JP2017523439A

JP2017523439A - 位相と強度を変調した２重構造化照明

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Publication number: JP2017523439A
Application number: JP2017520041A
Authority: JP
Inventors: ベン−レビーメイア
Original assignee: オプティクス３ディーエルティーディー．
Priority date: 2014-06-29
Filing date: 2014-07-31
Publication date: 2017-08-17
Also published as: WO2016001910A1; US20150377777A1

Abstract

生細胞物体を撮像する方法および装置が提供され、該方法は、（ａ）２つの軸で位相変調した電磁波を生成するために、二次元の位相格子の周期パターンの電磁波の位相を変調する工程、（ｂ）物体の位相変調した電磁波照明をもたらすために、物体に対して位相格子の実像を投影する工程、（ｃ）周期パターンの位相を変えるために、２つの軸に沿って経時的に周期パターンの位置を変える工程、（ｄ）検出器に対して物体の実像を投影する工程、（ｅ）検出器を用いて物体の複数の画像を記録する工程であって、画像の各々は周期パターンとともに異なる位置に記録される、工程、および、（ｆ）照明によって９０度位相からずれた情報を抽出することによって、物体の合成画像を計算する工程を含む。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１４年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／０８１，６１３号の優先権とその利益を主張する。

本発明は３Ｄ撮像に関し、具体的には、物体内の屈折率の変動によって位相変化を引き起こすことができる位相を変化させる物体の三次元（３Ｄ）の撮像に関する。１つの実施形態では、本発明は生細胞の撮像に関する。従来、生細胞は、「位相差方法を実証し、とりわけ位相差顕微鏡の発明で」、１９５３年にノーベル物理学賞を受賞したフリッツ・ゼルニケ（参考文献１）によって発明された位相差顕微鏡法技術を駆使して二次元（２Ｄ）で撮像される。位相差顕微鏡は、位相を変化させる物体による光の回折を、像面での強度変化（差）に変換する方法で、光の光学経路に影響を及ぼすことによって、透明および無色の物体の差を強調し、それによって、センサー、カメラ、または人間の目で位相変化を撮像する／知覚することができる。位相差顕微鏡は、細胞または細菌内の成分を示すことができ、生細胞を死に至らしめる追加の化学染色料なしでは観察することが非常に難しい各成分のわずかに異なる屈折率を特徴としている。

ゼルニケがノーベル賞を受賞してから間もない１９６０年には、ゲオルゲ・ノマルスキーが、現在では単に微分干渉（ＤＩＣ）顕微鏡として知られているものを発明し、位相を変化させる物体を検出可能な別の技術を世に送り出している（参考文献２）。

位相変化のより正確な測定は、ＵＳ２０１４００８５７１５号（参考文献１０。同様に、参考文献８−９および１１を参照）などの定量的な位相イメージングとして知られているデジタルホログラフィーによって得ることができる。デジタルホログラフィーでは、一般に「物体波」として知られている平面波は、位相物体を通って（ゆえに物体波という）、「参照波」と呼ばれる別の平面波に干渉して、インターフェログラムとして知られている干渉パターンを形成する。物体の位相変化の結果として生じる物体波の位相の歪みは、インターフェログラムから分析および測定することができる。

現在の生細胞撮像は、蛍光標識を利用した共焦点顕微鏡を使用する。共焦点顕微鏡は１９５７年にマービン・ミンスキーによって発明され（参考文献３）、生細胞を含む生体対象の３Ｄ撮像で広く使用されている。共焦点顕微鏡法は、一般的にはレーザー源の点照明を使用する光学撮像技術であるが、標本中の焦点のずれた光を除去するためにＨｇアークランプや空間のピンホールを用いることもある。結果として、共焦点顕微鏡は、焦点深度内の薄層を２Ｄで撮像し、その後、多くの薄層から３Ｄ画像を再構成することを可能にする。

