JP2017505621A - T細胞受容体を発現する細胞を生産する方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
腫瘍反応性TCRの遺伝子導入は、非反応性末梢血単核細胞(PBMC)および腫瘍浸潤リンパ球(TIL)に高いアビディティーと腫瘍反応性の両方を付与することが示された(Johnson et al. 2006)。これらの著者らは、黒色腫患者腫瘍消化物から直接TILクローンを作製すると、様々な細胞アビディティーを有する多様なMART−1反応性T細胞が明らかになること、およびドナーのPBMCに抗原特異的様式で全体的な細胞アビディティーを付与するにはTCRの移入で十分であることを報告した。さらに、非反応性TILは、高いアビディティーのMART−1 TCRでRNAエレクトロポレーションを行うと、腫瘍反応性となり得る。最近の臨床試験は、抗腫瘍TCRが形質導入されたT細胞の養子免疫移入が癌患者に持続的な他覚的応答を誘導し得ることを示した(Kunert A et al., 2013, Hinrichs CS, et al., 2014)。
a)TCRを発現し得る細胞、かつ/またはTCRを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなる細胞集団に、ベイトTCRポリペプチド鎖をコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、前記ベイトTCRポリペプチド鎖は、前記目的ペプチドと特異的に結合するカウンター鎖(counterchain)TCRポリペプチド鎖とともに親TCR(parent TCR)を構成し得る;および
b)前記ベイトTCRの発現を許容する条件下で培養すること
を含んでなる方法を含む。
a)TCRを発現し得る細胞、および/またはTCRを発現する細胞に分化し得る細胞集団に、ベイトTCRポリペプチド鎖をコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、前記ベイトTCRポリペプチド鎖は、前記目的ペプチドと特異的に結合するカウンター鎖TCRポリペプチド鎖とともに親TCRを構成し得る;ならびに
b)場合により、工程(a)で得られた形質導入された細胞集団から、前記目的ペプチドと選択的に結合する、ベイトTCRポリペプチド鎖とプレイTCRポリペプチド鎖を含んでなるTCRを発現する細胞を選択すること;ならびに
c)前記選択された細胞から、プレイTCRポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を単離すること
を含んでなる方法を含む。
(a)細胞集団に、前記目的ペプチドを認識するT細胞から発現され、従前に単離された、TCRを構成する2つのポリペプチド鎖のうちのいずれか一方をコードする核酸を形質導入すること、ここで、前記細胞集団は、TCRを発現し得る細胞、またはTCRを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなるものであり、
(b)工程(a)で得られた形質導入された細胞集団から、目的ペプチドに特異的なTCRを発現する組換え細胞を選択し、
(c)工程(b)で選択された細胞から、前記細胞集団に形質導入された核酸によりコードされるポリペプチドとともにTCRを構成するポリペプチドをコードする核酸を単離し、かつ
(d)工程(a)で前記細胞集団に形質導入された核酸と工程(c)で単離された核酸をペアとすること
を含んでなる方法が提供される。
a)TCRを発現し得る細胞、またはTCRを発現する細胞に分化し得る細胞(cells which cells can express a TCR or differentiate into cells expressing a TCR)を含んでなる細胞集団に、カウンター鎖TCRポリペプチド鎖とともに発現TCRを構成する、TCRポリペプチドであって、場合により、TCRαまたはTCRβポリペプチド鎖から選択されるTCRポリペプチドをコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、前記ベイトポリペプチドは、前記目的ペプチドを認識するT細胞から従前に単離されたものであり、
b)工程(a)で得られた、形質導入された細胞集団から、目的ペプチドに特異的なTCRを発現する組換え細胞を選択し、かつ
c)工程(b)で選択された細胞から、前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸によりコードされるポリペプチドとともにTCRを構成するプレイポリペプチドをコードする核酸を単離すること
を含んでなる方法を提供する。
一面は、目的ペプチドに特異的な高親和性TCR を生産するための方法であって、
a)TCRを発現し得る細胞および/またはTCRを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなる細胞集団に、ベイトTCRポリペプチド鎖をコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、前記ベイトTCRポリペプチド鎖は、前記目的ペプチドと特異的に結合するカウンター鎖TCRポリペプチド鎖とともに親TCRを構成し得る;ならびに
b)前記ベイトTCRの発現を許容する条件下で培養すること
を含んでなる方法を含む。
c)工程(a)または(b)で得られた形質導入された細胞集団から、前記目的ペプチドと選択的に結合する、ベイトTCRポリペプチド鎖およびプレイTCRポリペプチド鎖を含んでなるTCRを発現する組換え細胞を得ること;および
d)前記選択された細胞から、プレイTCRポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を単離すること
をさらに含んでなる方法を含む。
アラニンA D−−Ala、Gly、β−Ala、L−−Cys、D−Cys
アルギニンR D−−Arg、Lys、D−−Lys、ホモ−Arg、D−ホモ−Arg、Met、Ile、D−−Met、D−−Ile、Orn、D−Orn
アスパラギンN D−−Asn、Asp、D−−Asp、Glu、D−−Glu、Gln、D−−Gln
アスパラギン酸D D−−Asp、D−−Asn、Asn、Glu、D−−Glu、Gln、D−−Gln
