JP2017507165A - マイクロモールド成形された、または３次元印刷されたパルス放出ワクチン製剤 - Google Patents

Abstract

好ましくは２つまたはそれを超える期間で放出する抗原の単回注射のための、エマルジョン系およびマイクロモールド成形された（「ＭＭ」）、または３次元印刷された（「３ＤＰ」）ポリマー製剤を開発した。製剤は、好ましくは生体適合性、生分解性ポリマーから形成されている。抗原をカプセル封入する別個の領域は、単独で、または他の抗原、アジュバント、安定剤、および放出調整剤との組み合わせで、製剤中に存在する。抗原は好ましくは、投与時に賦形剤中に存在するか、または即時放出のために製剤の表面に存在し、そして抗原の初期放出の１０〜４５日後に放出されるために、必要に応じて、１つまたはそれを超えるさらなる期間における１０〜９０日間隔での抗原の放出のために製剤内に組み込まれている。ポリオに対する免疫化のための好ましい実施形態では、抗原は投与時に、ならびにその２か月後、４か月後および６か月後に放出される。

Description

発明の分野
本発明は概して、ワクチンの複数回の放出を提供する注射用ワクチン製剤の分野内にある。

発明の背景
ワクチンは典型的には抗原の初期用量、続いて初期投与後の、典型的には１０〜６０日後の規定の回数の１またはそれを超えるブースター用量を含む。世界の大部分で、ブースター用量の投与の必要性は、ワクチンの実用性を明らかに制限し、ならびに農業適用における経費および困難を増加させる。

ポリマーミクロスフェアは、効果的なワクチン送達ベヒクルである可能性を有する。それらは抗原提示細胞（ＡＰＣ）のターゲティングを強化する能力を有し、そして抗原の制御された、持続放出の可能性を有し、それによって複数回のワクチン接種の必要性を排除する可能性がある。さらにポリマーマトリックスは、不適な外部環境からのシールドとして作用でき、そして有害反応を低減させ、そして免疫低下した個体において、ワクチン株によって引き起こされる問題を抑制する可能性を有する。ＰＬＧＡミクロスフェアは、バースト放出を伴う、および伴わない単回免疫化用に開発された。ＰＬＧＡが提供する生分解性の性質および持続放出特性を考慮すると、ＰＬＧＡから製剤化されたミクロスフェアは、ワクチンの送達に有用であり得る。Ｋｉｒｂｙら、Ｃｈａｐｔｅｒ１３：Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇａｌａｃｔｉｄｅ ＰＬＧＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（２０１３）にまとめられている。ＰＬＧＡ系のマイクロ粒子は、ダブルエマルジョン溶剤蒸発、ナノ沈殿、クロスフロー濾過、塩析技術、エマルジョン拡散法、ジェットミリングおよび噴霧乾燥によって従来的に生成される。Ｋｉｒｂｙら、Ｃｈａｐｔｅｒ１３：Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇａｌａｃｔｉｄｅ ＰＬＧＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（２０１３）にまとめられている。ＰＬＧＡミクロスフェアを製剤化して、アジュバントとして作用できる、薬物およびタンパク質を含む様々な部分（ｍｏｉｅｔｙ）を組み込むこともできる。これらの方法によって生成されたＰＧＬＡ粒子を凍結乾燥し、そして後の使用および送達のために保存できることが企図されてきた。

Ｈａｎｅｓら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．、２８：９７−１１９（１９９７）は、ポリマーミクロスフェアを作製して、サブユニットタンパク質およびペプチド抗原を、それらの天然形態で連続様式またはパルス様式で数週間から数か月間、信頼でき、そして再現性のある動態で送達して、ブースター免疫化の必要性を取り除く試みに関して報告している。ミクロスフェアは、カプセル封入された抗原に及ぼすそれらの保護効果および腸管のパイエル板によって取り込まれるそれらの能力ゆえに、経口ワクチン送達のキャリヤとしての可能性を有している。ポリマーマトリックス内に捕捉されるか、またはこれに代えて、ポリマー自体の骨格に組み込まれ、そしてポリマーが分解する場合に抗原と同時に放出される、サイトカインを含むワクチンアジュバントの共送達によって、抗原のためのこれらの最適なデポー製剤の効力が強化され得る。

Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．４７（２）：１３５−１５０（１９９７）によって報告されるように、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）のためのサブユニットワクチン（例えば、ｇｐ１２０）の投与は、反復免疫化を擬似するシングルショットワクチンによって促進できる。ｇｐ１２０のパルス放出を提供するポリ（乳酸−コ
−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェアを作製した。ポリマー溶剤として塩化メチレンまたは酢酸エチルのいずれかを用いて、水中油中水型マイクロカプセル化法を使用してミクロスフェアを作製した。タンパク質は、２つの別個の段階において、生理学的条件下で放出された：初日に初期バーストが放出され、そして数週間または数か月後にタンパク質の第２バーストが放出された。タンパク質の第２バーストはＰＬＧＡの固有粘度およびラクチド／グリコリド比（バルク浸食）に依存した。

これらの研究により、注射用マイクロ粒子を使用してワクチン応答を達成することが可能であることが実証される。しかしながら、そのような生成物はヒトまたは動物使用のためにまだ承認されていない。抗原の効果的な搭載、カプセル封入および放出の均一性、ならびに抗原性に影響を及ぼさない、溶剤の極度な低レベルを達成することは困難である。

熱に安定な製剤の開発によってワクチン流通のための「コールドチェーン」の必要性を無くすことで、年間約２億ドルを節約し得ると推測されている。これらの戦略の実行に伴う困難の原因は、適切な凍結保護（ｃｒｙｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）方法の欠如にある。Ｋｉｒｂｙら、Ｃｈａｐｔｅｒ１３：Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇａｌａｃｔｉｄｅ ＰＬＧＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（２０１３）にまとめられている。ナノワクチンに関する類似の情報および開示を、Ｇｒｅｇｏｒｙら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．３：Ａｒｔｉｃｌｅ １３（２０１３）に見出すことができる。Ｎａｎｄｅｄｋａｒ、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．３４：９９５−１００３（２００９）。ミクロスフェアに含まれるタンパク質の安定化には問題が多い。多くの種類の安定化賦形剤が研究されている。ＫｉｍおよびＰａｃｋ、ＢｉｏＭＥＭＳ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１：１９−５０（２００６）にまとめられている。加えて、ミクロスフェア製作に使用されるポリマーの種類、その分解速度、分解生成物の酸性度、疎水性等もまた、組み込まれたタンパク質の安定性に影響し得る。

したがって、２回またはそれを超える回数でカプセル封入された抗原の放出を提供する注射用ポリマー製剤を提供することは本発明の目的である。

カプセル封入された抗原に損傷を与えず、そして安定化できる注射用ポリマー製剤を提供することは本発明のさらなる目的である。
２回またはそれを超える回数でカプセル封入された抗原の放出を提供する注射用ポリマー製剤のマイクロモールディングおよび３次元印刷のための方法および材料、ならびに得られた製剤を提供することが本発明のなおさらなる目的である。

Ｋｉｒｂｙら、Ｃｈａｐｔｅｒ１３：Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇａｌａｃｔｉｄｅ ＰＬＧＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（２０１３） Ｈａｎｅｓら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．、２８：９７−１１９（１９９７） Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ．４７（２）：１３５−１５０（１９９７） Ｇｒｅｇｏｒｙら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．３：Ａｒｔｉｃｌｅ １３（２０１３） Ｎａｎｄｅｄｋａｒ、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．３４：９９５−１００３（２００９） ＫｉｍおよびＰａｃｋ、ＢｉｏＭＥＭＳ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１：１９−５０（２００６）

好ましくは２つまたはそれを超える期間で放出する、抗原の単回注射のためのエマルジョン系およびマイクロモールド成形された（「ＭＭ」）、または３次元印刷（「３ＤＰ」）されたポリマー製剤を開発した。製剤を好ましくは生体適合性、生分解性ポリマーで形成する。単独で、または他の抗原、アジュバント、安定剤、および放出調整剤との組み合わせで抗原をカプセル封入する別個の領域が製剤内に存在する。抗原は好ましくは投与時に賦形剤中に存在するか、または即時放出のために製剤の表面に存在し、そして抗原の初回放出から１０〜４５日後に放出するために、必要に応じて１つまたはそれを超えるさらなる期間に１０〜９０日間隔で抗原を放出するために製剤内に組み込まれている。トレハロースガラスのような安定化剤の使用により抗原を安定化し得る。ポリオに対する免疫化のための好ましい実施形態では、投与のときに、そしてその２、４および６か月後に抗原を放出する。好ましい実施形態では、放出のバースト間の漏れは最小であり、そして放出は狭い時間枠で生じる。

研究により、オーバーラップがなく、カプセル封入された抗原に対する分解または損傷が最小である、抗原の別個の放出を提供するポリマーおよび溶剤系の選択が実証される。好ましい溶剤としては、塩化メチレンおよびクロロホルムが挙げられ、そして好ましいポリマーはポリ乳酸（「ＰＬＡ」）、ポリグリコール酸（「ＰＧＡ」）、およびそれらのコポリマー（「ＰＬＧＡ」）である。

針またはカニューレを介する皮下または筋肉内注射用に、鼻腔内のような粘膜領域への局所注射用に、または表皮への乱切によるために、製剤を設計する。好ましい適用は、細菌、ウイルス、原虫および寄生生物のような感染病原体に対して効果的な免疫応答を引き出す抗原の投与のためのものである。しかしながら、製剤は、他の治療用、予防用または診断用薬剤を単独でまたは抗原と組み合わせて投与するために使用してもよい。

