JP2017506257A - Compositions and methods for the treatment, prevention and diagnosis of cancer and other proliferative diseases - Google Patents

Abstract

本発明は、癌があるか、又は転移性疾患のリスクの高い哺乳動物対象で、癌細胞の転移を抑制するためにＩｄ（分化抑制）タンパク質の機能を損傷させるか、又はその濃度を減少又は除去する方法を提供する。抗Ｉｄ化合物の例には、Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド及びＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドの単離された鏡像異性体が含まれる。本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、標準的な抗癌治療法、例えば手術、放射線及び化学療法と組み合わされることができる。また、腫瘍関連血管新生を含む病原性血管新生病態、及び加齢黄斑変性を含む眼球血管病理を含むその他の過剰増殖性疾患を治療するための組成物及び方法が提供される。The present invention relates to a mammalian subject who has cancer or is at a high risk of metastatic disease, which damages the function of Id (inhibition of differentiation) protein in order to suppress the metastasis of cancer cells, or reduces the concentration thereof. Provide a way to remove. Examples of anti-Id compounds include N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide and N- ( Isolated enantiomers of 3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide are included. The anti-Id compositions and methods of the present invention can be combined with standard anti-cancer therapies such as surgery, radiation and chemotherapy. Also provided are compositions and methods for treating pathogenic angiogenic conditions, including tumor-associated angiogenesis, and other hyperproliferative diseases, including ocular vascular pathologies, including age-related macular degeneration.

Description

本発明は、哺乳動物対象における、病原性血管新生を含む、癌及びその他の増殖性疾患の予防、診断及び治療のための組成物並びに方法に関する。   The present invention relates to compositions and methods for the prevention, diagnosis and treatment of cancer and other proliferative diseases, including pathogenic angiogenesis, in mammalian subjects.

関連出願に対する相互参照
本願は、２０１３年１２月１３日に出願された米国仮出願番号第６０／９１６，１１６号、及び２０１４年２月６日に出願された米国仮出願番号第６１／９６５，７７６号の優先権を主張する。これらのそれぞれが、あらゆる目的に関して、その全体が参照によって本願に援用される。 CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS This application is filed in US Provisional Application No. 60 / 916,116, filed December 13, 2013, and US Provisional Application No. 61/965, filed February 6, 2014. Claim priority of 776. Each of these is hereby incorporated by reference in its entirety for all purposes.

分化抑制（Ｉｄ）タンパク質
へリックス−ループ−へリックスタンパク質（ＨＬＨ）のＩｄファミリは、癌における事実上全ての発症細胞機序及び決定事象である、細胞分化、細胞周期進行、老化、分化系列決定及びアトポーシスの調節に関わっている（Ｐｅｒｋ他、２００５年；Ｍｏｒｓｅ、２００６年；Ｌｉｎｇ他、２００６年、Ｎａｉｒ他、２０１３年）。用語「Ｉｄ」そのものが、細胞分化及び重要な調節タンパク質のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）への結合の両方を抑制するこれらのタンパク質の能力を特徴づける。４種類のＩｄタンパク質（Ｉｄ１−４）の中で、腫瘍侵襲性、転移及び血管新生でのＩｄ１の役割が最もよく特徴づけられており、癌におけるＩｄ１の役割に関する発見は、その後の議論に対する基礎を提供する。 Differentiation Inhibitory (Id) Proteins The Id family of helix-loop-helix proteins (HLH) is virtually all pathogenic cell mechanisms and determining events in cancer, cell differentiation, cell cycle progression, senescence, differentiation lineage determination And is involved in the regulation of atoposis (Perk et al., 2005; Morse, 2006; Ling et al., 2006, Nair et al., 2013). The term “Id” itself characterizes the ability of these proteins to inhibit both cell differentiation and binding of key regulatory proteins to DNA (deoxyribonucleic acid). Among the four Id proteins (Id1-4), the role of Id1 in tumor invasiveness, metastasis and angiogenesis is best characterized, and the discovery of the role of Id1 in cancer is the basis for further discussion I will provide a.

Ｉｄ１は、ヒトＩｄ１（配列識別番号１）（ＵｎｉＰｒｏＫＢ Ｐ４１１３４）及びマウスＩｄ１（配列識別番号２）（ＵｎｉＰｒｏＫＢ Ｐ２００６７）のＩｄ１タンパク質に関して９０％を超える著しい「相同性」（配列同一性）を示す下に提供される配列アライメント図で例証されるように、脊髄動物及び無脊椎動物だけでなく、種の間でも高度に保存されている（Ｄｅｅｄ他、１９９４年）。

Id1 has a marked “homology” (sequence identity) of over 90% with respect to the Id1 protein of human Id1 (SEQ ID NO: 1) (UniProKB P41134) and mouse Id1 (SEQ ID NO: 2) (UniProKB P20067) It is highly conserved among species as well as vertebrates and invertebrates, as illustrated in the provided sequence alignment diagrams (Deed et al., 1994).

ヒトＩｄ３（配列識別番号３）（ＵｎｉＰｒｏＫＢ Ｑ０２５３５）及びマウスＩｄ３（配列識別番号４）（ＵｎｉＰｒｏＫＢ Ｐ４１１３３）のＩｄ３タンパク質間の比較は、さらに近い配列同一性をもたらす。

Comparison between the Id3 proteins of human Id3 (SEQ ID NO: 3) (UniProKB Q02535) and mouse Id3 (SEQ ID NO: 4) (UniProKB P41133) results in closer sequence identity.

ヒトＩｄ２（ＵｎｉＰｒｏＫＢ Ｑ０２３６３）及びマウスＩｄ２（ＵｎｉＰｒｏＫＢ Ｐ４１１３６）タンパク質は、１３４個中の２個以外の全てが同一の残基を共有し、一方でヒトＩｄ４（ＵｎｉＰｒｏＫＢ Ｐ４７９２８）及びマウスＩｄ４（ＵｎｉＰｒｏＫＢ Ｐ４１１３９）は、配列が１００％同一である。   Human Id2 (UniProKB Q02363) and mouse Id2 (UniProKB P41136) proteins all share the same residues except two in 134, while human Id4 (UniProKB P47928) and mouse Id4 (UniProKB P41139) , The sequence is 100% identical.

ヒト及びネズミ科のＩｄの間でのこの普通でない高度の相同性又は配列同一性は、Ｉｄ構造、機能及び生態に関して、許容されたモデル対象としてのマウスからヒトに推定する実験的発見における高い信頼を提供する。   This unusually high degree of homology or sequence identity between human and murine Id is highly reliable in experimental discoveries inferred from mouse to human as an accepted model subject with respect to Id structure, function and ecology. I will provide a.

研究されたほとんどのＩｄは、健康な成人の分化した組織で極めて低濃度（通常は測定不能又は検出不能な濃度）で見られる転写調節因子であるＩｄ１である（癌組織又は発達中（胎児）の組織から通常検出可能な高いＩｄ濃度とは対照的である）。Ｉｄ３はＩｄ１のパラログと考えられ、一方でＩｄ２及びＩｄ４は、互いに及びＩｄ１及びＩｄ３とは明らかに異なる。   Most Ids studied are Id1, a transcriptional regulator (cancerous tissue or developing (fetus)) found in very low concentrations (normally unmeasurable or undetectable concentrations) in healthy adult differentiated tissues In contrast to the high Id concentrations normally detectable from other tissues). Id3 is considered a paralog of Id1, while Id2 and Id4 are clearly different from each other and from Id1 and Id3.

Ｉｄ１及び全てのＩｄへリックス−ループ−へリックス（ＨＬＨ）タンパク質についての主要な結合パートナーは、発生過程の調節因子として広範囲に２００を超えるメンバー及び官能基を含む、転写因子の塩基性へリックス−ループ−へリックス（ｂＨＬＨ）ファミリである（Ｐｏｗｅｌｌ及びＪａｒｍａｎ、２００８年；Ｍａｓｓａｒｉ、２０００年）。ｂＨＬＨファミリのうち特に重要なメンバーは、いわゆるＥタンパク質である。   The primary binding partner for Id1 and all Id helix-loop-helix (HLH) proteins is a basic helix of transcription factors that contains a broad range of over 200 members and functional groups as regulators of development. The loop-helix (bHLH) family (Powell and Jarman, 2008; Massari, 2000). A particularly important member of the bHLH family is the so-called E protein.

Ｅタンパク質は、普遍的に発現するｂＨＬＨタンパク質であり、ＤＮＡのＥ−ｂｏｘ要素に結合し、Ｉｄタンパク質により隔離される。Ｅ４７は、Ｅ２Ａ遺伝子のスプライス生成物である塩基性へリックス−ループ−へリックスタンパク質である。Ｅ−２６「ＥＴＳ」は、やはりＩｄタンパク質により阻害されることが提示されている調節転写因子の別のファミリ（おおよそ２０）である。Ｅ及びＥＴＳタンパク質の両方が、様々な細胞状況において細胞分化及び成長停止をさせることが証明されている。ＩｄＨＬＨタンパク質の頻度の低い結合パートナーには、特にＩｄ２（Ｄｅｓｐｒｅｚ他、２００３年）及びＩｄ１に対しての網膜芽細胞腫（ＲＢ、腫瘍抑制因子として機能するタンパク質）、非ｂＨＬＨタンパク質Ｅ−２６（ＥＴＳ）（様々な組織の発生及び例えば腫瘍抑制遺伝子であるｐ１６Ｉｎｋ４ａを介して癌の進行に関与する調節転写因子のファミリ）、ペアードボックス（Ｐａｘ）；マウスＩｄ関連−１（ＭＩＤＡ−１）；及びステロール調節結合タンパク質−ｌｃ、ＳＲＥＢＰ−ｌｃが含まれる。   E protein is a universally expressed bHLH protein that binds to the E-box element of DNA and is sequestered by Id protein. E47 is a basic helix-loop-helix protein that is a splice product of the E2A gene. E-26 “ETS” is another family (approximately 20) of regulatory transcription factors that has also been shown to be inhibited by Id proteins. Both E and ETS proteins have been shown to cause cell differentiation and growth arrest in a variety of cellular situations. Infrequent binding partners of IdHLH proteins include retinoblastoma (RB, a protein that functions as a tumor suppressor), particularly non-bHLH protein E-26 (ETS) for Id2 (Deprez et al., 2003) and Id1. ) (A family of regulatory transcription factors involved in the development of various tissues and cancer progression through, for example, the tumor suppressor gene p16Ink4a), a paired box (Pax); a mouse Id-related-1 (MIDA-1); Sterol regulatory binding protein-lc, SREBP-lc are included.

ＨＬＨファミリタンパク質の機能は、Ｉｄタンパク質の機能と似ている。一般的に、これらのタンパク質の全てが、細胞分化、細胞周期進行、老化、細胞関与（決定された系統／運命への）及び／又はアトポーシスにおける停滞又は変化の基本的なメディエーターである。しかし、Ｉｄタンパク質の活性は、通常はＨＬＨファミリタンパク質の活性への効果とは反対である。これは、下記の通り、ＨＬＨ及びｂＨＬＨタンパク質の間の結合による不活性化の結果が原因の１つである。   The function of HLH family proteins is similar to that of Id proteins. In general, all of these proteins are fundamental mediators of stagnation or change in cell differentiation, cell cycle progression, senescence, cell involvement (to determined lineage / fate) and / or atoposis. However, the activity of the Id protein is usually opposite to the effect on the activity of the HLH family proteins. This is partly due to the inactivation resulting from binding between HLH and bHLH proteins, as described below.

ｂＨＬＨタンパク質は、一般的に哺乳動物の細胞系で制限された成長又はゼロ成長の環境を媒介する。この役割と一致して、Ｂ及びＴ細胞におけるＥタンパク質の減少はＢ及びＴ細胞白血病の発生と関連する（Ｋｅｅ、２００９年）。これと対照的に、増加したＩｄタンパク質の発現は、ｂＨＬＨタンパク質を中和するＩｄの潜在能力に起因する成長促進環境に関連している。   bHLH proteins generally mediate a limited or zero growth environment in mammalian cell lines. Consistent with this role, loss of E protein in B and T cells is associated with the development of B and T cell leukemia (Kee, 2009). In contrast, increased Id protein expression is associated with a growth-promoting environment due to Id's potential to neutralize bHLH protein.

ｂＨＬＨタンパク質と他のｂＨＬＨタンパク質との間（Ｓｌａｔｔｅｒｙ他、２００８年）及びｂＨＬＨタンパク質とＩｄタンパク質などのＨＬＨタンパク質との間における相互作用（Ｎｏｒｔｏｎ、２０００年）の性質に関する様々な報告が公表されている。ｂＨＬＨファミリの全てのメンバーは、短い媒介ループにより分離されている２つの両親媒性のαヘリックスを含む高度に保存されたＨＬＨ領域を有する。この「ＨＬＨドメイン」は、ｂＨＬＨタンパク質活性に必須のホモ又はヘテロ二量化を成立させる。隣接したこのＨＬＨドメインは、標準「Ｅ−ｂｏｘ」配列を含んでいるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）要素に結合する能力のある基本領域である。   Various reports on the nature of interactions between bHLH proteins and other bHLH proteins (Slattery et al., 2008) and between bHLH proteins and HLH proteins such as Id proteins (Norton, 2000) have been published . All members of the bHLH family have a highly conserved HLH region containing two amphipathic α-helices separated by a short mediator loop. This “HLH domain” establishes homo- or heterodimerization essential for bHLH protein activity. This adjacent HLH domain is the basic region capable of binding to deoxyribonucleic acid (DNA) elements containing a standard “E-box” sequence.

Ｉｄタンパク質もＨＬＨドメインを有するが、ｂＨＬＨタンパク質のＤＮA結合をなす隣接した基本領域がない。この構造の結果、Ｉｄタンパク質は、他のＨＬＨ転写因子に結合することができ、遺伝子転写でのその活性を変更することができる。この方法で、Ｉｄ１は、結合して、ＤＮＡに結合して転写変化を媒介するｂＨＬＨ結合パートナーの能力を制限することによって、Ｅタンパク質、Ｅ４７のようなｂＨＬＨ転写因子の活性を抑制することが報告されている（分化促進及びアトポーシス促進の細胞変化を促すことが提示されている−様々な細胞の発生状況において抗腫瘍活性及び抗血管新生作用と相関すると考えられる）。   The Id protein also has an HLH domain, but there is no adjacent basic region that forms the DNA binding of the bHLH protein. As a result of this structure, the Id protein can bind to other HLH transcription factors and alter its activity in gene transcription. In this way, Id1 is reported to inhibit the activity of bHLH transcription factors such as E protein and E47 by binding to DNA and limiting the ability of bHLH binding partners to mediate transcriptional changes. (It has been proposed to promote cell differentiation in promoting differentiation and promotion of apoptosis-thought to correlate with anti-tumor activity and anti-angiogenic activity in various cell development situations).

ｄ１は、タンパク質キナーゼ−Ａ（ＰＫＡ）により調節可能な核からの輸送に伴って、細胞の細胞質及び核分画の両方に存在する（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ他、２００７年）。また、Ｉｄ１の細胞内濃度は、ユビキチン−プロテアソーム分解経路を通じて調節されることも提示され（Ｓｕｎ他、２００５年）、おおよそ１時間以下のＩｄタンパク質についての半減期をもたらす。この分解過程は、前立腺癌細胞におけるＴＮＦ−α誘導アトポーシスに関連する可能性がある（Ｌｉｎｇ他、２００６年）。報告によると、ｂＨＬＨタンパク質でのヘテロ二量化は、Ｉｄ分解速度に影響を与え、保護してＩｄタンパク質の半減期を延長し得る（Ｂｏｕｎｐｈｅｎｇ他、１９９９年）。   d1 is present in both the cytoplasm and nuclear fraction of cells with transport from the nucleus regulatable by protein kinase-A (PKA) (Nishiyama et al., 2007). It has also been shown that the intracellular concentration of Id1 is regulated through the ubiquitin-proteasome degradation pathway (Sun et al., 2005), resulting in a half-life for the Id protein of approximately 1 hour or less. This degradation process may be related to TNF-α induced apoptosis in prostate cancer cells (Ling et al., 2006). Reportedly, heterodimerization with bHLH protein can affect the rate of Id degradation and protect it to extend the half-life of the Id protein (Bounheng et al., 1999).

Ｉｄタンパク質及び血管新生
Ｉｄ１及びＩｄ３は、腫瘍の成長及び拡大に関連する「病原性血管新生」（「腫瘍関連血管新生」）を含む新たな血管の生成において重大な役割を果たすと提示されている。Ｉｄ１遺伝子のＨＵＶＥＣ細胞への送達は、アンジオポエチン−１を上昇させ、血管新生促進表現型を与える（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ他、２００５年）。報告によると、Ｉｄ１は、血管新生促進因子の血管内皮成長因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）（Ｌｅｅ他、２００６年）、ｂＦＧＦ（Ｒｕｚｉｎｏｖａ他、２００３年）、ＨＩＦ−１（Ｋｉｍ他、２００７年）、及びＥＧＦ−Ｒ（Ｌｉｎｇ他、２００４年）の「下流」で作用し、そのためＩｄ１活性の喪失は、複数の血管新生経路を損ない得る。そのような血管新生経路の複数標的化は、腫瘍が単一標的の抗血管新生療法（別の血管新生促進成長因子の上方制御を通じた応答によるものを含む）では効果がないことが明らかになったため、重要な方針である。 Id protein and angiogenesis Id1 and Id3 have been proposed to play a critical role in the generation of new blood vessels, including “pathogenic angiogenesis” (“tumor-associated angiogenesis”) associated with tumor growth and expansion. . Delivery of the Id1 gene to HUVEC cells raises Angiopoietin-1 and gives a pro-angiogenic phenotype (Nishiyama et al., 2005). According to reports, Id1 is an angiogenesis-promoting factor, vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) (Lee et al., 2006), bFGF (Ruzinova et al., 2003), HIF-1 (Kim et al., 2007). , And “downstream” of EGF-R (Ling et al., 2004), so loss of Id1 activity can impair multiple angiogenic pathways. Such multi-targeting of angiogenic pathways has been found to be ineffective for tumors with single-targeted anti-angiogenic therapies, including those that respond by up-regulating another pro-angiogenic growth factor Therefore, it is an important policy.

また、Ｉｄ１は、サイクリンの不活性化を通じて機能すると提示されている、ｐ２１（サイクリンキナーゼ阻害因子）と負の相互作用をすることが提示されている。Ｐ２１は、前駆細胞が腫瘍関連血管新生（Ｓｅａｎｄｅｌ他、２００８年）及び癌転移（Ｇａｏ他、２００８年；Ｇａｏ他、２００９年）において中心的な役割を果たすと考えられる骨髄血管新生（Ｃｉａｒｒｏｃｃｈｉ他、２００７年）において、内皮前駆細胞の形成を負に制御すると報告されている。腫瘍関連血管新生での内皮Ｉｄタンパク質発現のための直接的な役割は、Ｉｄ１^-/-、Ｉｄ３^+/-マウスにおける異種移植研究を基に提示されている。Ｉｄ１^-/-、Ｉｄ３^+/-マウスにおける異種移植腫瘍は、報告によると、完全には成長しないか、又はＩｄ野生型対照に比べて広範囲な出血及び壊死を伴う遅い成長を示し、一方で野生型骨髄由来内皮前駆細胞の移植は、Ｉｄ１^-/-；Ｉｄ３^+/-対象での腫瘍血管新生及び腫瘍成長を回復させるものと報告されている（Ｌｙｄｅｎ他、１９９９年；Ｌｙｄｅｎ他、２００１年）。 Id1 has also been shown to negatively interact with p21 (cyclin kinase inhibitor), which has been proposed to function through inactivation of cyclin. P21 is a bone marrow angiogenesis in which progenitor cells are thought to play a central role in tumor-associated angiogenesis (Seandel et al., 2008) and cancer metastasis (Gao et al., 2008; Gao et al., 2009). 2007) is reported to negatively control the formation of endothelial progenitor cells. A direct role for endothelial Id protein expression in tumor-associated angiogenesis has been presented based on xenograft studies in Id1 ^{− / −} , Id3 ^+/− mice. Xenograft tumors in Id1 ^{− / −} , Id3 ^+/− mice reportedly do not grow completely, or show slow growth with extensive bleeding and necrosis compared to Id wild type controls, while wild Type I bone marrow-derived endothelial progenitor cell transplantation has been reported to restore tumor angiogenesis and tumor growth in Id1 ^{− / −} ; Id3 ^+/− subjects (Lyden et al., 1999; Lyden et al., 2001) .

Ｉｄタンパク質及び癌
Ｉｄ１タンパク質は、癌の発生及び進行に関与する多種多様な信号伝達及び制御要素に関連すると報告されている（Ｆｏｎｇ他、２００４年）。特に興味深い関連は、Ｉｄ１及び癌転移の間で提示されている。Ｉｄ１は、ヒト乳癌における転移性変化とメカニズムで関連すると報告されている（Ｍｉｎｎ他、２００５年）。Ｉｄ１の過発現は、動物に移植された乳癌細胞での転移の一因であると報告されている（Ｆｏｎｇ他、２００３年）。別の研究で、Ｉｄ−１の過発現は、マウスにおいて骨髄性前駆細胞を不死化し、骨髄増殖性疾患をもたらすと報告されている（Ｓｕｈ他、２００８年）。 Id protein and cancer Id1 protein has been reported to be associated with a wide variety of signaling and regulatory elements involved in cancer development and progression (Fong et al., 2004). A particularly interesting link has been presented between Id1 and cancer metastasis. Id1 has been reported to be associated in a mechanism with metastatic changes in human breast cancer (Minn et al., 2005). Overexpression of Id1 has been reported to contribute to metastasis in breast cancer cells transplanted into animals (Fong et al., 2003). In another study, overexpression of Id-1 has been reported to immortalize myeloid progenitor cells in mice, resulting in myeloproliferative disease (Suh et al., 2008).

Ｉｄ１は、膀胱（Ｐｅｒｋ他、２００６年）、***（例えば、Ｓｃｈｏｐｐｍａｎｎ他、２００３年）、子宮頸部／子宮（Ｌｉ他、２００９年；Ｓｃｈｉｎｄｌ、他、２００１年；Ｍａｗ他、２００８年）、結腸（Ｚｈａｏ他、２００８年）、子宮内膜（Ｔａｋａｉ他、２００４年）、胃（Ｈａｎ他、２００４年；Ｉｗａｔｓｕｋｉ他、２００９年）、膠細胞（Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅ他、２００２年）、肝臓（Ｍａｔｓｕｄａ他、２００５年）、卵巣（Ｓｃｈｉｎｄｌ他、２００３年及びＭａｗ他、２００９年）、前立腺（Ｆｏｒｏｏｔａｎ他、２００７年；Ｙｕ他、２００９年；Ｃｏｐｐｅ他、２００４年；Ｏｕｙａｎｇ他、２００２年ａ）、腎臓（Ｌｉ他、２００７年）、扁平上皮細胞癌頭頚部（ＳＣＣＨＮ）（Ｋａｍａｌｉａｎ他、２００８年）、甲状腺（Ｋｅｂｅｂｅｗ他、２００４年；Ｃｉａｒｒｏｃｃｈｉ他、２０１０年）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ他、２０１０年）の固形腫瘍、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Ｔａｎｇ他、２００９年）などの液体腫瘍を含む多数の癌で高度に発現される。事実上全ての癌の種類で、Ｉｄ１の過発現は、悪性表現型及び不良な臨床結果に関連すると報告されている。しかし、Ｉｄタンパク質が、癌及び他の増殖性疾患並びに細胞病原事象に関与する複雑な発生系で相互作用して悪影響をなす機序及び経路に関する根本的な疑問は残っている。   Id1 is bladder (Perk et al., 2006), breast (eg, Schppmmann et al., 2003), cervix / uterus (Li et al., 2009; Schindl, et al., 2001; Maw et al., 2008), colon (Zhao et al., 2008), endometrium (Takai et al., 2004), stomach (Han et al., 2004; Iwatuki et al., 2009), glial cells (Vandeptute et al., 2002), liver (Matsuda et al., 2005) Year), ovary (Schindl et al., 2003 and Maw et al., 2009), prostate (Forotan et al., 2007; Yu et al., 2009; Coppe et al., 2004; Ouyang et al., 2002a), kidney (Li et al.) 2007), squamous cell carcinoma head and neck (SCCHN) (Kamalian et al., 2 2008), thyroid (Kebebew et al., 2004; Cialrocchi et al., 2010) and non-small cell lung cancer (NSCLC) (Bhattacharya et al., 2010) solid tumors and acute myeloid leukemia (AML) (Tang et al., 2009) Highly expressed in many cancers, including liquid tumors. In virtually all cancer types, Id1 overexpression has been reported to be associated with a malignant phenotype and poor clinical outcome. However, fundamental questions remain about the mechanisms and pathways by which Id proteins interact and adversely affect complex developmental systems involved in cancer and other proliferative diseases and cytopathogenic events.

下記の追加の観察及び報告が、哺乳動物対象における癌、癌転移、及び病原性血管新生の発生におけるＩｄ１の発現、機能及び生態の新たな理解に寄与しているが、理解は不完全である。   The following additional observations and reports contribute to a new understanding of Id1 expression, function and biology in the development of cancer, cancer metastasis, and pathogenic angiogenesis in mammalian subjects, but the understanding is incomplete .

●Ｉｄ発現及び機能に関与する複雑な要因 Ｉｄ１遺伝子の発現は、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）（ＬｅＰａｇｅ他、２００９年）、ＢＭＰ−６（Ｄａｒｂｙ他、２００８年）、成長／分化因子−５（ＧＤＦ５）（Ｃｈｅｎ他、２００６年）、及びインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）（Ｐｒｉｓｃｏ他、２００１年；Ｂｅｌｌｅｔｔｉ他、２００２年）を含む成長因子によって刺激されると報告されている。血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）は、Ｉｄ１の上流の遺伝子誘導因子（Ｂｅｎｅｚｒａ他、２００１年）及び下流のメディエーター（Ｌｅｅ他、２００６年；Ｌｉｎ他、２００５年）の両方であると報告されている。ＳＭＡＤタンパク質は、転写因子として機能する他のＳＭＡＤと複合体を形成することによって形質転換成長因子ベータリガンドの活性を調節すると提示されている（Ｌｉａｎｇ他、２００９年）。初期増殖応答タンパク質１（Ｅｇｒｌ）（Ｓｕｂｂａｒａｍａｉａｈ他、２００８年）、有機体の初期発生における遺伝子の発現に関与するヒト転写因子のＳｐ／ＫＬＦ（特異性タンパク質／クルッペル様因子）ファミリの構成員であるＳｐ１（Ｊｏｒｇａ他、２００７）、及び活性化転写因子−３（ＡＴＦ３）（Ｌｉ他、２００９年）は、プロモータ活性に肯定的な影響を与えると報告されており、一方で腫瘍抑制因子ＡＴＦ５は、Ｉｄ１遺伝子の発現を抑制すると報告されている（Ｇｈｏ他、２００８年）。また、成長因子活性の癌原遺伝子チロシンタンパク質キナーゼメディエーターであるＳｒｃは、Ｉｄ１の発現調節において役割を果たすことが報告されている（Ｇａｕｔｓｃｈｉ他、２００８年）。同様に、白血性表現型を回復させると報告されている転写因子であるフォークヘッドボックスＯ−３ａ（ＦＯＸ０３ａ）は、Ｉｄ１の転写下方制御により分化を促進することができる（Ｂｉｒｋｅｎｋａｍｐ他、２００７年）。Ｉｄ１遺伝子の下方制御はまた、胃癌での非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の抗癌活性についての機序として提示されている（Ｊａｎｇ他、２００６年）。ＮＳＡＩＤセレコキシブによってもたらされる乳癌細胞での炎症性プロスタグランジンＰＧＥ２の減少もまた、減少したＩｄ１濃度と関係がある（Ｓｕｂｂａｒａｍａｉａｈ他、２００８年）。 ● Complex factors involved in Id expression and function Expression of the Id1 gene is expressed in bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) (LePage et al., 2009), BMP-6 (Darby et al., 2008), growth / differentiation factor Reported to be stimulated by growth factors including -5 (GDF5) (Chen et al., 2006) and insulin-like growth factor-1 (IGF-1) (Prisco et al., 2001; Belletti et al., 2002) Yes. Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) is reported to be both a gene inducer upstream of Id1 (Benezra et al., 2001) and a downstream mediator (Lee et al., 2006; Lin et al., 2005). Has been. SMAD proteins have been proposed to modulate the activity of transforming growth factor beta ligands by forming complexes with other SMADs that function as transcription factors (Liang et al., 2009). Early Growth Response Protein 1 (Egrl) (Subbaramaiah et al., 2008), a member of the Sp / KLF (specific protein / Kruppel-like factor) family of human transcription factors involved in gene expression during early development of organisms Sp1 (Jorga et al., 2007) and activated transcription factor-3 (ATF3) (Li et al., 2009) have been reported to positively affect promoter activity, whereas the tumor suppressor ATF5 is It has been reported to suppress the expression of the Id1 gene (Gho et al., 2008). In addition, Src, a proto-oncogene tyrosine protein kinase mediator of growth factor activity, has been reported to play a role in the regulation of Id1 expression (Gautsch et al., 2008). Similarly, forkhead box O-3a (FOX03a), a transcription factor reported to restore the leukemic phenotype, can promote differentiation through transcriptional downregulation of Id1 (Birkenkamp et al., 2007). . Downregulation of the Id1 gene has also been proposed as a mechanism for the anticancer activity of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in gastric cancer (Jang et al., 2006). The decrease in inflammatory prostaglandin PGE2 in breast cancer cells caused by NSAID celecoxib is also associated with decreased Id1 concentration (Subbaramaiah et al., 2008).

●下流のＩｄ標的の複雑性 Ｉｄ１はまた、様々な下流の発癌チロシンキナーゼ（Ｔａｍ他、２００８年）、例えばＢｃｒ−Ａｂｌ、Ｔｅｌ−ＡＢＬ（慢性骨髄性白血病に関連する異常な融合タンパク質）、ＴＦＬ−ＰＤＧ−ＦβＲ（好酸球増多に関連する骨髄性腫瘍の患者で発見されるハイブリッド融合タンパク質）、ＦＬＴ３（ＶＥＧＦに対する受容体の１つに関連するチロシンキナーゼ１）−１ＴＤなどを標的とすると提示されている。Ｉｄ１は、発癌ラットのＲＡＳ（マイトジェンによって活性化されたタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路におけるＧＴＰａｓｅ）と協働し、細胞老化反応を妨害し、転移性乳癌を誘発すると想定される（Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ他、２００８年）。Ｉｄ１は癌細胞の増殖、生存及び浸潤（Ｌｉ他、２００７年）に重要なホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／タンパク質キナーゼＢ（Ａｋｔ）／核因子カッパベータ（ＮＦｋＢ）の信号伝達経路を刺激すると報告されている。Ｉｄ１は、ｐ１６の発現を抑制することができ、これは細胞老化を積極的に調節する（Ｚｈｅｎｇ他、２００４年；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ他、２００８年）。Ｉｄ１はまた、ｐ５３及びＮＦｋＢを通じてＢ細胞リンパ腫細胞−２（Ｂｃｌ−２）及びＢＣＬ−２関連Ｘタンパク質（Ｂａｘ）を調節することができ（Ｋｉｍ他、２００８年）、癌細胞の生存を高めるために、有糸***の間に後期促進複合体−Ｃ（ＡＰＣ／Ｃ）を通じて染色体不安定性を調節することができる（Ｗａｎｇ他、２００８年）。さらに、Ｉｄ１は、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）の阻害を通じて、Ａｋｔで媒介されたウイングレス型（Ｗｎｔ）信号伝達及びｐ２７リン酸化を活性化すると提示されている（Ｌｅｅ他、２００９年）。 Downstream Id Target Complexity Id1 also has various downstream oncogenic tyrosine kinases (Tam et al., 2008) such as Bcr-Abl, Tel-ABL (abnormal fusion protein associated with chronic myelogenous leukemia), TFL -Targeting PDG-FβR (a hybrid fusion protein found in patients with myeloid tumors associated with eosinophilia), FLT3 (tyrosine kinase 1 associated with one of the receptors for VEGF) -1TD, etc. Presented. Id1 is presumed to cooperate with RAS (GTPase in the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway) in carcinogenic rats to interfere with cellular senescence and induce metastatic breast cancer (Swarbrick et al., 2008). ). Id1 stimulates phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) / protein kinase B (Akt) / nuclear factor kappa beta (NFkB) signaling pathways important for cancer cell growth, survival and invasion (Li et al., 2007) It has been reported. Id1 can suppress p16 expression, which positively regulates cellular senescence (Zheng et al., 2004; Cummings et al., 2008). Id1 can also regulate B cell lymphoma cell-2 (Bcl-2) and BCL-2 related X protein (Bax) through p53 and NFkB (Kim et al., 2008) to enhance cancer cell survival. In addition, chromosomal instability can be regulated through anaphase-promoting complex-C (APC / C) during mitosis (Wang et al., 2008). Furthermore, Id1 has been proposed to activate Akt-mediated wingless (Wnt) signaling and p27 phosphorylation through inhibition of the phosphatase tensin homolog (PTEN) (Lee et al., 2009).

Ｉｄタンパク質及び転移
現在の知識は、癌転移におけるＩｄタンパク質及び他の調節因子の役割を実際に十分に理解するにはあまりにも不十分である。転移性疾患は、ヒトでの癌関連死の９０％を占める。転移の複雑性及び難治性の性質は、癌の罹患率及び死亡率を減少させる新たな方法及び手段開発の最大の障害を示す。転移は、多段階の多因子過程であり、２つの主要な段階（１）「原発」部位（即ち、癌が生じた最初の組織／臓器）からの癌細胞の物理的播種、及び（２）原発部位から離れた組織／器官への癌細胞による定着（Ｃｈａｆｆｅｒ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ、２０１１年）を有するものとして大まかに記載される。数多くの研究は、第１段階が脱分化又は発生の再活性化を伴い、決められた細胞を一般的に「上皮間葉転換」（ＥＭＴ）と呼ばれるより柔軟な運命に切り換えることを示している。ＥＭＴ転換は、原発性癌細胞に、高度の浸潤性の表現型に関連するより大きな転移潜在力を付与する（Ｔｈｉｅｒｙ他、２００９年）。 Id protein and metastasis Current knowledge is too inadequate to actually fully understand the role of Id protein and other regulators in cancer metastasis. Metastatic disease accounts for 90% of cancer-related deaths in humans. The complexity and refractory nature of metastasis represents the greatest obstacle to developing new methods and means to reduce cancer morbidity and mortality. Metastasis is a multi-stage, multifactorial process, with two major stages (1) physical dissemination of cancer cells from the “primary” site (ie, the first tissue / organ where the cancer occurred), and (2) Roughly described as having cancer cell colonization (Chaffer and Weinberg, 2011) in tissues / organs away from the primary site. Numerous studies have shown that the first stage involves dedifferentiation or reactivation of development, switching selected cells to a more flexible fate commonly referred to as “epithelial-mesenchymal transition” (EMT). . EMT conversion confers greater metastatic potential to primary cancer cells associated with a highly invasive phenotype (Thiery et al., 2009).

ＥＭＴの過程の間に、不変の上皮細胞はその上皮特性を失い、新たな腫瘍を播種するために他の位置（二次腫瘍部位）に移動する能力及び性向と結びついている間葉特性を獲得する。報告によると、ＥＭＴした癌細胞は、癌幹細胞（ＴＩＣ）と重要特性を共有する（Ｍａｎｉ他、２００８年）（新たな腫瘍を播種し、原発性腫瘍の不均一性を回復するその能力により機能的に定義される）（Ｖａｌｅｎｔ他、２０１２年）。ＥＭＴ誘導転写因子、例えばツイスト関連タンパク質１（Ｔｗｉｓｔ１、又はクラスＡｂＨＬＨタンパク質３８）の過発現による乳癌のＴＩＣの発生は、ＥＭＴによって引き起こされる転移性播種及びＴＩＣの発生の分子連鎖を提示する（Ｍａｎｉ他、２００８年；Ｍｏｒｅｌ他、２００８年）。しかし、転移の第２段階（離れた組織器官の定着）の間のＴＩＣの仕組みについてはあまり知られていない。ＥＭＴが乳癌のＴＩＣを誘導するという提示は、ほとんどの転移が分化した上皮形態を示すという臨床的観察に基づいて正当性を疑われた（Ｔａｒｉｎ他、２００５年）。これはＥＭＴが一時的な過程であり、「間葉上皮転換」（ＭＥＴ）による癌細胞の再分化が。少なくとも一部の癌において転移定着での原動力であるということを示すことができる（Ｂｒａｂｌｅｔｚ、２０１２年）。   During the EMT process, invariant epithelial cells lose their epithelial properties and acquire mesenchymal properties coupled with the ability and propensity to move to other locations (secondary tumor sites) to seed new tumors To do. Reports show that EMT cancer cells share important properties with cancer stem cells (TIC) (Mani et al., 2008) (functioning by their ability to seed new tumors and restore primary tumor heterogeneity) (Valent et al., 2012). Development of breast cancer TIC by overexpression of EMT-induced transcription factors such as twist-related protein 1 (Twist1, or class AbHLH protein 38) presents a molecular linkage of EMT-induced metastasis and TIC development (Mani et al. 2008; Morel et al., 2008). However, little is known about the mechanism of TIC during the second phase of metastasis (distant tissue organ consolidation). The suggestion that EMT induces breast cancer TIC was suspected based on clinical observation that most metastases exhibit differentiated epithelial morphology (Tariin et al., 2005). This is a temporary process of EMT, and the redifferentiation of cancer cells by “mesenchymal epithelial transition” (MET). It can be shown to be the driving force in metastasis in at least some cancers (Brabletz, 2012).

ＥＭＴが癌細胞の播種（局所実質の浸潤を含む（Ｙｏｏｋ他、２００６年）に影響を与え得る一方で、循環系への血管内侵入（Ｄｒａｋｅ他、２００９年）、移動の間の生存（Ｇａｌ他、２００８年）、及び二次部位への溢出（Ｌａｂｅｌｌｅ他、２０１１年；Ｖｕｏｒｉｌｕｏｔｏ他、２０１１年）、間葉表現型の喪失が、微小転移コロニーの形成を促進し得る。これは、ＥＭＴに関連する成長停止の反転と関係し得る（Ｂｒａｂｌｅｔｚ他、２００１年；Ｍｅｊｌｖａｎｇ他、２００７年；Ｖｅｇａ他、２００４年）。乳癌転移におけるＭＥＴの重要性は、播種後に、ＥＭＴ転写因子Ｔｗｉｓｔ１の人工的喪失（Ｔｓａｉ他、２０１２年）及びＥＭＴ転写因子「亜鉛フィンガーＥ−ｂｏｘ結合ホームボックス」（Ｚｅｂ）を阻害するマイクロＲＮＡの発現（Ｋｏｒｐａｌ他、２０１１年）が転移性乳癌細胞によって肺の定着を高めることを示す研究により提示されている。さらに、転写因子「ペアード関連ホームボックス１」（Ｐｒｒｘｌ）（これは、播種の間にＥＭＴを誘導するが、肺の定着に必要な幹細胞特性は抑制する）が、定着の前に必ず失われなければならない（この場合、ＴＩＣ表現型からのＥＭＴの分離）（Ｏｃａｎａ他、２０１２年）。転移コロニーを作るために必須のＴＩＣ特性は維持しつつ、コロニーを作る癌細胞が播種に必要な癌細胞の間葉表現型を捨てる方法の詳細は、不明なままである。   While EMT can affect cancer cell seeding (including local parenchymal invasion (Yok et al., 2006), vascular invasion into the circulatory system (Drake et al., 2009), survival during migration (Gal Et al., 2008), and extravasation to secondary sites (Labelle et al., 2011; Vuoriluoto et al., 2011), loss of the mesenchymal phenotype can promote the formation of micrometastatic colonies, which in EMT (Brabletz et al., 2001; Mejlwang et al., 2007; Vega et al., 2004) The importance of MET in breast cancer metastasis may be related to artificial loss of EMT transcription factor Twist1 after seeding (Tsai et al., 2012) and the EMT transcription factor “Zinc Finger E-box Binding Home Box” (Zeb) Studies have shown that expression of roRNA (Korpal et al., 2011) enhances lung colonization by metastatic breast cancer cells.In addition, the transcription factor “Paired Related Home Box 1” (Prrxl) (which EMT is induced during seeding but suppresses stem cell properties necessary for lung colonization but must be lost prior to colonization (in this case, separation of EMT from TIC phenotype) (Ocana et al. Details of how the colony-forming cancer cells abandon the mesenchymal phenotype of the cancer cells necessary for seeding remain unclear while maintaining the essential TIC properties for making metastatic colonies.

前述したことを考慮すると、Ｉｄタンパク質が相互作用して、癌及び他の増殖性疾患（例えば腫瘍関連血管新生）において悪影響をなす機序及び経路に関して、多くの重要な疑問が残っている。従って、哺乳動物対象において癌を治療するための新たな手段及び方法を提供するためにこれらの薬剤及び過程が活用される前に、克服されなければならない多くの障害及び難関がある。哺乳動物対象における転移癌を評価、管理及び治療する手段及び方法のための更なる必要性が、満たされないまま残っている。   In view of the foregoing, many important questions remain regarding the mechanisms and pathways through which Id proteins interact and adversely affect cancer and other proliferative diseases (eg, tumor-associated angiogenesis). Thus, there are many obstacles and challenges that must be overcome before these agents and processes can be utilized to provide new means and methods for treating cancer in mammalian subjects. There remains an unmet need for means and methods for assessing, managing and treating metastatic cancer in mammalian subjects.

本発明は、新生物又は他の細胞増殖性疾患を患っている哺乳動物対象においてＩｄ機能を調節する新たな手段及び方法を提供することによって、前述した必要性を満たし、更なる目的及び利点も満たす。なお、本発明は、癌及び転移に介在するＩｄタンパク質の役割及び作用並びにその生化学的及び分子標的を解明する新たな技術的発見を更に提供し、ヒト及び他の哺乳動物における癌及び転移並びに他の増殖性疾患の管理及び治療のための手段及び方法を提供する。   The present invention fulfills the aforementioned needs by providing new means and methods for modulating Id function in a mammalian subject suffering from a neoplasm or other cell proliferative disorder, with additional objects and advantages. Fulfill. The present invention further provides a new technical discovery to elucidate the role and action of the Id protein that mediates cancer and metastasis, and its biochemical and molecular targets. Means and methods for the management and treatment of other proliferative diseases are provided.

例示の態様では、本発明は、細胞増殖性疾患を治療するための、例えば、腫瘍又は原発性癌細胞の転移を抑制若しくは減少させるための組成物及び方法を提供する。これらの方法は、哺乳動物対象に、対象における病原性細胞の増殖、血管新生、癌、及び／又は転移性疾患を軽減又は予防するのに十分な有効量の「抗Ｉｄ化合物」を投与することを含む。例示の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、下記の化学式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶの例示の抗Ｉｄ化合物、又はその活性塩、鏡像異性体、多形体、溶媒和物、水和物、若しくはプロドラッグを使用する。   In exemplary aspects, the present invention provides compositions and methods for treating cell proliferative disorders, eg, inhibiting or reducing metastasis of tumors or primary cancer cells. These methods involve administering to a mammalian subject an effective amount of an “anti-Id compound” sufficient to reduce or prevent the growth of pathogenic cells, angiogenesis, cancer, and / or metastatic disease in the subject. including. In an exemplary embodiment, the compositions and methods of the present invention include an exemplary anti-Id compound of formula I, II, III, or IV, or an active salt, enantiomer, polymorph, solvate, water, Use Japanese or prodrugs.

本発明の特定の実施形態では、本願における方法及び組成物は、抗転移（又は抗増殖若しくは抗血管新生）に有効な量のラセミＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（「ＡＧＸ５１」）を含有する例示の抗Ｉｄ化合物又は組成物を用いる。異なる実施形態では、抗Ｉｄ化合物は、単離された、抗転移に活性であるＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドの（−）−鏡像異性体である。ＡＧＸ５１の（−）又は「マイナス」の鏡像異性体は、（＋）又は「プラス」の鏡像異性体に比べて、抗Ｉｄ効力の顕著かつ予想できない優位性をを示す。これに基づき、鏡像異性体が濃縮された、（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体の新たな製剤（（＋）−ＡＧＸ５１鏡像異性体の量又は濃度に比べて、増加された量又は濃度の（−）−ＡＧＸ５１を提供するように実質的に精製された（従来調製されているラセミＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドと比較して））が、本発明の組成物及び方法での驚くべき利点及び臨床的有益性を提供する。   In certain embodiments of the invention, the methods and compositions herein include an amount of racemic N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxole) effective for anti-metastasis (or anti-proliferation or anti-angiogenesis). An exemplary anti-Id compound or composition containing -5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide ("AGX51") is used. In a different embodiment, the anti-Id compound is isolated, anti-metastatic active N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) ) Propyl) -N-benzylpropionamide (-)-enantiomer. The (−) or “minus” enantiomer of AGX51 exhibits a significant and unpredictable superiority of anti-Id potency compared to the (+) or “plus” enantiomer. Based on this, a new formulation of (−)-AGX51 enantiomer enriched in enantiomers (increased in an amount or concentration (−) compared to the amount or concentration of (+)-AGX51 enantiomer. Substantially purified to provide -AGX51 (racemic N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl as previously prepared) ))) Compared to propyl) -N-benzylpropionamide)) provide surprising advantages and clinical benefits in the compositions and methods of the present invention.

特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物対象における転移性疾患を治療又は予防するのに有効な「抗転移」組成物及び治療方法を提供する。これらの方法は、単一療法又は協調的若しくは組み合わせ療法を使用することができる。本発明の化合物及び方法は、「抗転移に効果的」であり、例えば癌を呈した対象で転移の発生率、大きさ、組織若しくは臓器の分布、又は数を減らす。特定の実施形態では、抗転移活性は、転移の１つ以上の組織病理学的指標で観察される減少、例えば、二次組織又は解剖学的部位で観察される原発性腫瘍の特徴の転移細胞又は「巣」の発生、大きさ、数又は分布における量の減少に相当する。他の態様では、抗転移効果は、転移癌の予防及び／又は治療により証明され、例えば、本発明の抗Ｉｄ治療を受けた対象についての無病生存期間の増加によって立証される。   In certain embodiments, the present invention provides “anti-metastatic” compositions and methods of treatment effective for treating or preventing metastatic disease in mammalian subjects. These methods can use monotherapy or cooperative or combination therapy. The compounds and methods of the present invention are “effective in anti-metastasis” and, for example, reduce the incidence, size, tissue or organ distribution, or number of metastases in subjects who present with cancer. In certain embodiments, the anti-metastatic activity is a decrease observed in one or more histopathological indicators of metastasis, eg, metastatic cells characteristic of a primary tumor observed in a secondary tissue or anatomical site Or it corresponds to a decrease in the amount in the occurrence, size, number or distribution of “nests”. In other embodiments, the anti-metastatic effect is evidenced by prevention and / or treatment of metastatic cancer, eg, evidenced by an increase in disease-free survival for subjects who have received anti-Id treatment of the present invention.

本発明の他の組成物及び方法は、異常な血管成長又は「病原性血管新生」を特徴とする異なる細胞増殖性疾患を標的とする。これらの疾患標的の例には、異常な血管成長（例えば、黄斑変性）及び腫瘍関連血管新生によってもたらされる眼球疾患が含まれる。本発明の抗Ｉｄ化合物は、「抗血管新生」剤としても機能し、下記に記載されるように、これらがかなり強く腫瘍と関連する血管新生を含む病原性血管新生を治療又は予防する（二次腫瘍発生及び成長に関する多方面、抗転移及び抗血管新生攻撃をもたらす）のに役立つ。   Other compositions and methods of the invention target different cell proliferative diseases characterized by abnormal blood vessel growth or “pathogenic angiogenesis”. Examples of these disease targets include ocular diseases caused by abnormal blood vessel growth (eg, macular degeneration) and tumor-associated angiogenesis. The anti-Id compounds of the present invention also function as “anti-angiogenic” agents, as described below, to treat or prevent pathogenic angiogenesis, including angiogenesis that is fairly strongly associated with tumors (2 It leads to multiple aspects of secondary tumor development and growth, resulting in anti-metastatic and anti-angiogenic attacks).

本発明の追加の態様では、血液又は組織中のＩｄタンパク質（特にＩｄ１及び／又はＩｄ３）を測定する新たな診断検査が、転移性疾患の発生及び進行を監視するため、及び／又は抗Ｉｄ治療の有効性を評価するための有用な診断手段を提供するために示される。   In an additional aspect of the invention, a new diagnostic test that measures Id proteins (particularly Id1 and / or Id3) in blood or tissue is used to monitor the development and progression of metastatic disease and / or anti-Id therapy. It is shown to provide a useful diagnostic tool for assessing the effectiveness of.

さらに詳細な実施形態では、本発明の組成物及び方法は、二次治療薬、治療法又は治療方法と、キット若しくは製剤において組み合わされるか、又は協調的に投与される有効量の抗Ｉｄ化合物を使用することができる。例示の実施形態では、対象は、例えば放射線、化学療法、手術、又はこれらの組み合わせから選択される二次治療法又は薬剤と同時に又は連続して、抗Ｉｄ化合物で治療される。   In a more detailed embodiment, the compositions and methods of the present invention comprise an effective amount of an anti-Id compound that is combined with or co-administered in a kit or formulation with a second therapeutic agent, therapy or treatment method. Can be used. In an exemplary embodiment, the subject is treated with an anti-Id compound concurrently or sequentially with a second-line treatment or agent selected from, for example, radiation, chemotherapy, surgery, or a combination thereof.

本特許出願はカラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許出願の写しは、出願時及び必要な費用の支払時に提供される。
Ｉｄ１及びＩｄ３の濃度が、例示の抗Ｉｄ化合物、Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（ＡＧＸ５１）を用いた処理後の白血病細胞で大きく減少することを示すウェスタンブロットゲルを提供する。精製された（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体は、（＋）−ＡＧＸ５１鏡像異性体に比べて驚くべき立体特異的効果を示す。 Ｉｄ１及びＩｄ３の濃度が、ＡＧＸ５１を用いた処理後に乳癌細胞で可変的に影響されることを示し、本発明の抗Ｉｄ化合物の更なる驚くべき立体特異的効果を明らかにするウェスタンブロットゲルを提供する。 ＡＧＸ５１での処理に続く、ＭＭＬ−ＡＦ９融合タンパク質を過発現するマウスから誘導された白血病細胞株におけるｐ１６濃度の回復を示す免疫ブロットである。 ＡＧＸ５１での処理に続く、ヒト膀胱癌細胞株におけるｐ２１濃度の回復を示すウェスタンブロットである。 ＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞における細胞周期制御の回復に対するラセミ−ＡＧＸ５１、（＋）−ＡＧＸ５１（「Ｅｌ」）及び（−）−ＡＧＸ５１（「Ｅ２」）の効果をグラフで比較する。ＡＧＸ５１の（−）−鏡像異性体は、細胞周期制御の回復に対して顕著な立体特異性効果を示し、一方でＡＧＸ５１の（＋）−鏡像異性体は、驚くべきことに検出可能な効果を全くもたらさない。 本発明の例示の抗Ｉｄ化合物、ＡＧＸ５１の、移動依存の転移性疾患可能性のモデルにおける強力な抗移動効果を図示する。この細胞運動性「スクラッチ」アッセイは、ＡＧＸ５１が癌細胞の移動に関与する転移活性の強力な阻害剤であることを示す。 Ｃ５７／ＢＬマウスの脇腹に移植されたＶＥＧＦ−１６５及びＦＧＦ−２処理されたマトリゲルプラグにおいて血管の形成を減少させる、ＡＧＸ５１の強い抗血管新生効果を示す図である。 ヌードマウス（ｎ＝８／治療グループ）で行われた異種移植研究からのデータを提供する図である。ヌードマウスは、ＭＤＡ２３１ヒト***の腫瘍が移植され、移植後１４日目に、ビヒクル（ＤＭＳＯ）又は１日当り５０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１で５日間、そして８日目及び２２日目からは７．５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルで静脈注射処理された。箱ひげ図は、移植後５３日目（研究最終日）の腫瘍体積である。 対照（Ａ）及びＡＧＸ５１の低較正（Ｂ）のイオンクロマトグラムを提供する。 ＡＧＸ５１が速やかに吸収されることを示す血漿濃度データの対数線形プロットであり、Ｃ_maxはここで１５分と推定される。 ６０ｍｇ／ｋｇ、１日２回のＡＧＸ５１投与に続く血漿濃度のシミュレーションである。 Ｃ５７／ＢＬマウスに移植されたルイス肺癌（ＬＬＣ）腫瘍（移植後１４日目に摘出）の肺転移を直接的に減少させる、ＡＧＸ５１の強力な抗転移効果を証明する研究の計画及び結果を示す。ヒトにおける癌薬効を予測するためのこの広く許容されたモデルで、ＡＧＸ５１は移植された癌細胞の転移において、これまでにない減少を提供する。 尾静脈を通じてＢａｌｂ／ｃマウスに直接注射された乳癌（４Ｔ１）細胞の肺転移に対するＡＧＸ５１の効果をグラフで示す。ＡＧＸ５１は、注射された乳癌細胞の転移を大きく減少させる。 尾静脈を通じての乳癌（４Ｔ１）細胞の直接的な注射後のＢａｌｂ／ｃマウスにおける肺転移のＡＧＸ５１抑制の生物発光可視化を示す。ＡＧＸ５１の（−）−鏡像異性体は、ヒトにおける癌薬効を予測する生体モデル対象での転移に対して、強力に立体特異的に保護する。 パクリタキセル及びＡＧＸ５１の組み合わせが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍が移植されたマウスにおいて、最小の用量であっても腫瘍の成長を著しく減少させたことを示すグラフである。 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を移植してパクリタキセル及び可変量のＡＧＸ５１で処理したマウスでの１９日目の最終−当初腫瘍の体積における変化を示す図である。 ６０ｍｇ／ｋｇ、１日２回投与のＡＧＸ５１が、腫瘍成長の減少に対するパクリタキセルの効果を著しく増加させたことを示すグラフである。 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を移植してパクリタキセル及びＡＧＸ５１で処理したマウスでの４１日目の最終−当初腫瘍の体積における変化を示す図である。 パクリタキセルでの治療へのＡＧＸ５１の追加が、腫瘍成長の減少に対するパクリタキセルの効果を著しく増加させたことを示すグラフである。 パクリタキセル及びＡＧＸ５１で処理したＩｄ１ノックアウトマウスでの腫瘍の成長を示すグラフである。 パクリタキセル及びＡＧＸ５１で処理したＩｄ１ノックアウトマウスでの２０日目の平均腫瘍体積を示す図である。 パクリタキセル及び／又はＡＧＸ５１で処理したマウスにおける選択された化学的及び血液学的値の比較を示す図である。 マウスモデルにおける病原性網膜血管新生に対するＩｄ３遺伝子ノックアウトの効果を示すグラフである。 硝子体内に（ｉｖｔ）投与された（−）−ＡＧＸ５１が、ヒト加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のネズミ科モデルにおいて病原性網膜血管新生から保護することを示すグラフである。 腹腔内に（ｉｐ）投与された（−）−ＡＧＸ５１が、ヒトＡＭＤのネズミ科モデルで病原性網膜血管新生から保護することを示すグラフである。 本発明の再帰的診断−治療方法の実施において使用する生体試料でのＩｄタンパク質濃度／活性の検出のための変更されたサンドウィッチ免疫測定法の概略図である。 癌を予測及び管理するための本発明のＩｄ診断手段及び方法の使用を示すグラフである。 ヒト対象における乳癌の予測及び管理のための本発明のＩｄ診断手段及び方法の使用を示すグラフである。 本発明の鏡像異性体の分離方法Ａを用いてのＡＧＸ５１（＋）−及び（−）−鏡像異性体の溶出プロファイルのグラフである。 本発明の鏡像異性体の分離方法Ｂを用いてのＡＧＸ５１（＋）−及び（−）−鏡像異性体の溶出プロファイルのグラフである。 This patent application contains at least one drawing executed in color. Copies of this patent application with color drawings will be provided at the time of filing and upon payment of the necessary costs.
Concentrations of Id1 and Id3 may be increased to an exemplary anti-Id compound, N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropion Provided is a Western blot gel showing significant reduction in leukemic cells after treatment with amide (AGX51). The purified (−)-AGX51 enantiomer shows a surprising stereospecific effect compared to the (+)-AGX51 enantiomer. Provides a Western blot gel that demonstrates that the concentration of Id1 and Id3 is variably affected in breast cancer cells after treatment with AGX51, revealing further surprising stereospecific effects of the anti-Id compounds of the invention To do. FIG. 5 is an immunoblot showing recovery of p16 concentration in a leukemia cell line derived from a mouse overexpressing the MML-AF9 fusion protein following treatment with AGX51. FIG. 5 is a Western blot showing recovery of p21 concentration in human bladder cancer cell lines following treatment with AGX51. The effects of racemic-AGX51, (+)-AGX51 (“E1”) and (−)-AGX51 (“E2”) on restoration of cell cycle control in DU-145 human prostate cancer cells are compared graphically. The (−)-enantiomer of AGX51 exhibits a significant stereospecific effect on the restoration of cell cycle control, while the (+)-enantiomer of AGX51 surprisingly has a detectable effect. Will not bring at all. Figure 2 illustrates the potent anti-migration effect of an exemplary anti-Id compound of the invention, AGX51, in a model of migration-dependent metastatic disease potential. This cell motility “scratch” assay indicates that AGX51 is a potent inhibitor of metastatic activity involved in cancer cell migration. FIG. 6 shows the strong anti-angiogenic effect of AGX51, which reduces blood vessel formation in VEGF-165 and FGF-2 treated Matrigel plugs implanted in the flank of C57 / BL mice. FIG. 4 provides data from a xenograft study performed on nude mice (n = 8 / treatment group). Nude mice were transplanted with MDA231 human breast tumors, 14 days after transplantation with vehicle (DMSO) or 50 mg / kg AGX51 per day for 5 days, and 7.5 mg / kg from days 8 and 22. Treated intravenously with kg paclitaxel. The boxplot is the tumor volume 53 days after transplantation (the last day of the study). Provide ion chromatograms for control (A) and low calibration (B) of AGX51. FIG. 3 is a log-linear plot of plasma concentration data showing that AGX51 is rapidly absorbed, with C _max estimated here at 15 minutes. It is a simulation of plasma concentration following AGX51 administration twice a day at 60 mg / kg. Shows the design and results of a study demonstrating the potent antimetastatic effect of AGX51, which directly reduces lung metastasis of Lewis lung cancer (LLC) tumors transplanted in C57 / BL mice (extracted 14 days after transplantation) . In this widely accepted model for predicting cancer drug efficacy in humans, AGX51 provides an unprecedented reduction in the metastasis of transplanted cancer cells. The graph shows the effect of AGX51 on lung metastasis of breast cancer (4T1) cells injected directly into Balb / c mice through the tail vein. AGX51 greatly reduces metastasis of injected breast cancer cells. FIG. 6 shows bioluminescence visualization of AGX51 inhibition of lung metastasis in Balb / c mice after direct injection of breast cancer (4T1) cells through the tail vein. The (−)-enantiomer of AGX51 potently and stereospecifically protects against metastasis in biological model subjects that predict cancer drug efficacy in humans. FIG. 5 is a graph showing that the combination of paclitaxel and AGX51 significantly reduced tumor growth even in the lowest dose in mice transplanted with MDA-MB-231 tumor. FIG. 9 shows changes in the volume of final-initial tumors on day 19 in mice transplanted with MDA-MB-231 tumor and treated with paclitaxel and variable amounts of AGX51. FIG. 6 is a graph showing that AGX51 administered at 60 mg / kg twice daily significantly increased the effect of paclitaxel on reducing tumor growth. FIG. 11 shows changes in the volume of the final-initial tumor on day 41 in mice treated with paclitaxel and AGX51 after transplantation of MDA-MB-231 tumor. FIG. 4 is a graph showing that the addition of AGX51 to treatment with paclitaxel significantly increased the effect of paclitaxel on reducing tumor growth. FIG. 5 is a graph showing tumor growth in Id1 knockout mice treated with paclitaxel and AGX51. FIG. 6 shows the mean tumor volume on day 20 in Id1 knockout mice treated with paclitaxel and AGX51. FIG. 5 shows a comparison of selected chemical and hematological values in mice treated with paclitaxel and / or AGX51. It is a graph which shows the effect of Id3 gene knockout with respect to pathogenic retinal neovascularization in a mouse model. FIG. 6 is a graph showing that (−)-AGX51 administered intravitreally (ivt) protects against pathogenic retinal neovascularization in a murine model of human age-related macular degeneration (AMD). FIG. 6 is a graph showing that (−)-AGX51 administered intraperitoneally (ip) protects against pathogenic retinal neovascularization in a murine model of human AMD. 1 is a schematic diagram of a modified sandwich immunoassay for detection of Id protein concentration / activity in a biological sample used in the implementation of the recursive diagnostic-therapeutic method of the present invention. 2 is a graph showing the use of the Id diagnostic means and methods of the present invention for predicting and managing cancer. 2 is a graph showing the use of Id diagnostic means and methods of the present invention for the prediction and management of breast cancer in human subjects. It is a graph of the elution profile of AGX51 (+)-and (-)-enantiomer using the separation method A of the enantiomer of the present invention. It is a graph of the elution profile of AGX51 (+)-and (-)-enantiomer using the separation method B of the enantiomer of the present invention.