システインC D−−Cys、S−−Me−−Cys、Met、D−−Met、Thr、D−−Thr
グルタミンQ D−−Gln、Asn、D−−Asn、Glu、D−−Glu、Asp、D−−Asp
グルタミン酸E D−−Glu、D−−Asp、Asp、Asn、D−−Asn、Gln、Acid D−−Gln
グリシンG Ala、D−−Ala、Pro、D−−Pro、β−Ala Acp
イソロイシンI D−−Ile、Val、D−−Val、Leu、D−−Leu、Met D−−Met
ロイシンL D−−Leu、Val、D−−Val、Leu、D−−Leu、Met、D−−Met
リシンK D−−Lys、Arg、D−−Arg、ホモ−Arg、D−ホモ−Arg、Met、D−−Met、Ile、D−−Ile、Orn、D−−Orn
メチオニンM D−−Met、S−−Me−−Cys、Ile、D−−Ile、Leu、D−−Leu、Val、D−−Val
フェニルアラニンF D−−Phe、Tyr、D−−Thr、L−Dopa、His、D−−His、Trp、D−−Trp、トランス−3,4,または5−フェニルプロリン、シス−3,4,または5−フェニルプロリン
プロリンP D−−Pro、L−−I−チオアゾリジン−4−カルボン酸、D−−またはL−1オキサゾリジン−4−カルボン酸
セリンS D−−Ser、Thr、D−−Thr、アロ−Thr、Met、D−−Met、Met(O)、D−−Met(O)、L−−Cys、D−−Cys
トレオニンT D−−Thr、Ser、D−−Ser、アロ−Thr、Met、D−−Met、Met(O)、D−−Met(O)、Val、D−−Val
チロシンY D−−Tyr、Phe、D−−Phe、L−Dopa、His、D−−His
バリンV D−−Val、Leu、D−−I,eu Ile、D−−Ile、Met、D−Met。
1)アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
(a)TCRを発現し得る細胞、またはTCRを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなる細胞集団に、TCRαポリペプチド鎖またはTCRβポリペプチド鎖から選択されるTCRポリペプチド鎖をコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、TCRポリペプチド鎖は、カウンター鎖TCRポリペプチド鎖とともに、発現TCRを構成し、前記ベイトTCRポリペプチド鎖は、前記目的ペプチドを認識するT細胞から従前に単離されたものであり、
(b)形質導入された細胞集団をベイトTCRポリペプチド鎖の発現を許容する条件下で培養し、
(c)工程(b)で得られた形質導入された細胞集団から、目的ペプチドに特異的なTCRを発現する1以上の細胞を得、かつ
(d)工程(c)で得られた(obtainedd)細胞から、前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸によりコードされるTCRポリペプチド鎖とともにTCRを構成するプレイTCRポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を単離すること
を含んでなる方法を含む。
(a)細胞集団に、前記目的ペプチドを認識するT細胞から発現され、従前に単離された、TCRを構成するTCRαポリペプチド鎖またはTCRβポリペプチド鎖のうちのいずれか1つをコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、前記細胞集団は、TCRを発現し得る細胞、またはTCRを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなるものであり、
(b)形質導入された細胞集団をベイトTCRポリペプチド鎖の発現を許容する条件下で培養し、
(c)工程(b)で得られた形質導入された細胞集団から、目的ペプチドに特異的なTCRを発現する1以上の細胞を選択し、
(d)工程(c)で選択された1以上の細胞から、ベイト核酸によりコードされるTCRポリペプチド鎖とともにTCRを構成し得るTCRポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を単離し、かつ
(e)工程(a)で前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸または同鎖TCRポリペプチド鎖をコードする核酸と、工程(d)で単離されたプレイ核酸をペアとすること
を含んでなる方法に関する。
一面において、本開示は、目的ペプチドに特異的なTCRを発現する細胞を生産するための方法であって、細胞集団に、TCRを構成する2つのカウンター鎖ポリペプチド鎖(例えば、TCRαまたはβ)のうちいずれか一方をコードする核酸を形質導入する工程を含んでなる方法に関し、場合により、前記核酸は、前記目的ペプチドを認識するT細胞から発現され、および、従前に単離されたものであり、ならびに、前記細胞集団は、TCRを発現し得る細胞、またはTCRを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなる。例えば、図22参照。一実施態様では、本方法は、付加的TCRポリペプチド鎖、場合により、導入されたまたは共導入されたTCRポリペプチド鎖のカウンター鎖(例えば、TCRβが共導入された、またはされる場合にはTCRα)または異なるTCRポリペプチド鎖(例えば、TCRαおよびTCRδ)をコードする核酸を導入することをさらに含んでなる。
本開示は、(2)に記載される方法により得られた目的ペプチドに特異的なTCRを発現する細胞を含んでなる細胞集団に関する。加えて、本開示は、(1)に記載される方法によって得られた核酸ペアによりコードされるTCRを発現する細胞を含んでなる細胞集団に関する。