図１は、ＰＬＡ上で２６倍の三価ＩＰＶを、室内の温度および湿度で１６時間乾燥させた後に保持されたＤ抗原のパーセンテージに及ぼす、賦形剤：ワクチン比低下の影響を示す棒グラフである。賦形剤：１０％ソルビトール、８．５％ＭＳＧ、８．５％ＭｇＣｌ_２。 図２は、３７℃で湿気のある環境で賦形剤を伴う、凍結乾燥したＩＰＶ（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）の長期間安定性を示す線グラフである。安定性を経時的な（日）回収パーセント（回収％）として表現する。線グラフでは、Ｉ型ＩＰＶに関する線を（１）と指定し、ＩＩ型ＩＰＶに関する線を（２）と指定し、そしてＩＩＩ型ＩＰＶに関する線を（３）と指定する。 図３Ａおよび３Ｂは、ＰＬＬＡ（５０ｋＤ）からの、モデルタンパク質であるウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）（図３Ａ、μｇ／１０ｍｇのミクロスフェア；図３Ｂ、％ＢＳＡ）の、５％ＢＳＡおよび０．５％ＢＳＡに関する経時的な（週）放出のグラフである。 図４Ａおよび４Ｂは、ＰＬＬＡ（１００ｋＤ）からの、モデルタンパク質であるウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）（図４Ａ、μｇ／１０ｍｇのミクロスフェア；図４Ｂ、％ＢＳＡ）の、５％ＢＳＡおよび０．５％ＢＳＡに関する経時的な（週）放出のグラフである。 図５Ａおよび５Ｂは、ＰＬＬＡ（３００ｋＤ）からの、モデルタンパク質であるウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）（図５Ａ、μｇ／１０ｍｇのミクロスフェア；図５Ｂ、％ＢＳＡ）の、５％ＢＳＡおよび０．５％ＢＳＡに関する経時的な（週）放出のグラフである。 図６Ａおよび６Ｂは、Ｐ（ｄ，ｌ）ＬＡ（２０ｋＤ）からの、モデルタンパク質であるウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）（図６Ａ、μｇ／１０ｍｇのミクロスフェア；図６Ｂ、％ＢＳＡ）の、５％ＢＳＡおよび０．５％ＢＳＡに関する経時的な（週）放出のグラフである。 図７Ａおよび７Ｂは、ＰＬＧＡ製剤（図７Ａ）およびボーラス注射（図７Ｂ）に関する、経時的な（週）タンパク質放出のグラフである。 図８Ａおよび８Ｂは、カルボキシル基で誘導体化されたＰＬＧＡ（５０：５０）（２０ｋＤ）からの、０．５％の別のモデルタンパク質卵白アルブミン（「ＯＶＡ」）の放出と比較した、０．５％のモデルタンパク質であるウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）（図８Ａ、μｇ／１０ｍｇのミクロスフェア；図８Ｂ、％ＢＳＡ）の、経時的な（週）放出のグラフである。 図９Ａおよび９Ｂは、カルボキシル基で誘導体化されたＰＬＧＡ（５０：５０）（３１ｋＤ）からの、５％の別のモデルタンパク質卵白アルブミン（「ＯＶＡ」）の放出と比較した、５％のモデルタンパク質であるウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）（図９Ａ、μｇ／１０ｍｇのミクロスフェア；図９Ｂ、％ＢＳＡ）の、経時的な（週）放出のグラフである。 図１０Ａおよび１０Ｂは、カルボキシル基で誘導体化されたＰＬＧＡ（５０：５０）（３１ｋＤ）からの、０．５％の別のモデルタンパク質卵白アルブミン（「ＯＶＡ」）の放出と比較した、０．５％のモデルタンパク質であるウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）（図１０Ａ、μｇ／１０ｍｇのミクロスフェア；図１０Ｂ、％ＢＳＡ）の、経時的な（週）放出のグラフである。 図１１Ａおよび１１Ｂは、エマルジョンによって（図１１Ａ）、および３Ｄ印刷またはマイクロモールディング（図１１Ｂ）によって作製された粒子の概略図であり、ならびにボーラス注射からのタンパク質の放出をモデル化している、エマルジョン粒子（図１１Ｃ）および３ＤＰ粒子（図１１Ｄ）からのタンパク質の放出である。図１１Ｅは、ボーラス注射をシミュレーションする、１か月経過時のポリマー分解に基づくバーストの概略図である。 図１２Ａ〜１２Ｄは、３Ｄ印刷プロセスの概略図である：ＰＬＧＡ粒子の構造を作り出し（図１２Ａ）、薬物またはタンパク質を粒子に充填し（図１２Ｂ）、薬物またはタンパク質を乾燥させ（図１２Ｃ）、そして粒子をカプセル封入する（図１２Ｄ）。 図１３は、印刷中に圧電式のノズルジェットから「インク」（ポリマー溶液）の均一な単独の液滴を生成するために最適化されるべき波形パラメータの概略図である。 図１４Ａ〜１４Ｃは、糖賦形剤である１Ｍトレハロース、１Ｍスクロース、および３Ｍスクロースと共に凍結乾燥し、次いで４℃、２５℃または３７℃でインキュベートした後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。 図１４Ａ〜１４Ｃは、糖賦形剤である１Ｍトレハロース、１Ｍスクロース、および３Ｍスクロースと共に凍結乾燥し、次いで４℃、２５℃または３７℃でインキュベートした後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。 図１５Ａおよび１５Ｂは、０、０．５、０．７５、１または１．２５Ｍトレハロース、１と共に凍結乾燥し、次いで４℃（図１５Ａ）または２５℃（図１５Ｂ）でインキュベートした後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。 図１５Ａおよび１５Ｂは、０、０．５、０．７５、１または１．２５Ｍトレハロース、１と共に凍結乾燥し、次いで４℃（図１５Ａ）または２５℃（図１５Ｂ）でインキュベートした後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。 図１６Ａおよび１６Ｂは、溶剤としてテトラフルオロエチレン（「ＴＦＥ」）、ジクロロメタン（「ＤＣＭ」）、またはＴＦＥおよびＤＣＭを用いて、糖賦形剤無しで（図１６Ａ）または賦形剤として０．７５Ｍトレハロースを用いて（図１６Ｂ）、溶剤が蒸発するまで溶剤と混合した後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。 図１６Ａおよび１６Ｂは、溶剤としてテトラフルオロエチレン（「ＴＦＥ」）、ジクロロメタン（「ＤＣＭ」）、またはＴＦＥおよびＤＣＭを用いて、糖賦形剤無しで（図１６Ａ）または賦形剤として０．７５Ｍトレハロースを用いて（図１６Ｂ）、溶剤が蒸発するまで溶剤と混合した後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。 図１７Ａは、０Ｍの糖、０．５Ｍトレハロース、または０．５Ｍトレハロース・スクロースを伴うＩＶＰを３Ｄ−印刷されたＰＬＡ基材に印刷し、そして２５℃、相対湿度２２％で乾燥させた後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。図１７Ｂは、０．２５Ｍトレハロースまたは０．５Ｍトレハロース・スクロースを伴うＩＶＰを３Ｄ−印刷されたＰＬＡ基材に印刷し、そして２５℃、相対湿度１０．７％で乾燥させた後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。 図１７Ａは、０Ｍの糖、０．５Ｍトレハロース、または０．５Ｍトレハロース・スクロースを伴うＩＶＰを３Ｄ−印刷されたＰＬＡ基材に印刷し、そして２５℃、相対湿度２２％で乾燥させた後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。図１７Ｂは、０．２５Ｍトレハロースまたは０．５Ｍトレハロース・スクロースを伴うＩＶＰを３Ｄ−印刷されたＰＬＡ基材に印刷し、そして２５℃、相対湿度１０．７％で乾燥させた後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。 図１８Ａおよび１８Ｂは、０．５または０．７５Ｍトレハロースと共に凍結乾燥し、次いで２５℃でインキュベートした後（図１８Ａ）、またはピペッティングされた０．５Ｍトレハロース・スクロースもしくは噴射された０．５Ｍトレハロース・スクロースと共に凍結乾燥し、次いで２５℃、相対湿度１０．７％で乾燥させた後（図１８Ｂ）に保持されたＤ抗原のパーセントのグラフである。 図１８Ａおよび１８Ｂは、０．５または０．７５Ｍトレハロースと共に凍結乾燥し、次いで２５℃でインキュベートした後（図１８Ａ）、またはピペッティングされた０．５Ｍトレハロース・スクロースもしくは噴射された０．５Ｍトレハロース・スクロースと共に凍結乾燥し、次いで２５℃、相対湿度１０．７％で乾燥させた後（図１８Ｂ）に保持されたＤ抗原のパーセントのグラフである。 図１９Ａ〜１９Ｃは、注射後１週目（図１９Ａ）、２週目（図１９Ｂ）、および４週目（図１９Ｃ）に表３に提示された群に関してプロットされた抗−ＢＳＡ ＩｇＧ（抗体）力価を示す（ｌｏｇ２値で）グラフである。陰性対照は全てゼロであり、そしてミクロスフェア製剤は、ボーラス対照と比較して、同等またはより強い応答を生じている。（Ｆ４およびＦ８は空のミクロスフェアであり、薬物は含まれない；表４参照）。 図１９Ａ〜１９Ｃは、注射後１週目（図１９Ａ）、２週目（図１９Ｂ）、および４週目（図１９Ｃ）に表３に提示された群に関してプロットされた抗−ＢＳＡ ＩｇＧ（抗体）力価を示す（ｌｏｇ２値で）グラフである。陰性対照は全てゼロであり、そしてミクロスフェア製剤は、ボーラス対照と比較して、同等またはより強い応答を生じている。（Ｆ４およびＦ８は空のミクロスフェアであり、薬物は含まれない；表４参照）。 図２０Ａ〜２０Ｃは、製剤Ｃ（図２０Ａ）、製剤Ｇ（図２０Ｂ）、および製剤Ｅ（図２０Ｃ）を用いて調製されたミクロスフェアのサイズ分布を示すヒストグラムである。図２０Ｄ〜２０Ｆは、製剤Ｃ（図２０Ｄ）、製剤Ｇ（図２０Ｅ）、および製剤Ｅ（図２０Ｆ）の容積分布を示すヒストグラムである。 図２１Ａ〜２１Ｄは、０．５、３、または５重量％ＢＳＡを含有する７〜１７ｋＤａの５０：５０ＰＬＧＡ（図２１Ａ）、２４〜３８ｋＤａの５０：５０ＰＬＧＡ（図２１Ｂ）、３８〜５４ｋＤａの５０：５０ＰＬＧＡ（図２１Ｃ）、および４〜１５ｋＤａの７５：２５ＰＬＧＡ（図２１Ｄ）を用いて製剤化されたミクロスフェアからの毎週のＢＳＡ放出を示す（パーセンテージ（％）で）線グラフである。エラーバーは標準偏差を表す。 図２２Ａおよび２２Ｂは、マイクロ粒子から放出されたＢＳＡに対するマウス血清におけるＩｇＧ抗体力価を示す線グラフであり、そしてｌｏｇ２スケールでの経時的な幾何平均としてプロットされている。図２２Ａは、一連の３用量に一致するボーラスＢＳＡ注射と比較した、低用量製剤ＣおよびＧを示す。図２２Ｂは、その用量に一致するボーラス対照と比較した、高用量製剤Ｅを示す。ボーラスＢＳＡを対照群で０、４、および８週目に注射した。塗りつぶした記号は、Ａ（３群）に関してＡＮＯＶＡ分析、およびＢ（２群）に関してスチューデントｔ検定を使用して決定されたその時点での、同形の塗りつぶしていない記号の群と用量が一致する対照との間の有意差を示す。１、２、および３つの塗りつぶした記号は、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、およびｐ＜０．００１を示し、そしてエラーバーは標準偏差を表す。 図２３Ａおよび２３Ｂは、低用量（図２３Ａ）および高用量（図２３Ｂ）のＢＳＡでの免疫化によって誘起されるピーク力価を示すドットプロットである。全てのマイクロ粒子製剤に関するピーク力価は４週目に生じたが、両方のボーラス注射群は１０週目でピークになった。ＮＳは、多重比較に関して、ホルム−ボンフェローニ補正を用いるスチューデントｔ検定を使用したときの、有意水準０．０５での有意差無しを表す。製剤Ｃ、Ｇ、およびＥに関する調整したｐ値はそれぞれ０．０６４５、０．０５４３、および０．０７８４である。 図２４Ａ〜２４Ｃは、シェルのマイクロ作製の工程を示すマイクロモールディングプロセス（図２４Ａ）、薬物によるシェルの充填（図２４Ｂ）、およびキャップによるシェルの密封（図２４Ｃ）の概略図である。 図２５は、ボルテックスまたは超音波処理による有機性／水性混合の間の、賦形剤としてゼラチン、マルトデキストリン、プルラン、ミリスチン酸、およびＴｗｅｅｎ８０を伴う、または伴わないＩＰＶの安定性（回収％）を示す棒グラフである。 図２６は、ボルテックスまたは超音波処理によるＰＬＧＡとの有機性／水性混合の間の、賦形剤としてゼラチン、マルトデキストリン、プルラン、ミリスチン酸、およびＴｗｅｅｎ８０を伴う、または伴わないＩＰＶの安定性（回収％）を示す棒グラフである（ｓｏｎ＝超音波処理）。 図２７は、一晩の凍結乾燥による乾燥の後の、または３０〜３５℃で１時間のＧｅｎｅｖａｃの使用の後の、賦形剤としてプルラン、プルラン／ＢＳＡ、ソルビトール／ＭＳＧ／ＭｇＣｌ_２を伴うＩＰＶの安定性（回収％）を示す棒グラフである。 図２８は、緩衝剤としてＡｌ（ＯＨ）_３（線（２））、ミリスチン酸（線（３））、およびＭｇ（ＯＨ）_２（線（４））の存在下でのＰＬＧＡ粒子による経時的な（日）放出溶媒のｐＨにおける変化を示す線グラフである。緩衝剤の不在下での経時的な放出溶媒のｐＨにおける変化を表す線を（１）と標識する。 図２９は、ＰＬＧＡ粒子による経時的な（日）放出溶媒のｐＨにおける変化を示す線グラフである。バッファーを２〜３日毎に交換した後に試験したＰＬＧＡ５０２Ｈに関する線を（１）と指定し、バッファーを７日毎に交換した後に試験したＰＬＧＡ５０２Ｈに関する線を（２）と指定し、バッファーを２〜３日毎に交換した後に試験したＰＬＧＡ５０３Ｈに関する線を（３）と指定し、そしてバッファーを７日毎に交換した後に試験したＰＬＧＡ５０３Ｈに関する線を（４）と指定する。

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書にて使用される場合の「積層造形」または「３Ｄ印刷」とは、デジタルモデルから実際に任意の形状の３次元の固体物体を作製するプロセスを指す。積層プロセスを使用して３Ｄ印刷が達成され、ここで材料の連続層は異なる形状または厚みで置かれる。いくつかの実施形態では、「３Ｄ印刷」には、ノズルを通して噴射または押し出しされ、そして所望の形状に固化された押し出し、または溶媒系のポリマー含有インク（例えば、ＰＬＧＡ、ＰＬＬＡ等）が含まれる。形状は、ｘ、ｙおよびｚ方向に制御され得る。

本明細書にて使用される場合、「マイクロモールディング」とは、概してマイクロスケールで部品またはデバイスを製造するのに適しているプロセス、またはマイクロスケールにおいて特色または耐容性を有する部品またはデバイスを製造するのに適しているプロセスを指す。例示的な技術には、限定するものではないが、リソグラフィが含まれる。

本明細書にて使用される場合、「マイクロデバイス」とは、１ミクロン〜１０００ミクロン、１ミクロン〜５００ミクロン、１ミクロン〜２５０ミクロン、または１ミクロン〜１００ミクロンのような、マイクロスケールの寸法を有する任意の物体またはデバイスを指す。

「直径」なる用語は、当該技術分野において認識されており、そして物理学的な直径または流体力学的な直径のいずれかを指すために本明細書にて使用される。エマルジョンの直径は、典型的には流体力学的な直径を指す。カプセルの直径は、球形または非球形の形状の両方で、水和状態での物理学的直径を指してよい。カプセルの内側に封入された粒子、コロイドおよびセルの直径は、水和状態での物理学的直径を指す。本明細書にて使用される場合、非球形粒子または非球形カプセルの直径は、粒子の表面の２点間の最大直線距離を指し得る。複数の粒子またはカプセルに言及する場合、粒子またはカプセルの直径は、典型的には粒子またはカプセルの平均直径を指す。粒子またはコロイドの直径は、種々の技術を使用して測定することができ、その技術には限定するものではないが、光学または電子顕微鏡、および動的光散乱が含まれる。

