JP2017515509A - ワクチン用途のための高力価ウイルス様ベシクルの進化の方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年5月16日に出願された米国特許仮出願第61/994,161号に対して米国特許法第119条(e)の下で優先権を主張し、その出願はこれによってその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、National Institute of Healthにより授与された助成金R37 AI040357およびR01 AI45510の下で、政府の援助でなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
ワクチン接種は、公衆衛生の最大のサクセスストーリーの1つである。今日では、かつて小児の致死的疾患を引き起こしたウイルスの多くに対して防御をもたらすワクチンが、世界中で日常的に用いられている。しかしながら、ウイルスの不活性化または弱毒化を用いる典型的なワクチン開発法は、最も致命的なヒト病原体の一部に対しては失敗しており、新たなアプローチを必要としている。分子ウイルス学の進歩は、ウイルスの遺伝子操作を可能にし、ワクチン開発の新たな機会を開いている。ウイルスの遺伝子改変は、その弱毒化を可能にするだけではなく、他のウイルス由来の配列を取り込み、ある病原体を別の病原体のワクチン担体に変えることも可能にする。ウイルスベクターは、抗体(B細胞)、ヘルパーT細胞(CD4+T細胞)、および細胞傷害性Tリンパ球(CTL、CD8+T細胞)が媒介する免疫を含む広範囲の免疫応答を刺激するという点で典型的なワクチンに対する利点を示すことから、ワクチンを送達するための有望なツールとして研究されている。これらのウイルスベクターワクチンは、種々の感染性疾患および悪性疾患に対して使用することができる(Polo and Dubensky, Jr.Drug Discov Today. 2002, Jul 1;7(13):719-27(非特許文献1); Small and Hildegund, Curr Opin Virol. 2011, October 1; 1(4): 241-245(非特許文献2))。しかしながら、ウイルスベクターに基づくワクチンの使用には制限が存在する。例えば、ウイルスベクターに対する既存の抗ベクター免疫は、ワクチンを不活性化する可能性があり、関心対象の導入遺伝子のクローニング能を限定するという問題を提示する。この技術の効率を改善し、その制限を克服するために、非常に多くの研究が進行中である(Nayak and Herzog. Gene Therapy, 2009, 17 (3): 295-304(非特許文献3))。
本発明は、アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドウイルスベクターの組成物およびその使用の方法を提供する。本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターのアルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列は、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A 、A-10427-G 、G-11560-A 、A-11871-GおよびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうち少なくとも2つを含み、本発明のベクターは、アルファウイルス構造タンパク質をコードする機能的ヌクレオチド配列を欠いている。さらに、本発明のベクターを細胞培養において増やすと、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位(pfu)の力価のウイルス様ベシクル(VLV)が得られる。
本発明は、進化したウイルス様粒子(VLV)が、以前に記載された(米国特許出願第12/747,59号; Rolls et al., 1994. Cell 79:497-506およびRolls et al., 1996. Virology 218:406-41)VLV粒子より、はるかに高力価(1000倍以上)になり、かつ外来遺伝子をより安定に発現できるという予想外の発見に関する。よって、本明細書に記載の種々の態様において、変異アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列、変異非アルファウイルス構造ヌクレオチド配列、および真核生物プロモーターをコードするDNAを含み、高力価VLVを産生する、進化したハイブリッドウイルスベクターワクチンの作製に関する組成物および方法が開示される。加えて、本発明には、VLVを選択する組成物および方法、特定の疾患または障害を処置するおよび/または予防するまたはそれに対する免疫性を与える方法、ならびに本発明のVLVを投与した対象におけるメモリーT細胞免疫応答およびメモリーB細胞免疫応答を誘導する方法が含まれる。
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の任意の方法および材料が、本発明の試験の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法が、本明細書に記載されている。本発明を説明および特許請求する中で、以下の用語法を使用することになる。
組成物