本発明を詳細に説明する前に、本発明に関連して使用される様々な用語を定義する。これらの用語に加え、他のものは必要に応じて明細書の他の部分で定義される。本願で明確に定義されなければ、本明細書で使用される技術用語はその業界で認識される意味を有する。また、下記用語は特に明示されなければ、下記の意味を有する。   Before describing the present invention in detail, various terms used in connection with the present invention will be defined. In addition to these terms, others are defined elsewhere in the specification as appropriate. Unless otherwise defined herein, technical terms used herein have meanings recognized in the industry. Further, the following terms have the following meanings unless otherwise specified.

転移は、１つの臓器又はその一部から他の１つの隣接しない臓器又はその一部への癌の播種を指す。転移（複数形）は、転移により発生する二次部位における新たな癌の発生である。   Metastasis refers to the dissemination of cancer from one organ or part thereof to another non-adjacent organ or part thereof. Metastasis (plurality) is the development of new cancers at secondary sites arising from metastasis.

用語「化学療法」薬又は剤は、通常は承認された抗癌剤及び他の抗過剰増殖剤又は化学薬剤を指す。「化学療法」は、一般的に、細胞及び組織、通常は癌細胞及び代わりに又は併せて、病態の一部として新しく形成され、過剰増殖性疾患、通常は新生物又は癌を示す血管の細胞を破壊する、薬剤又は化学的活性に適用される。本発明での補助的使用のための化学療法剤には、限定ではないが、（１）チューブリン脱重合剤、例えばパクリタキセル、ドセタキセル、ＢＡＹ５９−８８６２アルブミンの結合されたパクリタキセルなどのタキサン、（２）ＤＮＡ損傷剤及びＤＮＡ合成を抑制する薬剤、（３）代謝拮抗物質、（４）抗血管新生剤及び血管破壊剤、（５）抗体、（６）内分泌療法、（７）免疫調節剤、（８）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、（９）信号伝達阻害剤、（１０）熱衝撃タンパク質の阻害剤、（１１）レチノイド、例えばオールトランスレチノイン酸、（１２）成長因子受容体又は成長因子自体の阻害剤、（１３）抗有糸***化合物、（１４）抗炎症剤、例えばＣＯＸ阻害剤、及び（１５）細胞周期調節剤、例えばチェックポイント調節剤及びテロメラーゼ阻害剤が含まれる。   The term “chemotherapeutic” drug or agent refers to normally approved anti-cancer agents and other anti-hyperproliferative or chemical agents. “Chemotherapy” generally refers to cells and tissues, usually cancer cells and, alternatively or in combination, newly formed cells as part of a disease state and cells of blood vessels that exhibit hyperproliferative disease, usually neoplasm or cancer Applied to drugs or chemical activities that destroy Chemotherapeutic agents for adjunct use in the present invention include, but are not limited to: (1) Tubulin depolymerizers such as paclitaxel, docetaxel, taxanes such as paclitaxel to which BAY59-8862 albumin is bound, (2 ) A DNA damaging agent and an agent that suppresses DNA synthesis, (3) an antimetabolite, (4) an anti-angiogenic and vascular disrupting agent, (5) an antibody, (6) endocrine therapy, (7) an immunomodulator, 8) Histone deacetylase inhibitors, (9) Signal transduction inhibitors, (10) Heat shock protein inhibitors, (11) Retinoids such as all-trans retinoic acid, (12) Growth factor receptor or growth factor itself Inhibitors of (13) antimitotic compounds, (14) anti-inflammatory agents such as COX inhibitors, and (15) cell cycle regulators such as checkpoint regulators and Romeraze inhibitors are included.

用語「併用療法」は、示された治療効果の達成のために２種類以上の異なる療法の提供を含む治療計画を指す。例えば、併用療法は２種類以上の化学的に異なる活性成分、例えば、抗Ｉｄ化合物及び化学療法剤の投与を含むことがある。あるいは、併用療法は、抗Ｉｄ治療及び／又は１つ以上の化学療法剤の投与を単独で又は他の治療の実施、例えば放射線療法及び／又は手術と共に含むことがある。二つ以上の化学的に異なる活性成分の投与のとの関連で、活性成分は同一の組成物の一部として又は異なる組成物として投与され得ると理解される。別の組成物として投与される場合、異なる活性成分を含有する組成物は、同一又は異なる投与方法を用いて同一又は異なる経路により同一又は異なる時期に投与されることができ、その全ては特定の状況に応じ、担当主治医により決定される。同様に、１つ以上の抗Ｉｄ治療が単独で、又は組み合わされる１つ以上の化学療法、例えば放射線及び／又は手術と併用して適用される場合、薬剤は手術又は放射線治療の前又は後に与えられることができる。「単一療法」は、単一投与で又は時間を掛けての複数回投与で投与される、１つの治療効果のある化合物の送達に基づく治療計画を指す。   The term “combination therapy” refers to a treatment plan that includes providing two or more different therapies to achieve the indicated therapeutic effect. For example, a combination therapy may include administration of two or more chemically different active ingredients, such as an anti-Id compound and a chemotherapeutic agent. Alternatively, combination therapy may include anti-Id treatment and / or administration of one or more chemotherapeutic agents alone or in conjunction with other treatment delivery, eg, radiation therapy and / or surgery. In the context of administration of two or more chemically different active ingredients, it is understood that the active ingredients can be administered as part of the same composition or as different compositions. When administered as separate compositions, compositions containing different active ingredients can be administered at the same or different times by the same or different routes using the same or different methods of administration, all of which are specific It will be decided by the attending physician depending on the situation. Similarly, if one or more anti-Id treatments are applied alone or in combination with one or more combined chemotherapy, such as radiation and / or surgery, the drug is given before or after surgery or radiation therapy. Can be done. “Monotherapy” refers to a treatment regimen based on the delivery of a single therapeutic compound administered in a single dose or in multiple doses over time.

「新生組織形成」は、異常かつ制御されない細胞の成長を指す。「新生物」又は腫瘍は、細胞の成長の異常な、制御されない、無秩序な増殖であり、時に癌と呼ばれる。新生物は、陽性又は悪性であり得る。新生物は、破壊的な成長、侵襲性、及び転移の特性を有する場合、悪性又は癌性である。侵襲性は、周辺組織の浸潤又は破壊による新生物の局所的広がりを指し、通常は組織の境界を定める基底層への浸透を含む（それによって、多くの場合身体の循環系に入る）。転移は、典型的には、多くの場合にリンパ又は血管を通じた、腫瘍細胞の離れた部位への播種を指す。転移はまた、腫瘍細胞の漿膜腔若しくはくも膜下又は他の空間を通じた隣接した部位への移動を指す。転移の過程を通じて、身体の他の区画、組織及び領域への腫瘍細胞の移動及び播種は、最初の癌が現れた「原発」部位から遠く離れた領域で「二次」新生物を定着させる。   “Neoplasia” refers to abnormal and uncontrolled cell growth. A “neoplasm” or tumor is an abnormal, uncontrolled, disordered proliferation of cell growth, sometimes referred to as cancer. Neoplasms can be positive or malignant. A neoplasm is malignant or cancerous if it has destructive growth, invasiveness, and metastatic properties. Invasive refers to the local spread of the neoplasm due to infiltration or destruction of surrounding tissue and usually involves penetration into the basal layer that delimits the tissue (and thereby often enters the body's circulatory system). Metastasis typically refers to dissemination of tumor cells to distant sites, often through lymph or blood vessels. Metastasis also refers to the migration of tumor cells to adjacent sites through the serosal or subarachnoid or other spaces. Through the process of metastasis, the migration and dissemination of tumor cells to other compartments, tissues and areas of the body establishes “secondary” neoplasms in areas far from the “primary” site where the first cancer appeared.

「対象」又は「患者」は、本発明の方法又は組成物によって影響を受け得る、治療が必要な動物を指す。本発明の抗Ｉｄ化合物及び方法を用いる治療に適している対象及び患者には、癌、転移性疾患、若しくは病原性血管新生を含むいずれかの増殖疾患を示す、又はそれらの発生リスクの高い脊髄動物、特に哺乳動物、例えばウシ、イヌ科、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、及び霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類を含む）、哺乳動物が含まれる。用語の治療又は療法「システム」は、本願で用いられた通り、複数の治療薬又は治療法、例えば抗Ｉｄ活性剤、化学療法、及び可能であれば毒性還元剤を使用する、組み合わされた製剤又はプロトコルを指し、協調的治療計画で使用される（単独で又は共に剤形化され、同時に又は順次投与される）。治療システムは、薬剤（例えば、抗Ｉｄ及び／又は従来の化学療法）治療を、別の治療介入又は治療法、例えば放射線療法又は手術と共に組み合せることもできる。本発明の抗Ｉｄ製剤及び方法を使用する任意の治療システムは、相補的手段又は方法、例えば化学療法剤、放射線療法、手術、遺伝子療法、ＤＮＡワクチン及び療法、ｓｉＲＮＡ療法、抗血管新生療法、免疫療法、骨髄移植、アプタマー並びに他の生物製剤、例えば抗体及び抗体変異体、受容体デコイ及び他のタンパク質ベースの治療剤を含むいずれかの組み合わせ「治療計画」に組み込まれることができる。   A “subject” or “patient” refers to an animal in need of treatment that can be affected by the methods or compositions of the invention. Subjects and patients suitable for treatment with the anti-Id compounds and methods of the present invention include any proliferative disease, including cancer, metastatic disease, or pathogenic angiogenesis, or a high risk of developing them Animals, particularly mammals such as cattle, canines, horses, cats, sheep, pigs, and primates (including human and non-human primates), mammals are included. The term treatment or therapy “system” as used herein refers to a combined formulation that uses multiple therapeutic agents or therapies, such as anti-Id active agents, chemotherapy, and possibly toxic reducing agents. Or refers to a protocol and used in a coordinated treatment regimen (dosed alone or together and administered simultaneously or sequentially). The treatment system can also combine drug (eg, anti-Id and / or conventional chemotherapy) treatment with another therapeutic intervention or treatment, eg, radiation therapy or surgery. Any therapeutic system that uses the anti-Id formulations and methods of the present invention can include complementary means or methods such as chemotherapeutic agents, radiation therapy, surgery, gene therapy, DNA vaccines and therapies, siRNA therapy, anti-angiogenic therapy, immunization. It can be incorporated into any combination “treatment plan” including therapy, bone marrow transplantation, aptamers and other biologics such as antibodies and antibody variants, receptor decoys and other protein-based therapeutics.

用語「治療」又は「治療すること」は、疾患又は障害に対する予防又は保護（即ち、臨床症状が発生しないようにすること）、疾患又は障害の抑制（即ち、臨床症状発生の停止若しくは抑制、及び／又は疾患若しくは障害の軽減（即ち、臨床症状を退行させること）を含む疾患又は障害のいずれかの治療を意味する。本発明の方法又は組成物は、多くの場合に、疾患の１つ以上の症状を防ぐこと、又は疾患の発症若しくは反復／再発を遅らせること（「予防」）、及び疾患の進行（例えば、増大した疾患症状の重症度、又はより進行した疾患症状の発症によって示される）を遅らせ、抑制し又は予防するために用いられる。   The term “treatment” or “treating” refers to prevention or protection against a disease or disorder (ie, preventing clinical symptoms from occurring), suppression of a disease or disorder (ie, stopping or suppressing the occurrence of clinical symptoms, and Means treatment of any disease or disorder, including alleviation of the disease or disorder (ie, regression of clinical symptoms) The method or composition of the invention often involves one or more of the diseases Preventing the symptoms of the disease, or delaying the onset or repetition / relapse of the disease (“prevention”), and the progression of the disease (eg, indicated by increased severity of the disease symptoms, or the onset of more advanced disease symptoms) Used to delay, suppress or prevent.

本発明の新たな方法又は組成物は、驚くべき発見過程から生じている。刺激された可変的な転移潜在力のある細胞株の間での遺伝子発現データの初期比較は、特定の候補遺伝子が転移性疾患カスケードの異なるステップの間に必要であることを報告する（Ｋａｎｇ他、２００３年ｂ；Ｍｉｎｎ他、２００５年；Ｙａｎｇ他、２００４年）。これらの報告の一部は、Ｉｄ１及びＩｄ３遺伝子の生成物を含むＩｄタンパク質の発現が、乳癌細胞の肺の定着に関わることを提示した（Ｇｕｐｔａ他、２００７年）。Ｉｄタンパク質は、以前から塩基性へリックス−ループ−へリックス（ｂＨＬＨ）転写因子の優れた陰性調節因子として報告されている（Ｐｅｒｋ他、２００５年）。   The new method or composition of the present invention results from a surprising discovery process. Initial comparison of gene expression data among stimulated variable metastatic potential cell lines reports that specific candidate genes are required during different steps of the metastatic disease cascade (Kang et al. 2003b; Minn et al., 2005; Yang et al., 2004). Some of these reports have shown that expression of Id proteins, including products of the Id1 and Id3 genes, is involved in lung colonization of breast cancer cells (Gupta et al., 2007). Id protein has long been reported as an excellent negative regulator of the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor (Perk et al., 2005).

Ｉｄタンパク質は、更に、胚性幹細胞の自己再生維持に重要な役割を果たし（Ｒｏｍｅｒｏ−Ｌａｎｍａｎ他、Ｙｉｎｇ他、２００３年）、成体組織幹細胞（Ｎａｍ及びＢｅｎｅｚｒａ、２００９年）及び造血幹細胞（Ｊａｎｋｏｖｉｃ他、２００７年）でこの機能を維持すると報告されている。   Id proteins also play an important role in maintaining self-renewal of embryonic stem cells (Romero-Lanman et al., Ying et al., 2003), adult tissue stem cells (Nam and Benezra, 2009) and hematopoietic stem cells (Jankovic et al., 2007) is reported to maintain this function.

Ｉｄ遺伝子はまた、特定の癌、例えば神経膠芽腫（Ａｎｉｄｏ他、２０１０年；Ｂａｒｒｅｔｔ他、２０１２年）及び結腸癌（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ他、２０１２年）においてＴＩＣ表現型の調節因子として関与している。ヒト乳癌で、Ｉｄ１は、より進行性のトリプルネガティブ［エストロゲン受容体、プロゲステロンに対して陰性、及びｎｅｕ型ヒト表皮成長因子−２（ＨＥＲ２）に対し陰性］及び異形成のサブタイプで、不良な臨床結果と関連する高いＩｄ１の発現と共に、主に発現される（Ｇｕｐｔａ他、２００７年）。   The Id gene is also implicated as a regulator of the TIC phenotype in certain cancers such as glioblastoma (Anido et al., 2010; Barrett et al., 2012) and colon cancer (O'Brien et al., 2012). Yes. In human breast cancer, Id1 is a poorer, more progressive triple negative [negative for estrogen receptor, progesterone and negative for neu human epidermal growth factor-2 (HER2)] and dysplasia. It is mainly expressed with high Id1 expression associated with clinical outcome (Gupta et al., 2007).

本発明は、Ｉｄ１及びＩｄ３の抑制剤を含むＩｄタンパク質の新たな抑制剤を使用することによって、癌及び転移の促進でのＩｄ機能を標的とする。これらの化合物は、本願で「抗Ｉｄ」化合物と称し、本発明の付随する方法は、合わせて「抗Ｉｄ」方法と称する。本発明の抗Ｉｄ化合物は、細胞集団、生理的区画、腫瘍、又は個体に対する直接適用又は注射により、通常は「抗Ｉｄ有効量」で存在する。これらの化合物及び方法は、本発明の異なる態様及び実施形態について本願に記載された通り「抗癌」、「抗転移」、「抗増殖」、及び／又は「抗血管新生」の有効活性を示す。   The present invention targets Id function in promoting cancer and metastasis by using new inhibitors of the Id protein, including inhibitors of Id1 and Id3. These compounds are referred to herein as “anti-Id” compounds, and the accompanying methods of the present invention are collectively referred to as “anti-Id” methods. The anti-Id compounds of the present invention are usually present in an “anti-Id effective amount” by direct application or injection to a cell population, physiological compartment, tumor, or individual. These compounds and methods exhibit effective activity of “anti-cancer”, “anti-metastasis”, “anti-proliferation”, and / or “anti-angiogenesis” as described herein for different aspects and embodiments of the present invention. .

例示の態様では、本発明は、細胞増殖性疾患を治療するための、例えば腫瘍又は原発性癌細胞の転移を抑制又は減少するための組成物及び方法を提供する。これらの方法は、哺乳動物対象に対して、その対象における病原性細胞の増殖、血管新生、癌、及び／又は転移性疾患の軽減又は予防に十分な有効量の「抗Ｉｄ化合物」を投与することを含む。例示の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、下記化学式Ｉの例示の抗Ｉｄ化合物を使用する。

式中、Ｒ₁は、アルキル、アルケニル、アルカノイル、アルキニル、アリール、アロイル、アラルキル、アルキルアミノ、アリールオキシ、水素、カルボキシル、ニトロ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオール、シクロアルケニルシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アラルキル、アミノ酸、ペプチド、染料、フルオロフォア、炭水化物又はポリペプチドからなる群から選択される置換若しくは非置換の低級炭化水素であり得る。Ｒ₂及びＲ₃は、独立して、まとめて、又は活性抗Ｉｄ（アトポーシス誘導、細胞増殖抑制、化学療法促進、転写調節、抗炎症性、細胞分化促進、細胞性形質転換調節）組成物をもたらすいずれかの組み合わせにおいて、水素、ヒドロキシル、スルフヒドリル、フッ素、メチル、エチル、プロピル、ベンジル、２−ブロモビニルアミノ、ヒドロキシメチル、メトキシ、ハロゲン、擬ハロゲン、シアノ、カルボキシル、ニトロ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオール、アルコキシカルボニルなどの１〜２０個の炭素を含む置換若しくは非置換の低級炭化水素、アルキルオキシカルボニルアミノ、アミノ、アミノ酸、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、アラルキル、アリールオキシ、カルボキシル、シクロアルケニル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アミノ酸、ペプチド、染料、フルオロフォア、炭水化物又はポリペプチドであり得る。Ｒ₄及びＲ₅は、独立して、まとめて、又は活性抗Ｉｄ（アトポーシス誘導、細胞増殖抑制、化学療法促進、転写調節、抗炎症性、細胞分化促進、細胞性形質転換調節）組成物をもたらすいずれかの組み合わせにおいて、アシル、又はアルキル、アルケニル、アルカノイル、アリール、アロイル、アラルキル若しくはアルキルアミノからなる群から選択される置換若しくは非置換の低級炭化水素であり得る。Ｒ₆は、酸素、硫黄、窒素などのヘテロ原子であり得る。Ｒ₇は、硫黄、窒素又は酸素などのヘテロ原子、あるいは炭素であり得る。Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀、Ｒ₁₁及びＲ₁₂は、独立して、まとめて、又は活性抗Ｉｄ（アトポーシス誘導、細胞増殖抑制、化学療法促進、転写調節、抗炎症性、細胞分化促進、細胞性形質転換調節）組成物をもたらすいずれかの組み合わせにおいて、水素、ヒドロキシル、スルフヒドリル、フッ素、メチル、エチル、プロピル、ベンジル、２−ブロモビニルアミノ、ヒドロキシメチル、メトキシ、ハロゲン、擬ハロゲン、シアノ及び１〜２０個の炭素を含む置換若しくは非置換の低級炭化水素から選択され得る。 In exemplary aspects, the present invention provides compositions and methods for treating cell proliferative disorders, eg, suppressing or reducing metastasis of tumors or primary cancer cells. These methods administer to a mammalian subject an effective amount of an “anti-Id compound” sufficient to reduce or prevent pathogenic cell proliferation, angiogenesis, cancer, and / or metastatic disease in the subject. Including that. In an exemplary embodiment, the compositions and methods of the invention use an exemplary anti-Id compound of formula I below.

Wherein R ₁ is alkyl, alkenyl, alkanoyl, alkynyl, aryl, aroyl, aralkyl, alkylamino, aryloxy, hydrogen, carboxyl, nitro, thioalkoxy, thioaryloxy, thiol, cycloalkenylcycloalkyl, heterocycloalkyl , Heteroaryl, aralkyl, amino acid, peptide, dye, fluorophore, carbohydrate, or a substituted or unsubstituted lower hydrocarbon selected from the group consisting of polypeptides. R ₂ and R ₃ are independently, collectively, or active anti-Id (atoposis induction, cell growth suppression, chemotherapy promotion, transcriptional regulation, anti-inflammatory, cell differentiation promotion, cellular transformation regulation) composition In any resulting combination, hydrogen, hydroxyl, sulfhydryl, fluorine, methyl, ethyl, propyl, benzyl, 2-bromovinylamino, hydroxymethyl, methoxy, halogen, pseudohalogen, cyano, carboxyl, nitro, thioalkoxy, thioaryl Substituted or unsubstituted lower hydrocarbons containing 1-20 carbons such as oxy, thiol, alkoxycarbonyl, alkyloxycarbonylamino, amino, amino acid, aminocarbonyl, aminocarbonyloxy, aralkyl, aryloxy, carboxyl, cycloalkenyl , Archi It can be a cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, amino acid, peptide, dye, fluorophore, carbohydrate or polypeptide. R ₄ and R ₅ are independently, collectively, or active anti-Id (atoposis induction, cell growth suppression, chemotherapy promotion, transcriptional regulation, anti-inflammatory, cell differentiation promotion, cellular transformation regulation) In any resulting combination, it can be acyl or a substituted or unsubstituted lower hydrocarbon selected from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkanoyl, aryl, aroyl, aralkyl or alkylamino. R ₆ can be a heteroatom such as oxygen, sulfur, nitrogen. R ₇ can be a heteroatom such as sulfur, nitrogen or oxygen, or carbon. R ₈ , R ₉ , R ₁₀ , R ₁₁ and R ₁₂ can be independently, collectively or active anti-Id (inducing apoptosis, cell proliferation suppression, chemotherapy promotion, transcriptional regulation, anti-inflammatory, cell differentiation promotion, In any combination that results in a composition that regulates cellular transformation), hydrogen, hydroxyl, sulfhydryl, fluorine, methyl, ethyl, propyl, benzyl, 2-bromovinylamino, hydroxymethyl, methoxy, halogen, pseudohalogen, cyano and It may be selected from substituted or unsubstituted lower hydrocarbons containing 1-20 carbons.

１個を超えるＲ基が存在する場合、Ｒ基は、同一である又は異なるようにして、いずれかの言及された基が選択されることができる。更なる実施形態では、２個以上のＲ基は共に結合されることができる。一部の実施形態では、Ｒ₂及びＲ₃は、環外での５又６員環構造の構成員であり得る。他の実施形態では、Ｒ₃及びＲ₄は、環外での５又６員環構造の構成員であり得る。更なる実施形態では、Ｒ₅及びＲ₆は、環外での５又６員環構造の構成員であり得る。更なる実施形態では、Ｒ₁₁及びＲ₁₂は、環外での５又６員環構造の構成員であり得る。一部の実施形態では、Ｒ₇が窒素であれば、Ｒ₆及びＲ₇は環外での５又６員環構造の構成員であり得る。他の実施形態では、Ｒ₆及びＲ₁₂は、環外での５又６員環構造の構成員であり得る。 If more than one R group is present, any of the mentioned groups can be selected such that the R groups are the same or different. In further embodiments, two or more R groups can be joined together. In some embodiments, R ₂ and R ₃ can be members of an exocyclic 5- or 6-membered ring structure. In other embodiments, R ₃ and R ₄ can be members of an exocyclic 5- or 6-membered ring structure. In a further embodiment, R ₅ and R ₆ can be members of an extra-annular 5- or 6-membered ring structure. In a further embodiment, R ₁₁ and R ₁₂ can be members of an extra-annular 5- or 6-membered ring structure. In some embodiments, if R ₇ is nitrogen, then R ₆ and R ₇ can be members of an exocyclic 5- or 6-membered ring structure. In other embodiments, R ₆ and R ₁₂ can be members of an exocyclic 5- or 6-membered ring structure.

より詳細な実施形態では、合理的に設計された化学式１の抗Ｉｄ化合物は、更なる候補から選択されることができ、式中、Ｒ₁、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀は、水素、ヒドロキシル、スルフヒドリル、ベンジル、２−ブロモビニルアミノ、ヒドロキシメチル、メトキシ、ハロゲン、擬ハロゲン、シアノ、カルボキシル、ニトロ、チオアルコキシ、チオアリール、チオール、１〜２０個の炭素を含む置換若しくは非置換の炭化水素、アルコキシカルボニル、アルキルオキシカルボニルアミノ、アミノ、アミノ酸、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、アリールオキシ、カルボキシル、シクロアルケニル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のアラルキル、ペプチジル、染料、フルオロフォア、炭水化物又はポリペプチドから独立して選択される。Ｒ₈及びＲ₉は、化学式Ｉに示されたオルト方向に加え、パラ配置も有し得る。Ｒ₇は、水素、ヒドロキシル、メトキシ、アジド、ニトリル、スルフヒドリル、ハロゲン、ベンゾイル、置換されたベンゾイル又は１〜２０個の炭素を含む置換若しくは非置換の炭化水素で置換されたヒドロキシル、主鎖が１〜２０個の炭素原子であるアルカノイル、ＣＦ₃（ＣＨ₂）_nＣＯ（式中、ｎ＝１〜１０）、ＣＨ₃（ＣＦ₂）_nＣ＝０（式中、ｎ＝１〜１０）、ＣＦ₃（ＣＦ₂）_n（式中、ｎ＝０〜３）、アリール、アルコキシ、ハロゲン、又はニトロ、アリールオキシ、アリールオキシのエステル、アダマントイル、置換されたアダマントイル又は１〜２０個の炭素のアロイルから独立して選択される。Ｒ₁₁がプロピオニルであれば、Ｒ₇はメトキシになり得ず、一方でＲ₇及びＲ₆は、化学式Ｉに示された通りオルトであるか又は互いにパラであり得る。Ｒ₁₁は、独立して水素、プロピオニル、ピボイル、ベンゾイル、置換されたベンゾイル、主鎖が１〜２０個の炭素原子であるアルカノイル、ＣＦ₃（ＣＨ₂）_nＣ＝Ｏ（式中、ｎ＝１〜１０）、ＣＨ₃（ＣＦ₂）_nＣ＝０（式中、ｎ＝１〜１０）又はＣＦ₃（ＣＦ₂）_n（式中、ｎ＝０〜３）であり、Ｒ₇がメトキシであれば、Ｒ₁₁はプロピオニルとなり得ない。Ｒ₁₂は、独立して水素、ハロゲン、²Ｈ、ＣＨ₃（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝０〜５）、ＣＦ₃（ＣＨ₂）_nＣ＝０（式中、ｎ＝１〜５）、ＣＨ₃（ＣＦ₂）_nＣ＝０（式中、ｎ＝１〜５）又はＣＦ₃（ＣＦ₂）_n（式中、ｎ＝０〜５）である。 In a more detailed embodiment, rationally designed anti-Id compounds of Formula 1 can be selected from further candidates, wherein R ₁ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₈ , R ₉ and R ₁₀ are hydrogen, hydroxyl, sulfhydryl, benzyl, 2-bromovinylamino, hydroxymethyl, methoxy, halogen, pseudohalogen, cyano, carboxyl, nitro, thioalkoxy, thioaryl, thiol, 1 to 20 carbons Substituted or unsubstituted hydrocarbons, including alkoxycarbonyl, alkyloxycarbonylamino, amino, amino acid, aminocarbonyl, aminocarbonyloxy, aryloxy, carboxyl, cycloalkenyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted Heterocycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, Substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted aralkyl, peptidyl, dyes, fluorophores, are independently selected from carbohydrates or polypeptides. R ₈ and R ₉ may have a para configuration in addition to the ortho direction shown in Formula I. R ₇ is hydrogen, hydroxyl, methoxy, azide, nitrile, sulfhydryl, halogen, benzoyl, substituted benzoyl or hydroxyl substituted with a substituted or unsubstituted hydrocarbon containing 1 to 20 carbons, backbone 1 Alkanoyl which is ˜20 carbon atoms, CF ₃ (CH ₂ ) _n CO (where n = 1 to 10), CH ₃ (CF ₂ ) _n C = 0 (where n = 1 to 10), CF ₃ (CF ₂ ) _n , where n = 0-3, aryl, alkoxy, halogen, or nitro, aryloxy, aryloxy esters, adamantyl, substituted adamantyl, or 1-20 carbons Selected independently from aroyl. If R ₁₁ is propionyl, R ₇ cannot be methoxy, while R ₇ and R ₆ can be ortho as shown in Formula I or para to each other. R ₁₁ is independently hydrogen, propionyl, pivoyl, benzoyl, substituted benzoyl, alkanoyl whose main chain is 1 to 20 carbon atoms, CF ₃ (CH ₂ ) _n C═O (where n = 1-10), CH ₃ (CF ₂ ) _n C = 0 (where n = 1 to 10) or CF ₃ (CF ₂ ) _n (where n = 0 to 3), and R ₇ is methoxy Then R ₁₁ cannot be propionyl. R ₁₂ is independently hydrogen, halogen, ² H, CH ₃ (CH ₂ ) _n (where n = 0 to 5), CF ₃ (CH ₂ ) _n C = 0 (where n = 1 to 5), CH ₃ (CF ₂ ) _n C = 0 (where n = 1 to 5) or CF ₃ (CF ₂ ) _n (where n = 0 to 5).

本発明のこれらの及び他の態様に関する追加の説明は、例えば、２０１２年３月２０日に発行された米国特許番号８，１３８，３５６、及び２０１４年７月２５日に出願された米国特許出願番号１４／３４１，７５６に見つけられることができ、あらゆる目的のためにその全体が参照によって本願に援用される。   Additional descriptions regarding these and other aspects of the present invention can be found in, for example, U.S. Patent No. 8,138,356 issued on March 20, 2012, and U.S. Patent Application filed on July 25, 2014. No. 14 / 341,756, which is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes.

例示の実施形態では、化学式Ｉから選択される抗Ｉｄ化合物は、下記化学式ＩＩに示されたようなＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（あるいは、「ＡＧＸ５１」）である。ＡＧＸ５１を含む様々な化学式Ｉの化合物には、その化合物の薬学的に許容可能な活性塩、並びにその化合物の活性鏡像異性体、多形体、代謝産物、溶媒和物、水和物、及びプロドラッグが含まれることが、本願における教示から理解される。

In an exemplary embodiment, the anti-Id compound selected from Formula I is N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3-, as shown in Formula II below. (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide (or “AGX51”). Various compounds of formula I, including AGX51, include pharmaceutically acceptable active salts of the compounds, and active enantiomers, polymorphs, metabolites, solvates, hydrates, and prodrugs of the compounds Is understood from the teachings herein.

Ｉｄタンパク質を阻害する新たな驚くべき有効な方法及び組成物は、下記化学式ＩＩＩの化合物及びその活性塩、鏡像異性体、多形体、代謝産物、溶媒和物、水和物、及びプロドラッグを更に含み得る。

式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₈、Ｒ₉、及びＲ₁₀は、独立して、まとめて、又は活性抗Ｉｄ化合物を提供するいずれかの組み合わせで、水素、ヒドロキシル、スルフヒドリル、フッ素、メチル、エチル、プロピル、ベンジル、２−ブロモビニルアミノ、ヒドロキシメチル、メトキシ、ハロゲン、擬ハロゲン、シアノ、カルボキシル、ニトロ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオール、１〜２０個の炭素を含む置換若しくは非置換の低級炭化水素；アルコキシカルボニル、アルキルオキシカルボニルアミノ、アミノ、アミノ酸、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、アラルキル、アリールオキシ、カルボキシル、シクロアルケニル、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のアラルキル、アミノ酸、ペプチド、染料、フルオロフォア、炭水化物又はポリペプチドであり得る。Ｒ₇は、水素、ヒドロキシル、ベンゾイル、置換されたベンゾイル又は１〜２０個の炭素を含む非置換の低級炭化水素で置換されたヒドロキシルから選択されることができる。Ｒ₁₁は、ヘテロ原子、例えば酸素、硫黄又は窒素であり得る。Ｒ₁₂は、アルキル、アルケニル、アルカノイル、アルキニル、アリール、アロイル、アラルキル、アルキルアミノ、アリールオキシ、水素、カルボキシル、ニトロ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオール、シクロアルケニル、置換若しくは非置換のヘテロ原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のアラルキル、アミノ酸、ペプチド、染料、フルオロフォア、炭水化物又はポリペプチドからなる群から独立して選択される低級炭化水素であり得る。 New surprisingly effective methods and compositions for inhibiting Id proteins further include compounds of formula III below and their active salts, enantiomers, polymorphs, metabolites, solvates, hydrates, and prodrugs May be included.

Wherein R ₁ , R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₈ , R ₉ , and R ₁₀ are either independently, together or provide any active anti-Id compound. In combination, hydrogen, hydroxyl, sulfhydryl, fluorine, methyl, ethyl, propyl, benzyl, 2-bromovinylamino, hydroxymethyl, methoxy, halogen, pseudohalogen, cyano, carboxyl, nitro, thioalkoxy, thioaryloxy, thiol, Substituted or unsubstituted lower hydrocarbon containing 1-20 carbons; alkoxycarbonyl, alkyloxycarbonylamino, amino, amino acid, aminocarbonyl, aminocarbonyloxy, aralkyl, aryloxy, carboxyl, cycloalkenyl, substituted or unsubstituted Alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, Substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted aralkyl, amino acids, peptides, dyes, fluorophores, may be a carbohydrate or polypeptide. R ₇ can be selected from hydrogen, hydroxyl, benzoyl, substituted benzoyl or hydroxyl substituted with an unsubstituted lower hydrocarbon containing 1-20 carbons. R ₁₁ can be a heteroatom such as oxygen, sulfur or nitrogen. R ₁₂ is alkyl, alkenyl, alkanoyl, alkynyl, aryl, aroyl, aralkyl, alkylamino, aryloxy, hydrogen, carboxyl, nitro, thioalkoxy, thioaryloxy, thiol, cycloalkenyl, substituted or unsubstituted heteroatom, Substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted aralkyl, amino acid, peptide, It can be a lower hydrocarbon independently selected from the group consisting of dyes, fluorophores, carbohydrates or polypeptides.

化学式ＩＩＩに関して、１個を超えるＲ基が存在する場合、Ｒ基は、言及されたいずれかの基から同一であるか又は異なるようにして選択され得る。更なる実施形態では、２個以上のＲ基が共に結合され得る。一部の実施形態では、Ｒ₄は、隣接する複数の環で、５又は６員環構造の構成員となり得る。本発明に使用されるための化学式ＩＩＩの例示の化合物は、化学式ＩＶに示されたようなＮ−［３−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル］−Ｎ−ベンジルプロパンアミドである。

With respect to Formula III, when more than one R group is present, the R group can be selected from the same or different from any of the groups mentioned. In further embodiments, two or more R groups can be attached together. In some embodiments, R ₄ can be a member of a 5- or 6-membered ring structure with multiple adjacent rings. Exemplary compounds of formula III for use in the present invention are N- [3- (1,3-benzodioxol-5-yl) -3- (2-methoxy) as shown in formula IV. Phenyl) propyl] -N-benzylpropanamide.

本発明の組成物及び方法に使用するための例示の抗Ｉｄ化合物は、Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（「ＡＧＸ５１」）である。本願で使用される通り、ＡＧＸ５１は、単離又は実質的に精製された形態であるＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド、及びＡＧＸ５１の全ての機能的に同等な塩、プロドラッグ、代謝産物、誘導体、類似体、及びコンジュゲートを指す。例えば、当業者は、ＡＧＸ５１が所望のプロドラッグ形態及び生体変化産物、並びに薬剤の容易に設計及び試験される類似体、誘導体及び複合形態又はコンジュゲーション形態を含むことを理解する。   Exemplary anti-Id compounds for use in the compositions and methods of the present invention are N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl. ) -N-benzylpropionamide ("AGX51"). As used herein, AGX51 is N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxy) in isolated or substantially purified form. Phenyl) propyl) -N-benzylpropionamide and all functionally equivalent salts, prodrugs, metabolites, derivatives, analogs, and conjugates of AGX51. For example, those skilled in the art will appreciate that AGX51 includes the desired prodrug forms and biotransformation products, as well as analogs, derivatives and complex or conjugation forms that are readily designed and tested for drugs.

従って、本発明は、ＡＧＸ１５の脱メチル化の形態、例えば、Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−ヒドロキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド、脱アミド化した形態、例えば、（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−ベンジル−３−（２−メトキシフェニル）プロパン−１−アミン、又は多重改質された（例えば、脱メチル化及び脱アミド化された）形態、例えば２−（１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（ベンジルアミノ）プロピル）フェノールを使用する組成物及び方法を含む。関連した実施形態では、抗Ｉｄ化合物は、Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドの生体変化産物のラセミ体又は精製された鏡像異性体での選択された塩の形態、例えば、（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−ベンジル−３−（２−メトキシフェニル）プロパン−１−アミン又は２−（１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（ベンジルアミノ）プロピル）フェノールの塩である。本願でのこれらの及び他の抗Ｉｄ化合物の例示の塩の形態には、限定ではないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、シュウ酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩及びコハク酸塩が含まれる。   Accordingly, the present invention provides a demethylated form of AGX15, such as N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-hydroxyphenyl) propyl) -N -Benzylpropionamide, deamidated form, for example (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -N-benzyl-3- (2-methoxyphenyl) propan-1-amine Or multiple modified (eg demethylated and deamidated) forms such as 2- (1- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (benzylamino) In a related embodiment, the anti-Id compound is N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (). 2-methoxyphenyl Propyl) -N-benzylpropionamide biotransformation product in racemic or purified enantiomer forms of selected salts such as (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5- Yl) -N-benzyl-3- (2-methoxyphenyl) propan-1-amine or 2- (1- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (benzylamino) propyl ) Phenol salts Exemplary salt forms of these and other anti-Id compounds in this application include, but are not limited to, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate Sulfate, oxalate, malate, maleate and succinate.

関連した実施形態では、抗Ｉｄ化合物は、単離された、抗転移活性であるＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドの鏡像異性体である。驚くべきことに、本願での発見は、並外れた抗Ｉｄ効果がＡＧＸ５１の（−）−鏡像異性体型にあることを明示する。従って、好ましい態様において、本発明は、増加した相対量又は濃度の（−）−ＡＧＸ５１（他の（＋）−ＡＧＸ５１鏡像異性体の量又は濃度に比べて、又はＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドの従来のラセミ製剤に見られる量に比べて）を提供するために、鏡像異性体が濃縮された、実質的に精製された（−）−ＡＧＸ５１の新たな製剤を使用する。   In a related embodiment, the anti-Id compound is isolated, anti-metastatic activity N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl). ) Propyl) -N-benzylpropionamide enantiomer. Surprisingly, the discovery herein demonstrates that the extraordinary anti-Id effect is in the (−)-enantiomer form of AGX51. Thus, in a preferred embodiment, the present invention relates to increased relative amounts or concentrations of (−)-AGX51 (compared to the amount or concentration of other (+)-AGX51 enantiomers or N- (3- (benzo [ d) [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide (as compared to the amount found in conventional racemic formulations) Use a new formulation of substantially purified (−)-AGX51 enriched in isomers.

さらに詳細な態様では、本発明の方法又は組成物は、Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドの「実質的に純粋な」又は「本質的に純粋な」抗転移に有効な（−）−鏡像異性体を使用する。例示の組成物では、精製された（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体は、少なくとも初期（即ち、プレフォーミュレーション）において、少なくとも８０〜９０％、９０〜９５％、９５％以上、又は９８％以上の「鏡像異性体の濃縮」（ｅｅ）又は「鏡像異性体純度」を示す形態で提供される。本願で使用される通り、９０〜９５％ｅｅの（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体製剤は「実質的に純粋な」ものであり、９８％ｅｅ以上の製剤は「本質的に純粋な」ものである。別の態様では、本発明の方法又は組成物は、「本質的に（＋）−Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド鏡像異性体がない」（即ち、全体のＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドの５％未満、２％未満又は１％未満が（＋）−鏡像異性体の形態であり、残りが（−）−鏡像異性体のみである）として定義される、「実質的に純粋な」（−）−Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド製剤を使用する。   In a more detailed aspect, the method or composition of the invention comprises N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N—. The (substantially pure) or “essentially pure” anti-metastasis effective (−)-enantiomer of benzylpropionamide is used. In exemplary compositions, the purified (−)-AGX51 enantiomer is at least 80-90%, 90-95%, 95% or more, or 98% or more, at least initially (ie, pre-formulation). Are provided in a form exhibiting “enantiomeric enrichment” (ee) or “enantiomeric purity”. As used herein, 90-95% ee (−)-AGX51 enantiomeric formulations are “substantially pure” and those above 98% ee are “essentially pure”. is there. In another aspect, the method or composition of the present invention comprises “essentially (+)-N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxy Phenyl) propyl) -N-benzylpropionamide enantiomer "(ie, total N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) ) Propyl) -N-benzylpropionamide is defined as less than 5%, less than 2% or less than 1% is in the form of the (+)-enantiomer and the remainder is the (-)-enantiomer only) "Substantially pure" (-)-N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropion Use amide formulations.

本発明の組成物及び方法で選択されたＡＧＸ５１鏡像異性体の正体及び量は、様々な手段で明らかにされることができる。例えば、これらの測定及び値は、従来のキラルクロマトグラフィー及び／又は偏光分析法を用いて明らかにされ得る。本願で使用される通り、用語「精製された」又は「濃縮された」（−）−ＡＧＸ５１は、（＋）−ＡＧＸ５１より（又はその化合物の従来の（非キラル）ラセミ製剤に存在する（−）−ＡＧＸ５１の量より）実質的に高濃度で安定した形態の（−）−ＡＧＸ５１を含むように人工的に濃縮されたいずれかの組成物に相当することを意図される。ここで、（−）−ＡＧＸ５１は、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、おおよそ９０％まで又はそれ以上、最大９５〜９８％まで又はそれ以上の鏡像体過剰率（ｅｅ）で生じる。   The identity and amount of the AGX51 enantiomer selected in the compositions and methods of the present invention can be revealed by various means. For example, these measurements and values can be revealed using conventional chiral chromatography and / or ellipsometry. As used herein, the term “purified” or “enriched” (−)-AGX51 is present in (or in conventional (non-chiral) racemic formulations of the compound over (+)-AGX51 (− It is intended to correspond to any composition that has been artificially concentrated to contain (−)-AGX51 in a stable form at a substantially higher concentration (than the amount of))-AGX51. Wherein (−)-AGX51 is at least about 60%, 70%, 75%, 80%, up to approximately 90% or more, up to 95-98% or more in enantiomeric excess (ee) Arise.

特定の態様では、本発明の方法又は組成物は、９８％を超える鏡像体過剰率（例えば、キラルクロマトグラフィー及び／又は光学純度試験により決定）で高度に精製又は単離された（−）−ＡＧＸ５１（少なくとも剤形化、保管又は投与前の出発物質として）を使用する。８５％又は９０％を超える鏡像体過剰率の（−）−ＡＧＸ５１の製剤は、対応する（＋）−ＡＧＸ５１鏡像異性体が実質的にないと考えられ、臨床使用に大変望ましい薬物製剤である。通常は、癌治療、転移性疾患の予防若しくは治療、又は血管新生又は他の増殖性疾患の治療のための本発明の医薬組成物は、約５％ｗ／ｗ以下、そして一部の実施形態では、約２％以下、又は１％ｗ／ｗ以下の（＋）−ＡＧＸ５１鏡像異性体（即ち、組成物に存在する全体のＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドの質量又はモル含量の百分率として測定される）を含む。   In certain embodiments, the methods or compositions of the invention are highly purified or isolated with an enantiomeric excess of greater than 98% (eg, as determined by chiral chromatography and / or optical purity testing) (−) — AGX51 (at least as starting material prior to formulation, storage or administration) is used. Formulations of (−)-AGX51 with an enantiomeric excess greater than 85% or 90% are considered to be substantially free of the corresponding (+)-AGX51 enantiomer and are highly desirable drug formulations for clinical use. Typically, the pharmaceutical composition of the present invention for cancer treatment, prevention or treatment of metastatic disease, or treatment of angiogenesis or other proliferative disease is about 5% w / w or less, and some embodiments About 2% or less, or 1% w / w or less of the (+)-AGX51 enantiomer (ie, the total N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol- 5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide (measured as a percentage of the mass or molar content).

実質的に純粋な（−）−Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（（−）−ＡＧＸ５１）、又は著しく鏡像異性体の濃縮された（−）−ＡＧＸ５１組成物の使用は、ラセミＡＧＸ５１又は（＋）−ＡＧＸ５１鏡像異性体に比べ、同じ用量での減少された副作用で、癌治療、転移性疾患の予防又は治療、並びに血管新生及び他の増殖性疾患の治療のための増強された治療効果を提供する。別の実施形態では、濃縮された（−）−ＡＧＸ５１は、ラセミＡＧＸ５１又は（＋）−ＡＧＸ５１鏡像異性体に比べて、より少ないか又は低頻度の用量で、より少ない副作用での同等又はより大きい治療効果を提供する。特定の態様では、ラセミＡＧＸ５１と同しい（重量又はモル濃度において）投薬で、本発明の（−）−ＡＧＸ５１が濃縮された組成物及び方法は、本願で用いられるか又は参照した活性測定、治療的指標及び臨床検査のうち、いずれか１つ又はその組み合わせを用いて、ラセミ体（又は実質的に純粋な（＋）−ＡＧＸ５１鏡像異性体）について観察された活性又は決定された治療有効性より、少なくとも１０％、２０％、３０％、又は５０％、７５〜９５％まで、１００％又は２００％もより大きい増加した活性又は治療有効性を示す。   Substantially pure (-)-N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide ((- ) -AGX51), or the use of a highly enantiomerically enriched (-)-AGX51 composition, with reduced side effects at the same dose compared to racemic AGX51 or (+)-AGX51 enantiomers It provides enhanced therapeutic effects for treatment, prevention or treatment of metastatic disease, and treatment of angiogenesis and other proliferative diseases. In another embodiment, the enriched (−)-AGX51 is equivalent or greater with fewer or less frequent doses and with fewer side effects than the racemic AGX51 or (+)-AGX51 enantiomer. Provides a therapeutic effect. In certain embodiments, compositions and methods of the present invention wherein (-)-AGX51 is enriched in dosages (in weight or molarity) similar to racemic AGX51 are used in this application or referenced activity measurements, treatments Activity observed or determined therapeutic efficacy for racemate (or substantially pure (+)-AGX51 enantiomer) using any one or a combination of clinical indicators and laboratory tests Exhibit increased activity or therapeutic efficacy, at least 10%, 20%, 30%, or 50%, up to 75-95%, as much as 100% or 200%.

抗癌及び抗転移組成物及び方法
本願での発見及び教示によると、本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、ｂＨＬＨタンパク質に対するＩｄ結合を効果的に遮断し、機能的に重要なＩｄ分解（即ち、細胞においてＩｄ濃度を治療的に減少させる）を促進し、細胞、組織及び生体に投与した時にＩｄ活性を抑制する。次に、これらの抗Ｉｄ活性は、腫瘍転移、並びに腫瘍関連血管新生、及び他の増殖性疾患状態及び症状を効果的に抑制する。この驚くべき方法で、本発明の組成物及び方法は、ほとんどの致命的な及び難治性新生物の緩和に有効な手段を提供する。 Anti-cancer and anti-metastatic compositions and methods According to the discoveries and teachings herein, the anti-Id compositions and methods of the present invention effectively block Id binding to bHLH proteins and functionally important Id degradation (ie, Reduce therapeutic Id concentration in cells) and suppress Id activity when administered to cells, tissues and organisms. In turn, these anti-Id activities effectively suppress tumor metastasis, as well as tumor-associated angiogenesis, and other proliferative disease states and symptoms. In this surprising way, the compositions and methods of the present invention provide an effective means for alleviating most deadly and refractory neoplasms.

本発明は、数多くのアメリカ人が癌により重大な影響を受けるという観点から、非常に大きな臨床的有望性を有する。ＮＩＨの国立癌研究所は、２００３年１月において、癌の病歴を有するおおよそ１億３７００万人のアメリカ人が生存していると推測する。これらの個人のうち一部は癌がないが、残りは癌の兆候があり、治療中であり得る。２０１３年には約５８，３５０名、１日に約１，６００名のアメリカ人が癌で死亡すると予想された。米国で、癌は死亡者４名のちの１名を占める。   The present invention has enormous clinical promise in view of the large number of Americans being significantly affected by cancer. The National Cancer Institute of NIH estimates that in January 2003, approximately 137 million Americans with a history of cancer are alive. Some of these individuals have no cancer, but the rest have signs of cancer and may be under treatment. In 2013, approximately 58,350 people were estimated to die from cancer per day, about 1,600 Americans. In the United States, cancer accounts for one of four deaths.

患者は、一般的に既に深く根付いた癌を有しており、既に実存の医療問題である全身腫瘍組織量を有している。これらの患者は、手術、放射線、化学療法（任意でホルモン療法を含む）で、時に全身腫瘍組織量を減少させるためのアジュバント、生物学的療法又は標的療法と共に治療される。この最初の治療又は一連の治療が完全な成功をもたらさない場合、腫瘍は多くの場合、更なる治療に対する耐性を示し、他の場合では癌が離れた臓器に転移して、多くの場合に致命的な結果を伴う。癌による死亡では、ほぼ例外なく癌の転移が先行し、したがって癌の転移は、癌の介在に関して最も重要かつ未解決の標的である。   Patients generally have already deeply rooted cancer and already have a whole body tumor mass, which is an existing medical problem. These patients are treated with surgery, radiation, chemotherapy (optionally including hormone therapy), sometimes with adjuvants, biological therapy or targeted therapy to reduce systemic tumor tissue mass. If this initial treatment or series of treatments does not provide complete success, the tumor is often resistant to further treatment, and in other cases the cancer has spread to distant organs and is often fatal With typical results. Cancer deaths are almost always preceded by cancer metastasis, and cancer metastasis is therefore the most important and unresolved target for cancer intervention.

癌転移の抑制は、ほとんどの既存の癌薬剤が細胞増殖のみを抑制する理由もあって、至急の治療での必要性がある。転移の分子生物学は、原発性癌細胞の形質転換よりも複雑で理解するのが困難であることがわかっている。悪性細胞によって播種及び定着される分子が、異なる種類の癌の間で共有されるため、この過程を抑制する薬剤は、従来の化学療法薬よりかなり広範囲に有益である。転移性カスケードを妨害する成果を挙げる介入は、原発性腫瘍からの癌細胞の播種及び続く二次腫瘍部位の定着に不可欠な機序及び活性に焦点を合わせる。特に本願で明らかにされるように、Ｉｄタンパク質は、これらの腫瘍発生事象の強力な誘導因子であり、これは本発明の強力な抗Ｉｄ組成物及び方法により無能力化又は遮断される。本願で提供される抗Ｉｄ化合物及び治療方法は、１）癌細胞の播種の予防、及び２）既存の転移の抑制、を含む複数の相補的抗転移戦略に焦点を合わせる。   Suppression of cancer metastasis is necessary for urgent treatment because most existing cancer drugs inhibit cell growth only. The molecular biology of metastasis has proven to be more complex and difficult to understand than the transformation of primary cancer cells. Because the molecules seeded and established by malignant cells are shared between different types of cancer, drugs that inhibit this process are of far greater benefit than conventional chemotherapeutic drugs. Interventions that produce results that interfere with the metastatic cascade focus on the mechanisms and activities that are essential for the dissemination of cancer cells from the primary tumor and the subsequent establishment of secondary tumor sites. As particularly demonstrated herein, the Id protein is a potent inducer of these oncogenic events, which is disabled or blocked by the potent anti-Id compositions and methods of the present invention. The anti-Id compounds and treatment methods provided herein focus on multiple complementary anti-metastasis strategies including 1) prevention of cancer cell dissemination and 2) suppression of existing metastases.