本明細書にて使用される場合の「生体適合性」なる用語は、それ自体宿主（例えば、動物またはヒト）に対して毒性でなく、また宿主において毒性濃度でモノマーもしくはオリゴマーサブユニットもしくは他の副産物を生成する速度で分解もしない（材料が分解する場合）１つまたはそれを超える材料を指す。

本明細書にて使用される場合の「生分解性」なる用語は、材料がその成分サブユニットに分解もしくは解体すること、または例えば生化学的プロセスによる材料のより小さな（例えば、非ポリマー性の）サブユニットへの消化を意味する。

「ミクロスフェア」、「マイクロ粒子」、または「マイクロカプセル」は、当該技術分野において認識されており、そして例えば、本組成物のような生体適合性ポリマーから形成される、実質的に球形の固体または半固体構造を含み、１ミクロン〜５００ミクロン、１ミクロン〜２５０ミクロン、または１ミクロン〜１００ミクロンのような、約１またはそれを超えて約１０００ミクロンまでの範囲にわたるサイズを有する。「マイクロ粒子」なる用語もまた当該技術分野において認識されており、そしてミクロスフェアおよびマイクロカプセル、ならびに上記２つのカテゴリーのいずれかに容易に分類され得ない構造を含み、その寸法は全て平均で約１０００ミクロン未満である。マイクロ粒子は球形または非球形であってよく、そして任意の規則的な、または不規則的な形状を有してもよい。構造が直径で約１ミクロン未満である場合、対応する、当該技術分野において認識されている用語である「ナノスフェア」、「ナノカプセル」および「ナノ粒子」を用いてもよい。

本明細書にて使用される場合、「狭い範囲の放出」とは概して、１時間、数時間、１日、１週間、１か月等のような具体的な期間にわたって薬剤が放出されることを意味する。

本明細書にて使用される場合、「抗原」または「ワクチン」とは、哺乳動物のような宿主生物において、特異的免疫応答を生成する任意の分子または実体を指す。

本明細書にて使用される場合、「免疫応答」とは、哺乳動物のような宿主において何らかの将来的な暴露に対して免疫を生成する抗原またはワクチンに対する特異的応答を指す。

「水溶性」とは概して、水性環境において溶解するかまたは分離する何らかのものを指す。

本明細書にて使用される場合の「エマルジョン」とは、液体の連続相において均質に分散された液体の別個の相を指す。

本明細書にて使用される場合、「親水性」とは、有機溶剤と比較して、水に対してより大きな親和性を有し、したがって水に溶解性である分子を指す。水（または緩衝化水溶液）と、オクタノール、酢酸エチル、塩化メチレン、またはメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルのような水非混和性有機溶剤との間の分配係数を測定することにより、化合物の親水性を定量化することができる。平衡化の後に、有機溶剤中よりも水中により高い濃度の化合物が存在する場合、その化合物は親水性であると考えられる。

本明細書にて使用される場合、「疎水性」とは、水と比較して、有機溶剤に対してより大きな親和性を有し、したがって有機溶剤に溶解性である分子を指す。水（または緩衝化水性溶液）と、オクタノール、酢酸エチル、塩化メチレン、またはメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルのような水非混和性有機溶剤との間のその分配係数を測定することにより、化合物の疎水性を定量化することができる。平衡化の後に、水中よりも有機溶剤中により高い濃度の化合物が存在する場合、その化合物は疎水性であると考えられる。

ＩＩ．製剤
Ａ．ポリマーおよび溶剤系
ポリマー
ミクロスフェアまたはマイクロカプセルを含み、そしてエマルジョン系であるものを含む、マイクロ粒子から形成され得る製剤、またはマイクロモールディングによって調製されるもののようなデバイスは、ポリマーから形成される。抗原は分散されていてもよいし、ポリマーによってカプセル封入されていてもよい。１つの実施形態では、デバイスは、１つまたはそれを超えるワクチンまたは抗原および安定剤を含有するだけのコア、ならびに１つまたはそれを超える生分解性ポリマーのみを含有するシェルまたは粒子壁を、添加剤を伴って、または伴わずに、含有する。抗原を伴わないポリマーを使用して密封するか、または製剤の領域を他の領域から分離し、そして異なる速度で放出し得る。

ポリマーは、抗原を保存する条件下で、および抗原を保存する試薬を使用して、生体適合性かつ処理可能でなければならない。製剤は、親水性ポリマー、疎水性ポリマー、両親媒性ポリマー、またはそれらの混合物から作製できる。製剤は１つまたはそれを超える親水性ポリマーを含有できる。

親水性ポリマーとしては、デンプンおよび多糖のようなセルロース系ポリマー；親水性ポリペプチド；ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＰＧＳ）、γ−ポリグルタミン酸、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸、ポリ−Ｌ−セリン、またはポリ−Ｌ−リジンのようなポリ（アミノ酸）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、およびポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）のようなポリアルキレングリコールおよびポリアルキレンオキシド；ポリ（オキシエチル化ポリオール）；ポリ（オレフィン系アルコール）；ポリビニルピロリドン；ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）；ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）；ポリ（サッカライド）；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリ（ビニルアルコール）、ならびにそれらのコポリマーが挙げられる。

疎水性ポリマーの例としては、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、およびポリ（乳酸−コ−グルコール酸）のようなポリヒドロキシ酸；ポリ３−ヒドロキシブチレートまたはポリ４−ヒドロキシブチレートのようなポリヒドロキシアルカノエート；ポリカプロラクトン；ポリ（オルトエステル）；ポリ無水物；ポリ（ホスファゼン）；ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）；チロシンポリカーボネートのようなポリカーボネート；ポリアミド（合成および天然ポリアミドを含む）、ポリペプチド、およびポリ（アミノ酸）；ポリエステルアミド；ポリエステル；ポリ（ジオキサノン）；ポリ（アルキレンアルキレート）；疎水性ポリエーテル；ポリウレタン；ポリエーテルエステル；ポリアセタール；ポリシアノアクリレート；ポリアクリレート；ポリメチルメタクリレート；ポリシロキサン；ポリ（オキシエチレン）／ポリ（オキシプロピレン）コポリマー；ポリケタール；ポリホスフェート；ポリヒドロキシバレレート；ポリアルキレンオキサレート；ポリアルキレンスクシネート；ポリ（マレイン酸）、ならびにそれらのコポリマーが挙げられる。ある特定の実施形態では、疎水性ポリマーは脂肪族ポリエステルである。好ましい実施形態では、疎水性ポリマーはポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、またはポリ（乳酸−コ−グルコール酸）である。

製剤は１つまたはそれを超える生分解性ポリマーを含有できる。

生分解性ポリマーは、水に不溶性または難溶性であり、体内で水溶性材料に化学的に、または酵素的に変換されるポリマーを含み得る。生分解性ポリマーは、架橋されたポリマーを水に不溶性または難溶性にさせる加水分解性架橋基によって架橋された可溶性ポリマーを含み得る。

生分解性ポリマーとしては、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸およびメタクリル酸エステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシルエチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロース硫酸ナトリウム塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレンポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ塩化ビニルポリスチレンおよびポリビニルピロリドン、それらの誘導体、直鎖および分岐鎖コポリマーおよびそれらのブロックコポリマー、ならびにそれらのブレンドが挙げられる。例示的な生分解性ポリマーとしては、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（ヒドロキシバレレート）、ポリ無水物、ポリ（アクリル酸）、ポリグリコリド、ポリ（ウレタン）、ポリカーボネート、ポリリン酸エステル、ポリホスファゼン、それらの誘導体、直鎖および分岐鎖コポリマーおよびそれらのブロックコポリマー、ならびにそれらのブレンドが挙げられる。

両親媒性ポリマーは疎水性ポリマーブロックおよび親水性ポリマーブロックを含有するポリマーであり得る。疎水性ポリマーブロックは、１つもしくはそれを超える前記疎水性ポリマーまたはそれらの誘導体もしくはコポリマーを含有できる。親水性ポリマーブロックは１つもしくはそれを超える上記親水性ポリマーまたはそれらの誘導体もしくはコポリマーを含有できる。

特に好ましい実施形態では、マイクロ粒子は、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、およびポリ（乳酸−コ−グリコール酸）のような生分解性ポリエステルまたはポリ無水物を含有する。マイクロ粒子は１つまたはそれを超える以下のポリエステルを含有できる：グリコール酸単位を含むホモポリマー（本明細書では「ＰＧＡ」と称する）、ならびにポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリ−Ｄ−ラクチド、およびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチドのような乳酸単位（本明細書では総称的に「ＰＬＡ」と称する）、ならびにポリ（ε−カプロラクトン）のようなカプロラクトン単位（本明細書では総称的に「ＰＣＬ」と称する）；ならびに乳酸：グリコール酸の比によって特徴付けられる種々の形態のポリ（乳酸−コ−グリコール酸）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）のような、乳酸およびグリコール酸単位を含むコポリマー（本明細書では総称的に「ＰＬＧＡ」と称する）；ならびにポリアクリレート、ならびにそれらの誘導体。例示的なポリマーとしてはまた、種々の形態のＰＬＧＡ−ＰＥＧまたはＰＬＡ−ＰＥＧコポリマーのような、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と前記されたポリエステルとのコポリマーが挙げられる（本明細書では総称的に「ＰＥＧ化ポリマー」と称する）。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ領域は切断可能なリンカーによってポリマーに共有結合して、「ＰＥＧ化ポリマー」を生じることができる。

製剤は１つのポリマー、または２つもしくはそれを超えるポリマーの混合物を含有できる。マイクロ粒子は安定剤、界面活性剤、または脂質のような他の実体を含有してもよい。

溶剤
ポリマー製剤には常にいくらか残留物が存在するので、溶剤は生体適合性でなければならない。代表的なポリマー溶剤としては、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラフルオロエチレン、および酢酸アシルのような有機溶剤が挙げられる。抗原を、アセトン、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、およびそれらの混合物のような水性または水混和性溶剤に溶解できる。

Ｂ．治療用、予防用、栄養補助用、および診断用薬剤
ワクチンの送達に関連して記載したが、製剤を使用して種々の治療用、予防用、栄養補助用、および／または診断用薬剤の放出を提供し得ることが理解される。これらの薬剤は低分子量薬物、ホルモンまたは成長因子のようなタンパク質、免疫調整物質、抗体、核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）であってよい。

抗原
感染病原体
送達のための抗原は、破傷風菌のような細菌、肝炎、インフルエンザ、およびポリオのようなウイルス、ならびにＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マラリア）およびＬｅｉｓｈｍａｎｉａのような原虫のような死滅させられたか、または弱毒化させた感染病原体である。表２にいくつかのワクチンを列挙し、その抗原は開示された製剤において使用することができる。他の抗原は、これらの感染病原体についての抗原として、癌抗原として、または免疫刺激剤として効果的な抗原性タンパク質、または炭水化物のようなハプテン、または糖抗原である。

灰白髄炎（ポリオ）は高度に伝染性のウイルス疾患であり、神経系に侵入し、そしてほんの数時間で全身麻痺を引き起こし得る。２００に１つの感染が非可逆性の麻痺に至り、この麻痺は通常下肢に限定される。麻痺した人のうち、５％〜１０％が横隔膜の麻痺のために死亡する。ポリオのための治療はない。しかしながら、これは、ワクチン接種によって予防することができる。

ポリオの症例は１９８８年以来、９９％を上回って減少しており、１２５を超える流行国において推定３５０，０００の症例が、２０１２年には、報告された症例はわずか２２３になった。現在２０１３年の始めには、世界中でわずか３か国（アフガニスタン、ナイジェリア、およびパキスタン）のみがこの疾患の流行国である。積極的なワクチン接種の努力にも関わらず、ポリオは完全には根絶されておらず、そして特に発展途上国において、依然として大流行が生じる。

ポリオに対して保護する２つの型のワクチン：不活化ポリオワクチン（ＩＰＶ）および経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）がある。ＩＰＶは、効果的であるためには、血流に投与する必要がある。対照的に、ＯＰＶは腸上皮を通過することにより効果的である。ＯＰＶは優れた腸免疫を付与し、投与が容易であり、そして経費が安いが、生きたポリオウイルスがワクチン接種を受けたものによって排出される。これは集団全体がワクチン接種されていない場合の懸念である。

そのように、ＩＰＶの使用は好ましい。

癌抗原
変異ゆえに異常構造を有する、腫瘍細胞において生成された任意のタンパク質は、腫瘍抗原として作用できる。そのような異常タンパク質は、関連する遺伝子の変異によって生成される。異常タンパク質の生成をもたらす癌原遺伝子および腫瘍抑制因子の変異は、腫瘍の原因であり、ゆえにそのような異常タンパク質は腫瘍特異的抗原と称される。腫瘍特異的抗原の例としては、ｒａｓおよびｐ５３遺伝子の異常生成物が挙げられる。対照的に腫瘍形成に関係しない他の遺伝子の変異は、腫瘍関連抗原と称される異常タンパク質の合成をもたらし得る。

正常には非常に低量で生成されるが、その生成が腫瘍細胞において劇的に増加するタンパク質は免疫応答の引き金となる。そのようなタンパク質の例は、酵素チロシナーゼであり、これはメラニン生成に必要である。正常には、チロシナーゼは微量で生成されるが、そのレベルはメラノーマ細胞において極めて向上している。

