JP2017505621A - Ｔ細胞受容体を発現する細胞を生産する方法および組成物 - Google Patents

Abstract

目的ペプチドに特異的なＴＣＲを形成し得るＴＣＲポリペプチド鎖を決定するための方法が提供される。また、目的ペプチドに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞を生産するための方法および組成物、ＴＣＲ鎖核酸および／またはＴＣＲ鎖ポリペプチドのペアおよび／またはＴＣＲをコードする核酸を生産するための方法および組成物、前記方法により得られたＴＣＲをコードする核酸を含む細胞を含んでなる細胞集団、ならびに対象に前記細胞集団を投与することを含んでなる障害を治療するための方法も提供される。

Description

関連出願の参照

本ＰＣＴ出願は、２０１４年１月２９日に出願された米国仮出願第６１／９３３，０４８号の優先権に基づき、３５ ＵＳＣ １１９の利益を主張するものであり、当該仮出願は引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。

本開示は、目的ペプチドに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する組換え細胞を生産する方法および組成物、核酸またはＴＣＲ鎖ポリペプチドのペアを得る方法および組成物、ならびに／またはＴＣＲをコードする核酸、前記方法により得られたＴＣＲまたはＴＣＲ鎖をコードする１以上の核酸を含む(harboring)組換え細胞を含んでなる細胞集団、ならびに対象に前記細胞集団を投与することを含んでなる障害を治療する方法に関する。

緒論
腫瘍反応性ＴＣＲの遺伝子導入は、非反応性末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に高いアビディティーと腫瘍反応性の両方を付与することが示された(Johnson et al. 2006)。これらの著者らは、黒色腫患者腫瘍消化物から直接ＴＩＬクローンを作製すると、様々な細胞アビディティーを有する多様なＭＡＲＴ−１反応性Ｔ細胞が明らかになること、およびドナーのＰＢＭＣに抗原特異的様式で全体的な細胞アビディティーを付与するにはＴＣＲの移入で十分であることを報告した。さらに、非反応性ＴＩＬは、高いアビディティーのＭＡＲＴ−１ ＴＣＲでＲＮＡエレクトロポレーションを行うと、腫瘍反応性となり得る。最近の臨床試験は、抗腫瘍ＴＣＲが形質導入されたＴ細胞の養子免疫移入が癌患者に持続的な他覚的応答を誘導し得ることを示した(Kunert A et al., 2013, Hinrichs CS, et al., 2014)。

これまでに同定されているほとんどの腫瘍関連抗原は、自己抗原である。中枢および末梢Ｔ細胞の免疫寛容のために、末梢Ｔ細胞からクローニングされた大多数のＴＣＲは親和性が低く、腫瘍関連抗原として自己抗原を発現する腫瘍細胞を認識するのに十分でない。高親和性ＴＣＲを同定または作製するための方法としては、バクテリオファージディスプレー突然変異および選択技術(Li et al., 2005)およびＴＣＲ ＣＤＲにおけるアミノ酸置換(Robbins et al., 2008)が含まれる。これらの方法を用いて同定されたＴＣＲ変異体は、野生型受容体と最も結合の強いＴＣＲの受容体との間に１００万倍の範囲の親和性を有する場合がある。

本開示は、一面において、目的ペプチドに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する組換え細胞を生産するための方法に関し、その方法は、細胞集団に、前記目的ペプチドを認識するＴ細胞から発現され、従前に単離された、ＴＣＲを構成する２つのポリペプチド鎖のうちのいずれか一方をコードする核酸で形質導入する工程を含んでなり、前記細胞集団は、ＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなる。一実施態様では、前記方法は、形質導入された細胞集団を、目的ペプチドを提示する抗原提示細胞とともに培養する工程を含んでなる。別の実施態様では、前記方法は、形質導入された細胞集団から目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する細胞を選択する工程をさらに含んでなる。さらに別の実施態様では、前記細胞集団は、ＰＢＭＣまたはＣＤ３リガンドで活性化されたＰＢＭＣの集団である。別の実施態様では、前記細胞集団に形質導入される前記核酸は、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖をコードする。さらに別の実施態様では、前記細胞集団に形質導入される核酸は、主としてＴＣＲによるペプチド認識に寄与する(contribute)ＴＣＲ鎖をコードする。

