JP2017526671A - ヒト抗−fgfr4抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列番号1〜6に示されるCDRH1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH1配列、
(b)配列番号7〜12に示されるCDRH2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号13〜20に示されるCDRH3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH3配列、
からなる群より選択される少なくとも1つのCDRを含む重鎖、
および/または、
(d)配列番号21〜23または68に示されるCDRL1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL1配列、
(e)配列番号24〜27に示されるCDRL2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号28〜35に示されるCDRL3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL3配列
からなる群より選択される少なくとも1つのCDRを含む軽鎖、
を含む。
(a)上記に定義される抗体、そのフラグメントまたは誘導体をコードする核酸配列、
(b)配列番号36〜43および配列番号44〜51のいずれか1つに示される核酸配列、
(c) (a)または(b)の配列のいずれか1つと相補の核酸配列、および、
(d) (a)、(b)または(c)に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、核酸配列、
からなる群より選択される、単離された核酸分子に関する。
Fab抗体フラグメントの単離
n−CoDeR Fabライブラリー(BioInvent,Lund,Sweden)を用いて、ヒトFGFR4を認識するFab抗体フラグメントを単離した。スクリーニングは、ヒトFGFR4−Fc(R&D Systems,Minneapolis,MN;U.S.A.)、ヒトFGFR4−His/Myc、または、ヒトFGFR4を安定的に発現するラット筋芽細胞株L6(ATCC,Manassas,VA;U.S.A.)のいずれかに対する、差動パニング法として設定した。ヒトFGFRs−Fc(R&D Systems)、ヒトFc(Jackson Immuno Research,Newmarket;UK)およびL6細胞の他のファミリーを、ネガティブ選択で用いた。液体パニングにおいて、ヒトFGFR4−FcおよびヒトFGFR4−His/Mycを、EZ−Link NHS−発色性−ビオチン(Thermo Fisher Scientific)を用いてビオチン化した。Dynabeads M−280ストレプトアビジン(Thermo Fisher Scientific)を加えて、FGFR4−結合ファージを回収した。固形パニングにおいて、ヒトFGFR4−FcおよびヒトFGFR4−His/Mycをポリスチレンボール上に直接固定化した。ファージをビーズとともにインキュベートして、ボールまたはFGFR4を発現しているL6細胞および未結合画分を洗浄により除去した。結合したファージを、トリプシンとのインキュベーションによりリリースさせて、E.coli中で増幅させた。合計5回の異なるパニングの後に、E.coli(TOP10F’)をFab−発現プラスミドで形質転換して、最終的に個々のFabクローンを発現させた。
上述の3回目のパニングによるFabを、以下のように結合について試験した:1pmoleのFGFR4−FcまたはFGFR4−His/MycをELISAプレートの各ウェルにコーティングして、4℃で一晩インキュベートした。洗浄およびブロッキングの後に、Fabを発現しているE.coli TOP10F’の培養培地をウェルに加えて、1時間インキュベートした。最後に、結合したFabを、ペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗−His−抗体(R&D Systems)またはペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗−ヒトFab(Jackson Immuno Research)とインキュベートすることにより検出した。シグナルは、Super Signal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific)を添加することにより検出した。FGFR4−結合Fabをシーケンスして、標準的なシーケンス技術を用いて特有のクローンを同定し、精製した特有のFabを、フローサイトメトリーによって、L6または293T細胞を発現しているヒトFGFR4(一過的または安定的な発現)への結合について分析した。確認された、FGFR4−結合Fabクローンを、標準的な組み換え技術を用いてIgG形式に変換した。
FGFR4に対するFab結合の機能性を、Elk1ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを介して試験し、以下のとおり実証された:
Huh−7細胞(JCRB Cell Bankから取得)を、37℃および5%CO2での標準的な条件下で、10%FBSを含むDMEM中で培養した。細胞を、5mM EDTA(PBS中)を用いて回収して、サンプル当たり200,000細胞を、示された抗−FGFR4抗体(1:3段階希釈;開始濃度30μg/ml)とともに4℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞を洗浄して、結合した抗体を、フィコエリトリン標識抗−ヒトIgG抗体(Jackson Immuno Research)を用いて判定した。Huh−7への抗体結合を、BD Accuri C6フローサイトメーター(BD Biosciences,San Jose,CA;U.S.A.)で測定して、AccuriC6ソフトウェアを用いて解析した。続いて、Prism(GraphPad Software,La Jolla,CA,U.S.A.)を用いて平衡解離定数(KD)を決定した。U3 Pharma抗体に関する計算されたKD値は、非常に似ていた(0.2および1.6nMの間)。図1は代表的な実験を示し、残りの抗体に関するKDは独立に決定した。GT−13に関する親和力は、全ての試験されたU3 Pharma抗体と比較した場合、より低いことが分かった(表4)。