腫瘍胎児性抗原は別の重要なクラスの腫瘍抗原である。例は、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。これらのタンパク質は、正常には、胚発生の初期段階で生成され、そして免疫系が十分に発達するときまでに消失する。ゆえにこれらの抗原に対する自己寛容は発達しない。

異常タンパク質はまた腫瘍ウイルス、例えば、エプスタイン・バーウイルス（「ＥＢＶ」）およびヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）に感染した細胞によっても生成される。これらのウイルスに感染した細胞は、転写される潜在型ウイルス性ＤＮＡを含有し、そして得られたタンパク質は免疫応答を生じる。タンパク質に加えて、細胞表面糖脂質および糖タンパク質のような他の物質もまた、腫瘍細胞において異常構造を有する場合があり、したがって免疫系の標的となり得る。

多くの腫瘍抗原は腫瘍ワクチンとして効果的である可能性を有する。αフェトプロテイン（胚細胞性腫瘍、肝細胞癌腫）および癌胎児性抗原（腸がん、肺がん、乳がん）に加えて、腫瘍抗原の例としては、ＣＡ−１２５（卵巣がん）、ＭＵＣ−１（乳がん、上皮性腫瘍抗原（乳がん）、およびメラノーマ関連抗原（悪性メラノーマ）が挙げられる。

Ｃ．安定化剤
抗原安定性は、ワクチン製剤の形成の間の、および体温での抗原構造の維持として定義される。以下で論じられるように、ポリマー組成物、溶剤の選択、および加工条件は抗原安定性を維持するのに非常に重要である。

安定化剤を加えてもよい。糖は、タンパク質のための安定化剤の典型的なグループである。例としては、スクロース、フルクトース、マンニトール、グルコース、およびトレハロースのような単糖、ならびにより複雑な糖が挙げられる。Ａｌｃｏｃｋら、Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅ ｐｏｘｖｉｒａｌ ａｎｄ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ ｓｕｐｒａｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｇｌａｓｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２（１９）：１９−１９ｒａ１２（２０１０）を参照のこと。

インビトロでの抗原特異的ＥＬＩＳＡによって、および動物においてインビボで免疫応答（例えば、ＩｇＧ）を測定することによって、抗原の安定化を決定することができる。カプセル封入および／または製造プロセスの各工程の間、２５℃（室温）、高湿度／高温条件での保存の間、生理学的条件下（ｐＨ７．２、３７℃）およびインビボ（動物モデル）での安定性を評価する。

Ｄ．抗原増加速度または放出の完全性
ガス発生によるバースト放出系は、カプセル封入された抗原の即時的な放出を可能にし得る。浸出または凍結乾燥により除去される細孔形成剤を利用してもよい。

ＩＩＩ．製造の方法
デバイスを製造するために使用される方法は、加工の間、および体温の両方で抗原安定性を維持すること、および形成および投与後の漏れを最小限にすることが不可欠である。製剤化後の滅菌は、典型的にはガンマ放射のような方法と組み合わされた無菌製造条件の組み合わせにより達成することができる。

Ａ．エマルジョン
標準的な技術を使用して、マイクロ粒子を作製することができる。好ましい技術は、有機溶剤中のポリマー溶液の、水溶液による乳化である。多量の非溶剤相への有機相の添加は、自然にできる単一のエマルジョンを形成し、そして得られた溶液を絶えず撹拌して、溶剤を蒸発させる。直ぐにミクロスフェアの形成が生じる。撹拌後、ミクロスフェアを洗浄し、次いで乾燥させる。

実施例により、単独で、またはトレハロースおよびスクロースのような安定剤との組み合わせで、ポリマーおよび抗原の乳化を使用したマイクロ粒子の形成が実証される。

Ｂ．３次元印刷
３Ｄ印刷はミクロスフェアの一貫性を増大させ、より均一な放出を可能にし、そして増大した担持容量を有する「マイクロロッド」のような、より複雑なデバイスを作製するための手段を提供でき、それは複数のミクロスフェアからの同時放出の必要性を排除し、そしてスケールアップを容易にすることができる。

３次元（３Ｄ）印刷は、デジタルモデルから３Ｄ物体を作製するプロセスである。３Ｄ印刷は積層プロセスであり、ここで材料の連続層を異なる形状で置く。各層を加えた後、典型的には光重合により「インク」を重合させ、そしてこのプロセスを、３Ｄ物体が作り出されるまで繰り返す。最近の商業的な利用可能性および低減されたコストによって、ワクチンおよび医薬品を含む生体分子の３Ｄ印刷が、発展途上国へのこれらの化合物の流通にとって魅力的なものになっている。これは最終製品をその国へ輸送する必要性を無くす。代わりに、３Ｄプリンタは、治療の場において、世界中の至る所からもたらされ得る単純なコンピュータプログラムから、要求される生体分子をプリントアウトすることができる。

３Ｄ印刷のワークフローは、３つの逐次的な工程で記載できる：１）粉末供給システムプラットフォームは持ち上げられ、そして製作プラットフォームは１層低下させられる；２）ローラーがポリマー粉末を薄層に広げる；３）プリントヘッドが、隣接する粉末粒子を一緒に結合させる液体結合剤を印刷する。Ｂｉｌｌｉｅｔら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、３３：６０２０−６０４１（２０１２）。ナノ生体材料製作のために、大抵は２種類の３Ｄ印刷技術が採用される。１つは典型的なプリンタを用いるインクジェット印刷である。Ｍａｒｉｚｚａら、Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｉｏｎｉｃ Ｅｎｇｉｎ．１１１：３９１−３９５（２０１３）。他方はナノインプリントリソグラフィである。

ナノインプリントリソグラフィ（ＮＩＬ）は、ナノ構造を製作するための迅速で、そしてコスト効率の高い技術である。ＮＩＬの手順は、そのような構造の複数の層を互いの上部に積み重ねることである；すなわち、完成した二重層の構造は、第２の層を上部に加工できるように化学的−機械的研磨を使用して平坦化されたスペーサー層で覆われている。Ｌｉｕら、Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔ．Ａｕｇ．（２０１３）。

インクジェット印刷を使用して、単分散ＰＬＧＡ粒子が生成されている。Ｂｏｈｍｅｒら、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ：Ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ、２８９：９６−１０４（２００６）。簡単に述べると、水相に浸したインクジェットノズルでＰＬＧＡ溶液の液滴を印刷する。この方法により、予測可能、かつ制御可能なサイズでミクロスフェアが生成される。この技術を使用して、パクリタキセル搭載単分散ミクロスフェアが作り出されている。Ｒａｄｕｌｅｃｕら、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｐ：１８−２１（２００５）。この技術に変更を加えたものを使用して、多層単分散ミクロスフェアが作り出されている。ＫｉｍおよびＰａｃｋ、ＢｉｏＭＥＭＳ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：１９−５０（２００６）を参照のこと。このテクノロジーを利用して、マイクロカプセルシェルの厚さを２ミクロン未満から数十ミクロンまで変動させることができると同時に、全径で５０ミクロンに近いマイクロカプセルのための、完全、および十分に集中したコアカプセル封入が維持される。

ミクロスフェアからの薬物送達速度は、均一な単分散マイクロ粒子、様々なサイズのマイクロ粒子の混合物、および異なる分解可能な層を有するマイクロ粒子を提供することによって変更されている。ＫｉｍおよびＰａｃｋ、ＢｉｏＭＥＭＳ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：１９−５０（２００６）を参照のこと。

インターネットサイトのｓｔｏｒｅ．ｍａｋｅｒｂｏｔ．ｃｏｍ／ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ２（２０１３）；Ｔｅｋｉｎら、Ｉｎｋｊｅｔ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ａｓ ａ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ、４：７０３−７１３（２００８）；Ｊａｎｇら、Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｆｌｕｉｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｎ ｉｎｋ−ｊｅｔ ｐｒｉｎｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２５：２６２９−２６３５（２００９）；Ｌａｎ、Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｍｕｌｔｉ−Ｍａｔｅｒｉａｌ ３Ｄ Ｐｒｉｎｔｅｒ．、Ｍ．Ｓｃ．Ｔｈｅｓｉｓ：Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１３；およびウェブサイトのｉｍａｇｅｘｐｅｒｔ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ−ｎｅｗ／ｐｄｆ／ＩＸｊｅｔＸｐｅｒｔ．ｐｄｆ．（２０１３）で、さらなる情報を見出すことができる。

実施例により、３ＤＰを使用したマイクロ粒子の調製を実証する。単分散インク液滴を一貫して噴射するために波形を最適化した。印加電圧、印加電圧の期間、および経時的な電圧の変化（スロープ）は全て、高品質なインク液滴を噴射するために最適化されなければならないパラメータである。例えば、１，４−ジオキサン中５ｗ／ｖ％３１ｋ（平均分子量）ＰＬＧＡの溶液に関して波形を最適化した。ＪｅｔＸｐｅｒｔ撮像システムを用いて波形を最適化し、そして次にインクおよび波形を複合材料インクジェット３Ｄプリンタに移した。ＪｅｔＸｐｅｒｔ撮像を定圧波形で行った。１つの実施形態では、５ｗ／ｖ％３１ｋ ＰＬＧＡ／１，４−ジオキサン（Ｚ＝５．３、η＝６．０８ミリパスカル秒）を使用した。この具体的な溶液に関して波形を最適化した。別の実施形態では、１５ｗ／ｖ％１２ｋ ＰＬＧＡ／１，２−ジクロロエタン（Ｚ＝５．８、η＝６．２４ミリパスカル秒）を使用した。大抵のノズルは第１の実施形態でのような最適な噴射を示したが、ごくわずかなノズルがサテライト滴を含有する液滴列を生じた。第３の実施形態では、１５ｗ／ｖ％１２ｋ ＰＬＧＡ／クロロホルム（Ｚ＝５．８、η＝５．９９ミリパスカル秒）を使用した（表１）。より揮発性の溶剤（クロロホルムまたはアセトン）を使用した場合、大抵のノズルは１滴より多くの液滴を継続的に発射した。概して、一定の最適化された波形および類似の流体特性のために、より揮発性の溶剤で作られたインクは一貫性のない噴射をもたらし、そしてプリントヘッドノズルは印刷の間に詰まった（１，２−ジクロロエタンまたはクロロホルムを使用した場合に観察された）。ノズルが詰まるのを防ぐために、インクを１，４−ジオキサンおよびＤＭＦで作製することができる。これらの溶剤を用いる印刷は、構造がモーフィングするのを防ぐために、層間でより長い乾燥時間が要求される。所定のポリマーに関して、ＧＰＣによって決定された場合、インク中のポリマー濃度を上昇させることにより、インクの粘度が上昇した。所定のポリマー濃度に関して、ポリマーの分子量範囲を大きくすることにより、インクの粘度が上昇した。ポリマーの添加後、インク密度および表面張力において観察された変化は、粘度変化と比較して、無視できるほどであった。

図１１Ａおよび１１Ｂは、エマルジョンによって（図１１Ａ）、および３Ｄ印刷によって（図１１Ｂ）作製された粒子の概略図であり、ならびにエマルジョン粒子（図１１Ｃ）および理想的な場合の３ＤＰ粒子（図１１Ｄ）からのタンパク質の放出である。これらは得られた構造における差を示し、それはまた放出動態を変化させる。

図１２Ａ〜１２Ｄは３Ｄ印刷プロセスの概略図である：ＰＬＧＡ粒子の構造を作り出し（図１２Ａおよび２４Ａ）、薬物またはタンパク質を粒子に充填し（図１２Ｂおよび２４Ｂ）、薬物またはタンパク質を乾燥させ（図１２Ｃ）、そして粒子をカプセル封入する（図１２Ｄおよび２４Ｃ）。概略図は、ワクチンを充填した立方体形状の構造物を示すが、モールドを利用して任意の形状のものを提供してよく、そしてモールドを層で、またはより複雑なパターンで充填してよいことが理解される。
表１：３ＤＰのための溶剤

波形パラメータを最適化して、印刷中に圧電式のノズルジェットから「インク」（ポリマー溶液）の均一な単独の液滴を生成することができる（図１３）。滴サイズは、印加電圧、電圧のスロープ、ポリマーおよび溶剤選択および濃度を含む、最適化された種々のパラメータの関数である。

Ｃ．マイクロモールディング
Ｐａｒｋら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ、９：２２３−２３４（２００７）は、精緻な設計を有するポリマーマイクロ構造を製作するためのマイクロモールディングの使用について記載している。マイクロモールドをポリマーマイクロ粒子で充填して、複雑な幾何学的形態を有し、そして穏やかな加工条件を使用して作製された、複数の材料から構成されたマイクロ構造を生成した。典型的には油−水、ダブルエマルジョン系；噴霧乾燥法；超臨界コンディショニング法；およびミリング法を使用して、これらのマイクロ粒子を調製する。好ましい実施形態では、フォトレジストで作られた雌型マスターモールドをフォトリソグラフィによって作り出し、雌型マスターモールドから、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で雄型マスター構造物を成形し、そして雄型マスター構造物からＰＤＭＳで作られた雌型複製モールドを成形することにより、マイクロモールドを調製することができる。温度／圧力法を使用して、かつ／または溶剤からポリマーマイクロ粒子をマイクロモールド成形することができる。