本発明の方法又は組成物は、本願で初めて臨床的有効性の関係において記載される通り、抗Ｉｄの投与が明示されている治療用途での使用を見出した。本発明の代表的な治療用途には、癌及び有害な細胞の増殖（過多形成）を特徴とする他の疾患を含む、細胞増殖性疾患の治療を含む。   The method or composition of the present invention has found use in therapeutic applications where the administration of anti-Id has been demonstrated as described for the first time in the context of clinical efficacy in this application. Exemplary therapeutic uses of the present invention include the treatment of cell proliferative diseases, including cancer and other diseases characterized by harmful cell proliferation (hyperplasia).

本発明の抗Ｉｄ組成物及び治療方法は、獣医（例えば、イヌ、ネコ、大型動物）及びヒト患者での癌の臨床的に有効な治療を含め、哺乳動物対象における細胞増殖性疾患の軽減又は予防に有効である。   The anti-Id compositions and methods of treatment of the present invention can reduce cell proliferative disorders in mammalian subjects, including clinically effective treatment of cancer in veterinarians (eg, dogs, cats, large animals) and human patients. Effective for prevention.

一般論として、本発明の組成物及び方法の抗Ｉｄ有効性は、細胞増殖性疾患（例えば、癌、転移性疾患、腫瘍関連血管新生）の１つ以上の症状の減少と関連付けられることができる。これは、細胞増殖、血管成長、細胞移動、二次腫瘍外観又は成長、炎症、又は標的化された細胞増殖性疾患に関連するいずれかの他の症状において観察される減少に基づいて検知又は定量化されることができる。様々な検査及びモデルシステムが、本願に記載された化学式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶの抗Ｉｄ化合物の治療の有効性の説明するために容易に用いられることができる。これらの検査は広く知られており、本願で意図される対象の増殖性疾患のそれぞれに対して広く受け入れられている臨床相関を含む。この状況において、直ぐに使用するための例示の検査には、特に細胞増殖マーカー、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、循環腫瘍細胞、様々な癌／腫瘍マーカー（例えば、ＰＳＡ）、及び組織学的、組織化学、及び免疫組織化学マーカーを検出又は定量して、原発及び転移癌細胞を検出し、位置を特定し、解剖学的に地図を作成し、及び／又は定量化する検査が含まれる。前述した細胞型及び機能性（即ち、細胞関与／運命、分化状態、発達潜在性）のそれぞれに対する有用な細胞特異的マーカーは、本発明のこれらの方法又は組成物での使用に関して、当業界に広く知られている。本発明の様々な検査及び診断又は臨床実施形態で細胞をタグ化、視角化、定量及び／又は分離するための例示のマーカーは、増加した転移潜在力のマーカーを有した転移細胞（例えば、上皮性特徴の喪失、増加した移動潜在力、二次部位定着潜在力に関するマーカー）のためのビメンチン＋、Ｎ−カドヘリン＋、Ｅ−カドヘリン−；ＥＰＣのためのＬｉｎ−、ＧＦＰ＋、ＶＥ−カドヘリン＋、ＣＤ１１−；癌幹細胞（例えば、乳癌）のためのＣＤ４４（高い）、Ｃｄ２４（低い）を含む。数多くの追加のマーカー、及びマーカーの組み合わせが、様々な検査及び診断並びに臨床方法で日常的に用いられ、本願でさらに論議される抗Ｉｄ活性、機能、細胞効果及び臨床効果を識別する同様の又は追加の特異性を有する。   In general terms, the anti-Id efficacy of the compositions and methods of the present invention can be associated with a reduction in one or more symptoms of a cell proliferative disorder (eg, cancer, metastatic disease, tumor associated angiogenesis). . This is detected or quantified based on a decrease observed in cell proliferation, blood vessel growth, cell migration, secondary tumor appearance or growth, inflammation, or any other symptom associated with the targeted cell proliferative disorder Can be A variety of tests and model systems can be readily used to illustrate the therapeutic efficacy of the anti-Id compounds of formulas I, II, III and IV described herein. These tests are widely known and include clinical correlations that are widely accepted for each of the proliferative disorders of interest contemplated herein. In this context, exemplary tests for immediate use include cell proliferation markers, circulating endothelial cells, circulating endothelial progenitor cells (EPC), circulating tumor cells, various cancer / tumor markers (eg, PSA), and tissues, among others. Includes tests that detect or quantify histological, histochemical, and immunohistochemical markers, detect primary and metastatic cancer cells, locate, anatomically map, and / or quantify It is. Useful cell-specific markers for each of the aforementioned cell types and functionalities (ie, cell engagement / fate, differentiation status, developmental potential) are known in the art for use in these methods or compositions of the invention. Widely known. Exemplary markers for tagging, visualizing, quantifying and / or separating cells in various testing and diagnostic or clinical embodiments of the invention include metastatic cells (eg, epithelial cells) with increased markers of metastatic potential. Vimentin +, N-cadherin +, E-cadherin- for sexual characteristics loss, increased migration potential, secondary site colonization potential); Lin-, GFP +, VE-cadherin + for EPC, CD11-; includes CD44 (high), Cd24 (low) for cancer stem cells (eg, breast cancer). Numerous additional markers, and combinations of markers, are routinely used in a variety of tests and diagnostics and clinical methods to identify anti-Id activity, function, cellular effects and clinical effects that are further discussed herein. Has additional specificity.

特定の実施形態では、本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、新生物の発生、再発又は成長の減少に有効である。抗新生物の有効量の抗Ｉｄ化合物を投与すると、治療対対照の対象において、５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、９０％以上まで新生物の発生率、数又は成長を減少させる。   In certain embodiments, the anti-Id compositions and methods of the invention are effective in reducing neoplastic development, recurrence or growth. Administration of an anti-neoplastic effective amount of an anti-Id compound, the incidence of neoplasia up to 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 75%, 90% or more in the treated versus control subjects, number Or reduce growth.

他の実施形態では、本発明は、「抗転移」組成物及び方法を提供し、これは哺乳動物対象における腫瘍転移の発生率又は重症度を効果的に減少させる。これらの方法は、単一療法又は協調的若しくは組み合わせ療法を使用することができる。目的の組成物及び方法が「抗転移で有効な」ことは、癌があるか、又は癌の発病リスクの高い治療対対照の対象で、転移の発生率、数又は大きさでの有意な減少により実証された。特定の実施形態では、抗転移効果は、転移の組織病理学的指標のうちの１つ以上、例えば、二次組織又はは解剖学的部位で観察される原発性腫瘍の特徴の転移された細胞若しくは「巣」の発生率、大きさ、数又は分布における定量的減少と関連する。あるいは、抗Ｉｄ化合物によりもたらされる癌細胞の移動又は播種での実質的な減少があり得る。他の実施形態では、抗転移効果は、癌又は転移の有効な予防及び／又は治療と関連する１つ以上の患者の治療指標での有意な好ましい増加によって、例えば、抗Ｉｄ化合物の投与を受けていない対照の対象に比べ、抗Ｉｄ化合物の投与を受けた対象についての無病生存期間の増加によって、立証される。   In other embodiments, the present invention provides “anti-metastatic” compositions and methods that effectively reduce the incidence or severity of tumor metastasis in a mammalian subject. These methods can use monotherapy or cooperative or combination therapy. A composition and method of interest is “effective in anti-metastasis” is a significant reduction in the incidence, number, or size of metastases in a treatment versus control subject who has cancer or is at high risk of developing cancer. Proved by In certain embodiments, the anti-metastatic effect is one or more of the histopathological indicators of metastasis, eg, metastasized cells of primary tumor features observed in secondary tissues or anatomical sites. Or it is associated with a quantitative decrease in the incidence, size, number or distribution of “nests”. Alternatively, there may be a substantial decrease in cancer cell migration or seeding caused by anti-Id compounds. In other embodiments, the anti-metastatic effect is achieved by a significant favorable increase in the therapeutic index of one or more patients associated with effective prevention and / or treatment of cancer or metastasis, eg, administration of an anti-Id compound. This is evidenced by an increase in disease-free survival for subjects receiving anti-Id compounds compared to non-control subjects.

本発明の化合物、組成物及び方法の抗転移効果は、細胞増殖性疾患及び／又は新生物について治療されている患者で、実質的な治療有益及び向上した治療結果を提供する。例示の実施形態では、本発明の抗Ｉｄ方法又は組成物で治療した癌患者は、従来の癌治療（例えば、本願における組成物及び方法で治療した患者で低減され又は除かれ得る化学療法及び放射線療法）に伴う有害な副作用の増加が全くなく、多くの場合に有意な減少がある改善された治療結果を示す。   The anti-metastatic effect of the compounds, compositions and methods of the present invention provides substantial therapeutic benefit and improved therapeutic results in patients being treated for cell proliferative diseases and / or neoplasms. In exemplary embodiments, cancer patients treated with an anti-Id method or composition of the invention are treated with conventional cancer treatments (eg, chemotherapy and radiation that can be reduced or eliminated in patients treated with the compositions and methods herein). There is no increase in adverse side effects associated with (therapy), and there is often an improved treatment result with a significant reduction.

これらの有益を反映して、本発明の方法は、転移性疾患の予防又は停止の１つ以上の実際的な治療指標、例えば、二次組織又は解剖学的部位で観察される原発性腫瘍の特徴の転移された細胞又は「巣」の発生率、大きさ、数又は分布での減少で、２０％以上の増加率を提供する。特定の実施形態では、抗Ｉｄ化合物及び方法の抗転移効果は、例えば抗Ｉｄ化合物で治療されていない適格な対照患者と比べたＩｄ治療患者の無疾患生存などの総体的指標を含む、受け入れられている転移性指標で２０％以上の増加を提供する。   Reflecting these benefits, the methods of the present invention can be used for one or more practical therapeutic indications for prevention or cessation of metastatic disease, such as primary tumors observed in secondary tissues or anatomical sites. A decrease in the incidence, size, number or distribution of cells or “nests” with transferred features provides an increase of over 20%. In certain embodiments, the anti-metastatic effects of anti-Id compounds and methods are accepted, including, for example, overall indicators such as disease-free survival of Id-treated patients compared to eligible control patients not treated with anti-Id compounds. Provide an increase of more than 20% in the metastatic index.

他の実施形態では、本発明の抗Ｉｄ化合物、製剤及び方法は、より大きな抗転移の臨床的有益性、例えば、認識される転移指標又はマーカー（例えば、原発性腫瘍部位又はその付近で観察された癌細胞の移動若しくは播種、血液又はリンパの生体試料で観察される転移、又は離れた組織若しくは臓器で検出される二次腫瘍の形成（例えば、放射線又は他の画像、生検、又は術後若しくは検屍後の病理組織学により））における２０〜５０％増加、５０〜７０％増加、最大７０％〜１００％までの減少を提供する。多くの場合において、本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法を使用する有効な臨床管理は、６ヶ月〜１年、１〜２年、２〜５年、５〜１０年又はそれ以上の間、原発及び／又は転移癌の症状、転移性疾患又は他の癌の症状の総体的予防、クリアランス又は安定した寛解を提供する。   In other embodiments, the anti-Id compounds, formulations and methods of the invention are observed in greater anti-metastatic clinical benefits, such as recognized metastatic indicators or markers (eg, at or near the primary tumor site). Cancer cell migration or dissemination, metastasis observed in biological samples of blood or lymph, or formation of secondary tumors detected in distant tissues or organs (eg, radiation or other images, biopsy, or postoperative Or by histopathology after the examination))), providing a 20-50% increase, 50-70% increase, up to 70% -100% decrease. In many cases, effective clinical management using the anti-Id compositions and methods of the present invention is between 6 months to 1 year, 1 to 2 years, 2 to 5 years, 5 to 10 years or more And / or provide overall prevention, clearance or stable remission of symptoms of metastatic cancer, metastatic disease or other cancer.

例示の実施形態では、本発明の抗Ｉｄ方法及び組成物は、抗転移で有効であり、治療されない又は偽薬治療対象に対する抗Ｉｄ治療対象で、転移において２０％以上の減少、２０％〜５０％、５０％〜７５％、最大９０％以上の減少を提供する（例えば、従来の転移細胞の検出、位置把握及び／又は定量のための比較組織病理、コンピュータ断層撮影、陽電子放射断層撮影及び／又は磁気共鳴映像により示される）。   In an exemplary embodiment, the anti-Id methods and compositions of the invention are effective in anti-metastasis and are an anti-Id treated subject that is not treated or is a placebo-treated subject with a 20% or greater reduction in metastasis, 20% to 50%. 50% to 75%, providing a reduction of up to 90% or more (eg, comparative histopathology, computer tomography, positron emission tomography and / or conventional detection, localization and / or quantification of metastatic cells) Shown by magnetic resonance images).

本願に示された全ての実施形態のそれぞれにおいて、抗転移効果は、通常は抗Ｉｄ治療患者とタキサン又は別の癌療法、例えば放射線療法との間で観察される有害な副作用（例えば、吐き気、体重減少、脱毛、免疫学的損傷など）の増加なし又は減少とさえ相関する。例示の実施形態において、抗Ｉｄ治療対象（抗Ｉｄ化合物の単一療法で治療した対象、及び併用方法、例えば抗Ｉｄにさらに加えた化学療法、又は抗Ｉｄにさらに加えた放射線療法で治療した対象を含む）は、１つ以上の一般的に表れる有害な癌治療の副作用（例えば、一般的な化学療法又は放射線療法の副作用）において増加を示さず、そして１つ以上の有害な癌治療の副作用の発生率又は重症度において（例えば、従来の化学療法又は放射線療法の単独で治療した陽性対照の対象に比べて）多くの場合少なくとも２０％減少、２０〜５０％減少、最大５０〜９０％又はそれ以上の減少を示す。   In each of all embodiments presented herein, the anti-metastatic effect is usually due to adverse side effects (eg, nausea, observed) between an anti-Id treated patient and a taxane or another cancer therapy, such as radiation therapy. Correlate with no or even a decrease in weight loss, hair loss, immunological damage, etc. In exemplary embodiments, subjects treated with anti-Id treatment (subjects treated with monotherapy of anti-Id compounds, and combination methods, eg, chemotherapy in addition to anti-Id or radiation therapy in addition to anti-Id. Does not show an increase in one or more commonly seen adverse cancer treatment side effects (eg, general chemotherapy or radiation therapy side effects) and one or more adverse cancer treatment side effects Often at least 20% reduction, 20-50% reduction, up to 50-90% or more (eg, compared to positive control subjects treated with conventional chemotherapy or radiation therapy alone) It shows a further decrease.

抗Ｉｄ療法に関連するであろう副作用には、本願に記載された新たな抗Ｉｄ化合物の抗血管新生効果に関連する副作用が含まれ得る。そのような予想される副作用はまだ評価されていないが、様々な管理手段がこの有害な続発症を効果的に制限又は予防することができる。例えば、本発明の組成物及び方法の抗血管新生活性に起因する創傷治癒の潜在的な障害は、明示された場合は癌手術前に、及び／又は抗Ｉｄ療法の開始前に有効治癒期間を考慮した手術後に、抗Ｉｄ治療を設けることによって避けることができる。追加の治癒促進剤及び方法、例えば治癒促進サイトカイン又は成長因子（例えば、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ））の協調的投与が、協調的に施されることができる。   Side effects that would be associated with anti-Id therapy can include side effects associated with the anti-angiogenic effects of the new anti-Id compounds described herein. Although such anticipated side effects have not yet been evaluated, various management measures can effectively limit or prevent this harmful sequelae. For example, potential obstacles to wound healing due to the anti-angiogenic activity of the compositions and methods of the present invention may include an effective healing period prior to cancer surgery if specified and / or before initiation of anti-Id therapy. Can be avoided by providing anti-Id treatment after surgery considering Additional healing-promoting agents and methods, such as coordinated administration of healing-promoting cytokines or growth factors (eg, platelet-derived growth factor (PDGF)) can be administered in a coordinated manner.

本発明のさらに詳細な態様では、抗Ｉｄ化合物及び方法はまた、循環内皮細胞の転移関連増加を減少させるのにも効果的である。循環内皮細胞は一般的に健康な個人の血液にはないが、癌を含む病原性血管新生を特徴とする疾患を患う個人において著しく上昇する。循環内皮細胞の数（力価又は赤血球容積率カウント）は、適用可能ないずれかの手段により、例えばフローサイトメトリー、イムノビーズ捕捉、蛍光顕微鏡検査、標準及び密度遠心分離、又はフィブロネクチンコーティングされたプレート上における単核細胞培養及び免疫細胞化学を通じて明らかにされることができる。本発明の抗Ｉｄ化合物の抗転移又は抗血管新生の有効量は、類似の病状（例えば、通常はＥＰＣの腫瘍関連上昇がある、治療前の転移性又は血管新生疾患の同等な状態）を示す偽薬治療対象で観察される濃度に比べて、５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、９０％以上まで循環内皮細胞の数を減少させる。   In a more detailed aspect of the present invention, anti-Id compounds and methods are also effective in reducing metastasis-related increases in circulating endothelial cells. Circulating endothelial cells are generally not found in the blood of healthy individuals, but are significantly elevated in individuals with diseases characterized by pathogenic angiogenesis, including cancer. The number of circulating endothelial cells (titer or red blood cell volume fraction count) can be determined by any applicable means such as flow cytometry, immunobead capture, fluorescence microscopy, standard and density centrifugation, or fibronectin coated plates. It can be revealed through mononuclear cell culture and immunocytochemistry above. An anti-metastatic or anti-angiogenic effective amount of an anti-Id compound of the invention exhibits a similar pathology (eg, pre-treatment metastatic or angiogenic disease equivalent condition, usually with a tumor-associated elevation of EPC). Reduce the number of circulating endothelial cells by 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 75%, 90% or more compared to the concentration observed in placebo-treated subjects.

他の詳細な実施形態では、本発明の抗Ｉｄ化合物及び方法は、転移性疾患の進行に関わった循環内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の転移関連増加の遮断又は減少に有効である。悪性形質転換及び転移は、循環ＥＰＣ数増加と関連する。内皮細胞産生は、一般的に骨髄からのＥＰＣの動員による損傷された血管系（腫瘍、及び他の場合の病原性血管新生に関連するものを含む）の修復に関与する。これに修復のための標的部位（腫瘍に関連して損傷された血管系の部位を含む）へのＥＰＣの帰巣が続く（Ｓｈａｋｅｄ他、２００６年；Ｓｈａｋｅｄ他、２００８年）。この血管修復過程には、多くの場合、特定の細胞毒性「化学療法」薬、例えばパクリタキセル、及び血管破壊剤（ＶＤＡ、例えばＺＤ６１２６又はＡＶＥ８０６２）での治療が後き、これは血管での有害な細胞毒性の副作用を伴う。パクリタキセル治療に後き、この血管新生修復過程が正常なマウスにおいて観察されるが、報告によると、Ｉｄ１遺伝子が欠乏したマウスにおいては存在しないと報告されている（Ｓｈａｋｅｄ他、２００８年）。   In other detailed embodiments, the anti-Id compounds and methods of the invention are effective in blocking or reducing metastasis-related increases in circulating endothelial progenitor cells (EPCs) involved in the progression of metastatic disease. Malignant transformation and metastasis are associated with increased circulating EPC numbers. Endothelial cell production is generally involved in the repair of damaged vasculature (including those associated with tumors and other pathogenic angiogenesis) by recruitment of EPCs from the bone marrow. This is followed by EPC homing to the target site for repair, including sites of damaged vasculature associated with the tumor (Shaked et al., 2006; Shaked et al., 2008). This vascular repair process is often followed by treatment with certain cytotoxic “chemotherapeutic” drugs such as paclitaxel, and vascular disrupting agents (VDA such as ZD6126 or AVE8062), which are harmful to the blood vessels. With cytotoxic side effects. Following paclitaxel treatment, this angiogenic repair process is observed in normal mice, but reports indicate that it is absent in mice deficient in the Id1 gene (Shaked et al., 2008).

腫瘍関連ＥＰＣの産生を担う骨髄での過程の正確な性質はまだ確立していないが、ＥＰＣの供給源は骨髄中の造血幹細胞（ＨＳＣ）と推定される。骨髄におけるＩｄ１の喪失は、末梢血液におけるＥＰＣの喪失をもたらし、腫瘍の血管新生及び成長の障害に関連すると報告されている。Ｉｄ１の欠如はまた、骨髄におけるＨＳＣの自己複製能力を弱め、骨髄系統へ分化するその傾向が増大する。この機能的欠陥は、Ｉｄ１抑制のもう１つの標的であるｐ２１の発現増加を含む、Ｉｄ１欠如ＨＳＣにおける転写変化に関連している（Ｃｉａｒｒｏｃｃｈｉ他、２００７年）。ＨＳＣサブセットで内皮及び骨髄系統分化に対するＩｄ１及びその標的遺伝子ｐ２１の対立する効果を強調するためには、表現型ＨＳＣが内皮の子孫を生じさせる上記能力のためにＩｄ１が必要とされる。Ｉｄ１−／−動物におけるｐ２１の除去は、機能的内皮集団を回復させ、Ｉｄ１−／−マウスにおいて観察される血管新生の欠陥を回復し、Ｉｄ１欠如ＨＳＣの早期骨髄関与を回復する。Ｉｄ１は、一般的な抗アトポーシス効果を通じて、細胞毒性での脅威に面した癌細胞への治療的にマイナスな保護の役割を果たすようである（Ｚｈａｎｇ他、２００６年；Ｗｏｎｇ他、２００４年）。これは前立腺癌細胞、非咽頭癌細胞、ＨｅＬａ（子宮頸部）癌細胞及びＭＣＦ７（***）癌細胞におけるパクリタキセル／ドセタキセル誘導性アトポーシスの研究に基づいて報告されている。また、Ｒａｆ／ＭＥＫ（Ｚｈａｎｇ他、２００６年）、及び／又はＭＡＰＫ信号伝達経路（Ｃｈｅｕｎｇ他、２００４年；Ｌｉｎ他、２００５年）のＩｄによる上方制御が、治療後の癌細胞によって獲得される細胞毒性に対する耐性を説明するために提示されている。   Although the exact nature of the process in the bone marrow responsible for the production of tumor-associated EPC has not yet been established, the source of EPC is presumed to be hematopoietic stem cells (HSCs) in the bone marrow. Loss of Id1 in the bone marrow has been reported to result in loss of EPC in the peripheral blood and is associated with impaired tumor angiogenesis and growth. The lack of Id1 also weakens the ability of HSCs to self-renew in the bone marrow and increases their tendency to differentiate into the myeloid lineage. This functional defect is associated with transcriptional changes in Id1-deficient HSCs, including increased expression of p21, another target of Id1 repression (Ciarrocchi et al., 2007). In order to highlight the opposing effects of Id1 and its target gene p21 on endothelial and myeloid lineage differentiation in the HSC subset, Id1 is required for the ability of the phenotype HSC to generate endothelial progeny. Removal of p21 in Id1 − / − animals restores functional endothelial population, restores the angiogenic defect observed in Id1 − / − mice, and restores early bone marrow involvement of Id1 deficient HSCs. Id1 appears to play a therapeutic negative protection against cancer cells facing the threat of cytotoxicity through a general anti-atopic effect (Zhang et al., 2006; Wong et al., 2004). This has been reported based on studies of paclitaxel / docetaxel-induced apoptosis in prostate cancer cells, non-pharyngeal cancer cells, HeLa (cervical) cancer cells and MCF7 (breast) cancer cells. Also, cells that are upregulated by Id of Raf / MEK (Zhang et al., 2006) and / or MAPK signaling pathway (Cheung et al., 2004; Lin et al., 2005) are acquired by cancer cells after treatment Presented to explain resistance to toxicity.

複雑かつ説明されていない経路の関与にもかかわらず、本発明の抗Ｉｄ化合物及び方法は、これらの経路の重要な交差地点で、Ｉｄタンパク質を根本的に無能力化する。また、この方法で、本発明の抗転移及び抗血管新生に有効な抗Ｉｄ化合物は、ＥＰＣの産生を標的としつつ、二次的には腫瘍関連血管新生及び関連した腫瘍の成長を無能力化する。特定の実施形態では、本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、類似の病状（例えば、通常はＥＰＣの腫瘍関連上昇がある、治療前の転移性又は血管新生疾患の同等な状態）を示す偽薬治療対象で観察される濃度に比べて、治療対象の循環血液試料におけるＥＰＣの数を少なくとも５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、９０％以上まで効果的に減少させる。   Despite the involvement of complex and unexplained pathways, the anti-Id compounds and methods of the present invention fundamentally disable the Id protein at important intersections of these pathways. Also, with this method, the anti-Id compounds effective for anti-metastasis and anti-angiogenesis of the present invention secondarily disable the tumor-related angiogenesis and related tumor growth while targeting the production of EPC To do. In certain embodiments, the anti-Id compositions and methods of the invention are placebos that exhibit similar pathologies (eg, pre-treatment metastatic or angiogenic disease equivalent status, usually with a tumor-related increase in EPC). Effectively reduces the number of EPCs in a circulating blood sample to be treated to at least 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 75%, 90% or more compared to the concentration observed in the treated subject .

本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、さらに老化又はアトポーシスに対する腫瘍細胞の細胞決定又は運命を変更させて、抗癌及び抗転移での有効性を発揮する。従って、本発明の更なる態様から、本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、抗Ｉｄ治療患者の原発又は二次腫瘍におけるアトポーシス又は老衰細胞の数を効果的に増加させる。特定の実施形態では、本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、類似の病状（例えば、通常は腫瘍の成長及びアトポーシス又は老衰細胞の低い発生率が伴う、治療前の転移性又は血管新生疾患の同等な状態）を示す偽薬治療対象からの対照試料中のアトポーシス又は老衰細胞の数と比べて、治療対象の腫瘍におけるアトポーシス又は老衰細胞の数（例えば、既存の腫瘍の生検又は剖検によって観察される）を少なくとも２０％、３０％、５０％、１００％、最大５倍、１０倍以上に増加させる。   The anti-Id compositions and methods of the present invention further alter the cellular determination or fate of tumor cells for aging or atoposis to exert efficacy in anti-cancer and anti-metastasis. Thus, from a further aspect of the invention, the anti-Id compositions and methods of the invention effectively increase the number of atopic or senile cells in the primary or secondary tumor of an anti-Id treated patient. In certain embodiments, the anti-Id compositions and methods of the present invention may be used to treat metastatic or angiogenic diseases prior to treatment, with similar pathologies (eg, usually associated with tumor growth and low incidence of atopic or senile cells). The number of atopic or senescent cells in the tumor to be treated (e.g., observed by biopsy or autopsy of an existing tumor) compared to the number of atopic or senescent cells in a control sample from a placebo-treated subject exhibiting equivalent status) At least 20%, 30%, 50%, 100%, 5 times, 10 times or more.

癌幹細胞は、新たな腫瘍（元の腫瘍の系統異質性を繰り返す能力を有する）を開始することができる大量の腫瘍細胞中の亜集団である。癌幹細胞は、自己再生及び多分化能を含む組織幹細胞の特性を共有する。癌幹細胞に対するＩｄタンパク質の正の制御活性が、結腸癌及び悪性神経膠腫で報告されており、他の種類の癌幹細胞もまた、Ｉｄタンパク質に依存するようである（Ｈｕａ他、２００６年；Ｊａｍｅｓ他、２０１０年；Ｊａｎｋｏｖｉｃ他、２００７年；Ｐｅｒｒｙ他、２００７年；Ｒａｗｌｉｎｓ他、２００９年；Ｓｕｈ他、２００９年；Ｌｙｄｅｎ他；１９９９年；Ａｎｉｄｏ他、２０１０年；Ｊｅｏｎ他、２０１１年）。結腸癌幹細胞では、Ｉｄ１及びＩｄ３の組み合わされた発現は、自己再生及び腫瘍発生の両方を増加させると報告されている（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ他、２０１２年）。癌幹細胞は化学療法剤に対する耐性を示し、培養に基づく試験でのＩｄ１及びＩｄ３のサイレンシングは、細胞をオキサリプラチンに対して感作させると報告されている（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ他、２０１２年）。高悪性度神経膠腫でＩｄタンパク質は、神経膠腫幹細胞を含む様々な腫瘍細胞集団で共発現される。ＨＲＡＳＶ１２腫瘍遺伝子により誘導される脳癌の同所移植モデルで、腫瘍細胞における条件Ｉｄ１、Ｉｄ２及びＩｄ３対立遺伝子の欠損は、神経膠腫幹細胞集団（ネスチン陽性及びステップ特異的胚芽抗原１（ＳＳＥＡ１）陽性細胞）を減少させ、腫瘍の成長を遮断し、生存を延長すると報告されている。自己再生潜在力について試験管内の選択された細胞は、細胞のマウス脳への移植後にＩｄ遺伝子が欠損される場合、腫瘍形成能力を失うが、Ｉｄ遺伝子が正常に存在する場合、これらは強力な腫瘍形成潜在力を有していると報告されている（Ｎｉｏｌａ他、２０１３年）。胚芽神経幹細胞（ＮＳＣ）は、報告によると、Ｉｄ１、Ｉｄ２及びＩｄ３の欠如時、自己再生及び多分化能を失うが、１つのＩｄ２対立遺伝子を有する細胞では正常に近く、これらの特性が持続する（Ｉｄタンパク質がＮＳＣでは重複して機能することを示唆する）（Ｎｉｏｌａ他、２０１２年）。マウス脳の発生時、Ｉｄ１及びＩｄ３の不活性化（いずれの遺伝子も単独でなく）は、報告によると、ＮＳＣの未成熟分化を触発し得る（Ｌｙｄｅｎ他、１９９９年）。Ｉｄ１及びＩｄ３のショートヘアピンＲＮＡ媒介サイレンシングは、報告によると、試験管内の同所移植実験で神経膠腫幹細胞特性を抹消する（Ａｎｉｄｏ他、２０１０年）。サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ａが不足したマウス星状膠細胞（Ｃｄｋｎ２ａ^-/-）において、Ｉｄ４の発現は、サイクリンＥ活性化及びノッチ（Ｎｏｔｃｈ）信号伝達に関する神経膠腫幹細胞マーカーを誘導する（Ｊｅｏｎ他、２００８年）。また、Ｉｄ４は、ＳＲＹ−ｂｏｘ２（ＳＯＸ２）のｍｉＲ−９^*媒介された抑制を再抑制し、神経膠腫幹細胞の潜在力及び化学耐性を増加させると報告されている（Ｊｅｏｎ他、２０１１年）。体性幹細胞と同様に、癌幹細胞がニッチに固定され、血管における内皮細胞との細胞−細胞接触を通じて支援信号を駆動する。ニッチを固守する能力は、正常な幹細胞及び癌幹細胞の重要な特徴である（Ｃａｌａｂｒｅｓｅ Ｃ他、２００７年；Ｃｈｅｎ Ｓ他、２０１３年；Ｌｅｗａｌｌｅｎ Ｍ他、２０１３年；Ｆｉｅｔｚ他、２０１１年；Ｌａｔｈｉａ ＪＤ他、２０１０年；Ｐａｒｋ ＤＭ他、２００９年）。Ｉｄタンパク質の喪失は、報告によると、ＮＳＣ及び神経膠腫幹細胞におけるニッチでの内皮細胞への幹細胞の付着を混乱させる（Ｎｉｏｌａ他、２０１２年；Ｎｉｏｌａ他、２０１３年）。ｂＨＬＨ転写のＩｄによって媒介された抑圧は、ＲＡＳ関連タンパク質１（ＲＡＰ１）、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＲＡＰ１ＧＡＰ）、インテグリン信号伝達を通じた細胞付着を制御する（Ｂｏｅｔｔｎｅｒ他、２００９年）ＲＡＰ１ＧＴＰａｓｅの阻害因子をコードするｂＨＬＨ標的遺伝子の発現を制限する。Ｉｄタンパク質の濃度が減少する場合、例えば、神経分化時又はＩｄノックアウトマウスにおけるＩｄタンパク質の欠如において、Ｒａｐ１ギャップの脱抑制はＲＡＰ１を阻害し、ニッチからの幹細胞の離脱を誘導する。従って、ＮＳＣではＩｄ−ｂＨＬＨ軸がニッチとの幹細胞の相互作用を導く細胞内在指示を動的に調節する一方で、神経膠腫幹細胞における増加したＩｄ活性によるｂＨＬＨ活性の継続封鎖は、異常な「ｏｎ」状態の付着信号を固着させることがあり、ＲＡＰ１ＧＡＰ、Ｉｄ２及びＩｄ３が高悪性度神経膠腫がある患者における予後マーカーという報告と関連がある。他の研究で、高いＩｄ１の発現がある高悪性度神経膠腫細胞は、試験管内での高い自己再生潜在力及び同所移植注射時の腫瘍形成能力を表すが、低いＩｄ１の発現がある細胞は、試験管内での自己再生が損なわれたが、さらに強力な腫瘍原性である（Ｂａｒｒｅｔｔ他、２０１２年）。これらの後者の幹細胞は、脳の神経領域中の「転移増幅前駆細胞」と類似の幹細胞型であり得る。ＮＣＳよりも低い濃度のＩｄタンパク質を発現するこれらの前駆細胞（Ｎａｍ他、２００９年）は、自己再生を制限することができるが、特定の脳腫瘍サブタイプの根源に関わっている可能性がある（Ｌｉｕ他、２０１１年）高い増殖潜在力を有している（Ｄｉａｚ−Ｆｌｏｒｅｓ他、２００６年）。Ｉｄ１の発現と腫瘍進行の間の逆相関関係は、プロニューラル遺伝子発現特性及び高いＩｄ１発現がある神経膠芽腫患者に対して、低いＩｄ１を特徴とする患者に比べ、両方のサブグループ共に不調ではあるが、若干より良い予測を説明することができる。特定の腫瘍の種類では、幹様細胞及び前駆細胞の特徴を有した細胞の両方が、腫瘍を効率的に播種させる能力を有し得る。また、これらの発見は、両方の細胞集団を標的にすることが神経膠芽腫を効果的に治療するために重要であることを示す（Ｂａｒｒｅｔｔ他、２０１２年）。 Cancer stem cells are a subpopulation in a large number of tumor cells that can initiate new tumors (with the ability to repeat the lineage heterogeneity of the original tumor). Cancer stem cells share the characteristics of tissue stem cells including self-renewal and pluripotency. Positive regulatory activity of the Id protein on cancer stem cells has been reported in colon cancer and malignant glioma, and other types of cancer stem cells also appear to be dependent on the Id protein (Hua et al., 2006; James). Jankovic et al., 2007; Perry et al., 2007; Rawlins et al., 2009; Suh et al., 2009; Lyden et al., 1999; Anido et al., 2010; Jeon et al., 2011). In colon cancer stem cells, the combined expression of Id1 and Id3 has been reported to increase both self-renewal and tumor development (O'Brien et al., 2012). Cancer stem cells show resistance to chemotherapeutic agents, and silencing of Id1 and Id3 in culture-based studies has been reported to sensitize cells to oxaliplatin (O'Brien et al., 2012). In high-grade gliomas, Id protein is co-expressed in various tumor cell populations, including glioma stem cells. In orthotopic transplantation model of brain cancer induced by HRASV12 oncogene, deletion of conditional Id1, Id2 and Id3 alleles in tumor cells is positive for glioma stem cell population (nestin positive and step specific germ antigen 1 (SSEA1)) Cell), block tumor growth and prolong survival. Selected cells in vitro for self-renewal potential lose their tumorigenic potential when the Id gene is defective after transplantation of the cells into the mouse brain, but they are potent when the Id gene is present normally. It has been reported to have tumorigenic potential (Niola et al., 2013). Embryonic neural stem cells (NSCs) reportedly lose self-renewal and pluripotency in the absence of Id1, Id2, and Id3, but are nearly normal in cells with one Id2 allele and these properties persist (Suggests that Id protein functions redundantly in NSC) (Niola et al., 2012). During mouse brain development, inactivation of Id1 and Id3 (neither gene alone) can be reported to trigger immature differentiation of NSCs (Lyden et al., 1999). Short hairpin RNA-mediated silencing of Id1 and Id3 reportedly eliminates glioma stem cell properties in in vitro orthotopic transplantation experiments (Anido et al., 2010). In mouse astrocytes deficient in cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (Cdkn2a ^{− / −} ), expression of Id4 induces glioma stem cell markers for cyclin E activation and Notch signaling (Jeon) Et al., 2008). Id4 has also been reported to reinhibit miR-9 ^* -mediated suppression of SRY-box2 (SOX2) and increase the potential and chemical resistance of glioma stem cells (Jeon et al., 2011). . Like somatic stem cells, cancer stem cells are fixed in a niche and drive assist signals through cell-cell contact with endothelial cells in blood vessels. The ability to adhere to the niche is an important feature of normal and cancer stem cells (Calabrese C et al., 2007; Chen S et al., 2013; Lewallen M et al., 2013; Fietz et al., 2011; Lathia JD et al. 2010; Park DM et al., 2009). Loss of Id protein reportedly disrupts stem cell attachment to endothelial cells in niches in NSC and glioma stem cells (Niola et al., 2012; Niola et al., 2013). Id-mediated suppression of bHLH transcription encodes an inhibitor of RAP1 GTPase that regulates cell attachment through RAS-related protein 1 (RAP1), GTPase activating protein (RAP1GAP), integrin signaling (Boettner et al., 2009) To limit the expression of the bHLH target gene. When the concentration of Id protein decreases, for example, during neuronal differentiation or in the absence of Id protein in Id knockout mice, derepression of the Rap1 gap inhibits RAP1 and induces stem cell withdrawal from the niche. Thus, in NSC, the Id-bHLH axis dynamically regulates the cellular endogenous direction leading to stem cell interaction with the niche, while the continued blockade of bHLH activity by increased Id activity in glioma stem cells is abnormal. “on” state adhesion signals may be pinned, and RAP1GAP, Id2, and Id3 are associated with reports of prognostic markers in patients with high-grade glioma. In other studies, high-grade glioma cells with high Id1 expression show high self-renewal potential in vitro and tumorigenic potential upon orthotopic implantation, but cells with low Id1 expression Is impaired in vitro self-renewal but is more potent oncogenic (Barrett et al., 2012). These latter stem cells may be of a similar stem cell type as “metastasis-amplified progenitor cells” in the neural region of the brain. These progenitor cells that express lower concentrations of Id protein than NCS (Nam et al., 2009) can limit self-renewal, but may be involved in the origin of certain brain tumor subtypes ( (Liu et al., 2011) have high growth potential (Diaz-Flores et al., 2006). The inverse correlation between Id1 expression and tumor progression is poor in both subgroups for glioblastoma patients with proneural gene expression characteristics and high Id1 expression compared to patients characterized by low Id1 Nevertheless, a slightly better prediction can be explained. For certain tumor types, both stem-like and progenitor cells can have the ability to seed tumors efficiently. These findings also indicate that targeting both cell populations is important for effectively treating glioblastoma (Barrett et al., 2012).

前述した報告内容に基づくと、Ｉｄタンパク質は、結腸直膓癌及び悪性神経膠腫の両方において、癌幹細胞の自己再生及び腫瘍開始能力の両方に必須である、幹細胞同一性の調節因子として重要な役割を果たすと想定される。癌幹細胞の発生に関連するメカニズムの複雑性及び特定されていない経路にもかかわらず、本発明の抗Ｉｄ化合物及び方法は、幹細胞同一性を混乱させ、幹細胞腫瘍発生を損なう重要な根幹でＩｄタンパク質を強力に無能力化する。抗転移及び抗血管新生に有効な本発明の化合物は、腫瘍幹細胞の生存力、増殖能力、腫瘍開始潜在力及び／又は細胞運命決定を特異的に標的化し、新たな又は定着した腫瘍に存在する新たな腫瘍誘導コンピテント幹細胞の集団を実質的に減少させる結果を提供する。特定の実施形態では、本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、治療対象の腫瘍のうち１つ以上の選択された幹細胞マーカー（例えば、既存の腫瘍の生検又は剖検を通じて観察される）を有する細胞の数を、類似の病状（例えば、通常は腫瘍の成長、新たな腫瘍の形成、及び腫瘍に関連した癌幹細胞の高い発生率が伴う、治療前新生物性又は転移性疾患と同等な状態）を表す偽薬治療対象で観察される濃度に比べて、少なくとも５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、９０％以上有効に減少させる。上皮細胞及びＥＰＣの決定と同様に、広く知られた検査、マーカー及び標識化試薬が、本願における組成物及び方法の抗幹細胞有効性を明らかにするために通常通り用いられる。当業者は、そのような検査が、例えば、細胞測定、イムノビーズ捕捉、及び免疫細胞化学などの従来の検査手法を用いる、陽性幹細胞マーカー、例えばネスチン及びＳＳＥＡ１の検出に基づいて、癌幹細胞を同定及び定量するために容易に考案及び実施されることを理解する。本願における教示及び上述された他の報告（紙面節約のために、それらの全ては参照によって本願に援用される）に従って、特に癌疾患リスクが低減した抗Ｉｄ治療対象に関して、より多くの別個の検査が、腫瘍幹細胞の生存力、増殖能力、腫瘍開始潜在力及び／又は細胞運命における差を明らかにする。   Based on the aforementioned report, Id protein is important as a regulator of stem cell identity that is essential for both cancer stem cell self-renewal and tumor initiation ability in both colonic carcinoma and malignant glioma. It is assumed to play a role. Despite the complexity of the mechanisms associated with the development of cancer stem cells and unspecified pathways, the anti-Id compounds and methods of the present invention provide important Id proteins that disrupt stem cell identity and impair stem cell tumor development. Is powerfully disabled. Compounds of the invention effective for anti-metastasis and anti-angiogenesis are present in new or established tumors that specifically target tumor stem cell viability, proliferative capacity, tumor initiation potential and / or cell fate decisions Providing results that substantially reduce the population of new tumor-derived competent stem cells. In certain embodiments, the anti-Id compositions and methods of the invention have one or more selected stem cell markers of a tumor to be treated (eg, observed through biopsy or autopsy of an existing tumor) The number of cells is comparable to pre-treatment neoplastic or metastatic disease with similar pathologies (eg, usually with tumor growth, new tumor formation, and high incidence of tumor-associated cancer stem cells ) Is effectively reduced by at least 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 75%, 90% or more compared to the concentration observed in placebo-treated subjects. Similar to epithelial cell and EPC determination, well-known tests, markers and labeling reagents are routinely used to demonstrate the anti-stem cell efficacy of the compositions and methods herein. One skilled in the art will identify cancer stem cells based on the detection of positive stem cell markers such as nestin and SSEA1, using such testing, for example, conventional testing techniques such as cytometry, immunobead capture, and immunocytochemistry. And understand that it is easily devised and implemented for quantification. In accordance with the teachings in this application and the other reports mentioned above (all of which are incorporated herein by reference for space savings), more separate tests, especially for anti-Id treated subjects with reduced risk of cancer disease Reveals differences in tumor stem cell viability, proliferative capacity, tumor initiation potential and / or cell fate.

癌及び転移性疾患に対する本発明の抗Ｉｄ治療方法の有効性は、様々な方法、例えば、Ｘ線又はＭＲＩを用いた腫瘍の映像化のいずれかにより（例えば、治療患者で腫瘍の大きさ又は数が減少したか否かを明らかにするために）、臨床的成功に関して監視されることができる。有効性は、多くの場合に腫瘍の大きさの減少のＸ線撮影での又はＭＲＩでの観察により明らかにされる。癌治療に有効な本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、要件を満たした比較可能な対照対象に比べて、治療患者での腫瘍又は治療患者群の平均腫瘍の大きさにおいて、通常は少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９０％以上の減少を提供する。   The effectiveness of the anti-Id treatment methods of the invention for cancer and metastatic disease can be demonstrated by any of a variety of methods, such as tumor imaging using X-rays or MRI (eg, tumor size or To determine whether the number has decreased), it can be monitored for clinical success. Efficacy is often revealed by radiographic or MRI observations of tumor size reduction. The anti-Id compositions and methods of the invention that are effective in treating cancer are typically at least 10 in tumor size in the treated patient or in the mean tumor size of the treated patient group compared to a comparable control subject that meets the requirements. %, 25%, 50%, 75%, providing a reduction of 90% or more.

癌及び転移性疾患に対する本発明の抗Ｉｄ治療方法の有効性は、適した試験対象及び対照対象の間で、血液試料中の循環腫瘍細胞の数を測定することによって更に明らかにされることができる。これは、限定ではないが、免疫磁気選択、フローサイトメトリー、イムノビーズ捕捉、蛍光顕微鏡検査、細胞形態分析、又は細胞分離技術を含む適用可能ないずれかの手段により達成できる。癌治療に有効な本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、通常は、要件を満たした比較可能な対照対象に比べて、治療患者又は治療患者群の血液試料中の循環腫瘍細胞の少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９０％以上の減少を提供する。   The effectiveness of the anti-Id treatment method of the invention against cancer and metastatic disease may be further clarified by measuring the number of circulating tumor cells in a blood sample between suitable test and control subjects. it can. This can be achieved by any applicable means including, but not limited to, immunomagnetic selection, flow cytometry, immunobead capture, fluorescence microscopy, cell morphology analysis, or cell separation techniques. The anti-Id compositions and methods of the invention that are effective in treating cancer are typically at least 10% of circulating tumor cells in a blood sample of a treated patient or group of treated patients compared to a comparable control subject that meets the requirements. 25%, 50%, 75%, 90% or more reduction.

癌及び転移性疾患に対する本発明の抗Ｉｄ治療方法の有効性は、限定ではないが、骨、リンパ節及び肺を含む二次組織又は器官における原発腫瘍細胞の発生又は数を検出若しくは測定して更に明らかにされることもできる。癌治療に有効な本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、通常は、要件を満たした比較可能な対照対象と比べて、治療患者での二次組織又は器官に転移した原発性腫瘍細胞の発生又は数において、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９０％以上の減少を提供する。   The effectiveness of the anti-Id treatment method of the present invention for cancer and metastatic disease includes, but is not limited to, detecting or measuring the occurrence or number of primary tumor cells in secondary tissues or organs including bone, lymph nodes and lung. It can also be revealed. The anti-Id compositions and methods of the present invention that are effective in treating cancer typically generate primary tumor cells that have metastasized to secondary tissues or organs in the treated patient compared to a comparable control subject that meets the requirements. Or provide a reduction of at least 10%, 25%, 50%, 75%, 90% or more in number.

本発明の特定の態様では、転移抑制又は減少を含む癌予防又は治療のための抗Ｉｄ組成物及び方法は、二次治療薬、治療法又は治療方法と共に有効量の抗Ｉｄ化合物の協調的投与を伴う。特定の例示の実施形態において、対象は、、抗Ｉｄ組成物と、化学療法薬（即ち、第二の抗癌又は抗転移薬、化合物又は化学製剤の使用）、放射線、化学療法、手術、又はこれらの製剤／方法のいずれかの組み合わせから選択される二次治療薬とで、同時又は連続的に治療される。   In certain aspects of the invention, anti-Id compositions and methods for cancer prevention or treatment, including metastasis inhibition or reduction, are coordinated administration of an effective amount of an anti-Id compound with a secondary therapeutic agent, therapy or treatment method. Accompanied by. In certain exemplary embodiments, the subject has an anti-Id composition and a chemotherapeutic agent (ie, use of a second anti-cancer or anti-metastatic agent, compound or chemical formulation), radiation, chemotherapy, surgery, or Treated simultaneously or sequentially with a second therapeutic agent selected from any combination of these formulations / methods.

特定の「協調的療法」又は「組み合わせ治療」の実施形態では、本発明は、組み合わせの抗癌又は抗転移活性を有する二次薬剤、化合物又は化学製剤と同時に（同じ時間に、任意には組み合わされた製剤で）投与される抗Ｉｄ化合物を使用する。この状況での二次化学療法薬は、従来の化学療法薬（例えば、タキサン）、血管破壊剤（ＶＤＡ）、又はＨＳＰ−９０阻害剤に分類される製剤を広く含むことが意図される。これらの及び関連した実施形態では、抗Ｉｄ化合物及び二次薬剤又は治療は、「組み合せて有効な」であり、これは生物活性（例えば、本願で定義された通り抗癌又は抗転移活性）、副作用、患者の結果、又は他の実際的な治療指標が、抗Ｉｄ化合物単独で又は二次薬剤で単独で治療した関連する対照対象で観察される結果よりも改善されることを意味する。   In certain “coordinated therapy” or “combination therapy” embodiments, the present invention may be concomitant with (at the same time, optionally in combination with) a secondary agent, compound or chemical formulation having a combination anti-cancer or anti-metastatic activity. Anti-Id compounds to be administered). Secondary chemotherapeutic drugs in this context are intended to broadly include formulations classified as conventional chemotherapeutic drugs (eg, taxanes), vascular disrupting agents (VDA), or HSP-90 inhibitors. In these and related embodiments, the anti-Id compound and the secondary agent or treatment are “effective in combination”, which is a biological activity (eg, an anti-cancer or anti-metastatic activity as defined herein), It means that side effects, patient outcomes, or other practical therapeutic indicators are improved over those observed in related control subjects treated with anti-Id compounds alone or with secondary agents alone.

本発明の抗Ｉｄ化合物及び方法は、組み合わせ製剤又は協調的治療プロトコル（二次治療薬又は方法と同時、前又は後に施される抗Ｉｄ療法）で、二次抗癌薬、薬剤又は介入の範囲のいずれかと協調的に使用されることができる。例示の協調的治療では、抗Ｉｄ化合物、例えばＡＧＸ５１は、化学療法薬又は療法と協調的に施される。本発明のこの態様で使用するための化学療法薬及び療法には、抗癌及び抗過剰増殖剤、癌細胞を破壊若しくは「再プログラム」する薬剤、新生物若しくは過剰増殖性病態に関連する血管を破壊する薬剤、及び腫瘍性細胞標的に有害な他の種類の薬剤が含まれる。これに関して、本発明で有用な化学療法剤は、限定ではないが次を含む。
（１）チューブリン脱重合剤、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ＢＡＹ５９−８８６２アルブミン結合ＶＤＡなどのタキソイド、
（２）ＤＮＡ損傷剤及びＤＮＡ合成阻害剤、
（３）代謝拮抗物質、
（４）抗血管新生剤及び血管破壊剤（ＶＤＡ）、
（５）抗体、
（６）内分泌療法、
（７）免疫調節物質、
（８）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、
（９）信号伝達阻害剤、
（１０）熱衝撃タンパク質阻害剤、
（１１）レチノイド、例えばオールトランスレチノイン酸、
（１２）成長因子受容体又は成長因子自体の阻害剤、
（１３）抗有糸***化合物、
（１４）抗炎症剤、例えばＣＯＸ阻害剤、及び
（１５）細胞周期調節物質、例えばチェックポイント調節物質及びテロメラーゼ阻害剤。 The anti-Id compounds and methods of the present invention are a combination formulation or coordinated treatment protocol (anti-Id therapy administered at the same time, before or after the second therapeutic agent or method), with a range of secondary anti-cancer drugs, agents or interventions. Can be used in concert with either In an exemplary coordinated therapy, an anti-Id compound, such as AGX51, is administered in concert with a chemotherapeutic agent or therapy. Chemotherapeutic agents and therapies for use in this aspect of the invention include anti-cancer and anti-hyperproliferative agents, agents that destroy or “reprogram” cancer cells, blood vessels associated with neoplasms or hyperproliferative conditions. Agents that destroy and other types of agents that are detrimental to neoplastic cell targets are included. In this regard, chemotherapeutic agents useful in the present invention include, but are not limited to:
(1) Tubulin depolymerizing agents, for example, taxoids such as paclitaxel, docetaxel, BAY59-8862 albumin binding VDA,
(2) DNA damaging agents and DNA synthesis inhibitors,
(3) antimetabolite,
(4) anti-angiogenic and vascular disrupting agents (VDA),
(5) antibodies,
(6) endocrine therapy,
(7) immunomodulator,
(8) histone deacetylase inhibitor,
(9) signal transmission inhibitor,
(10) a thermal shock protein inhibitor,
(11) Retinoids such as all-trans retinoic acid,
(12) an inhibitor of the growth factor receptor or the growth factor itself,
(13) antimitotic compounds,
(14) anti-inflammatory agents such as COX inhibitors, and (15) cell cycle regulators such as checkpoint regulators and telomerase inhibitors.

他の態様で、本発明の組み合わせ製剤は、１つ以上の従来の化学療法薬又は他の抗転移化合物若しくは薬剤と組み合わされた製剤で、記載された抗Ｉｄ化合物を含み、任意で当業界で既知の副作用の減少剤（どのような併用療法が用いられたのか、例えば、化学療法、放射線療法、又は両方を用いたのかに依存する）を含む。本発明の抗Ｉｄ化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態で提供され得る。これらの化合物は、経口、局所、非経口、経皮又は静脈内（ｉｖ）投与用に普通に製剤化できる。特定の実施形態では、例えば、複数の化合物が別々に投与される場合、複数の医薬組成物（それぞれ異なる活性剤を含む）が提供され得る。他の実施形態では、抗Ｉｄ活性剤、二次化学療法剤、及び任意で副作用還元剤を含有する単一製剤が提供される。   In other embodiments, the combination formulations of the present invention are formulations combined with one or more conventional chemotherapeutic agents or other anti-metastatic compounds or agents, including the described anti-Id compounds, and optionally in the art. Includes known side effect reducing agents (depending on what combination therapy was used, eg, chemotherapy, radiation therapy, or both). The anti-Id compounds of the invention can be provided in the form of pharmaceutically acceptable salts. These compounds can be commonly formulated for oral, topical, parenteral, transdermal or intravenous (iv) administration. In certain embodiments, for example, when multiple compounds are administered separately, multiple pharmaceutical compositions (each comprising a different active agent) can be provided. In other embodiments, a single formulation is provided that contains an anti-Id active agent, a secondary chemotherapeutic agent, and optionally a side effect reducing agent.

協調的療法に対して観察される組み合わせの有効性は、様々な理由で発生し得るが、一般的には２つ以上の独立した経路の組み合わされた阻害による。個々の経路は標的細胞（例えば、転移癌細胞）に対する「迂回」経路を提供することができ、脱出を防止するために複数の経路が標的化されることが必要とされる。例えば、既知の抗血管新生薬を用いて抗血管新生ストレスが示された場合、腫瘍の周辺細胞は近辺の血管を引き入れることによって、通常の腫瘍関連血管新生の破壊を「迂回」することができる。しかしこれは欠陥のある脱出機序で、多くの場合に腫瘍を低酸素ストレスに曝す。次にこのストレスは、熱衝撃因子９０（Ｈｓｐ９０）の内生的な活性により緩和され得る。従って、本発明の特定の実施形態で、Ｈｓｐ９０阻害剤は、抗Ｉｄ化合物と協調的に投与され、組み合わせによって有効な抗Ｉｄ及び抗ＨＳＰ９０活性を提供し、増強された臨床結果を伴う。   The effectiveness of the combination observed for coordinated therapy can occur for a variety of reasons, but is generally due to the combined inhibition of two or more independent pathways. Individual pathways can provide “bypass” pathways for target cells (eg, metastatic cancer cells), and multiple pathways need to be targeted to prevent escape. For example, when anti-angiogenic stress is demonstrated using known anti-angiogenic agents, tumor surrounding cells can "bypass" the destruction of normal tumor-related angiogenesis by drawing in nearby blood vessels . However, this is a defective escape mechanism, often exposing the tumor to hypoxic stress. This stress can then be relieved by the endogenous activity of thermal shock factor 90 (Hsp90). Thus, in certain embodiments of the invention, Hsp90 inhibitors are administered in concert with anti-Id compounds, providing effective anti-Id and anti-HSP90 activity in combination with enhanced clinical results.

本発明の抗Ｉｄ化合物及び方法は、血管破壊剤（ＶＤＡ）と組み合わせて特に効果的に使用され、多くの場合にＶＤＡ有効用量の減少及び／又はＶＤＡに関連する有害な副作用の減少を可能にする有益を伴う。ＶＤＡは、主に細胞骨格の血管網を混乱させて細胞形状及び透過性変化を誘発し、血管耐性、血管収縮、増加した血管透過性、血小板血栓及び血管閉鎖を引き起こす化学製剤である。血管破壊は、腫瘍（及び眼球疾患の場合、病的新生血管病変）から血液供給を奪う有効な治療戦略を表す。固形腫瘍では、血管破壊剤は腫瘍内の血管系を迅速に破壊し、血流を減少させ、腫瘍から酸素及び栄養素を奪い、腫瘍細胞死を引き起こす。新しく形成された血管のこの破壊は、新たな血管の形成を防止するように設計された抗血管新生療法の作用と対照をなす。多くの場合、ＶＤＡが腫瘍血液供給を制限し、これらを低酸素ストレス（熱衝撃タンパク質（ＨＳＰ）により緩和される）に誘導するので、これらの組み合わせ方法及び製剤は、多くの場合に協調的療法の結果をさらに高めるために抗ＨＳＰ９０製剤／方法を含む。   The anti-Id compounds and methods of the present invention are particularly effectively used in combination with a vascular disrupting agent (VDA), often allowing a reduction in the effective dose of VDA and / or reduction of adverse side effects associated with VDA. With the benefit of. VDA is a chemical formulation that primarily disrupts the vascular network of the cytoskeleton to induce cell shape and permeability changes, resulting in vascular resistance, vasoconstriction, increased vascular permeability, platelet thrombus and vascular closure. Vascular destruction represents an effective therapeutic strategy that deprives the blood supply from the tumor (and in the case of ocular disease, pathological neovascular lesions). In solid tumors, vascular disruptors quickly destroy the vasculature within the tumor, reduce blood flow, deprive the tumor of oxygen and nutrients, and cause tumor cell death. This destruction of newly formed blood vessels contrasts with the effects of anti-angiogenic therapies designed to prevent the formation of new blood vessels. Since VDA often limits tumor blood supply and induces them to hypoxic stress (relieved by heat shock protein (HSP)), these combined methods and formulations are often coordinated therapy To further enhance the results of the anti-HSP90 formulation / method.