マウス抗−Hisタグ抗体をBio−Rad(Hercules,CA;U.S.A.)から取得し、2μg/mlの濃度でMaxiSorp(登録商標)平底96ウェルELISAプレート(Sigma,St.Louis,MO;U.S.A.)上にコーティングした。コーティング後に、ヒトFGFR4の細胞外ドメイン(myc−およびHis−タグ化)を0.01μg/mlの濃度で加えた。非結合タンパク質の除去後に、示された抗FGFR4抗体を添加して(1:4段階希釈、開始濃度10μg/ml)、結合は最終的に、BMG Labtech(Ortenberg;Germany)によるFluostar Omega蛍光プレートリーダー機で、アルカリフォスファターゼ連結ヤギ抗−ヒトIgG F(ab’)フラグメントを用いたAttoPhos(登録商標)AP Fluorescent Substrate System(Promega)により検出した。代表的な結果を図2に示す。続いて、Graph Pad Prismを用いて、解離定数をU4−3、−5および−9について計算した(表5)。試験した全ての抗体は卓越したKDを示し、U4−3について観察された値は、以前に見られたものと同様であった。
標準的なアミンカップリングを用いて、ヤギ抗−ヒトIgG捕捉S−CM5センサーチップを用意した(参照のフローセルは捕捉抗体を同様に含んだ)。カルボキシメチル化デキストラン(CMD)表面を、200mM EDCおよび50mM NHSの混合物を7分間(10μl/分)注入することにより活性化した。続いて、10mM酢酸Na(pH5.0)中に希釈した30μg/mlの抗−ヒトIgG抗体を、7分間注入した(10μl/分)。残りの未反応のエステルを1Mエタノールアミン(pH8.5)でクエンチさせた(7分、10μl/ml)。17892〜18376RUの表面密度が抗ヒトIgG抗体に関して得られた。
Hek293細胞をCLS(Cell Lines Service,Eppelheim;Germany)より取得し、37℃および5%CO2の標準的な条件下で、10%FBSを含むDMEM中で培養した。0日目に、細胞を4×105細胞/10cm皿で蒔いた。24時間後、細胞を、ラット、マウス、ヒトまたはカニクイザル由来のFGFR4をコードするプラスミドでトランスフェクトした。細胞は48時間、タンパク質を発現させて、それから、PBS中5mM EDTAで皿から分離して、その後に、示された濃度の抗−FGFR4抗体U4−3またはGT−13とともにインキュベートした。結合は、フィコエリトリン−コンジュゲート抗−ヒトIgG抗体(Jackson Immuno Research Europe)を用いて判定した。データをBD Accuri C6フローサイトメーター(BD Biosciences.)で取得し、AccuriC6ソフトウェアを用いて解析した。抗体滴定試験(開始濃度10μg/ml;1:3希釈)は、抗体に関する解離定数の計算を可能にした(以下の表を参照)。抗体は、非常に低い濃度[1μg/ml]で既に試験した全ての種と同様の親和力を示し、KDは、ヒトおよびカニクイザルタンパク質に対して最良の結合を示す種で同等であった。しかしながら、U4−3は、GT−13と比較した場合、試験した全ての種にわたってより良い結合を示した。
Thermo Fisher Scientificより購入したNunc MaxiSorp(登録商標)平底96ウェルELISAプレートを、100μg/ウェルの終濃度で、R&D Systemsより得られた前述の組み換えヒトFGFR(細胞外ドメイン、Fcキメラ)(またはコントロールとしてBSA)でコーティングして、製造元の説明書に従って処理した。示されたとおりに抗−FGFR4抗体U4−3でインキュベーションした後に、Promegaより購入したAttoPhos(登録商標)AP Fluorescent Substrate Systemを用いてアルカリフォスファターゼ連結ヤギ抗−ヒトIgG F(ab’)で結合を検出して、BMG LabtechのFluostar Omega蛍光プレートリーダーで検出した。結果を図5に示す。
Hek293細胞をCLSから取得し、37℃および5%CO2の標準的な状態下で、10%FBSを含むDMEM中で培養した。0日目に細胞を蒔いて、24時間後に、示されたドメインを含むFGFR4をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクトした。細胞は48時間、タンパク質を発現させて、それから、PBS中5mM EDTAで皿から分離して、その後に、示された抗−FGFR4抗体とともにインキュベートした。結合を、フィコエリトリン−コンジュゲート抗−ヒトIgG抗体(Jackson Immuno Research Europe)を用いて判定した。データをBD Accuri C6フローサイトメーター(BD Biosciences)で取得し、AccuriC6ソフトウェアを用いて解析した。FGFR4に対するU4−3の結合は、主に受容体のIg様ドメイン2で生じ、Ig様ドメイン1(アミノ酸22〜180)および3(アミノ酸249〜349)では結合は見られなかった。結果を図6に示す。