噴霧乾燥およびエマルジョン技術を使用して、１〜３０μｍのサイズのポリマーマイクロ粒子をＰＬＡ、ＰＧＡおよびＰＬＧＡから作製した。これらのポリマーマイクロ粒子をＰＤＭＳマイクロモールドに室温で充填し、そして例えばマイクロ粒子をモールド内で、超音波で一緒に溶接することにより、一緒に溶融または結合させるが、同時にそのパッキング構造に固有の空隙を維持する。異なる組成のポリマーを有するように多層のマイクロ構造を製作し、そしてカプセル封入された化合物はマイクロ構造の異なる領域に位置した。モールドをポリマーメルトの代わりに固体ポリマーマイクロ粒子で充填して、穏やかな加工条件を使用して、複雑な幾何学的形態を有し、そして複数の材料から構成されるマイクロ構造を複製した。マイクロ粒子は室温および低圧でマイクロモールドの空洞に容易に流れ込むことができ、それにより高いアスペクト比を有するマイクロ構造を作るのが容易となる。さらに、ポリマーマイクロ粒子は、薬物のような化学的な化合物をカプセル封入でき、そしてモールドに連続層で充填して、複数の材料の組成物を収容することができる。モールドを充填した後、熱および超音波溶接、ならびに溶剤およびガスによる溶接を含むプラスチック溶接法により、モールド内でマイクロ粒子を溶接することにより、最終的なマイクロ構造を作り出すことができる。

一度、投与後の特定の時点での狭い時間の放出を得るために要求されるポリマー材料および条件を同定したら、これらの同じ技術を使用して、ワクチン製剤を製剤化することができる。

ＩＶ．投与の方法
ワクチン接種を必要とする個体にワクチン製剤を投与する。抗原の供給源に対する保護効果を引き出すスケジュールで放出される、有効な量の１つまたはそれを超える抗原を含む投薬製剤としてこれらを投与する。

マイクロ粒子またはマイクロカプセルを、好ましくは皮下または筋肉内に、例えば上腕背部の皮下に注射により、または粘膜表面（口腔、鼻腔内に、肺経路を介して、または他の開口部）に投与できるが、数日を超える長期間にわたって放出が起こるべき場合、注射が好ましい。

投与の時点で抗原のボーラスを放出するように投薬形態を設計する。これは、抗原の溶液または分散物を、後の時間に複数回の放出を提供するワクチン製剤と組み合わせて投与することにより、達成され得るか、またはデバイスは、最初のボーラス、および後続の放出（複数可）を提供するように製剤化され得る。
代表的なワクチンを表２に示す：

第三世界各国で大きな関心が寄せされるさらなるワクチンとしては、ポリオおよび痘瘡が挙げられる。以下ではこの適用のためのワクチンの例としてポリオワクチンを使用する。

ＩＰＶワクチンＳＳＩは、麻痺性灰白髄炎に対する予防的ワクチン接種のために使用される不活化ワクチンである。ＩＰＶワクチンＳＳＩは、ベロ細胞において増殖させた、不活化ポリオウイルス１型、２型および３型を含有する。
用量あたりの含有量（０．５ｍＬ）：
不活化ポリオウイルス１型（Ｂｒｕｅｎｈｉｌｄｅ） ４０Ｄ抗原単位；
不活化ポリオウイルス２型（ＭＥＦ−１） ８Ｄ抗原単位；
不活化ポリオウイルス３型（Ｓａｕｋｅｔｔ） ３２Ｄ抗原単位；
１９９培地を０．５ｍＬまで。

このワクチンは血清およびトリプシンを使用せずに製造され、そして保存剤またはアジュバントを含有しない。抗生物質は製造において使用しない。ＩＰＶワクチンＳＳＩは微量の残留ホルムアルデヒドを含有する。これはデンマークでＳｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔによって製造されている。

ＩＰＶワクチンＳＳＩは１回用量のバイアルに分配された注射用溶液である。初回ワクチン接種用に０．５ｍｌの一連の３用量を投与する。

以前に初回ワクチン接種されたヒトのブースターワクチン接種用に、０．５ｍｌの１用量を、最も早くて初回のワクチン接種シリーズの６か月後に投与する。追加のブースター用量の投与は、ポリオ免疫化に関する国の推奨に従って行われるべきである。ワクチンを筋肉内または皮下に投与すべきである。ワクチンは血管内に投与してはならない。最初の投薬時の年齢は少なくとも６週であるべきであり、そして初回ワクチン接種シリーズには、少なくとも４週間隔で少なくとも３回の免疫化が含まれるべきである。大抵の国は、ＤＰＴワクチンと同じスケジュール（典型的には２月齢、４月齢、および６月齢）を使用してＩＰＶを与える。

ＩＰＶワクチンＳＳＩの免疫原性および安全性は、小児使用のための組み合わせワクチンを用いた臨床試験を含め、いくつかの臨床試験において調査されている。ＩＰＶ以外に、これらの試験には破傷風、ジフテリア、百日咳およびインフルエンザ菌ｂ型に対するワクチン抗原が含まれた。

２月齢で免疫化を開始する場合、少なくとも１か月間隔での３回免疫化の初回ワクチン接種シリーズの完了によって、２回目の免疫化の１か月後に、３つ全ての型のポリオウイルスへの抗体陽転を招くことが予期できる。２月齢の前、および最も早くて６週齢のときに免疫化を開始する場合、８９％〜９９％の抗体陽転率が実証されている。したがって、このようなスケジュールでは、９月齢または生後２年目でのブースター用量を考慮すべきである。

ＩＰＶワクチンＳＳＩは、ＩＰＶまたはＯＰＶで初回免疫化された乳幼児、就学前児童および成人のワクチン再接種に使用できる。ＩＰＶワクチンＳＳＩは、１〜３用量のＩＰＶ、続いて１〜３用量のＯＰＶを使用する、ＩＰＶ／ＯＰＶ混合スケジュールで使用できる。ＯＰＶの最初の用量の前にＩＰＶを投与することが推奨される。ＩＰＶ／ＯＰＶ混合スケジュールでは、初回ワクチン接種後の保護抗体の持続が、少なくとも２０年間続いたことが示されている。ＩＰＶのみのスケジュールにおいて保護ＳＳＩの持続に推奨される用量：
Ｄ抗原１型−４０ＤＵ／ｍｌ
Ｄ抗原２型−８ＤＵ／ｍｌ
Ｄ抗原３型−３２ＤＵ／ｍｌ
１０倍の三価ＩＰＶ：
Ｄ抗原１型−３２７ＤＵ／ｍｌ
Ｄ抗原２型−７０ＤＵ／ｍｌ
Ｄ抗原３型−２７９ＤＵ／ｍｌ

本発明は以下の非限定的な実施例によってさらに理解される。

以下の実施例は、薬物／抗原の制御放出のための様々なポリマー−薬物またはポリマー−抗原製剤について記載する。制御放出はポリマー分解に依存して、単回注射後、経時的に薬物／抗原放出の複数回のバーストを達成する。ポリマー分解に基づく薬物／抗原放出のバースト後の製剤の免疫原性、および抗抗原抗体力価の持続的増加もまた提示する。製剤を作製する方法についても記載し、それには、自然形成エマルジョンを介したポリマーマトリックスへの抗原の組み込み、または３Ｄ印刷またはマイクロモールディングを介したポリマーシェル内への抗原のカプセル封入が含まれる。抗原の安定性、ポリマーマトリックスの安定性、および製剤の安定性を改善する研究も提示し、これにより所望の放出特性および免疫原性を伴う製剤を得ることができる。

実施例１：ワクチンの別個の放出のためのポリマーおよび溶剤の選択
材料および方法
ポリマー型−ＰＬＧＡ、ＰＬＬＡ；ポリマー分子量−９．５ｋ、２０ｋ、３１ｋ、４６ｋ
薬物搭載−０．５、３、５％；賦形剤−トレハロース、スクロース
カプセル封入−自然形成エマルジョン
本プロセスでは、有機相としてＣＨ_２Ｃｌ_２：ＴＦＥ：：４：１．（ＣＨ_２Ｃｌ_２−ジクロロメタンＴＦＥ−トリフルオロエタノール）を、ポリ（ビニルアルコール）（「ＰＶＡ」）と共に使用して、５％、３％または０．５％ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）または不活化ポリオウイルス（「ＩＰＶ」）をポリマーにカプセル封入した。多量の非溶剤相への有機相の添加は、自然形成の単一のエマルジョンを形成し、そして得られた溶液を絶えず撹拌して、溶剤を蒸発させる。直ぐにミクロスフェアが形成される。撹拌後、ミクロスフェアを洗浄し、次いで乾燥させる。Ｊａｋｌｅｎｅｃら、Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ＩＧＦ−Ｉ ａｎｄ ＴＧＦ−β１ ｆｒｏｍ ＰＬＧＡ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ−ｂａｓｅｄ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２９（１０）：１５１８−１５２５（Ａｐｒｉｌ ２００８）を参照のこと。

３７℃で、１ｍｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）に懸濁した１０ｍｇのミクロスフェアを用いてインビトロで放出試験を行った。用いた時点は１日目、４日目、７日目およびその後毎週である。各時点で、バイアルを遠心分離し、上清を取り除いてアッセイし、新鮮な１ｍｌのＰＢＳを加え、そしてペレット化されたミクロスフェアを再懸濁した。

結果
図２１Ａは、カルボキシル基で誘導体化されたＰＬＧＡ（５０：５０）（２０ｋＤ）からの、モデルタンパク質であるウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）の、５％ＢＳＡ、３％ＢＳＡ、および０．５％ＢＳＡに関する経時的な（週）放出のグラフである。

図２１Ｄは、カルボキシル基で誘導体化されたＰＬＧＡ（５０：５０）（９．５ｋＤ）からのウシ血清アルブミンの、５％ＢＳＡ、３％ＢＳＡ、および０．５％ＢＳＡに関する経時的な（週）放出のグラフである。

これらの図は、分子量は異なるが、同じポリマーからの放出を示す。この差だけで放出プロファイルが劇的に変化した。

図３Ａおよび３Ｂは、ＰＬＬＡ（５０ｋＤ）からのウシ血清アルブミンの、５％ＢＳＡおよび０．５％ＢＳＡに関する経時的な（週）放出のグラフである。

図４Ａおよび４Ｂは、ＰＬＬＡ（１００ｋＤ）からのウシ血清アルブミンの、５％ＢＳＡおよび０．５％ＢＳＡに関する経時的な（週）放出のグラフである。

図５Ａおよび５Ｂは、ＰＬＬＡ（３００ｋＤ）からのウシ血清アルブミンの、５％ＢＳＡおよび０．５％ＢＳＡに関する経時的な（週）放出のグラフである。

これらの３つのグラフ間の差は分子量だけである。しかしながら、いずれの場合にも。図２１におけるものの範囲に類似する、実質的に、異なる放出期間はなかった。

図６Ａおよび６Ｂは、Ｐ（ｄ，ｌ）ＬＡ（２０ｋＤ）からの、ウシ血清アルブミンの、５％ＢＳＡおよび０．５％ＢＳＡに関する経時的な（週）放出のグラフである。結果は図３〜５および２１に類似する。

ＰＬＧＡ−ＣＯＯＨ（５０：５０）を使用して最良の結果が得られた。これをＰＬＧＡ製剤（図７Ａ）に関して、ボーラス注射（図７Ｂ）と比較して図７Ａおよび７Ｂにまとめる。

図７Ａで使用された製剤の詳細を表３に提示する（表４および５も参照のこと）。表３では、Ｆ３とＦ７との差は、ポリマーの分子量である。Ｆ５は高搭載のＢＳＡを有する。Ｆ３およびＦ７は約３つの均等な用量を有するが、Ｆ５は初期用量が多く、続いて２つの用量がより少なく、これは２回のブースターショットによる初期ボーラスに非常に類似している。０日目に製剤を動物に注射する（単回注射）が、ボーラス対照は試験の経過中に３回注射して、製剤放出動態を擬似する。陰性対照には、製剤用の空のミクロスフェア、およびボーラス注射用の生理食塩水が含まれる。注射容量は２００μｌ（マウスの皮下（ＳＣ）注射のための最大容量）であった。２００μｌ注射の２回の注射（１下肢あたり１回）を実施した。最大の注射可能なミクロスフェア濃度は５０ｍｇ／ｍｌであった。
表３．Ｆ３、Ｆ５およびＦ７製剤の注射後の第１ピーク、第２ピークおよび第３ピークでの放出されたＢＳＡの量（μｇ）

図８Ａおよび８Ｂは、カルボキシル基で誘導体化されたＰＬＧＡ（５０：５０）（２０ｋＤ）からの、０．５％の卵白アルブミンの放出と比較した、０．５％のウシ血清アルブミンの経時的な（週）放出のグラフである。

図９Ａおよび９Ｂは、カルボキシル基で誘導体化されたＰＬＧＡ（５０：５０）（３１ｋＤ）からの、５％の卵白アルブミンの放出と比較した、５％のウシ血清アルブミンの経時的な（週）放出のグラフである。