位相差とは異なり、共焦点顕微鏡は位相変化を撮像することができず、生細胞を撮像する能力は蛍光標識の使用に限定される。蛍光標識やバイオマーカーはそれ以外の方法では得ることができない重要な情報を提供することができるため、前述の限定は必ずしも欠点ではない。例えば、異なるフルオロフォアでタグ付け／標識化された２つの分子間の相互作用を示す技術である蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を実行すれば、生細胞の活性の一部として発生する化学反応の貴重な情報を得ることができる。しかしながら、光毒性（ｐｈｏｔｏｔｏｘｉｔｙ）として知られている共焦点顕微鏡法の性能を低下させる、生細胞撮像に関連する蛍光性の欠点もある（参考文献４）。蛍光に使用される化学薬品はそれ自体では毒性はないが、電磁波で照射されると、電子が高エネルギー値まで励起され、化学的に活発になり、一重項酸素（^１Ｏ_２）、超酸化物（^・Ｏ_２ ⁻）、または、ヒドロキシルラジカル（ＨＯ^・）などの試薬を形成する。前述の試薬はすべて有毒であり、生細胞の活性に影響を与える−または、完全に破壊する−こともある。蛍光の代わりに用いることができる他の方法はラマン散乱と冷光であるが、このような技術を使用することはまれである。

構造化照明は、生体物質の薄片を撮像するためのパターン化した照明強度を用いる光学技術であり、共焦点顕微鏡法と同様の３Ｄを提供することができる（参考文献５）。構造化照明は、共焦点顕微鏡または標準的な非干渉性の顕微鏡の回折限界と比較して、位置分解能を２倍に改善する能力を与える超分解能として知られている、共焦点顕微鏡法を上回る分解能の利点を有している。超分解能は、静的なパターンの照明を用いて、１９６３年にＬｕｋｏｓｚとＭａｒｃｈａｎｄによって発明された（参考文献６を参照）。静的なパターンは、物体の複数の点がそのパターンに従って低光強度を受け取り、したがって、結果として得られた画像はこれらの点でノイズが多くなりやすい傾向があるということを意味する。

米国５，８６７，６０４号（参考文献７）によって１９９５年に同じ著者に紹介されたこの問題点に対する解決策は、経時的にパターンの位相を変化させることであって、したがって、物体の点はすべて同じ強度で異なる時間に照射される。本明細書ですべて説明されるよう参照によって組み込まれる米国５，８６７，６０４号は、顕微鏡のような光学撮像系を開示しており、ここで、物体は、１つまたは２つの軸ｘおよびｙの照明強度の周期的なパターンで照射され、パターンの位相は経時的に変化する。米国５，８６７，６０４号の教示によれば、像面における検出器の出力信号Ｓを分析することで、照射によって位相を変化させるＳの成分である信号Ｓ_１と、照射によって位相から９０度変化するＳの成分である信号Ｓ_２を生成することができる。米国５，８６７，６０４号はさらに、光学撮像系の回折限界の２倍に拡張することができる拡張分解能（超分解能）によって、同相信号Ｓ１が画像として物体に関連付けられることを証明する数学的な解析を紹介している。この分析はさらに、位相信号Ｓ_２からの９０度のずれがヒルベルト変換した画像として物体に関連付けられ、拡張分解能も提供することを証明している。

本発明は、生細胞内の位相変化を撮像することによって、蛍光なしで完全にまたは部分的に行うことができる３Ｄと薄片の撮像を提供するものである。さらに、両方の画像が同じまたは近接する薄片で測定された情報を伝えるように、このような位相変化撮像はＦＲＥＴなどの蛍光撮像技術に接続することができる。