標準的なFmoc−化学を用いて標的タンパク質(ヒトFGFR4細胞外ドメインのドメイン2)のアミノ酸配列に基づいてペプチドを合成し、スカベンジャーを用いて三フッ化酸を使用して脱保護した。立体構造的エピトープを再構成するために、Chemically Linked Peptides on Scaffolds(CLIPS)技術を用いて、拘束性(constrained)ペプチドを化学的足場上に合成した。ポリプロピレンPEPSCANカード(455ペプチドフォーマット/カード)上へ、重炭酸アンモニウム(20mM,pH7.9)/アセトニトリル(1:1(v/v))中1,3−ビス(ブロモメチル)ベンゼンのような、CLIPSテンプレートの0.5mM溶液と反応させることにより、ペプチド中の多数のシステインの側鎖をCLIPSテンプレートに連結させた。カードを、溶液中に完全に覆われながら30〜60分間、溶液中で穏やかに振った。最後に、カードを過剰のH2Oで広範囲にわたって洗浄して、1%SDS/0.1%β−メルカプトエタノールをPBS中に含む破壊−バッファー(pH7.2)中で、70℃で30分間超音波処理して、さらに45分間、H2O中で超音波処理を続けた。各ペプチドに対する抗体の結合を、PEPSCANに基づくELISAにおいて試験する。共有結合したペプチドを含む、455ウェルのクレジットカード形式のポリプロピレンカードを、例えば、PBS/1%Tween中、4%ウマ血清、5%オボアルブミン(w/v)のようなブロッキング溶液中に希釈された1μg/mlからなる一次抗体溶液とともにインキュベートした。洗浄後(3×10分)、ペプチドを25℃で1時間、1:1000希釈の抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートとともにインキュベートした(またはストレプトアビジン−HRP)。洗浄後(3×10分)、ペルオキシダーゼ基質2,2’−アジノ−ジ−3−エチルベンズチアゾリンスルホネート(ABTS)および2μlの3%H2O2を添加した。1時間後、発色現像を、電荷結合素子(CCD)−カメラおよび画像処理システムで測定および定量した。図7は、試験された抗体によるペプチド認識の違いを示し;具体的には、強調したテトラ−ペプチド配列RYNYは、U4−3によって認識されるがGT−13によって認識されない。
Hek293細胞をCLSから取得し、37℃および5%CO2の標準的な条件下で、10%FBSを含むDMEM中で培養した。0日目に細胞を2×105細胞/60mm皿で蒔いた。24時間後、FGFR4の細胞外ドメイン2(D2)をコードするプラスミド4.8μgで細胞をトランスフェクトした(表7)。発現したタンパク質はflag−タグを保有し、以下に示されるようにアミノ酸配列が異なった。細胞を60時間、タンパク質を発現させて(合間に培地交換した)、そして最終的に、PBS中5mM EDTAで皿から分離した。細胞を、示された濃度の抗−FGFR4抗体U4−3とともにインキュベートして、フィコエリトリン−コンジュゲート抗−ヒトIgG抗体(Jackson Immuno Research)を用いて結合を判定した。データをBD Accuri C6フローサイトメーター(BD Biosciences)で取得して、AccuriC6ソフトウェアを用いて解析した。蛍光強度をflagタグの発現に対して標準化した。結果を図8に示す。
Thermo Fisher Scientificより購入したNunc MaxiSorp(登録商標)平底96ウェルELISAプレートを、4μg/ウェルの終濃度で、組み換えヒトFGFR4(細胞外ドメイン、Fcキメラ;R&D Systemsより取得)でコーティングして、製造元の説明書に従って処理した。各ウェルをR&D Systems由来の1.2μg/mlの組み換えFGF−19とともにインキュベートして、その後に、示された濃度の抗−FGFR4抗体U4−3で処理した。インキュベーションおよび洗浄の後に、結合したFGF−19を、0.2μg/mlのビオチン化抗−FGF19抗体(R&D Systems)で検出して、その後に、アルカリフォスファターゼコンジュゲートストレプトアビジンとともにインキュベートした。AttoPhos(登録商標)AP Fluorescent Substrate System(Promega)とのインキュベーションにより酵素的反応を引き起こして、BMG LabtechのFluostar Omega蛍光プレートリーダーを用いて検出した。データは、U4−3が、受容体へのFGF−19の結合を効率的に競合することができることを示す。結果を図9に示す。
全長ヒトFGFR4を安定的に発現するL6細胞(ATCC)を、標準的な組織培養条件下(37℃、5%CO2)で、10%FBSを含むDMEMを用いて、12ウェル皿(1×105細胞/ウェル)にプレーティングした。翌日に、示された濃度の抗−FGFR4またはコントロール抗体を含む増殖培地で培地を置き換えた。1時間後、b−FGF(R&D Systems)を20ng/mlの濃度で、示されたウェルに添加した。10分間インキュベートした後、ホスファターゼ(Merck,Darmstadt,Germany)およびプロテアーゼ(Roche,Basel;Switzerland)の阻害剤を含むバッファー中にそれらが溶解される前に、ウェルを冷たいPBSで急いで洗浄した。サンプルは、最終的にゲル電気泳動に供して、その後に、Cell Signaling(Danvers,MA;U.S.A.)由来のホスホ−ERKおよびERKに対する抗体を用いて免疫ブロッティングをした(ニトロセルロース膜上)。バンドを検出して、適切な、蛍光標識された二次抗体と一緒に、Li−Cor(Lincoln,NE;U.S.A.)のOdyssey検出機を用いて定量化した。バンドは、Odysseyソフトウェアで定量化して、pERKおよび全ERK強度の間の比としてプロットした。図10(A)は代表的な免疫ブロットを示し、図10(B)はその後に定量化されたデータを示す。U4−3は、b−FGFが仲介するERKリン酸化の濃度依存的な阻害を示す。