図１０Ａおよび１０Ｂは、カルボキシル基で誘導体化されたＰＬＧＡ（５０：５０）（３１ｋＤ）からの、０．５％の卵白アルブミンの放出と比較した、０．５％のウシ血清アルブミンの経時的な（週）放出のグラフである。

これら全ては、ポリマーの分子量または搭載パーセントによってのみ変わる、優れた結果を示している。

実施例２：３ＤＰによって作製されたマイクロ粒子と比較した、エマルジョンによって作製されたマイクロ粒子からの予測放出プロファイル
コンピュータ制御されたインクジェット３Ｄ印刷により製作された粒子を、同一のマイクロメートルスケールの寸法、薬物搭載、およびポリマーマイクロ構造内の薬物の空間的位置で作製できる。２つの方法の間の主要な差は、エマルジョン系の粒子（左）はマトリックス系であり、そして薬物は粒子全体にわたって均質に分配されているという点である。３Ｄまたはマイクロモールド形成された粒子を右に示す。ワクチンおよびポリマーは明確に分離されており、ここでワクチンはコア内に存在し、そしてポリマーはシェル内にのみ存在する。これらの区別は、２つの粒子型の間の放出動態の独特な制御を可能にする。またマイクロモールド形成された粒子／３Ｄ印刷された粒子により、コアサイズも制御できるので、より高度な搭載が可能になる。

図１１Ｃの放出グラフは実施例１のデータに基づく。

図１１Ｅの概略図では、薬物またはワクチンをポリマーミクロスフェアにカプセル封入し、そしてポリマーマトリックス全体にわたって分散させる（Ａ）。一度水和すると、表面上のいかなる薬物も即座に放出され（Ｂ）、ゆえに初期バーストを引き起こす。この事象に続いて、ミクロスフェアは残留孔を有し、それを通して薬物がゆっくりと拡散して、第２のバーストを引き起こすことができる（Ｃ）。最後に、ポリマーバルクが浸食されたときに、著しい分子量の分解のために、薬物の残りが第３のバーストで放出される（Ｄ）。

実施例３：マイクロ粒子を作製するための圧電式噴射のパラメータの選択
材料および方法
最適化：
ＰＬＧＡの均一な、単独の液滴を噴射するためにノズルから適用される圧力
（波形）を補正する。
ＰＬＧＡ溶液の粘度を最適化する（Ｚ数）。
ノズルから効果的に噴射するのに十分に低い粘度にする。
基材上に固化するのに十分に高い粘度にする。

圧電式ドロップ・オン・デマンド（ＤＯＤ）インクジェット印刷における適切な滴形成は、無次元のＺ数を使用して記載できることが、試験により示されている。Ｚ数は、インクの流体特性（表面張力、密度、および粘度）およびプリントヘッドのノズルのサイズによって決定される。

Ｚ数範囲は、特定の波形でのインクの印刷適性を決定するために定義できる。
Ｚ数を使用してＰＬＧＡ溶液を特徴付けする：

溶剤をＰＬＧＡ溶解性および物理学的特性（すなわち蒸気圧および沸点）に基づいて選択する。

１つのＰＬＧＡ溶液インクに関して、一度最適な波形を決定すると、その同じ波形を使用して、ある特定の範囲内のＺ数を有するＰＬＧＡ溶液を使用することにより、異なる分子量のＰＬＧＡで印刷することができる。

結果
ＢＳＡおよびＩＰＶ溶液を噴射するための波形を図１３で示すように最適化した。これにより、ポリマープリンタ粒子をワクチンで充填することが可能になる。

実施例４：ＩＰＶ Ｄ抗原の喪失を最小にし、そして凍結乾燥およびカプセル封入の間
の安定性を増加させるための試験
凍結乾燥によるＤ抗原の喪失を防止するために、カプセル封入の前にＩＰＶを濃縮するための方法および試薬を最適化するために試験を行った。使用できる方法としては、遠心濾過および透析が挙げられる。

エマルジョンプロセスの間のＤ抗原喪失を低減させ得る賦形剤を試験した。ＢＳＡを使用していくらかの成功を得ている。この試験は糖を利用した。糖ガラスを形成するために糖濃度を変更して試験した。乾燥のために湿度条件も変更して試験した。

自然形成エマルジョンのプロセスのための他の溶剤系との比較も行った。初期の研究では、クロロホルム／アセトンを有機相に使用した。続く研究では、酢酸エチルをジクロロメタン（ＤＣＭ）の代わりに使用した。

材料および方法
Ａｌｃｏｃｋらは、糖ガラスに組み込まれたウイルスが長期間の固体状態安定性を示すことを報告した。（Ａｌｃｏｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２（１９）：１９−１９ｒａ１２（２０１０））３Ｄ印刷された基材におけるＩＰＶ安定性を類似の様式で試験した。共溶解した糖（スクロースおよびトレハロース）を含有するＩＰＶ溶液を、ＭａｋｅｒＢｏｔ Ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ２を使用して印刷された、スケールアップされたＰＬＡ構造物に沈着させた。ＩＰＶ／糖溶液の乾燥を周囲湿度で行ったが（湿度約２０％）、これはＡｌｃｏｃｋらが使用した湿度（約１０％）よりも高かった。

結果
図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃは、糖賦形剤である１Ｍトレハロース、１Ｍスクロース、および３Ｍスクロースと共に凍結乾燥し、次いで４℃、２５℃または３７℃でインキュベートした後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。

結果により、糖がＩＰＶの安定性を顕著に増加させ、そして４℃および２５℃での安定性の差はわずかしかなかったが、３７℃では安定性はより低かったことが実証される。結果によりまた、安定性はＩＰＶ型によって異なることも示された。

図１５Ａおよび１５Ｂは、０、０．５、０．７５、１または１．２５Ｍトレハロースと共に凍結乾燥し、次いで４℃（図１５Ａ）または２５℃（図１５Ｂ）でインキュベートした後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ、型およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。最良の結果は０．５Ｍおよび０．７５Ｍトレハロースで得られた。

図１６Ａおよび１６Ｂは、溶剤としてテトラフルオロエチレン（「ＴＦＥ」）、ジクロロメタン（「ＤＣＭ」）、またはＴＦＥおよびＤＣＭを用いて、糖賦形剤無しで（図１６Ａ）または賦形剤として０．７５Ｍトレハロースを用いて（図１６Ｂ）、溶剤が蒸発するまで溶剤と混合した後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。ＤＣＭは統計的に有意により良好であった。ＩＰＶはカプセル封入のプロセスの間に有機溶剤に暴露した場合、トレハロースを賦形剤として使用した場合でさえ安定ではなかった。

図１７Ａは、０Ｍの糖、０．５Ｍトレハロース、または０．５Ｍトレハロース・スクロースを伴うＩＶＰを、３Ｄ−印刷されたＰＬＡ基材上に印刷し、そして２５℃、相対湿度２２％で乾燥させた後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。図１７Ｂは、０．２５Ｍトレハロースまたは０．５Ｍトレハロース・スクロースを伴うＩＶＰを、３Ｄ−印刷されたＰＬＡ基材上に印刷し、そして２５℃、相対湿度１０．７％で乾燥させた後に保持されたＤ抗原（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＩＰＶ）のパーセントのグラフである。

Ａｌｃｏｃｋらは、ウイルス／糖溶液を制御された条件下（２０〜２５℃、相対湿度２〜１０％）で基材上に乾燥させた。図１７Ａに関する乾燥は、換気型細胞培養フード（２０〜２５℃、相対湿度２２．９％）内でＰＬＡ基材上のＩＰＶ／糖溶液を伴った。図１７Ｂに関する乾燥は、デシケーター内（２０〜２５℃、相対湿度１０．７％）でＰＬＡ基材上のＩＰＶ／糖溶液を伴った。安定性は室内温度／湿度に関して良好であった（３つ全てのＩＰＶ型は＞５０％Ｄ抗原を保持した）。

図１８Ａおよび１８Ｂは、０．５または０．７５Ｍトレハロースと共に凍結乾燥し、次いで２５℃でインキュベートした後（図１８Ａ）、またはピペッティングされた０．５Ｍトレハロース・スクロースもしくは噴射された０．５Ｍトレハロース・スクロースと共に凍結乾燥し、次いで２５℃、相対湿度１０．７％で乾燥させた後（図１８Ｂ）に保持されたＤ抗原のパーセントのグラフである。

これらの試験により、最良の結果は、凍結乾燥したＩＰＶを含有する３Ｄ−印刷されたＰＬＡ粒子を室内温度および湿度（相対湿度約２０％）で保存することにより得られたことが実証される。試験によってまた、ＩＰＶを噴射することは、ＩＰＶを凍結乾燥するよりも、ＩＰＶ安定性を有意に低下させないことが実証された。

実施例５：ＢＳＡ含有ＰＬＧＡ製剤の短期間インビボ免疫原性
抗ＢＳＡ ＩｇＧ（抗体）力価として提示される免疫応答を、製剤Ｆ３、Ｆ５およびＦ７の注射後、１、２、および４週目に測定した。前記の表３および以下の表４に提示する。製剤Ｆ４およびＦ８は空のミクロスフェア（薬物無し）であり、陰性対照として使用した（表４参照）。

結果を図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｃに提示する。抗体力価（ｌｏｇ２）を１、２、および４週目の種々の群に関してプロットする。陰性対照は全てゼロであり、そしてミクロスフェア製剤はボーラス対照と比較して同等またはより強い応答を生じている。

実施例６：ＢＳＡ含有ＰＬＧＡミクロスフェアの長期間インビボ免疫原性
材料および方法
材料
ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）ＲＧ５０２Ｈ、ＲＧ５０３Ｈ、ＲＧ５０４Ｈ、およびＲＧ７５２Ｈ）およびＢＳＡをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ、分子量＝２５，０００）をＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．（ウォリントン、ペンシルバニア州）から購入した。この研究で使用したジクロロメタン（ＤＣＭ）および２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）は試薬等級であった。

ミクロスフェア製作
ＢＳＡを含有するＰＬＧＡミクロスフェアの１６の製剤（表４）を、自然形成単一エマルジョン法（Ｆｕら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ、９２：１５８２−１５９１、２００３；およびＪａｋｌｅｎｅｃら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２９：１８５−１９２、２００８）を使用して製作した。簡単に述べると、２００ｍｇのＰＬＧＡを１０ｍＬの４：１ＤＣＭ：ＴＦＥに溶解し、そして３００μＬのＢＳＡ（水中）と混合した。混合により透明な単相の溶液が形成され、次いでそれを２００ｍＬの５（ｗ／ｖ）％ＰＶＡ（水中）に加えた。自然に形成したエマルジョンを室温で３時間撹拌した。次いで粒子を遠心分離によって収集し、水で５回洗浄し、そして凍結乾燥した。インビボ使用のために調製する場合、有機相およびＢＳＡ溶液を０．２μｍのポリテトラフルオロエチレンフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ、リトル・チャルフォント、英国）を通して濾過し、そして滅菌層流フード内で混ぜ合わせた。

表４．ミクロスフェア製剤およびサイズ特徴付け

ミクロスフェアの特徴付け
Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ３Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用してミクロスフェアサイズ分布を決定した。０．３９μｍのビンサイズを使用してヒストグラムを作り、そして±５ビンのウィンドウサイズで中心移動平均を使用して平滑化した。ＪＳＭ−５６００ＬＶ ＳＥＭ（ＪＥＯＬ、東京、日本）を使用して５ｋＶの加速電圧で、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を収集した。撮像の前に、Ｈｕｍｍｅｒ６．２スパッタリングシステム（Ａｎａｔｅｃｈ、バトルクリーク、ミシガン州）を使用して、サンプルをＡｕ／Ｐｄでコーティングして表面帯電を防止した。

インビトロＢＳＡ放出
１０ｍｇのミクロスフェアを、キャップ付きチューブ内で１ｍＬのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に分散し、そして回転プラットフォーム上で、３７℃でインキュベートした。各時点（１日目、次いで週１回を１〜１３週間）で、サンプルを１５００の相対遠心力（ＲＣＦ）で５分間遠心分離し、その後上清を収集した。次いでサンプルを新鮮なＰＢＳに再懸濁し、そしてその後の時点でのサンプリングのためにインキュベーターに戻した。ミクロスフェアからのＢＳＡ放出を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを使用して定量化し、そして試験の終わりまでに放出された全量に基準化した。サンプルを３回反復で実行し、そしてデータを平均±標準偏差として報告した。

ＢＳＡミクロスフェアのインビボ投与
全ての動物実験はＭＩＴの動物愛護委員会により承認された。簡単に述べると、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに（１）ＢＳＡ搭載ミクロスフェア、（２）非搭載ミクロスフェア、（３）ボーラスＢＳＡ、または（４）生理食塩水のみを注射した。最初の２群のマウスには１回だけ注射したが、ボーラスＢＳＡまたは生理食塩水のみを受けたマウスには、４週目および８週目に再度注射して、インビトロでのＰＬＧＡミクロスフェアからのＢＳＡ放出の量およびタイミングに一致させた。サンプルを２００μｌの生理食塩水に溶解または懸濁（適用可能な場合）させ、そして各後肢に全量で４００μｌを皮下注射した。表５は各群に関する正確な投薬計画を含有する。０、１、２、４、６、８、および１０週目に、１００μｌの血液を顎下から採取し、そして凝固の後、２０００ＲＣＦで、４℃で１０分間遠心分離して、血清を分離した。