血管破壊剤は、腫瘍において、腫瘍に関連した、脆弱かつ比較的新しく構築された血管系を標的にする（Ｔｏｚｅｒ他、２００５年、Ｍｉｔａ他、２０１３年）。プロトタイプのＶＤＡは、南アフリカ樹木であるアフリカブッシュウィロウ（Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ ｃａｆｆｒｕｍ）の根皮から単離された天然細胞***抑制剤であるコンブレスタチンである（Ｃｉｒｃａ ａｎｄ Ｍａｎｎ、２００３年；Ｔｏｚｅｒ他、２００１年）。これらの化合物のうち最も強力なものは、抗腫瘍薬であるコンブレタスタチンＡ−４（ＣＡ４）である。プロドラッグがＣＡ４−リン酸塩（ＣＡ４Ｐ）であるＣＡ４は、チューブリン重合の強い阻害を誘導するコルヒチンと同一の部位で内皮細胞中のチューブリンと結合する。ＣＡ４Ｐは、静止細胞でなく、増殖中である内皮細胞の形状の変化、細胞毒性、細胞透過性変化及びアトポーシスを誘発する。ＣＡ４Ｐに特に影響されやすい新しく形成された細胞とは異なり、成熟した細胞の細胞骨格はＣＡ４Ｐに影響されにくい。正常な血管とは異なる、ＣＡ４Ｐに対する腫瘍血管中の内皮細胞の選択的感度は、血栓を形成し、腫瘍の出血性壊死を引き起こす。   Vascular disruptors target in tumors the fragile and relatively newly constructed vasculature associated with tumors (Tozer et al., 2005, Mita et al., 2013). Prototype VDA is a comblestatin, a natural cytostatic, isolated from the root bark of the South African tree Combretum caffrum (Circa and Mann, 2003; Tozer et al., 2001). The most powerful of these compounds is combretastatin A-4 (CA4), which is an antitumor agent. CA4, whose prodrug is CA4-phosphate (CA4P), binds to tubulin in endothelial cells at the same site as colchicine, which induces strong inhibition of tubulin polymerization. CA4P induces changes in the shape of endothelial cells that are proliferating rather than quiescent cells, cytotoxicity, changes in cell permeability and apoptosis. Unlike newly formed cells that are particularly sensitive to CA4P, the cytoskeleton of mature cells is less susceptible to CA4P. The selective sensitivity of endothelial cells in tumor vessels to CA4P, unlike normal vessels, forms a thrombus and causes tumor hemorrhagic necrosis.

ＣＡ４Ｐは、現在様々な固形腫瘍の治療だけでなく、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、視力制限病態（Ｎａｎｂｕ他、２００３年：Ｅｉｃｈｌｅｒ他、２００６年）の治療として複数の臨床試験において評価中である。ＡＭＤは、基礎病理の一部として血管の過成長を特徴とする（Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ及びＨａｃｋｃｔｔ．２００３年）。さらに最近、抗血管新生剤、例えば新たな血管の形成を予防して腫瘍の成長を制限するベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ^TM）が一部の癌に対し承認されており、固形腫瘍の治療に広く使用されている。ベバシズマブと機序が関連した抗血管新生剤、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ^TM）は、ＡＭＤの治療に使用される。 CA4P is currently being evaluated in clinical trials as a treatment for various solid tumors, as well as for age-related macular degeneration (AMD), vision-restricted conditions (Nanbu et al., 2003: Eichler et al., 2006) . AMD is characterized by vascular overgrowth as part of the underlying pathology (Campchiaro and Hackct. 2003). More recently, anti-angiogenic agents, such as bevacizumab (Avastin ^™ ), which prevent the formation of new blood vessels and limit tumor growth, have been approved for some cancers and are widely used in the treatment of solid tumors. Yes. An anti-angiogenic agent, ranibizumab (Lucentis ^™ ), whose mechanism is associated with bevacizumab, is used to treat AMD.

ＶＤＡ及び抗血管新生剤は共に、異なる方法で作用するが、相補的方法として作用する。抗血管新生薬は、新たな血管が形成されないようにする。ＶＤＡとは異なり、抗血管新生剤は既に既存の腫瘍に栄養を供給する血管には作用しない。ＶＤＡは腫瘍内部の血管を分解し、従来の治療法、例えば細胞毒性化学療法、放射線、及び生物製剤に耐性のある腫瘍の中心部分で広範囲な細胞死を誘発する。従って、ＶＤＡは、実証された臨床有効性を有しているが（Ｈａｓａｎｉ及びＬｅｉｇｈｌ、２０１１年；Ｈｉｎｎｅｎ及びＥｓｋｅｎｓ、２００７年；ＭｃＫｅａｇｅ及びＢａｇｕｌｅｙ、２０１０年）、ＶＤＡ治療後のＥＰＣの誘導に対する予備的な証拠が、最近ＶＤＡ ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２又はＣＡ４Ｐを用いた第１相臨床試験で報告されている（Ｂｅｅｒｅｐｏｏｔ他、２００６年；Ｆａｒａｃｅ他、２００７年）。また、ＥＰＣ濃度における強力な上昇が、マウスにおける微小管阻害細胞毒性様の血管破壊剤（ＶＤＡ）を用いた治療期間に観察された（Ｓｈａｋｅｄ他、２００６年）。ＥＰＣのこの誘導は、ＶＤＡ治療の有効性を減少させる（Ｄａｅｎｅｎ他、２０１０年）。   Both VDA and anti-angiogenic agents act in different ways, but act as complementary methods. Anti-angiogenic drugs prevent the formation of new blood vessels. Unlike VDA, anti-angiogenic agents do not act on blood vessels that already supply nutrients to existing tumors. VDA breaks down blood vessels inside the tumor and induces extensive cell death in the central part of the tumor that is resistant to conventional therapies such as cytotoxic chemotherapy, radiation, and biologics. Thus, VDA has demonstrated clinical efficacy (Hasani and Leighhl, 2011; Hinnen and Eskens, 2007; McKeage and Baguley, 2010), but a preliminary for induction of EPC after VDA treatment Evidence has recently been reported in phase 1 clinical trials using VDA ZD6126, AVE8062 or CA4P (Beerepot et al., 2006; Face et al., 2007). A strong increase in EPC concentration was also observed during treatment with a microtubule inhibitory cytotoxic-like vascular disrupting agent (VDA) in mice (Shaked et al., 2006). This induction of EPC reduces the effectiveness of VDA treatment (Daenen et al., 2010).

本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、癌の発生率、転移、疾患の進行及び腫瘍の成長／侵襲性の減少のためのＶＤＡ治療と非常に相補的である。本願に記載された通り、本発明の抗Ｉｄ化合物、例えばＡＮＧＸ５１は、ＶＤＡ治療に対するＩｄによって媒介されたＥＰＣ反応を効果的に遮断する。従って、組み合わせによる剤形化及び方法で、ＡＮＧＸ５１は、同様の抗血管新生の有効性でＶＤＡ用量又は投与持続時間の減少を提供し、ＶＤＡによる腫瘍血管破壊に応答してのＥＰＣの増加に関連する血管新生の反動を少なくする。腫瘍を有したマウスのＶＤＡを用いた治療は、ＶＤＡ療法後に特徴的に残る、生存腫瘍の縁に帰巣するＥＰＣの急性の動員をもたらす。Ｉｄ１及びＩｄ３がＥＰＣの産生を促進するため、本発明の抗Ｉｄ化合物によるこのＥＰＣ反動急増の封鎖は、更なる腫瘍関連血管新生を直接的に軽減又は予防し、腫瘍の血流を遮断し、腫瘍の成長を予防する。   The anti-Id compositions and methods of the present invention are highly complementary to VDA therapy for reducing cancer incidence, metastasis, disease progression and tumor growth / invasiveness. As described herein, anti-Id compounds of the present invention, such as ANGX51, effectively block Id-mediated EPC responses to VDA treatment. Thus, in combination dosage forms and methods, ANGX51 provides a reduction in VDA dose or duration of administration with similar anti-angiogenic efficacy and is associated with increased EPC in response to tumor vascular destruction by VDA. Reduce the reaction of angiogenesis. Treatment of tumor-bearing mice with VDA results in an acute mobilization of EPCs homing to the margin of the live tumor that remains characteristic after VDA therapy. Since Id1 and Id3 promote the production of EPC, this blockade of EPC rebound surge by the anti-Id compounds of the present invention directly reduces or prevents further tumor-related angiogenesis, blocks tumor blood flow, Prevent tumor growth.

本願における他の協調的治療組成物及び方法は、癌及び転移媒介のための二次経路として細胞分割を標的とする。タキサンは、母細胞及び娘細胞の間に染色体を分配する細胞内機序を拮抗することによって癌細胞の成長を抑制する。タキサン耐性は、Ｉｄ１を活性化するノッチ信号伝達経路の活性化を伴うと報告されている。抗Ｉｄ１化合物とタキサン（例えば、タクソール又はパクリタキセル）の組み合わせは、この迂回を協調的に予防する。これらの組み合わせ方法は、腫瘍及び他の過剰増殖性細胞集団内の増殖を大きく軽減又は予防する。   Other coordinated therapeutic compositions and methods in this application target cell division as a secondary pathway for mediating cancer and metastasis. Taxanes suppress the growth of cancer cells by antagonizing intracellular mechanisms that distribute chromosomes between mother and daughter cells. Taxane resistance has been reported to involve activation of the Notch signaling pathway that activates Id1. A combination of an anti-Id1 compound and a taxane (eg, taxol or paclitaxel) cooperatively prevents this diversion. These combined methods greatly reduce or prevent growth in tumors and other hyperproliferative cell populations.

本発明の例示の実施形態では、協調的診断及び管理プロトコルは、乳癌又は卵巣癌の治療又は予防が想定される。例えば、乳癌又は卵巣癌の高いリスクを確証するためにＢｒＣＡ１遺伝子試験を用いて、乳癌又は卵巣癌の家族歴がある女性が治療に選択され得る。高リスク対象には、予防的な抗Ｉｄ治療（例えば、（−）−ＡＧＸ５１使用）を数ヶ月、最大１〜２年間、又はさらに長期間提供し、手術後には疾患の再発を予防するために提供する。その期間、定期的に全身のＩｄ濃度を測定する。Ｉｄが微量又は測定不能なものを超える濃度で検出される時、任意に化学療法で補助しながら、抗Ｉｄ治療は続けられるか又は増やされる。   In an exemplary embodiment of the invention, a coordinated diagnosis and management protocol is envisaged for the treatment or prevention of breast or ovarian cancer. For example, women with a family history of breast cancer or ovarian cancer can be selected for treatment using the BrCA1 gene test to establish a high risk of breast cancer or ovarian cancer. To provide high-risk subjects with prophylactic anti-Id therapy (eg, using (-)-AGX51) for months, up to 1-2 years, or longer, to prevent recurrence of the disease after surgery provide. During that period, the systemic Id concentration is measured periodically. When Id is detected at concentrations above trace amounts or not measurable, anti-Id treatment is continued or increased, optionally supplemented with chemotherapy.

本発明の治療に適している他の患者は、女性ヒトの通常のマンモグラフィーによって***の腫瘍について陽性であると識別され、腫瘍切除及び場合によって放射線療法が続く患者である。例えば、リンパ節で癌細胞が全く確認されない場合、抗Ｉｄ化合物は疾患の再発に対する保護を提供するために最大１年又はそれ以上の間、毎日長期間投与される。再発は、薬剤の抗腫瘍、抗転移、アトポーシス促進及び細胞周期制御効果促進のうち１つ以上を通じて予防される。定期的に、他のマーカー（例えば、転移性、内皮細胞、ＥＰＣ及び／又は癌幹細胞マーカー）と任意で組み合わせて全身のＩｄ濃度をその期間に測定する。Ｉｄが微量又は測定不能なものを超える濃度で検出される場合、抗Ｉｄ治療は続けられるか又は増やされる。   Other patients suitable for the treatment of the present invention are those patients identified as positive for breast tumors by normal mammography of female humans, followed by tumor resection and possibly radiation therapy. For example, if no cancer cells are identified in the lymph nodes, the anti-Id compound is administered daily for a long period of up to one year or more to provide protection against disease recurrence. Recurrence is prevented through one or more of drug anti-tumor, anti-metastasis, promotion of apoptosis, and promotion of cell cycle control effects. Periodically, systemic Id concentrations are measured during that period, optionally in combination with other markers (eg, metastatic, endothelial, EPC and / or cancer stem cell markers). If Id is detected at concentrations above trace amounts or not measurable, anti-Id treatment is continued or increased.

追加の協調的診断及び管理プロトコルが、乳癌予防又は既存の***の腫瘍の転移性進行予防のために提供される。患者は、女性ヒトの通常のマンモグラフィーによって***の腫瘍について陽性であると識別され、腫瘍切除及び場合によって放射線療法が続く。癌細胞は対象のリンパ節で確認される。対象には従来のパクリタキセル治療過程（例えば、３週毎に１２週間）が施される。この期間が過ぎると、抗Ｉｄ化合物はパクリタキセルの有効性を最大化するために毎日長期間投与される。抗Ｉｄ治療はパクリタキセル治療後、長期間（例えば、９〜１２ヶ月）続いて、疾患の再発に対して更なる保護を提供する。定期的に、全身Ｉｄ及び任意で他のマーカー濃度をその期間に測定する。Ｉｄが微量又は測定不能なものを超える濃度で検出される場合、抗Ｉｄ治療は続けられるか又は増やされる。   Additional coordinated diagnosis and management protocols are provided for breast cancer prevention or prevention of metastatic progression of existing breast tumors. The patient is identified as positive for a breast tumor by normal mammography of a female human, followed by tumor resection and possibly radiation therapy. Cancer cells are identified in the subject's lymph nodes. Subjects are given a conventional paclitaxel treatment course (eg, every 3 weeks for 12 weeks). After this period, anti-Id compounds are administered daily for long periods of time to maximize the efficacy of paclitaxel. Anti-Id treatment continues for a long time (eg, 9-12 months) after paclitaxel treatment and provides further protection against disease recurrence. Periodically, systemic Id and optionally other marker concentrations are measured during that period. If Id is detected at concentrations above trace amounts or not measurable, anti-Id treatment is continued or increased.

他の協調的診断及び管理プロトコルでは、以前に***の腫瘍について陽性であると通常のマンモグラフィーにより識別され、腫瘍切除（リンパ節で癌が発見されていない）で治療された患者が、腫瘍についての術後２年に検査される（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャニングに続き、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴスキャニング）により）。転移した腫瘍が発見された場合及び／又はリンパ節試験が癌細胞に対して陽性であった場合、対象には従来のタキサン療法（例えば、パクリタキセルを３週毎に１２週間投与）を施し、続いてＩｄ濃度及び記載された任意の他のマーカーの監視と共に抗Ｉｄ化合物を９〜１２ヶ月間、毎日投与し疾患の進行を防止する。   In other coordinated diagnostic and management protocols, patients who were previously identified by normal mammography as positive for breast tumors and treated with tumor resection (no cancer found in lymph nodes) Examined 2 years after surgery (eg, following computed tomography (CT) scanning followed by positron emission tomography (PET scanning)). If a metastatic tumor is found and / or if the lymph node test is positive for cancer cells, the subject is given conventional taxane therapy (eg, paclitaxel administered every 3 weeks for 12 weeks), followed by Anti-Id compounds are administered daily for 9-12 months, together with monitoring of Id concentration and any other markers described to prevent disease progression.

更なる例示の実施形態では、乳癌第３期（転移性）を示す対象が、癌治療及び管理のために選定される。そして、特定された対象は、高用量の放射線及びパクリタキセルの複数回投与を用いた積極的な組み合わせ治療計画を用いて治療される。治療後、組織病理及び／又はバイオスキャン［例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）及び／又は磁気共鳴映像］を用いて、上記一次治療後に検出可能な癌のない患者を識別した。続いて、これらの対象は、いずれかの残っている癌細胞が離れた臓器（例えば、脳又は肝臓）に再播種することを遮断するために、予防的治療計画で抗Ｉｄ化合物により長期的（例えば、数ヶ月、６〜９ヶ月、１〜２年又はそれ以上）治療される。この管理期間に、患者の血液中のＩｄの測定を定期的に行う。測定は治療後にも続けられる。数ヶ月〜１年又はそれ以上の別の管理期間後、Ｉｄ血液濃度は、転移潜在力の増加又は追加の疾患の存在を示す、増加が観察されることもある。続いて、抗Ｉｄ化合物を用いた治療は、非タキサン細胞毒、例えばエピルビシンを用いるもう１つの治療過程と組み合わされる。この治療後、Ｉｄ血液濃度が、転移潜在力又は微細腫瘍の存在に対して許容可能（基準線又は低危険）に一致する値まで減少しないならば、抗Ｉｄ治療は、治療後数年間又はさらに長い期間続く。   In a further exemplary embodiment, subjects exhibiting stage 3 breast cancer (metastatic) are selected for cancer treatment and management. The identified subject is then treated using an aggressive combination treatment plan using multiple doses of high doses of radiation and paclitaxel. After treatment, histopathology and / or bioscan [e.g. computed tomography (CT), positron emission tomography (PET) and / or magnetic resonance imaging] can be used to identify patients without cancer that can be detected after the first treatment. Identified. Subsequently, these subjects may be treated with anti-Id compounds in a prophylactic treatment regime for long-term (to prevent remapping of any remaining cancer cells into distant organs (eg, brain or liver). For example, several months, 6-9 months, 1-2 years or more). During this management period, Id in the patient's blood is periodically measured. Measurement continues after treatment. After another management period of months to a year or more, an increase in Id blood concentration may be observed, indicating increased metastatic potential or the presence of additional disease. Subsequently, treatment with anti-Id compounds is combined with another course of treatment with non-taxane cytotoxins, such as epirubicin. If after this treatment the Id blood concentration does not decrease to a value consistent with an acceptable (baseline or low risk) for metastatic potential or the presence of a fine tumor, anti-Id treatment may be achieved for several years after treatment or even Lasts for a long time.

他の例示の実施形態は、一連の組み合わせ療法を使用する。再発性又は転移性乳癌があると確認された患者をタキサン療法の積極的過程（例えば、５回の単一投与治療でタキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル又はアルブミン結合されたパクリタキセル）を３週毎に１２週間投与）でまず治療する。それには、血管破壊剤（ＶＤＡ）、例えばコンブレタスタチン−Ａ４リン酸塩を追加することができる。これらの療法に組み合わせて、抗Ｉｄ化合物も長期間毎日投与し、タキサン／ＶＤＡ治療の有効性を最大化する。抗Ｉｄ治療は、９〜１２ヶ月又はそれ以上の間、Ｉｄ及び記載された他のマーカー監視と共に続けて疾患の再発又は転移性進行を予防する。あるいは、これらの患者は、本発明の抗Ｉｄ化合物の拡張された、予防的投与によって補強された抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ）、又は抗ＶＥＧＦ受容体拮抗剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ）での２ヶ月毎の又は毎月の治療と組み合わせて、タキサン療法を施されることができる。   Other exemplary embodiments use a series of combination therapies. Patients identified as having recurrent or metastatic breast cancer are treated with an active course of taxane therapy (eg, taxane (eg, paclitaxel, docetaxel or albumin-conjugated paclitaxel) every 3 weeks in 5 single dose treatments) 12 weeks administration). To that end, a vascular disrupting agent (VDA) such as combretastatin-A4 phosphate can be added. In combination with these therapies, anti-Id compounds are also administered daily for long periods of time to maximize the effectiveness of taxane / VDA treatment. Anti-Id treatment continues for 9-12 months or longer along with Id and other described marker monitoring to prevent relapse or metastatic progression of the disease. Alternatively, these patients may be treated with an extended, prophylactic administration of an anti-Id compound of the invention with an anti-VEGF agent (eg, bevacizumab), or an anti-VEGF receptor antagonist (eg, sunitinib, sorafenib). Taxane therapy can be administered in combination with bi-monthly or monthly treatment.

本発明の他の実施形態では、協調的診断及び管理は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体の存在についての検査で陽性である患者に焦点を合わせる。これらの対象に、トラスツズマブ（ハーセプチン）での２ヶ月毎の又は毎月の治療と共に従来のタキサン療法を施すことができ、記載された毎日の抗Ｉｄ化合物治療が補助するか又は続く。抗Ｉｄ治療は、タキサン治療後６〜１２ヶ月間続き、疾患の再発に対する更なる保護を提供する。   In other embodiments of the invention, coordinated diagnosis and management focuses on patients who test positive for the presence of HER2 / neu receptors. These subjects can be given conventional taxane therapy with bimonthly or monthly treatment with trastuzumab (Herceptin), supplemented or followed by the daily anti-Id compound treatment described. Anti-Id treatment lasts 6-12 months after taxane treatment and provides additional protection against disease recurrence.

本発明の臨床管理方法はまた、さらに特異的な癌、例えば、エストロゲン及びプロゲステロン受容体陰性***の腫瘍の治療に適用できる。本願における例示のプロトコルは、腫瘍切除及び放射線治療を用いることができ、化学療法（例えば、３週毎に１２週間パクリタキセル及びドキソルビシンを使用）が続き、毎日の抗Ｉｄ療法が化学療法に伴われるか又は化学療法に続く（疾患の再発の予防のために化学療法以後の長期間の継続）。   The clinical management methods of the present invention are also applicable to the treatment of more specific cancers, such as estrogen and progesterone receptor negative breast tumors. Exemplary protocols in this application can use tumor resection and radiation therapy, followed by chemotherapy (eg, using paclitaxel and doxorubicin every 12 weeks for 12 weeks), with daily anti-Id therapy accompanied by chemotherapy Or follow chemotherapy (long-term continuation after chemotherapy to prevent disease recurrence).

他の難治性の事例では、癌患者はタキサン化学療法（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル又はアルブミン結合されたパクリタキセル使用）を用いて協調的に治療され、同時又は続くシスプラチン治療で補助され、抗Ｉｄ療法がタキサン療法に続き、６〜１２ヶ月又はそれ以上に及んで疾患の再発に対して保護する。   In other refractory cases, cancer patients are treated cooperatively with taxane chemotherapy (eg, using paclitaxel, docetaxel or albumin-conjugated paclitaxel), assisted by concurrent or subsequent cisplatin treatment, and anti-Id therapy is Following taxane therapy, protect against disease recurrence for 6-12 months or longer.

同様の協調的診断及び管理プロトコルが、他の形態の癌治療に対して提供される。例えば、前立腺癌患者は癌の進行ステップ及び転移危険を反映するグリーソン（Ｇｌｅｅｓｏｎ）スコアを提供するＰＳＡスクリーニング及び／又は生検に基づいて選択される。リスクの高い対象は、放射線及び化学療法で治療され、上述されたように拡張された抗Ｉｄ治療及び監視が組み合わされるか又は続く。この治療は、従来の抗アンドロゲン療法と協調し得る。   Similar coordinated diagnostic and management protocols are provided for other forms of cancer treatment. For example, prostate cancer patients are selected based on PSA screening and / or biopsy that provides a Gleeson score that reflects the cancer progression steps and risk of metastasis. High-risk subjects are treated with radiation and chemotherapy and combined or followed by extended anti-Id treatment and monitoring as described above. This treatment can be coordinated with conventional antiandrogen therapy.

上皮内黒色腫の治療のための協調的診断及び管理プロトコルには、局所タキサン治療が含まれ、本発明の治療又は予防用抗Ｉｄ治療が同時又はそれに続いて組み合わされることができる。   Coordinated diagnostic and management protocols for the treatment of intraepithelial melanoma include topical taxane therapy, and the therapeutic or prophylactic anti-Id therapy of the present invention can be combined simultaneously or subsequently.

カポシ肉腫の治療のための協調的診断及び管理プロトコルには、病巣内又は局所的タキサン治療が含まれ、本発明の治療又は予防用抗Ｉｄ治療が同時又はそれに続いて組み合わされることができる。この及び他の協調的治療方法は、任意で同時又はそれに続くインターフェロンアルファ治療を含み得る。   Coordinated diagnostic and management protocols for the treatment of Kaposi's sarcoma include intralesional or topical taxane therapy, and the therapeutic or prophylactic anti-Id therapy of the present invention can be combined simultaneously or subsequently. This and other collaborative treatment methods may optionally include simultaneous or subsequent interferon alpha treatment.

更なる追加の協調的診断及び管理方法は、本願における教示に従って、検討及び通常に実施され、限定ではないが、膀胱癌、結腸癌、膵臓癌、肺癌、脳癌、食道癌及び白血病を含む癌及び他の増殖性疾患の全ての種類及び進行度を含む。   Additional additional coordinated diagnosis and management methods are reviewed and routinely performed in accordance with the teachings herein, including but not limited to cancers including bladder cancer, colon cancer, pancreatic cancer, lung cancer, brain cancer, esophageal cancer and leukemia. And all types and degrees of progression of other proliferative diseases.

本発明の全ての協調的治療方法で、既知の有効な化学療法剤の全薬剤が、全範囲の血管破壊剤（ＶＤＡ）と同様に抗Ｉｄ療法と組み合わされることができ、ＨＳＰ９０阻害剤が、組み合わせ製剤中でＡＧＸ５１などの抗Ｉｄ薬と、及び協調的治療計画のいずれかの構成と組み合わされることができ、任意で放射線照射及び手術などの他の介入と組み合わされることができる。   With all the coordinated treatment methods of the present invention, all of the known effective chemotherapeutic agents can be combined with anti-Id therapy as well as the full range of vascular disrupting agents (VDA), and the HSP90 inhibitor can be It can be combined with anti-Id drugs such as AGX51 in a combination formulation, and any configuration of a coordinated treatment plan, and optionally combined with other interventions such as radiation and surgery.

腫瘍切除のための手術及び／又は腫瘍の収縮又は破壊のための放射線治療後、残っている腫瘍細胞からの転移は患者に依然として危険である。これに関し、抗Ｉｄ化合物を用いた続く治療は、この危険を減少させ、この方法で患者生存の機会を増加させる。また、脳癌では、放射線が腫瘍の成長を再供給できる癌幹様細胞を残して低い濃度のＩｄタンパク質を発現する細胞を殺傷する。抗Ｉｄ１製剤を放射線療法と併用すると、この攻撃的で致命的なヒト癌における生存率を増加させると予想される。   After surgery for tumor resection and / or radiation therapy for tumor shrinkage or destruction, metastasis from the remaining tumor cells is still dangerous to the patient. In this regard, subsequent treatment with anti-Id compounds reduces this risk and increases the chances of patient survival in this manner. Brain cancer also kills cells that express low levels of Id protein, leaving cancer stem-like cells where radiation can resupply tumor growth. Anti-Id1 formulations in combination with radiation therapy are expected to increase survival in this aggressive and deadly human cancer.

本発明の他の組成物及び方法は、異常な血管成長又は「病原性血管新生」を特徴とする異なった細胞増殖性疾患を標的にする。これらの疾患標的の例示には、異常な血管成長によってもたらされる眼球疾患（例えば、黄斑変性）、及び腫瘍関連血管新生が含まれる。本発明の抗Ｉｄ化合物は、下記の通り、「抗血管新生」剤としても機能し、腫瘍発生での様々な攻撃を媒介する、かなり強力な腫瘍関連血管新生（即ち、抗転移及び抗血管新生の両方）を含む病原性血管新生の治療又は予防に有用である。多くの癌の種類が、原発及び転移性腫瘍細胞の両方でのＩｄタンパク質の発現に依存し、腫瘍関連血管新生を支援する。本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、腫瘍及びそれが支援する血管を同時に全部標的にする。これらの実施形態では、本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、抗腫瘍（抗転移を含む）及び抗血管新生効果の両方をもたらす。他の抗血管新生剤は、単独では癌治療にわずかな有効性を有しており、多くの場合に治療反応の達成のために細胞毒性化学療法の協調的使用を必要とする。   Other compositions and methods of the invention target different cell proliferative diseases characterized by abnormal blood vessel growth or “pathogenic angiogenesis”. Examples of these disease targets include ocular diseases caused by abnormal blood vessel growth (eg, macular degeneration), and tumor-related angiogenesis. The anti-Id compounds of the present invention also function as “anti-angiogenic” agents, as described below, and are fairly powerful tumor-associated angiogenesis (ie, anti-metastasis and anti-angiogenesis) that mediates various attacks in tumor development. It is useful for the treatment or prevention of pathogenic angiogenesis including both of the above. Many cancer types rely on Id protein expression in both primary and metastatic tumor cells to support tumor-associated angiogenesis. The anti-Id compositions and methods of the present invention simultaneously target all of the tumor and the blood vessels it supports. In these embodiments, the anti-Id compositions and methods of the present invention provide both anti-tumor (including anti-metastasis) and anti-angiogenic effects. Other anti-angiogenic agents alone have little efficacy in cancer treatment and often require coordinated use of cytotoxic chemotherapy to achieve a therapeutic response.

病原性血管新生を伴う疾患治療用組成物及び方法
本発明の更なる実施形態は、いずれかの病原性血管新生若しくは新生血管病態又は疾患を有効に治療又は予防するために抗Ｉｄ化合物、例えばＡＧＸ５１を使用する。例示の病理的血管新生現象は、眼球疾患、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）に関連する。 Compositions and Methods for Treatment of Diseases Associated with Pathogenic Angiogenesis A further embodiment of the invention provides an anti-Id compound, such as AGX51, for effectively treating or preventing any pathogenic angiogenesis or neovascular condition or disease. Is used. An exemplary pathological angiogenesis phenomenon is associated with ocular disease, age-related macular degeneration (AMD).

ＡＭＤは、老人における不可逆的視力喪失の最もありふれた原因である（Ｊａｇｅｒ他、２００８年）。この病態は、眼球血管造影術により脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶ）及び非ＣＮＶ成分に区分され得る合成血管病変複合体により種類が定められる血管新生変化によりほとんど媒介される。ＡＭＤは、結晶腔の形成、ＲＰＥの破壊、ＣＮＶ、円盤状瘢痕の形成及び網膜下線維症を含む臨床及び病理的調査結果のスペクトルを特徴とする。ＡＭＤに対する持続事象は虚血又は酸素欠乏期間後、組織に血液供給が戻る時に引き起こされる眼球組織の慢性的虚血再潅流（Ｉ−Ｒ）負傷と考えられる。虚血性期間の血液からの酸素及び栄養素の欠如は、循環回復が正常機能の回復よりは酸化ストレスの誘導を通じて炎症及び酸化的損傷を引き起こす病態を提供する。過剰の太陽光、汚染、塵及び汚れによる累積する損傷により引き起こされる組織損傷が、Ｉ−Ｒ前の虚血に対する開始事象となるものと考えられる。   AMD is the most common cause of irreversible vision loss in the elderly (Jager et al., 2008). This pathology is mostly mediated by angiogenic changes that are typed by a synthetic vascular lesion complex that can be divided into choroidal neovascular membrane (CNV) and non-CNV components by ocular angiography. AMD is characterized by a spectrum of clinical and pathological findings including crystal cavity formation, RPE destruction, CNV, discoid scar formation and subretinal fibrosis. A sustained event for AMD is considered a chronic ischemic reperfusion (IR) injury of the ocular tissue that is caused when the blood supply returns to the tissue after an ischemia or hypoxia period. The lack of oxygen and nutrients from the blood during the ischemic period provides a pathology in which circulatory recovery causes inflammation and oxidative damage through induction of oxidative stress rather than restoration of normal function. Tissue damage caused by cumulative damage due to excessive sunlight, contamination, dust and dirt is believed to be the starting event for pre-IR ischemia.

ＡＭＤは、２つの形態、非滲出性（乾燥）及び滲出性（新生血管又は湿性）を有する。現在、米国における湿性ＡＭＤの波及は、１２０〜１５０万件と推定され、２００，０００件の新たな事例が毎年発生している。ＡＭＤは、老化疾患であるため、ＡＭＤがあるヒトの数は、ヒトがより長く生存し、ベビーブーム出生者が老化していくほど実質的に増加する見通しである。２０３０年まで、５００，０００件のＡＭＤが毎年診断されると推定される（Ｓｅｄｄｏｎ他、２００４年）。   AMD has two forms, non-exudative (dry) and exudative (neovascular or wet). Currently, the spread of wet AMD in the United States is estimated at 1.2 to 1.5 million, with 200,000 new cases occurring each year. Because AMD is an aging disease, the number of people with AMD is expected to increase substantially as humans survive longer and baby boomers age. Until 2030, it is estimated that 500,000 AMD are diagnosed annually (Seddon et al., 2004).

最近承認された抗ＶＥＧＦ治療は、ＡＭＤ治療において大きな躍進を示す（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他、２００６年；Ｂｒｏｗｎ他、２００９年）。有用な薬剤には、ラニビズマブ、注射用抗ＶＥＧＦ ｆａｂフラグメントが含まれ、これらはそれぞれ９５％及び４０％の患者で視力喪失の反転を安定化するか、又は媒介すると報告されている。前記薬剤で治療した患者の大多数は、視力回復を経験することができず、治療に対して陽性反応を有した患者は正常に運転又は読書する能力を再度得ることはできなかった。ベバシズマブ、注射用の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を用いた結果が相当するとして示された（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他、２００５年）。   Recently approved anti-VEGF therapy represents a major breakthrough in AMD therapy (Rosenfeld et al., 2006; Brown et al., 2009). Useful drugs include ranibizumab, an injectable anti-VEGF fab fragment, which are reported to stabilize or mediate reversal of vision loss in 95% and 40% of patients, respectively. The majority of patients treated with the drug failed to experience vision recovery, and patients with a positive response to treatment were unable to regain the ability to drive or read normally. Results with bevacizumab, an anti-VEGF monoclonal antibody for injection, have been shown to be comparable (Rosenfeld et al., 2005).

抗ＶＥＧＦ療法は、実際にＣＮＶ病変が著しく元の状態に戻らないため、網膜内及び網膜下浮腫の解決を引き起こす抗透過性作用を通じてほとんどのその有益な有効性を発揮するようである（Ｅｉｃｈｌｅｒ他、２００６年）。しかし、滲出性ＡＭＤ関連の視力喪失は、単独で脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）誘導された網膜下及び網膜内浮腫によるものではない。また、目における汎ＶＥＧＦ阻害の長期間の安全性は、まだ確立していない。感覚神経網膜で数多くの細胞により産生されたＶＥＧＦは、自然において神経保護性であり、慢性的阻害がニューロンの健康に障る（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ他、２００５年）。また、ＶＥＧＦは、ＲＰＥ細胞により構成的に発現され、休止脈絡膜毛細血管層の内皮に対する生存因子であるため（Ｗｉｔｍｅｒ他、２００３年）、長期間のＶＥＧＦ阻害は、この生命維持に必須の構造及び代謝支援のためにそれに依存する細胞に致命的であるという点を示唆する。慢性的抗ＶＥＧＦ治療の安全性に関して、抗ＶＥＧＦ治療で７年間治療を受けた患者の最近の再評価は、黄斑萎縮症が眼の９８％でフルオレセイン血管造影術により検出され、萎縮症の領域が劣悪な視覚結果と著しく関わっていることが報告されている（Ｒｏｆａｇｈａ他２０１３年）。湿性ＡＭＤに対するより良い治療手段に対する必要をさらに強調すると、７年間の抗ＶＥＧＦ治療後の患者の後続評価は、患者の三分の一がスネレンチャート試験上で１５文字以上下落し、視力において劣悪な結果を提供すると知られている（Ｒｏｆａｇｈａ他、２０１３年）。   Anti-VEGF therapy seems to exert most of its beneficial efficacy through anti-permeability effects that cause resolution of intraretinal and subretinal edema, as CNV lesions do not actually revert significantly (Eichler et al. 2006). However, exudative AMD-related visual loss is not due to choroidal neovascularization (CNV) -induced subretinal and intraretinal edema alone. Moreover, the long-term safety of pan-VEGF inhibition in the eye has not yet been established. VEGF produced by numerous cells in the sensory nerve retina is neuroprotective in nature, and chronic inhibition impairs neuronal health (Greenberg et al., 2005). In addition, since VEGF is constitutively expressed by RPE cells and is a survival factor for the endothelium of the resting choroidal capillary layer (Witmer et al., 2003), long-term VEGF inhibition is essential for maintaining this life and It suggests that it is lethal to cells that depend on it for metabolic support. Regarding the safety of chronic anti-VEGF treatment, a recent reassessment of patients treated with anti-VEGF treatment for 7 years shows that macular atrophy is detected by fluorescein angiography in 98% of the eyes and the area of atrophy is It has been reported to be significantly associated with poor visual outcome (Rofhaha et al 2013). Further emphasizing the need for better treatment for wet AMD, the patient's subsequent assessment after 7 years of anti-VEGF treatment showed that one-third of patients fell by more than 15 characters on the Snellen chart test, resulting in poor vision (Rofhaha et al., 2013).

ほとんどの眼球病態の治療のために一般的に使用される抗ＶＥＧＦ剤は、注射用ラニビズマブ、注射用アフリバーセプト、及び注射用ベバシズマブである。また、湿性ＡＭＤの他にも、これらの製剤は網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）又は網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）による黄斑浮腫の治療だけでなく糖尿病性網膜症による黄斑浮腫の治療用に使用される。また、抗ＶＥＧＦ剤の他にも、複数の臨床試験で血管破壊剤（ＶＤＡ）、ＣＡ−４リン酸塩がＡＭＤに対する有望な治療として評価される（Ｅｉｃｈｌｅｒ他、２００６年）。   Commonly used anti-VEGF agents for the treatment of most ocular conditions are ranibizumab for injection, aflircept for injection, and bevacizumab for injection. In addition to wet AMD, these formulations are not only used to treat macular edema due to central retinal vein occlusion (CRVO) or branch retinal vein occlusion (BRVO), but also for the treatment of macular edema due to diabetic retinopathy. used. In addition to anti-VEGF agents, vascular disruptors (VDA) and CA-4 phosphate are evaluated as promising treatments for AMD in several clinical trials (Eichler et al., 2006).

また、二つの手術過程、レーザー光凝固及び光力学治療が、ＡＭＤ、特に湿性ＡＭＤの必然的な病理である眼球病変の除去に時々使用される（Ｃｏｏｋ他、２００８年）。   In addition, two surgical processes, laser photocoagulation and photodynamic therapy, are sometimes used to remove ocular lesions that are an inevitable pathology of AMD, particularly wet AMD (Cook et al., 2008).

滲出性ＡＭＤの正確な病因及び発病は依然として広く知られていないが、様々な要因で組織化される血管及び血管外成分からなるものと考えられる（Ｔｅｚｅｌ他、２００４年；Ａｍｂａｔｉ他、２００３年）。しかし、ＡＭＤは、基礎病理の一部として血管の過成長を特徴とする（Ｃａｍｐｃｈｉａｒｏ他、２００３年）。滲出性ＡＭＤの血管成分は血管内皮細胞、内皮細胞前駆体及び血管周囲細胞を含んでなる。ＶＥＧＦは、血管成分の発病で重要なメディエーターのようである。しかし、脈絡膜血管の成長はＶＥＧＦだけでなく、数多くの他の製剤中における共同作用の相互作用を伴う。血管過程で追加要素の標的化は、全体の過程を調節する機会を提供する。組織損傷は、疾患過程の血管又は血管外成分から引き起こされ得る。血管外成分は、多くの場合に容積上最大の成分のようであり、組織病理により血管新生刺激の供給源のようである。この血管外成分は、主に炎症細胞及び稀には線維芽細胞及び神経膠又はＲＰＥからなる。マクロファージ及び補体システムは、現在ＣＮＶ誘発及び滲出性ＡＭＤの発病の播種において重要な役割を果たすことが知られている（Ｂｕｓｈｉｎｉ他、２０１１年；Ｇｏｌｄ他、２００６年；Ｋｌｅｉｎ他、２００５年；Ｈａｇｅｍａｎ他、２００５年；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ他、２００３年；Ｅｓｐｉｎｏｓａ−Ｈｅｉｄｍａｎｎ他、２００５年；Ｏｈ他、１９９９年；Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ他、２００２年；Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ他、２００３年）。さらに、老化中である眼球マクロファージにおける様々な生化学的変化は明らかなものであり、即ち、サイトカインＩＬ−１２は少なくなりつつ、サイトカインＩＬ−１０は増加し（Ｊａｇｅｒ他、２００７年）外傷誘導血管新生の全般的にあまり強力ではない緩和を誘導する［ＩＬ−１２は、そのＩＦＮ−γの上方制御を通じて強力に抗血管新生性であり（Ｄａｃｅ他、２００８年）、ＩＬ−１０は、血管新生促進性である（Ｋｅｌｌｙ他、２００７年）］。これらの変化は、ＡＭＤの顕著な老化依存性に対する説得力のある説明を提供する。   The exact etiology and pathogenesis of wet AMD is still not widely known, but is thought to consist of vascular and extravascular components organized by various factors (Tzel et al., 2004; Ambati et al., 2003). . However, AMD is characterized by vascular overgrowth as part of the underlying pathology (Campchiaro et al., 2003). The vascular component of exudative AMD comprises vascular endothelial cells, endothelial cell precursors and perivascular cells. VEGF appears to be an important mediator in the pathogenesis of vascular components. However, choroidal vessel growth involves not only VEGF but also synergistic interactions in many other formulations. Targeting additional elements in the vascular process provides an opportunity to regulate the entire process. Tissue damage can be caused by blood vessels or extravascular components of the disease process. Extravascular components often appear to be the largest components in volume and appear to be a source of angiogenic stimuli due to histopathology. This extravascular component consists mainly of inflammatory cells and rarely fibroblasts and glia or RPE. Macrophages and the complement system are now known to play an important role in the dissemination of CNV-induced and exudative AMD pathogenesis (Bushini et al., 2011; Gold et al., 2006; Klein et al., 2005; Hageman 2005; Tsutsusumi et al., 2003; Espinosa-Heidmann et al., 2005; Oh et al., 1999; Grossniklaus et al., 2002; Forrester et al., 2003). In addition, various biochemical changes in aging ocular macrophages are evident, ie, cytokine IL-12 is decreased while cytokine IL-10 is increased (Jager et al., 2007). [IL-12 is strongly anti-angiogenic through its up-regulation of IFN-γ (Dace et al., 2008) and IL-10 is angiogenic It is facilitating (Kelly et al., 2007)]. These changes provide a compelling explanation for the marked aging dependence of AMD.

前述した議論に照らして、滲出性ＡＭＤの治療のための新たな治療法に対する至急かつ満たされていない医学的必要が存在する。抗ＶＥＧＦ療法の最近表れた限界を考慮する時、これらの新たな治療剤は最終的に滲出性ＡＭＤを誘導するＣＮＶの発生で非ＶＥＧＦ依存ステップを標的とすべきである。Ｉｄを標的にすることは、ＡＭＤに関する病変の基底にある血管新生過程媒介におけるＩｄ、特にＩｄ１及びＩｄ３の根本的な役割のため、そのような標的を意味する。   In light of the foregoing discussion, there is an urgent and unmet medical need for new therapies for the treatment of wet AMD. When considering the emerging limitations of anti-VEGF therapy, these new therapeutic agents should target non-VEGF-dependent steps in the development of CNV that ultimately induce wet AMD. Targeting Id means such a target because of the fundamental role of Id, particularly Id1 and Id3, in mediating the angiogenic process underlying the pathology for AMD.

一態様で、本発明は、新生物を提示する対象に単一薬剤又は治療方法を使用する単一療法プロトコルで有効量の抗Ｉｄ化合物を投与することを含む病理的眼球血管新生の抑制方法を提供する。関連した実施形態では、本発明の治療方法には前記対象に対する二次治療薬、治療法又は治療方法と共に有効量の抗Ｉｄ化合物の投与が含まれる（例えば、対象に抗Ｉｄ化合物を、例えば下記から選択される二次治療法又は製剤と同時に又は順次に処理することによる：抗ＶＥＧＦ剤、ＶＤＡ、インターフェロン−γ（Ｎａｌｄｉｎｉ他、２００５年）、強力な抗血管新生サイトカイン、又はインターフェロン−γを誘導する製剤、例えば、ＩＬ−１２（Ｄｅｌ Ｖｅｃｃｈｉｏ他、２００７年及びＫｌｅｉｎｍａｎ他、２００８年）。   In one aspect, the invention provides a method for inhibiting pathological ocular neovascularization comprising administering to a subject presenting a neoplasm an effective amount of an anti-Id compound in a single therapy protocol using a single agent or method of treatment. provide. In related embodiments, the therapeutic methods of the invention include the administration of an effective amount of an anti-Id compound together with a second therapeutic agent, therapeutic method or method of treatment to the subject (eg, subject to an anti-Id compound, eg, Inducing anti-VEGF agents, VDA, interferon-γ (Naldini et al., 2005), potent anti-angiogenic cytokines, or interferon-γ Such as IL-12 (Del Vecchio et al., 2007 and Kleinman et al., 2008).

特定の「協調的療法」又は「併用治療」の実施形態では、本発明は、組み合わせによる抗成長活性を有した二次薬剤、化合物又は化学製剤と同時に（例えば、同時に又は組み合わせた製剤で投与）投与される抗Ｉｄ化合物を使用することができる。例示の実施形態では、二次化学療法薬は例えば、抗ＶＥＧＦ剤又は、ＶＤＡ、インターフェロン−γから選択される。これらの及び関連した実施形態では、抗Ｉｄ化合物及び二次薬剤は「組み合わせによって有効」であり、これは本願に定義された生物活性、例えば抗成長又は抗血管新生活性、副作用、患者の結果、又は他の実際的な治療指標が抗Ｉｄ化合物又は二次薬剤単独で治療した関連対照対象から観察された結果に比べて改善されたことを意味する。   In certain “coordinated therapy” or “combination treatment” embodiments, the invention contemplates a secondary agent, compound or chemical formulation that has combined anti-growth activity (eg, administered simultaneously or in a combined formulation). The administered anti-Id compound can be used. In an exemplary embodiment, the secondary chemotherapeutic agent is selected from, for example, an anti-VEGF agent or VDA, interferon-γ. In these and related embodiments, the anti-Id compound and the secondary agent are “effective by combination”, which is a biological activity as defined herein, eg, anti-growth or anti-angiogenic activity, side effects, patient outcome. Or other practical therapeutic index has been improved relative to the results observed from related control subjects treated with anti-Id compounds or secondary agents alone.

ＡＭＤ及び他の病原性新生血管又は血管新生病態の治療のための全ての既知の治療薬及び方法が、本発明の抗Ｉｄ化合物、例えばＡＧＸ５１を使用する特定の組み合わせ製剤及び協調的治療方法において有用である。特定の実施形態では、抗Ｉｄ化合物は、抗ＶＥＧＦ剤、ＶＤＡ、及び／又はインターフェロン−γと共に用いられ、これらの相補的治療薬の用量及び／又は副作用を低減し、これを共に使用することによる協調的臨床利益を維持するという利点を伴う。例えば、抗ＶＥＧＦ剤及び／又はＶＤＡの協調的使用に伴う抗Ｉｄ療法は、示された治療のための抗ＶＥＧＦ剤及び／又はＶＤＡ薬の従来の用量よりも低い量を使用して、組み合わせの有効性は、全用量の従来の抗ＶＥＧＦ剤及び／又はＶＤＡよりも大きく、そして長期間の視力喪失などの副作用が減少する。   All known therapeutic agents and methods for the treatment of AMD and other pathogenic neovascular or angiogenic conditions are useful in certain combination formulations and coordinated therapeutic methods using anti-Id compounds of the present invention, such as AGX51 It is. In certain embodiments, anti-Id compounds are used in conjunction with anti-VEGF agents, VDA, and / or interferon-γ to reduce the dose and / or side effects of these complementary therapeutics and use them together. With the advantage of maintaining coordinated clinical benefits. For example, anti-Id therapies associated with coordinated use of anti-VEGF agents and / or VDAs can be combined using lower amounts than conventional doses of anti-VEGF agents and / or VDA agents for the indicated treatment. Efficacy is greater than full doses of conventional anti-VEGF agents and / or VDA, and side effects such as prolonged vision loss are reduced.

特定の実施形態では、本発明の抗血管新生組成物及び方法は、哺乳動物対象における病理的眼球血管新生の減少に有効である。これらの方法は、単一療法又は上記のような協調的療法を使用することができる。本発明の方法（及び関連した化合物及び組成物）は「抗血管新生に有効」であり、例えば、ＡＭＤを示す対象の眼球組織における血管病変の発生率、大きさ、又は数を減少させる。特定の実施形態では、「血管新生の減少」は、観察されるＡＭＤ病変の大きさの組織病理学的又は眼球血管造影指標における減少、例えば、二次眼球部位で観察される病変又は病変の「巣」の発生率、大きさ、数又は分布減少に該当する。他の態様では、抗血管新生有効性はＡＭＤの有効な予防及び／又は治療と関係がある肯定的な変化、例えば、抗Ｉｄ化合物が提供されていない適した対照対象に比べ、抗Ｉｄ化合物を提供された対象に対して、疾患がないか又は疾患が安定した病態の期間の増加により明らかにされる。   In certain embodiments, the anti-angiogenic compositions and methods of the invention are effective in reducing pathological ocular neovascularization in a mammalian subject. These methods can use monotherapy or coordinated therapy as described above. The methods (and related compounds and compositions) of the present invention are “effective in anti-angiogenesis” and, for example, reduce the incidence, size, or number of vascular lesions in ocular tissues of subjects exhibiting AMD. In certain embodiments, a “reduced angiogenesis” is a decrease in the size of the observed AMD lesion in a histopathological or ocular angiographic index, eg, a “pathology or lesion observed in a secondary eye site”. This corresponds to a decrease in the incidence, size, number or distribution of nests. In other embodiments, the anti-angiogenic efficacy is a positive change associated with effective prevention and / or treatment of AMD, eg, anti-Id compounds compared to a suitable control subject that has not been provided with anti-Id compounds. For a given subject, this is manifested by an increase in the duration of the disease state in which the disease is absent or stable.

本発明の化合物、組成物及び方法の抗ＡＭＤ病変有効性、即ち、腎血管病変複合体の成長を減らすか、又は安定化する有効性は、日常的にその基礎病理の一部として有害な血管新生がある眼球病態（又は任意の他の病原性病態）に対して治療した患者において、実質的な治療的利点及び向上した治療結果を提供する。例示の実施形態では、本発明の抗Ｉｄ方法又は組成物で治療した患者は、有害な副作用における無増加又は減少が観察される、改善された治療結果を示す。本発明のこの有益、方法の例証は１つ以上の肯定的な臨床治療的指標における２０％以上の増加、例えば、ＡＭＤ病変指標における有益な変化（例えば、二次眼球部位で観察される病変又は原発病変の「巣」の発生率、大きさ、数又は分布における減少）を提供する。例示の実施形態では、抗Ｉｄ化合物及び方法の抗ＡＭＤ病変有効性は、適した対照の患者（抗Ｉｄ化合物で治療していない）で決定された生存に比べ、Ｉｄ治療患者に対して無疾患又は疾患安定病態の２０％以上の増加率で間接的に立証できる。他の実施形態では、本発明の抗Ｉｄ化合物、製剤及び方法は、より一層大きい抗ＡＭＤの臨床的有益性、例えば、１０年以上のより長い寛解を含み６ヶ月〜１年、１〜２年、２〜５年、５年以上の間観察された一次ＡＭＤ病変の全体の寛解を含み、実際的な治療指標における２０〜５０％の増加率、５０〜９０％の増加率、最大７５％〜１００％の増加率を結果として提供する。例示の実施形態では、本発明の抗Ｉｄ方法又は組成物は、例えば、非治療又は偽薬治療対象に対する抗Ｉｄ治療で、比較組織病理、眼球血管造影術、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）又はもう１つの眼球映像化技術により実証された通り、病変の大きさにおいて２０％以上の病変の大きさの減少、２０％〜５０％、５０％〜７５％、最大９０％以上の病変の大きさの減少を提供するのに有効な抗ＡＭＤである。   The anti-AMD lesion efficacy of the compounds, compositions and methods of the present invention, i.e., the ability to reduce or stabilize the growth of the renal vascular lesion complex, is routinely a deleterious vessel as part of its underlying pathology. In patients treated for an ocular condition (or any other pathogenic condition) with neoplasia, it provides substantial therapeutic benefits and improved therapeutic results. In an exemplary embodiment, patients treated with an anti-Id method or composition of the invention exhibit improved treatment results in which no increase or decrease in adverse side effects is observed. An illustration of this beneficial method of the invention is an increase of 20% or more in one or more positive clinical therapeutic indicators, such as beneficial changes in AMD lesion indicators (eg, lesions observed at secondary eye sites or Providing a reduction in the incidence, size, number or distribution of the “nest” of the primary lesion. In an exemplary embodiment, the anti-AMD lesion efficacy of anti-Id compounds and methods is disease-free for Id-treated patients compared to survival as determined in suitable control patients (not treated with anti-Id compounds). Alternatively, it can be indirectly proved at an increase rate of 20% or more of the disease stable condition. In other embodiments, the anti-Id compounds, formulations and methods of the present invention comprise a greater anti-AMD clinical benefit, eg, 6 months to 1 year, 1 to 2 years, including longer remissions of 10 years or more. , Including an overall remission of primary AMD lesions observed for 2-5 years, over 5 years, with a 20-50% increase in practical treatment index, 50-90% increase, up to 75% A 100% increase rate is provided as a result. In exemplary embodiments, the anti-Id methods or compositions of the invention are, for example, anti-Id treatments for non-treated or placebo-treated subjects, such as comparative histopathology, ocular angiography, optical coherence tomography (OCT), or another As demonstrated by two eye imaging techniques, lesion size reduction of more than 20% in lesion size, 20% -50%, 50% -75%, up to 90% reduction in lesion size Is an anti-AMD that is effective in providing

本願に示された全ての実施形態のそれぞれが、抗ＡＭＤ有効性は、通常は抗Ｉｄ治療患者と陽性対照の治療対象との間において、ＡＭＤの観察される症状、例えば、視力喪失での増加なし又は減少と相関する。例示の実施形態では、抗Ｉｄ化合物の単一療法で治療した対象、及び組み合わせ方法、例えば抗Ｉｄに加えて抗ＶＥＧＦ療法で治療した対象を含む抗Ｉｄ治療対象が、スネレンチャートスコアで無増加を示し、多くは従来の（例えば、抗ＶＥＧＦ）療法で治療した陽性対照対象に比べてスネレンチャートスコアにおいて少なくとも２０％の増加率、２０〜５０％の増加率、最大５０〜９０％又はそれ以上の増加を示す。   All of the embodiments shown in the present application show that anti-AMD effectiveness is usually increased between anti-Id treated patients and positive control subjects with observed symptoms of AMD, eg, loss of vision. Correlate with none or decrease. In exemplary embodiments, subjects treated with anti-Id compound monotherapy and combinations of methods, eg, subjects treated with anti-Id plus anti-VEGF therapy, have no increase in Snellen chart score. Many exhibit at least a 20% increase in snellen chart score compared to positive control subjects treated with conventional (eg anti-VEGF) therapy, an increase of 20-50%, up to 50-90% or more The increase is shown.

診断組成物及び方法、並びに関連した臨床管理手段
特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法による治療について識別された癌患者及び他の対象が、本願で明らかにされた新たな診断及び管理手段を用いる、改善された臨床管理用として評価及び選択される。 Diagnostic Compositions and Methods and Related Clinical Management Tools In certain embodiments, cancer patients and other subjects identified for treatment with the compositions and methods of the present invention are subject to the new diagnosis and management disclosed herein. Assessed and selected for improved clinical management using means.