一面は、目的ペプチドに特異的な高親和性ＴＣＲを作製するための方法であって、
ａ）ＴＣＲを発現し得る細胞、かつ／またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなる細胞集団に、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖をコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、前記ベイトＴＣＲポリペプチド鎖は、前記目的ペプチドと特異的に結合するカウンター鎖(counterchain)ＴＣＲポリペプチド鎖とともに親ＴＣＲ(parent TCR)を構成し得る；および
ｂ）前記ベイトＴＣＲの発現を許容する条件下で培養すること
を含んでなる方法を含む。

一実施態様では、前記方法は、工程（ａ）または（ｂ）で得られた形質導入された細胞集団から、前記目的ペプチドと選択的に結合する、ベイト(bait)ＴＣＲポリペプチド鎖とプレイ(prey)ＴＣＲポリペプチド鎖を含んでなるＴＣＲを発現する細胞を選択することをさらに含んでなる。

別の実施態様では、前記方法は、選択された細胞からプレイＴＣＲポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を単離することをさらに含んでなる。

別の面は、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを形成し得るＴＣＲポリペプチド鎖を得るための方法であって、
ａ）ＴＣＲを発現し得る細胞、および／またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞集団に、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖をコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、前記ベイトＴＣＲポリペプチド鎖は、前記目的ペプチドと特異的に結合するカウンター鎖ＴＣＲポリペプチド鎖とともに親ＴＣＲを構成し得る；ならびに
ｂ）場合により、工程（ａ）で得られた形質導入された細胞集団から、前記目的ペプチドと選択的に結合する、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖とプレイＴＣＲポリペプチド鎖を含んでなるＴＣＲを発現する細胞を選択すること；ならびに
ｃ）前記選択された細胞から、プレイＴＣＲポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を単離すること
を含んでなる方法を含む。

一実施態様では、前記ベイトＴＣＲポリペプチド鎖は、ベイトＴＣＲαおよび／またはベイトＴＣＲβポリペプチド鎖から選択される。

一実施態様では、工程（ａ）で得られた形質導入された細胞集団から、前記目的ペプチドと選択的に結合する、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖とプレイＴＣＲポリペプチド鎖を含んでなるＴＣＲを発現する細胞を選択する工程は、形質導入されたベイトポリペプチドを発現し、かつ、目的ペプチドと結合する細胞を単離することを含んでなる。

一実施態様では、プレイ核酸は、プレイ核酸をクローニングすることにより単離される。

ＴＣＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなる。一実施態様では、プレイＴＣＲポリペプチドＣＤＲ３領域は、対照ＴＣＲポリペプチドＣＤＲ３領域、場合により、親ＴＣＲの同族(cognate)ポリペプチド鎖（例えば、同じ鎖のタイプ）のＣＤＲ３領域におけるＣＤＲ３領域に比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾を含んでなる。

一実施態様では、前記方法は、目的ペプチドに対して増大したアビディティーおよび／または高い親和性を有するＴＣＲを形成するＴＣＲポリペプチド鎖を決定することを目的とし、前記方法は、ｉ）単離されたプレイ核酸およびベイト核酸を、ＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞に導入すること；ｉｉ）プレイＴＣＲポリペプチド鎖およびベイトＴＣＲポリペプチド鎖を含んでなるＴＣＲのアビディティーおよび／または親和性を測定すること；ならびにｉｉｉ）ベイトポリペプチド鎖およびプレイＴＣＲポリペプチド鎖が、対照ＴＣＲ、場合により親ＴＣＲ、に比べて、目的ペプチドに対して増大したアビディティーおよび／または親和性を有するＴＣＲを構成するプレイ核酸クローンを単離することをさらに含んでなる。

一実施態様では、ベイトポリペプチド、場合によりＴＣＲαおよび／またはベイトＴＣＲβポリペプチド鎖は、前記目的ペプチドを認識するＴ細胞で発現され、そのＴ細胞から従前に単離されたものである。

別の面ではまた、目的ペプチドに特異的なＴＣＲをコードする核酸ペアを作出するための方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞集団に、前記目的ペプチドを認識するＴ細胞から発現され、従前に単離された、ＴＣＲを構成する２つのポリペプチド鎖のうちのいずれか一方をコードする核酸を形質導入すること、ここで、前記細胞集団は、ＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなるものであり、
（ｂ）工程（ａ）で得られた形質導入された細胞集団から、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する組換え細胞を選択し、
（ｃ）工程（ｂ）で選択された細胞から、前記細胞集団に形質導入された核酸によりコードされるポリペプチドとともにＴＣＲを構成するポリペプチドをコードする核酸を単離し、かつ
（ｄ）工程（ａ）で前記細胞集団に形質導入された核酸と工程（ｃ）で単離された核酸をペアとすること
を含んでなる方法が提供される。