表５．インビボＢＳＡ投与のための投薬レジメン

ＰＬＧＡミクロスフェアからのＢＳＡ放出の免疫原性
エンドポイント酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＢＳＡに対する血清抗体力価を決定した。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）を、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム中１００μＬの１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液で、４℃で一晩コーティングした。次いで０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で、プレートを３回洗浄し、次いでブロッキング剤として、ＰＢＳＴ中５％脱脂乳中で、３７℃で２時間インキュベートした。別の一連のＰＢＳＴでの３回の洗浄の後、マウス血清サンプルを、４倍段階希釈物に加え、そして３７℃で２時間インキュベートした。試験が進むにつれて、血清希釈の程度を増加させ、そして力価が上昇した。次いでプレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、そしてブロッキングバッファー中１：１０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス２次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、バーミングハム、アラバマ州）と共に３７℃で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴでさらに５回洗浄し、そしてアルカリ性リン酸塩基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）からの１倍ジエタノールアミンバッファーに溶解した錠剤から調製した、１００μＬのｐ−ニトロフェニルリン酸溶液を使用して展開した。１０分後に、各ウェルに１００μＬの０．４Ｍ水酸化ナトリウムを加えることにより反応を停止させ、そしてＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００プロマイクロプレートリーダー（Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）を使用して、吸光度値を４０５ｎｍで読み取った。バックグラウンド値の２倍よりも大きな吸光度を生じる最高血清希釈度の逆数として力価を報告した。

統計分析
表４および図２０における全てのデータは平均±標準偏差として報告している。インビトロ試験を３回反復の実験で実施し、一方インビボ試験は全ての時点で全群に関して１０回反復の実験で実施したが、１０週目の製剤Ｃは例外で、そこでは１匹の動物からの血液量が不十分であったため、９回の反復を使用した。３つの低用量群に関して一元ＡＮＯＶＡ散統計分析、ならびに高用量ミクロスフェアおよびボーラス注射の比較のために対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して、時間を一致させた抗体力価を比較した。多重比較の影響を弱めるためホルム−ボンフェローニ補正を用いる対応のない両側スチューデントｔ検定を使用して、０．０５の有意レベルでピーク抗体力価の比較を実施した。

結果
ＢＳＡ含有ＰＬＧＡミクロスフェアの特徴付け
ＰＬＧＡおよびＢＳＡの１６全ての製剤は広範な粒子サイズの分布を伴う、球形のマイクロ粒子を生成した（表４）。インビボ試験に使用した製剤Ｃ、Ｇ、およびＥのサイズおよび形状は、全ての製剤の代表であった。製剤Ｃは、直径１０．３±６．２μｍであるミクロスフェアを生成したが、容積と直径との間の３次の関係のために、ＰＬＧＡ中のＢＳＡの分布が均質であると仮定すると、１０．３μｍより小さな粒子はたった４．２％の抗原搭載を含有した（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、４７：１３−２０、１９９７）。より大きな粒子が、抗原の大部分を含有し、その容積の９０％が、製剤Ｃに関しては、２２．１μｍより大きな粒子に含有された。製剤ＧおよびＥは、粒子直径がそれぞれ１２．１±８．２および８．６±６．７μｍで類似の特徴を実証したが、粒子容積の９０％が、それぞれ２３．１および２１．４μｍより大きな粒子に含有された。ミクロスフェア直径および容積分布のヒストグラムを図２０Ａ〜２０Ｆに見ることができる。５０％の累積粒子表面積が製剤Ｃ、Ｇ、およびＥに関してそれぞれ直径２３．６７、２９．５４、および２７．５８μｍよりも大きな粒子に存在したので、分布の大きい方の端の粒子はまた表面積効果に実質的にも寄与した。

ＰＬＧＡミクロスフェアからのＢＳＡのインビトロ放出
ＰＬＧＡミクロスフェアからのインビトロ放出動態をＢＣＡアッセイによって決定し、そして実験の期間中に放出された全ＢＳＡのパーセントとして表現した。乳酸対グリコール酸の５０：５０比の３つのポリマーのいずれかを使用して製作されたＰＬＧＡミクロスフェアにおいて、７５：２５比と比較して、ＢＳＡ放出および粒子分解はより迅速に生じた。５０：５０比のＰＬＧＡを使用して生成された全てのミクロスフェア製剤は１４週以内に分解したが、一方７５：２５ＰＬＧＡは２２週で分解した。ＢＳＡ放出のタイミングは、ＢＳＡ搭載よりもポリマー型により依存すると思われたが、大抵の場合に搭載が主にバーストのサイズに影響を及ぼした。図２１Ａにて示されるように、低分子量（７〜１７ｋＤａ）ＰＬＧＡは８週の経過にわたって、３つの別個のバーストで放出し、そして１４週目までに完全に分解した。中間分子量（２４〜３８ｋＤａ）のＰＬＧＡもまた、ＢＳＡ搭載に依存して、９〜１２週にわたって広がる３つのバーストを示し、そして１４週目までに分解した（図２１Ｂ）。最も高い分子量（３８〜５４ｋＤａ）のＰＬＧＡは、１日目および８週目に顕著なバーストを伴って９〜１２週にわたってＢＳＡを放出したが、３％ＢＳＡ搭載ミクロスフェアと５％ＢＳＡ搭載ミクロスフェアとの間により連続的な放出動態を伴った（図２１Ｃ）。低分子量（４〜１５ｋＤａ）ＰＬＧＡから作製された、より高い乳酸含有量（７５：２５）を伴うミクロスフェアは２２週にわたって分解し、そして初期バーストの後、段階的で半連続的な放出を示した（図２１Ｄ）。

１６のインビトロ製剤のうち、製剤Ｃ、Ｇ、およびＥを、そのインビトロ放出動態に基づいて後のインビボ試験のために選択した。製剤Ｃのミクロスフェアを、０．５％ＢＳＡを搭載した、低分子量ＰＬＧＡ（７〜１７ｋＤａ）を使用して作製し、製剤Ｇのミクロスフェアをわずかにより高い分子量のＰＬＧＡ（２４〜３８ｋＤａ）および０．５％ＢＳＡを用いて作製し、そして製剤Ｅのミクロスフェアを製剤Ｇと同じ分子量のＰＬＧＡを用いるが、より高い（５％）ＢＳＡ搭載を伴って作製した。製剤ＣからのＢＳＡ放出は、３つの別個のピークを特徴とし、それぞれ、１日目に全ＢＳＡの３３．４±５．１％が放出され、４週目に２７．２±４．３％が放出され、そして６週目および７週目の時点にかけて、３２．１±５．２％が放出された（図２１Ａ）。最小のＢＳＡ放出は１、２、４、および５週目に、または７週目の後に観察され、そしてミクロスフェアは、粒子の完全な溶解によって証明されるように、１０週目までに完全に分解した。

製剤Ｇミクロスフェアはまた３つのバーストでのＢＳＡ放出を特徴とする（図２１Ｂ）が、より長い時間枠にわたって広がった。加えて、全ミクロスフェア分解は、製剤Ｃについての１０週よりもむしろ、１４週後に観察された。製剤Ｇからの最初のＢＳＡバーストは１日目の時点で観察され、全ＢＳＡの２８．０±５．７％が放出された。これに４週目の１２．９±２．９％の第２バーストが続き、そしてバーストは８週目から１１週目まで延長され、その間に累積的に４３．８±２．０％のＢＳＡが放出された。粒子の完全な分解を通して、他のどの時点でも、放出溶媒中にＢＳＡはほとんど、または全く観察されなかった。

製剤ＥミクロスフェアはそのＢＳＡの６３．７±７．３％を１日目に放出したが、これはいずれの製剤の全量および全パーセンテージの両方に関しても、最大の初期バーストであった（図２１Ｃ）。この初期バースト後の実質的なＢＳＡ放出を伴う時点は３週目および８週目のみであり、そのときに全搭載の８．９±０．９％および８．８±２．１％がそれぞれ放出された。同じ分子量（２４〜３８ｋＤａ）のＰＬＧＡを使用した製剤Ｇに類似して、製剤Ｅは１４週目で完全に分解した。

ＢＳＡ含有ＰＬＧＡミクロスフェアの免疫原性
各ミクロスフェア製剤に対する液性免疫応答を、インビトロで粒子から放出されたＢＳＡの量およびタイミングと一致する、３つのボーラス注射からなる陽性対照と比較した。実験群内で、連続した週の間での力価における統計的に有意な増加を放出の証拠として使用した（１サンプル対応のｔ検定）。製剤Ｃは、１、２、および４週目で以前の時点と比較して抗体力価の有意な増加を誘起し（それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０００１、およびｐ＜０．００１）、次いで６および８週目に有意に減少し（それぞれｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５）、その後１０週目で安定化した（図２２）。同様に、製剤Ｇを受けたマウスは、１、２、および４週目に力価の有意な増加を示し（それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１、およびｐ＜０．０１）、６週目でそのままであり、次いで８週目までに有意に降下し（ｐ＜０．０５）、その後１０週目に再度安定化した。製剤Ｅは、抗体力価が１、２、および４週目に有意に増加した（全てに関してｐ＜０．００１）ような、類似の応答を誘起し、６週目に横ばいになり、次いで試験の終わりまで減少した（ｐ＜０．０５）。全体としては、３つ全てのマイクロ粒子製剤に対する免疫応答は、力価が最初の４週間にわたって上昇し、次いで１０週目までゆっくりと減少するような、類似した経時的な進行を実証した（図２２）。しかしながら、抗体力価の大きさは、ＢＳＡ搭載に大いに依存すると思われた。インビトロ実験に基づいて、製剤Ｅは、大きな初期バーストのために、最も早い時点（１日目）に製剤Ｃよりもおよそ１３倍多いＢＳＡを放出し、そして同様に１３倍高い抗体力価を誘起した。製剤Ｅによって誘起された抗体力価が、７倍のＢＳＡを放出した後、製剤Ｃに伴うものよりも８倍高かったので、この傾向はまた試験の終わりでも観察された。

ＢＳＡ搭載ミクロスフェア製剤のいずれかを受けた動物からの抗体力価は、用量が一致するボーラス注射を受けた動物からのものよりも、２および４週後に有意に高かった（それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）。しかしながら、４週目での２回目のボーラス注射で追加免疫化した後、力価は、６および８週目で、製剤と、用量が一致するそれらのボーラス群との間で、統計的に類似した。次いで３回目のボーラスの投与の後の１０週目に、ボーラスＢＳＡを受けた動物は、力価の別のスパイクを示し、その時点の、全ての用量が一致するミクロスフェア群と比較して、有意に高い抗体力価をもたらした（ｐ＜０．００１）。

時間が一致する抗体力価は、抗原提示のタイミングを示唆するが、抗原提示のタイミングにおいて起こり得るミスマッチのために（Ｐａｒｙａｎｉら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ、１０５：２００−２０５（１９８４）；Ｂａｒｒａｃｌｏｕｇｈら、Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ、５４：９５−１０３（２００９））、ピーク抗体力価がこの場合の免疫応答のより有用な指標であるかもしれない。インビトロでのミクロスフェアバーストのタイミングを合わせるためにボーラス注射スケジュールを選択したが、加速したインビボ分解が抗原放出の相殺を招いた可能性がある。結果的に、実験の終わりには、抗原の不存在下で予期されるように、ミクロスフェア群の抗体力価が数週間低下したが、ボーラス対照群における力価は３回目の注射の後に、その最高レベルに到達した。ピークの抗体力価を比較することが、タイミングの影響を制御し、そしてどの処置がより免疫原性であるかを決定する助けとなる。

製剤Ｃ、Ｇ、およびＥに関する抗体力価は、ミクロスフェア投与４週間後に、ｌｏｇ２スケールでそれぞれ１３．９±１．３、１３．７±２．２、および１６．１±２．１でピークとなったが、小用量および大用量に一致するボーラスは１０週後にそれぞれ１５．５±１．５および１７．７±０．８のｌｏｇ２力価でピークとなった（図２３）。多群力価比較に推奨されているホルム−ボンフェローニ補正法（Ｒｅｖｅｒｂｅｒｉ、Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓ．６：３７−４５（２００８））を使用して、製剤ＣおよびＧ（図２３Ａ）は、３回の２２μｇのＢＳＡの注射からなる、用量が一致するボーラス対照と統計的に異なることのないピーク抗体力価を誘起した（それぞれｐ^＊＝０．０６４５およびｐ^＊＝０．０５４３）。製剤Ｅ（図２３Ｂ）はまた、３回のボーラス注射からなる用量が一致するボーラス対照と、統計的に異なることのないピーク力価を誘起した（ｐ^＊＝０．０７８４）（表５）。

実施例７：薬物送達のためのＰＬＧＡマイクロモールド成形された粒子
材料および方法
単一薬物粒子の開発は、３つの主要な工程：１）シェルのマイクロ作製、２）ワクチン／薬物充填、および３）粒子密封を含む。