一実施形態では、対象が本願に提供された新たなＩｄ診断方法及びキットを用いる抗Ｉｄ組成物及び方法を用いる治療に選択される。任意のこれらの方法及び物質が高いＩｄ濃度（例えば、血液又は生検腫瘍試料で測定されるＩｄ１）の検出及び追跡を提供し、これは抗Ｉｄ治療を開始、継続、減少又は増加させる決定と関連する。特定の実施形態では、これらの診断方法には他の疾患指標（例えば、癌、又は転移、又は血管新生病理の生化学的又は組織学的マーカー）の存在に対して対象を診断して疾患評価及び管理を高める協調的診断の価値を提供することを含み得る。   In one embodiment, the subject is selected for treatment with an anti-Id composition and method using the new Id diagnostic methods and kits provided herein. Any of these methods and substances provide detection and tracking of high Id concentrations (eg, Id1 measured in blood or biopsy tumor samples), which is a decision to start, continue, decrease or increase anti-Id therapy Related. In certain embodiments, these diagnostic methods include diagnosing the subject for the presence of other disease indicators (eg, cancer, or metastasis, or a biochemical or histological marker of angiogenic pathology) to assess disease. And providing the value of collaborative diagnostics that enhance management.

高いＩｄ１濃度は、ＥＭＴの上皮表現型への復帰を誘導し、これは転移性部位の定着に必要である。癌患者における他の疾患衝撃と共にＩｄ濃度の減少及び伴う転移性経路及び細胞活性の伴う封鎖を実施するための強力な手段としてＩｄ１及びＩｄ３を緩和（即ち、その発現、活性又は機能を損傷又は抑制）する治療が本願で立証される。これらの方法で用いられる新たな抗Ｉｄ化合物の用量、治療持続時間及び有効性はＩｄ濃度における変化（これらの方法では多くの場合抗Ｉｄ治療における変化に直接的に応答）を監視して反射的に明らかにされる。従って、本発明の新たな治療方法は、任意の関連した試験試料、例えば細胞（例えば、腫瘍細胞、ＥＰＣ、癌幹細胞）、組織又は器官（例えば、新生物、転移、試験の生検試料、リンパ節）又は生体流体（例えば、血液、ＣＮＳ流体、リンパ流体）に集中することができる、内因性Ｉｄ濃度の相応する診断及び反射的な（臨床管理）監視に対する必要を創出する。   High Id1 concentrations induce the reversion of EMT to the epithelial phenotype, which is necessary for the establishment of metastatic sites. Mitigates Id1 and Id3 (ie, damages or suppresses its expression, activity or function) as a powerful means to implement a reduction in Id concentration and accompanying sequestration with metastatic pathways and cellular activity along with other disease impacts in cancer patients ) Is demonstrated in this application. The dose, duration of treatment and efficacy of new anti-Id compounds used in these methods are reflective by monitoring changes in Id concentration (these methods often respond directly to changes in anti-Id treatment). Will be revealed. Thus, the new treatment methods of the present invention can be used in any relevant test sample, eg, cells (eg, tumor cells, EPC, cancer stem cells), tissues or organs (eg, neoplasms, metastases, test biopsy samples, lymph Node) or biological fluids (eg, blood, CNS fluid, lymphatic fluid), creating a need for corresponding diagnostic and reflexive (clinical management) monitoring of endogenous Id concentrations.

本発明の抗Ｉｄ化合物を用いた治療に適している対象の選択は、癌、特に転移性疾患の危険がある患者から取得した生体試料（例えば、血液、小便又は唾液）中のＩｄ１及び／又はＩｄ３の高い濃度の検出により有用に提供される。本発明を用いた補助適用からこの方法でＩｄ濃度を検出する検査の使用は、高いＩｄ濃度を有した特定の患者における生物環境の観察を提供し、高い転移潜在力及びそれに伴う本発明の抗Ｉｄ化合物及び方法を用いる有効な治療に対する重大な必要を示す。   Selection of subjects suitable for treatment with the anti-Id compounds of the present invention includes Id1 and / or in biological samples (eg, blood, urine or saliva) obtained from patients at risk for cancer, particularly metastatic disease. Useful for detection of high concentrations of Id3. The use of a test to detect Id concentrations in this way from an auxiliary application using the present invention provides an observation of the biological environment in certain patients with high Id concentrations, and is associated with the high metastatic potential and associated anti-tumor effects of the present invention. It represents a critical need for effective treatment using Id compounds and methods.

用量及び製剤
一般的に、本発明の治療及び予防方法は、記載されたような抗Ｉｄ化合物又は組成物の「有効量」を使用する。これは細胞、組織、新生物、又は対象における標的化Ｉｄタンパク質（例えば、Ｉｄ１又はＩｄ３）の濃度又は濃度を検出可能に、著しく減少させるのに有効なＡＧＸ５１又は別の抗Ｉｄ化合物の量又は用量を指すことができる。有効性のこの立証は、標準Ｉｄタンパク質検査、例えば、標識されたＩｄ特異的抗体又は他の定量的Ｉｄ検出試薬を用いると容易である。他の実施形態では、本発明の抗Ｉｄ化合物の有効量又は用量がＩｄタンパク質の同族結合パートナーに対するＩｄタンパク質結合（例えば、ｂＨＬＨタンパク質、例えばＥ−４７に対するＩｄ二量化）を測定可能に阻害するのに有効な量又は用量として立証される。この脈絡から、抗Ｉｄ化合物の有効量又は用量を決定する代案的な測定法又は検査には、直接的であれ又は間接的であれ（活性がＩｄ活性又はＩｄ濃度の減少による調節に適用される）、任意の検出可能及び／又は定量化可能なＩｄ活性又は関する生物学的指標（例えば、転移又は腫瘍関連血管新生の組織病理学的又は臨床指標）における減少を媒介する化合物の有効量及び用量が含まれる。従って、この脈絡において抗Ｉｄ組成物及び方法は、試験群及び対照試料の間のアトポーシス又は細胞分化で立証される増加を通じて、細胞増殖における減少、細胞の移動における減少、原発性腫瘍細胞による二次部位定着における減少、腫瘍関連血管新生における減少、ＥＭＴ又はＭＥＴ進行における減少などにより「有効な」ものとして立証できる。 Dosage and Formulation In general, the therapeutic and prophylactic methods of the invention employ an “effective amount” of an anti-Id compound or composition as described. This is the amount or dose of AGX51 or another anti-Id compound effective to detectably and significantly reduce the concentration or concentration of a targeted Id protein (eg, Id1 or Id3) in a cell, tissue, neoplasm, or subject. Can be pointed to. This demonstration of efficacy is easy using standard Id protein tests, eg, labeled Id-specific antibodies or other quantitative Id detection reagents. In other embodiments, an effective amount or dose of an anti-Id compound of the invention measurably inhibits Id protein binding to a cognate binding partner of the Id protein (eg, Id dimerization to bHLH protein, eg, E-47). As an effective amount or dose. In this context, alternative measures or tests to determine the effective amount or dose of an anti-Id compound, whether direct or indirect (activity applies to modulation by reduction in Id activity or Id concentration) ), An effective amount and dose of a compound that mediates a decrease in any detectable and / or quantifiable Id activity or related biological indicator (eg, histopathological or clinical indicators of metastasis or tumor-associated angiogenesis) Is included. Thus, in this context, anti-Id compositions and methods have demonstrated a decrease in cell proliferation, a decrease in cell migration, a secondary by primary tumor cells through an increase evidenced by apoptosis or cell differentiation between test groups and control samples. It can be demonstrated as “effective” by a decrease in site colonization, a decrease in tumor-related angiogenesis, a decrease in EMT or MET progression, and the like.

便宜上、本発明の組成物は、多くの場合「抗細胞増殖性有効量」又は単位用量の抗Ｉｄ化合物、例えば、ＡＧＸ５１を含有するとして言及される。あるいは、組成物は「抗転移用量」の活性抗Ｉｄ化合物を含有する。その他の言及で、活性組成物は「抗血管新生の有効量」又は抗Ｉｄ薬の用量を含有する。   For convenience, the compositions of the invention are often referred to as containing an “anti-cell proliferative effective amount” or unit dose of an anti-Id compound, eg, AGX51. Alternatively, the composition contains an “anti-metastatic dose” of the active anti-Id compound. In other references, the active composition contains an “anti-angiogenic effective amount” or dose of an anti-Id drug.

本発明の抗Ｉｄ化合物は、安定性、送達、吸収、半減期、有効性、薬剤動態、及び／又は薬剤力学を高めて、有害な副作用を減少させ、又は薬学的用途の他の利点を提供できる１つ以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、ビヒクル、乳化剤、安定剤、保存剤、緩衝剤及び／又は他の添加剤と製剤化できる。ヒトを含む哺乳動物対象に対する投与のための活性抗Ｉｄ化合物の適した有効単位用量は、１０〜１５００ｍｇ、２０〜１０００ｍｇ、２５〜７５０ｍｇ、５０〜５００ｍｇ、又は１５０〜５００ｍｇの範囲であり得る。特定の実施形態では、抗Ｉｄ有効用量は、例えば、１０〜２５ｍｇ、３０〜５０ｍｇ、７５〜１００ｍｇ、１００〜２５０ｍｇ、又は２５０〜５００ｍｇのより狭い範囲から選択され得る。これらの及び他の有効な単位用量が単一投与で、又は複数の毎日、毎週又は毎月投与の形態で、例えば、毎日、毎週、又は１ヶ月毎に１〜５投与、又は２〜３投与を含む投与方法で投与することができる。１つの例示の実施形態において、１０〜２５ｍｇ、３０〜５０ｍｇ、７５〜１００ｍｇ、１００〜２５０ｍｇ、又は２５０〜５００ｍｇの用量が毎日１、２、３、４、又は５回投与される。さらに詳細な実施形態では、５０〜７５ｍｇ、１００〜２００ｍｇ、２５０〜４００ｍｇ、又は４００〜６００ｍｇの用量が１日１回又は１日２回投与される。代案的な実施形態では、用量は体重に基づいて計算され、例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／１日、１ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇ／１日、１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ／１日、２ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ／１日、２ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ／１日又は３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ／１日の量で投与することができる。   The anti-Id compounds of the present invention increase stability, delivery, absorption, half-life, efficacy, pharmacokinetics, and / or pharmacodynamics to reduce adverse side effects or provide other benefits for pharmaceutical applications It can be formulated with one or more possible pharmaceutically acceptable carriers, excipients, vehicles, emulsifiers, stabilizers, preservatives, buffers and / or other additives. Suitable effective unit doses of active anti-Id compounds for administration to mammalian subjects, including humans, can range from 10-1500 mg, 20-1000 mg, 25-750 mg, 50-500 mg, or 150-500 mg. In certain embodiments, the anti-Id effective dose may be selected from a narrower range of, for example, 10-25 mg, 30-50 mg, 75-100 mg, 100-250 mg, or 250-500 mg. These and other effective unit doses can be administered in a single dose or in the form of multiple daily, weekly or monthly doses, for example, 1-5 doses, or 2-3 doses daily, weekly, or monthly. It can be administered by administration methods including. In one exemplary embodiment, a dose of 10-25 mg, 30-50 mg, 75-100 mg, 100-250 mg, or 250-500 mg is administered 1, 2, 3, 4, or 5 times daily. In more detailed embodiments, a dose of 50-75 mg, 100-200 mg, 250-400 mg, or 400-600 mg is administered once a day or twice a day. In alternative embodiments, the dose is calculated based on body weight, such as from about 0.5 mg / kg to about 100 mg / kg / day, 1 mg / kg to about 75 mg / kg / day, 1 mg / kg to about Can be administered in an amount of 50 mg / kg / day, 2 mg / kg to about 50 mg / kg / day, 2 mg / kg to about 30 mg / kg / day or 3 mg / kg to about 30 mg / kg / day .

化学式Ｉ及び／又は化学式ＩＩＩの有効量の抗Ｉｄ化合物を含有する本発明の組成物の送達量、送達時間及び送達方法は、半減期、及び有効性を含み有効薬剤の送達、吸収、薬剤動態に関して既知の他の要因に基づいて個体の体重、年齢、性別及び病態、細胞増殖性疾患及び／又は関連した症状の重症度、投与が予防用又は治療用なのか否かのような要因に依存し、個体基準に日常的に調整される。   The delivery amount, delivery time and method of delivery of a composition of the invention containing an effective amount of an anti-Id compound of Formula I and / or Formula III includes delivery, absorption, pharmacokinetics of the active agent, including half-life and efficacy. Depends on factors such as the individual's weight, age, gender and pathology, the severity of the cell proliferative disorder and / or related symptoms, whether the administration is prophylactic or therapeutic based on other known factors And adjusted on an individual basis on a daily basis.

当該抗Ｉｄ製剤に対する有効用量又は複数投与治療計画は、概して対象で標的化された細胞増殖性疾患（例えば、癌、転移癌、腫瘍関連血管新生）を実質的に予防又は緩和して／するか、対象における細胞増殖性疾患に関する１つ以上の症状を実質的に予防又は緩和するために必要であり、それに十分な最小の投与方法に近接するように選択される。投与量及び投与プロトコルは、多くの場合数日、又は１週又は１年までの過程で繰り返される投与療法を含む。また、有効治療計画は、日、週、月又は数年までの過程にわたり持続する単一又は複数の投与量／１日基準に投与される予防的投与量を伴うことがある。   Does the effective dose or multi-dose treatment regimen for the anti-Id formulation substantially prevent or alleviate cell proliferative diseases (eg, cancer, metastatic cancer, tumor associated angiogenesis) targeted in the subject? , Selected to be in proximity to the minimal administration method necessary and sufficient to substantially prevent or alleviate one or more symptoms associated with the cell proliferative disorder in the subject. Dosages and administration protocols often include dosing regimens that are repeated over the course of several days or up to a week or year. Effective treatment regimes may also involve prophylactic doses administered on a single or multiple dose / day basis that lasts over a course of days, weeks, months or years.

説明すると、抗Ｉｄ活性剤は、従来の薬学的に許容可能な担体及び賦形剤（例えば、ビヒクル）と混合されることができ、水溶液、錠剤、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハなどの形態で使用できる。この医薬組成物は、特定の実施形態では、約０．１〜約９０重量％の活性化合物、さらに一般的に約１〜約３０重量％の活性化合物を含有する。医薬組成物は、一般的な担体及び賦形剤、例えばトウモロコシデンプン又はゼラチン、ラクトース、デキストロース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、第二リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、及びアルギン酸を含有し得る。本発明の製剤で通常使用される崩壊剤には、クロスカルメロース、微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、ナトリウムデンプングリコレート及びアルギン酸が含まれる。   To illustrate, anti-Id actives can be mixed with conventional pharmaceutically acceptable carriers and excipients (eg, vehicles), aqueous solutions, tablets, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers. It can be used in the form of The pharmaceutical composition, in certain embodiments, contains from about 0.1 to about 90% by weight of active compound, more typically from about 1 to about 30% by weight of active compound. The pharmaceutical compositions may contain common carriers and excipients such as corn starch or gelatin, lactose, dextrose, sucrose, microcrystalline cellulose, kaolin, mannitol, dicalcium phosphate, sodium chloride, and alginic acid. Disintegrants commonly used in the formulations of the present invention include croscarmellose, microcrystalline cellulose, corn starch, sodium starch glycolate and alginic acid.

液体組成物は一般的に懸濁化剤、保存剤、界面活性剤、湿潤剤、風味剤又は着色剤と共に化合物又は薬学的に許容可能な塩の適した液体担体、例えば、エタノール、グリセリン、ソルビトール、非水性溶媒、例えばポリエチレングリコール、油又は水中の懸濁液又は溶液からなる。あるいは、液体製剤は再構成可能な粉末で製造できる。例えば、活性化合物、懸濁化剤、スクロース及び甘味剤を含有する粉末は水を用いて再構成されて懸濁液を形成することができ、シロップは活性成分、スクロース及び甘味剤を含有する粉末で製造できる。   Liquid compositions generally include suspending agents, preservatives, surfactants, wetting agents, flavoring agents or colorants together with a suitable liquid carrier of the compound or pharmaceutically acceptable salt, such as ethanol, glycerin, sorbitol Consisting of a suspension or solution in a non-aqueous solvent such as polyethylene glycol, oil or water. Alternatively, the liquid formulation can be made from a reconstitutable powder. For example, a powder containing the active compound, suspending agent, sucrose and sweetener can be reconstituted with water to form a suspension, and a syrup is a powder containing the active ingredient, sucrose and sweetener Can be manufactured.

錠剤状の組成物は、固形組成物製造に日常的に使用される任意の適した薬学的担体を用いて製造できる。この担体の例には、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース及び結合剤、例えば、ポリビニルピロリドンが含まれる。また、錠剤は、カラーフィルムコーティング、又は担体の一部に含まれている色素と共に提供され得る。さらに、活性化合物は親水性又は疎水性マトリックスを含有する錠剤として制御放出剤形に製剤化できる。   A tablet-like composition can be made using any suitable pharmaceutical carrier routinely used for making solid compositions. Examples of this carrier include magnesium stearate, starch, lactose, sucrose, microcrystalline cellulose and binders such as polyvinylpyrrolidone. Tablets can also be provided with color film coatings, or pigments included in part of the carrier. In addition, the active compound can be formulated into controlled release dosage forms as tablets containing a hydrophilic or hydrophobic matrix.

カプセル状の組成物は、日常的なカプセル化の手順、例えば、活性化合物及び賦形剤の硬質ゼラチンカプセルへの混入によりカプセル状に製造できる。あるいは、活性化合物及び高分子量ポリエチレングリコールの半固体マトリックスが製造され、硬質ゼラチンカプセルで充填されるか、又は活性化合物のポリエチレングリコール中の溶液又は食用オイル、例えば液体パラフィン又は分画されたココナッツオイル中の懸濁液が製造され軟質ゼラチンカプセルに充填できる。   Capsule compositions can be made into capsules by routine encapsulation procedures, such as incorporation of the active compound and excipients into a hard gelatin capsule. Alternatively, a semi-solid matrix of the active compound and high molecular weight polyethylene glycol is produced and filled with hard gelatin capsules, or in a solution or edible oil of the active compound in polyethylene glycol such as liquid paraffin or fractionated coconut oil Can be prepared and filled into soft gelatin capsules.

含まれ得る錠剤結合剤は、アカシア、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、デンプン及びエチルセルロースである。使用できる潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム又は他の金属ステアレート、ステアリン酸、シリコン流体、タルク、ワックス、オイル及びコロイドシリカが含まれる。   Tablet binders that may be included are acacia, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone (povidone), hydroxypropylmethylcellulose, sucrose, starch and ethylcellulose. Lubricants that can be used include magnesium stearate or other metal stearates, stearic acid, silicone fluids, talc, waxes, oils and colloidal silica.

風味剤、例えばハッカ、ウィンターグリーンオイル、チェリー香味剤などが使用できる。さらに、投与形態の外観をさらに魅力的にしたり、又は製品の識別を補助するために着色剤を添加することが好ましい。   Flavoring agents such as peppermint, winter green oil, cherry flavoring agents and the like can be used. In addition, it is preferred to add a colorant to make the dosage form more attractive in appearance or to assist in product identification.

非経口で提供される際、活性である本発明の化合物及びその薬学的に許容可能な塩は、筋肉内、髄腔内又は静脈内投与用に製剤化できる。筋肉内又は髄腔内投与用の一般的な組成物は、活性成分のオイル、例えば、落花生油又はごま油中の懸濁液又は溶液である。静脈内又は髄腔内投与用の一般的な組成物は例えば、活性成分及びデキストロース又は塩化ナトリウム、又はデキストロース及び塩化ナトリウムの混合物を含有する滅菌等張性水溶液である。他の例は、ラクテート化されたリンガー注射、ラクテート化されたリンガープラスデキストロース注射、ノルモソル−Ｍ及びデキストロース、イソライトＥ、アシル化されたリンガー注射などである。任意で、補助溶媒、例えば、ポリエチレングリコール、キレート剤、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸、及び抗酸化剤、例えば、ナトリウムメタビスルフィトが製剤に含まれ得る。あるいは、溶液を凍結乾燥した後、投与直前に適した溶媒を用いて再構成することができる。   When provided parenterally, the compounds of the present invention and their pharmaceutically acceptable salts that are active can be formulated for intramuscular, intrathecal or intravenous administration. A common composition for intramuscular or intrathecal administration is a suspension or solution of the active ingredient in an oil, such as peanut oil or sesame oil. A typical composition for intravenous or intrathecal administration is, for example, a sterile isotonic aqueous solution containing the active ingredient and dextrose or sodium chloride, or a mixture of dextrose and sodium chloride. Other examples are lactated Ringer injection, lactated Ringer plus dextrose injection, normosol-M and dextrose, Isolite E, acylated Ringer injection, and the like. Optionally, co-solvents such as polyethylene glycol, chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid, and antioxidants such as sodium metabisulphite can be included in the formulation. Alternatively, the solution can be lyophilized and then reconstituted with a suitable solvent just prior to administration.

例えば、皮膚癌病変の治療のための特定の適用では、本発明の化合物は局所投与上で活性であり、経皮組成物として剤形化されるか、又は経皮送達装置（例えば、経皮パッチ）で標的化できる。この組成物には、例えば、バックキング（ｂａｃｋｉｎｇ）、活性化合物貯蔵器、制御膜、ライナー及び接触接着剤が含まれる。この経皮パッチが使われると、調節された量で本発明の化合物の連続又は不連続注入を提供することができる。   For example, in certain applications for the treatment of skin cancer lesions, the compounds of the invention are active on topical administration and are formulated as transdermal compositions or transdermal delivery devices (eg, transdermal) Target). This composition includes, for example, backing, active compound reservoir, control membrane, liner and contact adhesive. When this transdermal patch is used, it can provide continuous or discontinuous infusion of the compounds of the invention in controlled amounts.

経口投与に適した製剤は、以下のものからなり得る：（ａ）液体溶液、例えば希釈剤、例えば水、塩水、又はオレンジジュースに有効量の化合物を溶解させた溶液；（ｂ）それぞれ予定された量の活性成分を固形物又は顆粒で含むカプセル、サシェ又は錠剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁液；及び（ｄ）適したエマルジョン。錠剤状はラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、ポテトデンプン、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド性シリコンジオキシド、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、及び薬理的に両立可能な賦形剤のうちひとつ以上を含み得る。トローチ状は、活性成分を風味剤、普通スクロース及びアカシア又はトラガントガム中に含有することができ、そのだけでなくあめ型錠剤は活性成分を不活性ベース、例えばゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシア、エマルジョン、ゲルなどの中に含有し、活性成分に加え、当業界において知られている賦形剤を含む。   Formulations suitable for oral administration may consist of: (a) a liquid solution, such as a solution of an effective amount of the compound in a diluent, such as water, brine, or orange juice; (b) each scheduled. Capsules, sachets or tablets containing the active ingredient in solids or granules; (c) a suspension in a suitable liquid; and (d) a suitable emulsion. Tablets are lactose, mannitol, corn starch, potato starch, microcrystalline cellulose, acacia, gelatin, colloidal silicon dioxide, croscarmellose sodium, talc, magnesium stearate, stearic acid, and other excipients, colored One or more of agents, diluents, buffers, wetting agents, preservatives, flavoring agents, and pharmacologically compatible excipients may be included. The troches can contain the active ingredient in flavors, usually sucrose and acacia or gum tragacanth, as well as candy tablets contain the active ingredient in an inert base such as gelatin and glycerin, or sucrose and acacia, emulsion Contained in gels and the like and includes excipients known in the art in addition to the active ingredient.

本発明の抗Ｉｄ組成物は、肺吸入又は鼻腔内スプレーを通じて投与されるエアゾール製剤を含む。これらのエアゾール製剤は、加圧された許容可能な推進体、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに配置できる。これらは例えば噴霧機又はアトマイザで使用するための非加圧製剤用医薬品として製剤化できる。   The anti-Id compositions of the present invention include aerosol formulations administered through pulmonary inhalation or intranasal spray. These aerosol formulations can be placed in pressurized acceptable propellants such as dichlorodifluoromethane, propane, nitrogen and the like. These can be formulated, for example, as non-pressurized pharmaceuticals for use with a sprayer or atomizer.

非経口投与に適した製剤には水性及び非水性、等張の滅菌された注射溶液が含まれ、これらは抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤が意図する受給者の血液と等張性となるようにする溶質、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性等張性滅菌注射液が含まれる。製剤は単位用量又は複数回用量の密封容器、例えばアンプル及びバイアルで提示され得、滅菌された液体賦形剤、例えば、注射用水を使用直前に添加しさえするとなる冷凍乾燥（凍結乾燥）状態で保管できる。即座の注射溶液及び懸濁液が上記の種類の滅菌された粉末、顆粒、及び錠剤から製造できる。   Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous, isotonic sterile injection solutions, such as antioxidants, buffers, bacteriostats, and the blood of the intended recipient of the formulation. Aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions may be included which may include solutes, suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, and preservatives to render them tonic. The formulation can be presented in unit dose or multi-dose sealed containers, such as ampoules and vials, in a lyophilized (lyophilized) state where sterilized liquid excipients, such as water for injection, can even be added just prior to use. Can be stored. Extemporaneous injection solutions and suspensions can be prepared from sterile powders, granules, and tablets of the kind previously described.

局所投与に適した製剤は、活性成分に加え、当業界において知られている適切な担体を含有するクリーム、ゲル、ペースト、又は発泡剤として提示され得る。また、坐剤は、様々なベース、例えばエマルジョン化ベース又は水溶性ベースと混合して提供される。膣内投与に適した製剤は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡剤として提示され得る。   Formulations suitable for topical administration may be presented as creams, gels, pastes or foams containing, in addition to the active ingredient, suitable carriers known in the art. Suppositories are also provided in admixture with a variety of bases, such as emulsifying bases or water-soluble bases. Formulations suitable for vaginal administration can be presented as pessaries, tampons, creams, gels, pastes, foaming agents.

本願でそれぞれの投与単位、例えば、小さじ、大さじ、錠剤又は坐剤で提供され得る経口又は直腸内投与用の単位服用の形態、例えばシロップ、エリキシル、及び懸濁液は、１つ以上の阻害剤を含有する組成物を予定された量で含む。同様に、注射又は静脈内投与用単位服用の形態は、滅菌水、正常食塩水又は他の薬学的に許容可能な担体中の溶液としての組成物中に阻害剤を含有し得る。   Unit dosage forms for oral or rectal administration, such as syrups, elixirs, and suspensions, which can be provided in this application in each dosage unit, eg, teaspoon, tablespoon, tablet or suppository, are one or more inhibitors. In a predetermined amount. Similarly, unit dosage forms for injection or intravenous administration may contain the inhibitor in a composition as a solution in sterile water, normal saline or other pharmaceutically acceptable carrier.

用語「単位用量の形態」は、本願で使用される通り、ヒト及び動物対象に対して一元化された用量で適した物理的に分離された単位体であって、それぞれ薬学的に許容可能な希釈剤、担体又はビヒクルと会合時に、所望の有効性を提供するのに十分な量である予備決定量の本発明の化合物を含有する。本発明の新たな単位用量の形態に対する詳細な事項は、使用される特定化合物及び達成しようとする効果、及び宿主内における各化合物に関する薬剤力学に依存する。   The term “unit dose form” as used herein refers to a physically separated unit suitable for a unified dose for human and animal subjects, each pharmaceutically acceptable dilution. Contains a predetermined amount of a compound of the invention that is sufficient to provide the desired efficacy upon association with the agent, carrier, or vehicle. The details for the new unit dose form of the present invention depend on the particular compound used and the effect to be achieved and the pharmacodynamics for each compound in the host.

当業者は用量の濃度が特定化合物の機能、送達ビヒクルの性質などによって可変的であり得ることを容易に理解できる。与えられた化合物に対する適した用量は様々な手段によって当業者により容易に決定されることができる。動物、特にヒトに投与される用量は、合理的な時間フレーム上で動物における予防又は治療応答性を誘発するのに充分でなければならない。当業者は用量が使用される特定化合物の強度、動物の病態及び動物の体重だけでなく病気の重症度及び疾患のステップを含む様々な要因に依存するということを認識する。また、用量の大きさは、特定化合物の投与に伴うことがある任意の有害な副作用が存在するか否か、性質又は程度により明らかにされる。適した用量及び投薬計画は、所望の成長抑制及び免疫抑制応答を誘発することが知られている抗癌又は免疫抑制剤との比較により決定されることができる。   One skilled in the art can readily appreciate that the concentration of the dose can vary depending on the function of the particular compound, the nature of the delivery vehicle, and the like. Suitable dosages for a given compound can be readily determined by those skilled in the art by various means. The dose administered to an animal, particularly a human, must be sufficient to elicit prophylactic or therapeutic responsiveness in the animal over a reasonable time frame. Those skilled in the art will recognize that the dosage will depend on a variety of factors including the intensity of the particular compound used, the condition of the animal and the weight of the animal as well as the severity of the disease and the step of the disease. The size of the dose will also be clarified by the nature or extent of any adverse side effects that may accompany the administration of the particular compound. Suitable dosages and dosing schedules can be determined by comparison with anticancer or immunosuppressive agents known to elicit the desired growth suppression and immunosuppressive responses.

任意で、医薬組成物は、他の薬学的に許容可能な成分、例えば緩衝剤、界面活性剤、抗酸化剤、粘度変形剤、保存剤などを含有し得る。それぞれのこれらの成分は、当業界において知られている。例えば、その内容が本願に参考文献として含まれる米国特許第５，９８５，３１０号参照。本発明の製剤に使用するのに適した他の成分はＲｅｍｉｎｇｔｏｎの１９８５年度の文献から見つけることができる。また、実施形態では、水性シクロデキストリン溶液には、デキストロース、例えば、約５％のデキストロースが含まれる。   Optionally, the pharmaceutical composition may contain other pharmaceutically acceptable ingredients such as buffers, surfactants, antioxidants, viscosity modifiers, preservatives and the like. Each of these components is known in the art. See, for example, US Pat. No. 5,985,310, the contents of which are incorporated herein by reference. Other ingredients suitable for use in the formulations of the present invention can be found in Remington's 1985 literature. Also, in embodiments, the aqueous cyclodextrin solution includes dextrose, for example, about 5% dextrose.

キット及びシステム
また、組み合わせ製剤、協調的方法、診断及び治療手段及びシステムなどに関する前記説明に関するキット及びシステムが、本発明で提供される。協調的使用又は組み合わせ使用のために開示されたこれらの基本的な手段の全ての組み合わせが、組み合わせた「キット」の形態で本願で提供されるためにも意図される。本発明の方法の実施のための例示のキット及びシステムには、二次癌治療剤、例えば化学療法薬、ＶＤＡ、又はＨＳＰ９０阻害剤と、使用するために包装又は参照表示された抗Ｉｄ化合物を含む１つ以上の薬学的製剤が含まれ得る。特定の実施形態でキットは１つ以上の単位用量で存在する単一医薬組成物を含み得、ここで組成物は抗Ｉｄ化合物（例えば、（−）−ＡＧＸ５１及び化学療法剤又は毒性還元剤を全て含む。さらに別の実施形態では、キットは三つ以上の異なる医薬組成物を含み得、それぞれ抗Ｉｄ化合物、化学療法又は可能には毒性還元剤、又はこれらの要素の組み合わせを含む。前記成分に加え、対象キットは、さらに本発明の実施のための説明書を含み得る。これらの説明書は対象キット内に様々な形態で、例えば、キット包装上の適した媒体又は基板上に又は包装挿入物上に印刷された情報又は参照内容などとして提示され得る。 Kits and systems Also provided in the present invention are kits and systems relating to the above description relating to combination formulations, coordinated methods, diagnostic and therapeutic means and systems, and the like. All combinations of these basic means disclosed for coordinated or combined use are also intended to be provided herein in the form of combined “kits”. Exemplary kits and systems for carrying out the methods of the invention include a secondary cancer therapeutic agent, such as a chemotherapeutic agent, VDA, or HSP90 inhibitor, and an anti-Id compound packaged or referenced for use. One or more pharmaceutical formulations can be included. In certain embodiments, the kit can comprise a single pharmaceutical composition that is present in one or more unit doses, wherein the composition comprises an anti-Id compound (eg, (−)-AGX51 and a chemotherapeutic or toxic reducing agent). In yet another embodiment, the kit may comprise three or more different pharmaceutical compositions, each comprising an anti-Id compound, chemotherapy or possibly a toxic reducing agent, or a combination of these components. In addition, the subject kit may further include instructions for carrying out the present invention, which may be in various forms within the subject kit, such as on a suitable medium or substrate on the kit packaging or packaged. It can be presented as information printed on the insert or as reference content.

抗癌及び抗転移組成物及び方法
転移は、ほとんどの癌患者、恐らく最も有意には最も人口が多い癌患者の特に乳癌患者において持続的生存のための最大の治療挑戦課題である。転移に関する遺伝子及び調節因子の確認は、かなり複雑で臨床的観点から難治性であることが立証されている。ＤＮＡ結合（Ｉｄ）タンパク質の阻害因子は、乳癌転移を含む癌転移で様々な役割を果たすように多様に関わっている。転移部位では高いＩｄ１の発現が観察される。Ｉｄ１は、報告によると、癌細胞を循環（「播種」）させ、離れた転移性部位に播く（「定着」）ことを可能にする重要な間葉上皮転換（ＭＥＴ）変化調節において機能する。Ｉｄ１の人工的遺伝子ノックダウンは、肺で腫瘍細胞によりＭＥＴを混乱させ、乳癌のネズミ科モデルで肺転移の発生を遮断することが報告されている。 Anti-cancer and anti-metastatic compositions and methods Metastasis is the greatest therapeutic challenge for sustained survival in most cancer patients, perhaps the most significantly the most populous cancer patients, especially breast cancer patients. Identification of genes and regulators for metastasis has proven to be fairly complex and refractory from a clinical point of view. Inhibitors of DNA binding (Id) proteins are involved in a variety of ways to play various roles in cancer metastasis, including breast cancer metastasis. High Id1 expression is observed at the metastatic site. Id1 reportedly functions in regulating mesenchymal epithelial transition (MET) changes that allow cancer cells to circulate (“seeding”) and seed at distant metastatic sites (“establishment”). Artificial gene knockdown of Id1 has been reported to disrupt MET by tumor cells in the lung and block the development of lung metastases in a murine model of breast cancer.

本発明は、小分子が哺乳動物対象生体内でＩｄ機能を効果的に標的化及び遮断し、転移を撹乱させたり、癌の進行を遅らせ又は予防し、最終的に癌患者死亡率を軽減又は予防することができるという臨床的に実行可能な提示を最初に提供する。   The present invention allows small molecules to effectively target and block Id function in a mammalian subject, disrupt metastasis, slow or prevent cancer progression, and ultimately reduce cancer patient mortality or Provide a clinically viable presentation that can be prevented first.

本発明の抗Ｉｄ化合物は、癌患者で転移を治療及び／又は予防するための新らしくて大いに有効な方法を提供する。下記実施例は、例示の小分子抗Ｉｄ薬、Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（「ＡＧＸ５１」）の開発、特徴及び抗転移用途を説明する。この例示のリード化合物は、ＡＧＸ５１プラットホームに基づいて（例えば、化学式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに記載された代わりの薬剤設計に関して上述の通り）抗Ｉｄ活性を有した同等な薬剤の合理的設計のための基礎を提供する。ＡＧＸ５１は、膨大なインシリコ小分子スクリーン（２×１０⁶個に至る候補化合物）を含む、徹底した分子スクリーニングを通じて明らかにされた。本願で特徴とされるＡＧＸ５１は、Ｉｄ１及びその同族の結合パートナー（重要な調節ｂＨＬＨタンパク質、例えばＥ４７を含む）の二量化を妨害するのに効果的な方法で、Ｉｄ１の二量化ドメインに隣接する疎水ポケットに結合することができる第１の小分子剤としてスクリーンから現れた。この画期的発見は多くの点で驚くべきものであり、多くの候補遮断剤を用いてこれらの分子相互作用を効果的に妨害するこれまでの努力を、非常に不確実で常に失敗させた、ＨＬＨ−ｂＨＬＨ二量化の性質及び複雑性が少しもない。 The anti-Id compounds of the present invention provide a new and highly effective method for treating and / or preventing metastasis in cancer patients. The following example illustrates an exemplary small molecule anti-Id drug, N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropion. The development, characteristics and antimetastatic application of the amide (“AGX51”) will be described. This exemplary lead compound is based on the AGX51 platform (eg, as described above for alternative drug designs described in Formulas I, II, III, and IV) with a rational design of an equivalent drug with anti-Id activity. Provide a basis for AGX51 was revealed through thorough molecular screening, including a vast in silico small molecule screen (up to 2 × 10 ⁶ candidate compounds). AGX51, characterized in this application, is adjacent to the dimerization domain of Id1 in a way that is effective in preventing dimerization of Id1 and its cognate binding partners (including key regulatory bHLH proteins such as E47) It emerged from the screen as the first small molecule agent that could bind to the hydrophobic pocket. This groundbreaking discovery is surprising in many ways, and the previous efforts to effectively block these molecular interactions with many candidate blockers have been highly uncertain and have always failed. There is no nature and complexity of HLH-bHLH dimerization.

記載された通り本発明のＡＧＸ５１及び他の抗Ｉｄ化合物は、ｂＨＬＨタンパク質を有したＩｄ二量化官能基に結合して損傷させるだけでなく、この機序によって、臨床的に実行可能な方法で重要な転移性経路で下流のＩｄ活性と機能的に干渉もする。これらの活性のうち、特にＡＧＸ−５１は用量依存的方法でＤＮＡに対するＥ４７結合を高める（Ｉｄ１−Ｅ４７二量化のＡＧＸ−５１の有効な拮抗作用と関係がある）。下記実施例は、本発明の抗Ｉｄ化合物が（恐らくＩｄ−ＢＨＬＨタンパク質二量体を混乱させ、Ｉｄをユビキチン媒介された分解、及び同様に他のＩｄ分解的機序に露出させることによる「脱保護」又は「脱遮蔽」を通じて）細胞及び生体におけるＩｄ濃度の減少を効果的に媒介することを示す。本願におけるこの新たな予想しない抗Ｉｄ化合物の活性は、本願で言及した他の強力な抗Ｉｄの効果なしで、単独で臨床対象における有害Ｉｄ濃度を減少させる有効な手段を提供し、前癌細胞における癌の発生危険を直接的に減少させ、腫瘍性細胞における癌形質の転換を低減し、既存の新生物及び癌の転移潜在力を減少させることによってこれらの対象で癌を軽減又は予防する。   As described, AGX51 and other anti-Id compounds of the present invention not only bind to and damage Id dimerization functional groups with bHLH protein, but also by this mechanism are important in a clinically viable way It also functionally interferes with downstream Id activity in a simple metastatic path Of these activities, AGX-51, in particular, increases E47 binding to DNA in a dose-dependent manner (related to the effective antagonism of AGX-51 with Id1-E47 dimerization). The examples below show that the anti-Id compounds of the present invention (probably by disrupting the Id-BHLH protein dimer, exposing Id to ubiquitin-mediated degradation, as well as other Id-degrading mechanisms). It effectively mediates a decrease in Id concentration in cells and organisms (through protection or deshielding) The activity of this new unexpected anti-Id compound in this application provides an effective means of reducing harmful Id levels in clinical subjects alone, without the effects of other potent anti-Ids mentioned in this application, Cancer is reduced or prevented in these subjects by directly reducing the risk of developing cancer in cancer, reducing the transformation of cancer in neoplastic cells, and reducing the metastatic potential of existing neoplasms and cancer.

下記実施例はネズミ科の乳癌細胞（４Ｔ１）を、ＡＧＸ５１を用いて治療することにより、有害なＩｄ１タンパク質の濃度の臨床的に実行可能な減少を結果として提供することを示す。癌細胞培養試験におけるこの驚くべき結果に関し、ＡＧＸ５１は、細胞の生存力（アラマーブルー検査で測定）を減少させ、腫瘍様塊の形成を抑制する。また、本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法は、調節タンパク質ｐ１６及びｐ２１で治療の変化をもたらし、ＡＧＸ５１治療対象の血液中のＩｄの循環濃度を減少させ、循環内皮細胞及びＥＰＣを下方制御し、本願で明らかにされている数多くの追加の、明らかに異なる活性の中でも転移及び腫瘍の成長に関する病原性血管新生を下方制御する。試験管内及び生体内の両方におけるこれらの及び他のデータは、遺伝子的Ｉｄノックダウン実験からの結果と一致し、画期的な抗Ｉｄ小分子薬に対して予想しない驚くべきものと解釈されざるを得ない。   The following example shows that treatment of murine breast cancer cells (4T1) with AGX51 results in a clinically viable reduction in the concentration of harmful Id1 protein. With regard to this surprising result in cancer cell culture studies, AGX51 reduces cell viability (measured by Alamar Blue test) and suppresses tumor-like mass formation. The anti-Id compositions and methods of the present invention also result in therapeutic changes with the regulatory proteins p16 and p21, reduce circulating levels of Id in the blood of AGX51 treated subjects, down-regulate circulating endothelial cells and EPCs, Among the many additional and distinctly different activities that are revealed in this application, it down-regulates pathogenic angiogenesis with respect to metastasis and tumor growth. These and other data, both in vitro and in vivo, are consistent with the results from genetic Id knockdown experiments and should not be interpreted as unexpected and surprising for innovative anti-Id small molecule drugs. I do not get.

これらの例示のデータは、さらに本発明の抗Ｉｄ化合物及び方法が様々な転移性機序及び経路を強力に混乱させるということを示す（特に白血性、肺癌、膀胱癌、及び乳癌前臨床モデルで明らかにされている）。   These exemplary data further show that the anti-Id compounds and methods of the invention strongly disrupt various metastatic mechanisms and pathways (particularly in leukemic, lung cancer, bladder cancer, and breast cancer preclinical models). Has been revealed).

これらの研究で最後に、最有力候補の抗Ｉｄ薬ＡＧＸ５１は、ヒトを含む他の哺乳動物対象における臨床薬剤有用性の予測で広く受け入れられている複数の癌の種類の生体内ネズミ科モデルで実際腫瘍転移を明確に減少させることが証明された。４Ｔ１細胞の尾静脈注射後２４時間後の腹腔内注射で５０ｍｇ／ｋｇで投与時、ＡＧＸ５１は、肺転移の発生をかなり減少させる。肺転移の著しくより大きい阻害は、ＡＧＸ−５１投与を１日１回から２回に増加させた時に観察された。相当する研究及び結果は、ネズミ科の乳癌モデルから提供された。追加のデータはＡＧＸ５１がＩｄ依存ＭＥＴを遮断し、従って哺乳動物対象における転移性疾患を予防又は短縮させるという表明を提供する。本発明の抗Ｉｄ化合物によるこれらの新たな活性の更なる立証は、４Ｔ１転写体及びＥＭＴ／ＭＥＴ経路に対するＡＧＸ−５１効果の研究として進行中である。   Finally, in these studies, the leading candidate anti-Id drug AGX51 is an in vivo murine model of multiple cancer types that is widely accepted in predicting clinical drug utility in other mammalian subjects, including humans. In fact, it has been demonstrated to clearly reduce tumor metastasis. When administered at 50 mg / kg by intraperitoneal injection 24 hours after tail vein injection of 4T1 cells, AGX51 significantly reduces the occurrence of lung metastases. A significantly greater inhibition of lung metastasis was observed when AGX-51 administration was increased from once to twice daily. Corresponding studies and results were provided from a murine breast cancer model. Additional data provides a statement that AGX51 blocks Id-dependent MET, thus preventing or shortening metastatic disease in mammalian subjects. Further demonstration of these new activities by the anti-Id compounds of the present invention is ongoing as a study of the AGX-51 effect on the 4T1 transcript and EMT / MET pathway.

本願に提供された実施例は、単に説明のためのものであり、そして熟練家により本開示内容の教示と同等な実施形態を含み本発明の範囲又は実際的な適用を制限すると誤解釈されてはならない。これらの実施例は例示の小分子阻害剤ＡＧＸ５７を用いてＩｄタンパク質の濃度及び転移媒介機能を遮断及び無能力化し、本願に記載された他の類似の化合物が、Ｉｄ結合解除及び機能に対して有効な追加の製剤を提供するために、これらの教示を基にして構成される。   The examples provided herein are for illustrative purposes only and are misinterpreted by those skilled in the art to include embodiments equivalent to the teachings of the present disclosure and to limit the scope or practical application of the invention. Must not. These examples use the exemplary small molecule inhibitor AGX57 to block and incapacitate Id protein concentrations and translocation-mediated functions, and other similar compounds described in this application may be directed against Id debinding and function. Built on these teachings to provide additional effective formulations.

実施例１
抗Ｉｄ化合物の同定及び試験
本願に開示された実験は、３６４種の化合物の同定、及びＩｄ抑制に有用な１２個のペプチドの同時的な設計をまとめる。これらの実験は、追加の抗Ｉｄ化合物の識別、だけでなく、Ｉｄを阻害することができる候補化合物の有効性分析のための手段をさらに提供する。下記の検査には、候補化合物の有効性、例えば、Ｉｄ結合、Ｉｄ二量化封鎖、及び／又は細胞及び生体におけるＩｄの不安定化及び分解を媒介する能力を確認するための試験に実行可能な手段が含まれる。 Example 1
Identification and Testing of Anti-Id Compounds The experiments disclosed herein summarize the identification of 364 compounds and the simultaneous design of 12 peptides useful for Id suppression. These experiments further provide a means for the identification of additional anti-Id compounds, as well as the efficacy analysis of candidate compounds that can inhibit Id. The following tests are feasible for tests to confirm the effectiveness of candidate compounds, eg, Id binding, Id dimerization blockade, and / or the ability to mediate Id destabilization and degradation in cells and organisms. Means are included.

数百万個の化学物質を３次元的Ｅ４７−Ｉｄ１相互作用マッピングを用いてスクリーニングし、Ｅ４７−Ｉｄ１相互作用を潜在的に阻害することができる小分子を識別した。同族Ｉｄ１結合構造を概念化して、仮想スクリーニングはＩｄ１の複合体に対するモンテカルロシミュレーションを使用し、収集及び分析した１，０００，０００ステップ及び１００個の形態を含む小型化合物（固定された螺旋状破片）スクリーンを稼動した。最善のスコア及び総エネルギーを有した複合体の形態を、追加分析用として選択した。   Millions of chemicals were screened using 3D E47-Id1 interaction mapping to identify small molecules that could potentially inhibit E47-Id1 interaction. Conceptualizing the cognate Id1 binding structure, the virtual screening used Monte Carlo simulations for the complex of Id1, collected and analyzed a small compound containing 1,000,000 steps and 100 forms (fixed helical fragments) Activated the screen. The form of the complex with the best score and total energy was selected for further analysis.

仮想スクリーニングから上位３，０００個の化合物をＣｌｏｇＰ＜５、ｔＰＳＡ＜８０、分子量＜６００、及び化学的及び生化学的安定性に対して追加分析した。インシリコスクリーンで同定された３６４個の化合物が、表１に列挙されている。   The top 3,000 compounds from the virtual screen were further analyzed for ClogP <5, tPSA <80, molecular weight <600, and chemical and biochemical stability. The 364 compounds identified by in silico screen are listed in Table 1.

実施例２
合成抗Ｉｄペプチドの考案
Ｅ４７−Ｉｄ１ヘテロ二量体構造のＸ線からのＥ４７分子をペプチドの考案のための鋳型として使用した。ペプチドはＩｄ１とロイシン−ジッパー種類の二量体を形成（Ｅ４７とは形成しない）するよう設計され、Ｉｄ１と塩橋及び分子間Ｈ結合を形成する極性又は荷電した側鎖の導入により安定化できる。考案されたペプチドは、溶液中にα−螺旋形構造を維持する有意な可能性を有していると考えられた。特定のペプチドに対しては、ペプチドのヘリックス傾向が極性又は荷電した側鎖の導入により増大し、Ｉｄ１と相互作用しない位置で分子内Ｈ結合及び塩橋を形成する。天然アミノ酸を含んでいるペプチドのみ考慮された。 Example 2
Designing synthetic anti-Id peptides E47 molecules from X-rays of the E47-Id1 heterodimeric structure were used as templates for the design of peptides. Peptides are designed to form leucine-zipper-type dimers with Id1 (not with E47) and can be stabilized by the introduction of polar or charged side chains that form salt bridges and intermolecular H bonds with Id1 . The devised peptides were considered to have significant potential to maintain an α-helical structure in solution. For certain peptides, the helix tendency of the peptide is increased by the introduction of polar or charged side chains, forming intramolecular H bonds and salt bridges at positions that do not interact with Id1. Only peptides containing natural amino acids were considered.

提示されたペプチド二量体構造の安定性評価のためのＩｄ１ペプチド複合体のモデルのために、複数の動力学シミュレーションが行われた。シミュレーションはＡＭＢＥＲ−９４力場を用いて３００SYMBOL 176 \f "Symbol" \s 12Ｋの真空で行われた。位置的な拘束はＩｄ１の骨格原子を決定構造に近接するように維持するために適用され；Ｉｄの側鎖原子及びペプチドの全ての原子は拘束されなかった。４０ピコ秒の平衡及び３００ピコ秒の取得シミュレーションの間、二量体構造はポテンシャルエネルギーにおいて比較的小さい変動を有し、初期モデルに近く残っていた。ペプチドは、全体の多重動力学軌道の間、α−へリックス構造を維持した。初期モデル及び最終多重動力学構造でペプチド位置の間の平均自乗根の偏差は、Ｃ^α原子に対しては０．５０Åであり、全ての重い原子に対しては０．７４Åであった。ペプチドをＩｄ１に固着させる分子間Ｈ結合は、多重動力学シミュレーションの間、安定性を維持するように算出された。 Multiple kinetic simulations were performed for a model of the Id1 peptide complex for stability evaluation of the presented peptide dimer structure. The simulation was performed in a 300 SYMBOL 176 \ f "Symbol" \ s 12K vacuum using an AMBER-94 force field. Positional constraints were applied to keep the Id1 backbone atoms close to the determined structure; the side chain atoms of Id and all atoms of the peptide were not constrained. During the 40 ps equilibration and 300 ps acquisition simulation, the dimer structure had relatively small variations in potential energy and remained close to the initial model. The peptide maintained an α-helix structure during the entire multikinetic orbital. Deviation of the mean square root during peptide position in the initial model and the final multiple dynamics structure for the C ^alpha atom is 0.50A, it was 0.74Å for all heavy atoms. The intermolecular H-bond that anchors the peptide to Id1 was calculated to maintain stability during the multidynamic simulation.

必要な基準に符合するペプチドは、候補抗Ｉｄ化合物として同定された（表２）。   Peptides that meet the required criteria were identified as candidate anti-Id compounds (Table 2).

同定された化合物及びペプチドを、下記実施例においてさらに詳細に記載されるゲル移動及び細胞検査を用いた追加の試験及び分析に適用した。   The identified compounds and peptides were applied for additional testing and analysis using gel migration and cytology described in more detail in the examples below.

実施例３
合成抗Ｉｄ化合物のゲルシフト分析
インシリコ薬剤スクリーン及びペプチド合成から同定された３７６個の小分子を用いて、ゲル移動試験を実施した。同定された化合物を５％のＤＭＳＯに１００μｍの濃度で溶解し、Ｅ４７、Ｉｄ１及びＭｃｋを含有する結合混合物で反応させた。対照として、組換えヒトＥ４７を共通Ｅ−Ｂｏｘ応答因子（ＭＣＫ−５’ＴＴＧ ＡＴＣ ＣＣＣ ＣＣＡ ＡＣＡ ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＴＧＡ ＡＧＣ Ｔ（配列識別番号１７））を含有する³²Ｐ標識されたＭＣＫ二本鎖オリゴヌクレオチドを含有する標準結合反応に使用し、１００ｎｇのＩｄ１をＥ４７及びｐ３２標識されたＭＣＫを用いる標準結合反応に添加した。３０分の培養後、反応混合物を５％の非変性ポリアクリルアミドゲルに溶解し、オートラジオグラフで撮影した。結合されたＥ４７−ＭＣＫは、移動されたバンドを結果として提供した反面、未結合ＭＣＫは、ゲルの底面に移動した。Ｉｄ１及びＥ４７及びＭＣＫを含有する反応混合物では、Ｅ４７がＭＣＫに結合することができないことを示した。同定された分子がＩｄ１を阻害することができれば、ゲル移動試験は結合されたＥ４７−ＭＣＫの移動されたバンドを示したはずである。また、移動されたバンドの存在は、小分子がＥ４７及びＭＣＫの間の相互作用に対しては有効性を有さず、正常的なｂＨＬＨ媒介転写経路上における小分子の任意の非特異的効果の欠如を示す重要な観察を示唆する。 Example 3
Gel shift analysis of synthetic anti-Id compounds Gel migration studies were performed using 376 small molecules identified from in silico drug screens and peptide synthesis. The identified compound was dissolved in 5% DMSO at a concentration of 100 μm and reacted with a binding mixture containing E47, Id1 and Mck. As a control, recombinant human E47 was used as a ³² P-labeled MCK double-stranded oligo containing a common E-Box response factor (MCK-5′TTG ATC CCC CCA ACA CCT GCT GCC TGA AGC T (SEQ ID NO: 17)). Used for standard binding reactions containing nucleotides, 100 ng of Id1 was added to standard binding reactions using E47 and p32 labeled MCK. After incubation for 30 minutes, the reaction mixture was dissolved in 5% non-denaturing polyacrylamide gel and photographed by autoradiograph. Bound E47-MCK resulted in a migrated band, whereas unbound MCK migrated to the bottom of the gel. Reaction mixtures containing Id1 and E47 and MCK showed that E47 could not bind to MCK. If the identified molecule was able to inhibit Id1, the gel migration test should show a migrated band of bound E47-MCK. Also, the presence of the shifted band indicates that the small molecule has no effect on the interaction between E47 and MCK, and that any non-specific effect of the small molecule on the normal bHLH-mediated transcription pathway. Suggest important observations that indicate a lack of.

インシリコ薬剤スクリーンで同定された３７６個の小分子のうち、表３で１７個がゲルシフト分析で最も顕著な抗Ｉｄ活性を示すと確認された。これらの分子は、Ｅ４７、Ｉｄ１及びＭＣＫの存在時、顕著なゲル移動を提供する。   Of the 376 small molecules identified on the in silico drug screen, 17 were confirmed in Table 3 to show the most prominent anti-Id activity in gel shift analysis. These molecules provide significant gel migration in the presence of E47, Id1 and MCK.

表３で特定される分子は、Ｅ４７、Ｉｄ１及びＥｂｏｘの存在下にゲル移動を媒介する。これらの１７個の分子を更なるゲルシフト分析にかけて、結果の再現性及び一貫性を確認した。全てのこれらの化合物は、ゲル移動で特異な点を結果として提供し、これらが試験条件下にＩｄ１−Ｅ４７二量化の相互作用を撹乱できることを示した。ゲル移動程度（有効Ｉｄ１−Ｅ４７二量化封鎖と同等なものと考えられる）を基にして、２種類の小分子：Ｎ’−（４−イソプロピルフェニル）−１−ベンゾチオフェン−２−カルボヒドラジド及びＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（Ｎ−［３−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル］−Ｎ−ベンジルプロパンアミド）を追加試験用に選択した。しかし、表１、２における全ての３７６個の分子及び特異的に表３に列挙された全ての１７個の分子が、本発明の方法組成物に使用するための抗Ｉｄ候補化合物として考えられる。   The molecules identified in Table 3 mediate gel migration in the presence of E47, Id1 and Ebox. These 17 molecules were subjected to further gel shift analysis to confirm the reproducibility and consistency of the results. All these compounds resulted in a unique point in gel migration, indicating that they can disrupt the Id1-E47 dimerization interaction under the test conditions. Based on the degree of gel migration (which is considered equivalent to an effective Id1-E47 dimerization blockade), two small molecules: N ′-(4-isopropylphenyl) -1-benzothiophene-2-carbohydrazide and N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide (N- [3- (1,3-benzo Dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl] -N-benzylpropanamide) was selected for further testing. However, all 376 molecules in Tables 1 and 2 and all 17 molecules specifically listed in Table 3 are considered as anti-Id candidate compounds for use in the method compositions of the present invention.

Ｎ’−（４−イソプロピルフェニル）−１−ベンゾチオフェン−２−カルボヒドラジド（ＨＴＳ ０３８７６、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ）及びＮ−［３−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル］−Ｎ−ベンジルプロパンアミド（Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド）（６９５８６６７、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ）は、Ｉｄ１の存在下にＥ４７−ＭＣＫの間の結合を回復するその能力に基づいて同定された。これらの分子のＥ４７−Ｉｄ１相互作用を遮断する能力を、細胞ベースの試験でのその効果の分析前に類似の試験で２回以上確認した。また、二つの化合物の有効性が、ゲル移動試験で用量比例性であることが立証された。   N ′-(4-Isopropylphenyl) -1-benzothiophene-2-carbohydrazide (HTS 03876, Maybridge) and N- [3- (1,3-benzodioxol-5-yl) -3- (2 -Methoxyphenyl) propyl] -N-benzylpropanamide (N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropion Amide) (6958667, Chemidgege) was identified based on its ability to restore binding between E47-MCK in the presence of Id1. The ability of these molecules to block E47-Id1 interactions was confirmed more than once in similar tests before analysis of their effects in cell-based tests. In addition, the effectiveness of the two compounds was demonstrated to be dose proportional in the gel migration test.