ヒルベルト変換画像は、反射、送信、または蛍光を撮像する際には重要な情報を提供せず、構造化照明顕微鏡法においてそのような画像を分析する動機づけを与えない。本発明によれば、ヒルベルト変換は、位相を変化させる物体を解像する理想的な方法として使用される。なぜなら、そのような物体は縁で屈折率を途切れさせる傾向があり、ヒルベルト変換は、物体内のそのような不連続線を強化するためのものである。しかしながら、共焦点顕微鏡法も構造化照明顕微鏡も位相変化を正確に撮像するのに十分なほど感度が良くないため、本発明は、米国５，８６７，６０４号のＳ_２のようにヒルベルト変換画像を抽出することができる顕微鏡設計を記載しており、さらに位相を変化させる物体に対して高感度である。

本発明によれば、物体を撮像するための撮像装置が提供され、撮像装置は、（ａ）対物面と像面、（ｂ）周期的なパターンで電磁波の強度を変調するのに適した強度格子である第１の格子であって、強度変調した電磁波を形成する、第１の格子、（ｃ）対物面に対して、第１の格子で強度変調した電磁波の光の第１の実像を投影するのに適した第１の光学撮像系、（ｄ）周期的なパターンで電磁波の位相を変調するのに適した二次元の位相である第２の格子であって、位相変調した電磁波を形成する、第２の格子、（ｅ）第１の光学撮像系によって投影された光の方向とは反対の方向に、対物面に対して、第２の格子で位相変調した電磁波の光の第２の実像を投影するのに適した第２の光学撮像系、（ｆ）像面に対して対物面で光を撮像するのに適した第３の光学撮像系であって、第１の光学撮像系によって照射されると対物面にある物体から後方に移動する光と、第２の光学撮像系によって照射されると物体を通る光とを撮像するのに適した、第３の光学撮像系、（ｇ）第３の光学撮像系によって撮像された光を捕らえるのに適した、像面にあるセンサー、および、（ｈ）第１の光学撮像系によって投影された電磁波と相互作用する物体の第１の合成画像を計算するように構成された、センサーに接続されたプロセッサであって、物体において第２の光学撮像系によって投影された電磁波と位相変化で相互作用する物体の第２の合成画像を計算するようにさらに構成された、プロセッサ、を含んでいる。

以下に記載される本発明の好ましい実施形態のさらなる特徴によれば、プロセッサは、物体による電磁位相変化と、位相変化以外の物体との電磁相互作用の画像を得るために、第１の合成画像と第２の合成画像を組み合わせるようにさらに構成される。

記載される好ましい実施形態のまたさらなる特徴によれば、プロセッサは、物体の蛍光標識と位相変化の画像を得るために、第１の合成画像と第２の合成画像を組み合わせるようにさらに構成される。

またさらなる特徴によれば、プロセッサは、物体の発光標識と位相変化の画像を得るために、第１の合成画像と第２の合成画像を組み合わせるように構成される。

またさらなる特徴によれば、プロセッサは、物体のラマン散乱と位相変化の画像を得るために、第１の合成画像と第２の合成画像を組み合わせるように構成される。

またさらなる特徴によれば、プロセッサは、強度変調した電磁波で９０度位相ずれした信号を抽出することによって、第３の合成画像を計算するようにさらに構成される。

またさらなる特徴によれば、第１の格子の周期パターンは、パターン位相を変化させるために経時的に変えられ、第２の格子の周期パターンは、パターン位相を変化させるために経時的に置き換えられる。

またさらなる特徴によれば、第１の格子の周期パターンと第２の格子の周期パターンは、１つのアクチュエーターによって変えられる。

またさらなる特徴によれば、第１の合成画像の計算は、強度変調した電磁波で位相の信号を抽出することによって行われ、第２の合成画像の計算は、位相変調した電磁波で位相から９０度ずれた信号を抽出することによって実行される。