別の実施態様はまた、カウンター鎖ＴＣＲポリペプチドとともに目的ペプチドに特異的なＴＣＲを構成するＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸を作出するための方法であって、以下の工程：
ａ）ＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞(cells which cells can express a TCR or differentiate into cells expressing a TCR)を含んでなる細胞集団に、カウンター鎖ＴＣＲポリペプチド鎖とともに発現ＴＣＲを構成する、ＴＣＲポリペプチドであって、場合により、ＴＣＲαまたはＴＣＲβポリペプチド鎖から選択されるＴＣＲポリペプチドをコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、前記ベイトポリペプチドは、前記目的ペプチドを認識するＴ細胞から従前に単離されたものであり、
ｂ）工程（ａ）で得られた、形質導入された細胞集団から、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する組換え細胞を選択し、かつ
ｃ）工程（ｂ）で選択された細胞から、前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸によりコードされるポリペプチドとともにＴＣＲを構成するプレイポリペプチドをコードする核酸を単離すること
を含んでなる方法を提供する。

別の実施態様は、目的ペプチドに特異的な細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する組換え細胞を作出するための方法であって、細胞集団に、前記目的ペプチドを認識するＴ細胞から発現され、従前に単離された、ＴＣＲを構成するＴＣＲポリペプチド鎖のいずれか（例えば、ＴＣＲαまたはＴＣＲβまたはＴＣＲγまたはＴＣＲδのいずれか）をコードする核酸を形質導入する工程、ここで、前記細胞集団は、ＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなる、および前記形質導入された細胞集団を、ベイトＴＣＲポリペプチドの発現（例えば、およびＴＣＲの形成）を許容する条件下で培養する工程を含んでなる方法を含む。

一実施態様では、工程（ａ）は、形質導入された細胞集団を、目的ペプチドを提示する抗原提示細胞とともに培養する工程をさらに含んでなる。別の実施態様では、細胞集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＣＤ３リガンドで活性化されたＰＢＭＣの集団である。一実施態様では、工程（ａ）で前記細胞集団に形質導入される核酸は、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖をコードする。

一実施態様では、前記方法は、形質導入された細胞集団から、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する細胞を選択する工程をさらに含んでなる。

一実施態様では、前記細胞集団に形質導入される前記核酸は、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖をコードする。

一実施態様では、前記細胞集団に形質導入される前記核酸は、主としてＴＣＲによるペプチド認識に寄与するＴＣＲ鎖をコードする。

一実施態様では、前記形質導入は、２回、３回、４回、５回または６回繰り返される。

一実施態様では、プレイＴＣＲは例えば、Ｔ細胞から単離され得、例えば、内在的に発現されるＴＣＲ鎖である。

一実施態様では、プレイＴＣＲポリペプチドをコードする単離されたプレイ核酸が、ＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなる細胞の集団に形質導入され、場合により、ここで、単離されたプレイ核酸は、プレイＴＣＲポリペプチド鎖とともにＴＣＲを構成するＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸、場合によりベイトＴＣＲ核酸、と組み合わせて形質導入されて、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する細胞を含んでなる形質導入された細胞集団が作出される。

一実施態様では、細胞集団は、内在性ＴＣＲ鎖の発現を抑制するアンチセンス分子を形質導入される。

一実施態様では、形質導入される核酸、場合によりベイト核酸は、コドンの最適化が行われる。

また、本明細書に記載のおよび／またはＴＣＲ本明細書に記載のように得られるプレイ核酸を含んでなる目的ペプチドに特異的な高親和性ＴＣＲを含んでなる組換え細胞も提供される。

また、別の面で、本明細書に記載のまたは本明細書に記載の方法により得られるＴＣＲプレイポリペプチドまたは核酸を含んでなる目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する細胞を含んでなる細胞集団；場合により本明細書に記載のおよび／または本明細書に記載の方法により得られる核酸ペアを含んでなる目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する細胞を含んでなる細胞集団、も提供される。