本開示はまた、例えば、本明細書に記載の配列の1以上を含む、新規なTCR鎖およびCDR3領域ポリペプチド、ならびにそのようなTCR鎖およびCDR3領域をコードする核酸を提供する。配列番号73で表されるMART127−35ペプチドに特異的なTCRを発現する細胞は、配列番号2のアミノ酸配列を有するSIG35α鎖をコードする核酸を使用することで得ることができる。得られるT細胞で発現されるTCRはSIG35α鎖および、形質導入細胞で内在的に発現されるβ鎖によって形成される。例えば、クローン794およびクローン830はそれぞれ、SIG35α鎖および内在的に発現されるTCRβ鎖から構成され、MART127−35ペプチドに対して高いアビディティーを有するTCRを発現する。クローン794(配列番号4)およびクローン830(配列番号6)のTCRβ鎖をコードする単離されたおよび/または組換え操作された核酸が本開示に含まれる。同様に、配列番号74で表されるWT1235−243ペプチドに特異的なTCRを発現する細胞は、配列番号16のアミノ酸配列を有するTAK1β鎖をコードする核酸を使用することにより得ることができる。クローンT53、クローンA262、クローンT243およびクローンT262はそれぞれ、TAK1β鎖および内在的に発現されるTCRα鎖から構成され、WT1235−243ペプチドに対して高いアビディティーを有するTCRを発現する。クローンT53(配列番号8)、クローンA262(配列番号10)、クローンT243(配列番号12)およびクローンT262(配列番号14)のTCRα鎖をコードする核酸が本開示に含まれる。加えて、クローン8H、クローン7Qおよびクローン9Jはそれぞれ、SIG35α鎖および内在的に発現されるTCRβ鎖から構成され、MART127−35ペプチドに対して高いアビディティーを有するTCRを発現する。単離されたおよび/または組換え操作された、クローン8H(配列番号94)、クローン7Q(配列番号96)およびクローン9J(配列番号98)のTCRβ鎖をコードする核酸が本開示に含まれる。
細胞
PG13細胞株およびphoenix−eco細胞株を、10%ウシ胎児血清(FCS)および50μg/mLゲンタマイシン(Gibco)を添加したDMEM培地で培養した。CD8αβおよび固有のTCR分子の発現を欠くJurkat細胞サブクローンであるJurkat76細胞株を、10%FCSおよび50μg/mLゲンタマイシンを添加したRPMI 1640培地で培養した。CD80遺伝子およびCD83遺伝子で形質導入されたHLA−ヌルK562細胞を、HLA−A*02:01遺伝子またはHLA−A*2でさらに形質導入し、aAPCとして使用した。いくつかの実験では、227および228の位置に2つのアミノ酸置換(D227K/T228A)を有する突然変異HLA−A*02:01遺伝子および野生型HLA−A*02:01遺伝子の代わりにヒトIL−21遺伝子で形質導入された突然変異aAPC細胞を使用した。aAPC細胞もまた、10%FCSおよび50μg/mLゲンタマイシンを添加したRPMI 1640培地で培養した。特に、HLAクラスI分子の代わりにα−ヒトCD3 mAb(クローンOKT3)の膜型の重鎖および軽鎖で形質導入されたmOKT3−aAPC細胞を、1mg/mL G418スルフェート(Cellgro)、2.5μg/mLピューロマイシン(InvivoGen)および50μg/mLゲンタマイシンを添加したRPMI 1640培地で培養した。American Type Culture Collection(ATCC)から得たSupT1細胞およびT2細胞を、10%FCSおよび50μg/mLゲンタマイシンを添加したRPMI 1640で培養した。ATCCから得た黒色腫細胞株A375(HLA−A*02:01+、MART1−)およびMalme−3M(HLA−A*02:01+、MART1+)を、10%FCSおよび50μg/mLゲンタマイシンを添加したDMEMで培養した。健常ボランティアから末梢血単核細胞を単離し、使用まで液体窒素中で保存した。
HLA−A*02:01拘束およびMART127−35(A2/MART1)特異的TCRからクローニングされ、SIG35αと呼称されるTCRα鎖が、公開されたTCRα鎖として報告されている(Dietrich et al., 2003, Trautmann et al., 2002, Li et al., 2010)。HLA−A*24:02拘束およびWT1235−243(A24/WT1)特異的TCRα遺伝子およびTCRβ遺伝子を確立されたCTLクローンTAK1から、5’ RACE法(Clontech)を用いてクローニングした。SIG35α遺伝子はTRAV12−2/TRAJ35/Cαであり、TAK1のTCRα遺伝子およびTCRβ遺伝子はそれぞれTRAV20/TRAJ33/CαおよびTRBV5.1/TRBD2/TRBJ2−1/Cβ2である。SIG35α、TAK1αおよびTAK1β遺伝子のコドンを最適化し、各遺伝子をフューリン切断配列、sgsgリンカーおよび***ウイルス(F2A)ペプチド、次いで、末端切断型NGFR遺伝子(ΔNGFR)と連結し、この構築物をpMXレトロウイルスベクターに組み込んだ。エコトロピックレトロウイルスベクターを、TransIT293(Mirus Bio)を用いた、SIG35α/ΔNGFR、TAK1α/ΔNGFRまたはTAK1β/ΔNGFRレトロウイルスプラスミドのphoenix−eco細胞株への一時的トランスフェクションにより得、次いで、PG13細胞株に前記エコトロピックレトロウイルスベクターで形質導入し、クローニングした。安定なPG13細胞株から高力価GaLV偽型レトロウイルスベクターを得、ヒト末梢T細胞への形質導入に用いた。
末梢血単核細胞(PBMC)を健常なボランティアから単離し、形質導入の3日前に100IU/mLヒトIL−2(Proleukin;Novartis)の存在下で、50ng/mL α−ヒトCD3 mAb(クローンOKT3)で刺激した。次に、32℃、1000gで1時間、遠心分離を行うことにより、次の6日間、T細胞にSIG35α/ΔNGFRレトロウイルスベクターを形質導入した。形質導入後のA2/MART1特異的T細胞の頻度を測定するために、細胞をα−ヒトCD8 mAb(クローンB9.11;Beckman Coulter)、α−ヒトNGFR mAb(クローンME20.4;Biolegend)およびPEコンジュゲートHLA−A*02:01/MART126−35ヘテロクリティック多量体(Proimmune)、HLA−A*02:01/HIV pol476−484多量体(Proimmune)またはHLA−A*02:01/Flu58−66多量体で標識した。他の実験では、TAK1α/ΔNGFR遺伝子またはTAK1β/ΔNGFR遺伝子もどのTCR鎖がA24/WT1特異性の指定に主要な役割を持つかを調べるために、上記のように刺激済みのT細胞に形質導入した。形質導入後のWT1特異的T細胞の陽性を評価するために、細胞を上記抗体およびPEコンジュゲートHLA−A*24:02/WT1235−243ヘテロクリティックな四量体またはHLA−A*24:02/サバイビン−2B80−88四量体で標識した。標識された細胞を、CANTO(商標)IIフローサイトメーター(Becton Dickinson)およびFlowJoバージョン7.6.4ソフトウエア(TreeStar)を用いて分析した。四量体およびCD8+遺伝子改変T細胞の頻度は、ΔNGFR+細胞のゲート設定により分析した。