別の実施形態によれば、生細胞物体を撮像する方法が提供され、該方法は、（ａ）２つの軸で位相変調した電磁波を生成するために、二次元の位相格子の周期パターンの電磁波の位相を変調する工程、（ｂ）物体の位相変調した電磁波照明をもたらすために、物体に対して位相格子の実像を投影する工程、（ｃ）周期パターンの位相を変えるために、２つの軸に沿って経時的に周期パターンの位置を変える工程、（ｄ）検出器に対して物体の実像を投影する工程、（ｅ）検出器を用いて物体の複数の画像を記録する工程であって、画像の各々は周期パターンとともに異なる位置に記録される、工程、および、（ｆ）照明によって９０度位相からずれた情報を抽出することによって、物体の合成画像を計算する工程を含む。

本発明は位相構造化照明によって先行技術の制限を克服するものであり、これは、電磁波の位相が２つの軸において周期パターンで構造化されている、振幅と位相を特徴とする電磁波を用いて、物体を照射する新規な撮像系である。本明細書では数学的解析が提供され、これは、位相構造化照明を適用すると、位相を変化させる物体のヒルベルト変換画像を抽出することができることを証明している。本発明は、物体の蛍光標識と位相変化の両方の画像を得るために、強度構造化照明を位相構造化照明と組み合わせるための方法と装置も開示している。

ほんの一例として、添付の図面を参照して、様々な実施形態が本明細書に記載されている。

本発明の撮像装置のハイレベルブロック図である。本発明の一実施形態にかかる撮像装置のレイアウト図である。ａ−ｄは様々な伝達関数である。

図面と添付の記載を参照して本発明の原理と操作をよりよく理解してもよい。

ここで図面を参照すると、図１は、本発明の撮像装置の光学機構のハイレベルブロック図を示す。第１の電磁波（１００）は、光強度の１つの周期パターンの強度格子（１０１）である第１の格子によって変調される。用語「強度格子」は、光の強度を変調することができる、振幅格子、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、またはデジタル光プロセッサ（ＤＬＰ）などの任意の光学素子に−と交互に−使用される。強度変調した電磁波は、ビームスプリッター（１０３）のようなビーム分割部品またはダイクロイックミラーを介して、第１の光学撮像系（１０２／１０４）によって物体（１１０）に投影される。すなわち、第１の光学撮像系は、第１の格子で強度変調した電磁波の第１の実像を、物体（例えば、生細胞または細胞）が配される対物面に投影する。対物面の照明強度Ｌ_ｍｎは、第１の電磁波を照射されるとき、以下のように書くことができる：

式中、強度関数Ｌ_ｍｎは、δ_ｘ、δ_ｙの周期で、ｘおよびｙにおいて周期的である。整数ｍ＝１．．．Ｍと、ｎ＝１．．．Ｎは、双方向矢印（１１１）によって一般的に表される、例えば、強度格子を移動させるか、あるいは、ＬＣＤまたはＤＬＰで作成されたパターンを電気的に移動させることにより経時的に変えることができるパターンの位相に関連する。ＨＨは、強度を変調し得る、δ_ｘ、δ_ｙの高調波を表す。方程式（１）は、例えば、Ｍ＝１およびδ_ｘ→∞であるとき、一次元の格子を記載することもできる。

第３の光学撮像系（１０４／１０５）はセンサー（１１３）で対物面の光を像平面に撮像する。センサー／検出器は、例えば、カメラ、ＣＣＤカメラ、または、画像を撮ることができる任意のタイプの検出器であり得る。第３の光学撮像系（１０４／１０５）は、物体（１１０）から（蛍光、散乱、冷光、または他の方法によって）、プロセッサ（１１４）に接続されたセンサー（１１３）へと、後方に反射した／（後方に）戻った／後方に移動した光を撮像する。第１の光学撮像系によって照射されると、光は物体（１１０）から後方に移動する。センサー（１１３）はＭｘＮの画像Ｉ_ｍｎ（ｘ、ｙ）撮り、その一方で、強度格子の位相は変化する。第１の光学撮像系によって投影された電磁波と相互作用する物体Ｓ_１の第１の合成画像は、変換を用いて、照明により位相の信号を抽出することによって（すなわち、物体を照射する強度変調した電磁波）、米国５，８６７，６０４号の教示にしたがって、プロセッサ（１１４）によって計算することができる：

