JP2017513526A - 細胞生産性を増強するmiRNA - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明は、少なくとも2つの異なる領域を有する核酸コンストラクトに関し、前記領域は、生体分子の細胞生産を細胞中で刺激する少なくとも1つのmiRNAをコードする第一領域と、細胞死を抑制する少なくとも1つのmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤をコードする第二領域と、細胞増殖を調節する少なくとも1つのmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤をコードする第三領域とから選択される。本発明はさらに、それぞれの核酸コンストラクトを有する細胞に、また、in vitroで培養される細胞により生産される生体分子の生産量を増加させるための方法であって、前記生体分子の細胞生産を刺激するステップと、細胞死を減少させるステップと、増殖を調節するステップとから選択される少なくとも2つのステップを有する方法に関する。【選択図】 図2
Description
本発明は、生体分子の細胞生産の刺激、細胞生存の調節、及び/または増殖の調節などの明確な機能を有する、少なくとも1つのmiRNAまたはmiRNA阻害剤をそれぞれコードする少なくとも2つの異なる領域を有する、核酸コンストラクトに関する。本発明は、そのような核酸コンストラクトを有する細胞にさらに関する。更には、本発明は、in vitroで培養される細胞により生産される生体分子の生産量を増加させるための方法に関する。
インスリンなどの最初の製剤が生物工学的に、つまり生細胞中で、生産されて以来、生物学的製剤製造の分野は莫大に成長した。今日、多種の医薬化合物がバイオテクノロジーの方法を使用して生産されている。そのような化合物は、抗体、サイトカイン、ホルモン、並びに抗凝固剤を有する。殆どの化合物は細菌及び酵母などの下等生物中で生産されるが、哺乳類などの高次生物由来の細胞中で発現される必要がある、興味深い製剤、とくに大きく複雑なタンパク質の数が増えている。これは、所望の化合物の合成に関与する特定の酵素またはその他の分子の必要性ゆえであり、その酵素または分子は大部分が進化の後期に発達した。例えば、タンパク質の翻訳後修飾の殆どが酵素により媒介されており、その酵素は殆どの哺乳類細胞により発現しているが、細菌または酵母中には発現していない。従って、今日、生物学的製剤は、哺乳細胞工場中で広く生産されている。生物学的製剤、とくに組換えタンパク質の需要が急速に延びているため、産物の最大の質を維持しながらより高い産物力価を達成するために様々な戦略が追求された。しかしながら、原核生物の発現系と比較すると、バイオリアクターでの適度な産物力価及び低いストレス耐性は、なおも相当な難題である。哺乳類の製造細胞株の限界の克服は、生産効率を着実的に上昇させるための様々な細胞株工学操作的方法により、取り組まれてきた(例えば、Kramerら、2010)。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼにより媒介される、またはより最近ではCRISPR/Cas9系を使用することによる遺伝子ノックアウトはさておき、Bcl−XLまたはAVENなどの有益な遺伝子の導入は、哺乳類細胞工場を工学操作するためにしばしば適用された。しかしながら、これらの技法の大多数が、複雑、労働集約的であり、または確立に相当な時間を要する。さらに、従来型の細胞工学操作的方法は、通常、1つまたは数個の分泌増強遺伝子の過剰発現に依存する。しかしながら、恒常的な過剰発現は、生産細胞にさらなる翻訳負担を追加し、ゆえに目的の生物学的製剤を生産する能力を低下させる。
従って、当技術分野においては、生物学的製剤製造における生産効率を高める、とくに、目的の化合物の生産には向けられないエネルギー及び栄養の細胞消費を維持し、または最小化さえしつつ、生産性を高める、ツール及び方法に対する需要がある。
1つ目の態様においては、本発明は、少なくとも2つの異なる領域を有する核酸コンストラクトに関する。ここで、その領域は、細胞中における生体分子の細胞生産を刺激する少なくとも1つのmiRNAをコードする第一領域であって、そのmiRNAは群1から選択されるものである領域、細胞死を抑制する少なくとも1つのmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤をコードする第二領域であって、そのmiRNAは群2から選択され、またそのmiRNA阻害剤は群3から選択されるmiRNAを阻害するものである領域、並びに、細胞増殖を調節する少なくとも1つのmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤をコードする第三領域であって、そのmiRNAは群4または5から選択され、またそのmiRNA阻害剤は群4または5から選択されるmiRNAを阻害するものである領域から選択される。ここで、群1は、配列ID番号:1、2、3、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、26、27、28、29、32、34、37、39、40、41、42、44、45、46、47、48、49、51、52、53、55、56、57、58、62、63、66、67、69、70、75、76、77、80、81、82、83、86、88、90、91、93、98、99、100、101、102、103、104、106、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、120、121、128、130、132、134、136、137、138、141、142、143、147、151、152、155、158、163、165、171、174、182、183、185、186、188、190、201、203、207、211、212、214、217、222、223、228、230、233、238、239、240、254、255、269、276、278、279、285、及び294からなる。群2は、配列ID番号:1、2、3、4、6、8、9、20、52、98、5、7、24、31、33、50、54、59、60、61、64、68、71、73、74、79、85、87、89、92、94、95、97、145、153、154、156、159、161、166、167、168、169、170、172、175、176、178、179、180、181、184、191、192、194、195、196、197、199、200、204、205、206、208、209、210、213、216、219、220、221、224、225、226、227、229、231、236、237、241、242、243、245、247、248、251、252、253、256、257、258、259、260、262、265、266、268、271、272、273、274、277、280、282、284、289、293、及び295からなる。群3は、配列ID番号:296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、605、607、608、及び609からなる。群4は、配列ID番号:5、7、68、79、94、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、22、23、30、35、36、38、43、65、72、78、84、96、105、107、108、119、122、123、124、125、126、127、129、131、133、135、139、140、144、146、148、149、150、160、162、164、173、177、187、189、193、198、202、215、218、232、234、235、244、246、249、250、261、263、264、267、270、275、281、283、287、288、及び291からなる。また、群5は、配列ID番号:516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、及び606からなる。
さらなる態様においては、本発明は、本発明の核酸コンストラクトを有する細胞に関する。
さらなる態様においては、本発明は、in vitroで培養される細胞により生産される生体分子の生産量を増加させるための方法に関する。その方法は、群1から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを細胞中で上昇させることによりその生体分子の細胞生産を刺激するステップ、群2から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを細胞中で上昇させること、及び/または群3から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを低下させることにより、細胞死を減少させるステップ、並びに、細胞中において群4もしくは5から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを上昇させること、及び/または群4もしくは5から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを低下させることにより、細胞増殖を調節するステップから選択される、少なくとも2つのステップを有する。ここで、群1は、配列ID番号:1、2、3、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、26、27、28、29、32、34、37、39、40、41、42、44、45、46、47、48、49、51、52、53、55、56、57、58、62、63、66、67、69、70、75、76、77、80、81、82、83、86、88、90、91、93、98、99、100、101、102、103、104、106、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、120、121、128、130、132、134、136、137、138、141、142、143、147、151、152、155、158、163、165、171、174、182、183、185、186、188、190、201、203、207、211、212、214、217、222、223、228、230、233、238、239、240、254、255、269、276、278、279、285、及び294からなる。群2は、配列ID番号:1、2、3、4、6、8、9、20、52、98、5、7、24、31、33、50、54、59、60、61、64、68、71、73、74、79、85、87、89、92、94、95、97、145、153、154、156、159、161、166、167、168、169、170、172、175、176、178、179、180、181、184、191、192、194、195、196、197、199、200、204、205、206、208、209、210、213、216、219、220、221、224、225、226、227、229、231、236、237、241、242、243、245、247、248、251、252、253、256、257、258、259、260、262、265、266、268、271、272、273、274、277、280、282、284、289、293、及び295からなる。群3は、配列ID番号:296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、605、607、608、及び609からなる。群4は、配列ID番号:5、7、68、79、94、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、22、23、30、35、36、38、43、65、72、78、84、96、105、107、108、119、122、123、124、125、126、127、129、131、133、135、139、140、144、146、148、149、150、160、162、164、173、177、187、189、193、198、202、215、218、232、234、235、244、246、249、250、261、263、264、267、270、275、281、283、287、288、及び291からなる。また、群5は、配列ID番号:516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、及び606からなる。
さらなる態様においては、本発明は、細胞中で生体分子を生産するための方法であって、細胞培養物中で細胞を増殖させるステップ、配列ID番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを上昇させるステップ、並びに細胞培養物から生体分子を単離するステップを有する方法に関する。
さらなる態様においては、本発明は、細胞中での生体分子の生産において、群1から選択される少なくとも1つのmiRNAと、群2から選択される少なくとも1つのmiRNA、及び/または群3から選択されるmiRNAを阻害する少なくとも1つのmiRNA阻害剤と、群4もしくは5から選択される少なくとも1つのmiRNA、及び/または群4もしくは5から選択されるmiRNAを阻害する少なくとも1つのmiRNA阻害剤との組合せの使用に関する。ここで、群1は、配列ID番号:1、2、3、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、26、27、28、29、32、34、37、39、40、41、42、44、45、46、47、48、49、51、52、53、55、56、57、58、62、63、66、67、69、70、75、76、77、80、81、82、83、86、88、90、91、93、98、99、100、101、102、103、104、106、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、120、121、128、130、132、134、136、137、138、141、142、143、147、151、152、155、158、163、165、171、174、182、183、185、186、188、190、201、203、207、211、212、214、217、222、223、228、230、233、238,239、240、254、255、269、276、278、279、285、及び294からなる。群2は、配列ID番号:1、2、3、4、6、8、9、20、52、98、5、7、24、31、33、50、54、59、60、61、64、68、71、73、74、79、85、87、89、92、94、95、97、145、153、154、156、159、161、166、167、168、169、170、172、175、176、178、179、180、181、184、191、192、194、195、196、197、199、200、204、205、206、208、209、210、213、216、219、220、221、224、225、226、227、229、231、236、237、241、242、243、245、247、248、251、252、253、256、257、258、259、260、262、265、266、268、271、272、273、274、277、280、282、284、289、293、及び295からなる。群3は、配列ID番号:296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、605、607、608、及び609からなる。群4は、配列ID番号:5、7、68、79、94、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、22、23、30、35、36、38、43、65、72、78、84、96、105、107、108、119、122、123、124、125、126、127、129、131、133、135、139、140、144、146、148、149、150、160、162、164、173、177、187、189、193、198、202、215、218、232、234、235、244、246、249、250、261、263、264、267、270、275、281、283、287、288、及び291からなる。また、群5は、配列ID番号:516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、及び606からなる。