本発明は、図1に示されている高力価ハイブリッドウイルスベクターの発見に、一部基づく。ベクターは、表1に示されているような、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含む、アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含む、DNA配列を含む。これらの配列は、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに対応する第2のプロモーター配列を特定するDNAに機能的に連結されている。この配列は、次に、水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質をコードするDNAに機能的に連結されている。ベクターは、アルファウイルス構造タンパク質をコードする機能的なヌクレオチド配列を欠いている。ベクターを細胞培養において増やす際には、高力価のウイルス様ベシクル(VLV)が得られ、例えば、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位(pfu)の力価が得られる。
本発明において、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターは、本発明で有用な任意の異種タンパク質をコードしてもよく、本発明のハイブリッドウイルスベクターにタンデムに挿入される1つより多い異種タンパク質をコードしてもよい。典型的には、異種タンパク質は、ペプチド断片、ポリペプチド、タンパク質、または融合タンパク質である。任意で、異種タンパク質は、対象へのベクターの投与の後に対象において異種タンパク質に対して細胞媒介免疫応答が誘導されるのに適している。
本発明のベクターは、種々の適用において、疾患に対する免疫性を対象に与える、および/または対象における疾患を処置する、予防する、もしくは疾患のリスクを減少させるのに有用なVLVを生じさせるのに有用である。
本発明のVLVは、薬学的組成物として製剤化され得る。
投与のレジメンは、有効量を構成するものに影響を及ぼし得る。例えば、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターは、単一用量で、いくつかの分割された投薬量で、対象に投与されてもよく、および、時差的な投薬量が、毎日もしくは逐次的に投与されてもよく、または、用量は、継続的に注入されてもよく、もしくはボーラス注射であってもよい。さらに、投薬量は、治療的または予防的状況の緊急性によって示されるように、比例して増大または減少させてもよい。
1つより多い経路を投与のために使用することができるが、特定の経路が、別の経路よりも即時のかつ有効な反応を提供できることを、当業者は認識しているであろう。本発明の組成物のいずれかの投与の経路は、吸入、経口、鼻、直腸、非経口、舌下、経皮、経粘膜(例えば、舌下、舌、(経)頬、(経)尿道、膣(例えば、経膣的および膣周囲的)、鼻(内)、および(経)直腸)、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、クモ膜下腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、ならびに局所投与を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載されているような、所与の疾患、障害、もしくは状態、またはその症状を処置、予防、または改善するためのキットであって、a)本明細書に記載されているような化合物または組成物;および任意でb)本明細書に記載されているような追加の作用物質または療法を含むキットが、提供される。キットは、疾患、障害、または状態を処置、予防、または改善するようにキットを使用するための説明書または標識を、さらに含むことができる。なおさらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されているような、所与の疾患、障害、もしくは状態、またはその症状についてのアッセイのためのキットにまで及ぶ。そのようなキットは、例えば、PCRもしくは他の核酸ハイブリダイゼーション技術(マイクロアレイ)由来の試薬、または免疫学に基づく検出技術(例えば、ELISpot、ELISA)用の試薬を含有し得る。
プラスミドDNA内でのp50 VLVゲノムの再構築
Life TechnologiesからのSuperScript III RT-PCRキットおよび15 DNAプライマー対をp50VLV由来のRNAと共に用いて、p50 VLVゲノムをカバーする、オーバーラップするdsDNA断片を作製した。断片の配列を決定し(Yale Keck Facility)、DNAstarソフトウエアを用いてアセンブルした。プラスミドpBK-SFVG-E660GagからのSIV gag遺伝子を、SFVキャプシドタンパク質をコードする合成遺伝子と置換することによって、プラスミドpCMV-SFVG-CAP(図1A〜1B)を作製した。p50 VLVゲノム配列中に見られる1,672ヌクレオチド欠失を、Bpu10I〜SpeI部位に及ぶ合成DNA断片を用いてpCMV-SFVGCAP中に導入した(図5)。残りの変異を、p50 VLV RNAからRT-PCRによって調製した図示した制限断片を用いて段階的に導入した。部位特異的変異を、Agilent TechnologiesからのQuik-Change II突然変異誘発キットを用いて作製した。
p50 VLVの力価を、BHK-21(ATCC CCL 10)細胞単層に対する段階的希釈および標準的な2-dプラークアッセイを用いてルーチン的に測定した。低力価VLVプラークを解剖顕微鏡を用いて計数し、その力価を間接免疫蛍光顕微鏡法を用いて測定し、感染中心におけるVSV Gタンパク質発現を検出した。
5%(wt/vol)FBSを含むDMEM中のおよそ107個のBHK-21細胞を10のMOIでp50 VLVに感染させ、37℃にて24時間インキュベートした。次いで、培地を800×gにて5分間遠心分離し、細胞および細胞デブリを取り除いた。次いで、10 mlの培地を28 mLの10%(wt/vol)スクロースを含むPBS上に層状にし、Beckman SW28ローターで25,000 rpmにて1.25時間遠心分離した。VLVのペレットを200 μLのPBSで再懸濁し、次いで、4.5 mLの10%スクロースを含むPBS上に層状にし、Beckman SW41ローターで40,000 rpmにて1時間遠心分離した。ペレットを100 μLのPBSで再懸濁した。VSVビリオンを並行して増殖させかつ精製し、SDS/PAGEゲル電気泳動用のマーカーを提供した。