抗原特異的T細胞株を確立するために、CD8+遺伝子改変T細胞をCD8+T細胞単離キット(MACS(商標)ビーズ;Miltenyi Biotec)により得た。A2/MART1特異的CD8+遺伝子改変T細胞の拡大増殖のために、野生型HLA−A*02:01分子を発現するwtA2−aAPC細胞または野生型HLA−A*02:01の代わりに上記の突然変異HLA−A*02:01分子およびヒトIL−21を発現するmutA2−aAPC細胞を10μg/mL MART127−35ペプチド(AAGIGILTV)(配列番号73)でパルス処理した。A24/WT1特異的CD8+遺伝子改変T細胞、HLA−A*24:02分子を発現するA24−aAPC細胞を、1μg/mL WT1235−243ヘテロクリティックなペプチド(CYTWNQMNL)(配列番号74)でパルス処理した。aAPC細胞は、無血清RPMI 1640培地中、室温にて6時間、ペプチドでパルス処理した。次に、aAPC細胞に20,000ラッドを照射し、洗浄し、24ウェルプレートの、50μg/mLゲンタマイシンおよび10%ヒトAB血清(Gemini Bio−products)を添加したRPMI中に1:20の比で精製したCD8+遺伝子改変T細胞に加えた。翌日、再指向CD8+T細胞培養物に、3〜4日毎に低用量のヒトIL−2(10IU/mL)およびヒトIL−15(10ng/mL)(PeproTech)を添加した。7日毎に繰り返し刺激を行った。2回目の刺激の後、細胞株を各四量体陽性およびIFN−γ分泌について評価した。四量体およびCD8+遺伝子改変T細胞の頻度をΔNGFR+細胞のゲート設定により分析した。
表1および2に示されるように、TCR Vβサブタイプ分析は、A2/MART1多量体+CD8+T細胞に対してBeta Mark TCR Vβレパートリーキット(Beckman−Coulter)を用いて行った。TCR Vβサブタイプ分析に用いた命名法は、Wei et al, 1994からのものである。
TRIzol(Ambion)を製造者の説明書に従って用い、SIG35α/ΔNGFRまたはTAK1β/ΔNGFRで形質導入されたT細胞から全RNAを抽出した。TRBV27を含み、SIG35αとペアをなした全長TCRβ遺伝子をRT−PCRにより、TRBV27特異的フォワードプライマー5’−TRBV27
96ウェル平底ポリビニリデンジフルオリドプレート(Millipore)を、捕捉α−ヒトインターフェロン−γ(IFN−γ)mAb(クローン1D1K;MABTECH)またはα−ヒトインターロイキン−2(IL−2)mAb(R&D Systems)でコーティングし、一晩4℃でインキュベートした。2%FCSを添加したPBSで洗浄した後、T細胞を、10%FCSを添加したRPMI 1640培地中、ペプチドの存在下または不在下で、2.0×104/ウェルの示されたAPCとともに、37℃で20〜24時間インキュベートした。使用したペプチドは、A2/MARTに対しては110μg/mL MART127−35または10μg/mL HIV pol476−484ペプチド、A24/WT1に対しては1μg/mL WT1235−243ヘテロクリティックペプチドまたはHIV−1 env584−592ペプチドであった。インキュベーション後、プレートを洗浄し、ビオチンコンジュゲート検出α−ヒト IFN−γ mAb(7−B6−1;MABTECH)またはα−ヒトIL−2 mAb(R&D system)とともに4℃で一晩インキュベートした後、IFN−γの場合にはHRPコンジュゲートストレプトアビジン(SA)またはIL−2の場合にはALPコンジュゲートSAに曝した。特異的スポットを明らかにするために、IFN−γの場合には3−アミノ−9−エチルカルバゾール(Sigma−Aldrich)および0.015%H2O2を含有する100μLの0.1M酢酸バッファーまたはIL−2の場合には100mM NaClおよび0.5mM MgCl2およびニトロブルーテトラゾリウム/5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−ホスフェート(Promega)を含有する100mM Tris−HCl(pH9.5)バッファーを各ウェルに加えた。40分後、水で洗浄することにより呈色反応を中断させ、プレートを乾燥させた。拡散性の大きなスポットを、ImmunoSpot(登録商標)バージョン5.0.2ソフトウエア(Cellular Technology Limited)を用いて計数した。
A2/MART1反応性を調べるために、Jurkat76細胞株に、CD8αβ遺伝子を伴い、または伴わずにSIG35α遺伝子でレトロウイルスによる形質導入を行った。これらの遺伝子の形質導入後、Jurkat76/SIG35αまたはJurkat76/CD8αβ/SIG35αトランスフェクト体に、TCRβ遺伝子(クローン:413、523、788、1086、830、または794)でさらに形質導入を行い、ヒトCD3 MACS(商標)ビーズシステム(Miltenyi Biotec)で選別した。Jurkat76細胞株にはまた、CD8αβ遺伝子を伴い、または伴わずに、DMF5と呼称されるA2/MART1特異的TCRでも形質導入を行った。Jurkat76/DMF5 TCRトランスフェクト体およびJurkat76/CD8αβ/DMF5 TCRトランスフェクト体もまた、DMF5 TCRのA2/MART1反応性をSIG35α/TCRβ TCRのそれと比較するために確立した。これらのJurkat76トランスフェクト体を、A2/MART1に対するTCRの構造的アビディティーを評価するために、漸増濃度のHLA−A*02:01/MART127−35ヘテロクリティック多量体で染色した。機能的アビディティーは、IL−2 ELISPOTアッセイにおいて漸増濃度のMART127−35ペプチドでパルス処理したT2細胞を刺激因子として用いて試験した。