さらなる面は、障害を治療するための方法であって、対象に治療上有効な量の本明細書に記載のように得られる細胞集団または組換え体を投与する工程を含んでなる方法を含む。

一実施態様では、前記方法は、投与工程前に、細胞集団をサイトカインおよび／または抗原ペプチドで活性化する工程をさらに含んでなる。

別の面は、配列番号４、６、９４、９６または９８で表されるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖をコードする核酸である。

さらに別の面は、配列番号８、１０、１２および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖をコードする核酸である。

また、一実施態様では、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜８６、８８〜９１、９４、９６、９８、１１２、１１４、１１６〜１２２から選択される配列および／もしくは配列番号４、６、８、１０、１２、１４、５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜８６、８８〜９１、９４、９６、９８、１１２、１１４、１１６〜１２２から選択される配列とから選択される配列と(to a sequence selected from to a sequence selected from)少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列またはＣＤＲ領域もしくは非ＣＤＲ領域などのその一部を含んでなる、単離されたおよび／または組換え操作されたポリペプチドも提供される。一実施態様では、前記ポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜８６、８８〜９１、９４、９６、９８、１１２、１１４、１１６〜１２２のいずれか１つの配列を含んでなる。

一実施態様では、前記単離されたおよび／または組換え操作されたポリペプチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、５１、５３、５５、５７、５９、６１、９３、９５、９７、１１１、１１３、１１５および／または配列番号３、５、７、９、１１、１３、５１、５３、５５、５７、５９、６１、９３、９５、９７、１１１、１１３、１１５から選択される配列とから選択される配列と(to a sequence selected from to a sequence selected from)少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有し、ならびに、例えば、４、６、８、１０、１２、１４、５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜９１、１１２、１１４および１１６〜１２２から選択されるポリペプチドまたはＣＤＲ領域もしくは非ＣＤＲ領域などのその一部をコードする核酸配列のいずれか１つによりコードされる。

一実施態様では、前記単離されたおよび／または組換え操作された核酸は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、５１、５３、５５、５７、５９、６１、９３、９５、９７、１１１、１１３および１１５のいずれか１つに示される配列を含んでなる。

また、一実施態様では、配列番号５２、５４、５６、５８、６０ ６２、８１〜９１、１１２、１１４および１１６〜１２２から選択されるＣＤＲ３領域アミノ酸配列を含んでなるＴＣＲ鎖をコードする単離されたおよび／または組換え操作された核酸も提供される。

一実施態様では、本明細書に記載の単離されたおよび／または組換え操作された核酸は、ＴＣＲβ鎖が配列番号４、６、９４、９６または９８で表されるアミノ酸配列を含んでなる。

また、一実施態様では、ＣＤＲ３領域が配列番号５２、５４、８１〜９１、１１２、１１４、および１１６〜１２２のいずれか１つを含んでなる単離された、かつ／または組換え操作されたＴＣＲβ鎖も提供される。

別の実施態様は、ＣＤＲ３領域が配列番号５６、５８、６０および６２のいずれか１つを含んでなる単離されたＴＣＲα鎖を含む。

別の面は、配列番号５６、５８、６０および６２からなる群から選択されるＣＤＲ３領域アミノ酸配列を含んでなるＴＣＲα鎖をコードする単離されたおよび／または組換え操作された核酸を含む。

一実施態様では、単離されたおよび／または組換え操作された核酸は、配列番号８、１０、１２および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＴＣＲα鎖をコードする。

別の実施態様は、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖が配列番号５２、５４、８１〜９１、１１２、１１４および１１６〜１２２のいずれか１つの配列を含んでなるＣＤＲ３領域を含んでなり、および／または前記ＴＣＲα鎖が配列番号５６、５８、６０および６２のいずれか１つの配列を含んでなるＣＤＲ３領域を含んでなる、単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲを含む。

別の実施態様は、本明細書に記載の単離された核酸および／もしくはポリペプチド、本明細書に記載のＴＣＲβ鎖、本明細書に記載のＴＣＲα鎖、ならびに／または本明細書に記載のＴＣＲを含んでなる単離されたおよび／または組換え操作された細胞を含む。

別の面は、本明細書に記載のプレイ核酸またはプレイポリペプチドを含んでなり、および／または障害を治療するために本明細書に記載の方法を用いて作出された核酸、ポリペプチド組成物、場合により医薬組成物、組換え細胞または細胞集団を含む。