上述のように調製したVLV(およそ5 μL)を、プラズマイオン化により疎水化された、カーボン被覆EMグリッドに塗布した。グリッドを1%グルタルアルデヒドで2分間固定し、続いて、PBS(pH 7.4)および水で洗浄し、次いで、2%(wt/vol)酢酸ウラニルで染色し、風乾した。免疫金標識のために、試料を、1%BSA含むPBSでプレインキュベートしたグリッドに塗布した。グリッド上の未固定の試料を、VSV Gに対するマウスモノクローナル抗体と共に直接インキュベートし、1%BSAを含むPBSで洗浄し、12 nm金粒子にコンジュゲートしたロバ抗マウスIgG(Abcam)と共にインキュベートした。次いで、グリッドを洗浄し、2%(wt/vol)リンタングステン酸で染色し、次いで、乾燥させた。グリッドをFEI 120kV透過型電子顕微鏡で検分した。電子画像をGatan 4k×4k CCDカメラで取得した。
組織培養における大規模な継代を通して、進化後に高力価になるVLVを生じるために、図1A〜図1Bに図示した出発DNA構築物を使用した。この構築物を用いて生じたSFVレプリコンRNAは、第1のサブゲノムプロモーターからVSV Gを、および第2のプロモーターからSFVキャプシドタンパク質を発現する。この構築物から感染性粒子が導き出され、VLVに典型的な低力価(およそ105感染単位/ml)を呈することが見出された。より高い力価になるであろう粒子を進化させることが可能であるかどうかを判定するために、BHK細胞上でのVLVの継代を1年の期間にわたって追跡した。最初の継代において、細胞変性効果(CPE)を示す細胞由来の培地の5%を、6 cmディッシュ上の新鮮なBHK細胞の上に移し、次いで、強いCPEが3〜5日までに発生した。SFVキャプシドタンパク質の発現は、継代8までに完全に失われ、その発現が粒子産生を阻害していたことが示唆された。連続した継代に伴って、粒子力価の増大、および24時間未満でのずっとより急速なCPE発生が認められた。継代50までに、VLVは、5×107 pfu/mlより高い力価に達するように進化し、2日後にBHK細胞上に変動するサイズの目に見えるプラークを形成した。この時点で、大きなプラークを選択し、その後「p50 VLV」と呼ばれることになるクローン化したVLVストックを生じるために使用した。このp50 VLVは、出発ベクターをおよそ1000倍上回る増大である、およそ108 pfu/mlの力価になる。
p50 VLV中にどのタンパク質が存在するか決定するために、BHK細胞を10 cmディッシュ上でおよそ10の感染多重度(MOI)でp50 VLVまたはVSVに感染させた。細胞が大規模な CPEを示した24時間後に、培地中のVSV粒子またはVLVを2回の超遠心分離により精製した。次いで、VLVおよびVSV粒子中のタンパク質をSDS-PAGE、続いて銀染色によって分析した。図2に示すように、VSVビリオン粒子は5種類のタンパク質N、P、M、GおよびLを含んだ一方で、精製したp50 VLV粒子は唯一の明らかな構造タンパク質としてVSV Gタンパク質を含んだ。SFVキャプシドタンパク質(29.8 kDa)の痕跡は存在せず、初期継代時にその発現が失われていることと一致した。p50 VLVに感染した5×106 BHK細胞からのVLVタンパク質の総収量はおよそ20 μgであり、VSVに感染した同じ数の細胞は約60 μgの総ウイルスタンパク質を生じた。未感染のBHK細胞由来の培地からは測定可能なタンパク質収量は回収されなかった。
タンパク質特性解析のために用いられる精製した粒子を、グルタルアルデヒド固定化および酢酸ウラニルによるネガティブ染色の後に透過型電子顕微鏡検査(TEM)により撮像した。例を図3A〜3Cに示す。粒子の多くは、その表面上にタンパク質スパイク、おそらくVSV Gタンパク質(VSVG)を有しているように見えた(矢印)。この方法によってTEM用に調製された粒子の一部は、壊れて、核酸を放出しているようにも見えた(図3C)。
VSVと比較してp50 VLVの増殖速度を試験するために、従来の一段増殖曲線(図4A)を行った。細胞をp50 VLVまたはVSVいずれかに10の感染多重度(MOI)で感染させ、次いで、投入粒子を取り除き、次いで、試料を指定した時間で培地から取り出し、プラークアッセイにより力価を測定した。VLVの増殖速度は、感染後12時間で最大力価に達するVSVと同様であった。VLV力価はVSVより約8〜10倍低く、その小さなプラークサイズと一致した(図4B)。
p50 VLVゲノムのコンセンサス配列を決定するために、逆転写およびPCRを行って、ゲノム全体をカバーする、オーバーラップするDNA断片を生じ、次いで、これらの断片を配列決定した。アセンブルした配列は、(ヌクレオチド13333と13334との間に位置するベクター欠失において)1672ヌクレオチドの大きな欠失を明らかにし、これにより、第2のSFVプロモーター、キャプシド遺伝子全体、および、ポリ(A)の前のSFV配列の187ヌクレオチド以外のすべてが除去されていた(図1)。
*アミノ酸は、SFV nsP1〜4ポリタンパク質において、またはVSV Gタンパク質において番号付けされている。太字で下線のテキストは、変化したアミノ酸を示す。