1つ目の態様においては、本発明は、少なくとも2つの異なる領域を有する核酸コンストラクトに関する。その領域は、細胞中における生体分子の細胞生産を刺激する少なくとも1つのmiRNAをコードする第一領域であって、そのmiRNAは群1から選択されるものである領域、細胞死を抑制する少なくとも1つのmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤をコードする第二領域であって、そのmiRNAは群2から選択され、またそのmiRNA阻害剤は群3から選択されるmiRNAを阻害するものである領域、並びに、 細胞増殖を調節する少なくとも1つのmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤をコードする第三領域であって、そのmiRNAは群4または5から選択され、またそのmiRNA阻害剤は群4または5から選択されるmiRNAを阻害するものである領域から選択される。
マイクロRNA(miRNA)は、真確細胞において全般的遺伝子発現を翻訳後に調節し、また種をまたいで非常によく保存されている、ヌクレオチド約22個の内因性の小さい非コードRNA分子である。単一のmiRNAは通常、最大で何百の異なるメッセンジャーRNA(mRNA)を調節し、また殆どのmRNAが複数のmiRNAにより標的化されると予期されている。miRNA遺伝子はRNAポリメラーゼIIにより転写され、次いで処理され、一本鎖成熟miRNAを生じ、これがRNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれる。RISC複合体の中心部として、miRNAはRISCをそのmRNA標的へと先導し、そこでmiRNAは部分的相補塩基対合によりmRNA転写物の3’非翻訳領域(3’UTR)に結合する。遺伝子サイレンシングは、アルゴノート−2(AGO2)媒介性mRNA切断、またはAGO1から4により促進される翻訳抑制のいずれかにより起こり、いずれの経路でも最終的に相当するタンパク質のレベルを低下させる(van Rooij、2011)。小干渉RNA(siRNA)とは対照的に、miRNAは標的転写物の3’UTR内の結合部位に対し部分的にしか相補的でなく、これにより特異性はより低くなり、従って潜在的標的遺伝子のプールを増加させる。完全なWatson−Crick塩基対合は、成熟miRNAの5末端におけるヌクレオチド2〜7/8の間の配列をカバーするmiRNA「シード」領域においてのみ、混在している。miR−30メンバーなどの同一の「シード」配列を有するmiRNAは、ファミリーにグループ化される。生物情報学的標的予測ツールに従えば、同じファミリーのメンバーは、多数の標的mRNAを共有することになっている。
発明者は、1つのmiRNAの標的が多数であるにもかかわらず、いくつかのmiRNAは一定の細胞プロセスに対し特異的な効果を示すことを発見した。組換えCHO−SEAP浮遊細胞株において、1139のmiRNAを有する完全ネズミ科ミミックライブラリーを使用して機能的ハイコンテントmiRNAスクリーニングを実施することにより、発明者は特定の細胞機能を向上させるのに適している別個のmiRNAを明らかにした。とくに、群1(表1)のmiRNAが、生体分子の細胞生産を刺激することが発見された。本明細書において使用される用語「生体分子の細胞生産」は、細胞あたりに生産される生体分子の量を意味する。細胞生産は、培養物から回収されうる生体分子の生産量を指す培養物全体の「容積生産性」に対し、「比生産性」とも呼ばれる。細胞生産のレベルは、1つの細胞により期間あたり合成される生体分子の量に、例えば、タンパク質翻訳速度に、また適用可能であれば細胞から生体分子が分泌される効率に、主に依存する。従って、群1のmiRNAは、1つのまたは両方すらのプロセスに影響すると予期される。群1内では、配列ID番号:1、3、6、8、10、29、39、40、47、49、51、55、91、103、115、132、137、171、211、及び294からなる群9のmiRNAが、細胞生産に最も顕著な効果を示すことが発見された。従って、第一領域は、好ましくは、群9から選択される少なくとも1つのmiRNAをコードする。
群2(表2)及び3(表3)のmiRNAは、細胞死を抑制することにより(群2)、またはアポトーシスもしくはネクローシスを促進することにより(群3)、細胞生存に影響を及ぼすことが発見された。培養物内の細胞死は、生産する細胞の数を減少させるだけでなく、全培養物に著しい負担をももたらす。死細胞は残骸として培養物内に残り、これが細胞ストレスを上昇させ、また高濃度では有毒にさえなりうる。従って、細胞の残骸は培養物から除去される必要があるが、これは培養条件を乱し、細胞に物理的ストレスを与え、これら全ては最終的には生産性の低下をもたらす。従って、細胞死を抑制するため、核酸コンストラクトは群2のmiRNAをコードし、群2のmiRNAはアポトーシスを直接的に阻害するのに適している。これらのmiRNAのうち、配列ID番号:3、7、20、54、59、73、94、145、159、175、176、178、179、199、206、248、251、252、266、及び272からなる群10のmiRNAは、細胞生存に最も顕著な効果を示すことが発見された。従って、第二領域は、好ましくは、群10から選択される少なくとも1つのmiRNAをコードする。群3(表3)のmiRNAは、細胞死を、とくにアポトーシス(群6、表6)またはネクローシス(群7、表7)を促進することが発見された。従って、これらのmiRNAの阻害は細胞死を抑制するのに適切である。群3内では、配列ID番号:297、305、307、311、312、313、321、330、331、335、336、340、345、351、359、405、412、458、510、及び608からなる群11のmiRNAが、最も顕著な細胞死誘発効果を有することが発見された。これらのmiRNAの阻害が最も好ましいように。従って、第二領域は、好ましくは、群11から選択されるmiRNAを阻害する、少なくとも1つのmiRNA阻害剤をコードする。
群4(表4)のmiRNAは増殖を促進することが見いだされ、一方で群5(表5)のmiRNAは細胞***を低下させた。従って、群4のmiRNAの発現かつ群5のmiRNAの阻害は、増殖を促進するのに適しており、群5のmiRNAの発現かつ群4のmiRNAの阻害は、増殖を阻害するのに適している。各単一細胞の細胞生産のほか、培養物中に存在する細胞数は、回収されうる生体分子の生産量を決定する。従って、生産する培養物のサイズを大きくするためには、とくに成長が遅い細胞が使用される、または細胞培養を始める場合には、細胞増殖を刺激することが望まれうる。他方で、いったん培養物が最適細胞密度に到達したら、細胞増殖を阻害することが望まれうる。***するためには、細胞は、膜、細胞核、及びさらなるオルガネラを含むほぼ全ての構成要素をざっと2倍にする必要がある。これはエネルギー及びタンパク質翻訳能力を消費し、するとエネルギー及びタンパク質翻訳能力は目的の生体分子の生産のためには提供されない。従って、とくにいったん最適培養サイズに到達したら、細胞増殖を阻害することが望まれうる。群4の miRNAのうち、配列ID番号:5、7、22、30、35、43、68、72、78、84、96、146、148、160、173、177、198、202、232、234、244、267、及び283からなる群12のmiRNAが、細胞増殖に対し最も顕著な効果を有した。また、増殖を抑制することが分かっているmiRNAのうち、配列ID番号:517、523、526、529、531、533、537、548、550、558、560、561、563、566、567、571、575、577、583、591、600、601、及び604からなる群13のmiRNAが、最も効果的であった。従って、細胞増殖を促進するためには、第三領域は、好ましくは、群12から選択されるmiRNA、及び/または群13から選択されるmiRNAを阻害するmiRNA阻害剤をコードする。細胞増殖を阻害するためには、第三領域は、好ましくは、群13のmiRNA、及び/または群12のmiRNAを阻害するmiRNA阻害剤をコードする。
細胞培養物から回収されうる生体分子の生産効率及び合計出力は、いくつかの細胞プロセスに依存する。そのうち最も重要なのは、生体分子のタンパク質細胞生産(翻訳/分泌)、細胞生存、及び細胞増殖であり、これらの調節は相互に関連しさえする。異なる細胞プロセスに影響する少なくとも2つのmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤を導入することにより、多数の細胞経路が最適化されうる。これが目的の生体分子の生産量の増加をもたらす。miRNA及びmiRNA阻害剤のそれぞれが、相互に関連するいくつもの細胞経路のさまざまな標的遺伝子に影響し、これにより細胞内のタンパク質の組成に影響する。タンパク質合成を増強するための1つまたはいくつかの酵素の過剰発現と対比して、細胞の内因性タンパク質プール内のバランスを変えることは、望ましい生体分子の生産からエネルギーを引き出さない。miRNAを発現することは実際には翻訳を減少させ、したがって生体分子の生産のためにエネルギー及びタンパク質翻訳能力を解放する。さらに、生産の制限要因は、生産される生体分子により異なるかもしれず、あるいは培養条件によっては培養中に変化さえしうる。miRNAを制御することにより多種のタンパク質の組成に影響を及ぼすことにより、経路全体を調節することが可能である。これにより、単一の合成酵素を過剰発現させる、または単一のタンパク質分解酵素を阻害もしくはノックアウトすることによっては対処できないだろう、さまざまな制限を克服することが可能である。
本明細書で使用される用語「生体分子」は、細胞により生産され、また細胞から回収されることが適切である、あらゆる化合物を指す。好ましくは、生体分子は生物学的製剤、つまり治療薬、予防薬、診断薬を含む製剤であり、それは天然には本質的に生物学的でありバイオテクノロジーを使用して製造される。生物学的製剤は、とくに、抗体、酵素、ホルモン、ワクチンであるが、また、例えば腫瘍溶解性ウィルス及び遺伝子治療のために使用されるウィルスなどの、ウィルスでもありうる。従って、生物学的製剤は好ましくは組換え分子であり、より好ましくは組換えタンパク質または組換えウィルスである。
本明細書で使用される用語「miRNA阻害剤」は、細胞内で所与のmiRNAの量を特異的に低下させるのに適するあらゆる化合物を指す。miRNA阻害剤は、例えば、目的のmiRNAに特異的に結合しそれによりその標的mRNAへの結合を防ぐ核酸分子である。そのような阻害剤は、アンタゴmir、miRNAスポンジ、及びmiRNAデコイを含む。アンタゴmirは標的化されるmiRNAに完全に相補的な小さいオリゴヌクレオチドであり、一方、miRNAスポンジ及びmiRNAデコイは、目的のmiRNAに対する複数のタンデムな結合部位を有する核酸分子である。複数の結合部位ゆえ、その分子はmiRNAの強力な競合阻害剤として働く(Ebert及びSharp、2010)。これに従い、miRNA阻害剤は、アンタゴmir、miRNAスポンジ、及びmiRNAデコイからなる群から好ましくは選択される。あるいは、miRNA阻害剤は、例えばプロモーターまたはエンハンサーなどの、目的のmiRNAの調節エレメンTを標的化しうる。
ある好ましい実施形態においては、核酸コンストラクトは、3つの異なる領域を有する。細胞生産、細胞死、及び細胞増殖のそれぞれに影響する少なくとも1つのmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤を有することにより、生体分子の生産における細胞の効率が最適化されうる。
ある好ましい実施形態においては、少なくとも1つの領域、好ましくは各領域が、少なくとも2つ、3つ、4つ、または5つの異なるmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤をコードする。あらゆる領域も、1つより多いmiRNAまたはmiRNA阻害剤をコードしうる。たとえば、同じファミリーに属し従って関連するmiRNAを標的化する、いくつかのmiRNAが有されうる。これにより、例えばmiR−30ファミリーのいくつかのメンバーの組み合わせ導入により観察されるように、1つの特定の経路の調節を強化することが可能である。あるいは、より広くにわたる効果を生むためには、異なる経路を標的化するさまざまなmiRNAが使用されうる。増殖、タンパク質合成、及び細胞死のような細胞プロセスは、通常1つより多いシグナル経路により調節されており、その経路の多くが相互に関連している。従って、どの細胞経路が生体分子生産のための制限要因を呈するか知られていない場合には、いくつかの経路を標的化することが特に有利である。miRNAのどちらかと言えば小さいサイズゆえ、本発明の核酸コンストラクトは、20のmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤、またはそれより多くをコードしうる。本明細書で使用される用語「領域」は、miRNA、または、例えばアンタゴmirもしくはmiRNAデコイなどのmiRNA阻害剤へと転写される部分を有する、核酸コンストラクト上のセクションを指す。その領域は、プロモーター、オペレーター(例えば、エンハンサー、リプレッサー、及びイスレーター)、3‘UTR調節エレメント(例えばsiRNA結合部位、miRNA結合部位)、またはスプライシングシグナルなどの、miRNAまたはmiRNA阻害剤の転写を制御するための調節エレメントさらに有しうる。
ある好ましい実施形態においては、その少なくとも2つの異なる領域は、異なるプロモーターにより制御される。これはつまり、各領域がそれ自身の調節エレメントを、前記領域中に有されるmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤の転写がコンストラクトの他の領域に有されるmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤とは独立に調節されうるように、有するということである。これは、細胞増殖及び細胞生産が、細胞培養の間の異なる時点において調節されるべきである場合に、有利である。培養を引き起こす際には細胞増殖が促進されうる一方、いったん最適細胞濃度に達すれば、細胞生産性が増強されうる。培養の状態によっては、細胞死の調節がとくに誘発されうる。さらに、独立の調節エレメントの使用は、異なる細胞プロセスのためのmiRNAまたはmiRNA阻害剤をさまざまな量で提供することを可能にする。例えば、細胞生産を刺激するmiRNAは強力なプロモータ下に設置されうる一方、細胞死に影響するmiRNAまたはmiRNA阻害剤はより弱いプロモーターにより調節されうる。
ある好ましい実施形態においては、少なくとも2つの異なる領域が1つの共通のプロモーターにより制御される。これは、核酸コンストラクトの迅速で容易な調製を可能にし、好ましくはどちらかといえば単純な調節がすでに十分な生体分子の生産量をもたらす場合に適用されうる。
ある好ましい実施形態においては、少なくとも1つのプロモーターが誘導性または阻害性である。誘導性/阻害性プロモーターは、その活性が、温度、光、酸素、または化学物質の存在などの外部環境に依存することが特徴である。誘導性または阻害性プロモーターを使用すると、細胞培養の間にコンストラクトの1つまたは全部の領域の翻訳が開始され、かつ/または停止される時点を、正確に決定することが可能である。誘導性調節エレメントは、例えばテトラサイクリン/ドキシサイクリン「Tet−On」システムを含み、阻害性調節エレメントは、例えば「Tet−Off」システムまたは調節性光遺伝学的遺伝子発現システム、温度制御プロモーター、及びTrsRベースのシステム(クオラムセンシグベース)を含む。
ある好ましい実施形態においては、核酸コンストラクトは、発現ベクター、エピソームベクター、またはウィルスベクターである。細胞内でmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤を発現させるためには、核酸コンストラクトは細胞内に導入される必要がある。これはさまざまな方法で可能であり、例えばトンランスフェクション、つまり真確細胞中に核酸分子を移入する非ウィルス性の方法である。そのような適用に対しては、核酸コンストラクトは好ましくは、発現ベクターまたはエピソームベクターとして提供される。あるいは、核酸コンストラクトはトランスダクションにより、つまり細胞内への核酸のウィルス媒介性移入により、細胞内に導入されうる。そのような適用に対しては、核酸コンストラクトは、好ましくはウィルスベクターとして提供される。
さらなる態様においては、本発明は、本発明のコンストラクトを有する細胞に関する。そのような細胞は、生体分子を生産するのに適していて、その生産効率及び全生産量は、異なる細胞プロセスに関与する少なくとも2つのmiRNAを調節することにより最適化される。そのような細胞は、好ましくは生物学的製剤製造において使用される。