実施例４
白血病細胞におけるＩｄ−ｂＨＬＨ結合のＡＧＸ５１撹乱及びＡＧＸ５１媒介Ｉｄ分解
本実施例は、例示の抗Ｉｄ化合物、Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（「ＡＧＸ５１」）の、ｂＨＬＨタンパク質とのＩｄ二量化を混乱させ、及び細胞システムにおける未結合Ｉｄタンパク質の迅速な分解を誘発する新たな能力を示す。ＥＴＯキメラ性タンパク質を発現するＴＡ白血病細胞をビヒクル対照（ＤＭＳＯ）又は２０μΜ濃度の、ラセミＡＧＸ５１、ＡＧＸ５１の精製された（＋）−鏡像異性体（下記の「鏡像異性体分離Ａ」における頂点「Ｅ−１」）、又はＡＧＸ５１の精製された（−）−鏡像異性体（鏡像異性体分離Ａにおける頂点「Ｅ−２」）で処理した。細胞溶解物（２０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移動させた。免疫ブロットをウエスタンブロッティングで分析し、化学発光で視角化した（図１）。Ｉｄ１及びＩｄ３に対する一次抗体をＢｉｏＣｈｅｃｋ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手した。 Example 4
AGX51 perturbation and AGX51-mediated Id degradation of Id-bHLH binding in leukemia cells This example illustrates an exemplary anti-Id compound, N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- New ability of (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide (“AGX51”) to disrupt Id dimerization with bHLH protein and to induce rapid degradation of unbound Id protein in cellular systems Indicates. TA leukemia cells expressing ETO chimeric protein were purified from vehicle control (DMSO) or purified (+)-enantiomer of racemic AGX51, AGX51 at a concentration of 20 μM (vertex “E” in “Enantiomer separation A” below). -1 "), or AGX51 was purified (-) - treated with enantiomer (vertices in enantiomer separation a" E-2 "). Cell lysate (20 μg) was separated by SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane. Immunoblots were analyzed by Western blotting and visualized by chemiluminescence (FIG. 1). Primary antibodies against Id1 and Id3 were obtained from BioCheck (Foster City, CA).

図１は、ＴＡ白血性細胞をラセミＡＧＸ５１で処理した後、Ｉｄ１及びＩｄ３の濃度が大きく減少することを示すウェスタンブロットゲルを提供する。本願で他の調査文書で記録された通り、（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体（「鏡像異性体分離Ａ」における第２溶出頂点「Ε−２」（下記参考））の抗Ｉｄ活性は、驚くべきことにラセミＡＧＸ５１の抗Ｉｄ活性よりも遥かにより大きく、（＋）−ＡＧＸ５１（「鏡像異性体分離Ａ」における第１溶出頂点「Ｅ−１」と表示）は、Ｉｄ１に対し最小の有効性のみを有する（図１）。   FIG. 1 provides a Western blot gel showing that the concentration of Id1 and Id3 is greatly reduced after treating TA leukemic cells with racemic AGX51. The anti-Id activity of the (−)-AGX51 enantiomer (the second eluting apex “Ε-2” (see below) in “Enantiomer separation A”), as recorded in other research documents in this application, is surprising It should be far greater than the anti-Id activity of racemic AGX51, and (+)-AGX51 (labeled first elution peak “E-1” in “Enantiomer Separation A”) is least effective against Id1 Only (FIG. 1).

実施例５
乳癌細胞におけるＩｄ−ｂＨＬＨ結合のＡＧＸ５１媒介撹乱及びＡＧＸ５１媒介Ｉｄ分解
Ｉｄに結合してｂＨＬＨタンパク質とのＩｄ二量化を混乱させ、未結合Ｉｄタンパク質分解を誘発するＡＧＸ５１の能力を乳癌の細胞モデルで立証した。４Ｔ１ネズミ科の乳癌細胞を前記実施例ＩＶにおけるようにビヒクル対照（ＤＭＳＯ）又は２０μΜ濃度の、ラセミＡＧＸ５１、ＡＧＸ５１の精製された（＋）−鏡像異性体（「頂点分離Ａ由来のＥ−１」）、又はＡＧＸ５１の精製された（−）−鏡像異性体（「頂点分離Ａ由来のＥ−２」）で処理した。細胞溶解物（２０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移動させた。免疫ブロットをウエスタンブロッティングで分析し、化学発光で視角化した。Ｉｄ１及びＩｄ３に対し同一の一次抗体（ＢｉｏＣｈｅｃｋ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用した。 Example 5
AGX51-mediated perturbation of Id-bHLH binding in breast cancer cells and binding to AGX51-mediated Id degradation Id disrupts Id dimerization with bHLH protein and demonstrates the ability of AGX51 to induce unbound Id proteolysis in a breast cancer cell model did. Racemic AGX51, purified (+)-enantiomer of racemic AGX51, AGX51 (“E-1 from vertex separation A”) in 4T1 murine breast cancer cells as in Example IV above, vehicle control (DMSO) or 20 μΜ concentration. ), Or a purified (−)-enantiomer of AGX51 (“E-2 from apex separation A”). Cell lysate (20 μg) was separated by SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane. Immunoblots were analyzed by Western blotting and visualized by chemiluminescence. The same primary antibody (BioCheck, Foster City, CA) was used against Id1 and Id3.

抗Ｉｄ化合物ＡＧＸ５１の立体特異的活性は、この乳癌モデル（４Ｔ１細胞）から部分的に確認された（図２）。しかし、これらの結果は、ＡＧＸ５１鏡像異性体の間のこの立体特異性に対する分子基盤をさらに複雑にする。乳癌細胞に相当するウェスタンブロットデータ（図２）は、再度抗Ｉｄ１結合撹乱及び分解に対して（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体が（＋）−ＡＮＧＸ５１鏡像異性体よりも遥かに優れていることを示すことを表す（弱いＩｄ１信号が全てのレーンで依然として検出可能であるが、これは除去又はノックダウンが任意の試料で完了していないことを示す）。   The stereospecific activity of the anti-Id compound AGX51 was partially confirmed from this breast cancer model (4T1 cells) (FIG. 2). However, these results further complicate the molecular basis for this stereospecificity among AGX51 enantiomers. Western blot data corresponding to breast cancer cells (FIG. 2) shows that the (−)-AGX51 enantiomer is again far superior to the (+)-ANGX51 enantiomer against anti-Id1 binding disruption and degradation. (Weak Id1 signal is still detectable in all lanes, indicating that removal or knockdown is not complete for any sample).

白血病細胞及び乳癌細胞の両方でＩｄ１タンパク質の濃度のこの立体特異的（−）−ＡＢＸ５１媒介破壊は、前記鏡像異性体が転移性疾患の予防及び治療媒介に強力な手段として深く関わっていることを示す。   This stereospecific (−)-ABX51-mediated disruption of the concentration of Id1 protein in both leukemia and breast cancer cells indicates that the enantiomer is deeply involved as a powerful tool in the prevention and treatment mediation of metastatic disease. Show.

白血病細胞に対する実施例ＩＶに示された結果とは対照的に、ＡＧＸ５１製剤（ラセミ体「混合」、又は（＋）又は（−）濃縮した鏡像異性体製剤）のいずれもが、乳癌細胞におけるＩｄ３分解を促進するＩｄ３結合を効果的に害しない損なわないようである。   In contrast to the results shown in Example IV for leukemia cells, any of the AGX51 formulations (racemic “mixed” or (+) or (−) enriched enantiomeric formulations) is an Id3 in breast cancer cells. It appears to be intact without effectively harming the Id3 bond that promotes degradation.

（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体に対する抗Ｉｄ１活性が独歩的なものでない場合、ＡＧＸ５１及びその鏡像異性体に対する予想しない立体特異的調査結果は、支配的追跡を提供する。比較すると、抗Ｉｄ１活性は（＋）−ＡＧＸ５１鏡像異性体では最小又は完全に欠乏している。（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体特異的活性は、白血病細胞から逆説的にＩｄ１及びＩｄ３の両方に対して強力である反面、前記モデルで（＋）−ＡＧＸ５１鏡像異性体製剤（「Ε−２」）に相当する濃度の活性が観察される（図１）。前記後者の観察は、実験の産物であり得、恐らく（＋）−ＡＧＸ５１製剤中に少量の（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体（５〜１０％）（鏡像異性体分離Ａからの分画「Ｅ−１」）がＩｄ３の濃度の強力な減少を媒介する可能性がある（３種類の製剤全部に対して観察される：ラセミ体「混合」；（＋）−鏡像異性体「Ｅ−１」；及び（−）−鏡像異性体「Ｅ−２」）（図１）。   If the anti-Id1 activity against the (−)-AGX51 enantiomer is not monopolistic, the unexpected stereospecific findings for AGX51 and its enantiomer provide dominant follow-up. In comparison, anti-Id1 activity is minimally or completely deficient in the (+)-AGX51 enantiomer. The (−)-AGX51 enantiomer specific activity is paradoxically strong against both Id1 and Id3 from leukemia cells, whereas in the model (+)-AGX51 enantiomer formulation (“Ε-2” ) Is observed (FIG. 1). The latter observation could be the product of an experiment, possibly with a small amount of (−)-AGX51 enantiomer (5-10%) (fraction “E” from enantiomer separation A in the (+)-AGX51 formulation. -1 ") may mediate a strong decrease in the concentration of Id3 (observed for all three formulations: racemic" mixed "; (+)-enantiomer" E-1 " And (-)-enantiomer "E-2") (Figure 1).

しかし、本願におけるＩｄ−１及びＩｄ３立体特異的データの対照は、この単純な「汚染物」の説明に対する疑問を提起する。あるいは、特定の癌細胞中により低い濃度のＩｄ３が存在するか、又はＩｄ１よりＩｄ３に対する全ての形態のＡＧＸ５１のより大きい活性が存在するかもしれない。しかし、この後者の解釈は、ＡＧＸ５１ラセミ体、（−）−ＡＧＸ５１又は（＋）−ＡＧＸ５１鏡像異性体のいずれもが、乳癌細胞での有意なＩｄ３分解を媒介しないようであることを示唆する、図２における結果により正当性を疑われる。   However, the contrast of Id-1 and Id3 stereospecific data in this application raises questions about this simple “contaminant” description. Alternatively, there may be a lower concentration of Id3 in certain cancer cells, or greater activity of all forms of AGX51 against Id3 than Id1. However, this latter interpretation suggests that neither the AGX51 racemate, the (−)-AGX51 or the (+)-AGX51 enantiomer appears to mediate significant Id3 degradation in breast cancer cells, The correctness is suspected by the result in FIG.

従って、（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体が白血病細胞で二つの複合体Ｉｄ１−及びＩｄ３−ｂＨＬＨ全部強力な不安定化及び破壊（本願に提供される検出濃度でＩｄ１及びＩｄ３タンパク質の全体除去に該当）を媒介し、これに比べて乳癌細胞では相当する抗Ｉｄ１立体特異的活性が（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体にはあるが、乳癌細胞で任意の形態のＡＮＧＸ５１に対し観察される抗Ｉｄ３活性は全くないか、又はほとんどない（三つの製剤が全て白血病細胞で強力な抗Ｉｄ３タンパク質除去の有効性を発揮することは驚くべきであり、当惑する発見として考えられるに違いない−恐らく研究のうち、この細胞型でのみ表される（−）−ＡＧＸ５１の微小な汚染及び特別な抗Ｉｄ３効力、又はあるいは不完全な立体特異的効果（ここで（−）−ＡＧＸ−５１は、極めて抗Ｉｄ１優勢であり、（＋）鏡像異性体に抗Ｉｄ３活性は全くないか、又はほとんどなく、但し（−）−ＡＧＸ５１及び（＋）−ＡＧＸ−５１鏡像異性体の両方が相当する抗Ｉｄ３活性を示す）が指定され得る。   Thus, the (−)-AGX51 enantiomer is a leukemia cell and the two complexes Id1- and Id3-bHLH are all strongly destabilizing and destroying (corresponding to the total removal of Id1 and Id3 proteins at the detection concentrations provided herein) Anti-Id3 activity observed against any form of ANGX51 in breast cancer cells, although there is a corresponding anti-Id1 stereospecific activity in breast cancer cells compared to this in the (−)-AGX51 enantiomer There is no or very little (all three preparations exert a potent anti-Id3 protein removal efficacy in leukemia cells and must be considered a perplexing finding-perhaps out of research (-)-AGX51 microfouling and special anti-Id3 potency, or alternatively incomplete stereospecific effects (where (- -AGX-51 is highly anti-Id1 predominant and the (+) enantiomer has little or no anti-Id3 activity, except that the (-)-AGX51 and (+)-AGX-51 enantiomers Both exhibit corresponding anti-Id3 activity).

本願で観察される（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体の驚くべき抗Ｉｄ効力は、生物系における立体化学の従来の理解事実に基づいては予想されれないものである。単純な生化学的システムにおける立体化学的相互作用の概念は、反対極性鏡像異性体の間における潜在的な異質的活性を予想する。しかし、当該分野では任意の化合物、例えばＡＮＧＸ５１の間における立体化学的機能異質性予測に対して類似の基礎を提供するにおいては明確に失敗した。ＡＧＸ５１は、Ｉｄと相互作用し、ｂＨＬＨタンパク質及びその他の複合体結合パートナーとのＩｄ二量化を混乱させることが示された画期的化合物である。これらの複合体結合対のうち特に同種及びヘテロ二量化ドメインを含む大型へリックス−ループ−へリックス構造は、従来の立体生化学モデル（例えば、単純な酵素−基質相互作用）では関連性がない。ＡＧＸ５１と類似の任意の化合物のうち、任意の種類の立体特異的効果の科学的に整粒された予測はないが、これはＡＧＸ５１が本願で最初に探求され記録された発見の発生初期分野の開拓抗Ｉｄ薬であるためである。   The surprising anti-Id potency of the (−)-AGX51 enantiomer observed in the present application is unexpected based on conventional understanding of stereochemistry in biological systems. The concept of stereochemical interaction in a simple biochemical system anticipates potential heterogeneous activity between opposite polarity enantiomers. However, the art has clearly failed to provide a similar basis for the prediction of stereochemical functional heterogeneity among any compounds, such as ANGX51. AGX51 is a breakthrough compound that has been shown to interact with Id and disrupt Id dimerization with bHLH proteins and other complex binding partners. Of these complex binding pairs, large helix-loop-helix structures, particularly containing homologous and heterodimerization domains, are not relevant in conventional stereobiochemical models (eg, simple enzyme-substrate interactions). . Of any compound similar to AGX51, there is no scientifically sized prediction of any kind of stereospecific effects, but this is an early field of discovery where AGX51 was first explored and recorded in this application. This is because it is a pioneering anti-Id drug.

実施例６
癌細胞株に対する抗Ｉｄ化合物の致命的な有効性
前立腺癌細胞株ＤＵ１４５及びＰＣ３（１０％ＢＣＳ中）を、米国種菌協会（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。細胞を１０％のＢＣＳ（ハイクローン、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）及び適切な抗生剤（ペニシリン／ストレプトマイシン、ファンギゾン、及びゲンタマイシン（ＩｎｖｉｔｒｏｇｎＩｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）培地で培養した。全ての細胞を５％のＣＯ₂を含有する完全加湿大気中で３７゜Ｃで培養した。 Example 6
Fatal efficacy of anti-Id compounds against cancer cell lines Prostate cancer cell lines DU145 and PC3 (in 10% BCS) were obtained from the American Inoculum Association (Rockville, MD). Cells were treated with Ham's F12 (Gibco, Carlsbad, CA) containing 10% BCS (Hyclone, Logan, UT) and appropriate antibiotics (penicillin / streptomycin, fungizone, and gentamicin (Invitrogn Inc., Carlsbad, CA)) All cells were cultured at 37 ° C. in a fully humidified atmosphere containing 5% CO ₂ .

５０％密集度で、細胞を１００μΜのＤＭＳＯ、１０００ｍＯｓｍｏｌのウレア＋ＮａＣｌ、１μΜのＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（ＡＧＸ５１）、１０μΜのＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド、及び１００μΜのＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル））−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド、１μＭＮ’−（４−イソプロピルフェニル）−１−ベンゾチオフェン−２−カルボヒドラジド、１０μＭＮ’−（４−イソプロピルフェニル）−１−ベンゾチオフェン−２−カルボヒドラジド、又は１００μΜのＮ’−（４−イソプロピルフェニル）−１−ベンゾチオフェン−２−カルボヒドラジドで処理した。細胞の形態及び成長を１週間、形態又は細胞死における変化に対する顕微鏡検査で毎日監視した。アトポーシスは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ．ＷＩ）社のカスパーゼ−Ｇｌｏ３／７試験システムを用いてカスパーゼ３及びカスパーゼ７活性を測定することによって決定した。   At 50% confluency, cells were treated with 100 μΜ DMSO, 1000 mOsmol urea + NaCl, 1 μΜ N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl ) -N-benzylpropionamide (AGX51), 10 μΜ N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropion Amide and 100 μΜ N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl))-3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide, 1 μMN ′-(4 -Isopropylphenyl) -1-benzothiophene-2-carbohydrazide, 10 μMN ′-(4-isopropylphenyl) -1-benzothiophene 2-carbohydrazide, or 100μΜ of N '- was treated with (4-isopropylphenyl) -1-benzothiophene-2-carbohydrazide. Cell morphology and growth were monitored daily for 1 week by microscopic examination for changes in morphology or cell death. Atoposis was determined by measuring caspase 3 and caspase 7 activity using the Promega (Madison. WI) caspase-Glo3 / 7 test system.

１００μｍの濃度のＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジル］プロピオンアミドは、３日内にＰＣ３細胞の大量細胞死を誘導し、処理６日後には、生存細胞が観察されなかった。ＤＵ１４５細胞に対する有効性は、３日後には明確ではなく、細胞は健康ではないように見え、対照に比べて増殖することができなかった。さらに、６日後には、ＤＵ１４５細胞のＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドを用いた処理が細胞死を誘導した。Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドも、１μΜだけ低い濃度でＤＵ１４５におけるアトポーシスを誘導し得る（図３（Ｃ））。また、細胞生存は、Ｎ’−（４−イソプロピルフェニル）−１−ベンゾチオフェン−２−カルボヒドラジドにも敏感であった。１μｍの濃度におけるＮ’−（４−イソプロピルフェニル）−１−ベンゾチオフェン−２−カルボヒドラジドは、ＤＵ１４５細胞で細胞死を誘導し得る。要約すると、Ｅ４７−Ｉｄ１相互作用の２種類の小分子阻害剤は、前立腺癌細胞株で大量の細胞死を誘導することが確認された。   N- (3- (Benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzyl] propionamide at a concentration of 100 μm was detected within 3 days in PC3 cells. Massive cell death was induced, and no viable cells were observed after 6 days of treatment. Efficacy against DU145 cells was not clear after 3 days and the cells appeared to be unhealthy and could not grow compared to the control. Furthermore, after 6 days, N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide from DU145 cells was used. Treatment that induced cell death. N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide also induces apoptosis in DU145 at concentrations as low as 1 μM (FIG. 3C). Cell survival was also sensitive to N '-(4-isopropylphenyl) -1-benzothiophene-2-carbohydrazide. N '-(4-isopropylphenyl) -1-benzothiophene-2-carbohydrazide at a concentration of 1 [mu] m can induce cell death in DU145 cells. In summary, two small molecule inhibitors of the E47-Id1 interaction have been confirmed to induce massive cell death in prostate cancer cell lines.

Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドの前立腺癌細胞に対する有効性の根源となる分子機序は、アトポーシスの一次メディエーター、カスパーゼ３／７の活性測定により評価される。Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（１−１００μｍ）を用いた処理は、ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞の全部でカスパーゼ３／７における有意な増加をもたらし、これはアトポーシス誘導剤のスタウロスポリン（１０μｍ）で処理した細胞におけるカスパーゼ活性よりもさらに高い。   Molecules underlying the effectiveness of N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide on prostate cancer cells The mechanism is evaluated by measuring the activity of caspase 3/7, the primary mediator of atoposis. Treatment with N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide (1-100 μm) was performed using DU145. And all of the PC3 cells resulted in a significant increase in caspase 3/7, which is even higher than the caspase activity in cells treated with the apoptosis-inducing agent staurosporine (10 μm).

実施例７
ＡＧＸ５１は、白血病細胞でｐ１６濃度を回復する
ＭＭＬ−ＡＦ９融合タンパク質を過発現するマウスから誘導された白血病細胞をＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（ＡＧＸ５１）の濃度を増加しながら処理した。１０μΜのＡＧＸ５１でＤＭＳＯ対照に比べて５０％成長抑制が観察された。総細胞溶解物を５０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸及び０．０２％のナトリウムアザイドを、新しく添加されたコンプリートプロテアーゼ阻害剤と共に含有する緩衝液を用いて収集した。タンパク質溶解物（２０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移動させた。免疫ブロットをウエスタンブロッティングで分析し、ウェスタンライトニング化学発光検出キットを用いて視角化した。図３に示された通り、ＩＣ₅₀濃度におけるＡＧＸ５１は、ＤＭＳＯビヒクルに比べてｐ１６を回復させた。前記研究に使用された一次抗体は、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ社（ＣＡ、ＵＳＡ）から購買した。 Example 7
AGX51 treats leukemia cells derived from mice overexpressing the MML-AF9 fusion protein that restores p16 concentration in leukemia cells. Treatment was performed with increasing concentrations of 3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide (AGX51). 50% growth inhibition was observed with 10 μΜ AGX51 compared to DMSO control. Total cell lysate was diluted with 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholic acid and 0.02% sodium azide. Collected with buffer containing with newly added complete protease inhibitor. Protein lysate (20 μg) was separated by SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane. Immunoblots were analyzed by Western blotting and visualized using a Western Lightning Chemiluminescence Detection Kit. As shown in FIG. 3, AGX51 at IC ₅₀ concentrations restored p16 compared to DMSO vehicle. The primary antibody used in the study was purchased from Epitomics, Burlingame (CA, USA).

実施例８
ＡＧＸ５１は、ヒト膀胱癌細胞からｐ２１濃度を回復する
ヒト膀胱癌細胞株にＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（ＡＧＸ５１）を濃度を増加しながら処理し、ＡＧＸ５１の濃度衝撃に対しては、上記でｐ１６のＡＧＸ５１による回復に対する実施例ＶＩＩに記載された通り加工した。総細胞溶解物を記載された通り収集し、加工し、分離し及びウェスタンブロットに移動させた。ウェスタンブロットは、図３に示されたとおり用いて視角化された。ＡＧＸ５１は、ｐ２１の顕著な用量依存性の回復を媒介した。ｐ１６回復活性の場合と同じように、前記活性は、細胞システムモデリング臨床疾患で強力な抗Ｉｄ有効性を表す。ｐ２１の場合、Ｉｄは、本来ｐ２１の細胞周期制御及び抗増殖効果に関わっているｐ２１の正常なＥタンパク質調節を損傷させる。これによって本発明の新たな抗Ｉｄ化合物及び方法が転移環境中のＩｄ濃度を機能的にノックダウンするか、又は除去し、ここでＩｄのノックダウンは直接的にｐ２１のＥタンパク質の誘導を遊離し、健康なｐ２１濃度を癌細胞に戻しておく。本発明のＡＧＸ５１及びその他の抗Ｉｄ化合物のこの分子回復活性が、本願で細胞の移動、細胞の増殖、アトポーシス及び転移性疾患の進行及び臨床的阻止に対するその他の重要機序上で強力な抗癌及び抗転移影響を媒介することが示される。 Example 8
AGX51 is a N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl group in human bladder cancer cell line that restores p21 concentration from human bladder cancer cells. ) -N-benzylpropionamide (AGX51) was processed in increasing concentrations and processed for concentration bombardment of AGX51 as described above in Example VII for recovery of p16 by AGX51. Total cell lysates were collected, processed, separated and transferred to Western blots as described. Western blots were visualized using as shown in FIG. AGX51 mediated a significant dose-dependent recovery of p21. As with p16 recovery activity, the activity represents a potent anti-Id efficacy in cellular system modeling clinical diseases. In the case of p21, Id impairs the normal E protein regulation of p21, which is inherently involved in p21 cell cycle control and antiproliferative effects. This allows the novel anti-Id compounds and methods of the present invention to functionally knock down or eliminate Id concentrations in the metastatic environment, where Id knockdown directly liberates induction of p21 E protein. The healthy p21 concentration is returned to the cancer cells. This molecular recovery activity of AGX51 and other anti-Id compounds of the present invention is a potent anti-cancer in this application on other important mechanisms for cell migration, cell proliferation, apoptosis and metastatic disease progression and clinical arrest And mediate anti-metastatic effects.

実施例９
抗Ｉｄ化合物は癌細胞株で重要な細胞周期制御を回復させる
ＤＵ１４５前立腺癌細胞を米国種菌協会（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。細胞に血清を２４時間の間欠乏させ、１μＭのＮ’−（４−イソプロピルフェニル）−１−ベンゾチオフェン−２−カルボヒドラジド（ＡＧＸ８）又はＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（ＡＧＸ５１）を２４時間処理した。処理後、細胞を洗浄し、エタノール中に固定し、プロピジウムヨウ化物で染色後、蛍光活性化された細胞分類（ＦＡＣＳ）分析（Ａｃｃｕｒｉ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ、Ｉｎｃ．，ＡｎｎＡｒｂｏｒ、ＭＩ）で分析した。細胞ペレットを懸濁させ、細胞周期の各識別される段階における細胞数をフローサイトメトリーで測定した。 Example 9
Anti-Id compounds were obtained from the American Inoculum Association (Rockville, MD) DU145 prostate cancer cells that restore important cell cycle control in cancer cell lines . Cells are intermittently deprived of serum for 24 hours and 1 μM N ′-(4-isopropylphenyl) -1-benzothiophene-2-carbohydrazide (AGX8) or N- (3- (benzo [d] [1,3 Dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide (AGX51) was treated for 24 hours. After treatment, cells were washed, fixed in ethanol, stained with propidium iodide, and then analyzed by fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis (Accury Cytometers, Inc., Ann Arbor, MI). The cell pellet was suspended and the number of cells at each identified stage of the cell cycle was determined by flow cytometry.

ＡＧＸ５１及びＡＧＸ８は、共に細胞周期制御を良好に回復することについて、明確な活性を示した。ＡＧＸ８は、細胞周期制御の救援に対して前記試験でＡＧＸ５１よりも有効でなかった。これらのデータは、Ｉｄ１が正常的な細胞周期制御を損なうか又は不能にすることによって、部分的に癌促進及び転移誘導作用を部分的に媒介するという報告と一致する。   Both AGX51 and AGX8 showed clear activity in successfully restoring cell cycle control. AGX8 was less effective than AGX51 in the test for rescue of cell cycle control. These data are consistent with reports that Id1 partially mediates cancer promotion and metastasis-inducing effects by impairing or disabling normal cell cycle control.

本願における研究に従い、細胞周期制御を媒介するＡＧＸ５１の能力は可能な立体特異的効果に関してさらに分析した。図５は、１つの特異的鏡像異性体、（−）−ＡＧＸ５１（「Ｅ２」）がＤＵ−１４５前立腺癌細胞における細胞周期制御の回復でラセミＡＧＸ５１（「Ｅ０」）より著しくより大きい活性である反面、残りの鏡像異性体（＋）−ＡＧＸ５１（「Ｅ１」）は事実上不活性のようであるという驚くべき結果を説明する。データは、サブＧ０（アトポーシス性）、Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ相における細胞％の平均値である。エラーバーはＳＥであり、＊はｐ＜０．０５と定める。処理濃度は、全て１０ｎＭであった。改善された細胞周期制御は、細胞周期のＧ２／ｍ相においては、より少ない細胞で例示され、サブＧ０細胞休眠相においては、より多くの細胞で例示される。   Following the study in this application, the ability of AGX51 to mediate cell cycle control was further analyzed for possible stereospecific effects. FIG. 5 shows that one specific enantiomer, (−)-AGX51 (“E2”) is significantly more active than racemic AGX51 (“E0”) in restoring cell cycle control in DU-145 prostate cancer cells. On the other hand, it explains the surprising result that the remaining enantiomer (+)-AGX51 ("E1") appears to be virtually inert. Data are mean values of% cells in sub-G0 (atoposis), G1, S and G2 / M phases. The error bar is SE, and * is defined as p <0.05. All treatment concentrations were 10 nM. Improved cell cycle control is illustrated with fewer cells in the G2 / m phase of the cell cycle and more cells in the sub-G0 cell dormancy phase.

前述した調査結果は、本発明の抗Ｉｄ化合物がＩｄ依存性の細胞周期調節喪失の強力な撹乱を媒介することを示す。従って、本発明は制御されない癌又は転移性細胞増殖と関係がある、Ｉｄ調節喪失細胞周期循環の制限を通じて癌の発生を直接的に無能力化する手段及び方法を提供する。関連した研究配置で、発明者はヒト疾患の細胞システム及び生体内モデルの両側で癌細胞の数多くの異なる種類の増殖速度を大きく減少させるものと示された、本願に記載された抗Ｉｄ化合物の直接的な抗増殖有効性を立証した。   The aforementioned findings indicate that the anti-Id compounds of the present invention mediate a strong perturbation of Id-dependent loss of cell cycle regulation. Thus, the present invention provides a means and method for directly disabling cancer development through limiting Id-regulated cell cycle circulation, which is associated with uncontrolled cancer or metastatic cell growth. In a related research arrangement, the inventor has shown that the anti-Id compounds described herein have been shown to greatly reduce the growth rate of many different types of cancer cells on both sides of the cellular system and in vivo model of human disease. Direct anti-proliferative efficacy was demonstrated.

ＡＧＸ５１の直接的な抗増殖活性は、他のモデルの特にヒト膀胱癌細胞における癌細胞の増殖を制限する用量に比例した方法で明らかにされている。ＵＭＵＣ−３ヒト膀胱癌細胞をＤＭＳＯ（対照）又は１０μΜ又は２０μΜのＡＧＸ５１で処理した。４８時間後、細胞の生存力数はトリパンブルー排除染色で決定した。また、全体の細胞溶解物は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸及び０．０２％のナトリウムアザイドを、新しく添加されたコンプリートプロテアーゼ阻害剤と共に含有する緩衝液を用いて収集した。３種類の２０μｇのタンパク質溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移動させた。免疫ブロットをＩｄ１、ｐ１６又はｐ２１に対するウエスタンブロッティングで分析し、ブロット上の結果はウェスタンライトニング化学発光検出キットを用いて視角化した。３種類の一次抗体は、Ｉｄ１、ｐ１６又はｐ２１に対するのである。Ｉｄ１に対する一次抗体はＢｉｏＣｈｅｃｋ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手した。ｐ１６及びｐ２１抗体はＰｉｅｒｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社、（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購買した。アクチン染色を内部標準化に用いた。   The direct antiproliferative activity of AGX51 has been demonstrated in a dose proportional manner that limits the growth of cancer cells in other models, particularly in human bladder cancer cells. UMUC-3 human bladder cancer cells were treated with DMSO (control) or 10 μΜ or 20 μΜ AGX51. After 48 hours, cell viability was determined by trypan blue exclusion staining. Also, the total cell lysate consisted of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholic acid and 0. 02% sodium azide was collected using a buffer containing freshly added complete protease inhibitor. Three 20 μg protein lysates were separated by SDS-PAGE and transferred to a nitrocellulose membrane. The immunoblot was analyzed by Western blotting against Id1, p16 or p21, and the results on the blot were visualized using a Western Lightning Chemiluminescence Detection Kit. The three primary antibodies are against Id1, p16 or p21. Primary antibody against Id1 was obtained from BioCheck (Foster City, CA). The p16 and p21 antibodies were purchased from Pierce Antibodies, Inc. (Rockford, IL). Actin staining was used for internal standardization.

これらの研究で、ＡＮＧＸ５１は、ＤＭＳＯ対照に比べておおよそ５０パーセントの成長抑制（１０μＭのＡＧＸ５１から観察される）を媒介した。また、これらの研究は、ＡＧＸ５１媒介の抗増殖活性がＩｄ１タンパク質におけるＡＧＸ−５１媒介減少と関係があり、ｐ２１濃度における増加を伴うことを立証した（ｐ１６濃度に対しては、実質的な効果がより少ない）。従って、ｐ２１活性／発現の直接的な調節物質として作用すると、ＡＮＧＸ５１もまた、細胞周期制御安定化及び内皮前駆細胞（ＥＰＣ）及びＥＰＣ依存性腫瘍関連血管新生の産生減少のために機能する。   In these studies, ANGX51 mediated approximately 50 percent growth inhibition (observed from 10 μM AGX51) compared to the DMSO control. These studies also demonstrated that AGX51-mediated antiproliferative activity was associated with an AGX-51-mediated decrease in Id1 protein, with an increase in p21 concentration (a substantial effect on p16 concentration). Fewer). Thus, when acting as a direct regulator of p21 activity / expression, ANGX51 also functions for cell cycle control stabilization and reduced production of endothelial progenitor cells (EPC) and EPC-dependent tumor-associated angiogenesis.

実施例１０
ＡＧＸ５１は、転移に必須のＩｄ依存性細胞の移動を遮断する
細胞の移動は、全般的に特定の細胞の、１つの場所からもう１つの場所に移動する能力を促進する数多くの個々の生物学的過程の和を反映する。細胞の移動は、腫瘍の転移に必須の統合機序であり、最も致命的な過程は新生物に関するものである（Ｃｈｉａｎｇ及びＭａｓｓａｇｕｅ、２００８年）。本実施例は本発明の例示の抗Ｉｄ化合物、例えばＡＧＸ５１がＩｄ依存性転移性細胞の移動遮断により転移性疾患を軽減又は予防する方法を示す。 Example 10
AGX51 blocks the migration of Id-dependent cells essential for metastasis. Cell migration generally promotes the ability of certain cells to migrate from one location to another in a number of individual biology. Reflects the sum of all processes. Cell migration is an integral mechanism essential for tumor metastasis, and the most lethal process involves the neoplasm (Chiang and Massague, 2008). This example shows how an exemplary anti-Id compound of the present invention, eg, AGX51, can reduce or prevent metastatic disease by blocking migration of Id-dependent metastatic cells.

細胞の移動潜在力は、従来の「スクラッチアッセイ」方法を使用し容易に明らかにされる。スクラッチアッセイの基本的なステップは、細胞単一層に「スクラッチ」を生成して、スクラッチ付近への細胞の移動開始時及び細胞の移動の間、一定の間隔の映像捕捉及び前記映像比較で細胞の移動速度定量を伴う。試験管内のスクラッチアッセイは、細胞の移動における細胞マトリックス及び細胞−細胞相互作用に関する研究に特に適している。   Cell migration potential is readily revealed using conventional “scratch assay” methods. The basic step of the scratch assay is to create a “scratch” in the cell monolayer that captures and captures images at regular intervals during the beginning of and during the movement of cells to the vicinity of the scratch. With movement speed quantification. In vitro scratch assays are particularly suitable for studies on cell matrix and cell-cell interactions in cell migration.

この研究のために、ＰＣ３細胞をプレーティングし、ほとんど密集するように生長させる。ｐ２００ピペットチップを用いて細胞層中にチャネルをスクラッチし、細胞を洗浄し、スクラッチ領域からの残骸を除去した。続いて、ＡＧＸ−５１投与ビヒクル（ＤＭＳＯ）を含有する培地又はＡＧＸ−５１を含有する培地を細胞に添加して、細胞を毎日撮影した。   For this study, PC3 cells are plated and grown to be almost confluent. The channel was scratched into the cell layer using a p200 pipette tip, the cells were washed and debris from the scratch area was removed. Subsequently, a medium containing AGX-51 administration vehicle (DMSO) or a medium containing AGX-51 was added to the cells, and the cells were photographed daily.

結果を図６に示された写真に提供する。４日後、投与ビヒクル（ＤＭＳＯ）を含有する培地で処理したプレーティングされた細胞試料中のスクラッチ又はチャネルが消失し、ＡＧＸ−５１で処理したプレーティングされた細胞試料中のチャネルのみが開いたままである。一定に繰り返したこの試験は、相当する結果を提供し、抗Ｉｄ活性ＡＧＸ５１が強力にＩｄ依存性細胞の移動を阻害するということを明らかに表す。従って、本発明はＩｄ依存性細胞の移動を減少又は無能力化して癌の発生及び転移を直接的に遮断する追加の手段及び方法を提供する。   The results are provided in the photograph shown in FIG. After 4 days, scratches or channels in the plated cell sample treated with medium containing the dosing vehicle (DMSO) disappeared, and only the channel in the plated cell sample treated with AGX-51 remained open. is there. This test, repeated regularly, provides comparable results and clearly demonstrates that anti-Id activity AGX51 potently inhibits Id-dependent cell migration. Accordingly, the present invention provides additional means and methods to directly block cancer development and metastasis by reducing or disabling Id-dependent cell migration.

実施例１１
ＡＧＸ５１は、癌の成長及び転移に必須のＩｄ依存性血管新生を遮断する
ＶＥＧＦ−１６５及びＦＧＦ−２処理マトリゲルプラグを第０日にＣ５７ＢＬ／６マウスに移植した。マウスをビヒクル又はＡＧＸ５１で処理した。抗Ｉｄ化合物をプラグ（２５μｇ／ｍｇ）に又は毎日ｉｐ処理（３０又は１００ｍｇ／ｋｇ）で１０日間提供した。プラグは第１０日目に収合し、固定させて、パラフィン包埋させた。各プラグの３個セクション（５μΜの厚さ）を抗ＣＤ３１抗体で染色し、ヘマトキシリン及びエオシン染色を用いて対照染色した。ＣＤ３１陽性微細血管をプラグ毎にした全体断面に対して計数し、平均微細血管の密度±ＳＤを決定した。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ試験を統計分析に用いた。 Example 11
AGX51 was implanted in C57BL / 6 mice on day 0 with VEGF-165 and FGF-2 treated Matrigel plugs that block Id-dependent angiogenesis essential for cancer growth and metastasis . Mice were treated with vehicle or AGX51. Anti-Id compounds were delivered to plugs (25 μg / mg) or daily ip treatment (30 or 100 mg / kg) for 10 days. The plugs were assembled on day 10 and fixed and embedded in paraffin. Three sections (5 μ （thick) of each plug were stained with anti-CD31 antibody and control stained with hematoxylin and eosin staining. CD31 positive microvessels were counted against the entire cross section for each plug and the mean microvessel density ± SD was determined. The Student'st test was used for statistical analysis.

本研究からの微細血管データは図７に提供される。ビヒクル対照動物に比べて、全てのＡＧＸ５１対象は新たな血管の形成に対して著しく保護された。研究に対する統計処理は次の通りであった：ｐ＞０．０５（ｎ＝７）、２５μｇ／ｐｌｕｇ、３０及び１００ｍｇ／ｋｇの用量グループそれぞれに対してビヒクル（ｎ＝９）に比べ０．０１（ｎ＝６）及び０．０１（ｎ＝７）。最大の保護は１００ｍｇ／ｋｇ、ｑｄのｉｐ投与で４４％であった。マトリゲルプラグのスライスを研究の終わりに組織学的に分析し、対照対象に比べＡＧＸ５１処理対象で完成血管及び、従って、内皮細胞の存在における主な減少を明らかにした。   Microvascular data from this study is provided in FIG. Compared to vehicle control animals, all AGX51 subjects were significantly protected against the formation of new blood vessels. The statistical treatment for the study was as follows: p> 0.05 (n = 7), 0.01 compared to vehicle (n = 9) for each of the 25 μg / plug, 30 and 100 mg / kg dose groups. (N = 6) and 0.01 (n = 7). Maximum protection was 44% with ip administration of 100 mg / kg qd. Matrigel plug slices were analyzed histologically at the end of the study and revealed a major reduction in the presence of completed blood vessels and thus endothelial cells in AGX51 treated subjects compared to control subjects.

関連した研究で、雌性ヌードマウスにＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を同所移植で（乳腺脂肪パッド）移植した。移植前に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にトリプシン処理し、遠心分離して、５０％のｐＤＰＢＳ／５０％のマトリゲル溶液中に５ｘ１０⁶細胞／５０μＬの濃度で再懸濁させ、使用時まで冷凍した。冷凍したマトリゲルを４゜Ｃで２４時間の間解凍した。注射器、針及び細胞は使用される時まで氷で維持した。注射前に、細胞を逆転により軽く混合し、必要な体積だけ２５ｘ５／８”ゲージの針が備えられた、冷たい注射器に提供した。泡の発生に有意しながら注射器を軽く逆転させ混合した。４〜６週齢で、マウスに１０ｘ１０⁶のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を含有する５０μｌのマトリゲルを同所移植部位に注射した。細胞はケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（６ｍｇ／ｋｇ）により麻酔された動物の右側の尻尾の方の乳腺脂肪パッドに２６ｘ３／８”ゲージの針を用いて同所移植で注射した。続いて、腫瘍が１００ｍｍ³の体積に定着されるようにし、その後、動物（通常は５動物／治療グループ）に無作為でビヒクル（ＤＭＳＯ）又は６０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１ １日２回をｉｐで処理した。処理の４１日後、マウスを子宮頸部脱臼で犠牲にして、腫瘍を摘出し、１０％の緩衝した（中性）ホルマリンに組織病理学的分析用に固定させた。組織をホルマリンから取り出して３ｘＰＢＳで洗浄し、２４〜４８時間の間４゜ＣでＰＢＳ中３０％のスクロースに浸るようにして冷凍保護し、パラフィンに包埋した。パラフィンブロックはスライドに組み入れるために５μｍの厚さセクションに凍結セクションする時まで−２０゜Ｃ又は８０゜Ｃで保管した。スライドを抗ＣＤ３１で処理して、ＰＢＳで洗浄し、内皮細胞をアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）システムを用いて検出した。スライドをヘマトキシリン及びエオシン染色でカウンター染色し、核が見えるようにした。 In a related study, female nude mice were transplanted with MDA-MB-231 human breast cancer cells by orthotopic transplantation (mammary fat pad). Prior to transplantation, MDA-MB-231 cells were trypsinized, centrifuged, resuspended in 50% pDPBS / 50% Matrigel solution at a concentration of 5 × 10 ⁶ cells / 50 μL and frozen until use. . The frozen Matrigel was thawed at 4 ° C for 24 hours. Syringes, needles and cells were kept on ice until used. Prior to injection, the cells were gently mixed by reversal and provided to a cold syringe equipped with a 25 x 5/8 "gauge needle in the required volume. The syringe was gently reversed and mixed, significantly affecting foam development. At -6 weeks of age, mice were injected with 50 μl of Matrigel containing 10 × 10 ⁶ MDA-MB-231 cells at the orthotopic implantation site, cells were anesthetized with ketamine (120 mg / kg) / xylazine (6 mg / kg). The animals were injected by orthotopic implantation using a 26 × 3/8 ”gauge needle into the mammary fat pad towards the right tail of the animals. Subsequently, the tumor was allowed to settle to a volume of 100 mm ³ , after which animals (usually 5 animals / treatment group) were treated randomly with vehicle (DMSO) or 60 mg / kg AGX51 twice daily with ip. did. After 41 days of treatment, mice were sacrificed by cervical dislocation and tumors were removed and fixed in 10% buffered (neutral) formalin for histopathological analysis. The tissue was removed from formalin, washed with 3 × PBS, cryopreserved by immersion in 30% sucrose in PBS at 4 ° C. for 24-48 hours, and embedded in paraffin. Paraffin blocks were stored at −20 ° C. or 80 ° C. until frozen sections into 5 μm thick sections for incorporation into slides. Slides were treated with anti-CD31 and washed with PBS, and endothelial cells were detected using an avidin-biotin complex (ABC) system. The slides were counterstained with hematoxylin and eosin staining so that nuclei were visible.

これらの研究試料で一貫して観察された通り、内皮細胞がある血管がビヒクル処理組織学的サンプルでは目立ったが、ＡＧＸ５１処理された動物では一貫して欠けていた。   As consistently observed in these study samples, blood vessels with endothelial cells were prominent in vehicle-treated histological samples but consistently absent in AGX51-treated animals.

これらの調査結果は、本発明のＡＧＸ５１及び他の化合物の抗Ｉｄ機能がＩｄによって媒介された病原性血管新生の特異的封鎖まで拡張されるということを直接表明した。転移性カスケードにおけるこの媒介機序は、腫瘍関連血管新生の封鎖を通じた癌管理及び転移性疾患の予防及び減少のための特に強力な手段を提供する。   These findings directly expressed that the anti-Id function of AGX51 and other compounds of the present invention is extended to a specific blockade of pathogenic angiogenesis mediated by Id. This mediation mechanism in the metastatic cascade provides a particularly powerful tool for cancer management through the blockade of tumor-associated angiogenesis and prevention and reduction of metastatic disease.

実施例１２
内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の阻害によってもたらされるＡＧＸ５１の抗癌有効性
本発明の追加の組成物及び方法は、別々に内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の産生抑制及び生存減少により腫瘍関連血管新生を損傷させる。ＥＰＣは、新たな腫瘍の血管新生に対する寄与（及び腫瘍の成長により引き起こされる血管破壊から定着した腫瘍の救出）による腫瘍の成長及び転移促進を担う。ＥＰＣの産生及び生存は、癌及び転移性システムでＩｄ依存性であり、従って本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法がＥＰＣの軽減又は予防を通じて及び／又はＥＰＣ機能及び発生能の不全を通じて転移を効果的に軽減又は予防する。 Example 12
Anti-cancer efficacy of AGX51 resulting from inhibition of endothelial progenitor cells (EPC) Additional compositions and methods of the present invention separately impair tumor-associated angiogenesis by inhibiting endothelial progenitor cell (EPC) production and reducing survival . EPC is responsible for promoting tumor growth and metastasis through the contribution of new tumors to angiogenesis (and rescue of established tumors from vascular destruction caused by tumor growth). EPC production and survival is Id-dependent in cancer and metastatic systems, and thus the anti-Id compositions and methods of the present invention can effect metastasis through reduction or prevention of EPC and / or through failure of EPC function and developmental potential. Alleviate or prevent.

本実施例は、本願における他の実施例で提示されたものと同一の試験対象を用い、非処理対照動物で癌の進行及び転移を誘導する病態中の対照動物を抗Ｉｄ処理動物と比較する。本実施例の追加の目的は、本発明の組成物及び方法を用いて処理又は未処理された動物でＥＰＣ濃度のＩｄ依存性変化を示すことである。本実施例によると、前述した実施例ＩＶ〜ＶＩＩで記載された処理及び未処理モデル動物の各クラスがＥＰＣ濃度に対して評価される（例えば、ＥＰＣマーカー（例えばＧＦＰ＋及びＶＥ−カドヘリン＋）に対し誘導された抗体を用いる多変量流動分類を用いて、骨髄又は循環血液からの試料でＥＰＣ測定）。本発明の抗Ｉｄ組成物及び方法、特に（−）−ＡＮＧＸ５１で処理した動物は、抗Ｉｄ化合物媒介された、ＥＰＣ濃度における用量依存性の減少を表す（対照動物、及びより少ない活性の抗Ｉｄ化合物、例えばラセミＡＮＧＸ５１及び特に抗転移不活性（＋）−ＡＮＧＸ５１鏡像異性体で処理した動物と比較）。   This example uses the same test subjects as presented in other examples in this application, and compares control animals in pathological conditions that induce cancer progression and metastasis in untreated control animals to anti-Id treated animals. . An additional objective of this example is to show Id-dependent changes in EPC concentration in animals treated or untreated with the compositions and methods of the present invention. According to this example, each class of treated and untreated model animals described in Examples IV-VII above is evaluated for EPC concentrations (eg, EPC markers (eg GFP + and VE-cadherin +)). EPC measurements on samples from bone marrow or circulating blood using multivariate flow classification with antibodies directed against). The anti-Id compositions and methods of the present invention, particularly animals treated with (−)-ANGX51, exhibited a dose-dependent decrease in EPC concentration mediated by anti-Id compounds (control animals and less active anti-Id). Compound, for example racemic ANGX51 and especially compared to animals treated with antimetastatic inactive (+)-ANGX51 enantiomers).

実施例１３
抗Ｉｄ化合物が生体内腫瘍の成長を抑制する
ヌードマウス（ｎ＝８／治療グループ）にＭＤＡ２３１ヒト癌細胞を移植する。移植１４日後、マウスをｉｐでＤＭＳＯ（ビヒクル）又はＤＭＳＯ中の５０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１で処理した。全てのマウスには、第８日第２２日に始まり、５日間連続してｉｖで７．５ｍｇ／ｋｇを投与した。ボックスプロットは移植５３日後の腫瘍の体積である（研究の最終日）。 Example 13
NDA231 human cancer cells are transplanted into nude mice (n = 8 / treatment group) in which the anti-Id compound suppresses tumor growth in vivo . Fourteen days after transplantation, mice were treated ip with DMSO (vehicle) or 50 mg / kg AGX51 in DMSO. All mice received 7.5 mg / kg iv starting on day 8 and day 22 for 5 consecutive days. Box plot is tumor volume 53 days after transplantation (last day of study).

対照グループにおける動物２匹及び処理グループにおける動物１匹が第５３日に斃死した（データは使用しない）。全ての生存した動物に対する腫瘍の大きさの調査結果が、図１３に提供される。図８に示された通り、ＡＧＸ５１を用いた処理は腫瘍の成長に対して約５０％の有意な［ビヒクル（ＤＭＳＯ）対照に比べてｐ＝０．０５］マイナス効果を提供する。   Two animals in the control group and one animal in the treatment group were moribund on day 53 (data not used). Tumor size survey results for all surviving animals are provided in FIG. As shown in FIG. 8, treatment with AGX51 provides approximately 50% significant [p = 0.05 compared to vehicle (DMSO) control] negative effects on tumor growth.

実施例１４
ＡＧＸ５１の用量の最適化
ＣＤ１雄性マウス（３／時点）にｉｐでＤＭＳＯ中の３０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１を処理した。投与前及び投与後、０．２５、０．５、１．０、２．０、４．０、８．０及び４２時間目に後眼窩の穿孔によりへパリン添加されたチューブに血液を収集した。試験のための１μｇの内部標準（Ｓ１０９０３７、Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及び１００μＬのｐＨ７．４ＰＢＳを血液から収穫した血清に添加した。混合物を１分間１ｍＬのメチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）と共にボルテックスさせ、ＭＴＢＥを乾燥Ｎ₂（ｇ）と共に遠心分離して除去した。ＭＴＢＥ除去後、残留する残渣を２００μＬのＡＣＮで再構成した。５μＬの前記溶液を電気噴霧ＬＣ−ＭＳセットがカップリングされている２．０ｘ２５０ｍｍのＣ１８カラムを用いるＬＣ／ＭＳで分析し、ＨＰＬＣ流出物中のｍ／ｚ４３２（ＡＧＸ５１）及びｍ／ｚ４６８（Ｓ１０９０３７）をモニターした。ＡＣＮ（８５）／Ｈ₂Ｏ＋０．１％のギ酸の流速は、２００μＬ／分である。繰り返し１００μＬ対照血漿に０、０．０３、０．１１、０．３３、１又は３μｇのＡＧＸ５１を添加して、記載された通り試料を分析して補正曲線サンプルを２回製作した。補正試料における４３２対ｍ／ｚ４６８の割合（ｙ）及び、試料におけるＡＧＸ５１の濃度（ｘ）を線形回帰で分析し、傾き（ｍ）及び切片（ｂ）を収得し、実験試料で前記割合をＡＧＸ５１の濃度で変換するために使用した。試験からの典型的なイオンクロマトグラムを図９に提供する。 Example 14
Optimized dose of AGX51 CD1 male mice (3 / time point) were treated ip with 30 mg / kg AGX51 in DMSO. Blood was collected in heparinized tubes by retroorbital perforation at 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 and 42 hours before and after dosing. . 1 μg internal standard (S109037, Aldrich, St. Louis, MO) and 100 μL pH 7.4 PBS for testing were added to serum harvested from blood. The mixture was vortexed with 1 mL of methyl t-butyl ether (MTBE) for 1 minute and the MTBE was removed by centrifugation with dry N ₂ (g). After removal of MTBE, the remaining residue was reconstituted with 200 μL of ACN. 5 μL of the solution was analyzed by LC / MS using a 2.0 × 250 mm C18 column coupled with an electrospray LC-MS set, and m / z 432 (AGX51) and m / z 468 (S109037) in the HPLC effluent. Was monitored. The flow rate of ACN (85) / H ₂ O + 0.1% formic acid is 200 μL / min. Repeatedly add 0, 0.03, 0.11, 0.33, 1 or 3 μg of AGX51 to 100 μL control plasma and analyze the sample as described to generate two correction curve samples. The ratio (y) of 432 to m / z 468 in the corrected sample and the concentration (x) of AGX51 in the sample were analyzed by linear regression to obtain the slope (m) and the intercept (b). Used to convert at a concentration of. A typical ion chromatogram from the test is provided in FIG.

図１０に示された通り、ＡＧＸ５１は、第１時点で１５分に発生したＣ_maxに速く吸収された。観察されたプロファイルは、第１区画からの除去に対するｔ_1/2がおおよそ３０分、第二区画からの末端除去ｔ_1/2がおおよそ６時間で二つの区画モデルと一致した。薬剤はおおよそ８０リットル／ｋｇのＶｚ／Ｆに広く分布され、１００ｍＬ／ｋｇ／分を超えるＧｌ／Ｆに比較的迅速に取り除かれた。 As shown in FIG. 10, AGX51 was rapidly absorbed by C _max generated at 15 minutes at the first time point. The observed profile was consistent with the two compartment model with a t _1/2 for removal from the first compartment of approximately 30 minutes and an end removal t _1/2 from the second compartment of approximately 6 hours. The drug was widely distributed at approximately 80 liters / kg Vz / F and was removed relatively quickly to Gl / F above 100 mL / kg / min.

様々な投与シミュレーションがＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）における二つの区画モデルを用いて行われ、ＰＫパラメーターはＷｉｎＮｏｎｌｉｎにおける二つの区画モデルに対する血漿濃度データの適合度から算出した。標的基準は、様々な癌細胞培養システム、例えば、ＤＵ１４５（前記実施例ＶＩ及びＶに示される）で増殖を抑制するためのＡＧＸ５１に対し観察されたｌＣ₅₀値の範囲の下限である２μΜ（０．４３１μｇ／ｍＬ）を超えるＡＧＸ５１の血清濃度を維持するためである。図１１に示された通り、シミュレーションは６０ｍｇ／ｋｇ、１日２回の投与が標的基準を達成することを提示した。 Various dosing simulations were performed using the two compartment model in WinNonlin (Pharsight, Sunnyvale, CA), and PK parameters were calculated from the fit of plasma concentration data for the two compartment model in WinNonlin. The targeting criterion is 2 μΜ (0 μm, the lower limit of the range of 1C ₅₀ values observed for various cancer cell culture systems such as DU145 (shown in Examples VI and V above) for inhibiting AGX51 to inhibit proliferation. This is to maintain a serum concentration of AGX51 exceeding .431 μg / mL). As shown in FIG. 11, the simulations showed that 60 mg / kg, twice daily dosing achieves the target criteria.

実施例１５
ＡＧＸ５１がヒト対象における癌薬効予測のための許容されたネズミ科モデルで生体内肺癌転移を極めて減少させる
本実施例は本願の新たな抗Ｉｄ化合物及び方法の強力な、生体内抗転移の有効性を示す。ルイス肺癌の尾静脈注射に従来の方法による肺転移の測定を後続した。３０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに７．５ｘ１０⁵のルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞／動物を移植した。移植７日後、グループ毎に５Ｍ／５Ｆに毎日腹腔内に（ｉｐ）２５日間ビヒクル（ＤＭＳＯ）、又は５０ｍｇ／ｋｇのラセミＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（ＡＧＸ５１）を投与した。移植１４日後、もう１つのグループの５Ｍ／５Ｆ動物に毎日ｉｐで１８日間５０ｍｇ／ｋｇのＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドを処理した。腫瘍を第７日〜１４日まで３回測定した。１４日目に腫瘍を摘出した。図４から立証されるように、動物は摘出後１８日目である第３２日に肺転移の存在に対して検屍した。第１４日目の腫瘍は各処理グループに対しておおよそ同じ大きさであったため、実験の末期で明らかにされた肺転移の任意の差は、比較グループにおける異なる腫瘍の大きさによりもたらされるものでないことを保障する。 Example 15
This example shows that AGX51 significantly reduces in vivo lung cancer metastasis in an accepted murine model for predicting cancer efficacy in human subjects. This example demonstrates the potent, in vivo antimetastatic efficacy of the new anti-Id compounds and methods of the present application. Indicates. The tail vein injection of Lewis lung cancer was followed by measurement of lung metastasis by conventional methods. Thirty C57BL / 6 mice were transplanted with 7.5 × 10 ⁵ Lewis lung cancer (LLC) cells / animals. Seven days after transplantation, 5M / 5F daily for each group (ip) vehicle (DMSO) for 25 days, or 50 mg / kg racemic N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5- Yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide (AGX51) was administered. 14 days after transplantation, another group of 5M / 5F animals were given daily ip at 50 mg / kg N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2- Methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide was treated. Tumors were measured 3 times from day 7 to day 14. The tumor was removed on the 14th day. As demonstrated by FIG. 4, the animals were examined for the presence of lung metastases on day 32, 18 days after removal. Since day 14 tumors were roughly the same size for each treatment group, any differences in lung metastases revealed at the end of the experiment were not caused by different tumor sizes in the comparison group To ensure that.

