及び１８）、１０ｍ（配列番号１９及び２０）、１１ｍ（配列番号２１及び２２）、１２ｍ（配列番号２３及び２４）、１３ｍ（配列番号２５及び２６）、１４ｍ（配列番号２７及び２８）及び１５ｍ（配列番号２９及び３０）からなる群から選択される、３つの異なる二本鎖のｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項４に記載の組成物。
  8. 前記３つの異なる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記組成物は、薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物である、請求項４〜８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記ｓｉＲＮＡは、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする、請求項４〜９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. （ａ）請求項３に記載の単離された二本鎖のｓｉＲＮＡ分子から選択される１つ以上の単離された二本鎖のｓｉＲＮＡ分子と、
    （ｂ）カチオン性脂質と、
    （ｃ）非カチオン性脂質と
    を含む、核酸−脂質粒子。
  12. 前記カチオン性脂質は、１，２−ジリノレイルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジ−γ−リノレニルオキシ（ｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（γ−ＤＬｅｎＤＭＡ；化合物（１５））、３−（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミン（ＤＬｉｎ−ＭＰ−ＤＭＡ；化合物（８））、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート）（化合物（７））、（６Ｚ，１６Ｚ）−１２−（（Ｚ）−デカ−４−エニル）ドコサ−６，１６−ジエン−１１−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノアート（化合物（１３））、その塩、及びその混合物からなる群から選択される、請求項１１に記載の核酸−脂質粒子。
  13. 前記非カチオン性脂質はコレステロールまたはその誘導体である、請求項１１〜１２のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子。
  14. 前記非カチオン性脂質はリン脂質である、請求項１１〜１２のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子。
  15. 前記非カチオン性脂質は、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物である、請求項１１〜１２のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子。
  16. 前記リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びその混合物からなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の核酸−脂質粒子。
  17. 前記リン脂質はＤＰＰＣである、請求項１６に記載の核酸−脂質粒子。
  18. 前記リン脂質はＤＳＰＣである、請求項１６に記載の核酸−脂質粒子。
  19. 粒子の凝集を阻害する複合脂質をさらに含む、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子。
  20. 前記粒子の凝集を阻害する複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質複合体である、請求項１９に記載の核酸−脂質粒子。
  21. 前記ＰＥＧ−脂質複合体は、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）複合体、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＡＡ）複合体、ＰＥＧ−リン脂質複合体、ＰＥＧ−セラミド（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）複合体、及びその混合物からなる群から選択される、請求項２０に記載の核酸−脂質粒子。
  22. 前記ＰＥＧ−脂質複合体はＰＥＧ−ＤＡＡ複合体である、請求項２１に記載の核酸−脂質粒子。
  23. 前記ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）複合体、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）複合体、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）複合体、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）複合体、ＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）複合体、及びその混合物からなる群から選択される、請求項２２に記載の核酸−脂質粒子。
  24. 前記ｓｉＲＮＡは、前記粒子内に完全に封入されている、請求項１１〜２３のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子。
  25. 前記粒子は、総脂質：ｓｉＲＮＡの質量比が約５：１〜約１５：１である、請求項１１〜２４のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子。
  26. 前記粒子は、中位径が約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍである、請求項１１〜２５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子。
  27. 前記粒子は高電子密度の核を有する、請求項１１〜２６のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子。
  28. 前記カチオン性脂質は、前記粒子中に存在する総脂質の約４８ｍｏｌ％〜約６２ｍｏｌ％を占める、請求項１１〜２７のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子。
  29. リン脂質及びコレステロールまたはコレステロール誘導体を含み、前記リン脂質は、前記粒子中に存在する総脂質の約７ｍｏｌ％〜約１７ｍｏｌ％を占め、前記コレステロールまたはその誘導体は、前記粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％を占める、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子。
  30. 前記粒子の凝集を阻害する複合脂質は、前記粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％を占める、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子。
  31. 前記脂質は、処方物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、ＹまたはＺのいずれか１つに記載のように処方される、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子。