プラスミドDNA内で高力価p50 VLV配列を再構成し、かつどの配列変化がp50 VLVの高力価表現型を生じさせるのに関与しているか決定するために、p50 VLV配列の段階的再構築をDNA起動ベクターにおいて開始した(図5)。最初に、「1672」ヌクレオチド欠失を、欠失を含む合成DNA断片を用いてプラスミド内に導入した。この断片は、pCMV-SFV-GCAPの唯一のBpu10I部位およびSpe I部位の間に挿入され、pCMV-SFVG-Δ1672を生じた。この構築物は、高力価VLVを産生せず(わずか2×105/ml)、欠失はVLV力価を増加させるのにわずかな効果しか有していなかったことを示した。次いで、p50 VLV RNAの逆転写およびPCRを用いて、示した制限部位、EcoRV-BstEII、BstEII-BglII、およびBglII-Bpu10Iに及ぶDNA断片を作製した。次いで、p50 VLV変異を含むこれらの断片を用いて、pCMV-SFVG-Δ1672プラスミドDNA中の対応する断片を置換し、R1、R2、R2,3 および R1,2,3と表示される組換え体を作製した。すべての構築物を配列決定し、p50 VLVコンセンサスに合致しなかったすべての構築物を廃棄した。興味深いことに、細胞の上へのこれら初期組換え体のトランスフェクション後に、それらは様々な力価を生じたが、いずれも高力価p50、プラーク形成VLVを生じなかった。しかしながら、変異のすべてを一緒に組換え体R1,2,3(pCMV-SFV-G-p50Rと表されるプラスミド)の中に入れると、高力価表現型が回復した。これらの結果は、進化した変異の何らかの組み合わせが高力価表現型を生じるのに必要とされることを示唆した。それらはまた、変異のサブセットの取り込み(例えば、R1組換え体内に)が複製に有害であることも示した。VSV G外部ドメインにおける変異N34Dが高力価 VLVの作製に必要とされないことも後の構築物において決定された。
SFVレプリコンからのVSV Gタンパク質の発現によって生じるVLVの以前の研究では、もっと低い力価の感染性ベシクルを生じさせるメカニズムは決定されなかった(米国特許出願第12/747,59号; Rolls et al., 1994. Cell 79:497-506およびRolls et al., 1996. Virology 218:406-411)。可能性のある説明は、それらは、細胞変性液胞(CPV)内の小球体と呼ばれる膜陥入において大部分が見られるが、時折細胞表面上にも見られるSFV複製複合体から生じるというものであった(Froshauer et al., 1988. The Journal of Cell Biology 107:2075-2086; Grimley et al., 1968. Journal of Virology 2:1326-1338)。より最近の研究は、SFV小球体は最初に細胞表面で形成され、次いで、エンドサイトーシスによって取り込まれ、最終的には、細胞質内のCPV中に蓄積されることを示している(Spuul et al., 2010. Journal of Virology 84:7543-7557)。
細胞表面から出芽する多くのエンベロープウイルスは、多胞体内に出芽するベシクルにカーゴをソーティングするために細胞が通常用いる、細胞出芽機構(ESCRT複合体と呼ばれる)をリクルートする(Votteler and Sundquis, 2013. Cell host & microbe 14:232-241; Weiss, E. R., and H. Gottlinger, 2011. Journal of molecular biology 410:525-533)。これらのウイルスは、出芽部位にESCRT複合物の成分をリクルートするその内膜タンパク質中に後期ドメインと呼ばれる配列モチーフを有する。これらのモチーフにおける変異は、細胞からのウイルス粒子の不完全な出芽、および膜性のくびれ部分による保持をもたらす。低力価VLVは細胞表面上に多数の小球体を保持しているように見えることから、p50 VLVゲノムにおける配列変化を調べ、継代がSFV非構造タンパク質のいずれかの後期ドメイン配列について選択されているかどうかを決定した。実際、nsP1における4つの変異のうち1つは、nsP1のC末端の近くでアミノ酸配列PIAPをPTAPに変えていることが見出された(表1)。P(T/S)APは、タンパク質tsG101に結合し、ESCRTタンパク質複合体のリクルートを開始し、ウイルス出芽を促進する、内部ウイルス膜タンパク質中の共通モチーフであり、nsP1は、nsP1、2、3および4の複合体からなるSFV複製複合体の膜アンカーである。
ユビキチン化は多くの場合、カーゴの多胞体(MVB)へのソーティングに関与し、MG-132などのユビキチン化の阻害剤は多くの場合、MVB/ESCRT経路を乗っ取るウイルス(例えば、HIV)の出芽を阻害する(Taylor et al., 2007, Journal of Virology 81:13631-13639; Weiss and Gottlinger, 2011, Journal of Molecular Biology 410:525-533)。この概念を用いて、p50 VLVへの感染後の細胞のMG-132処理が高力価p50 VLVの産生を55倍阻害することを示した。この阻害は、p50 VLVがESCRT経路を用いて出芽を促進するという考えと一致した。実験は以下のように行った:BHK細胞をp50 VLV(10 pfu/細胞)に1時間感染させ、洗浄し、次いで、100 uM MG-132の存在下または非存在下で24時間インキュベートした。次いで、VLV力価をプラークアッセイにより決定した。
図5に示すR1組換え体により得られた結果は、PTAPモチーフは高力価VLVを生じさせるのに十分ではないことを示唆する。しかしながら、この解釈は、他の変異の非存在下で有害である可能性のあるnsP1における他の3つの変異およびnsP2における1つの変異の存在によって複雑になる。PTAP変異が高力価粒子産生に必要であるかどうかを決定するために、完全に再構成されたp50ベクター(pCMVSFVG-p50R、図5)においてPTAPモチーフだけを変異し、元のPIAP配列に戻した。次いで、BHK細胞上へのトランスフェクション後のPIAP構築物およびPTAP構築物について得られた力価を比較した。トランスフェクション後48時間後に得られた力価は、PIAPでは1.2×106 i.u/mlおよびPTAPでは1×108 i.u./mlであり、高力価の生成におけるPTAPモチーフの重要な役割が示された。