ヒルベルト変換した物体Ｓ_２の第３の合成画像は、変換を用いて、照明によって９０度位相からずれた信号を抽出することによって（すなわち、強度変調した電磁波）、米国５，８６７，６０４号の教示にしたがって、計算することができる：

変調Ｓも計算することができる：

本発明は、波面の位相の周期パターンの位相格子（１０６）である、第２の格子によって変調された第２の電磁波（１１５）をさらに開示している。「位相格子」との用語は、位相格子のような任意の光学素子、特定の構造の液晶（ＬＣＤではない）、または、電磁光波の位相を変調可能な他の光学素子を指す−または、交互に用いて−ために使用される。位相格子は、周期パターンの電磁波の位相を変調することができ、それによって、位相変調した電磁波を形成する、二次元の位相格子である。第２の格子の周期パターンは、パターン位相を変化させるために、経時的に変えることができる。第２の光学系（１０７、１０８、１０９）（例えば、結像レンズ（ｔｕｂｅｌｅｎｓ）、折り重なる鏡、および、対物レンズ）は、第２の格子／位相格子で位相変調した電磁波の光の第２の実像を、対物面に投影することができる。光の第２の実像が投影される方向は、光の第１の実像が投影された方向とは反対の方向である。

位相変調波の最初の５つの格子を対物面上で第２の光学系（１０７−１０９）によって投影することで、以下の波動関数Ψ_ｍｎの物体（１１０）を照射する：

これを合計して以下の式にすることができる（数学的解析の詳細を参照）

ここで、ｉ^２＝−１は、「複素虚数単位（ｃｏｍｐｌｅｘｉｍａｇｉｎａｒｙｕｎｉｔ」である。物体を照らす波動関数Ψ_ｍｎは、距離Λ_ｘ、Λ_ｙの周期で、ｘおよびｙで周期的な位相変化を有している。σ（ｘ，ｙ）は波動関数であり、位相格子を照射するとともに、光学系（１０７／１０９）による投影後の、もともとの波（１１５）に関連付けられる。整数ｍ＝１．．．Ｍ’と、ｎ＝１．．．Ｎ’は、双方向矢印（１１２）によって一般に表わされる、圧電アクチュエーターのような機械式アクチュエーターによって位相格子を移動させる、あるいは、液晶上に作成されたパターンを電気的に移動させることによって、経時的に変化させることができる。本発明の１つの実施形態では、１つの機械式アクチュエーターは強度と位相格子の両方を移動させることができる。方程式５ａは、振幅と位相によって特徴付けられる電磁波を用いて物体を照射する、新しい撮像システムを示しており、波の位相は２つの軸の周期パターンで構造化される。

物体（１１０）を通る光線は、プロセッサ（１１４）に接続されたセンサー（１１３）に対して、第３の光学撮像系（１０４／１０５）によって撮像される。センサー（１１３）はＭ’ｘＮ’の画像を撮り、その一方で、位相格子（１０６）のパターンの位相は、（例えば、機械式または電気式のアクチュエーターによって）変えられる。ここで、第２の光学撮像系によって投影された電磁波と位相変化で相互に作用する、物体によって引き起こされたヒルベルト変換した位相変化の第２の合成画像Ｓ’_２は、方程式５ａの照明波パターンによって、および、変換を用いて、９０度位相からずれた信号を抽出することによって、以下に提示される新しい解析によって証明されるように、本発明の教示にしたがって計算することができる。

画像Ｓ_１およびＳ’_２を一緒に組み合わせて、Ｓ_１の（蛍光、冷光、または他の方法による）標識化またはラマン散乱撮像を用いて、あるいは、Ｓ’_２の（位相変化による）標識化撮像なしで、生細胞のあらゆる情報を得ることができる。標識化は生細胞にとって有毒なものとなり得るため、かつ、通常は、特定の分子と特定の化学的プロセスに非常に特有なものであるため、Ｓ’_２から与えられる追加の情報は貴重である。