3℃および5%CO2の標準的な条件下で、10%FBSを含むDMEM中で培養された、Huh−7細胞(JCRB Cell Bankから取得)を、60mm皿へ蒔いた(2×105細胞/皿)。翌日に、培地を取り除き、示されたとおりの抗−FGFR抗体U4−3(0.1、1、3および10μg/ml)またはコントロールIgGを含む、増殖培地で置き換えた。6日後に、細胞をPBSで2回洗浄して、IP溶解バッファー(Merck由来のホスファターゼ阻害剤およびRoche由来のプロテアーゼ阻害剤を含む)中で溶解させた。抗−FGFR4抗体(マウス)およびGE Healthcare Bio−SciencesのrProtein A Sepharose Fast Flowマトリックスを用いて、全FGFR4を免疫沈降した。マトリックスを洗浄して、サンプルを最終的に電気泳動により分離させた。タンパク質をゲルからニトロセルロース膜に移して、リン酸化チロシン残基(pFGFR4の検出)または全FGFR4を認識する抗体(Santa Cruz Dallas,TX;U.S.A.)でブロットして、サンプルの均等なローディングを確認した。適切な二次抗体およびLi−CorのOdyssey検出機を用いてバンドを検出した。代表的なスキャンを、免疫沈降に関して図11(A)に示し、全細胞溶解物の免疫ブロットに関して図11(B)に示す。バンドをスキャンした後に、FGFR4およびpFGFR4の間の比をOdysseyソフトウェアで判定して、図11(C)に見ることができるようにIgGコントロール値に対して標準化した。抗−FGFR4抗体U4−3は、試験した全ての濃度で、FGFR4リン酸化の強い阻害を示した。
ヒトFGFR4およびヒトFGF19を安定的に発現しているNIH3T3細胞を、10%のFBS、500μg/mlのG418および150μg/mlのハイグロマイシンを含むRPMI1640中で培養した。実験の初日に、2,000細胞を、示された濃度のU4−3またはU4−9抗体を含む96ウェルPrimeSurface Plate(Sumitomo Bakelite,Tokyo;Japan)の各ウェルに蒔いた。標準的な組織培養インキュベーター(37℃および5%CO2)での5日のインキュベーション後に、細胞増殖を、Perkin Elmer(Waltham,MA;U.S.A.)のVICTORプレートリーダーを用いてCellTiter−Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay(Promega)で判定した。値を未処置サンプルに標準化し、両方の抗体は、細胞増殖を70%よりも高く効率的に低減させた。IC50値を計算して、それぞれ24.7nMおよび10.6nM(U4−9)であると決定された。結果を図12に示す。
Huh−7細胞(JCRB Cell Bank)を、37℃および5%CO2の標準的な条件下で、10%FBSを含むDMEM中で培養した。細胞をPBS/0.05%トリプシンで回収して、上部寒天培地(イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、0.4寒天、20%FBS)中に再懸濁して、凝固させた下部寒天培地(IMDM中20%FBS、0.75%寒天)上に注意深く注いだ。96ウェルプレートの各ウェルは、2,000細胞を含んだ。ウェルを、抗−FGFR4抗体U4−3(最高濃度30μg/ml)またはコントロールIgG抗体の存在下でインキュベートして;コロニー形成を経時的に観察した(約3週)。Sigma(St.Louis,MO;U.S.A.)のMTT試薬を用いて生存細胞を染色して、Oxford Optronix(Abingdon;UK)のコロニー計数システムを用いてコロニーを定量化して、未処理のコントロールに対して標準化した。試験した抗−FGFR4抗体U4−3は、コントロール抗体と比較した場合、Huh−7細胞の濃度依存的な増殖阻害を示した。結果を図13に示す。
ZR−75−1細胞(CLS)を、10%FBS、10μg/mlインスリンおよび2mMグルタミンで補充されたRPMI1640中で培養した。実験の日に、2,000細胞を、示された量の抗体を含む培地中に、6ウェルプレートの各ウェルに蒔いた。培地および抗体を週に2回交換して、細胞を合計16日間培養した(37℃および5%CO2)。培地を最後に除去して、細胞を、0.5%クリスタルバイオレット溶液(Carl Roth,Karlsruhe,Germany)で染色した。目に見えるコロニーをコロニー計数システム(Oxford Optronix)でカウントして、いかなる処理も受けなかったウェル(NT)に対して標準化した。結果を図14に示す。U4−3は、コントロール処理と比較した場合、目に見えるコロニーの形成を、約50%効率的に阻害した。
MEM(10%FBS)中で培養した1000のMG−63細胞(ATCC)を、示された量の抗体を含む96ウェルPrimeSurfaceプレート(Sumitomo Bakelite)の各ウェルに蒔いた。標準的な組織培養インキュベーター(37℃および5%CO2)での5日のインキュベーション後、細胞増殖を、Perkin ElmerのVICTORプレートリーダーを用いてCellTiter−Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay(Promega)で判定した。結果を図15に示す。抗体U4−3は、細胞増殖を約25%低減させ;これは0.4μg/mlの濃度で既に見られた。
増殖阻害は、ミューリン腫瘍モデルにおいて、抗−FGFR4抗体により仲介された。雌NU/NUヌードマウスを、Charles River Laboratories(Boston,MA;U.S.A.)から取得した。誕生後6週に、動物に5×106Huh−7細胞を皮下注射した(マトリゲル中、BD Biosciences)。注射の14日後、同様の腫瘍体積を有する動物をプールして、腹腔内注射により抗−FGFR4抗体で処置した(q3d×3)。腫瘍体積(mm3)を、式[体積=0.52×(幅)2×(長さ)]を用いて、腫瘍接種後15、18、21および24日目に測定した。図16(A)は、Huh−7での処置の際の腫瘍増殖の用量依存的阻害、最大増殖阻害(25mpkの投与量で約68%が観察された)を示す。10mpkでは、U4−3およびU−4−9の両方とも、腫瘍増殖の同等の阻害を示した(図16(B))。同一の投与レジメンを用いてGT−13とU4−3を直接比較した場合、U4−3は優れた効能を示し、統計的に有意に、より良好に腫瘍増殖を阻害した(図16(C))。