ある好ましい実施形態においては、コンストラクトは細胞のゲノム中に組み込まれる。本発明に従うコンストラクトを細胞の内因性ゲノム中に導入することにより、生物学的製剤製造のための安定細胞株が提供されうる。そのような細胞株は、一定かつ確実量で生体分子を生産でき、また従って大規模生産のためにはとくに好ましい。大量生産は通常、確立された高需要の生物学的製剤を提供するために作動される。さらに、核酸コンストラクトをゲノムに組み込むことにより、継続的な細胞増殖の間にコンストラクトを失う可能性は低下し、核酸コンストラクトは培養の全存続期間を通じて存在する。従って、細胞は好ましくは安定細胞株細胞である。
ある好ましい実施形態においては、コンストラクトはトランスフェクションにより細胞に組み込まれる。一過性トランスフェクションは、新しい特性を有する所与の細胞を提供するための、容易かつ迅速な方法である。それは労働集約的でもコスト集約的でもなく、膨大な選択プロセスを必要としない。労働集約的な安定細胞株の確立が非効率的であろうような、生体分子が告知から短期間で生産される必要がある、または少量の生体分子のみ必要である場合、核酸コンストラクトのトランスフェクションによる導入がとくに好ましい。
ある好ましい実施形態においては、細胞のゲノムの群1、2、4、及び/または5から選択される少なくとも1つのmiRNAをコードする領域が増幅され、かつ/あるいは、細胞のゲノムの群3、4、及び/または5から選択される少なくとも1つのmiRNAをコードする領域が欠損させられまたはサイレンシングされる。細胞内に本発明の核酸コンストラクトを導入するほか、細胞のmiRNAの内因性発現を阻害または変化させることにより、miRNAが提供されうる。特定のmiRNAのレベルを上昇させるためには、このmiRNAをコードする細胞ゲノムの領域が増幅されうる。同様に、内因性miRNAをコードする領域は、そのmiRNAが細胞中に存在しなくなるように、欠損させられうる。miRNAをコードする遺伝子を欠損させる代わりに、細胞内のmiRNAレベルは、サイレンシングにより、例えば競合阻害剤を使用して、低下させられうる。
ある好ましい実施形態においては、細胞は哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、例えば、複雑な翻訳後修飾を有するタンパク質など、複雑な構造の生体分子を生産するのにとくに好ましい。哺乳類細胞は、複雑なタンパク質を生成し、折り畳み、また修飾するために必要な合成経路を内因的に有する。例えばハムスター、マウス、アヒル、またはヒトなどの異なる起源に由来する、さまざまな細胞システムが利用可能である。miRNAは、Chinese hamster ovary(CHO)細胞を使用して同定されたが、異なる哺乳類種間での多くの遺伝子の顕著な配列相同性ゆえ、他種の細胞、とくに他の哺乳類細胞において、タンパク質発現、折り畳み、分泌、及び産物の質を決定する細胞パラメーターに影響を及ぼすのに適している。例えば、CHO細胞においてアポトーシス促進効果を有することが分かっているmiRNAは、ヒト腫瘍及び前脂肪細胞細胞株においてアポトーシスを誘発するのに適していた(図10)。
ある好ましい実施形態においては、哺乳類細胞はChinese hamster ovary(CHO)細胞であり、好ましくは、CHO−K1細胞、CHO DG44細胞、CHO DUKX B11細胞、CHO dhfr細胞、またはCHO−S細胞である。
ある好ましい実施形態においては、細胞は、ヒト細胞、好ましくは腎細胞、肝細胞、胚網膜細胞、羊膜細胞、または間葉系幹細胞である。ヒト起源の生体分子の生産については、とくにそれがヒト医療において使用されることが意図される場合、ヒト細胞由来の細胞生産システムが好ましい。修飾の不正確な折り畳みによる生体分子のわずかな変化は、タンパク質の活性をより低くしうるし、あるいはタンパク質に有害作用を示させさえしうる。さらに、CHO細胞を使用して同定されたmiRNAは、ヒト細胞においても類似の効果を有することが見いだされた。
ある好ましい実施形態においては、細胞は昆虫細胞、好ましくはSf9、Sf21、TriEXTM、またはHi5細胞である。そのような細胞システムは、例えばタンパク質などの分子であって、その分子が不可欠な機能を果たす他のシステムから由来する分子の生産のためには、とくに好ましい。そのようなタンパク質をその天然の細胞環境中で発現することは、生産細胞の細胞プロセスを妨害するであろうし、あるいは細胞死さえもたらしうる。これは、生体分子の生産効率を著しく害するであろうし、実現されうる生産量を強く制限する。例えば、細胞経路に対し顕著に影響を有する一定のヒト受容体分子は、昆虫細胞から高生産量で生産されうる。それらの分子がこれらの細胞中では生物学的作用を果たさないからである。
さらなる態様においては、本発明は、in vitroで培養される細胞により生産される生体分子の生産量を増加させるための方法に関する。その方法は、群1から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを細胞中で上昇させることによりその生体分子の細胞生産を刺激するステップと、群2から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを細胞中で上昇させ、かつ/または群3から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを低下させることにより細胞死を低下させるステップと、群4もしくは5から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを細胞中で上昇させ、かつ/または群4もしくは5から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを低下させることにより細胞の増殖を調節するステップとから選択される、少なくとも2つのステップを有する。本明細書で使用される用語「生体分子の生産量」は、全培養物の容積生産量、つまり培養物から回収されうる目的の生体分子の合計量を指す。生体分子の生産のためには、好ましくは目的の生体分子を生産するのに適合させられた安定細胞株から、細胞培養が確立される。これは、生体分子がタンパク質の場合には、望まれるタンパク質をコードする遺伝子の1つまたは複数のコピーを導入することにより達成されうる。望ましい方法を使用することにより、細胞生産、増殖、及び細胞生存のうち少なくとも2つの細胞プロセスが、特定のmiRNAのレベルを調節することにより影響を受ける。細胞生産能力、細胞増殖、及び細胞生存のバランスを取ることにより、細胞培養物のエネルギー及び栄養の消費を上昇させるであろう追加の翻訳負担を細胞に課すことなく、生体分子の出力を上昇させることが可能である。
ある好ましい実施形態においては、細胞中でmiRNAを過剰発現させることにより、miRNA存在下で細胞に電気穿孔を施すことにより、またはmiRNA及びトランスフェクタントを細胞が培養されている培地に添加することにより、少なくとも1つのmiRNAのレベルが上昇させられる。あるいは、トランスフェクションのために細胞が移入される緩衝液に、miRNA及びトランスフェクタントが添加されてもよい。細胞内でのmiRNAのレベルを上昇させるためには、2つの別個の取り組みが利用可能である。miRNAをコードする核酸分子は、細胞転写機構がコンストラクトからのmiRNAを発現するように、細胞へと導入されうる。これは、個々のエピソーム分子として細胞中で維持され、もしくは細胞のゲノムへと組み込まれる、発現ベクターもしくはウィルスベクターの使用により、または安定細胞株の使用により、達成されうる。あるいは、細胞内のmiRNAのレベルは、miRNAをRNA分子として、例えばpri−もしくはpre−miRNA、成熟miRNA、またはmiRNAミミックとして提供することにより、上昇させられうる。例えば、RNA分子は、トランスフェクタント、つまりリポフェクタミン(Invitrogen)と共に培養物へと添加される。そのトランスフェクタントは、核酸またはmiRNAを被包するリポソームを形成する脂質サブユニットを含有する。そのリポソームはそれから、核酸が細胞質へと導入されるように、細胞の膜と融合する。
ある好ましい実施形態においては、少なくとも1つのmiRNAのレベルが、そのmiRNAをコードする細胞のゲノムの領域を欠損させる、または、細胞中でそのmiRNAに対して向けられたmiRNA阻害剤を発現させることにより、そのmiRNA阻害剤の存在下で細胞に電気穿孔を施すことにより、もしくは細胞が培養される培地にmiRNA阻害剤及びトランスフェクタントを添加することによりそのmiRNAの転写を調節することで、低下させられる。あるいは、トランスフェクションのために細胞が移入される緩衝液に、miRNA阻害剤及びトランスフェクタントが添加されうる。miRNAのレベルの低下は、さまざまなアプローチにより達成されうる。例えば、miRNAをコードしている内因性遺伝子が、細胞のゲノムから欠損させられうる。これは、生体分子が安定細胞株により生産されるべき場合に好ましい。ところが、このアプローチは、いくつかの場合においては非可逆的である。あるいは、miRNAをコードする内因性の遺伝子が、miRNAの転写が確定的に活性化または不活性化されるように、誘発性調節エレメント下に置かれてもよい。そのほか、内因性miRNAは、例えばアンタゴmirまたはRNAスポンジなどの競合的阻害剤を提供することにより阻害されてもまたよい。これらは、トラクスフェクションに際し、細胞内で発現させられてもよく、あるいは、トランスフェクタントと共に培養物にRNA分子として添加されてもよい。単一のアプローチの代わりに、異なるアプローチの組合せが適用されてもよい。
ある好ましい実施形態においては、細胞死は、群2から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを細胞中で上昇させ、かつ/または群6から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを低下させることにより、アポトーシスを減少させることで低下させられる。細胞死の2つの主なタイプが知られ、それは互いに明白に異なる。アポトーシスは、プログラム細胞死とも呼ばれ、通常は細胞プロセスの欠陥の結果惹起される細胞変換の、明確な帰結である。ネクローシスは、これに対しむしろ、通常例えば細胞傷害などの外部衝撃により惹起される、細胞の外傷性の溶解である。細胞種及び培養条件により、細胞死の1タイプが他方よりもより顕著でありうる。興味深いことに、発明者は、アポトーシスとネクローシスとの両者の調節に関与する、いくつものmiRNAを発見した。さらに、アポトーシスに関しては、阻害性並びに促進性のmiRNA(それぞれ群2及び6)が同定された。これに対し、ネクローシスに関しては、専ら促進性のmiRNA(群7)が発見された。特定の細胞培養に及び培養条件によっては、アポトーシスまたはネクローシスが、生体分子生産の間により顕著となりうる。従って、好ましい実施形態においては、細胞死は、群7から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを低下させることによりネクローシスを減じることで、減少する。
さらなる態様においては、本発明は、細胞中で生体分子を生産するための方法に関する。その方法は、細胞培養物中で細胞を繁殖させるステップと、配列ID番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを上昇させるステップと、細胞培養物から生体分子を単離するステップとを有する。細胞生産、増殖、及び細胞生存などの別個の細胞プロセスを特異的に調節するmiRNAを解明するにあたり、発明者は、これらのプロセスのうち1つより多くに影響を与える、一定のmiRNAをさらに発見した。miR−99b−3p(配列ID番号:1)は、生体分子の細胞生産を増加させるだけでなく、抗アポトーシス効果をも示す。miR−767(配列ID番号:2)、miR−30a−5p(配列ID番号:3)、miR−3062−5p(配列ID番号:4)、miR−200a−5p(配列ID番号:6)、miR−135a−1−3p(配列ID番号:8)、miR−743a−5p(配列ID番号:9)、及びmiR−30d−5p(配列ID番号:20)についても、同様の組合せ効果が観察された。miR−291b−3p(配列ID番号:5)、及びmiR−1a−3p(配列ID番号:7)は、細胞生存及び細胞増殖の両方を促進し、その結果、生産される生体分子の生産量を総体的に増加させることが発見された。さらに、miR−694(配列ID番号:10)、miR−674−3p(配列ID番号:11)、miR−669d−3p(配列ID番号:12)、miR−301b−5p(配列ID番号:13)、miR−212−5p(配列ID番号:14)、miR−203−5p(配列ID番号:15)、miR−200b−5p(配列ID番号:16)、miR−200a−3p(配列ID番号:17)、miR−1968−5p(配列ID番号:18)、及びmiR−150−3p(配列ID番号:19)は、増殖及び細胞生産性の両方に影響を与えることが見いだされた。これらのmiRNAの1つまたはそれより多くを増加させることは、生体分子の生産を最適化させるための容易かつ効率的なアプローチを提供する。miRNAを細胞中に導入するためには、本明細書において言及されるあらゆる方法、またはその組合せが使用されうる。
さらなる態様においては、本発明は、細胞中での生体分子の生産における、群1から選択される少なくとも1つのmiRNA、群2から選択される少なくとも1つのmiRNA及び/または群3から選択されるmiRNAを阻害する少なくとも1つのmiRNA阻害剤、並びに、群4もしくは5から選択される少なくとも1つのmiRNA及び/または群4もしくは5から選択されるmiRNAを阻害する少なくとも1つのmiRNA阻害剤の組合せの使用に関する。細胞生産を促進するmiRNA、細胞死を抑制するmiRNAまたはmiRNA阻害剤、及び/または細胞増殖を調節するmiRNAもしくはmiRNA阻害剤は、さまざまな形態で提供されうる。例えば、miRNA/阻害剤は、単一の核酸コンストラクトとして提供されうる。あるいは、それぞれがmiRNAのサブセットをコードする多数の核酸分子が提供されうる。例えば、少なくとも1つの群1のmiRNAをコードする1つの発現ベクター、群2のmiRNAをコードする第二の発現ベクター、及び群5のmiRNAに対して向けられるmiRNA阻害剤をコードする第三の発現ベクターである。同様に、miRNA及びmiRNA阻害剤は、いくつものpri−もしくはpre−miRNA分子、またはmiRNAミミックの収集物として提供されうる。従って、miRNAは、多様なmiRNA及び/または阻害剤を有するキットとして、単一の組成物中に、または別々に提供されうる。
さらなる態様においては、本発明は、配列ID番号1−295からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAをコードする領域、及び/または配列ID番号296−609からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAに対して向けられる少なくとも1つの阻害剤をコードする領域を有する、核酸コンストラクトに関する。配列ID番号1−295のmiRNAの全てが、これらのmiRNAのいずれかを過剰発現する培養物から回収されうる生体分子の量が増加するように、総体的生体分子生産を促進することが見いだされた。殆どのmiRNAについて、個別の経路(つまり細胞増殖、細胞死、及び細胞生産性)に対する効果が見いだされ、このことは、観察された総体的な生体分子生産の増加を少なくとも部分的には説明するはずである。従って、それぞれのmiRNAが単独でまたは組合せで、生産細胞からの生体分子生産を増強させるのに適している。さらに、いくらかのmiRNAは、より一般的に細胞のパフォーマンスに影響を与え、細胞生存、増殖、または細胞生産を顕著に変化させることなく、容積生産の総体的な増加をもたらすようである。これらのmiRNAは、miR−721(配列ID番号:157)、miR−107−3p(配列ID番号:286)、miR−181a−1−3p(配列ID番号:290)、及びmiR−19b−2−5p(配列ID番号:292)である。これらのmiRNAは、前述のプロセスの1つまたは2つのを顕著に変化させる代わりに、むしろそれら全てに、また可能性としてはさらに細胞シグナル経路に影響することが示唆される。配列ID番号1−295の殆どのmiRNAと同様に、配列ID番号296から609のそれぞれが、細胞増殖、及び/または細胞死に効果を引き起こすことが見いだされた。単一または複数のこれらのmiRNAの阻害が、細胞生存、及び/または増殖を促進し、総体的な生体分子生産の増加をもたらすのに適している。
従って、さらなる態様においては、本発明は、in vitroで培養される細胞により生産される生体分子の生産量を増加するための方法に関する。その方法は、配列ID番号1−295からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを細胞中で上昇させるステップ、及び/または配列ID番号296−609からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを細胞中で低下させるステップを有する。