シェルのマイクロ作製には、マスク製作（リソグラフィ）、フルオロ−モールド製作（ＵＶコア）およびＰＬＧＡの熱プレス（１２０℃で３０分間）を使用してよい。薬物充填の工程は、Ｂｉｏｄｏｔロボットによって実行してもよく、コアを１．５ｎＬの容量の薬物で充填する。ＰＬＧＡキャップをシェル上に置き、そして次に粒子を３７℃で５分間密封し、そしてアセトンを５分間蒸発させることにより密封を達成する。

プロセスの概略図を図１２Ａ〜１２Ｄおよび２４Ａ〜２４Ｃに提示する。これらのマイクロ粒子は、それぞれ３７℃で５分間密封する積み重ねとして製造してよい。

結果
マイクロモールド成形された粒子シェルのｘ、ｙ、およびｚ寸法は、４５０×４５０×３００μｍで、１００×１００×１００μｍのコアを有する（キャップ寸法は４５０×４５０×１５０μｍ）か、または２００×２００×１５０μｍで、１００×１００×１００μｍのコアを有する。これらの寸法により、２１ゲージの針（内径５１４μｍ）または２３ゲージの針（内径３３７μｍ）を用いて粒子を送達することが可能になる。

実施例８．薬物／糖溶液を沈着させるための単独のＰＬＡ粒子
材料および方法
０．５Ｍトレハロースおよび０．５Ｍスクロース溶液中のＩＰＶをＰＬＡ粒子に沈着させ、次いで幹細胞培養フード内で、室温で乾燥させた。Ｍａｋｅｒｂｏｔプリンタを使用して、ＰＬＡ粒子を３Ｄ印刷してもよい。

結果
この方法によって、糖溶液中の薬物または抗原を基材上に沈着させることが可能になり、そのため薬物または抗原は糖ガラス内で安定化されるので、単独のＰＬＡ粒子は、薬物および抗原の上での乾燥、ならびにその送達に有用なプラットフォームとして役立つ可能性がある。ＰＬＡ粒子上でのＩＰＶ抗原の安定性に関する試験を以下の実施例にて提示する。

実施例９：ＩＰＶミクロスフェアの安定性
前記実施例１にて提示されるＩＰＶミクロスフェア形成のプロセスは、製造プロセスの間のＩＰＶ安定性に関する課題をはらんでいる。この課題を、課題を克服する知見の概要と共に表６に提示する。

表６．ＩＰＶ安定性に対する障害、障害を克服するために取られたアプローチおよび知見の概要。

実施例１０：ＩＰＶとゼラチンまたは穏やかな界面活性剤との同時カプセル封入および超音波処理が乳化中のＩＰＶ安定性を増加させる
材料および方法
ＩＰＶを水および／または賦形剤と、１００：１のｗ／ｗ比で混合した。使用した賦形剤はゼラチン、マルトデキストリン、プルラン、ミリスチン酸、およびＴｗｅｅｎ８０であった。次いで賦形剤を伴うＩＰＶをＤＣＭ、またはＰＬＧＡ／ＤＣＭに加えた。混合物を最高設定で１０秒間ボルテックスするか、または２５％の振幅で１０秒間超音波処理した。ＥＬＩＳＡバッファー（ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）を加え、混合物を高設定で１０秒間ボルテックスし、そして遠心分離によって層を分離した。水層を除去し、そしてＥＬＩＳＡによって試験した。

結果
ゼラチンおよびＴｗｅｅｎ８０の両方がＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型ＩＰＶの安定性を改善した（図２５）。

ＩおよびＩＩＩ型ＩＰＶは概して損傷に対して最も鋭敏であり、２０％振幅で３０秒間の超音波処理で最良の回収を示した（図２６）。

実施例１１：Ｇｅｎｅｖａｃを用いるＩＰＶおよび賦形剤の乾燥はＩＰＶ回収を改善する
材料および方法
ＩＰＶを２６倍に濃縮し、そしてプルラン、プルラン／ＢＳＡ、またはソルビトール／ＭＳＧ／ＭｇＣｌ_２と、１００：１、３５０：１、または７００：１の質量比で混合した。賦形剤を伴うＩＰＶを凍結乾燥（一晩）によって、またはＧｅｎｅｖａｃ（１時間、３０〜３５℃）を使用して乾燥させた。賦形剤を伴う乾燥ＩＰＶを再懸濁した後、ＥＬＩＳＡによって回収を試験した。

結果
凍結乾燥（Ｌｙｏ）およびＧｅｎｅｖａｃの全ての対となる群で（図２７）、Ｇｅｎｅｖａｃは凍結乾燥よりも高い回収を示した。

実施例１２：凍結乾燥したＩＰＶは３７℃で長期間安定性を示す
材料および方法
ＩＰＶを賦形剤である１０％ソルビトール、８．５％ＭＳＧ、および８．５％ＭｇＣｌ_２と４０，０００：１で混合し、そしてプラスチックチューブ中で凍結乾燥した。凍結乾燥した、賦形剤を伴うＩＰＶをプラスチックチューブ中で、乾燥剤と共に袋内で、加湿環境および３７℃で３０日まで保存した。種々の時点で、凍結乾燥したＩＰＶを再懸濁し、そしてＥＬＩＳＡによって回収に関して試験した。

結果
賦形剤を伴う凍結乾燥形態のＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型ＩＰＶは、３７℃で保存した場合、長期間安定性を示した（図２）。

実施例１３：ＰＬＧＡ粒子による放出溶媒のｐＨの変化
ＰＬＧＡはバルク浸食によって分解し、ミクロスフェアの内側の酸蓄積をもたらす。インビトロ保存の間に、限定された容量のバッファーはチューブ内に酸蓄積を引き起こす場合があり、それは粒子浸食およびミクロスフェアの内側の酸蓄積に至る場合がある。インビボ適用では、局所環境におけるバッファーは常に補給され、粒子の外側の酸蓄積は最低限である。ＰＬＧＡはバルク浸食によって分解するので、ミクロスフェアの内側の酸蓄積は問題になる可能性がある。したがって、いくつかのＰＬＧＡ分子を、バッファーを２〜３日毎に、または７日毎に変えた場合の放出溶媒のｐＨの経時的な変化に関して試験した。

結果
図２９における結果は、ＰＬＧＡ分子単独で放出溶媒のｐＨを変化させて、経時的にそれをさらに酸性にさせることを実証する。２〜３日毎にバッファーを変えることが、この影響を軽減する助けとなるが、それでは問題を解決しない。

実施例１４．ＰＬＧＡミクロスフェアの酸性生成物を緩衝する賦形剤
Ｉ型ＩＰＶはｐＨ７．４、３７℃で比較的に安定であり、そしてＩＩ型およびＩＩＩ型ＩＰＶはｐＨ６〜８、３７℃で安定であったことが観察された。したがって、いくつかの賦形剤を、ＰＬＧＡミクロスフェアの酸性生成物を緩衝するそれらの緩衝能力に関して試験した。
材料および方法
Ｍｇ（ＯＨ）_２、Ａｌ（ＯＨ）_３、およびミリスチン酸のような緩衝剤をＰＬＧＡミクロスフェアに組み込んで、放出溶媒のｐＨの変化を最小化した。また、Ｍｇ（ＯＨ）_２は水にほとんど、または全く溶けず、それはポリマーマトリックス全体にわたって分布したままであり、そして潜在的に内部区画を緩衝できる。Ａｌ（ＯＨ）_３は公知のアジュバントであり、そして免疫原性を増加させることができる。

結果
図２８における結果では、Ｍｇ（ＯＨ）_２が放出溶媒中の酸性副産物を緩衝でき、そして約ｐＨ７で放出溶媒のｐＨを安定化できることが実証される。
実施例１５．安定化賦形剤を組み込むＩＰＶミクロスフェア

実施例９〜１４の調査に基づいて、ＩＰＶおよび種々の安定化添加剤を組み込むＰＬＧＡミクロスフェアを作製した。これらの製剤を以下の表７に提示し、そしてＰＬＧＡ５０２Ｈを用いて作った。ＰＬＧＡ５０３Ｈのような、より高分子量のポリマーを用いる他の製剤もまた企図される。

実施例１６．ＰＬＡ上での乾燥の後のＩＰＶ安定性により、より低い賦形剤：ワクチン比の使用が可能になる

ＰＬＡ上で２６倍の三価ＩＰＶを室内の温度および湿度で１６時間乾燥させた後のＤ抗原の保持を試験した。使用した賦形剤は１０％ソルビトール、８．５％ＭＳＧ、８．５％ＭｇＣｌ_２であった。賦形剤の、試験したワクチンに対する比は３００対１、１００対１、６０対１、３０対１、または賦形剤無しであった。保持されたＤ抗原のパーセントをＥＬＩＳＡによってアッセイした。

結果
ＰＬＡ上での溶液の乾燥に際して、比を３０：１にまで下げたときに、安定性の有意な降下は観察されなかった（図１）。このデータにより、濃縮された賦形剤不含のＩＰＶは、抗原活性を大きく喪失することなく、ＰＬＡ立方体上で乾燥させることができることが示された。

実施例１７．賦形剤と混合し、ＰＬＡ立方体上で乾燥させた濃縮ＩＰＶの他の製剤
表８に列挙した製剤は、濃縮ＩＰＶを示された賦形剤溶液（「ポリオール」および「その他」の欄）と、示された比（「賦形剤：ワクチン」の欄、全ての示された比は１００：１である）で混合し、そしてＰＬＡ立方体上で一晩乾燥させたときに保持されたＤ抗原％を表す。

他に定義しない場合、本明細書で使用する全ての技術的用語および科学的用語は、開示された本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に引用した文献および引用した材料は、具体的に参照によって組み込まれる。当業者は、本明細書に記載する本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等のものを認識するか、または通常の実験のみを使用して確認することができる。このような同等のものが以下の請求の範囲によって包含されることを意図する。

Claims (19)

1. 抗原を、必要に応じて前記抗原のための安定剤と組み合わせて含む生体適合性ポリマーのエマルジョン製剤、３次元印刷、またはマイクロモールディングによって形成されたポリマー製剤であって、前記抗原が、インビボで免疫応答を引き出すのに有効な量で規定の期間に放出される、ポリマー製剤。
2. 治療用、予防用、栄養補助用、または診断用薬剤を、必要に応じて安定剤と組み合わせて含む生体適合性ポリマーのエマルジョン製剤、３次元印刷、またはマイクロモールディングによって形成されたポリマー製剤であって、前記薬剤が少なくとも２つの異なる時点で、または異なる放出動態で、前記製剤の別個の領域から放出される、ポリマー製剤。
3. 前記薬剤が１つまたはそれを超える抗原であり、前記抗原が、インビボで免疫応答を引き出すのに有効な量で規定の期間に放出される、請求項２に記載の製剤。
4. 投与時に賦形剤中に存在するか、前記製剤の表面に存在するか、または前記製剤と混合された、インビボで免疫応答を引き出すのに有効な量の抗原をさらに含む、請求項１または３に記載の製剤。
5. 糖、油、脂質、および炭水化物、好ましくは糖であり、最も好ましくはスクロース、トレハロース、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、必要に応じて糖ガラスの形態である糖からなる群から選択される安定化剤をさらに含む、請求項１または２に記載の製剤。
6. 前記抗原が感染病原体または腫瘍に対して免疫応答を引き出す、請求項１または３に記載の製剤。
7. 前記感染病原体がウイルス、細菌、真菌または原虫である、請求項６に記載の製剤。
8. 前記ウイルスがポリオ、インフルエンザ、肝炎、ロタウイルス、麻疹、ムンプス、風疹、および水痘からなる群から選択される、請求項７に記載の製剤。
9. 前記細菌がジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）、百日咳（Ｐｅｒｔｕｓｓｉ）、破傷風菌、肺炎球菌、および髄膜炎菌からなる群から選択される、請求項７に記載の製剤。
10. 前記抗原が、腫瘍に対するＴ細胞応答を選択的に引き出す腫瘍抗原である、請求項６に記載の製剤。
11. 前記ポリマーが加水分解による生分解性であり、好ましくはポリエステルであり、最も好ましくはポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、およびそれらのコポリマーからなる群から選択される、請求項１または２に記載の製剤。
12. １０〜９０日の間隔で、好ましくは３０〜６０日の間隔で放出を提供する、請求項１または２に記載の製剤。
13. マイクロ粒子、マイクロカプセル、またはミクロスフェアの形態である、請求項１または２に記載の製剤。
14. 前記製剤が注射用である、請求項１または２に記載の製剤。
15. 前記製剤が移植可能である、請求項１または２に記載の製剤。
16. 前記製剤は、鼻、肺、口腔、膣および直腸からなる群から選択される粘膜表面に適用することができる、請求項１または２に記載の製剤。
17. 治療用、予防用、栄養補助用または診断用薬剤を、それを必要とする個体に送達する方法であって、前記個体に請求項１〜１６のいずれかに記載の製剤を投与することを含む、方法。
18. 前記製剤が、抗原を、必要に応じて前記抗原のための安定剤と組み合わせて含む生体適合性ポリマーの３次元印刷またはマイクロモールディングによって形成されたポリマー製剤であって、前記抗原が、インビボで免疫応答を引き出すのに有効な量で規定の期間に放出される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記抗原が２か月またはそれを超える月間隔で放出され、前記抗原がポリオまたはＤＰＴである、請求項１８に記載の方法。