  32. １ｍ（配列番号１及び２）、２ｍ（配列番号３及び４）、３ｍ（配列番号５及び６）、４ｍ（配列番号７及び８）、５ｍ（配列番号９及び１０）、６ｍ（配列番号１１及び１２）、７ｍ（配列番号１３及び１４）、８ｍ（配列番号１５及び１６）、９ｍ（配列番号１７及び１８）、１０ｍ（配列番号１９及び２０）、１１ｍ（配列番号２１及び２２）、１２ｍ（配列番号２３及び２４）、１３ｍ（配列番号２５及び２６）、１４ｍ（配列番号２７及び２８）及び１５ｍ（配列番号２９及び３０）からなる群から選択される２つの異なる二本鎖のｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項１１〜３１のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子。
  33. 前記２つの異なる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例２に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される、請求項３２に記載の核酸−脂質粒子。
  34. １ｍ（配列番号１及び２）、２ｍ（配列番号３及び４）、３ｍ（配列番号５及び６）、４ｍ（配列番号７及び８）、５ｍ（配列番号９及び１０）、６ｍ（配列番号１１及び１２）、７ｍ（配列番号１３及び１４）、８ｍ（配列番号１５及び１６）、９ｍ（配列番号１７及び１８）、１０ｍ（配列番号１９及び２０）、１１ｍ（配列番号２１及び２２）、１２ｍ（配列番号２３及び２４）、１３ｍ（配列番号２５及び２６）、１４ｍ（配列番号２７及び２８）及び１５ｍ（配列番号２９及び３０）からなる群から選択される３つの異なる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項１１〜３１のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子。
  35. 前記３つの異なる二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の組み合わせは、実施例３に記載の組み合わせのいずれか１つから選択される、請求項３４に記載の核酸−脂質粒子。
  36. 請求項１１〜３５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子及び薬理学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  37. 細胞内のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングするための方法であって、発現したＢ型肝炎ウイルス遺伝子を含む細胞と、請求項１１〜３５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子または請求項３６に記載の医薬組成物とを、前記ｓｉＲＮＡが前記細胞に入り、前記細胞内のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする条件下で接触させるステップを含む、前記方法。
  38. 前記細胞は哺乳類の細胞である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記細胞は、前記粒子を前記哺乳類に全身経路を介して投与することにより接触される、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記哺乳類はヒトである、請求項３８または３９に記載の方法。
  41. 前記ヒトは、Ｂ型肝炎ウイルス感染またはＢ型肝炎ウイルス／Ｄ型肝炎ウイルス感染が原因の肝臓疾患と診断されている、請求項４０に記載の方法。
  42. Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子発現のサイレンシングにより、前記哺乳類のＢ型肝炎ウイルス及び／またはＤ型肝炎ウイルスの粒子量が、核酸−脂質粒子が存在しない場合のＢ型肝炎ウイルス及び／またはＤ型肝炎ウイルスの粒子量より少なくとも約５０％抑制される、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 哺乳類（例えば、ヒト）の細胞内のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする際に使用するための、請求項１１〜３５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子または請求項３６に記載の医薬組成物。
  44. 哺乳類（例えば、ヒト）の細胞内のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする医薬品を調製するための、請求項１１〜３５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子または請求項３６に記載の医薬組成物の使用。
  45. 哺乳類のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染に関連する１つ以上の症状を改善する方法であって、前記哺乳類に、治療有効量の請求項１１〜３５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子または請求項３６に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
  46. 前記粒子を全身経路により投与する、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記核酸−脂質粒子のｓｉＲＮＡは、前記哺乳類のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を阻害する、請求項４５〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記哺乳類はヒトである、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記ヒトは、肝臓疾患を患っている、請求項４８に記載の方法。
  50. 哺乳類（例えば、ヒト）のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染に関連する１つ以上の症状の改善に使用するための、請求項１１〜３５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子または請求項３６に記載の医薬組成物。
  51. 哺乳類（例えば、ヒト）のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染に関連する１つ以上の症状を改善する医薬品を調製するための、請求項１１〜３５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子または請求項３６に記載の医薬組成物の使用。
  52. 哺乳類のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染を治療するための方法であって、前記哺乳類に、治療有効量の請求項１１〜３５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子または請求項３６に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
  53. 哺乳類（例えば、ヒト）のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染の治療に使用するための、請求項１１〜３５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子または請求項３６に記載の医薬組成物。