実施例A:Huh−1腫瘍モデルにおける、抗−FGFR4抗体により仲介される増殖阻害。
雌Balb/cヌードマウス(5〜6週齢)を、5×106Huh−1細胞で皮下注射した。腫瘍サイズが150mm3に到達した後に、動物を、腹腔内注射[25mpk]により投与される抗−FGFR4抗体を用いて3週間、週に2回処置した。腫瘍体積(mm3)を、式(L×W2)/2を用いて、カリパスにより、示されるとおりに測定した。結果を図17(A)に示す。
Hep3B細胞を用いたこと、および、マトリゲル(BD Biosciences)を用いてそれらが移植されたことを除いて、上記のとおりに動物を処置した。腫瘍体積を、示された時間に、上述のとおりに決定した。結果を図17(B)に示す。
別の肝臓ミューリン腫瘍モデルにおける、抗−FGFR4抗体により仲介される増殖阻害。
雌BALB/cヌードマウスを、Shanghai Lingchang Bio−Technology Co.Ltd(LC,Shanghai,China)から取得した。誕生後7週に、動物を、0.1mlのPBS(マトリゲル中1:1、BD Biosciences San Jose,CA;U.S.A.)中、1×107SNU−761腫瘍細胞を皮下注射した。平均腫瘍サイズが119m3に到達したときに処置を開始した。抗−FGFR4抗体を5週間、週に2回、腹腔内注射により投与した。腫瘍体積は任意の所定の処置の有効性に影響し得るので、マウスを、それらの腫瘍体積に基づいて、無作為化されたブロックデザインを用いてグループに割り当てた。このことは、全てのグループが同等のベースラインを有することを確実にした。実験動物を割り当てるのに無作為化されたブロックデザインを用いることは、各動物が、任意の所定の処置群に割り当てられる可能性が同一であることを確実にさせて、したがって、体系的なエラーが最小限化された。腫瘍体積は、カリパスを用いて二次元で週に2回測定し、体積は、式:V=0.5a×b2(ここでaおよびbは、それぞれ腫瘍の長い直径および短い直径である)を用いてmm3で表わした。
患者由来の胃異種移植片腫瘍モデルGA0080における、抗−FGFR4抗体により仲介される増殖阻害。
雌BALB/cヌードマウス(8〜9週齢)を、Shanghai Lingchang Bio−Technology Co.Ltd(LC,Shanghai,China)から取得した。女性患者に由来するHuPrime(登録商標)胃癌モデルGA0080を、この効能試験に選択した。このモデルの病理は、適度−低度に分化された腺癌である。
ヒト結腸癌(SW620)異種移植片腫瘍モデルにおける、抗−FGFR4抗体により仲介される増殖阻害。
雌NMRIヌードマウス(5〜6週齢)を、Charles River GmbH(Sulzfeld,Germany)から取得した。100μl PBS中、5×106SW620腫瘍細胞(ATTC No.CCL−227)を、20匹の雌NMRIヌードマウスの左脇腹に皮下接種した。12日目に、約150〜200mm3の平均腫瘍サイズに到達した後、20匹の腫瘍を有する動物を、10匹の動物の2グループに、それぞれ腫瘍サイズに従ってブロック無作為化した。抗−FGFR4抗体U4−3を、1日目から38日目まで、13、17、20、24、27、31、34および38のスケジュールで、腫瘍を有するマウスに、腹腔内に週に2回投与した。腫瘍サイズを、上述のとおりに週に2回測定した。図20は、抗−FGFR4抗体U4−3での処置の際の、腫瘍増殖の阻害を示す。U4−3は、原発腫瘍の増殖の著しい阻害を示した。
Claims (36)
- ヒト抗体であって、
ヒトFGFR4のアミノ酸119〜248の間、好ましくはアミノ酸152〜240の間、より好ましくはアミノ酸230および240の間のエピトープに対して向けられる、
ヒト抗体、または前記抗体の機能性フラグメントまたは機能性誘導体。 - 請求項1の抗体であって、
FGFR4のIg様ドメイン2、具体的には、アミノ酸配列RYNYを含むエピトープに結合する、
抗体。 - 請求項1または2の抗体であって、
(i)以下を含む重鎖:
配列番号1〜6のいずれか1つに示される配列またはそれから1または2アミノ酸が異なる配列を有する重鎖相補性決定領域1(CDRH1)、配列番号7〜12のいずれか1つに示される配列またはそれから1または2アミノ酸が異なる配列を有する重鎖相補性決定領域2(CDRH2)、および/または、配列番号13〜20のいずれか1つに示される配列またはそれから1または2アミノ酸が異なる配列を有する重鎖相補性決定領域3(CDRH3)、および/または
(ii)以下を含む軽鎖:
配列番号21〜23および68のいずれか1つに示される配列またはそれから1または2アミノ酸が異なる配列を有する軽鎖相補性決定領域1(CDRL1)、配列番号24〜27のいずれか1つに示される配列またはそれから1または2アミノ酸が異なる配列を有する軽鎖相補性決定領域2(CDRL2)、および/または、配列番号28〜35のいずれか1つに示される配列またはそれから1または2アミノ酸が異なる配列を有する軽鎖相補性決定領域3(CDRL3)、
を含む、
抗体、またはヒトFGRF4上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。 - 請求項3の抗体であって、
配列番号1〜6のいずれか1つに示される配列を有するCDRH1、配列番号7〜12のいずれか1つに示される配列を有するCDRH2、配列番号13〜20のいずれか1つに示される配列を有するCDRH3、配列番号21〜23および68のいずれか1つに示される配列を有するCDRL1、配列番号24〜27のいずれか1つに示される配列を有するCDRL2、および、配列番号28〜35のいずれか1つに示される配列を有するCDRL3、
を含む、
抗体。 - 請求項1から4のいずれか一項の抗体であって、
(a)配列番号1に示されるCDRH1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH1配列、