A24/WT1反応性を評価するために、Jurkat76/CD8αβトランスフェクト体に、TAK1β遺伝子で形質導入した。Jurkat76/CD8αβ/TAK1βトランスフェクト体に、TCRα遺伝子(クローン:T53、A262、T243、T262)または親TAK1α遺伝子でさらに形質導入し、FITCコンジュゲートα−ヒトVβ5.1 mAb(Beckman Coulter)およびα−FITC−MACS(商標)ビーズシステム(Miltenyi Biotec)で選別した。確立されたJurkat76/CD8αβ/TAK1β/TCRα細胞株を、IL−2 ELISPOTアッセイにおいてA24/WT1反応性に関して評価した。いくつかの実験では、腫瘍細胞表面で天然にプロセシングされ、提示されたA2/MART1またはA24/WT1の反応性を調べるためにこれらのJurkat76トランスフェクト体を用いた。A2/MART1特異的TCRに対してはMalme−3M細胞を用い、A24/WT1特異的TCRに対してはA24−aAPC細胞を用いた。
TCR遺伝子改変T細胞の養子免疫移入は技術的に実現可能であり、癌免疫療法に有望な処置である。しかしながら、胸腺選択および末梢性免疫寛容が、末梢T細胞から高親和性腫瘍反応性TCRを同定することを困難にする。高親和性TCRを効率的に単離するために、末梢T細胞に、単独でHLA拘束ペプチド特異性を指定することができる、単一のTCR鎖遺伝子(例えば、本明細書ではヘミチェーンとも呼ばれる)を導入することにより、胸腺無選択T細胞レパートリーを作製した。種々のクロノタイプTCRβ鎖を発現する複数のHLAA*02:01(A2)/MART1 CD8+ T細胞クローンから共有されるTCRα遺伝子(クローンSIG35α)を単離した。SIG35αで形質導入した場合、A2+およびA2−の両ドナーからの末梢CD8+ T細胞はA2/MART1を認識し、A2/MART1特異的様式で拡大増殖した。試験した総てのドナーで、A2/MART1多量体+細胞は主としてTRBV27 TCRβ鎖を発現し、それらのCDR3β配列は極めて多様であった(図24および25参照)。11のクロノタイプTRBV27 TCRβ鎖が、CD8共受容体の存在下または不在下で、ヒトTCRαβ欠損T細胞上でSIG35αとともに個々に再構成された。これらのトランスフェクト体は広範な構造的および機能的アビディティー(>2桁)を有していた。表6に示されるように、11のトランスフェクト体のうち6つが、A2/MART1 TCRを発現するもの、すなわち、クローンDMF5よりも高いアビディティーを示し、CD8非依存的にA2+ MART1+腫瘍細胞を認識した。ポリクローナルSIG35α鎖で形質導入されたCD8+T細胞の養子免疫移入は、in vivoにおいてA2+ MART1+腫瘍細胞の増殖を阻害した。重要なことには、一本鎖TCR遺伝子導入戦略は、A2/NYESO−1およびA2/Her2に特異的なCD8+T細胞の生成に上手く拡張された。
同種異系造血幹細胞移植(HSCT)において、移植片対宿主病(GVHD)から白血病(GVL)の影響を分離するための慣例の戦略はまだ無い。クロノタイプT細胞受容体(TCR)はMHC拘束抗原特異的反応性を持つだけではなく同種異系MHC拘束反応性(アロ反応性)も持つことが示されている。TCRの一次構造を調整することによって、T細胞によって引き起こされるGVLおよびGVHDが分子レベルで分離可能であるかどうかが検討された。ビルムス腫瘍1(WT1)は、多くの腫瘍で過剰発現されるが、正常な細胞では過剰発現されない腫瘍関連抗原である。HLA−A*24:02/WT1235−243(A24/WT1)を認識するとともにHLA−B*57:01(B57)に対してアロ反応性を有するWT1特異的TCR、クローンTAK1が従前に単離された。TAK1β鎖で形質導入されているがTAK1α鎖を持たない末梢T細胞は、2名のA24陰性ドナーを含む、6名の供試ドナーの総てで、A24/WT1およびB57の両方を認識した。重要なことには、ポリクローナルTAK1βで形質導入されたT細胞により示されたA24/WT1反応性は、B57アロ反応性とは相関が無かった。CD8α/β+ TCR−T細胞株上で、TAK1β鎖とともに種々のTCRα鎖から構成される43のA24/WT1および/またはB57反応性TCRが再構成されていた。A24/WT1の反応性とTAK1β鎖とペアをなしたTRAV36 TCRα鎖のB57アロ反応性には相関があったことが判明した(R2=0.904、p<0.0001)。これに対して、TAK1β鎖とともに再構成された非TRAV36 TCRα鎖のA24/WT1およびB57反応性は相関していなかった(R2=0.031、p<0.471)。A24/WT1に対するクロノタイプ非TRAV36 TCRα鎖の反応性の同定には成功したが、B57では成功しなかった。これらの結果は、クロノタイプTCRの抗原特異的反応性およびアロ反応性は、TCRの一次構造を調整することにより分離可能であることを示唆する。
Claims (46)
- 高親和性TCR、目的ペプチドに特異的なTCRを発現する組換え細胞および/または目的ペプチドに特異的なTCRを形成し得るT細胞受容体(TCR)ポリペプチド鎖をコードする核酸を得る方法であって、
a.TCRを発現し得る細胞、および/またはTCRを発現し得る細胞に分化し得る細胞を含んでなる細胞集団に、ベイトTCRポリペプチド鎖をコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、前記ベイトTCRポリペプチド鎖は、前記目的ペプチドと特異的に結合するカウンター鎖TCRポリペプチド鎖とともに親TCRを構成し得るものである;
b.形質導入された細胞集団をベイトTCRポリペプチド鎖の発現を許容する条件下で培養すること;ならびに
c.下記の1以上:
i)工程(b)で得られた形質導入された細胞集団から、前記目的ペプチドと選択的に結合する、ベイトTCRポリペプチド鎖とプレイTCRポリペプチド鎖を含んでなるTCRを発現する組換え細胞を得ること;
ii)工程(c)(i)で得られた細胞から、プレイTCRポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を単離すること;および/または