ワクチンベクターとしてVLVを用いる以前の研究では、第2のサブゲノムmRNAプロモーターから外来遺伝子が発現することが見出された(Rose et al., 2008. PNAS 105:5839-5843; Schell et al., 2011. Journal of Virology 85:5764-5772)。外来遺伝子の発現は多くの場合、VLVのわずか2〜3継代の後に失われることも見出された(Rolls et al., 1996. Virology 218:406-411; Rolls et al., 1994. Cell 79:497-506)。喪失は典型的には、第2のプロモーターおよび第2の遺伝子の一部または全部を含む欠失を伴った。VLVにおけるより優れた遺伝子安定性を生じさせることが可能かどうか決定するために、一本のmRNAにおいて必須G遺伝子の発現と非必須外来遺伝子の発現とを連結させることに基づく、新たな戦略を開発した。外来タンパク質およびVSV Gの等モル発現を得るために、2つのオープンリーディングフレーム(ORF)を、ゾセア・アシグナウイルス由来の18アミノ酸T2Aペプチドで分離して連結させた(Szymczak et al., 2004. Nature Biotechnology 22:589-594)。このペプチドおよび他の関連ペプチドは、一本のmRNAから複数のタンパク質を発現させるために用いられている(Szymczak-Workman et al., 2012. Cold Spring Harbor protocols 2012:199-204)。これらのペプチドは当初、自己切断性であると考えられていたが、現在では、それらはリボソームの「スキッピング」を引き起こすと考えられる。リボソーム機能は、GlyおよびPro間のペプチド結合形成を妨げるペプチドによって改変され、上流タンパク質の放出を引き起こすが、下流ペプチドの連続的な翻訳は可能にする(Szymczak-Workman et al., 2012. Cold Spring Harbor protocols 2012:199-204)。VSV Gの上流に外来遺伝子を置くことによって、上流リーティングフレームの発現を維持する強力な選択となるはずである。
で分離してVSV G遺伝子ORFの上流にサル免疫不全ウイルス(SIV)gag遺伝子ORFを置くことにより試験した。この発現カセットを、単一のサブゲノムSFVプロモーターの後ろの単一G遺伝子に代えてpCMV-p50Rベクターにクローン化した。この構築物から回収したVLVは、少なくとも108 pfu/mlの力価を生じ、このことは、追加の遺伝子の発現がVLV力価を有意に低下させなかったことを示した。VLVに感染した細胞からのGagおよびGの発現を、SIV GagおよびVSV Gに対する抗体を用いてSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングにより検証した(図8B)。Gag上のT2AペプチドのC末端伸長は、別のサブゲノムプロモーターから発現させたGagと比較すると、GagおよびGag切断産物の移動度を減少させた(図8B)。別のプロモーターからGagを発現するVLVは、わずか5継代後にGag発現の喪失を示したが、T2AペプチドによりGに連結させ発現させたGagは少なくとも10継代の間安定していた。
本発明のワクチン接種試験において、低力価VLVまたは高力価VLVによる鼻腔内経路または筋肉内経路を用いたとき、マウスにおいて体重減少または他の発症の徴候は観察されなかった。高力価VLVの毒性の可能性についても、マウスの尾静脈内に5×106 PFUを注入することにより試験した。体重減少、行動修正、および他の神経機能障害の徴候はマウスにおいて観察されなかった。高力価VLVに関連する神経毒性の可能性についても、頭蓋内(IC)経路により試験した。成体マウス(n=5)に、Hamiltonシリンジを用いて、脳の左前頭葉内に105 PFUのVLVを定位的に注射した。マウスは6週間観察され、いかなる神経機能障害の徴候もいかなる他の有害な徴候もなく健康な状態を保った。これに対し、この経路により投与されたVSVは10 PFUですら、10日以内に致死性の脳炎を引き起こす。よって、粒子上にVSV Gタンパク質が豊富であるにも関わらず、おそらく、そのインビボでの複製は非常に限定されているために、粒子は脳において病原性を有さない。実際のエンベロープRNAウイルスとは異なり、これらのVLVはそのRNAを保護するヌクレオキャプシドを欠いており、自然免疫応答により非常に迅速に制御されるものと思われる。
高力価VLVが免疫原性を保持するかどうかを決定するために、マウスに106または105プラーク形成単位(PFU)いずれかで筋肉内にワクチン接種し、28日後にVSVに対する中和抗体(nAb)について血清を試験した。この単回ワクチン接種後に、VSV nAb力価は平均して、1:960(106 PFU群)および1:640(105 PFU)であった。ワクチン接種しなかったマウスは検出可能なnAbを有さなかった(<1:20)。これらの結果は、継代したVLVが強力なnAb反応を生じる能力を保持していたことを示す。
図9A〜9Cは、高力価VLV粒子の生成のモデルを示す。図9Aは、VSV GをコードしないSFVレプリコンは最初に、形質膜にて電球形の小球体に形成されることを示す。次いで、これらの小球体はエンドサイトーシスによって急速に取り込まれ、最終的に、SFVレプリコンを含む細胞中に見られる古典的な細胞変性液胞(CPV)中に蓄積される(Spuul et al., 2010. Journal of Virology 84:7543-7557)。表面にVSV Gを発現するSFVレプリコンの場合には、小球体のエンドサイトーシスはおそらくVSV Gによって阻害され(Whitaker-Dowling et al., 1983. Virology 131:137-143; Wilcox et al., 1983. The Journal of Cell Biology 97:1444-145)、その結果、図9Aおよび9Bに見られるように細胞表面上に捕捉される小球体のレベルが高くなる。これらの小球体は効率的に発芽することができないが、時折、細胞表面から放出され、隣接細胞に感染する。VLVの大規模な継代の後、SFV nsP1タンパク質のC末端近くの「後期ドメイン」PTAPモチーフを生じさせる1つの変異を含む、複数の変異が選択された。この変異は、細胞表面からのVLVの放出を引き起こしたために選択された。nsPタンパク質におけるさらなる変異は、おそらくESCRT複合体に対するPTAPモチーフの曝露を高めて、細胞表面から小球体を急速に切断させることによって(図9C)、より高い水準の粒子産生に寄与する可能性がある。