さらに、本発明は、細胞中で生体分子を生産する方法に関する。その方法は、細胞培養物中で細胞を繁殖させるステップと、配列ID番号1−295からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを細胞中で上昇させ、かつ/または配列ID番号296−609からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを細胞中で低下させるステップと、細胞培養物から生体分子を単離するステップとを有する。
ある好ましい実施形態においては、miRNA及び/またはmiRNA阻害剤は、電気穿孔により、もしくはトランスフェクタントと共に細胞培養物中に添加され、またはウィルスベクターにより細胞へと導入される。
さらなる態様においては、本発明は、in vitroで培養される細胞により生産される生体分子の細胞生産を刺激するために、群1から選択される少なくとも1つのmiRNAの使用に関する。群1のmiRNAは、全て細胞生産の顕著な増加を示し、全培養物により生産される生体分子の量の増加をもたらした。
さらなる態様においては、本発明は、in vitroで培養される細胞の細胞死を抑制するための、群2から選択される少なくとも1つのmiRNA、及び/または群3から選択されるmiRNAに対して向けられるmiRNA阻害剤の使用に関する。群2のmiRNAのいずれかを過剰発現し、かつ/または群3のmiRNAのいずれかを阻害することにより、細胞生存が促進され、生産細胞の総数を増加させる。次いでこのことは、生産される生体分子の総量を増加させる。
さらなる態様においては、本発明は、in vitroで培養される細胞の増殖を調節するために、群4もしくは5から選択される少なくとも1つのmiRNA、及び/または群4もしくは5のmiRNAに対して向けられるmiRNA阻害剤の使用に関する。細胞増殖は、培養の状態に依存して特異的に調節されうる。培養の初めでは、可能な限り迅速に最適細胞濃度に到達するように増殖が増強されうる。これは、群4のmiRNAのいずれかを過剰発現し、かつ/または群5のmiRNAのいずれかを阻害することにより実現しうる。これに対し、いったん培養が十分に確立したら、生体分子の生産のより高い能力を提供するためには、増殖の低下が有利でありうる。これは、群5のmiRNAのいずれかを過剰発現し、かつ/または群4のmiRNAのいずれかを阻害することにより実現しうる。
材料及び方法
細胞培養
CHO細胞の培養
CHO DG44細胞(Life Technologies、Carlsbad、CA、USA)から確立した浮遊適合性CHO−SEAP細胞は、TubeSpin(登録商標)バイオリアクター50ユーブ(TPP、Trasadingen、Switzerland)において、4mM L−Glutamine(Lonza、Vervier、Belgium)及び0.1%抗クランピング剤(Life Technologies)が補足されたProCHO5培養培地(Lonza)中で育成された。安定miRNA過剰発現CHO−SEAP細胞のための培養培地は、10μg/mL ピューロマイシンジヒドロクロリド(InvivoGen、San Diego、CA、USA)が追加で補足された。一般に、培養前の細胞濃度は、指数関数的増殖を確実にするため、トランスフェクションの1日前においてmLあたり0.5×106生細胞に調節され、細胞は、37℃、5%CO2、及び湿度85%にて、オービタルシェーカーインキュベーター(Sartorius Stedim、Goettingen、Germany、またはKuehner、Birsfelden、Switzerland)中で、140rpm(25mmオービット)での攪拌を伴って維持された。
細胞培養
CHO細胞の培養
CHO DG44細胞(Life Technologies、Carlsbad、CA、USA)から確立した浮遊適合性CHO−SEAP細胞は、TubeSpin(登録商標)バイオリアクター50ユーブ(TPP、Trasadingen、Switzerland)において、4mM L−Glutamine(Lonza、Vervier、Belgium)及び0.1%抗クランピング剤(Life Technologies)が補足されたProCHO5培養培地(Lonza)中で育成された。安定miRNA過剰発現CHO−SEAP細胞のための培養培地は、10μg/mL ピューロマイシンジヒドロクロリド(InvivoGen、San Diego、CA、USA)が追加で補足された。一般に、培養前の細胞濃度は、指数関数的増殖を確実にするため、トランスフェクションの1日前においてmLあたり0.5×106生細胞に調節され、細胞は、37℃、5%CO2、及び湿度85%にて、オービタルシェーカーインキュベーター(Sartorius Stedim、Goettingen、Germany、またはKuehner、Birsfelden、Switzerland)中で、140rpm(25mmオービット)での攪拌を伴って維持された。
ヒト細胞株の培養
T98G、HCT116、SKOV3、SGBSは、T25、T75、T175組織培養フラスコ、または96ウェル組織培養プレートにおいて、4mMグルタミン、100μMピルビン酸、及び10%v/vウシ胎児血清(FBS)を含有するDulbecco‘s Modified Eagle’s Medium (DMEM) High Glucose中で育成された。細胞は、37℃、5%CO2、及び湿度95%にて維持された。
T98G、HCT116、SKOV3、SGBSは、T25、T75、T175組織培養フラスコ、または96ウェル組織培養プレートにおいて、4mMグルタミン、100μMピルビン酸、及び10%v/vウシ胎児血清(FBS)を含有するDulbecco‘s Modified Eagle’s Medium (DMEM) High Glucose中で育成された。細胞は、37℃、5%CO2、及び湿度95%にて維持された。
HeLa細胞の細胞培養
接着増殖するHeLa DJ細胞(MediGene AG、Planegg/Martinsried、Germany)は、10%熱非動化FBS(Sigma Aldrich、St.Louis、MO、USA)及び2mM GlutaMAX(登録商標)(Life technologies、Carlsbad、CA、USA)が補足された、高グルコースDulbecco‘s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Life technologies)中で育成された。細胞は、T75またはT175組織培養フラスコ中で培養され、37℃、5%CO2、及び湿度95%にて維持された。
接着増殖するHeLa DJ細胞(MediGene AG、Planegg/Martinsried、Germany)は、10%熱非動化FBS(Sigma Aldrich、St.Louis、MO、USA)及び2mM GlutaMAX(登録商標)(Life technologies、Carlsbad、CA、USA)が補足された、高グルコースDulbecco‘s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Life technologies)中で育成された。細胞は、T75またはT175組織培養フラスコ中で培養され、37℃、5%CO2、及び湿度95%にて維持された。
CHO浮遊細胞株のトランスフェクション
miRNAミミックまたは小干渉RNA(siRNA)の非ウィルス性送達は、ScreenFect(登録商標)A(InCella、Eggenstein−Leopoldshafen、Germany)を使用して実施された。第一及び第二スクリーニングのための小規模なトランスフェクションは、U形底の96ウェル浮遊培養プレート(Greiner、Frickenhausen、Germany)中で行われた。第二スクリーニングについては、選択されたmiRNミミックが再度トランスフェクションされ、プレートは、37℃、5%CO2、及び湿度90%にてHeraeus(登録商標)BBD 6220細胞培養インキュベーター(Thermo Scientific)内に配置された、Mini−Orbitalデジタルシェーカー(Bellco、Vineland、USA)上に、800rpmでの攪拌で配置された。標的検証のためのスケールアップトランスフェクションは12ウェル浮遊培養プレート(Greiner)中で行われ、プレートは140rpmでの攪拌を伴うオービタルシェーカーインキュベーター中でインキュベートされた。トランスフェクションには、1139の異なるmiRNAミミックを有する全ネズミ科miRNAミミックライブラリー(Sanger miRBase release 18.0に基づく)(QIagen、Hilden、Germany)が使用され、全トランスフェクションは生物学的トリプリケートで行われた。Alexa Fluor(登録商標)647でラベルされた非標的化siRNA(AF647−siRNA)(Qiagen)が、トランスフェクション効率の指標として、各エフェクター及びコントロールmiRNAと共に同時トランスフェクションされた。機能的トランスフェクションコントロールとして、抗SEAP siRNA(Qiagen)、CHO特異的抗増殖剤(第一スクリーニングのために使用)、並びに細胞死コントロールsiRNA(第二スクリーニング)が使用された。非標的化のスクランブルmiRNA(Qiagen)は、ネガティブコントロール(miR−NT)として使用された。プラスミドDNA(pDNA)トランスフェクションについては、CHO−SEAP細胞がNEON(登録商標)トランスフェクションシステム(Life Technologies)を利用してヌクレオフェクションされた。1.0×107生細胞がペレット化されて110μLのBuffer R(Life Technologies)中に再懸濁され、次いでエンドトキシンフリーの25μgのpDNAが添加された。細胞は、1650ボルトにて一パルスで20ミリ秒かけてヌクレオフェクションされ、新たな培養培地10mL中に播種された。トランスフェクションされた細胞は、トランスフェクション後48時間に、10g/mLピューロマイシンジヒドロクロリドを培養物に添加することにより、抗生物質選択にかけられた。
miRNAミミックまたは小干渉RNA(siRNA)の非ウィルス性送達は、ScreenFect(登録商標)A(InCella、Eggenstein−Leopoldshafen、Germany)を使用して実施された。第一及び第二スクリーニングのための小規模なトランスフェクションは、U形底の96ウェル浮遊培養プレート(Greiner、Frickenhausen、Germany)中で行われた。第二スクリーニングについては、選択されたmiRNミミックが再度トランスフェクションされ、プレートは、37℃、5%CO2、及び湿度90%にてHeraeus(登録商標)BBD 6220細胞培養インキュベーター(Thermo Scientific)内に配置された、Mini−Orbitalデジタルシェーカー(Bellco、Vineland、USA)上に、800rpmでの攪拌で配置された。標的検証のためのスケールアップトランスフェクションは12ウェル浮遊培養プレート(Greiner)中で行われ、プレートは140rpmでの攪拌を伴うオービタルシェーカーインキュベーター中でインキュベートされた。トランスフェクションには、1139の異なるmiRNAミミックを有する全ネズミ科miRNAミミックライブラリー(Sanger miRBase release 18.0に基づく)(QIagen、Hilden、Germany)が使用され、全トランスフェクションは生物学的トリプリケートで行われた。Alexa Fluor(登録商標)647でラベルされた非標的化siRNA(AF647−siRNA)(Qiagen)が、トランスフェクション効率の指標として、各エフェクター及びコントロールmiRNAと共に同時トランスフェクションされた。機能的トランスフェクションコントロールとして、抗SEAP siRNA(Qiagen)、CHO特異的抗増殖剤(第一スクリーニングのために使用)、並びに細胞死コントロールsiRNA(第二スクリーニング)が使用された。非標的化のスクランブルmiRNA(Qiagen)は、ネガティブコントロール(miR−NT)として使用された。プラスミドDNA(pDNA)トランスフェクションについては、CHO−SEAP細胞がNEON(登録商標)トランスフェクションシステム(Life Technologies)を利用してヌクレオフェクションされた。1.0×107生細胞がペレット化されて110μLのBuffer R(Life Technologies)中に再懸濁され、次いでエンドトキシンフリーの25μgのpDNAが添加された。細胞は、1650ボルトにて一パルスで20ミリ秒かけてヌクレオフェクションされ、新たな培養培地10mL中に播種された。トランスフェクションされた細胞は、トランスフェクション後48時間に、10g/mLピューロマイシンジヒドロクロリドを培養物に添加することにより、抗生物質選択にかけられた。
接着細胞株のトランスフェクション
細胞は、7.500/cm2(T98G)、10.000/cm2(HCT116)、13.000/cm2(SKOV3)、または6.000/cm2(SGBS)にて、96ウェル組織培養プレート中に播種され、24時間育成された。トランスフェクションの当日、0.4μl ScreenFectA、4.6μl Dilution Buffer、5.0μl miRNA(1μM)、及び90μl DMEMを併せることによりトランスフェクション複合体が形成され、室温にて20分間リポプレックス形成をさせた。培養培地が除去され、各ウェルに100μlのトランスフェクション複合体が添加された。6時間後、もう75μlのDMEMが添加された。
細胞は、7.500/cm2(T98G)、10.000/cm2(HCT116)、13.000/cm2(SKOV3)、または6.000/cm2(SGBS)にて、96ウェル組織培養プレート中に播種され、24時間育成された。トランスフェクションの当日、0.4μl ScreenFectA、4.6μl Dilution Buffer、5.0μl miRNA(1μM)、及び90μl DMEMを併せることによりトランスフェクション複合体が形成され、室温にて20分間リポプレックス形成をさせた。培養培地が除去され、各ウェルに100μlのトランスフェクション複合体が添加された。6時間後、もう75μlのDMEMが添加された。
miRNAのトランスフェクション、及び組換えアデノ随伴ベクター(rAAV)の生産
トランスフェクションの1日前、HeLa DJ細胞(MediGene AG)が12ウェルマイクロプレートにおいて、cm2あたり3.0×104細胞の細胞密度にて、10%熱非動化FBS、及び2mM GlutaMAX(登録商標)が補足された高グルコースDMEM中に播種された。トランスフェクションの当日、Lipofectamine(商標)2000(Life technologies)を使用して、細胞にrAAV生産プラスミドとmiRミミックとが同時トランスフェクションされた。各ウェルにつき、1.8μLのLipofectamine(商標)2000が、100μl DMEM培地(Life Technologies)で予め希釈された。rAAVベクターを有する1.5μgのプラスミドDNA、HAdVヘルパープラスミド(E2A、E4、VARNA 1及び2)、並びにHAdV5 E1ヘルパープラスミドが、モル比1:1:1にて100μLのDMEM培地中で混合され、次いで50nM miRNAミミック(Qiagen、Hilden、Germany)が添加された。希釈されたLipofectamine(商標)2000をDNA/miRNA溶液と併せることにより、リポプレックス形成がなされ、次いで室温にて15分間インキュベーションされた。培養培地が除去され、10%熱非動化FBS、及び2mM GlutaMAX(登録商標)が補足された800μLの高グルコースDMEMが、各ウェルに添加された。最後に、200μLのリポプレックス溶液が各ウェルに順次添加された。