必要に応じて、物体Ｓ’_１によって作成された位相変化の画像は、変換を使用して計算することができる：

式中、Ｓ’_１（ｘ、ｙ）は、方程式５ａの照明波パターンを含む位相の信号である。

以下の新しい解析は、本発明の教示に従って、位相を変化させる物体のヒルベルト変換撮像に対する数学的な証明を与えるものである。簡略化するために、理解しやすくするために、および、長い数学的な公式化を避けるために、モデルが１つの軸ｘで与えられる。２つの軸ｘ，ｙの延長は、単純に、所定の解析の同じ線に従っている。

図２は、本発明の実施形態にかかる撮像装置のレイアウト図を描いている。電磁波が位相格子（１１）（図１の位相格子（１０６）に似ているが、１つの軸にのみに減らされる）を通過し、一次格子が光学撮像系（１３）によって物体（１４）上に投影されると仮定する。位相格子のパターンは双方向矢印（１２）によって一般に表わされる方向に移動させることができる。ここで、物体は電磁波の振幅と位相を表す電磁波関数Ψによって照射され、Λと等しい基本周期を備えた周期的な位相変化を含む。

ここで、ｇ_０，ｇ_１は実定数ｉ^２＝−１であり、σは、和の両方の成分で現われる波動関数であり、これは、両方の成分が互いに干渉性であることを示している。位相Φ_ｋは時間Φ_ｋ＝Φ_０＋２π ｋ／Ｎ、および、ｋ＝１、２、．．．Ｎとともに変化させることができる。方程式７は次のようにも書くことができる：

物体が透明であって、物体内の屈折率の変化と関連付けられる位相変化によって電磁波に影響すると仮定すると、位相変化は複素関数Θ（ｘ）によってモデル化することができる：

式中、ξは空間周波数であり、Ｍ（ξ）Φ（ξ）は変調と位相である。物体によって作成された位相変化は小さく（わずかな障害条件）、近似値を使用することができると仮定される：

式中、Ｊ_０，Ｊ_１は０次および１次のベッセル関数である。Θ（ｘ）は次のように書くことができる：

そして、わずかな障害条件は、以下を意味する：

物体の実像は、検出器（１６）（例えば、カメラなどのセンサー）に投影される。検出器は物体の複数の画像を記録し、それぞれの画像は異なる位置／パターン相で、周期的なパターンの照射で記録される。プロセッサ（１７）は、１つの軸に減らした、方程式６の変換を用いることによって物体の合成画像を計算し、物体の位相変調電磁波照射により、９０度位相ずれした成分Ｓ’_２を抽出する。

目標：
分析の目標は、検出器（１６）によって像平面で検知された強度信号を、方程式６の変換を使用してプロセッサ（１７）で分析して、照射パターンを含む９０度位相ずれした成分のＳ’_２を引き出すことができること、および、成分Ｓ’_２が、空間周波数ξ＝０−最大値の帯域内で、物体によって誘発された位相変化Θ（ｘ）のヒルベルト変換として物体に関連付けられるということを証明することである。前述のものは以下の数式に言い換えることができる。

式中、Ｔ（ξ）は撮像系の伝達関数である。

証明：
物体（１４）を通過した後、電磁波関数は、以下の式で表すことができる。

そして、指数形式の方程式５を使用して、以下のものを受け取る。

図２の光学撮像系（１５）は、レンズ系の開口数によって定義されたカットオフ周波数まで、単位伝達を含むコヒーレント伝達関数Ｈ（ξ）の古典的なモデルによって、分析目的のために表される。簡略化のために、基本的な周期Λがカットオフ周波数も定義するように、証明は設計されているとさらに仮定する。