さらなる面は、障害を治療するための、本明細書に記載の方法を用いて作出する核酸、組成物および／または細胞集団の使用を含む。

図１は、ＳｕｐＴ１ ＴＣＲβ、ＳＩＧ３５αとペアとした場合にはＡ２／ＭＡＲＴ１を認識するがＤＭＦ５αとペアとした場合には認識しないことを示すフローサイトメトリー分析である。ＴＣＲα欠損ヒトＴ細胞株であるＳｕｐＴ１細胞に、ＳＩＧ３５α、ＤＭＦ５α、およびＤＭＦ５αβを形質導入した。トランスフェクト体はＡ２／ＭＡＲＴ１またはＡ２／Ｆｌｕ多量体およびα−ヒトＣＤ３ ｍＡｂで染色された。 図２は、胸腺選択はＳＩＧ３５αを有するＡ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲを構成し得るＴＣＲβレパートリーに影響を及ぼすとは思われないことを示すフローサイトメトリー分析およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。Ａ）２名のＨＬＡ−Ａ２＋ドナーおよび２名のＡ２−ドナーから新たに単離した末梢Ｔ細胞を、１００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２の存在下、５０ｎｇ／ｍＬ α−ヒトＣＤ３ ｍＡｂ（ＯＫＴ３）で刺激し、レトロウイルスにより、末端切断型ＮＧＦＲ（ΔＮＧＦＲ）遺伝子（Ｍｏｃｋ）、ＳＩＧ３５α／ΔＮＧＦＲ遺伝子を形質導入した。ＳＩＧ３５α遺伝子とΔＮＧＦＲ遺伝子の間にはフューリン、ｓｇｓｇおよび***ウイルスのＦ２Ａ配列が挿入されていた。形質導入６時間後、２．０×１０５のトランスフェクト体を、α−ヒトＣＤ８ ｍＡｂおよびα−ヒトＮＧＦＲ ｍＡｂとコンジュゲートした８μｇ／ｍＬ Ａ２／ＭＡＲＴ１多量体またはＡ２／ＨＩＶ多量体で染色した。ΔＮＧＦＲ陽性細胞にゲートをかけ、多量体／ＣＤ８陽性を分析した；Ｂ）ＳＩＧ３５αで形質導入されたＡ２＋末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ａ２／ＭＡＲＴ１を認識する。ＨＬＡ−Ａ２＋末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞に、ＳＩＧ３５αまたはＭｏｃｋを形質導入した。ａＡＰＣ刺激前に、Ａ２／ＭＡＲＴ１の特異性をＡ２／ＭＡＲＴ１およびＡ２／ＨＩＶ多量体を用いた多量体染色により分析した。Ａ２／ＨＩＶ多量体を陰性対照として用いた。ＳＩＧ３５αで形質導入されたＡ２−末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ａ２／ＭＡＲＴ１を認識する。ＨＬＡ−Ａ２−末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞に、ＳＩＧ３５αまたはＭｏｃｋを形質導入した。ａＡＰＣ刺激前に、Ａ２／ＭＡＲＴ１の特異性をＡ２／ＭＡＲＴ１およびＡ２／ＨＩＶ多量体を用いた多量体染色により分析した。Ａ２／ＨＩＶ多量体を陰性対照として用いた；Ｃ）ＳＩＧ３５αで形質導入された末梢Ｔ細胞はＡ２／ＭＡＲＴ１認識に高いアビディティーを示す。Ａ２＋またはＡ２−ドナー由来のＳＩＧ３５αまたはＭｏｃｋで形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞に対してＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。ＳＩＧ３５αまたはＭｏｃｋで形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍＬ ＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドでパルス処理したｗｔＡ２−ａＡＰＣでの初回刺激の後に、応答細胞として用いた。１０μｇ／ｍＬ ＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドまたはＨＩＶ ｐｏｌ４７６−４８４ペプチドでパルス処理したＴ２細胞を、刺激細胞として用いた（左）。ＨＩＶ ｐｏｌ４７６−４８４ペプチドを陰性対照ペプチドとして用いた。Ａ２＋／ＭＡＲＴ１＋黒色腫系統としてのＭａｌｍｅ−３ＭおよびＡ２＋／ＭＡＲＴ１−黒色腫系統としてのＡ３７５を刺激細胞として用いた（右）。試験は総て３反復で行い、エラーバーはＳＤを示す；Ｄ）ＳＩＧ３５αで形質導入されたＡ２／ＭＡＲＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ｗｔＡ２−ａＡＰＣに基づく刺激時に拡大増殖する。Ａ２＋またはＡ２−ドナーのＳＩＧ３５αで形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍＬ ＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドでパルス処理したｗｔＡ２−ａＡＰＣで１週間に１回刺激した。