iii)工程(c)(ii)において単離された、単離されたプレイ核酸と、発現された際に高親和性TCRを提供するベイト核酸をペアとすること
を含んでなる、方法。 - 工程(b)で得られた形質導入された細胞集団から、前記目的ペプチドと選択的に結合する、ベイトTCRポリペプチド鎖とプレイTCRポリペプチド鎖を含んでなるTCRを発現する組換え細胞を得る工程が、形質導入されたベイトTCRポリペプチド鎖を発現し、かつ、目的ペプチドと結合する細胞集団の1以上の細胞を単離することを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記プレイ核酸が前記プレイ核酸をクローニングすることにより単離される、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プレイTCRポリペプチド鎖が、対照TCRポリペプチドCDR3領域のCDR3領域、場合により親TCRにおける同族ポリペプチド鎖のCDR3領域、に比べて少なくとも1つのアミノ酸修飾を含んでなるCDR3領域を含んでなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、
i)ベイトTCRポリペプチド鎖の発現を許容する条件下でTCRを発現し得る細胞またはTCRを発現し得る細胞に分化し得る細胞に、単離されたプレイ核酸およびベイト核酸を導入すること;ii)プレイTCRポリペプチド鎖とベイトTCRポリペプチド鎖とを含んでなるTCRのアビディティーおよび/または親和性を測定すること;ならびに、iii)プレイTCRポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸クローンを単離すること、ここで、前記ベイトTRポリペプチド鎖および前記プレイTCRポリペプチド鎖は、対照TCR、場合により親TCRに比べて目的ペプチドに対して増大したアビディティーおよび/または親和性を有するTCRを構成するものである、
をさらに含んでなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - カウンター鎖TCRポリペプチドとともに目的ペプチドに特異的なTCRを構成するTCRポリペプチド鎖をコードする核酸を得るための請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法であって、以下の工程:
a.TCRを発現し得る細胞、またはTCRを発現し得る細胞に分化し得る細胞を含んでなる細胞集団に、カウンター鎖TCRポリペプチド鎖とともにTCRを構成するベイトTCRポリペプチド鎖であって、場合によりTCRαおよびTCRβポリペプチド鎖から選択されるTCRポリペプチド鎖をコードするベイト核酸を形質導入し、ここで、前記ベイトTCRポリペプチド鎖は、前記目的ペプチドを認識するT細胞から従前に単離されたものであり、
b.前記形質導入された細胞集団をベイトTCRポリペプチド鎖の発現を許容する条件下で培養し、
c.工程(b)で得られた形質導入された細胞集団から目的ペプチドに特異的なTCRを発現する細胞を得、かつ
d.工程(c)で得られた細胞から、前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸によりコードされるポリペプチドとともにTCRを構成するプレイTCRポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を単離すること
を含んでなる、方法。 - TCRを発現する組換え細胞を得る工程が、形質導入された細胞集団を、目的ペプチドを提示する抗原提示細胞とともに培養する工程を含んでなる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 形質導入された細胞集団から目的ペプチドに特異的なTCRを発現する組換え細胞を得る工程が、セルソーティング、場合により蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用することを含んでなる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 目的ペプチドに特異的なTCRをコードする核酸のペアを得るための請求項1に記載の方法であって、以下の工程:
a.細胞集団に、TCRを構成するベイトポリペプチド鎖の群から選択されるベイトTCRポリペプチド鎖をコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、前記ベイトTCRポリペプチド鎖は、目的ペプチドを認識するT細胞から発現され、従前に単離されたものであり、前記細胞集団は、TCRを発現し得る細胞、またはTCRを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなるものであり、
b.前記形質導入された細胞集団をベイトTCRポリペプチド鎖の発現を許容する条件下で培養し、
c.工程(b)で得られた形質導入された細胞集団から、目的ペプチドに特異的なTCRを発現する組換え細胞を得、
d.工程(c)で得られた細胞から、前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸によりコードされるポリペプチドとともにTCRを構成するポリペプチドをコードするプレイ核酸を単離し、かつ
e.工程(a)で前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸と工程(d)で単離されたプレイ核酸をペアとすること