(b)配列番号7に示されるCDRH2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号13に示されるCDRH3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH3配列、
を含む重鎖
および/または、
(d)配列番号21に示されるCDRL1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL1配列、
(e)配列番号24に示されるCDRL2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号28に示されるCDRL3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL3配列、
を含む軽鎖
を含む、
抗体、またはヒトFGFR4上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。 - 請求項1から5のいずれか一項の抗体であって、
(a)配列番号2に示されるCDRH1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH1配列、
(b)配列番号7に示されるCDRH2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号14に示されるCDRH3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH3配列、
を含む重鎖、
および/または、
(d)配列番号22に示されるCDRL1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL1配列、
(e)配列番号24に示されるCDRL2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号29に示されるCDRL3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL3配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトFGFR4上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。 - 請求項1から5のいずれか一項の抗体であって、
(a)配列番号3に示されるCDRH1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH1配列、
(b)配列番号8に示されるCDRH2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号15に示されるCDRH3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH3配列、
を含む重鎖、
および/または、
(d)配列番号23に示されるCDRL1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL1配列、
(e)配列番号25に示されるCDRL2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号30に示されるCDRL3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL3配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトFGFR4上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。 - 請求項1から5のいずれか一項の抗体であって、
(a)配列番号4に示されるCDRH1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH1配列、
(b)配列番号9に示されるCDRH2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号16に示されるCDRH3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH3配列、
を含む重鎖、
および/または、
(d)配列番号22に示されるCDRL1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL1配列、
(e)配列番号24に示されるCDRL2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号31に示されるCDRL3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL3配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトFGFR4上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。 - 請求項1から5のいずれか一項の抗体であって、
(a)配列番号5に示されるCDRH1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH1配列、
(b)配列番号10に示されるCDRH2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号17に示されるCDRH3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH3配列、
を含む重鎖、
および/または、
(d)配列番号22に示されるCDRL1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL1配列、