図１２に示されたデータは、例示の本発明の抗Ｉｄ薬、ＡＧＸ５１を用いたヒト疾患の動物モデルの処理を通じて生体内媒介された、これまでにない抗転移活性を示す。データが表明するように、本研究でラセミＡＧＸ５１は、５個の転移性腫瘍巣よりもさらに多く提示する処理された動物数における５０％超えの減少を媒介する。本願におけるデータは、さらに複数の試験試料で一致することが示され、さらに抗Ｉｄ有効性（細胞におけるＩｄタンパク質のＡＧＸ５１媒介Ｉｄ結合撹乱及び除去、及び転移に重要なＩｄ依存細胞の移動の破壊）の他の証拠とも一致する。本願におけるこれらの及び他の研究結果により、本発明の抗Ｉｄ化合物は哺乳動物対象における転移性癌発生及び進行を治療、軽減及び予防する強力な手段を提供する。   The data shown in FIG. 12 shows unprecedented anti-metastatic activity mediated through treatment of animal models of human disease with an exemplary anti-Id drug of the invention, AGX51. As the data express, racemic AGX51 mediates a reduction of more than 50% in the number of treated animals presenting more than 5 metastatic tumor foci in this study. The data in this application was further shown to be consistent with multiple test samples, and further anti-Id efficacy (AGX51-mediated Id binding disruption and removal of Id protein in cells, and disruption of Id-dependent cell migration important for metastasis) Consistent with the other evidence. Based on these and other research results in the present application, the anti-Id compounds of the present invention provide a powerful means of treating, reducing and preventing metastatic cancer development and progression in mammalian subjects.

実施例１６
ＡＧＸ５１は抗転移薬有効性の臨床予測モデルを用いた生体内乳癌転移を極めて減少させる
本実施例は臨床的乳癌治療有効性の広く許容されたネズミ科モデルを用いた乳癌媒介に巣をおく。乳癌転移は全世界的にヒトにおける癌死亡の主な原因である。乳癌転移の共通部位は肺である。前記実施例ＩＩＩは、マウスにおける移植された肺腫瘍の転移に対するＡＧＸ５１の治療有効性を立証した反面、本研究は試験対象の血流に直接注射された乳癌細胞に対するＡＧＸ５１の抗転移効果を測定する。 Example 16
AGX51 significantly reduces in vivo breast cancer metastasis using a clinical predictive model of anti-metastatic drug efficacy This example nests in breast cancer mediation using a widely accepted murine model of clinical breast cancer treatment efficacy. Breast cancer metastasis is the leading cause of cancer death in humans worldwide. A common site for breast cancer metastasis is the lung. While Example III demonstrated the therapeutic efficacy of AGX51 on transplanted lung tumor metastasis in mice, this study measures the anti-metastatic effect of AGX51 on breast cancer cells injected directly into the bloodstream of the test subject .

ルシフェラーゼ遺伝子でタグされた乳癌細胞（４Ｔ１）をＢａｌｂ／ｃマウスの尾静脈を通じて注射した（マウス当り５．０ｘ１０⁴細胞、５個のマウスグループ）。肺転移の発生を生物発光映像化により監視した。腫瘍細胞注射後第１日目に、マウスを１日２回、ｉ．ｐ．で４週間投与ビヒクル（ＤＭＳＯ）（５マウス）又は５０ｍｇ／ｋｇのＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（ＡＧＸ５１）（５マウス）で処理した。生物発光映像化を週１回行った。４週目の週末には、肺を収集して転移性負荷に対して分析した（図１３）。 Breast cancer cells (4T1) tagged with a luciferase gene were injected through the tail vein of Balb / c mice (5.0 × 10 ⁴ cells per mouse, group of 5 mice). The occurrence of lung metastases was monitored by bioluminescence imaging. On the first day after tumor cell injection, mice were i. p. Vehicle (DMSO) (5 mice) or 50 mg / kg N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl)- Treated with N-benzylpropionamide (AGX51) (5 mice). Bioluminescence imaging was performed once a week. On the 4th weekend, lungs were collected and analyzed for metastatic burden (Figure 13).

図１３に示された通り、ＡＧＸ５１を用いた処理は本実施例の直接的な注射モデルで乳癌転移を極めて減少させた。抗Ｉｄ処理された動物のこれまでにない４０％が完全に転移せずに残っていた。ＤＭＳＯ対照対象に比べてＡＧＸ５１処理では観察される転移の平均数で５倍数超えの、さらに大きい減少があった。   As shown in FIG. 13, treatment with AGX51 significantly reduced breast cancer metastasis in the direct injection model of this example. An unprecedented 40% of the anti-Id treated animals remained completely metastasized. There was an even greater reduction in AGX51 treatment compared to the DMSO control subjects, with an average number of metastases observed that was more than fivefold.

実施例１７
ＡＧＸ５１の抗転移効果が（−）−ＡＮＧＸ５１鏡像異性体により優勢に又は独歩的に媒介される立体特異性である
（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体の激甚な抗Ｉｄ１優勢性を特徴とするＡＧＸ５１鏡像異性体の立体特異的抗Ｉｄ結合及びＩｄ分解（除去）活性を明らかにした上記の先駆的研究を基に、転移性カスケードで細胞過程に影響を与えるＡＧＸ５１の立体特異的効果を説明するために追加調査を実施した。 Example 17
AGX51 mirror image characterized by the striking anti-Id1 predominance of the (−)-AGX51 enantiomer, wherein the anti-metastatic effect of AGX51 is stereospecificity mediated predominantly or independently by the (−)-ANGX51 enantiomer To explain the stereospecific effects of AGX51 that affect cellular processes in a metastatic cascade, based on the above pioneering studies that revealed stereospecific anti-Id binding and Id degradation (removal) activity of isomers An additional survey was conducted.

実施例Ｖの方法論に後続して、ラセミＡＧＸ５１及び（−）−ＡＧＸ５１及び（＋）−ＡＧＸ５１の二つの鏡像異性体の抗転移効果を並んで比較した。   Following the methodology of Example V, the anti-metastatic effects of the two enantiomers of racemic AGX51 and (−)-AGX51 and (+)-AGX51 were compared side by side.

ＤＭＳＯ又はラセミＡＧＸ５１の投与を受けた５個の対象、及びそれぞれ（−）−ＡＧＸ５１又は（＋）ＡＧＸ５１鏡像異性体で処理する５匹のマウスの追加グループを用いて前記実施例Ｖに記載されたプロトコルによって転移を評価した。これらの研究のために、ＡＧＸ５１鏡像異性体をより高い濃度の鏡像異性体の濃縮（おおよそ９８％の鏡像異性体純度）を提供する、異なる分離方法を用いて精製した。興味深いことに、第２濃縮方法（「鏡像異性体の分離方法Ｂ」）は第１分離方法Ａで提示されたプロファイルと正反対の溶出プロファイルを提供した（方法Ｂでは（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体が１番目（「頂点１」）に溶出され、（＋）−ＡＧＸ５１鏡像異性体が２番目（「頂点２」）に溶出される）。このように明らかに異なる製造デザイン及び溶出プロファイルは、（−）−ＡＧＸ５１及び（＋）−ＡＧＸ５１鏡像異性体の各物理化学特性の更なる解明及び説明のために提供される。   Described in Example V above with 5 subjects receiving DMSO or racemic AGX51 and an additional group of 5 mice treated with (−)-AGX51 or (+) AGX51 enantiomer, respectively. Metastasis was assessed by protocol. For these studies, the AGX51 enantiomer was purified using a different separation method that provided a higher concentration of enantiomer enrichment (approximately 98% enantiomeric purity). Interestingly, the second enrichment method (“Enantiomer Separation Method B”) provided an elution profile that was the exact opposite of the profile presented in the first separation method A (in Method B, the (−)-AGX51 enantiomer). Is eluted first ("Vertex 1") and the (+)-AGX51 enantiomer is eluted second ("Vertex 2"). Such distinctly different manufacturing designs and elution profiles are provided for further elucidation and explanation of the respective physicochemical properties of the (−)-AGX51 and (+)-AGX51 enantiomers.

本研究では（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体により表されるもう１つの優れた抗Ｉｄ活性を明らかにした；即ち、生体内抗転移効果媒介に対する激甚な優勢又は独歩的な立体特異性。生物発光映像化の際、陽性転移性信号がビヒクル又は（＋）−ＡＮＧＸ鏡像異性体の投与を受けた全ての動物の肺領域で観察された（（＋）−ＡＧＸ５１鏡像異性体グループの動物のうち２匹は、映像化ステップ前に斃死）。これに比べ、ラセミＡＧＸ５１、又は活性、（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体の投与を受けた５匹のマウスのうち、ただ３匹のみ肺で検出可能な転移性信号を示した。   This study revealed another excellent anti-Id activity represented by the (−)-AGX51 enantiomer; ie, a radical predominance or monotonic stereospecificity for mediating antimetastatic effects in vivo. During bioluminescence imaging, a positive metastatic signal was observed in the lung region of all animals receiving vehicle or (+)-ANGX enantiomer ((+)-AGX51 enantiomer group of animals). Two of them died before the imaging step). Compared to this, only 3 out of 5 mice receiving racemic AGX51 or active, (−)-AGX51 enantiomers showed detectable metastatic signals in the lungs.

前述した研究と手続上同一の確認研究中、封入体に対する２週予備可視化は、作成を省略してこの文を短縮する。本研究はグループ毎にＤＭＳＯビヒクル、ラセミＡＮＧＸ５１、（−）−ＡＮＧＸ５１（「頂点１」）、又は（＋）−ＡＮＧＸ５１（「頂点２」）で処理する動物を伴う。図１４に示された通り、ＤＭＳＯ及び（＋）−ＡＮＧＸ５１（「頂点２」）グループの４匹ずついる動物のうち、２匹では全て広範囲な肺転移（胸部領域における著しい生物発光により表示）が発生した反面、ラセミＡＮＧＸ５１及び（−）−ＡＮＧＸ５１（「頂点１」）を処理した動物は全部転移信号が完全に清潔なまま残っている。   During a confirmation study that is procedurally identical to the previous study, a two-week preliminary visualization of inclusion bodies omits the creation and shortens this sentence. This study involves animals treated with DMSO vehicle, racemic ANGX51, (−)-ANGX51 (“Vertex 1”), or (+)-ANGX51 (“Vertex 2”) per group. As shown in FIG. 14, of the four animals in the DMSO and (+)-ANGX51 (“Vertex 2”) groups, two all had extensive lung metastases (indicated by significant bioluminescence in the breast region). On the other hand, all animals treated with racemic ANGX51 and (−)-ANGX51 (“Vertex 1”) remain completely clean of the metastatic signal.

実施例１８
抗癌薬協調的療法−ＡＧＸ５１及びタキサン
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にトリプシン処理し、遠心分離して５０％のＤＰＢＳ／５０％マトリゲル溶液に５ｘ１０⁶細胞／５０μＬの濃度で再懸濁させ、冷凍した。使用前に、冷凍したマトリゲルを４゜Ｃで２４時間の間解凍した。注射器、針及び細胞は使用される時まで氷で維持した。注射前に、細胞を逆転により軽く混合し、２５ｘ５／８”ゲージの針が備えられた、冷たい注射器で必要な体積だけを取った。注射器を軽く逆転させて泡が生じないように注意して混合した。 Example 18
Anticancer drug coordinated therapy—AGX51 and taxane MDA-MB-231 cells trypsinized, centrifuged and resuspended in 50% DPBS / 50% Matrigel solution at a concentration of 5 × 10 ⁶ cells / 50 μL and frozen . Prior to use, the frozen Matrigel was thawed at 4 ° C for 24 hours. Syringes, needles and cells were kept on ice until used. Prior to injection, the cells were gently mixed by reversal and only the required volume was taken with a cold syringe equipped with a 25 x 5/8 "gauge needle. Care should be taken to gently reverse the syringe to avoid foaming. Mixed.

１０ｘ１０⁶のＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を含んでいる５０μＬマトリゲルをケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（６ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した４〜６週齢の雌性ヌードマウスの右側の尻尾の方の乳腺脂肪パッドに２６ｘ３／８”ゲージの針を用いてｉｍ投与して同所移植で注射した。腫瘍が１００ｍｍ³の体積を確保するようにした後、動物を無作為で分けて試験化合物又はビヒクルを用いてｉｐ処理した。 50 μL Matrigel containing 10 × 10 ⁶ MDA-MB231 cells was placed on the mammary fat pad on the right tail of 4-6 week old female nude mice anesthetized with ketamine (120 mg / kg) / xylazine (6 mg / kg). Im administered using a 26 x 3/8 "gauge needle and injected by orthotopic implantation. After ensuring that the tumor had a volume of 100 mm ³ , the animals were randomly divided and ip with the test compound or vehicle. Processed.

移植１４日後、マウスにｉｐでＤＭＳＯ（ビヒクル）、１５ｍｇ／ｋｇパクリタキセルのＤＭＳＯ溶液、１５ｍｇ／ｋｇ、パクリタキセルのＤＭＳＯ溶液を、６．７ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、又は６０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１と共に又は６０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１だけ単独で５日間処理した。腫瘍の体積はデジタルカリパス及び下記式を用いた研究を通じて決定した：腫瘍の体積＝１／２（長さｘ幅²）、式中、最大の縦直径は腫瘍の長さであり、最大の横直径は幅である。４１日の投与後、マウスを子宮頸部脱臼で犠牲にして、最終腫瘍の体積及び重量を記録し比較した。 14 days after transplantation, mice were given ip with DMSO (vehicle), 15 mg / kg paclitaxel in DMSO, 15 mg / kg, paclitaxel in DMSO with 6.7 mg, 20 mg, or 60 mg / kg of AGX51 or 60 mg. / Kg AGX51 alone was treated for 5 days. Tumor volume was determined through a study using a digital caliper and the following formula: tumor volume = 1/2 (length x width ² ), where the maximum longitudinal diameter is the length of the tumor and the maximum horizontal The diameter is the width. After 41 days of administration, the mice were sacrificed by cervical dislocation and the final tumor volume and weight were recorded and compared.

図１５及び１６に示された通り、１９日目に、パクリタキセルは単独で腫瘍の成長をおおよそ４０％減少させた。ＡＧＸ５１は、単独で１日２回６０ｍｇ／ｋｇでも腫瘍の成長に影響を与えられなかった。しかし、３種類のＡＧＸ５１用量全部−１日２回６、７、２０及び６０ｍｇ／ｋｇは、ｐ≦０．０１に腫瘍の成長を著しく減少させ、６０ｍｇ／ｋｇの用量は研究出発時よりも小さい、多くの腫瘍に最大の有効性を提供した。   As shown in FIGS. 15 and 16, on day 19, paclitaxel alone reduced tumor growth by approximately 40%. AGX51 alone had no effect on tumor growth even at 60 mg / kg twice a day. However, all three AGX51 doses-twice daily, 6, 7, 20, and 60 mg / kg significantly reduced tumor growth at p ≦ 0.01, with the 60 mg / kg dose being smaller than at the start of the study Provided the greatest efficacy for many tumors.

追加グループのマウスを１５ｍｇ／ｋｇ、ｑ５ｄ、用量に比べて２種類の異なる用量のパクリタキセル−７．５ｍｇ／ｋｇ及び２２．５ｍｇ／ｋｇ、ｑ５ｄと共に６０ｍｇ／ｋｇ、１日２回，ＡＧＸ５１−で処理した。７．５ｍｇ／ｋｇの用量は、追加の有効性を提供しない反面、２２．５ｍｇ／ｋｇにおける有効性は１５ｍｇ／ｋｇの用量で観察されるものよりも改善された点を表さなかった。予備研究で使用された２５ｍｇ／ｋｇの用量に比べ、マウスが有意な低体温症を経験して、１５ｍｇ／ｋｇのグループに比べて無気力であったが、動物が２２．５ｍｇ／ｋｇの用量に対してある程度より良い耐性を示した。   Additional groups of mice were treated with 15 mg / kg, q5d, two different doses of paclitaxel-7.5 mg / kg and 22.5 mg / kg, qmg with 60 mg / kg, twice daily, AGX51- did. While the 7.5 mg / kg dose did not provide additional efficacy, the efficacy at 22.5 mg / kg did not represent an improvement over that observed at the 15 mg / kg dose. Mice experienced significant hypothermia compared to the 25 mg / kg dose used in the preliminary study and were lethargic compared to the 15 mg / kg group, but the animals were at a dose of 22.5 mg / kg. It showed better resistance to some extent.

第２研究で、ヌードマウス（ｎ＝５／６０ｍｇ／ｋｇ、１日２回，ＡＧＸ５１及びパクリタキセル用量（ｎ＝８）を除いた処理グループに、再びＭＤＡ２３１ヒト癌細胞を移植した。移植１４日後、マウスにｉｐでＤＭＳＯ（ビヒクル）、１５ｍｇ／ｋｇパクリタキセル、又は１５ｍｇ／ｋｇ、パクリタキセルと共に６０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１を処理した。本研究でマウスに対するパクリタキセルの１５ｍｇ／ｋ、ｑ５ｄ用量の効果は、以前の研究においてより、さらに明確であった：数日間の重症の無気力、低体温症及び不良な外観。腫瘍の成長に対するパクリタキセル単独処理の有効性は発生が遅かった。しかし、最終的にパクリタキセル単独では腫瘍の成長をおおよそ５０％減少させ、これらの研究で６０ｍｇ／ｋｇ、１日２回であるＡＧＸ５１は、図１７及び１８に示された通り、この有効性を著しく（ｐ≦０．０１）増加させた。   In the second study, nude mice (n = 5/60 mg / kg, twice daily, treatment group except AGX51 and paclitaxel dose (n = 8) were transplanted again with MDA231 human cancer cells. 14 days after transplantation. Mice were treated ip with DMSO (vehicle), 15 mg / kg paclitaxel, or 15 mg / kg, and 60 mg / kg AGX51 with paclitaxel.In this study, the effects of 15 mg / k, q5d dose of paclitaxel on mice Were more apparent: severe lethargy, hypothermia and poor appearance for several days.Effectiveness of treatment with paclitaxel alone on tumor growth was slow to develop, but eventually paclitaxel alone Reduced growth by approximately 50%, with these studies being 60 mg / kg twice daily AGX51, as shown in FIGS. 17 and 18, significantly the efficacy (p ≦ 0.01) increased.

追加の研究は、腫瘍の退行を最大化するＡＧＸ５１の投与時間を調査した。ヌードマウス（ｎ＝４／処理グループ）にＭＤＡ２３１ヒト癌細胞を移植した。移植１４日後、マウスにｉｐでＤＭＳＯ（ビヒクル）、４０ｍｇ／ｋｇのＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドを単一投与／１日又は２０ｍｇ／ｋｇの用量／１日で処理した。第４１日目に腫瘍の体積における観察された平均増加（±ＳＤ）（最終値から初期値を引く）は２４２．６９±１３３．５８（ｑｄ）及び４７．９８±８６．３１ｍｍ³（１日２回）であり、差は統計的に有意であった（ｐ＜０．０３）。 Additional studies investigated the time of administration of AGX51 that maximized tumor regression. NDA231 human cancer cells were transplanted into nude mice (n = 4 / treatment group). 14 days after transplantation, mice were given ip in DMSO (vehicle), 40 mg / kg N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl)- N-benzylpropionamide was treated at a single dose / day or a dose of 20 mg / kg / day. The observed mean increase in tumor volume (± SD) on day 41 (subtract initial value from final value) is 242.69 ± 133.58 (qd) and 47.98 ± 86.31 mm ³ (1 day 2) and the difference was statistically significant (p <0.03).

本願における追加の研究は、ＡＧＸ５１及びドセタキセルの組み合わせた抗癌有効性を評価した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をトリプシン処理して、遠心分離し、５０％ＤＰＢＳ／５０％マトリゲル溶液で５ｘ１０⁶細胞／５０μＬの濃度で再懸濁させ、冷凍した。使用前に、冷凍したマトリゲルを４゜Ｃで２４時間の間解凍した。注射器、針及び細胞は使用される時まで氷で維持した。注射前に、細胞を逆転により軽く混合し、２５ｘ５／８”ゲージの針が備えられた、冷えた注射器で必要な体積だけ吸い上げた。注射器を軽く逆転させて泡が生じないように注意しながら混合した。 Additional studies in this application evaluated the combined anticancer efficacy of AGX51 and docetaxel. MDA-MB-231 cells were trypsinized, centrifuged, resuspended in 50% DPBS / 50% Matrigel solution at a concentration of 5 × 10 ⁶ cells / 50 μL and frozen. Prior to use, the frozen Matrigel was thawed at 4 ° C for 24 hours. Syringes, needles and cells were kept on ice until used. Prior to injection, the cells were gently mixed by reversal and aspirated to the required volume with a cold syringe equipped with a 25 x 5/8 "gauge needle. Mixed.

１０ｘ１０⁶のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を含有する５０μＬマトリゲルをケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（６ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した４〜６週齢の雌性ヌードマウスの右側の尻尾の方の乳腺脂肪パッドに２６ｘ３／８”ゲージの針を用いてｉｍ投与して同所移植で注射した。続いて、腫瘍を１００ｍｍ³の体積で定着した後、動物を無作為で分けて試験品又はビヒクルを用いてｉｐ処理した。移植１４日後、マウスにｉｐでＤＭＳＯ（ビヒクル）、１５ｍｇ／ｋｇのドセタキセルｑ５ｄ、又は１５ｍｇ／ｋｇのドセタキセルｑ５ｄ及び２０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１ １日２回を処理した。図１９に示された通り、第４１日の腫瘍の体積（最終−初期）における平均（±ＳＤ）は、ドセタキセル及びドセタキセル＋ＡＧＸ５１それぞれに対して４９７．４７±６３．０８（ｎ＝５）及び５７．５５±８７．６３ｍｍ³（ｎ＝４）であった。差は有意であった（ｐ＜０．００１）。 Mammary fat pad on the right tail of 4-6 week old female nude mice anesthetized with ketamine (120 mg / kg) / xylazine (6 mg / kg) 50 μL matrigel containing 10 × 10 ⁶ MDA-MB-231 cells Implanted with a 26 x 3/8 "gauge needle and injected by orthotopic implantation. Subsequently, after the tumor was established in a volume of 100 mm ³ , the animals were randomly divided using a test article or vehicle. Fourteen days after transplantation, mice were treated ip with DMSO (vehicle), 15 mg / kg docetaxel q5d, or 15 mg / kg docetaxel q5d and 20 mg / kg AGX51 twice a day, as shown in FIG. As shown, the mean (± SD) in tumor volume (final-early) on day 41 is docetaxel and docetaxel + AGX51, respectively. Relative 497.47 ± 63.08 (n = 5) and 57.55 was ^{± 87.63mm 3 (n = 4)} . The difference was significant (p <0.001).

実施例１９
Ｉｄ１遺伝子大Ｉｄ１タンパク質抑制有効性の比較
Ｉｄ１ノックアウトマウスにマトリゲル中の１０６ＬＬＣ細胞を移植した。腫瘍がおおよそ３５０ｍｍ³まで成長するようにした後、ＤＭＳＯビヒクル対照、１５ｍｇ／ｋｇ、ｑ５ｄ．パクリタキセル又は１５ｍｇ／ｋｇ、ｑ５ｄ、パクリタキセル＋３０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１、１日２回１９ｄで処理した（５／処理グループ）。研究にはＭＳ４に指定した２個の追加グループを含ませた：上記で記載された通り移植され、ＤＭＳＯビヒクル対照又は３０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１、１日２回１９ｄで処理されたＣ５７ＢＬ６マウス。図２０及び２１に示された通り、ＡＧＸ５１は、Ｃ５７ＢＬ７６マウスに移植されたＬＬＣ腫瘍に対しては全く効果がなかった（平均体積±ＳＤがＤＭＳＯ処理された動物に対しては、５３７４．１８±１９１２．２５ｍｍ³である反面、ＡＧＸ５１処理された動物に対しては５１４３．４４±１１２２．１７ｍｍ³）。普通の抗成長有効性の文献における報告とは反対に、ＭＳ４におけるＩｄ１欠損は非常に速く成長するＬＬＣ細胞で抗成長有効性を全く提供しなかった。また、より一層驚くべきことに、パクリタキセル（ＰＡＸ）処理が最初の１８日の研究では単に非常に平凡な有効性を有し、第２０日には全く有効性を示さなかった。しかし、ＡＧＸ５１＋パクリタキセルの組み合わせは有意な（ｐ＜０．０１）抗成長有効性を提供した。 Example 19
Comparative Id1 knockout mice Id1 gene large Id1 protein inhibiting efficacy were transplanted 106LLC cells in Matrigel. After the tumors to grow roughly to 350 mm ^3, DMSO vehicle control, 15mg / kg, q5d. Treated with paclitaxel or 15 mg / kg, q5d, paclitaxel + 30 mg / kg AGX51, 19d twice a day (5 / treatment group). The study included 2 additional groups designated MS4: C57BL6 mice transplanted as described above, treated with DMSO vehicle control or 30 mg / kg AGX51, 19d twice daily. As shown in FIGS. 20 and 21, AGX51 had no effect on LLC tumors transplanted into C57BL76 mice (5374.18 ± for animals whose mean volume ± SD was DMSO treated). whereas a 1912.25mm ^3, 5143.44 ± 1122.17mm ³ for AGX51 treated animals). Contrary to reports in the normal anti-growth efficacy literature, Id1 deficiency in MS4 did not provide any anti-growth efficacy in very fast growing LLC cells. Also, more surprisingly, paclitaxel (PAX) treatment had only very mediocre efficacy in the first 18 days of study and showed no efficacy at day 20. However, the combination of AGX51 + paclitaxel has provided significant (p <0.01) anti-growth efficacy.

実施例２０
ＡＧＸ５１の安全性
本発明の抗Ｉｄ化合物は、ほとんどの従来の化学療法薬に対して観察されるものと対照的に、Ｉｄタンパク質を特異的に標的とし、根本的な細胞機能の撹乱又は実質的毒性の提供なく、その強力な抗癌及び抗転移効果を媒介するようである。ＡＧＸ５１の安全性プロファイルを評価するために、８〜１２週齢、ＣＤ１マウス（５／治療グループ）にｑ５ｄでＤＭＳＯ、１５ｍｇ／ｋｇ、ｑｄ、ＰＴＸ、６０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１、１日２回又は１５ｍｇ／ｋｇ、ｑｄ、パクリタキセル＋６０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１、１日２回（ＭＳ３に指定）を投与した。へパリン添加された血液試料を第６日目に最終Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（ＡＧＸ５１）投与後１２時間目に後眼窩の穿孔で収得した。血液から収穫血漿を標準臨床化学及び血液学分析水及び正常なパクリタキセル及びＡＧＸ５１に対し分析した。 Example 20
AGX51 Safety The anti-Id compounds of the present invention specifically target the Id protein and, in contrast to those observed for most conventional chemotherapeutic drugs, disrupt or substantially disrupt the fundamental cellular function. It appears to mediate its potent anticancer and antimetastatic effects without providing toxicity. To assess the safety profile of AGX51, 8-12 weeks old, CD1 mice (5 / treatment group) in DM5, DMSO, 15 mg / kg, qd, PTX, 60 mg / kg AGX51 twice daily or 15 mg at 15 mg / kg / Kg, qd, paclitaxel + 60 mg / kg of AGX51, twice a day (designated MS3). The heparinized blood sample was subjected to a final N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzyl on day 6. Twelve hours after administration of propionamide (AGX51), it was obtained by posterior orbital perforation. Harvested plasma from blood was analyzed for standard clinical chemistry and hematology analysis water and normal paclitaxel and AGX51.

パクリタキセルだけを単独で処理したものに比べ、重量又は臨床化学（ＡＬＢ、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＭＹ、ＴＢＩＬ、ＢＵＮ、Ｃａ、ＰＨＯＳ、ＣＲＥ、ＧＬＵ、Ｎａ、Ｋ、ＴＰ＆Ｇｌｏｂ）又は血液学（ＷＢＣ、Ｌｙｍ、Ｍｏｎ、Ｇｒａ、ＲＢＣ、Ｈｇ、赤血球容積率＆血小板）値に対してＡＧＸ５１の逆効果は全く観察されなかった。同様に、ＤＭＳＯビヒクル対照に比べこれらの同一の測定に対してＡＧＸ５１に対し全く有効性が観察されなかった。データはＡｂａｘｉｓ ＶｅｔＳｃａｎ分析器（ＵｎｉｏｎＣｉｔｙ、ＣＡ）を用いて収得された。これらの実験室試験に対する代表的なセットに対するデータが図２２に提供される。   Weight or clinical chemistry (ALB, ALP, ALT, AMY, TBIL, BUN, Ca, PHOS, CRE, GLU, Na, K, TP & Glob) or hematology (WBC, Lym, compared to those treated with paclitaxel alone No adverse effect of AGX51 was observed on the values of (Mon, Gra, RBC, Hg, erythrocyte volume fraction & platelets). Similarly, no efficacy was observed for AGX51 for these same measurements compared to the DMSO vehicle control. Data was acquired using an Abaxis VetScan analyzer (UnionCity, CA). Data for a representative set for these laboratory tests is provided in FIG.

実施例２１
抗Ｉｄ化合物は加齢黄斑変性において病原性血管新生から保護する
ＡＧＸ５１の抗Ｉｄ及び抗血管新生活性はヒト加齢黄斑変性（ＡＭＤ）治療用疾患機序及び薬効の予測で広く許容されたモデルシステムを用いて、マウスの網膜で病原性血管新生に対して強力に保護することが本実施例で明らかにされている。 Example 21
Anti-Id compounds protect against pathogenic angiogenesis in age-related macular degeneration The anti-Id and anti-angiogenic activity of AGX51 is a widely accepted model for predicting disease mechanisms and drug efficacy for the treatment of human age-related macular degeneration (AMD) Using this system, it is demonstrated in this example that the mouse retina provides strong protection against pathogenic angiogenesis.

Ｉｄ３欠損マウス１４匹（ｎ＝９対照及びｎ＝５マウス）の網膜をフェニレフリン／アトロピンを用いて１０分間拡張させた後、ケタミン／キシレン（５：１）を用いて５分間麻酔し、レーザー熱傷を負わせた。カバースリップを透明な眼科用媒体を用いて目の表面に（下部側）位置させ、レーザー用レンズとして作用するようにした。光を目に照らして視神経及び神経網膜を可視化した。続いて、微細レーザーを眼球裏側に垂直となるように設定した網膜の裏に集中させた。熱傷は、血管間の視神経から離れている（血管は避けるようにする）１光学ディスクに位置させた。レーザーに対する設定事項は、下記の通りであった：持続時間１００ｍｓ、強さ２５０ｍＷ及び直径５０ミクロン。レーザー熱傷は神経網膜を貫通し、網膜色素上皮性（ＲＰＥ）層に巣をおいてＢｒｕｃｈ’ｓ膜の破裂を引き起こした。熱傷直後、流体のポケットが熱傷周辺に形成され、熱傷地点を表示した。ポケットは熱傷の熱で膨張した流体によるものである。ポケットは結局小さくなるが、熱傷地点は依然として観察される。   The retinas of 14 Id3-deficient mice (n = 9 control and n = 5 mice) were expanded with phenylephrine / atropine for 10 minutes, then anesthetized with ketamine / xylene (5: 1) for 5 minutes, and laser burns Owed. The cover slip was placed on the eye surface (lower side) using a transparent ophthalmic medium to act as a laser lens. The optic nerve and neural retina were visualized in the light. Subsequently, the fine laser was focused on the back of the retina set to be perpendicular to the back of the eyeball. The burn was located on one optical disc, away from the optic nerve between blood vessels (avoid blood vessels). The settings for the laser were as follows: duration 100 ms, intensity 250 mW and diameter 50 microns. The laser burn penetrated the neural retina and caused the Bruch's membrane to rupture, nest in the retinal pigment epithelial (RPE) layer. Immediately after the burn, a pocket of fluid was formed around the burn, indicating the burn spot. The pocket is due to the fluid expanded by the heat of the burn. The pocket will eventually become smaller, but the burn spot will still be observed.

Ｂｒｕｃｈ’ｓ膜の破裂後２週目に、動物を犠牲にして、その眼球を収穫し、パラホルムアルデヒドに一晩置いた。続いて、眼球をＰＢＳで洗浄し、ＲＰＥ−脈絡膜−鞏膜複合体を神経網膜から分離した。続いて、複合体（厚さが約２００ミクロン）を一晩トリトンＸ−１００及び抗コラーゲンＩＶ抗体を含有するＰＢＳで培養した後、一晩洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ接合された二次抗体と一晩培養した。続いて、複合体を一晩洗浄し、評価用色褪せ防止媒体（ａｎｔｉ−ｆａｄｅｍｅｄｉｕｍ）に平らに組み入れた。共巣顕微鏡検査を用いたＺ線映像化を用いて、４ミクロンセクションを複合体の上部から下部まで映像化した（約５０個のイメージ）。続いて、中心瘢痕／血管が生じた領域（複合体の略中間）を手作業で輪郭取り、映像は蛍光の背景濃度に対して独立して分析した。背景蛍光を各イメージの概括した領域から差し引きした後、それぞれ相対的蛍光に対して分析した。続いて、全体蛍光を計算した。４つの熱傷があるそれぞれの動物のｎが１である。データは平均病変体積±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で表現し、ＳＰＳＳソフトウェアを用いて分析した。実験グループの間の差の統計的有意性は、体積の片側試験（ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−試験）を用いて算出された。図２３に示された通り、Ｉｄ３欠損はＢｒｕｃｈ’ｓ膜のレーザー誘導破壊後の血管新生を損傷させ、これはＡＭＤの前記モデルシステムで病原性血管新生反応の全体発生でＩｄ３が少なくとも部分的に関わっていることを示す。前記モデルは広く許容可能であり、数多くの抗ＡＭＤ薬開発に成功的に用いられている。   Two weeks after Bruch's membrane rupture, the animals were sacrificed and their eyes were harvested and placed in paraformaldehyde overnight. Subsequently, the eyeball was washed with PBS, and the RPE-choroid-capsular complex was separated from the neural retina. Subsequently, the complex (thickness of about 200 microns) is incubated overnight in PBS containing Triton X-100 and anti-collagen IV antibody, then washed overnight, and overnight with AlexaFluor-conjugated secondary antibody. did. Subsequently, the composite was washed overnight and incorporated flat in an anti-fade medium for evaluation. Using Z-ray imaging with confocal microscopy, 4 micron sections were imaged from the top to the bottom of the complex (approximately 50 images). Subsequently, the area where the central scar / vessel was created (approximately in the middle of the complex) was manually outlined and the images were analyzed independently of the background concentration of fluorescence. Background fluorescence was subtracted from the generalized area of each image and then analyzed for relative fluorescence. Subsequently, total fluorescence was calculated. Each animal with 4 burns has a n = 1. Data were expressed as mean lesion volume ± standard error of the mean (SEM) and analyzed using SPSS software. Statistical significance of differences between experimental groups was calculated using a one-tailed Student's t-test. As shown in FIG. 23, Id3 deficiency damages angiogenesis after laser-induced disruption of Bruch's membrane, which is at least partially due to the overall development of pathogenic angiogenic response in the AMD model system. Show that you are involved. The model is widely acceptable and has been successfully used in the development of numerous anti-AMD drugs.

Ｉｄ３欠損動物に対する平均ＣＮＶ面積は野生型動物の面積のおおよそ半分であり、結果は統計的に大きく有意である（ｐ＜０．００１）。   The average CNV area for Id3-deficient animals is approximately half that of wild type animals, and the results are statistically significant (p <0.001).

（前記Ｉｄ遺伝子ノックアウト研究で提示されたような）相当する保護性抗ＡＭＤ効果が現在、驚くべきことに本発明の小分子抗Ｉｄ薬、ＡＮＧＸ５１を用いて達成される。さらに予想できないことは、ＡＮＧＸ５１の抗ＡＭＤ（抗血管新生）効果が硝子体内（影響された目に直接）、だけでなく腹腔内に（薬剤が安定した、有効な状態で網膜組織に移動しなければならない）処理された対象で観察されたという点である。さらに先駆的なことは、本願におけるデータがＡＧＸ５１の抗血管新生及び抗ＡＭＤ有効性が立体特異的であり、活性が主要に又は独歩的に新たな（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体にあるということを説得力を持って示す。   The corresponding protective anti-AMD effect (as presented in the Id gene knockout study) is now surprisingly achieved using the small molecule anti-Id drug of the invention, ANGX51. What is even more unexpected is that the anti-AMD (anti-angiogenic) effect of ANGX51 must move not only into the vitreous (directly in the affected eye), but also into the peritoneal cavity (drugs are stable and effective). It must be observed in the treated object. What is even more pioneering is that the data in this application show that the anti-angiogenesis and anti-AMD efficacy of AGX51 is stereospecific and the activity is mainly or monopolously in the new (−)-AGX51 enantiomer. With persuasive power.

図２４を参照すると、（−）−ＡＧＸ５１は、上記と同一の方法で硝子体内に（ｉｖｔ）投与された。Ｃ５７ＢＬマウス（５／処理グループ）は第１日にレーザー処理によりＣＮＶを有するようになった。試験マウスにＡＧＸ５１（「Ｅ２」）（１０μｇ）の（−）−鏡像異性体を投与し、対照にはビヒクル（７０％のＤＭＳＯ／３０％の水）を投与する。レーザー処理１時間後、投与はｉｖｔで第７日目にした。第１４日に犠牲にして、病変の大きさの測定（フルオレセイン標識されたデキストランを用いて遂行）を行った。   Referring to FIG. 24, (−)-AGX51 was administered intravitreally (ivt) in the same manner as described above. C57BL mice (5 / treatment group) came to have CNV by laser treatment on day 1. Test mice receive AGX51 (“E2”) (10 μg) of the (−)-enantiomer, and controls receive vehicle (70% DMSO / 30% water). One hour after laser treatment, administration was ivt on day 7. At the sacrifice of day 14, lesion size was measured (performed with fluorescein-labeled dextran).

図２５を参照すると、（−）−ＡＧＸ５１を上記と同一の方法で用いて腹腔内に（ｉｐ）投与した。Ｃ５７ＢＬマウス（１０／治療グループ）は第１日目にレーザー処理によりＣＮＶを有するようになった。試験マウスにレーザー処理後２時間目にＡＧＸ５１（「Ｅ２」）（２０ｍｇ／ｋｇ、ｑｄ）の（−）−鏡像異性体を投与した後、１４日間毎日２０ｍｇ／ｋｇ、１日２回を投与し、対照マウスにはビヒクル（７０％のＤＭＳＯ／３０％の水）を提供した。第１４日に犠牲にして、病変の大きさの測定を完了した。   Referring to FIG. 25, (−)-AGX51 was administered intraperitoneally (ip) using the same method as described above. C57BL mice (10 / treatment group) became CNV on the first day by laser treatment. The test mice were administered AGX51 (“E2”) (20 mg / kg, qd) (−)-enantiomer at 2 hours after laser treatment, followed by 20 mg / kg twice daily for 14 days. Control mice were provided with vehicle (70% DMSO / 30% water). At the sacrifice of day 14, the measurement of lesion size was completed.

前述した研究は本発明の例示の抗Ｉｄ化合物によってもたらされる強力な抗血管新生及び抗ＡＭＤを示す。強力な抗Ｉｄ活性は、再びこれらの研究で使用された（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体を用いて立証される。図２３〜２５を比較すると、（−）−ＡＧＸ５１がＩｄ３遺伝的ノックダウンにより収得されるように、抗血管新生及び抗ＡＭＤ有効性を媒介するということが明らかである。二つの抗Ｉｄ薬試験（図２４及び２５）で、観察された抗血管新生活性の程度は、対象で表示される病原性血管新生欠陥の５０％超えの減少に該当して、ヒトにおけるＡＭＤ及び他の病原性血管新生疾患治療において本発明により提供される臨床的に非常に有効な媒介であることが予測される。硝子体内（ｉｖｔ）送達の直接経路に比べて腹腔内（ｉｐ）投与の遠隔経路により投与された（−）−ＡＧＸ５１により提示される、ほとんど同一の活性（図２５）は、身体における遠隔臨床標的、例えば分離されているか又は標準薬剤の送達／生体使用効率に難治性である激しい腫瘍、ＣＮＳ標的及び他の区画に達するにおいて前記薬剤のこれまでにない有効性に対する前兆である。   The studies described above show potent anti-angiogenesis and anti-AMD provided by exemplary anti-Id compounds of the present invention. Strong anti-Id activity is again demonstrated with the (−)-AGX51 enantiomer used in these studies. Comparing FIGS. 23-25, it is clear that (−)-AGX51 mediates anti-angiogenesis and anti-AMD efficacy as obtained by Id3 genetic knockdown. In the two anti-Id drug trials (FIGS. 24 and 25), the degree of anti-angiogenic activity observed corresponds to a reduction of more than 50% of the pathogenic angiogenic defect displayed in the subject, and AMD in humans And is expected to be a clinically very effective vehicle provided by the present invention in the treatment of and other pathogenic angiogenic diseases. Almost the same activity presented by (−)-AGX51 administered by a remote route of intraperitoneal (ip) administration compared to the direct route of intravitreal (ivt) delivery (FIG. 25) is a remote clinical target in the body. A precursor to the unprecedented efficacy of the drug in reaching severe tumors, CNS targets and other compartments, eg, isolated or refractory to standard drug delivery / biousability.

実施例２２
新たな抗Ｉｄ診断手段により補助される癌治療及び転移性疾患の管理
また、本発明は、癌を含む増殖性疾患の診断及び再帰的治療のための生体試料からＩｄタンパク質、例えばＩｄ１を検出及び定量するための新たな組成物、方法及びキットを提供する。これらの方法は、本願に記載された抗Ｉｄ治療に適している癌患者及び他の対象の、敏感かつ大きく成功的な臨床管理達成のための治療計画で変形を加えて患者からＩｄの検出と共に新たな治療方法で有効に統合できる。 Example 22
Cancer treatment and metastatic disease management assisted by new anti-Id diagnostic tools The present invention also detects Id proteins, eg Id1, from biological samples for the diagnosis and recursive treatment of proliferative diseases including cancer. New compositions, methods and kits for quantification are provided. These methods, along with the detection of Id from patients with variations in the treatment plan for achieving sensitive and highly successful clinical management of cancer patients and other subjects suitable for anti-Id treatment as described herein. Can be effectively integrated with new treatment methods.

本発明の臨床適用のために、続けて治療患者で抗Ｉｄ有効性を決定することが重要である。ＡＧＸ５１がＩｄのＥタンパク質との相互作用を混乱させる時、Ｉｄタンパク質が分解するため、患者におけるＩｄ１喪失測定はこれらの患者の治療及び管理状態の変更に有用な情報を提供する。Ｉｄ濃度は腫瘍を有した実験用マウスだけでなく、乳癌患者の血清で全て上昇している。これらの状況における高い濃度のＩｄは、試料製造の間又は同時に溶解する循環ＥＰＣ及び／又は循環腫瘍細胞に関わっているものと考えられる。従って、Ｉｄ１濃度が患者の血清で減少したのか否かを決定するための単純な血液検査を本発明の抗Ｉｄ化合物で処理することは、臨床試みの到達のための抗Ｉｄ化合物の有効性の評価を進行することができるようにする。これらの測定に基づいて、臨床管理は個別患者の疾患状態及び治療反応に合わすことができる（例えば、初期に成功的な薬剤処理時、Ｉｄ濃度の集中的低下決定時、抗Ｉｄ薬投与を減少させ、潜在的な不要な治療費用及び／又は副作用を軽減する）。   For clinical application of the present invention, it is important to subsequently determine anti-Id efficacy in the treated patient. Since Id protein degrades when AGX51 disrupts the interaction of Id with E protein, Id1 loss measurements in patients provide useful information for changing the treatment and management status of these patients. Id concentrations are all elevated in the serum of breast cancer patients as well as in laboratory mice with tumors. High concentrations of Id in these situations are believed to be associated with circulating EPC and / or circulating tumor cells that lyse during or simultaneously with sample preparation. Thus, treating a simple blood test with the anti-Id compounds of the present invention to determine if Id1 levels were reduced in the patient's serum is a measure of the effectiveness of the anti-Id compounds for reaching clinical trials. Allow the evaluation to proceed. Based on these measurements, clinical management can be tailored to the individual patient's disease state and treatment response (eg, reducing initial anti-Id drug administration when successfully treating drugs early, determining intensive reductions in Id levels) Reducing potential unnecessary treatment costs and / or side effects).

本願における再帰的診断方法の実際的な実行は、下記実施例により立証される協調的に統合された診断／治療臨床管理手段を提供する。試験方法は、生体試料、例えば、体液（例えば、小便、血漿、ＣＮＳ流体、発現された又は抽出された乳腺流体、など）、組織（例えば、骨髄、血液、腫瘍生検試料）、及び診断に有用なその他の試料物質からＩｄ標的を検出するために特別に改変される。この新たな試験の図式的説明が図２６に提供される。この試験は、改良された「サンドウィッチ」技術を使用し、これにより微細適正ウェルに結合された後、癌が公知となったり又は癌の危険に面した癌スクリーン対象からの試験試料（例えば、血清）に露出させたＩｄ１に対して非常に特異的なモノクローナル抗体を提供するようになり、試料中のＩｄ１タンパク質が抗ＩｄモノクローナルＡｂによる結合を許容するようになった。洗浄後、プレートをワサビペルオキシダーゼ（Ｅ４７−ＨＲＰ）にコンジュゲーションされたＥ４７タンパク質に露出させた。この新たな試験の構築によって、モノクローナルＡｂに結合された試料からのＩｄ１タンパク質は、試料の中に本来存在する量に直接比例してＨＲＰ標識されたＥ４７に結合し、維持される。続いて、プレートに結合されたＥ４７−ＨＲＰは、比色定量のための発色基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）に露出させた。   The practical implementation of the recursive diagnostic method in this application provides a collaboratively integrated diagnostic / therapeutic clinical management tool as demonstrated by the examples below. Test methods include biological samples such as body fluids (eg urine, plasma, CNS fluid, expressed or extracted mammary fluid, etc.), tissues (eg bone marrow, blood, tumor biopsy samples), and diagnostics. Specially modified to detect Id targets from other useful sample material. A schematic description of this new test is provided in FIG. This test uses an improved “sandwich” technique that allows a test sample from a cancer screen subject (eg, serum) to become known to the cancer or face the risk of cancer after being bound to a fine-fit well. ) Exposed highly specific monoclonal antibodies to Id1, and the Id1 protein in the sample allowed binding by anti-Id monoclonal Ab. After washing, the plate was exposed to E47 protein conjugated to horseradish peroxidase (E47-HRP). With the construction of this new test, Id1 protein from the sample bound to the monoclonal Ab binds and maintains HRP-labeled E47 in direct proportion to the amount originally present in the sample. Subsequently, E47-HRP bound to the plate was exposed to 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), a chromogenic substrate for colorimetric determination.

前述したＩｄ１検出試験は、本願でヒト乳癌患者及び正常対象対照を立証して、癌を潜伏（ｃａｎｃｅｒｂｅａｒｉｎｇ）及び癌患者の完全区別を確かにし、従って、敏感かつ強力な臨床診断、治療及び管理手段を提供するようになった。   The Id1 detection test described above establishes human breast cancer patients and normal subject controls in this application to ensure cancer cancer bearing and complete differentiation between cancer patients, and thus a sensitive and powerful clinical diagnostic, therapeutic and management tool. Began to provide.

図２６に示された試験設計によると、ＥＬＩＳＡ微細適正プレートを既知の量の抗Ｉｄ１マウスモノクローナル抗体（ＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＳａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でコーティングする。１００μＬのＩｄ１標準（１０Ｘ、２０Ｘ、４０Ｘ、５０Ｘ、１６０Ｘ、３２０Ｘ及び６４０Ｘ（Ｉｄ１強化マウス血清））をウェルに分配した。続いて、溶液を３０秒間徹底的に混合し、４゜Ｃで１６時間の間培養した。１６時間後、プレートの内容物を廃棄物容器に出して空にし、培養混合物を除去した。微細適正プレートを蒸留水で５回洗浄し、吸収紙で満遍なく貼り付け、残留水滴を全部除去した。１００μＬのＥ４７ＨＲＰコンジュゲート試薬（１：２５又は１：５０）を各ウェルに分配し、３０秒間徹底的に混合した。続いて、プレートを室温で２時間培養した後、培養を投棄し、微細適正プレートを蒸留水で５回洗浄した後、吸収紙で満遍なく貼り付け、残留水滴を全部除去した。続いて、１００μＬのＴＭＢ試薬を各ウェルに分配し、５秒間軽く混合した。続いて、微細適正プレートを暗室中、室温で２０分間培養した。２０分後、１００μＬのＳｔｏｐ溶液を各ウェルに添加し反応を中断した。溶液を３０秒間軽く混合し、１５分以内に４５０ｎｍで吸光度を検督した。収得した吸光度値をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いてＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｒｔｏｎ双曲線方程式に適用した。濃度データ大吸光度値の適合度に対する相関関係の係数は、０．９９超えであった。   According to the test design shown in FIG. 26, an ELISA microproperty plate is coated with a known amount of anti-Id1 mouse monoclonal antibody (BD PharmingenSan Diego, Calif.). 100 μL of Id1 standard (10 ×, 20 ×, 40 ×, 50 ×, 160 ×, 320 × and 640 × (Id1 enriched mouse serum)) was dispensed into the wells. Subsequently, the solution was mixed thoroughly for 30 seconds and incubated at 4 ° C. for 16 hours. After 16 hours, the contents of the plate were emptied into a waste container and the culture mixture was removed. The fine appropriate plate was washed 5 times with distilled water and evenly attached with absorbent paper to remove all residual water droplets. 100 μL of E47HRP conjugate reagent (1:25 or 1:50) was dispensed into each well and mixed thoroughly for 30 seconds. Subsequently, after culturing the plate at room temperature for 2 hours, the culture was discarded, the fine appropriate plate was washed 5 times with distilled water, and then evenly attached with absorbent paper to remove all residual water droplets. Subsequently, 100 μL of TMB reagent was dispensed into each well and mixed gently for 5 seconds. Subsequently, the fine appropriate plate was incubated in the dark at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, 100 μL of Stop solution was added to each well to interrupt the reaction. The solution was mixed gently for 30 seconds and the absorbance was checked at 450 nm within 15 minutes. The collected absorbance values were applied to the Michaelis-Merton hyperbolic equation using WinNonlin (Pharsight, Mountainview, CA). The coefficient of correlation for the goodness of fit of the concentration data large absorbance value was over 0.99.

総４２匹のｐ５３ノックアウトマウスを標準条件で維持した。これらを１２ｈ明−１２ｈ暗サイクルの冷暖房調節空間で広葉樹チップと共にプラスチックケージに閉じ込め、与えられた基本食餌（Ｏｒｉｅｎｔａｌ ＮＭＦ；Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ．Ｊａｐａｎ）及び水を任意で用いることができるようにした。血清試料をマウスから収得した。続いて、各マウスからの１００μＬの血清を既知の量の抗Ｉｄ１マウスモノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でコーティングされた微細適正プレート上のウェルに添加した。続いて、溶液を３０秒間徹底的に混合し、４゜Ｃで１６時間の間培養した。１６時間後、プレートの内容物を廃棄物容器に出して空にし、培養混合物を除去した。微細適正プレートを蒸留水で５回洗浄し、吸収紙に満遍なく貼り付け、残留水滴を全部除去した。１００μＬのＥ４７ＨＲＰコンジュゲート試薬（１：２５又は１：５０）を各ウェルに分配し、３０秒間徹底的に混合した。続いて、プレートを室温で２時間の間培養した後、培養を投棄し、微細適正プレートを蒸留水で５回洗浄した後、吸収紙に満遍なく貼り付け、残留水滴を全部除去した。続いて、１００μＬのＴＭＢ試薬を各ウェルに分配し、５秒間軽く混合した。続いて、微細適正プレートを暗室中、室温で２０分間培養した。２０分後、各ウェルに１００μＬのＳｔｏｐ溶液を添加し反応を中断した。溶液を３０秒間軽く混合し、１５分以内に吸光度を４５０ｎｍで検督した。   A total of 42 p53 knockout mice were maintained under standard conditions. These are confined in a plastic cage with hardwood chips in a 12h light-12h dark cycle air conditioning space so that the given basic diet (Oriental NMF; Oriental Yeast Co., Tokyo. Japan) and water can optionally be used. did. Serum samples were obtained from mice. Subsequently, 100 [mu] L of serum from each mouse was added to wells on a fine sized plate coated with a known amount of anti-Id1 mouse monoclonal antibody (BD Pharmingen, San Diego, CA). Subsequently, the solution was mixed thoroughly for 30 seconds and incubated at 4 ° C. for 16 hours. After 16 hours, the contents of the plate were emptied into a waste container and the culture mixture was removed. The fine appropriate plate was washed 5 times with distilled water and evenly adhered to the absorbent paper to remove all residual water droplets. 100 μL of E47HRP conjugate reagent (1:25 or 1:50) was dispensed into each well and mixed thoroughly for 30 seconds. Subsequently, after culturing the plate at room temperature for 2 hours, the culture was discarded, the fine appropriate plate was washed 5 times with distilled water, and then evenly attached to the absorbent paper to remove all residual water droplets. Subsequently, 100 μL of TMB reagent was dispensed into each well and mixed gently for 5 seconds. Subsequently, the fine appropriate plate was incubated in the dark at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, 100 μL of Stop solution was added to each well to stop the reaction. The solution was mixed gently for 30 seconds and the absorbance was checked at 450 nm within 15 minutes.

血清試料が収得された後、マウスを犠牲にして腫瘍に対して分析した。図２７に示された通り、受信者操作特性（Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔ、ＲＯＣ）曲線による評価を用いて算出された有腫瘍及び無腫瘍動物間に線を引いて分けた。４２個の濃度値のＲＯＣ評価は、ただ１つの偽陽性及び１つの偽陰性を予測した。   After serum samples were obtained, mice were sacrificed and analyzed for tumors. As shown in FIG. 27, a line was drawn between tumor-bearing and tumor-free animals calculated using an evaluation with a Receiver Operation Characteristic (ROC) curve. An ROC assessment of 42 concentration values predicted only one false positive and one false negative.