トランスフェクションの1日前、HeLa DJ細胞(MediGene AG)が12ウェルマイクロプレートにおいて、cm2あたり3.0×104細胞の細胞密度にて、10%熱非動化FBS、及び2mM GlutaMAX(登録商標)が補足された高グルコースDMEM中に播種された。トランスフェクションの当日、Lipofectamine(商標)2000(Life technologies)を使用して、細胞にrAAV生産プラスミドとmiRミミックとが同時トランスフェクションされた。各ウェルにつき、1.8μLのLipofectamine(商標)2000が、100μl DMEM培地(Life Technologies)で予め希釈された。rAAVベクターを有する1.5μgのプラスミドDNA、HAdVヘルパープラスミド(E2A、E4、VARNA 1及び2)、並びにHAdV5 E1ヘルパープラスミドが、モル比1:1:1にて100μLのDMEM培地中で混合され、次いで50nM miRNAミミック(Qiagen、Hilden、Germany)が添加された。希釈されたLipofectamine(商標)2000をDNA/miRNA溶液と併せることにより、リポプレックス形成がなされ、次いで室温にて15分間インキュベーションされた。培養培地が除去され、10%熱非動化FBS、及び2mM GlutaMAX(登録商標)が補足された800μLの高グルコースDMEMが、各ウェルに添加された。最後に、200μLのリポプレックス溶液が各ウェルに順次添加された。
miRNA発現ベクターのクローニング
Cricetulus griseus(cgr)の天然型miRNA前駆体(pre−miR)配列である、cgr−MIR30a、cgr−MIR30c−1、及びcgr−MIR30eが、ハムスターのゲノムDNA(gDNA)からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得られた。従って、gDNAはCHO−SEAP培養物から単離された。gDNAからのPCRは、Thermus aquaticus(Taq)及びPyrococcus furiosus(Pfu)からの2つの異なるDNAポリメラーゼの1:1混合物(Fisher Schientific、St.Leon Rot、Germany)を使用して実施された。およそ100bpの上流及び下流のゲノム隣接領域を含むpre−miR配列を増幅するためには、以下のPCRプライマーが使用された:cgr−MIR30a(PCR断片長332bp)、フォワード5’−TTGGATCCAGGGCCTGTATGTGTGAATGA−3’(配列ID番号:610)、リバース5’−TTTTGCTAGCACACTTGTGCTTTAGAAGTTGC−3’(配列ID番号:611);cgr−MIR30c−1(PCR断片長344bp)、フォワード5’−TTGGATCCAAAATTACTCAGCCCATGTAGTTG−3’(配列ID番号:612)、リバース5’−TTTTGCTAGCTTAGCCAGAGAAGTGCAACC−3’(配列ID番号:613);cgr−MIR30e(PCR断片長377bp)、フォワード5’−TTGGATCCATGTGTCGGAGAAGTGGTCATC−3’(配列ID番号:614)、リバース5’−TTTTGCTAGCCTCCAAAGGAAGAGAGGCAGTT−3’(配列ID番号:615)。増幅されたPCR産物は、それぞれの端において、PCRプライマーにより導入されたBamHI/Nhel制限部位を含有した。消化されたPCR断片は、Rapid DNA Dephos & Ligation Kit (Roche Dianostics)を利用して、miRNASelect(商標)pEGP−miR発現ベクター(Cell Biolabs、San Diego、CA、USA)中に、BamHI及びNhel制限部位間に、ライゲーションされた。pre−miR配列の正しい組み込みは、DNAシークエンシング(SRD、Bad Homburg、Germany)により、全てのmiRNAについて確認された。いずれのpre−miR配列も欠如するmiRNASelect(商標)pEGP−miR−Nullベクター(Cell Biolabs)が、ネガティブコントロールとして機能した。
Cricetulus griseus(cgr)の天然型miRNA前駆体(pre−miR)配列である、cgr−MIR30a、cgr−MIR30c−1、及びcgr−MIR30eが、ハムスターのゲノムDNA(gDNA)からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得られた。従って、gDNAはCHO−SEAP培養物から単離された。gDNAからのPCRは、Thermus aquaticus(Taq)及びPyrococcus furiosus(Pfu)からの2つの異なるDNAポリメラーゼの1:1混合物(Fisher Schientific、St.Leon Rot、Germany)を使用して実施された。およそ100bpの上流及び下流のゲノム隣接領域を含むpre−miR配列を増幅するためには、以下のPCRプライマーが使用された:cgr−MIR30a(PCR断片長332bp)、フォワード5’−TTGGATCCAGGGCCTGTATGTGTGAATGA−3’(配列ID番号:610)、リバース5’−TTTTGCTAGCACACTTGTGCTTTAGAAGTTGC−3’(配列ID番号:611);cgr−MIR30c−1(PCR断片長344bp)、フォワード5’−TTGGATCCAAAATTACTCAGCCCATGTAGTTG−3’(配列ID番号:612)、リバース5’−TTTTGCTAGCTTAGCCAGAGAAGTGCAACC−3’(配列ID番号:613);cgr−MIR30e(PCR断片長377bp)、フォワード5’−TTGGATCCATGTGTCGGAGAAGTGGTCATC−3’(配列ID番号:614)、リバース5’−TTTTGCTAGCCTCCAAAGGAAGAGAGGCAGTT−3’(配列ID番号:615)。増幅されたPCR産物は、それぞれの端において、PCRプライマーにより導入されたBamHI/Nhel制限部位を含有した。消化されたPCR断片は、Rapid DNA Dephos & Ligation Kit (Roche Dianostics)を利用して、miRNASelect(商標)pEGP−miR発現ベクター(Cell Biolabs、San Diego、CA、USA)中に、BamHI及びNhel制限部位間に、ライゲーションされた。pre−miR配列の正しい組み込みは、DNAシークエンシング(SRD、Bad Homburg、Germany)により、全てのmiRNAについて確認された。いずれのpre−miR配列も欠如するmiRNASelect(商標)pEGP−miR−Nullベクター(Cell Biolabs)が、ネガティブコントロールとして機能した。
定量的フローサイトメトリー
細胞解析のため、トランスフェクションされたCHO−SEAP細胞が、トランスフェクション後72時間に、細胞濃度、生存度、ネクローシス、及びトランスフェクション効率について解析された。紫(405nm)、青(488nm)、及び赤(635nm)の励起レーザーが備えられているMACSQuant(登録商標)Analyzer(Miltenyi Biotech、Bergisch−Gladbach、Germany)を利用して、細胞はハイスループット定量的フローサイトメトリーにより解析された。40μLの3×染色溶液[15μg/mL ヨウ化プロピジウム(PI)(Roth、Karlsruhe、Germany)、6μg/mL Calcein−Violet450−AM(eBioscience、Frankfurt、Germany)、0.5mM EDTAが補足されたProCHO5培地(Lonza)]が、80μLの細胞懸濁物に添加され、37℃、5%CO2、及び湿度85%にて、20分間インキュベートされた。次いで細胞が数えられ、生存度がCalcein−Violet450−AM染色により測定された。ネクローシス/アポトーシス後期の細胞はPI排除により検出され、トランスフェクション効率は、Alexa Fluor(登録商標)647蛍光について生細胞を解析することにより決定された。
細胞解析のため、トランスフェクションされたCHO−SEAP細胞が、トランスフェクション後72時間に、細胞濃度、生存度、ネクローシス、及びトランスフェクション効率について解析された。紫(405nm)、青(488nm)、及び赤(635nm)の励起レーザーが備えられているMACSQuant(登録商標)Analyzer(Miltenyi Biotech、Bergisch−Gladbach、Germany)を利用して、細胞はハイスループット定量的フローサイトメトリーにより解析された。40μLの3×染色溶液[15μg/mL ヨウ化プロピジウム(PI)(Roth、Karlsruhe、Germany)、6μg/mL Calcein−Violet450−AM(eBioscience、Frankfurt、Germany)、0.5mM EDTAが補足されたProCHO5培地(Lonza)]が、80μLの細胞懸濁物に添加され、37℃、5%CO2、及び湿度85%にて、20分間インキュベートされた。次いで細胞が数えられ、生存度がCalcein−Violet450−AM染色により測定された。ネクローシス/アポトーシス後期の細胞はPI排除により検出され、トランスフェクション効率は、Alexa Fluor(登録商標)647蛍光について生細胞を解析することにより決定された。
アポトーシスの解析
トランスフェクションされた細胞は、Nicoletti染色手順を使用してアポトーシスについて解析された。この目標を達成するため、接着増殖細胞は、PBSで洗浄され、35μlトリプシン/EDTA溶液の添加により剥離され、反応は10%v/v FBSを含有するDMEM80μLの添加により停止された。洗浄ステップを含む全材料が、解析の対象とされた。浮遊細胞は、染色手順に直接用いられた。2nより少ないDNA含量を有する細胞(=Sub−G0/G1細胞)は、アポトーシス性であると分類された。従って、トランスフェクションされた細胞の懸濁物50μLが、ウェルあたり培養培地100μを含有する新たな96ウェルマイクロプレートに移入され、5分間150×gにて遠心分離された。100μLの上清が、SEAPタンパク質定量化に使用される別の96ウェルマイクロプレートに移入された。細胞ペレットは、100μLのNicoletti染色溶液(0.1%クエン酸ナトリウム、0.05% Triton X−100、10μg/mL PI、及び1U/μL RNase Aが補足された1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS))中に再懸濁させられ、4℃にて30分間、暗所でインキュベートされた。処理された細胞は、MACSQuant(登録商標)Analyzer(Miltenyi Biotech)で定量的フローサイトメトリーにより解析された。
トランスフェクションされた細胞は、Nicoletti染色手順を使用してアポトーシスについて解析された。この目標を達成するため、接着増殖細胞は、PBSで洗浄され、35μlトリプシン/EDTA溶液の添加により剥離され、反応は10%v/v FBSを含有するDMEM80μLの添加により停止された。洗浄ステップを含む全材料が、解析の対象とされた。浮遊細胞は、染色手順に直接用いられた。2nより少ないDNA含量を有する細胞(=Sub−G0/G1細胞)は、アポトーシス性であると分類された。従って、トランスフェクションされた細胞の懸濁物50μLが、ウェルあたり培養培地100μを含有する新たな96ウェルマイクロプレートに移入され、5分間150×gにて遠心分離された。100μLの上清が、SEAPタンパク質定量化に使用される別の96ウェルマイクロプレートに移入された。細胞ペレットは、100μLのNicoletti染色溶液(0.1%クエン酸ナトリウム、0.05% Triton X−100、10μg/mL PI、及び1U/μL RNase Aが補足された1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS))中に再懸濁させられ、4℃にて30分間、暗所でインキュベートされた。処理された細胞は、MACSQuant(登録商標)Analyzer(Miltenyi Biotech)で定量的フローサイトメトリーにより解析された。
SEAP定量化
トランスフェクションされた細胞の培養上清中におけるSEAPタンパク質レベルが、白い96ウェル非結合性マイクロプレートにおいてSEAPレポーター遺伝子アッセイ(Roche Diagnostics)を使用して定量化された。原理的には、化学発光基質CSPD(3−(4−メトキシスピロ[1,2−ジオキセタン−3,2’(5’ −クロロ)−トリシクロ(3.3.1.13,7)デカン]−4−イル)フェニルフォスフェート)がSEAPにより脱リン酸化され、分解して最大波長477nmにて発光する不安定なジオキセタンアニオンを生じる。内因性のアルカリフォスファターゼは、提供されるInactivation Buffer(Roche Diagnostics)を使用する化学的不活性化の後に、試料を30分間65℃にてインキュベートすることにより、阻害された。CHO−SEAP細胞株の高いSEAP発現レベルゆえ、培養上清は新たな培養培地で1:60に予め希釈された。CSPD基質の添加後に、SpectraMax(登録商標)M5eマイクロプレートリーダー(Molecular Devices、Sunnyvale、CA、USA)を使用して、化学発光が検出された。
トランスフェクションされた細胞の培養上清中におけるSEAPタンパク質レベルが、白い96ウェル非結合性マイクロプレートにおいてSEAPレポーター遺伝子アッセイ(Roche Diagnostics)を使用して定量化された。原理的には、化学発光基質CSPD(3−(4−メトキシスピロ[1,2−ジオキセタン−3,2’(5’ −クロロ)−トリシクロ(3.3.1.13,7)デカン]−4−イル)フェニルフォスフェート)がSEAPにより脱リン酸化され、分解して最大波長477nmにて発光する不安定なジオキセタンアニオンを生じる。内因性のアルカリフォスファターゼは、提供されるInactivation Buffer(Roche Diagnostics)を使用する化学的不活性化の後に、試料を30分間65℃にてインキュベートすることにより、阻害された。CHO−SEAP細胞株の高いSEAP発現レベルゆえ、培養上清は新たな培養培地で1:60に予め希釈された。CSPD基質の添加後に、SpectraMax(登録商標)M5eマイクロプレートリーダー(Molecular Devices、Sunnyvale、CA、USA)を使用して、化学発光が検出された。
qRT−PCR解析
全RNA(小RNA<200bpを含む)が、miRNeasyミニKit(QIagen)を、製造者により提供されるプロトコールに従って使用して単離された。RNA濃度及び純度は、NanoDrop(登録商標)スペクトロフォトメーター(Thermo Schientific)を使用して、UVスペクトロメトリーにより決定された。相補的DNA(cDNA)は、miScript II RT Kit(Qiagen)を使用して、1μgの全RNAから合成された。LightCycler(登録商標)480(Roche Diagnostics)での成熟miRNの検出のため、20−1に希釈されたcDNAでmiScript SYBRグリーンPCRキット(Qiagen)を使用して、RT−PCRが実施された。以下のmiRNA特異的プライマーが使用された:成熟miR−30a−5pフォワード、5’−TGTAAACATCCTCGACTGGAAGC−3’(配列ID番号:616);miR−30b−5pフォワード、5’−TGTAAACATCCTACACTCAGCT−3’(配列ID番号:617);miR−30c−5pフォワード、5’−TGTAAACATCCTACACTCTCAGC−3’(配列ID番号:618);miR−30d−5pフォワード、5’−CTTTCAGTCAGATGTTTGCTGC−3’(配列ID番号:619);miR−30e−5pフォワード、5’−TGTAAACATCCTTGACTGGAAGC−3’(配列ID番号:620);miScript Universal Primer(Qiagen)が、各成熟miRNAに対するリバースプライマーとして機能した;U6フォワード、5’−CTCGCTTCGGCAGCACA−3’(配列ID番号:621);U6リバース、5’−AACGCTTCACGAATTTGCGT−3’(配列ID番号:622)。相対的な成熟miRNA発現差は、比較C(T)法を適用することにより計算された。