を含んでなる、方法。 - 工程(c)で組換え細胞を得ることが、形質導入された細胞集団を、目的ペプチドを提示する抗原提示細胞とともに培養する工程を含んでなる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団が末梢血単核細胞(PBMC)、場合によりCD3リガンドで活性化されたPBMCの集団である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)で前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸がTCRα鎖またはTCRβ鎖をコードする、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)で前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸が、TCRによるペプチド認識に主として寄与するTCR鎖をコードする、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 形質導入が2回、3回、4回、5回および/または6回繰り返される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- プレイTCRポリペプチド鎖をコードする単離されたプレイ核酸がTCRを発現し得る細胞、またはTCRを発現し得る細胞に分化し得る細胞に形質導入され、場合により、ここで、前記単離されたプレイ核酸は、プレイTCRポリペプチド鎖とともにTCRを構成するTCRポリペプチド鎖をコードする核酸、場合によりベイトTCR核酸、と組み合わせて形質導入され、目的ペプチドに特異的なTCRを発現する組換え細胞を含んでなる形質導入された細胞集団を生産する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞集団または細胞がまた、内在性TCR鎖の発現を抑制するためのアンチセンス分子でも形質導入される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 形質導入された1以上の前記核酸、場合によりベイト核酸、のコドンが最適化される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号4、6、8、10、12、14、52、54、56、58、60、62、81〜86、88〜91、94、96、98、112、114、116〜122から選択される配列および/または配列番号4、6、8、10、12、14、52、54、56、58、60、62、81〜86、88〜91、94、96、98、112、114、116〜122から選択される配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列および/または配列番号3、5、7、9、11、13、51、53、55、57、59、61、93、95、97、111、113、115のいずれか1つによりコードされる配列および/または3、5、7、9、11、13、51、53、55、57、59、61、93、95、97、111、113、115から選択される配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含んでなり、ならびに、4、6、8、10、12、14、52、54、56、58、60、62、81〜86、88〜91、94、96、98、112、114、116〜122から選択されるポリペプチドをコードするか、またはCDR領域もしくは非CDR領域などのその一部を含んでなり、場合により、本明細書の配列から少なくとも1つのアミノ酸変異を含んでなるか、もしくはコードし、および/または本明細書のいずれかの核酸配列のコドン最適化型を含んでなる配列を含んでなる、単離されたおよび/または組換え操作されたTCRポリペプチド。
- 相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3を含んでなり、前記CDRの配列が、
CDR1:配列番号20、22、24、26、28、30、100、102、104;
CDR2:配列番号36、38、40、42、44、46、106、108、110;および
CDR3:配列番号52、54、56、58、60、62、81〜91、112、114、116〜122
から選択され、ならびに/または
前記CDR配列は、
CDR1:配列番号20、22、24、26、28、30、100、102;
CDR2:配列番号36、38、40、42、44、46、106、108、110;および
CDR3:配列番号52、54、56、58、60、62、81〜91、112、114、116〜122
から選択される配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するものである、
請求項18に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCRポリペプチド。 - 前記CDR配列が、
CDR1:配列番号20、22、24、26、28、30、100、102;
CDR2:配列番号36、38、40、42、44、46、106、108;および
CDR3:配列番号52、54、56、58、60、62、81〜91、112、114、116〜122
から選択される、請求項19に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCRポリペプチド鎖。 - 前記TCRポリペプチド鎖がCDR1、CDR2およびCDR3領域を含んでなるTRCβポリペプチド鎖であり、前記CDR配列は、
CDR1:配列番号20、22、100、102;
CDR2:配列番号36、38、106、108;および
CDR3:配列番号52、54、81〜91、112、114、116〜122
から選択される、請求項20に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCRポリペプチド鎖。 - 前記TCRβポリペプチド鎖が、MART127−35ペプチドと特異的に結合するTCRαポリペプチドカウンター鎖とともに親TCRを構成し得る、請求項21に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCRポリペプチド鎖。
- TCRαポリペプチドカウンター鎖が、配列番号2を有するSIG35α鎖である、請求項22に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCRポリペプチド鎖。
- 前記TCRβポリペプチド鎖が、配列番号4、6、94、96および98から選択される配列を有する、請求項19〜23のいずれか一項に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCRポリペプチド鎖。
- 前記TCRポリペプチド鎖が、CDR1、CDR2およびCDR3領域を含んでなるTRCαポリペプチド鎖であり、CDR配列が、
CDR1:配列番号24、26、28、30;
CDR2:配列番号40、42、44、46;および