本発明におけるＩｄ検出検査の強力な診断有用性は、乳癌があるか、又はないヒト女性患者の集団で乳癌スクリーニング資格に対して前述した手段及び方法適用によりさらに立証した。１５個の血清試料を正常健康又は進展した乳癌がある女性から収得した（ＢｉｏＣｈｅｃｋ、Ｉｎｃ．，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）。盲検分析で、既知の量の抗Ｉｄ１マウスモノクローナル抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ）でコーティングされた微細適正プレート上のウェルに１５個の１００μＬ試料を入れた。溶液を３０秒間徹底的に混合し、４゜Ｃで１６時間の間培養した。１６時間後、プレートの内容物を廃棄物容器に出して空にし、培養混合物を除去した。微細適正プレートを蒸留水で５回洗浄し、吸収紙に満遍なく貼り付け、残留水滴を全部除去した。１００μＬのＥ４７ＨＲＰコンジュゲート試薬（１：２５又は１：５０）を各ウェルに分配し、３０秒間徹底的に混合した。続いて、プレートを室温で２時間の間培養後、培養を空にし、プレートを蒸留水で５回洗浄した後、吸収紙を満遍なく貼り付け、残留水滴を全部除去した。続いて、１００μＬのＴＭＢ試薬を各ウェルに分配し、５秒間軽く混合した。続いて、プレートを暗室で室温で２０分間培養した。２０分後、２００μＬのＳｔｏｐ溶液を各ウェルに添加し反応を中断した。溶液を３０秒間軽く混合させて、吸光度を１５分以内に４５０ｎｍで検督した。図２８に示された通り、癌陽性及び正常試料の間の区分に対して、これらの試験結果のこれまでにない高い正確度があった。   The powerful diagnostic utility of the Id detection test in the present invention was further demonstrated by the means and methods applied above for breast cancer screening qualification in a population of human female patients with or without breast cancer. Fifteen serum samples were obtained from women with normal health or advanced breast cancer (BioCheck, Inc., Foster City, CA). In a blinded analysis, fifteen 100 μL samples were placed in wells on a microfitting plate coated with a known amount of anti-Id1 mouse monoclonal antibody (BD Pharmingen, San Diego, Calif.). The solution was mixed thoroughly for 30 seconds and incubated at 4 ° C for 16 hours. After 16 hours, the contents of the plate were emptied into a waste container and the culture mixture was removed. The fine appropriate plate was washed 5 times with distilled water and evenly adhered to the absorbent paper to remove all residual water droplets. 100 μL of E47HRP conjugate reagent (1:25 or 1:50) was dispensed into each well and mixed thoroughly for 30 seconds. Subsequently, after culturing the plate at room temperature for 2 hours, the culture was emptied, the plate was washed 5 times with distilled water, and then absorbent paper was applied evenly to remove all residual water droplets. Subsequently, 100 μL of TMB reagent was dispensed into each well and mixed gently for 5 seconds. Subsequently, the plates were incubated for 20 minutes at room temperature in a dark room. After 20 minutes, 200 μL of Stop solution was added to each well to interrupt the reaction. The solution was mixed gently for 30 seconds and the absorbance was checked at 450 nm within 15 minutes. As shown in FIG. 28, there was an unprecedented high accuracy of these test results for the segment between cancer positive and normal samples.

本発明のさらに詳細で再帰性の統合された診断治療方法で、患者は任意の数の他の特異的癌マーカー（例えば、高い前立腺癌危険をスクリーニングする前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）使用）を用いて主に又は相補的にスクリーニングできる。組織病理学的及び／又は免疫組織化学分析と任意でカップリングされた生検は、一次的又は統合された診断を追加で整備することができる。特定の患者では、本願に記載された通り転移性危険などに巣をおいて追加で（例えば、識別された腫瘍試料（又は他の試料、例えば小便、唾液又はＣＮＳ流体中のそのマーカー）、腫瘍、血液、骨髄中のＥＰＣ又は癌幹細胞におけるＩｄ１測定により）診断評価を整備することができる。   In a more detailed and recursive integrated diagnostic treatment method of the present invention, a patient uses any number of other specific cancer markers (eg, using prostate specific antigen (PSA) to screen for high prostate cancer risk) Can be screened primarily or complementarily. A biopsy, optionally coupled with histopathological and / or immunohistochemical analysis, can additionally provide a primary or integrated diagnosis. In certain patients, additional nests such as metastatic risk as described herein (eg, identified tumor samples (or other samples such as urine, saliva or its markers in CNS fluid), tumors, etc. A diagnostic evaluation can be established (by measuring Id1 in EPC or cancer stem cells in blood, bone marrow).

本発明の再帰的診断治療方法を説明するために、臓器に限定された癌を有した対象が、前立腺癌に限定された臓器で維持される日常的な後続措置を伴い長期的な予防的投薬方法（例えば、数ヶ月、５〜９ヶ月、１〜２年、２年以上長期間の毎日）で投与される抗Ｉｄ化合物を使用する治療に選択され得る。この投薬方法は伝統的手術及び化学療法癌治療が伴う不要な外傷及び生活の質、費用の問題を避けながら癌の転移を長期間抑制できるようにする。この新たな治療計画とともに、これらの試験結果を基に明らかにされる特に高いＩｄ１及び／又はＩｄ３に対しＩｄの濃度試験のために患者で規則的血液検査が上記で記載された通り遂行される。連続的治療ステップに比べて初期から減少したり、停滞したり、又は高いＩｄ発現が多くの場合投与、又は治療レパートリーにおける変化（より多いか、又はより少ない治療薬又は治療法への転換、又は、一般的に疾患の危険、現在及び予想される治療有効性、及び否定的な患者の影響のバランスを取る強力な／攻撃性媒介超過又は未満への転換を含む）に直接対応するようにする。   In order to illustrate the recursive diagnostic treatment method of the present invention, subjects with cancer limited to organs are treated with long-term preventive medication with routine follow-up maintained in organs limited to prostate cancer. It can be selected for treatment using anti-Id compounds administered in a method (eg, several months, 5-9 months, 1-2 years, 2 years or longer daily). This dosing method allows long-term suppression of cancer metastasis while avoiding unnecessary trauma and quality of life and cost problems associated with traditional surgery and chemotherapy cancer treatment. Along with this new treatment plan, a regular blood test is performed on the patient as described above for the Id concentration test for the particularly high Id1 and / or Id3 revealed on the basis of these test results. . Reduced from initial, stagnant, or high Id expression in many cases compared to continuous treatment steps, often administration, or change in treatment repertoire (more or less conversion to therapeutic agent or therapy, or , In general, including a strong / aggressive mediated excess or less conversion that balances disease risk, current and expected therapeutic effectiveness, and negative patient impact) .

減少するか、又は安定したＩｄ濃度は、将来の治療及び／又は予後指標として依存することができ、成功的な抗Ｉｄ治療として治療を維持するか、又は猶予するための決定手段までとなり得る。治療履歴の間のＩｄの更なる上昇は、本発明の方法又は組成物を用いた抗Ｉｄ投与を増加し／するか二次抗癌又は抗転移薬を用いる組み合わせ療法又は代案的な治療法（例えば、化学療法及び／又は放射線）の開始に対する決定を表示することができる。本発明のこの管理パラダイムと組み合わせて、本発明の追加の方法は、協調的管理治療方法、例えば、血液癌マーカーに対する後続試験、転移性疾患振戦に対する監視を続けるための放射線学的及び／又は組織病理学的スクリーニングなどを用いて患者診断及び管理のためのその他の従来の方法を使用して、本願に記載された抗Ｉｄ化合物及び組み合わせ療法を用いて単一療法を整備及び管理することができる。   Decreasing or stable Id concentrations can depend on future treatments and / or prognostic indicators, and can even be a decision tool to maintain or postpone treatment as a successful anti-Id treatment. Further increases in Id during the treatment history may increase anti-Id administration using the methods or compositions of the invention / combination therapy or alternative treatments using secondary anti-cancer or anti-metastatic agents ( For example, a decision on the start of chemotherapy and / or radiation) can be displayed. In combination with this management paradigm of the present invention, the additional methods of the present invention include coordinated management therapy methods such as follow-up testing for blood cancer markers, radiology and / or to continue monitoring for metastatic disease tremor. Other conventional methods for patient diagnosis and management, such as with histopathological screening, may be used to develop and manage monotherapy with the anti-Id compounds and combination therapies described herein. it can.

前述した協調的診断及び管理プロトコルは、改変され、前立腺癌患者を治療するために、抗Ｉｄ方法及び組成物並びに二次的な抗テストステロン薬又は療法の両方と協調して用いられることができる。あるいは、前立腺特異的放射線を抗Ｉｄ治療の以前に、同時に又は後に用いることができる。   The cooperative diagnostic and management protocol described above can be modified and used in concert with both anti-Id methods and compositions and secondary anti-testosterone drugs or therapies to treat prostate cancer patients. Alternatively, prostate specific radiation can be used before, simultaneously with, or after anti-Id therapy.

前述した協調的診断及び管理プロトコルは、乳癌治療又は既存の乳癌の転移性進行の予防のために変更して用いられることができる。患者は、ヒト女性での通常のマンモグラフィーによって***の腫瘍について陽性であると識別され、リンパ節に癌がない場合に腫瘍切除が続く。癌は、局在して表れたため、対象に化学療法に関して非常に悪化される生活の質、及び化学療法による人生後半の新生物発生可能性（Ｖｅｇａ−Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ、２００３年）を含む不要な外傷を避けるために癌転移を慢性的に抑制するために抗Ｉｄ化合物を投与した。高いＩｄ、特に高いＩｄ１及び／又はＩｄ３を示した患者における血液検査は抗Ｉｄ化合物を用いた治療を決定する根拠になるはずなのに、これはこの症状が転移に対する身体陽性環境を示唆するためである。関連した例示の実施形態において、この方法の管理で患者に抗Ｉｄ治療前に、同時に又は以後に抗Ｉｄ化合物と同等に化学療法、及び／又は***特異的放射線で処理することができる。   The collaborative diagnosis and management protocol described above can be modified and used for breast cancer treatment or prevention of metastatic progression of existing breast cancer. Patients are identified as positive for breast tumors by normal mammography in human women, and tumor resection follows when there is no cancer in the lymph nodes. Because cancer appeared to be localized, the subject suffered unnecessary trauma, including a quality of life that was greatly exacerbated with chemotherapy, and the possibility of neoplastic development later in life due to chemotherapy (Vega-Stromberg, 2003). To avoid cancer metastasis chronically, an anti-Id compound was administered. Blood tests in patients with high Id, especially high Id1 and / or Id3 should be the basis for determining treatment with anti-Id compounds, because this symptom suggests a body positive environment for metastasis . In a related exemplary embodiment, the management of this method allows the patient to be treated with chemotherapy and / or breast-specific radiation equivalently or at the same time as the anti-Id compound before, or after, anti-Id treatment.

また、本発明の協調的診断及び管理プロトコルは、結腸癌治療又は既存の結腸癌の進行予防に用いられることができる。治療対象に適した腫瘍を表す従来の結腸頃検査により患者を選択し、手術（及び／又は組織病理学的試験）後、結腸癌が非転移性で残っているものと考えられる対象を追加で選択した。これらの対象には、従来の化学療法に関する生活の質の低下を含む不要な外傷を避けるために癌転移を慢性的に抑制するために抗Ｉｄ化合物を投与した。高いＩｄ、特に高いＩｄ１及び／又はＩｄ３を示した患者における血液検査は、抗Ｉｄ化合物を用いた治療に対する決定をサポートし、これはこの測定が転移に対する身体内陽性環境を示唆するためである。関連した実施形態では、この方法の管理中である患者に抗Ｉｄ治療の以前に、同時に又は以後に抗Ｉｄ化合物と協調的に化学療法、及び／又は胃腸（Ｇｌ）特異的放射線を処理することができる。   The coordinated diagnosis and management protocol of the present invention can also be used to treat colon cancer or prevent progression of existing colon cancer. Select patients by conventional colonic examination that represents a suitable tumor for the treatment target, and after surgery (and / or histopathological examination), add additional subjects where colon cancer is considered to remain non-metastatic Selected. These subjects were administered anti-Id compounds to chronically suppress cancer metastasis to avoid unnecessary trauma, including a loss of quality of life associated with conventional chemotherapy. Blood tests in patients who showed high Id, particularly high Id1 and / or Id3, supported decisions on treatment with anti-Id compounds because this measurement suggests a positive body environment for metastasis. In a related embodiment, treating a patient under management of the method with chemotherapy and / or gastrointestinal (Gl) specific radiation in concert with an anti-Id compound prior to, simultaneously with, or after anti-Id therapy. Can do.

その他の協調的診断及び管理プロトコルが黒色腫の治療に用いられる。対象は原位置における黒色腫と診断された（腫瘍が皮膚の最外層である表皮に残る）。黒色腫は手術で摘出し、その後、化学療法又はその他の従来の癌治療に関する不要な外傷及び生活の質の低下を避けるために癌転移の抑制のために対象に抗Ｉｄ化合物を長期間投与した。高いＩｄ、特に高いＩｄ１及び／又はＩｄ３を示す患者における血液検査は、この発見事実が転移に対する身体内陽性環境に関するために、抗Ｉｄ化合物を用いた治療決定をサポートする。   Other coordinated diagnostic and management protocols are used to treat melanoma. The subject was diagnosed with melanoma in situ (the tumor remains in the epidermis, the outermost layer of the skin). Melanoma is surgically removed and then administered long-term anti-Id compounds to the subject to suppress cancer metastasis to avoid unnecessary trauma and quality of life associated with chemotherapy or other conventional cancer treatments . Blood tests in patients with high Id, particularly high Id1 and / or Id3, support treatment decisions with anti-Id compounds because this finding relates to the body positive environment for metastasis.

別の例示の協調的診断及び管理プロトコルで、第ＩＩＩ期（転移性）、乳癌を有した女性を選択した。従って、特定された対象は、高容量の放射線及び複数回投与のＴａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）を使用する積極的な組み合わせ治療計画を用いて治療した。この一次的治療後、組織病理及び／又はバイオスキャン（例えば、コンピュータ断層撮影、陽電子放射断層撮影及び／又は磁気共鳴映像）を用いて患者に検出可能に存在する癌がないことを確認した。続いて、これらの対象には長期的な期間（例えば、５〜９ヶ月、１〜２年又はそれ以上）の間、離れた臓器（例えば、脳又は肝臓）への任意の残留癌細胞の再播種を遮断するために予防的治療計画でＩｄ１を投与した。この管理期間に患者血中Ｉｄの測定を定期的に行った。数ヶ月〜１年以上の別の管理期間後、Ｉｄ血液濃度は増加したと観察され得、これは転移潜在力の増加を示す。続いて、抗Ｉｄ化合物を用いた治療は投与又は周期において増加（又は再開）させる。以後Ｉｄ血液濃度が許容可能な（基準線又は低危険）転移潜在力と一致する値に減少すると、抗Ｉｄ処理を減少する。この監視及び再帰的媒介サイクルは、該当女性の一生を通じて維持される。   Another exemplary collaborative diagnostic and management protocol selected women with stage III (metastatic), breast cancer. Thus, the identified subjects were treated with an aggressive combination treatment regimen using high doses of radiation and multiple doses of Taxol® (paclitaxel). After this primary treatment, histopathology and / or bioscan (eg, computed tomography, positron emission tomography and / or magnetic resonance imaging) was used to confirm that there was no detectably present cancer in the patient. Subsequently, these subjects may be allowed to re-establish any residual cancer cells to distant organs (eg, brain or liver) for long periods of time (eg, 5-9 months, 1-2 years or longer). Id1 was administered on a prophylactic regime to block seeding. During this management period, the patient's blood Id was regularly measured. After another management period of months to a year or more, the Id blood concentration can be observed to increase, indicating an increase in metastatic potential. Subsequently, treatment with the anti-Id compound is increased (or resumed) in the administration or cycle. If the Id blood concentration is subsequently reduced to a value consistent with an acceptable (baseline or low risk) metastatic potential, anti-Id treatment is reduced. This monitoring and recursive mediation cycle is maintained throughout the lifetime of the woman.

実施例２３
Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシペニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド鏡像異性体の分離
ＡＧＸ５１の個別（＋）−及び（−）−鏡像異性体は、キラルカラムがある分取ＨＰＬＣを用いてラセミ（非キラル）ＡＧＸ５１組成物から得られる。キラル固定相上の分離は許容可能な純度の鏡像異性体を取得するのに有効なものと判明された。 Example 23
Separation of N- (3- (Benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide enantiomers Individual (+)-and AGX51 The (−)-enantiomer is obtained from the racemic (non-chiral) AGX51 composition using preparative HPLC with a chiral column. Separation on a chiral stationary phase has been found to be effective in obtaining enantiomers of acceptable purity.

本願では「鏡像異性体の分離方法Ａ」及び「方法Ｂ」と称する２種類の異なるＨＰＬＣシステムを設計して実施した。両方法とも、生物試験のために高ｍｇ又は低グラム量のＡＧＸ５１鏡像異性体を提供するために設計及び調整された。両方法とも溶出溶媒として有機性アルコールと共に超臨界ＣＯ２を使用する。しかし、その方法は、異なるカラムを用いる：方法Ａは、パークルコンセプト（Ｐｉｒｋｌｅ−ｃｏｎｃｅｐｔ）と正常［１−（３，５−ジニトロベンズアミド）−１，２，３，４−テトラヒドロフェナントレン］を用い、方法Ｂは、多糖類固定相（３，５−ジメチルフェニルカルバメートを用いて誘導された遊離されたヒドロキシル基があるセルロース）を用いた。   In this application, two different HPLC systems designated “Enantiomeric Separation Method A” and “Method B” were designed and implemented. Both methods were designed and tailored to provide high mg or low gram quantities of AGX51 enantiomers for biological testing. Both methods use supercritical CO2 with organic alcohol as the eluting solvent. However, the method uses a different column: Method A uses the Parkle-concept and normal [1- (3,5-dinitrobenzamido) -1,2,3,4-tetrahydrophenanthrene]. Method B used a polysaccharide stationary phase (cellulose with free hydroxyl groups derived using 3,5-dimethylphenylcarbamate).

二つの方法が、下記表４及び５でさらに詳細に記載され、比較される。

The two methods are described and compared in more detail in Tables 4 and 5 below.

二つの方法の両方で、分取後生成物単離は、おおよそ４０゜Ｃの水槽温度における減圧の下、回転蒸発器を用いて提供される。収得したゴムをそのまま使用したり、又は単離後鏡像異性体ゴムをメタノール−ヘキサン又は酢酸エチル−ヘキサンからの生成物の一部の喪失と共に結晶化することができる。類似のＨＰＬＣ条件を用いて分析用ＨＰＬＣにより明らかにされる単離された鏡像異性体純度が鏡像異性体製造に用いられた。   In both two methods, post-preparation product isolation is provided using a rotary evaporator under reduced pressure at a water bath temperature of approximately 40 ° C. The obtained rubber can be used as is or the isolated enantiomeric rubber can be crystallized with some loss of product from methanol-hexane or ethyl acetate-hexane. The isolated enantiomeric purity as revealed by analytical HPLC using similar HPLC conditions was used for enantiomeric production.

方法Ａ又は方法Ｂにより製造される鏡像異性体は、同一のＬＣ／ＭＳ（電気噴霧イオン化）プロファイル、即ち、ＭＨ⁺＝４３２、及び４００ＭＨｚ陽性子ＮＭＲ分光学、即ち、４．１８ｐｐｍ（ベンジル水素）で１水素三重項、６．６〜７．４ｐｐｍ芳香族領域で１２個の水素信号、０．９６ｐｐｍ（プロピオニルメチル）で３個の水素三重項中心、３．７３（メトキシ基）で３個の水素多重項を中心とする、５．９ｐｐｍ（１，３ジオキソールモイアティ中のメチレン）で２個の水素微分する多重項を中心とする、４．５０ｐｐｍ（窒素に付着したベンジルメチレン）で２個の水素多重項を中心とする、３．０７ｐｐｍ（窒素に付着した第２メチレン）で２個の水素多重項を中心とする、多重頂点相応する４個までの水素に該当する多重頂点（不斉炭素に隣接したメチレン及びプロピオニルモイアティ中のカルボニルに隣接したメチレン）を表す。 The enantiomers produced by Method A or Method B have the same LC / MS (electrospray ionization) profile, ie MH ⁺ = 432, and 400 MHz positive NMR spectroscopy, ie 4.18 ppm (benzyl hydrogen). 1 hydrogen triplet, 6.6 to 7.4 ppm aromatic signal, 12 hydrogen signals, 0.96 ppm (propionylmethyl), 3 hydrogen triplet centers, 3.73 (methoxy group), 3 At 4.50 ppm (benzylmethylene attached to nitrogen) centered on two hydrogen-differentiating multiplets at 5.9 ppm (methylene in 1,3 dioxole moiety) centered on the hydrogen multiplet Multiples corresponding to up to four hydrogens corresponding to multiple vertices centered on two hydrogen multiplets at 3.07 ppm (second methylene attached to nitrogen) centered on two hydrogen multiplets Point represents a (methylene adjacent to carbonyl in adjacent methylene and propionyl Rumoi Ati to asymmetric carbons).

方法Ａ又は方法Ｂの２種類で作られた鏡像異性体は、偏光計で評価し、各鏡像異性体に対する旋光性を確立した。ペアをなす他の鏡像異性体で回転観察されるものとは反対方向に偏光回転する鏡像異性体対の中における個別鏡像異性体の能力は、鏡像異性体を明らかに区分して定量するようにする別個の特徴づけとして普遍的に許容される。本願から反復的及び一貫的に行われた偏光計評価は、異色型偏光子があるＪａｓｃｏ Ｐ−２０００を用いた。各鏡像異性体の濃度は、メタノール中のおおよそ１％であり、光源はタングステン−ハロゲンランプであり、放出光の波長は５８９ｎｍであった。２０゜Ｃで上記の条件下の鏡像異性体は、＋２８度又は２８度の偏光で回転した。   Enantiomers made by two methods, Method A or Method B, were evaluated with a polarimeter to establish optical rotation for each enantiomer. The ability of individual enantiomers in a pair of enantiomers to rotate polarized in the opposite direction to that observed for the other enantiomers in the pair is quantified by clearly distinguishing the enantiomers. Universally acceptable as a separate characterization. The polarimeter evaluations performed repeatedly and consistently from this application used Jasco P-2000 with a different color polarizer. The concentration of each enantiomer was approximately 1% in methanol, the light source was a tungsten-halogen lamp, and the wavelength of the emitted light was 589 nm. The enantiomers under the above conditions at 20 ° C rotated with +28 degrees or 28 degrees of polarization.

方法Ａ及び方法Ｂによるラセミ（非キラル）ＡＧＸ５１の分析のためのＨＰＬＣプロファイルが、それぞれ図２９及び３０に提供された。これらのクロマトグラム中の頂点は、個々の頂点が偏光特定から（＋）又は（−）方向に偏光を回転させたのか否かについて表示された。興味深いことに、鏡像異性体に対する溶出順序が方法Ａ及び方法Ｂで異なる。方法Ａでは、第１溶出頂点が（＋）−鏡像異性体であり、方法Ｂでは第１溶出頂点が（−）−鏡像異性体である。   HPLC profiles for the analysis of racemic (non-chiral) AGX51 by Method A and Method B were provided in FIGS. 29 and 30, respectively. The vertices in these chromatograms were displayed as to whether the individual vertices were rotated in the (+) or (-) direction from the polarization specification. Interestingly, the elution order for enantiomers differs between Method A and Method B. In Method A, the first elution peak is the (+)-enantiomer, and in Method B, the first elution peak is the (−)-enantiomer.

実施例２４
ＡＧＸ５１の生体変化産物
本発明の更なる実施例は、例示の生体内抗Ｉｄ化合物ＡＧＸ５１の変化生成物の説明を通じて本願に示される。ＣＤ１雄性マウス（３／時点）にｉｐでＤＭＳＯ中の３０ｍｇ／ｋｇのＡＧＸ５１を処理した。後眼窩の穿孔により投与前及び投与後０．２５、０．５、１．０、２．０、４．０、８．０＆２４時間目にへパリン添加されたチューブの中に血液を収集した。１００μＬのｐＨ７．４ＰＢＳを遠心分離により血液から収穫血漿に添加して、投与前を除いた全ての時点から試料を組み合せた。混合物を１ｍＬのメチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）と共に１分間ボルテックスさせ、ＭＴＢＥを乾燥Ｎ₂（ｇ）との遠心分離後、除去した。ＭＴＢＥの除去後、残っている残渣を２００μＬのＣＡＮ中に再建した。５μＬの前記溶液を電気噴霧ＬＣ−ＭＳセットとカップリングされた２．０ｘ２５０ｍｍＣ１８カラムを用いてＬＣ／ＭＳで分析しＨＰＬＣ流出物中のｍ／ｚ１００−６００を監視した。流速は２００μＬ／分のＡＣＮ（８５）／Ｈ₂０＋０．１％ギ酸だった。 Example 24
AGX51 Biotransformation Products Further embodiments of the present invention are presented herein through the description of exemplary biotransformation products of the in vivo anti-Id compound AGX51. CD1 male mice (3 / time point) were treated ip with 30 mg / kg AGX51 in DMSO. Blood was collected into tubes that had been parinized before and at 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 & 24 hours after dosing by retroorbital perforation. 100 μL of pH 7.4 PBS was added to the harvested plasma from the blood by centrifugation and the samples were combined from all time points except before dosing. The mixture was vortexed with 1 mL of methyl t-butyl ether (MTBE) for 1 minute and the MTBE was removed after centrifugation with dry N ₂ (g). After removal of MTBE, the remaining residue was reconstructed in 200 μL CAN. 5 μL of the solution was analyzed by LC / MS using a 2.0 × 250 mm C18 column coupled with an electrospray LC-MS set to monitor m / z 100-600 in the HPLC effluent. The flow rate was 200 μL / min ACN (85) / H ₂ 0 + 0.1% formic acid.

質量スペクトルデータは共通の生体内変化経路、例えば脱アルキル化、ヒドロキシル化、などを反映するＭＨ⁺イオンに対して慎重にスクリーニングした。脱メチル化、ＭＨ⁺＝ｍ／ｚ４１８（Ｍ１）、脱プロピオニル化、ＭＨ⁺＝ｍ／ｚ３７６（Ｍ２）及び脱メチル化＋脱プロピオニル化、ＭＨ⁺＝ｍ／ｚ３４８（Ｍ３）に該当するイオンを見つけ、以下で提示された通り３種類の構造Ｍ１、Ｍ２及びＭ３が同定された。

Mass spectral data were carefully screened against MH ⁺ ions reflecting common biotransformation pathways such as dealkylation, hydroxylation, and the like. Ions corresponding to demethylation, MH ⁺ = m / z 418 (M1), depropionylation, MH ⁺ = m / z 376 (M2) and demethylation + depropionylation, MH ⁺ = m / z 348 (M3) Found, three types of structures M1, M2 and M3 were identified as presented below.

本明細書に引用された全ての公報及び特許及びそれに列挙された全ての公報及び特許は、本願で公報が引用される関連性によって方法及び／又は物質を開示及び説明する任意の目的において説明を減らすため、参考文献として含まれる。本願における任意の公報の引用は、本発明が先行技術発明により、この公報より先立つ時期に権利を与えられた承認として解釈されてはならない。なお、与えられた刊行日は実際の刊行日と異なる場合があり、実際の刊行日は、個別に確認される必要があるかもしれない。   All publications and patents cited in this specification and all publications and patents listed therein are described for any purpose of disclosing and explaining methods and / or substances by the relevance to which the publications are cited in this application. To reduce, included as a reference. Citation of any publication in this application shall not be construed as an admission that the invention is entitled by a prior art invention at a time prior to this publication. Note that the given publication date may differ from the actual publication date, and the actual publication date may need to be confirmed individually.

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Claims (45)

新生物を患う哺乳動物対象における転移を低減する方法であって、該方法は、化学式Ｉの抗Ｉｄ化合物（分化抑制剤）の抗転移有効量を前記患者に投与することを含み、

式中、Ｒ₁、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀は、水素、ヒドロキシル、スルフヒドリル、ベンジル、２−ブロモビニルアミノ、ヒドロキシメチル、メトキシ、ハロゲン、擬ハロゲン、シアノ、カルボキシル、ニトロ、チオアルコキシ、チオアリール、チオール、１〜２０個の炭素を含む置換若しくは非置換の炭化水素、アルコキシカルボニル、アルキルオキシカルボニルアミノ、アミノ、アミノ酸、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、アリールオキシ、カルボキシル、シクロアルケニル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のアラルキル、ペプチジル、染料、フルオロフォア、炭水化物又はポリペプチドから独立して選択され、Ｒ₈及びＲ₉は、化学式Ｉに示されたオルト方向に加え、パラ配置も有することができ、Ｒ₇は、水素、ヒドロキシル、メトキシ、アジド、ニトリル、スルフヒドリル、ハロゲン、ベンゾイル、置換されたベンゾイル又は１〜２０個の炭素を含む置換若しくは非置換の炭化水素で置換されたヒドロキシル、主鎖が１〜２０個の炭素原子であるアルカノイル、ＣＦ₃（ＣＨ₂）_nＣＯ（式中、ｎ＝１〜１０）、ＣＨ₃（ＣＦ₂）_nＣ＝０（式中、ｎ＝１〜１０）、ＣＦ₃（ＣＦ₂）_n（式中、ｎ＝０〜３）、アリール、アルコキシ、ハロゲン、又はニトロ、アリールオキシ、アリールオキシのエステル、アダマントイル、置換されたアダマントイル又は１〜２０個の炭素のアロイルから独立して選択され、Ｒ₁₁がプロピオニルであれば、Ｒ₇はメトキシでなく、Ｒ₇及びＲ₆は、化学式Ｉに示された通りオルトであるか又は互いにパラであることができ、Ｒ₁₁は、独立して水素、プロピオニル、ピボイル、ベンゾイル、置換されたベンゾイル、主鎖が１〜２０個の炭素原子であるアルカノイル、ＣＦ₃（ＣＨ₂）_nＣ＝Ｏ（式中、ｎ＝１〜１０）、ＣＨ₃（ＣＦ₂）_nＣ＝０（式中、ｎ＝１〜１０）又はＣＦ₃（ＣＦ₂）_n（式中、ｎ＝０〜３）であり、Ｒ₇がメトキシであれば、Ｒ₁₁はプロピオニルでなく、Ｒ₁₂は、独立して水素、ハロゲン、²Ｈ、ＣＨ₃（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝０〜５）、ＣＦ₃（ＣＨ₂）_nＣ＝０（式中、ｎ＝１〜５）、ＣＨ₃（ＣＦ₂）_nＣ＝０（式中、ｎ＝１〜５）又はＣＦ₃（ＣＦ₂）_n（式中、ｎ＝０〜５）である、方法。 A method of reducing metastasis in a mammalian subject suffering from a neoplasm, the method comprising administering to said patient an anti-metastatic effective amount of an anti-Id compound of formula I (differentiation inhibitor),

In the formula, R ₁ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₈ , R ₉ , R ₁₀ are hydrogen, hydroxyl, sulfhydryl, benzyl, 2-bromovinylamino, hydroxymethyl, methoxy, halogen, pseudohalogen, cyano. , Carboxyl, nitro, thioalkoxy, thioaryl, thiol, substituted or unsubstituted hydrocarbon containing 1 to 20 carbons, alkoxycarbonyl, alkyloxycarbonylamino, amino, amino acid, aminocarbonyl, aminocarbonyloxy, aryloxy, Carboxyl, cycloalkenyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted aralkyl, peptidyl, dye, fluorophore , Charcoal Is independently selected from halides or polypeptide, R ₈ and R _9, in addition to the indicated ortho direction Formula I, can also have para arrangement, R ₇ is hydrogen, hydroxyl, methoxy, azido, nitrile , Sulfhydryl, halogen, benzoyl, substituted benzoyl or hydroxyl substituted with a substituted or unsubstituted hydrocarbon containing 1 to 20 carbons, alkanoyl with a main chain of 1 to 20 carbon atoms, CF ₃ ( CH ₂ ) _n CO (where n = 1 to 10), CH ₃ (CF ₂ ) _n C = 0 (where n = 1 to 10), CF ₃ (CF ₂ ) _n (where n = 0-3), aryl, alkoxy, halogen, or nitro, aryloxy, aryloxy ester, adamantyl, substituted adamantyl, or aroyl of 1-20 carbons independently Is, if R ₁₁ is propionyl, R ₇ is not methoxy, R ₇ and R ₆ can be a formula or para to each other is as ortho shown in I, R ₁₁ is independently Hydrogen, propionyl, pivoyl, benzoyl, substituted benzoyl, alkanoyl whose main chain is 1 to 20 carbon atoms, CF ₃ (CH ₂ ) _n C═O (where n = 1 to 10), CH ₃ (CF ₂ ) _n C = 0 (where n = 1 to 10) or CF ₃ (CF ₂ ) _n (where n = 0 to 3), and R ₇ is methoxy, R ₁₁ Is not propionyl, and R ₁₂ is independently hydrogen, halogen, ² H, CH ₃ (CH ₂ ) _n (where n = 0 to 5), CF ₃ (CH ₂ ) _n C = 0 (wherein _{, n = 1~5), CH 3} (CF 2) n C = 0 ( where, n = 1 to 5) or CF ₃ (CF _{2) n} (where, n = 0 to 5 In it, way. 前記抗Ｉｄ化合物は、ラセミＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（ＡＧＸ５１）である、請求項１に記載の方法。   The anti-Id compound is racemic N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide (AGX51). The method of claim 1. 前記抗Ｉｄ化合物によってもたらされる転移の低減は、治療されなかった対照の対象に比べ、抗Ｉｄ治療をされた対象に関して癌のない生存期間の２０％より大きな増加をもたらす、請求項１に記載の方法。   2. The reduction in metastasis caused by the anti-Id compound results in a greater than 20% increase in cancer-free survival for anti-Id treated subjects compared to untreated control subjects. Method. 前記抗Ｉｄ化合物によってもたらされる転移の低減は、治療されなかった対照の対象に比べ、抗Ｉｄ治療をされた対象に関して少なくとも２０〜５０％の癌のない生存期間の増加をもたらす、請求項１に記載の方法。   The reduction in metastasis caused by the anti-Id compound results in at least 20-50% cancer-free survival increase for anti-Id treated subjects compared to untreated control subjects. The method described. 前記抗Ｉｄ化合物によってもたらされる転移の低減は、治療されなかった対照の対象に比べ、抗Ｉｄ治療をされた対象において臓器転移の平均大きさ又は数で少なくとも平均２０％の低減をもたらす、請求項１に記載の方法。   The reduction in metastasis caused by the anti-Id compound results in at least an average 20% reduction in the average size or number of organ metastases in anti-Id treated subjects compared to untreated control subjects. The method according to 1. 前記抗Ｉｄ化合物によってもたらされる転移の低減は、治療されなかった対照の対象に比べ、抗Ｉｄ治療をされた対象において臓器転移の平均大きさ又は数で２０〜５０％より大きな低減をもたらす、請求項１に記載の方法。   The reduction in metastasis caused by the anti-Id compound results in a reduction of greater than 20-50% in the mean size or number of organ metastases in anti-Id treated subjects compared to untreated control subjects. Item 2. The method according to Item 1. 前記抗Ｉｄ化合物によってもたらされる転移の低減は、治療されなかった対照の対象に比べ、抗Ｉｄ治療をされた対象において臓器転移の平均大きさ又は数で少なくとも５０％の低減をもたらす、請求項１に記載の方法。   The reduction in metastasis caused by the anti-Id compound results in a reduction of at least 50% in the average size or number of organ metastases in anti-Id-treated subjects compared to untreated control subjects. The method described in 1. 前記抗Ｉｄ化合物は、下記（化学式ＩＩ）から選択されるＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（ＡＧＸ５１）の代謝産物である、Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−ヒドロキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（化学式ＩＩａ）、Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−ベンジル−３−（２−メトキシフェニル）プロパン）−１−アミン（化学式ＩＩｂ）、２−（１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（ベンジルアミノ）プロピル）フェノール（化学式ＩＩｃ）若しくはこれらの代謝産物の１つの鏡像異性体、又はこれらの代謝産物の１つの単離された鏡像異性体である、請求項１に記載の方法。

The anti-Id compound is N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N— selected from the following (Chemical Formula II): N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-hydroxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide, which is a metabolite of benzylpropionamide (AGX51) (Formula IIa), N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -N-benzyl-3- (2-methoxyphenyl) propane) -1-amine (formula IIb), 2- (1- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (benzylamino) propyl) phenol (formula IIc) or one enantiomer of these metabolites, Is one isolated enantiomers of these metabolites, The method of claim 1.

前記抗Ｉｄ化合物は、Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（ＡＧＸ５１）、Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−ベンジル−３−（２−メトキシフェニル）プロパン）−１−アミン、又は２−（１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（ベンジルアミノ）プロピル）フェノールの塩である、請求項１に記載の方法。   The anti-Id compound includes N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide (AGX51), N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -N-benzyl-3- (2-methoxyphenyl) propane) -1-amine, or 2- (1- (benzo [d] The process according to claim 1, which is a salt of [1,3] dioxol-5-yl) -3- (benzylamino) propyl) phenol. 前記塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、シュウ酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩又はコハク酸塩である、請求項９に記載の方法。   10. The salt of claim 9, wherein the salt is hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, sulfate, oxalate, malate, maleate or succinate. Method. 化学療法剤、血管破壊剤（ＶＤＡ）、抗血管新生剤、又はＨＳＰ９０から選択された第二の抗Ｉｄ化合物を協調的に投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。   The method of claim 1, further comprising coordinately administering a second anti-Id compound selected from a chemotherapeutic agent, a vascular disrupting agent (VDA), an anti-angiogenic agent, or HSP90. 鏡像異性体が多く含まれた、抗転移活性であるＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドの（−）−鏡像異性体（（−）−ＡＧＸ５１）を含み、哺乳動物対象での増殖性疾患又は転移性疾患の１つ以上の症状を低減又は予防するための有効量で（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体を含む剤形である、医薬組成物。   N- (3- (Benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzyl which is anti-metastatic activity rich in enantiomers Including the (−)-enantiomer of propionamide ((−)-AGX51) in an effective amount to reduce or prevent one or more symptoms of proliferative or metastatic disease in a mammalian subject (− )-A pharmaceutical composition which is a dosage form comprising the AGX51 enantiomer. 前記組成物は、６０％以上の鏡像体過剰率の（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体の鏡像異性体純度を有する、請求項１２に記載の医薬組成物。   13. The pharmaceutical composition according to claim 12, wherein the composition has an enantiomeric purity of (-)-AGX51 enantiomer with an enantiomeric excess of 60% or more. 前記組成物は、９０％以上の鏡像体過剰率の（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体の鏡像異性体純度を有する、請求項１２に記載の医薬組成物。   13. The pharmaceutical composition according to claim 12, wherein the composition has an enantiomeric purity of (-)-AGX51 enantiomer with an enantiomeric excess of 90% or more. 前記組成物は、９８％以上の鏡像体過剰率の（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体の鏡像異性体純度を有する、請求項１２に記載の医薬組成物。   13. The pharmaceutical composition according to claim 12, wherein the composition has an enantiomeric purity of (-)-AGX51 enantiomer with an enantiomeric excess of 98% or more. 前記抗転移活性である実質的に純粋な（−）−ＡＧＸ５１は、経口、口腔、経鼻、エアゾール、局所、経皮、粘膜、又は注射送達用に製剤される、請求項１２に記載の医薬組成物。   13. The medicament of claim 12, wherein said anti-metastatic activity substantially pure (-)-AGX51 is formulated for oral, buccal, nasal, aerosol, topical, transdermal, mucosal, or injectable delivery. Composition. 前記抗転移活性である実質的に純粋な（−）−ＡＧＸ５１は、徐放性粘膜送達製剤、徐放性局所送達製剤又はパッチ装置で処方される、請求項１２に記載の医薬組成物。   13. The pharmaceutical composition of claim 12, wherein the substantially pure (-)-AGX51 that is anti-metastatic activity is formulated in a sustained release mucosal delivery formulation, a sustained release topical delivery formulation or a patch device. 前記抗転移活性である実質的に純粋な（−）−ＡＧＸ５１は、おおよそ８時間以上に亘ってヒト対象での（−）−ＡＧＸ５１の持続的な抗転移有効血漿濃度を提供するために有効な送達形態で製剤され、持続的な抗転移の有効性は、治療される対象における循環血漿でのＩｄ１又はＩｄ３濃度の持続的な低減と関連する、請求項１２に記載の医薬組成物。   The substantially anti-metastatic activity substantially pure (−)-AGX51 is effective to provide a sustained anti-metastatic effective plasma concentration of (−)-AGX51 in human subjects over approximately 8 hours or more. 13. A pharmaceutical composition according to claim 12, formulated in a delivery form, wherein the efficacy of sustained anti-metastasis is associated with a sustained reduction in circulating Id1 or Id3 concentration in the subject being treated. 前記（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体の約１００ｍｇ〜約９００ｍｇの間の抗転移に有効な１日の用量を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。   13. The pharmaceutical composition of claim 12, comprising a daily dose effective between about 100 mg to about 900 mg of the (-)-AGX51 enantiomer effective for anti-metastasis. ５０〜１００ｍｇの用量、１００〜２００ｍｇの用量、１５０〜３００ｍｇの用量、３００〜４００ｍｇの用量、４００〜６００ｍｇの用量から選択される抗転移有効用量を含み、１日に１〜３回の投与で抗転移に有効である、請求項ｘｘに記載の医薬組成物。   Including an antimetastatic effective dose selected from a dose of 50-100 mg, a dose of 100-200 mg, a dose of 150-300 mg, a dose of 300-400 mg, a dose of 400-600 mg The pharmaceutical composition according to claim xx, which is effective for antimetastasis. 鏡像異性体が多く含まれた、抗転移活性であるＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミドの（−）−鏡像異性体（（−）−ＡＧＸ５１）と、
化学療法剤、血管破壊剤（ＶＤＡ）、抗血管新生剤、又はＨＳＰ９０から選択された第二の抗Ｉｄ化合物と、
を含む医薬組成物。 N- (3- (Benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzyl, an antimetastatic activity, rich in enantiomers The (−)-enantiomer of propionamide ((−)-AGX51);
A second anti-Id compound selected from a chemotherapeutic agent, a vascular disrupting agent (VDA), an anti-angiogenic agent, or HSP90;
A pharmaceutical composition comprising 哺乳動物対象における病原性血管増殖性疾患を治療する方法であって、該方法は、化学式Ｉの抗Ｉｄ化合物の抗血管新生有効量を前記患者に投与することを含み、

式中、Ｒ₁、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₀は、水素、ヒドロキシル、スルフヒドリル、ベンジル、２−ブロモビニルアミノ、ヒドロキシメチル、メトキシ、ハロゲン、擬ハロゲン、シアノ、カルボキシル、ニトロ、チオアルコキシ、チオアリール、チオール、１〜２０個の炭素を含む置換若しくは非置換の炭化水素、アルコキシカルボニル、アルキルオキシカルボニルアミノ、アミノ、アミノ酸、アミノカルボニル、アミノカルボニルオキシ、アリールオキシ、カルボキシル、シクロアルケニル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のアラルキル、ペプチジル、染料、フルオロフォア、炭水化物又はポリペプチドから独立して選択され、Ｒ₈及びＲ₉は、化学式Ｉに示されたオルト方向に加え、パラ配置も有することができ、Ｒ₇は、水素、ヒドロキシル、メトキシ、アジド、ニトリル、スルフヒドリル、ハロゲン、ベンゾイル、置換されたベンゾイル又は１〜２０個の炭素を含む置換若しくは非置換の炭化水素で置換されたヒドロキシル、主鎖が１〜２０個の炭素原子であるアルカノイル、ＣＦ₃（ＣＨ₂）_nＣＯ（式中、ｎ＝１〜１０）、ＣＨ₃（ＣＦ₂）_nＣ＝０（式中、ｎ＝１〜１０）、ＣＦ₃（ＣＦ₂）_n（式中、ｎ＝０〜３）、アリール、アルコキシ、ハロゲン、又はニトロ、アリールオキシ、アリールオキシのエステル、アダマントイル、置換されたアダマントイル又は１〜２０個の炭素のアロイルから独立して選択され、Ｒ₁₁がプロピオニルであれば、Ｒ₇はメトキシでなく、Ｒ₇及びＲ₆は、化学式Ｉに示された通りオルトであるか又は互いにパラであることができ、Ｒ₁₁は、独立して水素、プロピオニル、ピボイル、ベンゾイル、置換されたベンゾイル、主鎖が１〜２０個の炭素原子であるアルカノイル、ＣＦ₃（ＣＨ₂）_nＣ＝Ｏ（式中、ｎ＝１〜１０）、ＣＨ₃（ＣＦ₂）_nＣ＝０（式中、ｎ＝１〜１０）又はＣＦ₃（ＣＦ₂）_n（式中、ｎ＝０〜３）であり、Ｒ₇がメトキシであれば、Ｒ₁₁はプロピオニルでなく、Ｒ₁₂は、独立して水素、ハロゲン、²Ｈ、ＣＨ₃（ＣＨ₂）_n（式中、ｎ＝０〜５）、ＣＦ₃（ＣＨ₂）_nＣ＝０（式中、ｎ＝１〜５）、ＣＨ₃（ＣＦ₂）_nＣ＝０（式中、ｎ＝１〜５）又はＣＦ₃（ＣＦ₂）_n（式中、ｎ＝０〜５）である、方法。 A method of treating a pathogenic angioproliferative disorder in a mammalian subject comprising administering to said patient an anti-angiogenic effective amount of an anti-Id compound of formula I;

In the formula, R ₁ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₈ , R ₉ , R ₁₀ are hydrogen, hydroxyl, sulfhydryl, benzyl, 2-bromovinylamino, hydroxymethyl, methoxy, halogen, pseudohalogen, cyano. , Carboxyl, nitro, thioalkoxy, thioaryl, thiol, substituted or unsubstituted hydrocarbon containing 1 to 20 carbons, alkoxycarbonyl, alkyloxycarbonylamino, amino, amino acid, aminocarbonyl, aminocarbonyloxy, aryloxy, Carboxyl, cycloalkenyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted aralkyl, peptidyl, dye, fluorophore , Charcoal Is independently selected from halides or polypeptide, R ₈ and R _9, in addition to the indicated ortho direction Formula I, can also have para arrangement, R ₇ is hydrogen, hydroxyl, methoxy, azido, nitrile , Sulfhydryl, halogen, benzoyl, substituted benzoyl or hydroxyl substituted with a substituted or unsubstituted hydrocarbon containing 1 to 20 carbons, alkanoyl with a main chain of 1 to 20 carbon atoms, CF ₃ ( CH ₂ ) _n CO (where n = 1 to 10), CH ₃ (CF ₂ ) _n C = 0 (where n = 1 to 10), CF ₃ (CF ₂ ) _n (where n = 0-3), aryl, alkoxy, halogen, or nitro, aryloxy, aryloxy ester, adamantyl, substituted adamantyl, or aroyl of 1-20 carbons independently Is, if R ₁₁ is propionyl, R ₇ is not methoxy, R ₇ and R ₆ can be a formula or para to each other is as ortho shown in I, R ₁₁ is independently Hydrogen, propionyl, pivoyl, benzoyl, substituted benzoyl, alkanoyl whose main chain is 1 to 20 carbon atoms, CF ₃ (CH ₂ ) _n C═O (where n = 1 to 10), CH ₃ (CF ₂ ) _n C = 0 (where n = 1 to 10) or CF ₃ (CF ₂ ) _n (where n = 0 to 3), and R ₇ is methoxy, R ₁₁ Is not propionyl, and R ₁₂ is independently hydrogen, halogen, ² H, CH ₃ (CH ₂ ) _n (where n = 0 to 5), CF ₃ (CH ₂ ) _n C = 0 (wherein _{, n = 1~5), CH 3} (CF 2) n C = 0 ( where, n = 1 to 5) or CF ₃ (CF _{2) n} (where, n = 0 to 5 In it, way. 前記抗Ｉｄ化合物は、ラセミＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（ＡＧＸ５１）、又は単離された（−）−ＡＧＸ５１鏡像異性体である、請求項２２に記載の方法。   The anti-Id compound is racemic N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide (AGX51), or 23. The method of claim 22, which is an isolated (-)-AGX51 enantiomer. 前記抗Ｉｄ化合物は、ラセミＮ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−メトキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド、Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（２−ヒドロキシフェニル）プロピル）−Ｎ−ベンジルプロピオンアミド（化学式ＩＩａ）、Ｎ−（３−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ−ベンジル−３−（２−メトキシフェニル）プロパン）−１−アミン（化学式ＩＩｂ）、２−（１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−３−（ベンジルアミノ）プロピル）フェノール（化学式ＩＩｃ）、又はそれらの単離された鏡像異性体である、請求項２２に記載の方法。

The anti-Id compound is racemic N- (3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-methoxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide, N- (3 -(Benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -3- (2-hydroxyphenyl) propyl) -N-benzylpropionamide (formula IIa), N- (3- (benzo [d] [ 1,3] dioxol-5-yl) -N-benzyl-3- (2-methoxyphenyl) propane) -1-amine (formula IIb), 2- (1- (benzo [d] [1,3] dioxole) 23. The method of claim 22, which is -5-yl) -3- (benzylamino) propyl) phenol (Chemical Formula IIc), or an isolated enantiomer thereof.

前記抗Ｉｄ化合物は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、シュウ酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩又はコハク酸塩から選択される塩形態である、請求項２２に記載の方法。   The anti-Id compound is in a salt form selected from hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, sulfate, oxalate, malate, maleate or succinate. 23. The method of claim 22, wherein: 前記病原性血管増殖性疾患は眼疾患である、請求項２２に記載の方法。   23. The method of claim 22, wherein the pathogenic vascular proliferative disease is an eye disease. 前記眼疾患は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、鎌状赤血球網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、新生血管黄斑症、又は眼癌からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。   The eye diseases include age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, sickle cell retinopathy, retinal vein occlusion, central retinal vein occlusion (CRVO), branch retinal vein occlusion ( 26. The method of claim 25, selected from the group consisting of BRVO), neovascular macular disease, or eye cancer. 前記病原性血管増殖性疾患は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である、請求項２２に記載の方法。   23. The method of claim 22, wherein the pathogenic vascular proliferative disorder is age-related macular degeneration (AMD). 前記病原性血管増殖性疾患は、湿った、滲出性ＡＭＤである、請求項２７に記載の方法。   28. The method of claim 27, wherein the pathogenic angioproliferative disorder is wet, exudative AMD. 前記抗Ｉｄ化合物は、抗ＶＥＧＦ剤、抗ＶＥＧＦ受容体拮抗剤、血管破壊剤（ＶＤＡ）、ＨＳＰ−９０阻害剤、抗炎症化合物から選択される二次薬剤と協調的に投与される、請求項２２に記載の方法。   The anti-Id compound is administered in concert with a secondary agent selected from an anti-VEGF agent, an anti-VEGF receptor antagonist, a vascular disruption agent (VDA), an HSP-90 inhibitor, an anti-inflammatory compound. 23. The method according to 22. 光力学治療（ＰＤＴ）又はレーザー光凝固を更に含む、請求項２２に記載の方法。   23. The method of claim 22, further comprising photodynamic therapy (PDT) or laser photocoagulation. 前記抗Ｉｄ化合物は、治療されなかった対照の対象に比べ、抗Ｉｄを治療された対象において滲出性ＡＭＤ病変の発生（治療での病変数）又は大きさ（対象又は対象群での罹患した全網膜表面）での２０％より大きな治療による低減をもたらす、請求項２９に記載の方法。   The anti-Id compound is associated with the occurrence (number of lesions in the treatment) or size (total number of affected lesions in the subject or subject group) in subjects treated with anti-Id compared to control subjects that were not treated. 30. The method of claim 29, wherein the reduction is by treatment greater than 20% at the retina surface. 前記抗Ｉｄ化合物は、治療されなかった対照の対象に比べ、抗Ｉｄを治療された対象において滲出性ＡＭＤ病変の発生（治療での病変数）又は大きさ（対象又は対象群での罹患した全網膜表面）での３０〜５０％の治療による低減をもたらす、請求項２９に記載の方法。   The anti-Id compound is associated with the occurrence (number of lesions in the treatment) or size (total number of affected lesions in the subject or subject group) in subjects treated with anti-Id compared to control subjects that were not treated. 30. The method of claim 29, wherein a reduction by treatment of 30-50% at the surface of the retina is achieved. 前記抗Ｉｄ化合物は、治療されなかった対照の対象に比べ、抗Ｉｄを治療された対象において滲出性ＡＭＤ病変の発生（治療での病変数）又は大きさ（対象又は対象群での罹患した全網膜表面）での５０％より大きな治療による低減をもたらす、請求項２９に記載の方法。   The anti-Id compound is associated with the occurrence (number of lesions in the treatment) or size (total number of affected lesions in the subject or subject group) in subjects treated with anti-Id compared to control subjects that were not treated. 30. The method of claim 29, wherein the reduction is by treatment greater than 50% on the retina surface. 前記抗Ｉｄ化合物による滲出性ＡＭＤ病変の抑制は、治療されなかった対照の対象に比べ、抗Ｉｄを治療された対象において、選択された治療又は観察期間でスネレンラインスコアの少なくとも２０％の低下をもたらす、請求項２９に記載の方法。   Suppression of exudative AMD lesions by the anti-Id compound results in a reduction in snellen line score of at least 20% in the selected treatment or observation period in subjects treated with anti-Id compared to non-treated control subjects 30. The method of claim 29, wherein: 前記抗Ｉｄ化合物による滲出性ＡＭＤ病変の抑制は、治療されなかった対照の対象に比べ、抗Ｉｄを治療された対象において、選択された治療又は観察期間でスネレンラインスコアの少なくとも２０〜５０％の低下をもたらす、請求項２９に記載の方法。   Inhibition of exudative AMD lesions with the anti-Id compound is at least 20-50% of the snellen line score in the selected treatment or observation period in the subject treated with anti-Id compared to a control subject not treated. 30. The method of claim 29, wherein the method results in a decrease in. 前記抗Ｉｄ化合物による滲出性ＡＭＤ病変の抑制は、治療されなかった対照の対象に比べ、抗Ｉｄを治療された対象において、選択された治療又は観察期間でスネレンラインスコアの少なくとも５０％の低下をもたらす、請求項２９に記載の方法。   Inhibition of exudative AMD lesions by the anti-Id compound reduces at least 50% of the snellen line score in the selected treatment or observation period in anti-Id treated subjects compared to untreated control subjects 30. The method of claim 29, wherein: （ａ）抗Ｉｄ活性化合物と、
（ｂ）抗ＶＥＧＦ剤、抗ＶＥＧＦ受容体拮抗剤、血管破壊剤（ＶＤＡ）、ＨＳＰ−９０阻害剤、抗炎症化合物から選択される第二の薬剤化合物と、
を含む、病原性血管新生病態について薬剤治療を受けている対象の治療での使用のための組成物又はキット。 (A) an anti-Id active compound;
(B) a second drug compound selected from an anti-VEGF agent, an anti-VEGF receptor antagonist, a vascular disruption agent (VDA), an HSP-90 inhibitor, an anti-inflammatory compound;
A composition or kit for use in the treatment of a subject undergoing drug treatment for a pathogenic angiogenic condition. Ｉｄタンパク質の生体試料での濃度を明らかにすることによって哺乳動物対象における過剰増殖性疾患を診断するための方法であって、該方法は、
試験対象からの生体試料を、Ｉｄタンパク質のＨＬＨ領域と結合するＩｄ結合タンパク質と反応させることと、
前記試料を、前記Ｉｄ結合タンパク質によって結合された前記Ｉｄタンパク質の前記ＨＬＨ領域から離された前記Ｉｄタンパク質での抗体結合部位で前記Ｉｄタンパク質に特異的に結合する標識された抗体と接触させることと、ここで前記標識された抗体は、前記Ｉｄタンパク質での前記Ｉｄ結合タンパク質とは異なる位置に結合し、
前記Ｉｄ結合タンパク質と複合体を形成した前記標識された抗体の量を計ることと、
を含む方法。 A method for diagnosing a hyperproliferative disease in a mammalian subject by revealing the concentration of an Id protein in a biological sample comprising:
Reacting a biological sample from the test subject with an Id binding protein that binds to the HLH region of the Id protein;
Contacting the sample with a labeled antibody that specifically binds to the Id protein at an antibody binding site in the Id protein separated from the HLH region of the Id protein bound by the Id binding protein; Wherein the labeled antibody binds to a position different from the Id binding protein in the Id protein;
Measuring the amount of the labeled antibody complexed with the Id binding protein;
Including methods. 前記Ｉｄ結合タンパク質又は前記抗Ｉｄ抗体は、固相支持体に結合される、請求項３９に記載の方法。   40. The method of claim 39, wherein the Id binding protein or the anti-Id antibody is bound to a solid support. 前記Ｉｄ結合タンパク質又は前記抗Ｉｄ抗体が標識される、請求項３９に記載の方法。   40. The method of claim 39, wherein the Id binding protein or the anti-Id antibody is labeled. 前記抗Ｉｄ抗体及び前記Ｉｄ結合タンパク質の両方が標識される、請求項３９に記載の方法。   40. The method of claim 39, wherein both the anti-Id antibody and the Id binding protein are labeled. 前記Ｉｄ結合タンパク質は、Ｅ１２、Ｅ４７、Ｅ２−２、ＨＥＢ、ＭｙｏＤ及びＭＲＦから選択されるｂＨＬＨタンパク質である、請求項３９に記載の方法。   40. The method of claim 39, wherein the Id binding protein is a bHLH protein selected from E12, E47, E2-2, HEB, MyoD and MRF. 前記Ｉｄタンパク質は、Ｉｄ１又はＩｄ３である、請求項３９に記載の方法。   40. The method of claim 39, wherein the Id protein is Id1 or Id3. 前記生体試料は、癌である又は癌若しくは転移性疾患の危険性が高いと診断された哺乳動物対象からの体液、血液又は組織試料である、請求項３９に記載の方法。   40. The method of claim 39, wherein the biological sample is a body fluid, blood or tissue sample from a mammalian subject who has been diagnosed with cancer or at high risk of cancer or metastatic disease.

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