全RNA(小RNA<200bpを含む)が、miRNeasyミニKit(QIagen)を、製造者により提供されるプロトコールに従って使用して単離された。RNA濃度及び純度は、NanoDrop(登録商標)スペクトロフォトメーター(Thermo Schientific)を使用して、UVスペクトロメトリーにより決定された。相補的DNA(cDNA)は、miScript II RT Kit(Qiagen)を使用して、1μgの全RNAから合成された。LightCycler(登録商標)480(Roche Diagnostics)での成熟miRNの検出のため、20−1に希釈されたcDNAでmiScript SYBRグリーンPCRキット(Qiagen)を使用して、RT−PCRが実施された。以下のmiRNA特異的プライマーが使用された:成熟miR−30a−5pフォワード、5’−TGTAAACATCCTCGACTGGAAGC−3’(配列ID番号:616);miR−30b−5pフォワード、5’−TGTAAACATCCTACACTCAGCT−3’(配列ID番号:617);miR−30c−5pフォワード、5’−TGTAAACATCCTACACTCTCAGC−3’(配列ID番号:618);miR−30d−5pフォワード、5’−CTTTCAGTCAGATGTTTGCTGC−3’(配列ID番号:619);miR−30e−5pフォワード、5’−TGTAAACATCCTTGACTGGAAGC−3’(配列ID番号:620);miScript Universal Primer(Qiagen)が、各成熟miRNAに対するリバースプライマーとして機能した;U6フォワード、5’−CTCGCTTCGGCAGCACA−3’(配列ID番号:621);U6リバース、5’−AACGCTTCACGAATTTGCGT−3’(配列ID番号:622)。相対的な成熟miRNA発現差は、比較C(T)法を適用することにより計算された。
rAAVベクター定量化
トランスフェクション後72時間、HeLa DJ細胞は3回の凍結/融解サイクル(液体窒素/37℃)にかけられ、細胞片は3700×gでの15分間の遠心分離により除去された。AAVゲノム粒子は、AAV−2逆位末端反復(ITR)の定量化に基づきqRT−PCRにより決定された。ホスト細胞及びパックされていないDNAの除去のための粗試料の前処理は、Mayginnes及び同僚(Mayginnes et al., 2006)により開示された手順から適合され、以下の変更を伴った:DNaseI処理(Qiagen)前に、試料はDNase反応緩衝液(22.2mM Tris/HCl pH8.0、2.2mM MgCl2)で200倍に希釈された。最終試料は、MilliQ H2Oでさらに3倍希釈された。1×106 AAVベクタープラスミドコピー、及び/またはDNase Iを含有する緩衝液コントロールは、同等に処理された。反応は、CFX96TM器械(Bio−Rad Laboratories Inc., Hercules, Canada)にて、12.5μL SYBR Green Master Mix(QIAGEN)、2.5μL AAV2 ITRプライマーミックス(Aurnhammer et al., 2012)、5μL水、及び5μLテンプレート(処理済みサンプル/コントロール、非テンプレートコントロールのための水、または102から108プラスミドコピーの標準物質の系列希釈)を含む合計容量25μL中で実施された。PCR条件は、以下の通りであった:95℃にて5分間の予インキュベーション、次いで95℃にて10秒間にわたる変性の39サイクル、それから60℃での30秒間のアニーリング/伸長である。データ解析は、CFX Managerソフトウェア(Bio−Rad Laboratories Inc)を使用して行われた。
トランスフェクション後72時間、HeLa DJ細胞は3回の凍結/融解サイクル(液体窒素/37℃)にかけられ、細胞片は3700×gでの15分間の遠心分離により除去された。AAVゲノム粒子は、AAV−2逆位末端反復(ITR)の定量化に基づきqRT−PCRにより決定された。ホスト細胞及びパックされていないDNAの除去のための粗試料の前処理は、Mayginnes及び同僚(Mayginnes et al., 2006)により開示された手順から適合され、以下の変更を伴った:DNaseI処理(Qiagen)前に、試料はDNase反応緩衝液(22.2mM Tris/HCl pH8.0、2.2mM MgCl2)で200倍に希釈された。最終試料は、MilliQ H2Oでさらに3倍希釈された。1×106 AAVベクタープラスミドコピー、及び/またはDNase Iを含有する緩衝液コントロールは、同等に処理された。反応は、CFX96TM器械(Bio−Rad Laboratories Inc., Hercules, Canada)にて、12.5μL SYBR Green Master Mix(QIAGEN)、2.5μL AAV2 ITRプライマーミックス(Aurnhammer et al., 2012)、5μL水、及び5μLテンプレート(処理済みサンプル/コントロール、非テンプレートコントロールのための水、または102から108プラスミドコピーの標準物質の系列希釈)を含む合計容量25μL中で実施された。PCR条件は、以下の通りであった:95℃にて5分間の予インキュベーション、次いで95℃にて10秒間にわたる変性の39サイクル、それから60℃での30秒間のアニーリング/伸長である。データ解析は、CFX Managerソフトウェア(Bio−Rad Laboratories Inc)を使用して行われた。
結果
組換えCHO−SEAP浮遊細胞における一過性ハイコンテントmiRNAスクリーニング
発明者は、細胞機能を向上させるmiRNAを同定するため、組換えCHO−SEAP浮遊細胞において、1139の異なるmiRNAミミックを使用して、ハイコンテントmiRNAスクリーニングを行った。この関連で、全てのトランスフェクションされた細胞が、複数パラメーターのフローサイトメトリーベースの細胞解析を利用して、さまざまな細胞パラメーターについて解析された。96ウェルフォーマットでの小二重鎖RNAに対するトランスフェクション条件が慎重に最適化され、非標的化コントロールmiRNA(miR−NT)、SEAP mRNAに対するsiRNA(抗SEAP siRNA)、並びにCHO特異的抗増殖siRNAを含む、いくつかの機能的コントロールが使用された。複雑な生産培地中で育成される細胞中に効率的かつ機能的にmiRNAミミックを送達することが以前に示された(Fischer et al., 2013)、新規の非ウィルス性トランスフェクション試薬(ScreenFect(登録商標)A)を使用して、低い細胞傷害率にて、>95%の高いトランスフェクション率が再現性を伴って達成された。送達コントロールとして、蛍光ラベルされた非標的化siRNA(AlexaFluor(登録商標)647−siRNA)が、全エフェクター及びコントロールmiRNA/siRNAとそれぞれ同時トランスフェクションされた。トランスフェクション後72時間において、細胞濃度、生存度、ネクローシス、及びトランスフェクション効率が、ハイスループット定量的フローサイトメトリーにより測定された。SEAPタンパク質濃度は、市販のSEAPレポーターアッセイを使用して決定された。miRNAミミックの期間が限定的な一過性の効果と、細胞表現型の変化の出現との両者を考慮して、3日の培養期間が選択された。抗SEAP siRNAがトランスフェクションされた細胞のSEAP生産性の顕著な低下、並びに抗増殖siRNAがトランスフェクションされた細胞の生細胞密度(VCD)の顕著な低下は、全スクリーニングプレートにおける機能的トランスフェクションの指標となる(図1)。さらに、スパイクインのAlexaFluor(登録商標)(AF)647−siRNAが、各ウェルにおけるmiRNAミミックの取込みを確認した。
組換えCHO−SEAP浮遊細胞における一過性ハイコンテントmiRNAスクリーニング
発明者は、細胞機能を向上させるmiRNAを同定するため、組換えCHO−SEAP浮遊細胞において、1139の異なるmiRNAミミックを使用して、ハイコンテントmiRNAスクリーニングを行った。この関連で、全てのトランスフェクションされた細胞が、複数パラメーターのフローサイトメトリーベースの細胞解析を利用して、さまざまな細胞パラメーターについて解析された。96ウェルフォーマットでの小二重鎖RNAに対するトランスフェクション条件が慎重に最適化され、非標的化コントロールmiRNA(miR−NT)、SEAP mRNAに対するsiRNA(抗SEAP siRNA)、並びにCHO特異的抗増殖siRNAを含む、いくつかの機能的コントロールが使用された。複雑な生産培地中で育成される細胞中に効率的かつ機能的にmiRNAミミックを送達することが以前に示された(Fischer et al., 2013)、新規の非ウィルス性トランスフェクション試薬(ScreenFect(登録商標)A)を使用して、低い細胞傷害率にて、>95%の高いトランスフェクション率が再現性を伴って達成された。送達コントロールとして、蛍光ラベルされた非標的化siRNA(AlexaFluor(登録商標)647−siRNA)が、全エフェクター及びコントロールmiRNA/siRNAとそれぞれ同時トランスフェクションされた。トランスフェクション後72時間において、細胞濃度、生存度、ネクローシス、及びトランスフェクション効率が、ハイスループット定量的フローサイトメトリーにより測定された。SEAPタンパク質濃度は、市販のSEAPレポーターアッセイを使用して決定された。miRNAミミックの期間が限定的な一過性の効果と、細胞表現型の変化の出現との両者を考慮して、3日の培養期間が選択された。抗SEAP siRNAがトランスフェクションされた細胞のSEAP生産性の顕著な低下、並びに抗増殖siRNAがトランスフェクションされた細胞の生細胞密度(VCD)の顕著な低下は、全スクリーニングプレートにおける機能的トランスフェクションの指標となる(図1)。さらに、スパイクインのAlexaFluor(登録商標)(AF)647−siRNAが、各ウェルにおけるmiRNAミミックの取込みを確認した。
プレート間の比較を可能にするため、各試料の値それぞれのプレート上のコントロール(miR−NT)の平均値に正規化することにより、データの正規化が行われた。Dunnettの多重比較検定と組み合わせられた一元配置分散分析(ANOVA)を適用することにより、各読み出しパラメーターに関する有意な変化が決定された(プレート上のmiR−NTコントロールに対し、p<0.05)。VCD、アポトーシス、ネクローシス/アポトーシス後期、比及び容積SEAP生産性などの重要な細胞の特徴を考慮し、全1139のエフェクターmiRNAについて、正規化された平均値が決定された。統計的に有意なヒットの数を、試験された全ミミックに対する割合として表わす、ケーキチャートが図2に示される。SEAP生産性に関しては、トランスフェクションされたmiRNAの大部分である16%が、72後に上清中のSEAP生産量を有意に増大させ、最善の候補は最大で2倍の向上を示した(図2A)。miRNAの21%については、有意に上昇した細胞比生産性さえも検出された(図2B)。しかしながら、これは部分的には、細胞死の誘発を伴わない細胞濃度の低下に関連した。とくに平均比生産性を少なくとも20%上昇させた314のmiRNAは、細胞の生存度を低下させることなく、トランスフェクション後3日に、平均VCDを最大69%低下させることも発見された。全miRNAの5%については有意により高い生細胞密度が測定され、一方で全miRNAの13%はアポトーシス率を低下させた(図2C及びD)。細胞増殖を増強するmiRNAのパーセンテージは、miRNAライブラリーの4%がネクローシス細胞の数を減少させたという、 miRNA導入後のより高い生存度を示唆する事実に合致する(図2E)。
スクリーニング解析が、miR−30ダミリーの機能性を同定した
第一スクリーニングにより得られた結果を検証するため、発明者は、攪拌培養物において、選択されたmiRNAヒットのサブセットを一過性にトランスフェクションすることにより、第二スクリーニングを行った。マルチウェルプレートでの攪拌培養様式は、静置培養の推定される酸素制限が実質的に克服されている、標準的な振盪フラスコ培養と、はるかにより比較可能である。96ウェルプレートの振盪速度、並びにmiRNAミミック濃度は、懸濁物における強力な培養及び一過性トランスフェクションを可能にするために注意深く最適化された。第一ステップにおいては、第一細胞スクリーニング由来の297のmiRNAヒットが、上で言及されたバイオプロセス関連性細胞パラメーターのうち少なくても1つに対する正の影響の再評価のために、選択された。このアプローチは、第一スクリーニングと比較して、殆どのmiRNAについて表現型の効果を確認した(図7、8、及び9)。このことは、ハイコンテントスクリーニング法の高い再現性を支持する。
第一スクリーニングにより得られた結果を検証するため、発明者は、攪拌培養物において、選択されたmiRNAヒットのサブセットを一過性にトランスフェクションすることにより、第二スクリーニングを行った。マルチウェルプレートでの攪拌培養様式は、静置培養の推定される酸素制限が実質的に克服されている、標準的な振盪フラスコ培養と、はるかにより比較可能である。96ウェルプレートの振盪速度、並びにmiRNAミミック濃度は、懸濁物における強力な培養及び一過性トランスフェクションを可能にするために注意深く最適化された。第一ステップにおいては、第一細胞スクリーニング由来の297のmiRNAヒットが、上で言及されたバイオプロセス関連性細胞パラメーターのうち少なくても1つに対する正の影響の再評価のために、選択された。このアプローチは、第一スクリーニングと比較して、殆どのmiRNAについて表現型の効果を確認した(図7、8、及び9)。このことは、ハイコンテントスクリーニング法の高い再現性を支持する。
両スクリーニングの結果を解析することにより、全miR−30ファミリー(miR−30a、miR−30b、miR−30c、miR−30d、miR−30eを有する)は、CHO細胞におけるSEAP生産の増強に明らかに貢献した。全miR−30メンバーにおいて、ガイド鎖であると考えられる成熟5p鎖は、観察された細胞表現型を誘発した。しかしながら、miR−30c−3pも、miR−30ファミリーの中では唯一の3p鎖として、SEAP生産性を大いに上昇させることが分かった。図3Aは、第一スクリーニングにおける全6つの生産性向上性miR−30ファミリーメンバーについて、容積SEAP生産量におけるそれぞれの倍率変化を示す。miR−30b−5pにより媒介される上昇は生物学的トリプリケートの高い標準偏差ゆえに統計学的には有意ではなかったが、発明者は、そのより高い容積生産性に貢献する明らかな傾向につき、グラフにmiR−30b−5pを含めた。
さらに、miR−30ファミリーは、検証スクリーニングにおいては、CHO細胞における組換えタンパク質発現の強力な駆動者として、確実に確認されることができた(図3B)。より大きい割合のmiRNAミミックのトランスフェクションにより(50nM)、静置培養中でのトランスフェクション(15nM)と比較して、SEAP生産性の上昇は、濃度依存的なオフターゲット効果の誘発なく、さらにより顕著に表れた。SEAP生産の著しい上昇は、miR−30がトランスフェクションされた培養物中においては、細胞密度の低下が伴った(図3C)。しかしながら、生存度は負の影響を受けず(図3D)、これは、細胞が、細胞成長及び増殖よりも、大きく増強されたタンパク質生産にそのエネルギー源の殆どを使用したという推測を促進する。
miRNAファミリーの特徴的な特性は、成熟miRNA鎖が、そのmiRNA標的と完全に塩基が対になっている共通の「シード」配列を共有することである。全てのmiR−30−5pの5’末端における7つのヌクレオチドを有する共通の「シード」のほか、全てのmiR−30−5pは、位置9から11(UCC)及び15から17(ACU)それぞれにおけるヌクレオチドをも共有する。miR−30については22−23ヌクレオチドの全長を考慮すると、この発見は、このmiRNAファミリーが、低くとも60%の配列類似性を共有し、miR−30a−5p、miR−30d−5p、及びmiR−30e−5pは、>90%の配列相同性すら共有する。
それぞれのmiRNAによる複数の効果に対する識見を得るには、1つの細胞パラメーターが別の1つの細胞パラメーターに対してプロットされてもよく、これは細胞工学にとって非常に興味深い機能的miRNAの候補の同定を可能にする。この目的を達成するため、タンパク質生産及び生細胞密度の上昇、またはアポトーシスの減少などの、バイオプロセスのパフォーマンスに有益な表現型の変化が調べられた。miR−30ファミリーの詳細な解析は、miR−30a−5p、miR−30c−1−3p、及びmiR−30d−5pの3つのmiRNAが容積及び比生産性の両者の上昇に対し組み合わせ効果を呈し(図3E)、またmiR−30a−5p、及びmiR−30d−5pは両者ともアポトーシス細胞の数を追加で減少させ、細胞工学のための魅力的な標的としてその可能性を強調する(図3F)ことを明らかにした。