(e)配列番号24に示されるCDRL2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号32に示されるCDRL3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL3配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトFGFR4上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。 - 請求項1から5のいずれか一項の抗体であって、
(a)配列番号4に示されるCDRH1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH1配列、
(b)配列番号11に示されるCDRH2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号18に示されるCDRH3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH3配列、
を含む重鎖、
および/または、
(d)配列番号22に示されるCDRL1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL1配列、
(e)配列番号24に示されるCDRL2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号33に示されるCDRL3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL3配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトFGFR4上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。 - 請求項1から5のいずれか一項の抗体であって、
(a)配列番号6に示されるCDRH1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH1配列、
(b)配列番号12に示されるCDRH2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号19に示されるCDRH3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH3配列、
を含む重鎖、
および/または、
(d)配列番号22に示されるCDRL1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL1配列、
(e)配列番号26に示されるCDRL2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号34に示されるCDRL3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL3配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトFGFR4上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。 - 請求項1から5のいずれか一項の抗体であって、
(a)配列番号3に示されるCDRH1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH1配列、
(b)配列番号7に示されるCDRH2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号20に示されるCDRH3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH3配列、
を含む重鎖、
および/または、
(d)配列番号68に示されるCDRL1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL1配列、
(e)配列番号27に示されるCDRL2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号35に示されるCDRL3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL3配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトFGFR4上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。 - 請求項1から5のいずれか一項の抗体であって、
(a)配列番号3に示されるCDRH1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH1配列、
(b)配列番号8に示されるCDRH2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH2配列、および
(c)配列番号15に示されるCDRH3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRH3配列、
および/または、
(d)配列番号68に示されるCDRL1、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL1配列、
(e)配列番号27に示されるCDRL2、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL2配列、および
(f)配列番号35に示されるCDRL3、またはそれから1または2アミノ酸が異なるCDRL3配列、
を含む軽鎖、
を含む、
抗体、またはヒトFGFR4上の同一エピトープを認識するモノクローナル抗体。 - 請求項1から13のいずれか一項の抗体であって、
配列番号52〜59のいずれか1つに示される重鎖可変領域および/または配列番号60〜67のいずれか1つに示される軽鎖可変領域を含む、
抗体。 - 請求項1から14のいずれか一項の抗体であって、
Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)、フラグメント、Fvフラグメント、ダイアボディ、または単鎖抗体分子である、