  54. 哺乳類（例えば、ヒト）のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染を治療する医薬品を調製するための、請求項１１〜３５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子または請求項３６に記載の医薬組成物の使用。
  55. 内科的治療に使用するための、請求項１１〜３５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子または請求項３６に記載の医薬組成物。
  56. 細胞内のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングするための方法であって、発現したＢ型肝炎ウイルス遺伝子を含む細胞と、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物とを、前記ｓｉＲＮＡが前記細胞に入り、前記細胞内のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする条件下で接触させるステップを含む、前記方法。
  57. 前記細胞は哺乳類の細胞である、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記細胞は、前記組成物を前記哺乳類に全身経路を介して投与することにより接触される、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記哺乳類はヒトである、請求項５７または５８に記載の方法。
  60. 前記ヒトは、Ｂ型肝炎ウイルス感染またはＢ型肝炎ウイルス／Ｄ型肝炎ウイルス感染が原因の肝臓疾患と診断されている、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子発現のサイレンシングにより、前記哺乳類のＢ型肝炎ウイルス及び／またはＤ型肝炎ウイルスの粒子量が、核酸−脂質粒子が存在しない場合のＢ型肝炎ウイルス及び／またはＤ型肝炎ウイルスの粒子量より少なくとも約５０％抑制される、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 哺乳類（例えば、ヒト）の細胞内のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする際に使用するための、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
  63. 哺乳類（例えば、ヒト）の細胞内のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現をサイレンシングする医薬品を調製するための、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  64. 哺乳類のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染に関連する１つ以上の症状を改善する方法であって、前記哺乳類に、治療有効量の請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、前記方法。
  65. 前記組成物を全身経路により投与する、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記組成物のｓｉＲＮＡは、前記哺乳類のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を阻害する、請求項６４〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記哺乳類はヒトである、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記ヒトは、肝臓疾患を患っている、請求項６７に記載の方法。
  69. 哺乳類（例えば、ヒト）のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染に関連する１つ以上の症状の改善に使用するための、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
  70. 哺乳類（例えば、ヒト）のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染に関連する１つ以上の症状を改善する医薬品を調製するための、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  71. 哺乳類のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染を治療するための方法であって、前記哺乳類に、治療有効量の請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、前記方法。
  72. 哺乳類（例えば、ヒト）のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染の治療に使用するための、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
  73. 哺乳類（例えば、ヒト）のＢ型肝炎ウイルス感染及び／またはＤ型肝炎ウイルス感染を治療する医薬品を調製するための、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  74. 内科的治療に使用するための、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
  75. 哺乳類（例えば、ヒト）においてＤ型肝炎ウイルスの複製を阻害し、かつ／またはＤ型肝炎ウイルス感染の１つ以上の症状を改善するための方法であって、治療有効量の請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１〜３５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子、または請求項３６に記載の医薬組成物を前記哺乳類に投与するステップを含み、前記核酸−脂質粒子または組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の合成を阻害する、前記方法。
  76. 哺乳類（例えば、ヒト）においてＤ型肝炎ウイルスの複製を阻害し、かつ／またはＤ型肝炎ウイルス感染の１つ以上の症状を改善する際に使用するための、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の合成を阻害する、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１〜３５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子、または請求項３６に記載の医薬組成物。
  77. 哺乳類（例えば、ヒト）においてＤ型肝炎ウイルスの複製を阻害し、かつ／またはＤ型肝炎ウイルス感染の１つ以上の症状を改善する医薬品を調製し、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の合成を阻害する、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１〜３５のいずれか一項に記載の核酸−脂質粒子または請求項３６に記載の医薬組成物の使用。
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