miR−30ファミリーがCHO細胞におけるタンパク質生産を増強させる潜在性をさらに調べるため、発明者は、さまざまな度合いの組換えSEAP生産増加を示すmiR−30ファミリーのメンバー2つを選択し(miR−30a−5p及びmiR−30c−5p)、増大した培養規模で、これらのmiRNAを別々に、並びに両miRNAの組合せをトランスフェクションすることにより、スケールアップ実験を行った。同様に、miR−30a−5p及びmiR−30c−5pは、2mLバッチ培養において、一過性トランスフェクション後に容積及び比SEAP生産性を大いに上昇させた(図4C)。miR−30a−5p単独がトランスフェクションされたCHO−SEAP培養物は、72時間後、より高い細胞密度を示し、一方でmiR−30c−5pの導入は、細胞密度の低下をもたらした(図4B)。しかしながら、生存度は負の影響を受けなかった。これは、細胞密度の低下は細胞比SEAP生産性の大いなる増大によるかもしれないことを示唆する。等しい濃度(それぞれ25nM)での両miRNA種の同時トランスフェクションは、miR−30c−5pの成長阻害効果を逆戻りさせることができ、50nMのmiR−30c−5pミミックでトランスフェクションされた細胞と比較して、より高いSEAP力価をもたらした。さらに、miR−30a/miR−30c濃度を最大50nM(合計miRNA濃度100nM)まで増加させることにより、生細胞密度は、miR−NTでトランスフェクションされたコントロール細胞と比較してさらに上昇し、miR−30a−5pミミック50nMでトランスフェクションされた細胞と類似の値を呈した。このことは、miR−30aとmiR−30cとの相加、または相乗効果さえにも賛同するかもしれず、これはさまざまなmiRNAの組合せでの安定発現に対する重要な暗示を有する。
miR−30ファミリーメンバーの安定過剰発現
miRNAミミックの一過性導入の結果が安定miRNA過剰発現に内挿されうることを確認するため、発明者はmiR−30ファミリーメンバー3つを選択し、CHO−SEAP親細胞株ベースの安定過剰発現細胞プールを確立させた。目的のmiRNAの安定な長期発現には、各前駆配列がホスト細胞ゲノムへと組み込まれなければならない。正しい細胞内Drosha/DGCR8プロセシングは、適切な上流及び下流隣接領域を含む、内因性pre−miRNAの天然型のゲノム配列環境を要する。従って発明者は、ゲノムDNAからのおよそ100bpの上及び下流の両隣接領域を含む、MIR30a、MIR30c、及びMIR30eの内因性前駆miRNA配列をPCR増幅し、哺乳類発現ベクター中へとサブクローニングした。pre−miRNA配列は、緑蛍光タンパク質−ピューロマイシン(GFP−Puro)融合タンパク質の上流に、ヒト伸長因子1アルファ(EF1α)プロモーターの制御下に挿入された(図5A)。この特徴は2つの長所を与える。第一に、GFP蛍光による正にトランスフェクションされた細胞の検出を可能にし(並びに蛍光活性化細胞選別を容易にし)、第二に、培養物に抗生物質圧力を加えることにより、安定的にトランスフェクションされた細胞の選択を可能にする。さらに、EF1αプロモーターは、強力な導入遺伝子並びにmiRNA発現を誘発し、また、ヒトサイトメガロウィルス(hCMV)前初期プロモーターなどのウィルスプロモーターと比較して、CHO細胞中でのエピジェニックな遺伝子サイレンシングに対する傾向は比較的低いことが報告されている。その結果、組換えCHO細胞における長期miRNA過剰発現は、人工的に作成されたキメラステムループに成熟miRNA−5p及び−3p鎖のみが組み込まれる、前に開示されたmiRNA発現アプローチと比較して、より安定的かつ効率的であることが予期される。
miRNAミミックの一過性導入の結果が安定miRNA過剰発現に内挿されうることを確認するため、発明者はmiR−30ファミリーメンバー3つを選択し、CHO−SEAP親細胞株ベースの安定過剰発現細胞プールを確立させた。目的のmiRNAの安定な長期発現には、各前駆配列がホスト細胞ゲノムへと組み込まれなければならない。正しい細胞内Drosha/DGCR8プロセシングは、適切な上流及び下流隣接領域を含む、内因性pre−miRNAの天然型のゲノム配列環境を要する。従って発明者は、ゲノムDNAからのおよそ100bpの上及び下流の両隣接領域を含む、MIR30a、MIR30c、及びMIR30eの内因性前駆miRNA配列をPCR増幅し、哺乳類発現ベクター中へとサブクローニングした。pre−miRNA配列は、緑蛍光タンパク質−ピューロマイシン(GFP−Puro)融合タンパク質の上流に、ヒト伸長因子1アルファ(EF1α)プロモーターの制御下に挿入された(図5A)。この特徴は2つの長所を与える。第一に、GFP蛍光による正にトランスフェクションされた細胞の検出を可能にし(並びに蛍光活性化細胞選別を容易にし)、第二に、培養物に抗生物質圧力を加えることにより、安定的にトランスフェクションされた細胞の選択を可能にする。さらに、EF1αプロモーターは、強力な導入遺伝子並びにmiRNA発現を誘発し、また、ヒトサイトメガロウィルス(hCMV)前初期プロモーターなどのウィルスプロモーターと比較して、CHO細胞中でのエピジェニックな遺伝子サイレンシングに対する傾向は比較的低いことが報告されている。その結果、組換えCHO細胞における長期miRNA過剰発現は、人工的に作成されたキメラステムループに成熟miRNA−5p及び−3p鎖のみが組み込まれる、前に開示されたmiRNA発現アプローチと比較して、より安定的かつ効率的であることが予期される。
miR−30ファミリーの各メンバーを過剰発現する安定細胞プールがピューロマイシン選択により順調に確立され、成熟miRNAの過剰発現がqRT−PCRにより評価された(図5B)。とりわけ、miRNA過剰発現の倍率変化値は、各成熟miRNAの内因性レベルに非常によく依存する。qRT−PCR解析は、適度にしか発現していないmiR−30a−5pまたはmiR−30c−5pと比較して、miR−30e−5pがCHO細胞中に非常に豊富にあることを明らかにした。このことは、可能性として、安定プール中でのmiR−30過剰発現における観察された違いを説明しうる。
安定MIR30a、MIR30c、及びMIR30e過剰発現プールは、7日間バッチ培養され、モックコントロール細胞(pEGP−MIR−Null)並びに親CHO−SEAP細胞株と比較された。上清中のSEAPタンパク質濃度の解析は、CHO−pEGP−MIR30a、CHO−pEGP−MIR30c、及びCHO−pEGP−MIR30eが、コントロール細胞と比較して有意により多いSEAP生産したことを確認した(図5C)。観察された容積生産性の上昇が細胞数または比生産性のいずれの上昇によるかを調べるため、発明者は細胞密度及び生存度を解析し、親CHO−SEAP細胞と比較として、MIR30a過剰発現細胞が、播種後3日からずっと高い細胞密度及び生存度に達したことを発見した(図5D)。代謝副産物の蓄積、並びに枯渇培養培地による栄養供給の低下は、ネガティブコントロール(pEGP−MIR−Null)及び親CHO−SEAP細胞の定常増殖フェーズの開始に見られるように、通常、増殖率の低下を伴う。MIR30a過剰発現細胞が播種後6日までより高い生存度で増殖し続けたことは、miR−30a−5pの一過性導入がアポトーシス率を低下させたという観察結果(図3F)と共に、MIR30aの抗アポトーシス機能を示唆する。
これに対し、MIR30c過剰発現プールはわずかな細胞濃度低下を示し、一方でMIR30e過剰発現は、バッチ培養の間に細胞濃度及び生存度に対して有意な効果を示さなかった。しかしながら、細胞比SEAP生産性は、MIR30c及びMIR30e過剰発現細胞において、それぞれほぼ2倍近く大きく上昇した(図5E)。これに伴い、非常に増強された組換えタンパク質生産性は、CHO−pEGP−MIR30cプールの細胞増殖の減少、並びにより早期における生存度の低下に対する1つの潜在的な理由であるかもしれず、これは、培地中の栄養物のより速い消費によるかもしれない。さらに、発明者は、同じpre−miR−30c前駆体から派生する両miR−30c鎖(5p及び3p)が、一過性スクリーニングにおける組換えタンパク質発現を増強することを観察した(図3A及びB)。従って、また別の潜在的な理由は、MIR30c過剰発現の結果として両鎖がより豊富に存在するため、成熟miR−30c−5p及びmiR−30c−1−3pが同時に作用し、より強い表現型効果をもたらすことでありうる。
驚くべきことに、これらの3つのmiRNAが同じシード配列を共有し、また残りの配列は数個のヌクレオチドにおいてしか異ならないにもかかわらず、細胞表現型に対する効果は著しく多様である。このことは、所与のmiRNAのその標的mRNAに対する特異性、また従ってその生物学的機能が、シード配列単独によるのではなく、むしろmiRNA配列全体により決定されることを明らかにする。miR−30ファミリーの多様な機能に対するもう1つの理由は、成熟配列はほぼ同一であるため、miRNA前駆配列が、miRNAの運命に重要な役割を果たし、またmiRNAの機能の決定に関与しているかもしれないと考えることができることだろう。まとめると、安定miR−30過剰発現の結果は、一過性miRNAミミックのトランスフェクション実験の効果が安定様式で再現されうることをついに証明した。より重要なことには、これは、miRNAが、生物学的製剤生産細胞の培養パフォーマンスを向上させるための魅力的なツールであることを再度強調する。
定常増殖フェーズの間、成熟miR−30発現レベルは上昇する
バッチ浮遊細胞培養生産プロセスは、異なるフェーズに大きく分けられ、定常増殖フェーズは主な生産期とみなされる。そのフェーズでは、細胞がその代謝を増殖からタンパク質発現上昇へと転換させ、これは流加培養において、並びに二フェーズ生産プロセスにおいて活用される特性である。miR−30ファミリーは、異なるCHO株により、並びにさまざまな培養条件下で発現されることが以前に示された。発明者は、miR−30ファミリーが実際にCHO細胞におけるタンパク質生産の増加に貢献するならば、成熟miR−30分子の濃度は、指数関数的増殖の間よりも定常増殖フェーズにおいてより豊富に存在するかもしれないと仮説を立てた。この仮定を試験するため、発明者は、3つの独立のCHO−SEAP細胞のバッチ培養を行い、培養プロセスの間のmiR−30a−5p及びmiR−30c−5pの発現レベルをそれぞれ解析した。qRT−PCR解析は、CHOバッチ培養の定常増殖期の間、成熟miR−30a及びmiR−30cが強く亢進したことを明らかにした(図6A)。アポトーシス細胞死により主に駆動される最後のステージである衰退フェーズにおいて両miRNAの発現レベルが亢進したままであったにもかかわらず、一過性(図6B)または安定miR−30過剰発現(図5D)後のいかなる時もアポトーシスの増加が観察されなかったため、miR−30ファミリーはアポトーシスに関与していないかもしれない。したがってむしろ、細胞は、より効果的なタンパク質発現へとその代謝転移を制御するための内因性の手段として、miR−30を使用しうるようである。冗長に翻訳され、正しく折り畳まれ、並びに翻訳後修飾されなければならないタンパク質と比較して、小RNAとしてのマイクロRNAは、遺伝子制御にすぐに利用可能になるためには、転写され処理されさえすればよい。このことは、miRNAを、細胞表現型における迅速な変換を付与する小さな内因性ツールとして分類した、最近の研究を促進する。
バッチ浮遊細胞培養生産プロセスは、異なるフェーズに大きく分けられ、定常増殖フェーズは主な生産期とみなされる。そのフェーズでは、細胞がその代謝を増殖からタンパク質発現上昇へと転換させ、これは流加培養において、並びに二フェーズ生産プロセスにおいて活用される特性である。miR−30ファミリーは、異なるCHO株により、並びにさまざまな培養条件下で発現されることが以前に示された。発明者は、miR−30ファミリーが実際にCHO細胞におけるタンパク質生産の増加に貢献するならば、成熟miR−30分子の濃度は、指数関数的増殖の間よりも定常増殖フェーズにおいてより豊富に存在するかもしれないと仮説を立てた。この仮定を試験するため、発明者は、3つの独立のCHO−SEAP細胞のバッチ培養を行い、培養プロセスの間のmiR−30a−5p及びmiR−30c−5pの発現レベルをそれぞれ解析した。qRT−PCR解析は、CHOバッチ培養の定常増殖期の間、成熟miR−30a及びmiR−30cが強く亢進したことを明らかにした(図6A)。アポトーシス細胞死により主に駆動される最後のステージである衰退フェーズにおいて両miRNAの発現レベルが亢進したままであったにもかかわらず、一過性(図6B)または安定miR−30過剰発現(図5D)後のいかなる時もアポトーシスの増加が観察されなかったため、miR−30ファミリーはアポトーシスに関与していないかもしれない。したがってむしろ、細胞は、より効果的なタンパク質発現へとその代謝転移を制御するための内因性の手段として、miR−30を使用しうるようである。冗長に翻訳され、正しく折り畳まれ、並びに翻訳後修飾されなければならないタンパク質と比較して、小RNAとしてのマイクロRNAは、遺伝子制御にすぐに利用可能になるためには、転写され処理されさえすればよい。このことは、miRNAを、細胞表現型における迅速な変換を付与する小さな内因性ツールとして分類した、最近の研究を促進する。
異所的なmiR−30過剰発現の後に観察された効果がmiR−30ファミリーメンバーのノックダウンにより元に戻されうるかを決定するため、発明者は、内因性miR−30c−5pを一過的に抑制し、次いでCHO−SEAP細胞のタンパク質生産性及び生細胞密度に与える結果を調べた。一般にアンタゴmiRまたはmiRNA阻害剤と呼ばれる、miR−30c−5pに特異的なアンチセンス阻害剤を使用して、発明者は、内因性miR−30c発現が強く抑制されることを発見した(図6C)。しかしながら、比SEAP生産性も生細胞密度も、抗miR−30c−5pアンタゴmiRにより有意な影響を受けなかった。このことは、内因性miR−30レベルを低下させることは、タンパク質生産に関して反対の効果をもたらさないかもしれないことを示唆する(図6D及びE)。
腫瘍細胞及び前脂肪細胞におけるアポトーシスの誘発
上で開示のスクリーニングにおいて同定されたmiRNAが、Chinese Hamster以外の種由来の細胞においても、その特定の細胞機能を呈するかどうかを決定するため、miR−134−5p、miR−378−5p、及びlet−7d−3pがヒト細胞株中で一過的に過剰発現された。調べられた細胞株は、腫瘍細胞株、つまりSKOV3(卵巣癌腫)、T98G(膠芽腫)、HCT 116(大腸癌腫)、及びSGBS前脂肪細胞細胞株を有した。CHO−SEAP細胞に関しては、miR−134−5p、miR−378−5p、及びlet−7d−3pは、4つの細胞株全てにおいてアポトーシスを誘発し、前脂肪細胞において効果は最も顕著であった。これらの結果は、CHO細胞において特定の細胞機能を有することが同定されたmiRNAは、他の種由来の細胞においてもその特定の効果を誘発するのに十分に適していることを示す。
上で開示のスクリーニングにおいて同定されたmiRNAが、Chinese Hamster以外の種由来の細胞においても、その特定の細胞機能を呈するかどうかを決定するため、miR−134−5p、miR−378−5p、及びlet−7d−3pがヒト細胞株中で一過的に過剰発現された。調べられた細胞株は、腫瘍細胞株、つまりSKOV3(卵巣癌腫)、T98G(膠芽腫)、HCT 116(大腸癌腫)、及びSGBS前脂肪細胞細胞株を有した。CHO−SEAP細胞に関しては、miR−134−5p、miR−378−5p、及びlet−7d−3pは、4つの細胞株全てにおいてアポトーシスを誘発し、前脂肪細胞において効果は最も顕著であった。これらの結果は、CHO細胞において特定の細胞機能を有することが同定されたmiRNAは、他の種由来の細胞においてもその特定の効果を誘発するのに十分に適していることを示す。
組換えアデノ随伴ベクター(rAAV)の生産
ウィルス生産プラスミドがトランスフェクションされたHeLa細胞は、さらなる感染のためのウィルス粒子を生産するために使用されうる。組換えアデノ随伴ベクター(rAAV)の生産を増加させるため、HeLa細胞はrAAV生産プラスミド及びmiRNA483ミミックが同時トランスフェクションされる。これは、1.5から2倍のrAAVの細胞生産の増加をもたらした(図11)。
ウィルス生産プラスミドがトランスフェクションされたHeLa細胞は、さらなる感染のためのウィルス粒子を生産するために使用されうる。組換えアデノ随伴ベクター(rAAV)の生産を増加させるため、HeLa細胞はrAAV生産プラスミド及びmiRNA483ミミックが同時トランスフェクションされる。これは、1.5から2倍のrAAVの細胞生産の増加をもたらした(図11)。
参照文献
Aurmhammer, C., Haase, M., Muether, N., Hausl, M., Rauschhuber, C., Huber, I., Nitschko, H,, Busch, U., Sing, A., Ehrhardt, A., Baiker, A., (2012) Universal real−time PCR for the detection and quantification of adeno−associated virus serotype 2−derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods 23, 18−28.