CDR3:配列番号56、58、60、62
から選択される、請求項19に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCRポリペプチド鎖。 - 前記TCRα鎖が、WT1234−243ペプチドと特異的に結合するTCRβポリペプチドカウンター鎖とともに親TCRを構成し得る、請求項25に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCRポリペプチド鎖。
- 前記TCRβポリペプチドカウンター鎖が配列番号16を有するTAK1β鎖である、請求項25または26に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCRポリペプチド鎖。
- 前記TCRαポリペプチド鎖が配列番号8、10、12、および14から選択される配列を有する、請求項25〜27のいずれか一項に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCRポリペプチド鎖。
- 前記TCRポリペプチドがTCRβポリペプチド鎖であり、前記CDR3領域が配列番号52、54、81〜91、112、114および116〜122のいずれか1つを含んでなる、請求項18に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCRポリペプチド。
- 前記TCRポリペプチドがTCRαポリペプチド鎖であり、前記CDR3領域が配列番号56、58、60および62のいずれか1つを含んでなる、請求項18に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCRポリペプチド。
- 請求項18〜30のいずれか一項に記載の、TCRポリペプチド鎖をコードする単離されたおよび/または組換え操作された核酸。
- i)配列番号3、5、7、9、11、13、51、53、55、57、59、61、93、95、97、111、113および115のいずれか1つに示される配列;
ii)配列番号52、54、81〜91、112、114および116〜122から選択されるCDR3領域アミノ酸配列を含んでなるTCRβポリペプチド鎖をコードするもの;
iii)配列番号4、6、94、96または98から選択されるアミノ酸配列をコードするもの;
iv)配列番号56、58、60および62からなる群から選択されるCDR3領域アミノ酸配列を含んでなるTCRαポリペプチド鎖をコードするもの;または
v)配列番号8、10、12および14からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるTCRαポリペプチド鎖をコードするもの
を含んでなる、請求項31に記載の単離されたおよび/または組換え操作された核酸。 - TCRαポリペプチド鎖とTCRβポリペプチド鎖とを含んでなり、前記TCRβポリペプチド鎖は、配列番号52、54、81〜91、112、114および116〜122のいずれか1つの配列を含んでなるCDR3領域を含んでなり、ならびに/または前記TCRαポリペプチド鎖は、配列番号56、58、60および62のいずれか1つの配列を含んでなるCDR3領域を含んでなり、場合により、前記TCRは膜画分に含まれる、単離されたおよび/または組換え操作されたTCR。
- 前記TCRαポリペプチド鎖が、配列番号16を有するTAK1βポリペプチド鎖とともにTCRを構成する、請求項33に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCR。
- 前記TCRβポリペプチド鎖が、配列番号2を有するSIG35αポリペプチド鎖とともにTCRを構成する、請求項33または34に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCR。
- 前記TCRが1以上の哺乳動物TCRポリペプチド鎖、場合によりヒトTCRポリペプチド鎖および/またはハイブリッドTCRポリペプチド鎖、を含んでなる、請求項33〜35のいずれか一項に記載の単離されたおよび/または組換え操作されたTCR。
- 請求項18〜36のいずれか一項に記載の単離された核酸、TCRポリペプチド鎖またはTCRを含んでなる組換え細胞。
- プレイ核酸を含んでなり、および、目的ペプチドに特異的なTCRを発現し、前記TCRが対照TCRに比べて増大した親和性および/またはアビディティーを有し、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法により得られる、請求項37に記載の組換え細胞。
- 請求項18〜38のいずれか一項に記載の前記TCRポリペプチド鎖、該TCRポリペプチド鎖をコードする核酸、TCRポリペプチド鎖および/または組換え細胞を、場合により薬学上許容可能な担体と組み合わせて含んでなる組成物。
- 請求項38に記載の組換え細胞を含んでなる請求項39に記載の組成物。
- 必要とする対象に治療上有効な量の請求項38に記載の組換え細胞または請求項40に記載の組成物を投与する工程を含んでなる、障害を改善または治療するための方法。
- 前記細胞集団を投与工程の前にサイトカインおよび/または抗原ペプチドで活性化する工程をさらに含んでなる、請求項41に記載の方法。
- 障害を治療するための請求項18〜40のいずれか一項に記載の方法を用いて生産された核酸、TCRポリペプチド、TCR、組成物または組換え細胞。
- 障害を治療するための請求項9〜40のいずれか一項に記載の方法を用いて生産された核酸のペア、TCR、組成物および/または組換え細胞の使用。
- 前記障害が、白血病、固形腫瘍などの癌、肝炎、インフルエンザウイルスまたはHIVなどのウイルス、結核菌、MRSA、またはVREなどの細菌)、アスペルギルス属、カンジダ属、およびクリプトコッカス属などの真菌によって引き起こされる感染性疾患から選択される、請求項41〜44のいずれか一項に記載の方法、核酸、TCRポリペプチド、TCR、組成物または組換え細胞。
- 組換え細胞が同種異系反応性を軽減するように選択されている、請求項41〜44のいずれか一項に記載の方法、核酸、TCRポリペプチド、TCR組成物または組換え細胞または使用。
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