Claims (52)
- アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドウイルスベクターであって、
該アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列が、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含み、
該ベクターが、アルファウイルス構造タンパク質をコードする機能的ヌクレオチド配列を欠いており、
さらに、該ベクターを細胞培養において増やす際に、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位(pfu)の力価のウイルス様ベシクル(VLV)が得られる、
高力価ハイブリッドウイルスベクター。 - アルファウイルスがセムリキ森林ウイルス(SFV)である、請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
- サブゲノムRNAプロモーターがセムリキ森林ウイルス(SFV)プロモーターである、請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
- 2A DNAが、ゾセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルスDNAであり、かつT2Aペプチドをコードする、請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
- 請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターによって生じたレプリコンRNAを含む、ウイルス様ベシクル(VLV)。
- プロモーター配列が構成性プロモーターである、請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
- プロモーター配列がサイトメガロウイルス前初期プロモーターである、請求項6記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
- 少なくとも5×107 pfu/mlの力価のVLVが得られる、請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
- 少なくとも1×108 pfu/mlの力価のVLVが得られる、請求項8記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
- 少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAが、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入される、請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
- 少なくとも1つの異種タンパク質が、感染性疾患、悪性疾患および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患に関連する、請求項10記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
- 感染性疾患が、エシェリキア属(Escherichia)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ボルデテラ属(Bordetella)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、ナイセリア属(Neisseria)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、放線菌(Actinomycete)、ストレプトミセス菌(Streptomycete)、ノカルジア属(Nocardia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルシニア属(Yersinia)、フランシセラ属(Fancisella )、パストレラ属(Pasturella )、モラクセラ属(Moraxella)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、エリジペロスリックス属(Erysipelothrix)、ブランハメラ属(Branhamella)、アクチノバチルス属(Actinobacillus)、ストレプトバチルス属(Streptobacillus)、リステリア属(Listeria)、カリマトバクテリウム属(Calymmatobacterium)、ブルセラ属(Brucella)、バチルス属(Bacillus)、クロストリジウム属(Clostridium)、トレポネーマ属(Treponema)、サルモネラ属(Salmonella)、クレブシエラ属(Kleibsiella )、ビブリオ属(Vibrio)、プロテウス属(Proteus)、エルウイニア属(Erwinia)、ボレリア属(Borrelia)、レプトスピラ属(Leptospira)、スピリルム属(Spirillum)、カンピロバクター属(Campylobacter)、シゲラ属(Shigella)、レジオネラ属(Legionella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、アエロモナス属(Aeromonas)、リケッチア属(Rickettsia)、クラジミア属(Chlamydia)、コクシエラ属(Coxiella)、ボレリア属およびマイコプラスマ属(Mycoplasma)からなる群より選択される原核生物に起因する、請求項11記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