Ebert MS, Sharp PA; MicroRNA sponges: progress and possibilities; RNA. 2010 Nov;16(11):2043−50
Fischer S, Wagner A, Kos A, Aschrafi A, Handrick R, Hannemann J, Otte K. Breaking limitations of complex culture media: functional non−viral miRNA delivery into pharmaceutical production cell lines. J Biotechnol. 2013 Dec;168(4):589−600.
Kramer O, Klausing S, Noll T; Methods in mammalian cell line engineering: from random mutagenesis to sequence−specific approaches; Appl Microbiol Biotechnol. 2010 Sep;88(2):425−36.
Mayginnes, J.P., Reed, S.E., Berg, H.G., Staley, E.M., Pintel, D.J., Tullis, G.E., (2006) Quantification of encapsidated recombinant adeno−associated virus DNA in crude cell lysates and tissue culture medium by quantitative, real−time PCR. J Virol Methods 137, 193−204.
van Rooij E; The art of microRNA research; Circ Res. 2011 Jan 21;108(2):219−34.
Aurmhammer, C., Haase, M., Muether, N., Hausl, M., Rauschhuber, C., Huber, I., Nitschko, H,, Busch, U., Sing, A., Ehrhardt, A., Baiker, A., (2012) Universal real−time PCR for the detection and quantification of adeno−associated virus serotype 2−derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods 23, 18−28.
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Claims (15)
- 少なくとも2つの異なる領域を有する核酸コンストラクトであって、前記領域が、
細胞における生体分子の細胞生産を刺激する少なくとも1つのmiRNAをコードする第一領域であって、前記miRNAは群1から選択される、第一領域と、
細胞死を抑制する少なくとも1つのmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤をコードする第二領域であって、前記miRNAは群2から選択され、前記miRNA阻害剤は群3から選択されるmiRNAを阻害する、第二領域と、
細胞増殖を調節する少なくとも1つのmiRNA及び/またはmiRNA阻害剤をコードする第三領域であって、前記miRNAは群4または5から選択され、前記miRNA阻害剤は群4または5から選択されるmiRNAを阻害する、第三領域と
から選択され、
群1は、配列ID番号:69、1、2、3、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、26、27、28、29、32、34、37、39、40、41、42、44、45、46、47、48、49、51、52、53、55、56、57、58、62、63、66、67、70、75、76、77、80、81、82、83、86、88、90、91、93、98、99、100、101、102、103、104、106、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、120、121、128、130、132、134、136、137、138、141、142、143、147、151、152、155、158、163、165、171、174、182、183、185、186、188、190、201、203、207、211、212、214、217、222、223、228、230、233、238、239、240、254、255、269、276、278、279、285、及び294からなり、
群2は、配列ID番号:1、2、3、4、6、8、9、20、52、98、5、7、24、31、33、50、54、59、60、61、64、68、71、73、74、79、85、87、89、92、94、95、97、145、153、154、156、159、161、166、167、168、169、170、172、175、176、178、179、180、181、184、191、192、194、195、196、197、199、200、204、205、206、208、209、210、213、216、219、220、221、224、225、226、227、229、231、236、237、241、242、243、245、247、248、251、252、253、256、257、258、259、260、262、265、266、268、271、272、273、274、277、280、282、284、289、293、及び295からなり、
群3は、配列ID番号:296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、605、607、608、及び609からなり、
群4は、配列ID番号:5、7、68、79、94、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、22、23、30、35、36、38、43、65、72、78、84、96、105、107、108、119、122、123、124、125、126、127、129、131、133、135、139、140、144、146、148、149、150、160、162、164、173、177、187、189、193、198、202、215、218、232、234、235、244、246、249、250、261、263、264、267、270、275、281、283、287、288、及び291からなり、かつ
群5は、配列ID番号:516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、及び606からなる、核酸コンストラクト。 - 請求項1記載の核酸コンストラクトにおいて、
前記第一領域は、群9から選択される少なくとも1つのmiRNAをコードし、かつ/あるいは、
前記第二領域は、群10から選択される少なくとも1つのmiRNA、及び/または群11から選択されるmiRNAを阻害するmiRNA阻害剤をコードし、かつ/あるいは、
前記第三領域は、群12もしくは13から選択される少なくとも1つのmiRNA、及び/または群12もしくは13から選択されるmiRNAを阻害するmiRNA阻害剤をコードし、
群9は、配列ID番号:1、3、6、8、10、29、39、40、47、49、51、55、91、103、115、132、137、171、211、及び294からなり、
群10は、配列ID番号:3、7、20、54、59、73、94、145、159、175、176、178、179、199、206、248、251、252、266、及び272からなり、
群11は、配列ID番号:297、305、307、311、312、313、321、330、331、335、336、340、345、351、359、405、412、458、510、及び608からなり、
群12は、配列ID番号:5、7、22、30、35、43、68、72、78、84、96、146、148、160、173、177、198、202、232、234、244、267、及び283からなり、かつ
群13は、配列ID番号:517、523、526、529、531、533、537、548、550、558、560、561、563、566、567、571、575、577、583、591、600、601、及び604からなる、核酸コンストラクト。 - 請求項1または2記載の核酸コンストラクトにおいて、前記少なくとも2つの異なる領域は異なるプロモーターによって制御され、好ましくは少なくとも1つのプロモーターが誘発性または阻害性である、核酸コンストラクト。
- 上記請求項のいずれか記載の核酸コンストラクトにおいて、前記miRNA阻害剤がアンタゴmir、miRNAスポンジ、またはmiRNAデコイである、核酸コンストラクト。
- 上記請求項のいずれか記載の核酸コンストラクトにおいて、前記生体分子が、生物学的製剤であり、好ましくは組換え分子であり、より好ましくは組換えタンパク質または組換えウィルスである、核酸コンストラクト。
- 上記請求項のいずれか記載の核酸コンストラクトにおいて、前記核酸コンストラクトが、発現ベクター、エピソームベクター、またはウィルスベクターである、核酸コンストラクト。
- 請求項1〜6のいずれか記載のコンストラクトを有する細胞。
- 請求項7記載の細胞において、前記コンストラクトが前記細胞のゲノム中に組み込まれている、細胞。
- 請求項7または8記載の細胞において、群1、2、または4から選択される少なくとも1つのmiRNAをコードする前記細胞のゲノムの領域が増幅され、かつ/または、群3または5から選択される少なくとも1つのmiRNAをコードする前記細胞のゲノムの領域が欠損され、またはサイレンシングされている、細胞。
- 請求項7〜9のいずれか記載の細胞において、前記細胞が安定細胞株細胞である、細胞。
- in vitroで培養される細胞によって生産される生体分子の生産量を増加させる方法であって、
群1から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを前記細胞中で上昇させることによって、前記生体分子の細胞生産を刺激する工程と、
群2から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを前記細胞中で上昇させ、かつ/または群3から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを低下させることによって、細胞死を減少させる工程と、
群4または5から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを前記細胞中で上昇させ、かつ/または群4または5から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを低下させることによって、前記細胞の増殖を調節する工程と
から選択される少なくとも2つの工程を有し、
群1は、配列ID番号:69、1、2、3、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、26、27、28、29、32、34、37、39、40、41、42、44、45、46、47、48、49、51、52、53、55、56、57、58、62、63、66、67、70、75、76、77、80、81、82、83、86、88、90、91、93、98、99、100、101、102、103、104、106、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、120、121、128、130、132、134、136、137、138、141、142、143、147、151、152、155、158、163、165、171、174、182、183、185、186、188、190、201、203、207、211、212、214、217、222、223、228、230、233、238、239、240、254、255、269、276、278、279、285、及び294からなり、
群2は、配列ID番号:1、2、3、4、6、8、9、20、52、98、5、7、24、31、33、50、54、59、60、61、64、68、71、73、74、79、85、87、89、92、94、95、97、145、153、154、156、159、161、166、167、168、169、170、172、175、176、178、179、180、181、184、191、192、194、195、196、197、199、200、204、205、206、208、209、210、213、216、219、220、221、224、225、226、227、229、231、236、237、241、242、243、245、247、248、251、252、253、256、257、258、259、260、262、265、266、268、271、272、273、274、277、280、282、284、289、293、及び295からなり、
群3は、配列ID番号:296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、605、607、608、及び609からなり、
群4は、配列ID番号:5、7、68、79、94、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、22、23、30、35、36、38、43、65、72、78、84、96、105、107、108、119、122、123、124、125、126、127、129、131、133、135、139、140、144、146、148、149、150、160、162、164、173、177、187、189、193、198、202、215、218、232、234、235、244、246、249、250、261、263、264、267、270、275、281、283、287、288、及び291からなり、かつ
群5は、配列ID番号:516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、及び606からなる、方法。 - 請求項11記載の方法において、miRNAのレベルが、前記細胞中において前記miRNAを過剰発現することによって、前記miRNAの存在下で前記細胞に電気穿孔を施すことによって、または前記細胞が培養される培地に前記miRNA及びトランスフェクタントを添加することによって、上昇させられる、方法。
- 請求項11または12記載の方法において、miRNAのレベルが、前記miRNAをコードするもしくはその転写を調節する前記細胞のゲノムの領域を欠損させることによって、前記miRNAに対して向けられるmiRNA阻害剤を前記細胞中で発現させることによって、前記miRNA阻害剤の存在下で前記細胞に電気穿孔を施すことによって、または前記細胞が培養される培地にmiRNA阻害剤及びトランスフェクタントを添加することによって、低下させられる、方法。
- 細胞中で生体分子を生産する方法であって、
細胞培養物中で前記細胞を繁殖させる工程と、
配列ID番号:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAのレベルを上昇させる工程と、
前記細胞培養物から前記生体分子を単離する工程と
を有する、方法。 - 細胞中での生体分子の生産における、群1から選択される少なくとも1つのmiRNAと、群2から選択される少なくとも1つのmiRNA及び/または群3から選択されるmiRNAを阻害する少なくとも1つのmiRNA阻害剤と、群4もしくは5から選択される少なくとも1つのmiRNA及び/または群4もしくは5から選択されるmiRNAを阻害する少なくとも1つのmiRNA阻害剤との組合せの使用であって、
群1は、配列ID番号:1、2、3、4、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、26、27、28、29、32、34、37、39、40、41、42、44、45、46、47、48、49、51、52、53、55、56、57、58、62、63、66、67、69、70、75、76、77、80、81、82、83、86、88、90、91、93、98、99、100、101、102、103、104、106、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、120、121、128、130、132、134、136、137、138、141、142、143、147、151、152、155、158、163、165、171、174、182、183、185、186、188、190、201、203、207、211、212、214、217、222、223、228、230、233、238、239、240、254、255、269、276、278、279、285、及び294からなり、
群2は、配列ID番号:1、2、3、4、6、8、9、20、52、98、5、7、24、31、33、50、54、59、60、61、64、68、71、73、74、79、85、87、89、92、94、95、97、145、153、154、156、159、161、166、167、168、169、170、172、175、176、178、179、180、181、184、191、192、194、195、196、197、199、200、204、205、206、208、209、210、213、216、219、220、221、224、225、226、227、229、231、236、237、241、242、243、245、247、248、251、252、253、256、257、258、259、260、262、265、266、268、271、272、273、274、277、280、282、284、289、293、及び295からなり、
群3は、配列ID番号:296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、605、607、608、及び609からなり、
群4は、配列ID番号:5、7、68、79、94、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、22、23、30、35、36、38、43、65、72、78、84、96、105、107、108、119、122、123、124、125、126、127、129、131、133、135、139、140、144、146、148、149、150、160、162、164、173、177、187、189、193、198、202、215、218、232、234、235、244、246、249、250、261、263、264、267、270、275、281、283、287、288、及び291からなり、かつ
群5は、配列ID番号:516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、及び606からなる、使用。
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