光伝達関数Ｈ（ξ）を用いて、１／Λよりも高いすべての空間周波数を除去することによって、像平面Ψ_１で波動関数を分析することができ、以下が得られる。

そして、検出器（１６）によって測定された像平面の強度は、以下と等しい。

エネルギーへの貢献が非常に小さい成分は、式（１２）で小さな障害の仮定を使用して、無視することができる。

１つの軸に減らす際の方程式６の変換によって、測定された強度から成分のＳ_２を抽出することができる。

および、方程式１９にしたがって強度を使用して、以下を得る。

したがって、方程式１３が証明される。
方程式２０の変換を行うために、較正の工程が必要であり、この工程において、初期の位相２πｘ／Λ＋φ_０が画像の各点で測定される。この較正は強度構造化照明について明らかである。なぜなら、格子が見られ、格子の位相が、例えば、物体が平面鏡である際にカメラの強度画像から分析されるからである。位相の線が強度画像には現われないため、位相格子の較正はより複雑である。しかしながら、強度画像Ｉ_ｋは、１／Λでの格子周波数よりも２倍高い空間周波数２／Λで、第２の高調波位相を用いて変調され、その結果、変換を用いて初期の位相を較正するための簡単な方法を提供し、

その後、以下を用いて位相を測定することができ、

式中、ａｒｇ｛Ｑ｝は、Ｑの独立変数（ａｒｇｕｍｅｎｔ）である。２つの軸ｘ−ｙ内で２次元の格子を較正するために同じ概念を適用することができる。

方程式１３の伝達関数Ｔ（ξ）は、方程式２１の定数Ｃであり、２／Λと等しいカットオフ周波数に達する。これは、方程式１６で表されるように、１／Λで光学撮像系（１５）のカットオフ周波数よりも２倍高い。これが暗示していることは、以前に達成されたよりも２倍高い位置分解能の改善（位置超分解能）（ｌａｔｅｒａｌｓｕｐｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）である。

図３のａ−ｄは様々な伝達関数を描いている。図３のｄは、方程式１６に記載されているような、図３のｃの回折の限定された、収差のないコヒーレント伝達関数と比較して、方程式２１に記載されているような位相構造化照明撮像装置の伝達関数を示している。図３のａは、回折の限定された非干渉性の光伝達関数を描いている。図３のｂは、米国５，８６７，６０４に記載されているような強度（振幅）構造化照明撮像系の伝達関数を描いている。

本発明は限られた数の実施形態に関して記載されているが、本発明の多くの変更、改良、および他の適用がなされてもよいことが企図されよう。したがって、以降に続く請求項で詳述されるような発明は、本明細書に記載の実施形態に限定されるわけではない。

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９．ＴａｋａｈｉｒｏＩｋｅｄａ， “Ｈｉｌｂｅｒｔｐｈａｓｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｆｏｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇｆａｓｔｄｙｎａｍｉｃｓｉｎｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｍａｙ１５，２００５／Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．１０／ＯＰＴＩＣＳＬＥＴＴＥＲＳ
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１１．ＳｈｗｅｔａｄｗｉｐＣｈｏｗｄｈｕｒｙａｎｄＪｏｓｅｐｈＩｚａｔｔ， “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎｐｈａｓｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｆｏｒｂｒｏａｄｂａｎｄ，ｓｕｂｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｈａｓｅｉｍａｇｉｎｇ”，Ｆｅｂｒｕａｒｙ１５，２０１４／Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．４／ＯＰＴＩＣＳＬＥＴＴＥＲＳ