- 感染性疾患が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、任意の他の肝炎関連ウイルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)および特に高リスク発がん性ヒトパピローマウイルス型、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)(ヒトヘルペスウイルス8(HHV-8)としても公知)、単純ヘルペスウイルス(HSV)(任意のサブタイプ)、呼吸器多核体ウイルス(RSV)および関連する呼吸器ウイルス、インフルエンザウイルス、SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)を含むコロナウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、SIV、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、アルボウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水痘ウイルス、ハンタウイルス 、ならびに任意の新興ウイルス、特に、エボラウイルス、マーブルグウイルス、西ナイルウイルス(WNV)、セントルイス脳炎ウイルス(SLEV)、リフトバレー熱ウイルス(RVFV)、およびブニヤウイルス科の他のメンバーからなる群より選択されるウイルスに起因する、請求項11記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
- 感染性疾患が、アピコンプレクサ類およびトリパノソーマ類からなる群より選択される原生動物に起因する、請求項11記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
- 悪性疾患が、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、濾胞性非ホジキンリンパ腫、悪性メラノーマ、ヘアリーセル白血病、多発性骨髄腫、カルチノイド症候群および肝臓およびリンパ節転移を伴うカルチノイド腫瘍、AIDS関連カポジ肉腫、腎細胞がん、大腸の腺がん、頭頸部扁平上皮がん、結腸がん、肺がん、乳がん、胃がん、前立腺がん、ならびに子宮内膜がんからなる群より選択されるがんである、請求項11記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
- 自己免疫疾患が、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリトマトーデス、およびI型糖尿病からなる群より選択される、請求項11記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
- 請求項1記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されるウイルス様ベシクル(VLV)を含む、組成物。
- 請求項10記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されるウイルス様ベシクル(VLV)を含む、組成物。
- 異種タンパク質が、感染性疾患、悪性疾患、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患に関連する、請求項18記載の組成物。
- 異種タンパク質に対する免疫性を対象に与える方法であって、少なくとも107 pfu/mlの請求項18記載のVLVを含む組成物を該対象に投与する工程を含み、異種タンパク質の発現が該対象において免疫応答を誘導する、方法。
- 異種タンパク質が、感染性疾患、悪性疾患、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患に関連する、請求項20記載の方法。
- 対象において疾患を処置および/または予防する方法であって、治療的有効量の請求項16記載の組成物を、そのような処置を必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
- 疾患が、感染性疾患、悪性疾患、および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患である、請求項22記載の方法。
- 対象にワクチン接種する方法であって、薬学的に許容される量の請求項18記載の組成物を該対象に投与する工程を含み、該組成物の投与が該対象において免疫応答を誘発する、方法。
- 組成物が対象に予防的に投与される、請求項24記載の方法。
- 組成物が対象に治療的に投与される、請求項25記載の方法。
- 組成物がアジュバントと組み合わせて投与される、請求項24記載の方法。
- アジュバントが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Quil A、Detox、ISCOM、およびスクアレンからなる群より選択される、請求項27記載の方法。
- 対象において異種タンパク質に対するメモリーT細胞免疫応答を生じさせる方法であって、(a)請求項18記載の組成物を対象に、該対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する工程;(b)第2のその後の時期に、第2の有効量の請求項18記載の組成物を投与する工程を含み、該異種タンパク質に対するTメモリー細胞が該対象において生じる、方法。