抗体。 - 請求項1から15のいずれか一項の抗体であって、
IgG1−、IgG2−、IgG3−またはIgG4−型の、
抗体。 - 請求項1から16のいずれか一項の抗体であって、
前記抗体は、FGFR4シグナリングの阻害剤であり、具体的には、前記抗体は、FGRF4に結合するリガンドの阻害剤である、
抗体。 - 請求項17の抗体であって、
前記抗体は、FGFR4に対する、FGF1、FGF2、FGF4、FGF6、FGF8、FGF9、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21および/またはFGF23の結合を阻害する、
抗体。 - 請求項1から18のいずれか一項の抗体であって、
前記抗体は、FGFR1−3b、cに対して交差反応性がない、
抗体。 - 請求項1から19のいずれか一項の抗体を含むコンジュゲートであって、
前記抗体は、標識基および/またはエフェクター基、好ましくは治療基に連結されている、
コンジュゲート。 - IL−2に融合された請求項1から19のいずれか一項の抗体を含む、
融合タンパク質。 - 単離された核酸分子であって、
(a)請求項1から19のいずれか一項の、抗体、その抗体フラグメントまたは誘導体、または請求項20のコンジュゲートまたは請求項21の融合タンパク質をコードする、核酸配列、
(b)配列番号36〜43および配列番号44〜51のいずれか1つに示される核酸配列、
(c) (a)または(b)の配列のいずれか1つに相補な核酸配列;および、
(d) (a)、(b)または(c)に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸配列、
からなる群より選択される、
核酸分子。 - 請求項22の核酸配列を含むベクター、好ましくは発現ベクターであって、
前記核酸配列は、制御配列に動作可能に連結されている、
ベクター。 - 請求項22の核酸または請求項23のベクターを含む、
宿主。 - 請求項24の宿主であって、
ヒト、細菌、動物、真菌、両生類または植物細胞である、
宿主。 - 請求項25の宿主であって、
非ヒトトランスジェニック動物である、
宿主。 - 請求項1から19のいずれか一項の抗体、請求項20のコンジュゲートまたは請求項21の融合タンパク質を製造する方法であって、
請求項24から26のいずれか一項の宿主から、前記の抗体、抗体コンジュゲートまたは融合タンパク質を得るステップを含む、
方法。 - 医薬組成物であって、
請求項1から19のいずれか一項の抗体、請求項20のコンジュゲート、または請求項21の融合タンパク質、請求項22の核酸分子、請求項23のベクター、請求項24から26のいずれか一項の宿主、または請求項27の方法により生産される抗体を含む、
医薬組成物。 - 請求項28の医薬組成物であって、
さらなる活性剤を含む、
医薬組成物。 - 請求項1から19のいずれか一項の抗体、請求項20のコンジュゲート、請求項21の融合タンパク質、請求項22の核酸分子、請求項23のベクター、請求項24から26のいずれか一項の宿主、または請求項28から29のいずれか一項の医薬組成物であって、
FGFR4発現、過剰発現および/または機能亢進と関連する疾患の、診断、予防および/または治療での使用のための、
抗体、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主、または医薬組成物。 - 請求項30の使用のための、抗体、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主、または医薬組成物であって、
前記疾患は、過剰増殖性疾患である、
抗体、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主、または医薬組成物。 - 請求項31の使用のための、抗体、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主、または医薬組成物であって、
前記の過剰増殖性疾患は、好ましくは、肝細胞癌腫、乳癌、胃癌、結腸癌、横紋筋肉腫、前立腺癌、卵巣癌、軟組織肉腫、メラノーマ、頭頸部扁平上皮癌および肺腺癌からなる群より選択される癌、および、FGFR4を発現または過剰発現する他の癌、および腫瘍転移の形成である、
抗体、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、宿主、または医薬組成物。 - 代謝疾患、具体的には、メタボリック症候群または肥満の、診断、予防および/または治療での使用のための、
請求項1から19のいずれか一項の抗体、請求項20に記載のコンジュゲート、請求項21の融合タンパク質、請求項22の核酸分子、請求項23のベクター、請求項24から26のいずれか一項の宿主、または請求項28から29のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 左室肥大、心肥大または慢性腎臓疾患の、診断、予防および/または治療での使用のための、
請求項1から19のいずれか一項の抗体、請求項20のコンジュゲート、請求項21の融合タンパク質、請求項22の核酸分子、請求項23のベクター、請求項24から26のいずれか一項の宿主、または請求項28から29のいずれか一項の医薬組成物。 - FGFR4の発現、過剰発現および/または機能亢進と関連する症状の診断のための方法であって、
サンプルを、請求項1から19のいずれか一項の抗体、請求項20のコンジュゲートまたは請求項21の融合タンパク質と接触させるステップ、および、FGFR4の存在を検出するステップ、を含む、
方法。 - 請求項1から19のいずれか一項の抗体、請求項20のコンジュゲート、請求項21の融合タンパク質、請求項22に記載の核酸分子、または請求項23のベクター、および、さらなる抗悪性腫瘍剤を含む、
キット。
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