Claims

物体を撮像するための撮像装置であって、
（ａ）対物面と像面、
（ｂ）周期的なパターンで電磁波の強度を変調するのに適した強度格子である第１の格子であって、強度変調した電磁波を形成する、第１の格子、
（ｃ）前記対物面に対して、前記第１の格子で前記強度変調した電磁波の光の第１の実像を投影するのに適した第１の光学撮像系、
（ｄ）周期的なパターンで電磁波の位相を変調するのに適した二次元の位相格子である第２の格子であって、位相変調した電磁波を形成する、第２の格子、
（ｅ）前記第１の光学撮像系によって投影された前記光の方向とは反対の方向に、前記対物面に対して、前記第２の格子で前記位相変調した電磁波の光の第２の実像を投影するのに適した第２の光学撮像系、
（ｆ）前記像面に対して前記対物面で光を撮像するのに適した第３の光学撮像系であって、前記第１の光学撮像系によって照射されると前記対物面にある物体から後方に移動する光と、前記第２の光学撮像系によって照射されると前記物体を通る光とを撮像するのに適した、第３の光学撮像系、
（ｇ）前記第３の光学撮像系によって撮像された前記光を捕らえるのに適した、前記像面にあるセンサー、および、
（ｈ）前記第１の光学撮像系によって投影された前記電磁波と相互作用する物体の第１の合成画像を計算するように構成された、前記センサーに接続されたプロセッサであって、前記物体において前記第２の光学撮像系によって投影された前記電磁波と位相変化で相互作用する前記物体の第２の合成画像を計算するようにさらに構成された、プロセッサ、を含む撮像装置。
前記プロセッサは、前記物体による電磁位相変化と、前記物体との位相変化以外の電磁相互作用の画像を得るために、前記第１の合成画像と前記第２の合成画像を組み合わせるようにさらに構成される、請求項１に記載の撮像装置。
前記プロセッサは、前記物体の蛍光標識と位相変化の画像を得るために、前記第１の合成画像と前記第２の合成画像を組み合わせるようにさらに構成される、請求項１に記載の撮像装置。
前記プロセッサは、前記物体の発光標識と位相変化の画像を得るために、前記第１の合成画像と前記第２の合成画像を組み合わせるように構成される、請求項１に記載の撮像装置。
前記プロセッサは、前記物体のラマン散乱と位相変化の画像を得るために、前記第１の合成画像と前記第２の合成画像を組み合わせるように構成される、請求項１に記載の撮像装置。
前記プロセッサは、前記強度変調した電磁波で９０度位相ずれした信号を抽出することによって、第３の合成画像を計算するようにさらに構成される、請求項１に記載の撮像装置。
前記第１の格子の前記周期パターンは、パターン位相を変化させるために経時的に置き換えられる、請求項１に記載の撮像装置。
前記第２の格子の前記周期パターンは、パターン位相を変化させるために経時的に置き換えられる、請求項１に記載の撮像装置。
前記第１の格子の前記周期パターンと前記第２の格子の前記周期パターンは、１つのアクチュエーターによって置き換えられる、請求項１に記載の撮像装置。
前記第１の合成画像の前記計算は、前記強度変調した電磁波で位相の信号を抽出することによって行われ、前記第２の合成画像の計算は、前記位相変調した電磁波で位相から９０度ずれた信号を抽出することによって実行される、請求項１に記載の撮像装置。
生細胞物体を撮像する方法であって、
（ａ）２つの軸で位相変調した電磁波を生成するために、二次元の位相格子の周期パターンの電磁波の位相を変調する工程、
（ｂ）物体の位相変調した電磁波照明をもたらすために、前記物体に対して前記位相格子の実像を投影する工程、
（ｃ）前記周期パターンの位相を変えるために、前記２つの軸に沿って時間における前記周期パターンの位置を変える工程、
（ｄ）検出器に対して前記物体の実像を投影する工程、
（ｅ）前記検出器を用いて前記物体の複数の画像を記録する工程であって、前記画像の各々は前記周期パターンとともに異なる前記位置に記録される、工程、および、
（ｆ）前記照明によって９０度位相からずれた情報を抽出することによって、前記物体の合成画像を計算する工程を含む、方法。