- 対象において異種タンパク質に対する適応B細胞免疫応答を生じさせる方法であって、(a)請求項18記載の組成物を対象に、該対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与する工程;(b)第2のその後の時期に、第2の有効量の請求項18記載の組成物を投与する工程を含み、該異種タンパク質に対するBメモリー細胞が該対象において生じる、方法。
- アルファウイルス非構造タンパク質ヌクレオチド配列をコードするDNA配列に機能的に連結されているプロモーター配列を含み、該DNA配列が、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターに機能的に連結され、それが、2Aペプチドをコードする2A DNAに機能的に連結され、次にそれが、水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質をコードするVSV G DNAに機能的に連結されている、DNA配列を含む、高力価ハイブリッドウイルスベクターを含むタンパク質発現システムであって、
SFV非構造タンパク質ヌクレオチド配列が、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G, G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-G、およびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうちの少なくとも2つを含み、
該ベクターが、SFV構造タンパク質をコードする機能的ヌクレオチド配列を欠いており、
さらに、該ベクターを細胞培養において増やす際に、少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位(pfu)の力価のウイルス様ベシクル(VLV)が得られる、
タンパク質発現システム。 - アルファウイルスがセムリキ森林ウイルス(SFV)である、請求項31記載のタンパク質発現システム。
- サブゲノムRNAプロモーターがセムリキ森林ウイルス(SFV)プロモーターに由来する、請求項31記載のタンパク質発現システム。
- 2A DNAが、ゾセア・アシグナウイルスDNAであり、かつT2Aペプチドをコードする、請求項31記載のタンパク質発現システム。
- 請求項31記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより生じるレプリコンRNAを含む、ウイルス様ベシクル(VLV)。
- プロモーター配列が構成性プロモーターである、請求項31記載のタンパク質発現システム。
- プロモーター配列がサイトメガロウイルス前初期プロモーターである、請求項36記載のタンパク質発現システム。
- 少なくとも5×107 pfu/mlの力価のVLVが得られる、請求項31記載のタンパク質発現システム。
- 少なくとも1×108 pfu/mlの力価のVLVが得られる、請求項38記載のタンパク質発現システム。
- 少なくとも1つの異種タンパク質をコードするDNAが、アルファウイルスサブゲノムRNAプロモーターと2A DNAとの間に挿入される、請求項31記載のタンパク質発現システム。
- VLVにおけるVSV Gタンパク質の発現を安定化する方法であって、VLV Gタンパク質の発現がVLVの複製の間中維持されるように、2Aペプチドをコードする2A DNAを、VSV Gタンパク質をコードするDNAに機能的に連結させる工程を含む、方法。
- VLVにおける異種タンパク質の発現を安定化する方法であって、異種タンパク質の発現がVLVの複製の間中維持されるように、2Aペプチドをコードする2A DNAを異種タンパク質をコードするDNAに機能的に連結させ、次に、VSV Gタンパク質に機能的に連結させる工程を含む、方法。
- 以下の工程を含む、高力価 RNAウイルス様ベシクル(VLV)を選択する方法:
(i) アルファウイルス構造タンパク質を含まないウイルス構造タンパク質をコードするRNA配列を含むハイブリッドウイルスベクターを細胞培養において継代することによって、VLVを生じさせる工程;および
(ii)生じたVLVを、細胞培養におけるVLVの大規模な継代およびVLVの定方向突然変異誘発からなる群より選択される少なくとも1つの手法を用いて、高力価VLVについてスクリーニングする工程。 - ハイブリッドウイルスベクターRNA配列がアルファウイルス非構造タンパク質をコードする、請求項43記載の方法。
- 非構造タンパク質がセムリキ森林ウイルス(SFV)非構造タンパク質である、請求項44記載の方法。
- ウイルス構造タンパク質がラブドウイルス糖タンパク質を含む、請求項43記載の方法。
- 糖タンパク質が水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質である、請求項46記載の方法。
- 高力価VLVが少なくとも1 mlあたり107プラーク形成単位(pfu)を産生する、請求項43記載の方法。
- 高力価VLVが、免疫応答を誘導するのに有効な量で対象に投与される、請求項43記載の方法。
- 対象が哺乳動物である、請求項20、22、24、29、30および49のいずれか一項記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項50記載の方法。
- SFV構造タンパク質ヌクレオチド配列を欠き、かつVSV G タンパク質ヌクレオチド配列と、G-4700-A、A-5424-G、G-5434-A、T-5825-C、T-5930-C、A-6047-G、G-6783-A、G-6963-A、G-7834-A、T-8859-A、T-8864-C、G-9211-A、A-10427-G、G-11560-A、A-11871-GおよびT-11978-Cからなる群より選択される変異のうち少なくとも2つを含むSFV非構造タンパク質ヌクレオチド配列とを含む、少なくとも107プラーク形成単位(pfu)の力価を有するRNAウイルス様ベシクル(VLV)。
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