刺激と刺激の間に、Ｔ細胞に３日毎にＩＬ−２（１０ＩＵ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）を補充した。１回目と２回目の刺激の後に行ったＡ２／ＭＡＲＴ１多量体染色を示す；Ｅ）ＳＩＧ３５αで形質導入されたＡ２／ＭＡＲＴ１ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ｍｕｔＡ２−ａＡＰＣに基づく刺激時に拡大増殖する。Ａ２＋またはＡ２−ドナーのＳＩＧ３５αで形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍＬ ＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドでパルス処理したＩＬ−２１分泌ｍｕｔＡ２−ａＡＰＣで１週間に１回刺激した。刺激と刺激の間に、Ｔ細胞に３日後にＩＬ−２（１０ＩＵ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）を補充した。２回目と３回目の刺激の後に行ったＡ２／ＭＡＲＴ１多量体染色を示す。 図３は、Ａ２／ＭＡＲＴ１を認識するためにはＳＩＧ３５αが主としてＴＣＲ Ｖβ１４とペアとなることを示す棒グラフおよびフローサイトメトリー分析である。Ａ）Ａ２＋またはＡ２−ドナーのａＡＰＣ刺激前の、ＳＩＧ３５αで形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ａ２／ＭＡＲＴ１多量体、ＴＣＲ Ｖβサブタイプに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびα−ヒトＣＤ８ ｍＡｂで共染色した。Ａ２＋ドナーおよびＡ２−ドナーの両方でＡ２／ＭＡＲＴ１を認識するためには、ＳＩＧ３５αは主としてＴＣＲ Ｖβ１４とペアとなる。各サブタイプを発現するＡ２／ＭＡＲＴ１多量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。Ｂ）「多くの」ＴＣＲ Ｖβ１４クロノタイプが、ＳＩＧ３５αとペアとした場合にＡ２／ＭＡＲＴ１を認識することができる。ＳＩＧ３５αで形質導入されたＣＤ８＋Ｖβ１４＋Ｔ細胞中のＡ２／ＭＡＲＴ１多量体＋細胞のパーセンテージを示す。使用する命名法はWei et al., 1994からのものである。 図４は、ＳＩＧ３５αとコンジュゲートしてＡ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲを構成し得るＴＣＲβ可変遺伝子２７（ＴＲＢＶ２７）クロノタイプを同定する棒グラフは極めてヘテロかつユニークである。Ａ２＋またはＡ２−ドナーのＳＩＧ３５αで形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞を１０μｇ／ｍＬ ＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドでパルス処理したｗｔＡ２−ａＡＰＣで刺激した。Ａ２／ＭＡＲＴ１多量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーセルソーティングにより選別した。選別したＴ細胞から単離したＴＣＲ ＴＲＢＶ２７鎖を配列決定した。単離されたＴＣＲ ＴＲＢＶ２７鎖のＪβ遺伝子セグメントおよびＣＤＲ３長を示す。 図５は、ＳＩＧ３５αからなるＡ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲの構造的アビディティー範囲がＣＤ８の有無において極めて幅広いものであり得ることを示すサイトメトリー分析である。Ａ）ＣＤ８αβおよび固有のＴＣＲの発現を欠くＪｕｒｋａｔ７６細胞に、レトロウイルスによりＣＤ８αβを形質導入した。Ｊｕｒｋａｔ７６細胞またはＪｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８αβ細胞に個々のＴＣＲβ鎖（クローン：４１３、５２３、７８８、１０８６、８３０、または７９４）およびＴＣＲα ＳＩＧ３５α鎖またはＤＭＦ５ ＴＣＲを安定的に形質導入した。総てのトランスフェクト体がＣＤ３に関して＞９５％陽性であった。Ａ２／ＨＩＶ多量体を陰性対照として用いた。Ｊｕｒｋａｔ７６上に再構成されたＡ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲは、様々な構造的アビディティーを有する。Ｊｕｒｋａｔ７６トランスフェクト体は、２μｇ／ｍＬ Ａ２／ＭＡＲＴ１多量体またはＡ２／ＨＩＶ多量体およびα−ヒトＣＤ３ ｍＡｂで染色された。Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８αβ上で再構成されたＡ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲも、様々な構造的アビディティーを有する。Ｊｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８αβトランスフェクト体は、２μｇ／ｍＬ Ａ２／ＭＡＲＴ１多量体またはＡ２／ＨＩＶ多量体およびα−ヒトＣＤ８で染色された。Ｃ）再構成されたＡ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲは広範な構造的アビディティーを示す。Ｊｕｒｋａｔ７６トランスフェクト体（左）およびＪｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８αβトランスフェクト体（右）の構造アビディティーを、漸増濃度のＡ２／ＭＡＲＴ１多量体での多量体染色により評価した。 図６は、ＳＩＧ３５αからなるＡ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲの機能的アビディティーウィンドウがＣＤ８の有無において極めて幅広いものであり得ることを示すＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。Ａ）Ｊｕｒｋａｔ７６細胞またはＢ）Ｊｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８αβ細胞に、個々のＴＣＲβ鎖（クローン：４１３、５２３、７８８、１０８６、８３０、または７９４）およびＳＩＧ３５α鎖またはＤＭＦ５ ＴＣＲを安定的に形質導入した。総てのトランスフェクト体がＣＤ３に関して＞９５％陽性であった。トランスフェクト体に対してＩＬ−２ ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。１０μｇ／ｍＬ ＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドまたはＨＩＶ ｐｏｌ４７６−４８４ ペプチドでパルス処理したＴ２細胞を刺激細胞として用いた（左）。ＨＩＶ ｐｏｌ４７６−４８４ペプチドを陰性対照ペプチドとして用いた。Ａ２＋／ＭＡＲＴ１＋黒色腫系統としてのＭａｌｍｅ−３ＭおよびＡ２＋／ＭＡＲＴ１−黒色腫系統としてのＡ３７５を刺激細胞として用いた（右）。（Ａ）Ｊｕｒｋａｔ７６上で再構成されたＡ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲは、Ａ２／ＭＡＲＴ１認識に関して高いアビディティーを示す。Ｊｕｒｋａｔ７６トランスフェクト体において、ペプチドでパルス処理したＴ２細胞（左）および腫瘍細胞株標的（右）を用いてＩＬ−２ ＥＬＩＳＰＯＴを行った。実験は総て３反復で行い、エラーバーはＳＤを示す；（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８αβ上で再構成されたＡ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲは、Ａ２／ＭＡＲＴ１認識に関して高いアビディティーを示す。Ｊｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８αβトランスフェクト体において、ペプチドでパルス処理したＴ２細胞（左）および腫瘍細胞株標的（右）を用いてＩＬ−２ ＥＬＩＳＰＯＴを行った。実験は総て３反復で行い、エラーバーはＳＤを示す；（Ｃ）再構成されたＡ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲは様々な機能的アビディティーを示す。Ｊｕｒｋａｔ７６トランスフェクト体（左）およびＪｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８αβトランスフェクト体（右）の機能的アビディティーは、漸増濃度のＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドでパルス処理したＴ２細胞を刺激細胞として用い、ＩＬ−２分泌により評価した。 図７は、Ａ２４／ＷＴ１のＴＡＫ１β中心認識を示すフローサイトメトリー分析である。５名のＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２（Ａ２４）＋ドナーおよび２名のＡ２４−ドナーから新たに単離した末梢Ｔ細胞を１００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２の存在下、５０ｎｇ／ｍＬ α−ヒトＣＤ３ ｍＡｂ（ＯＫＴ３）で刺激し、レトロウイルスにより、末端切断型ＮＧＦＲ（ΔＮＧＦＲ）遺伝子（Ｍｏｃｋ）、ＴＡＫ１α／ΔＮＧＦＲまたはＴＡＫ１β／ΔＮＧＦＲ遺伝子を形質導入した。ＴＡＫ１αまたはＴＡＫ１β遺伝子とΔＮＧＦＲ遺伝子の間にはフューリン、ｓｇｓｇおよび***ウイルス由来のＦ２Ａ配列が挿入されていた。６回の形質導入後に、２．０×１０^５のトランスフェクト体を、α−ヒトＣＤ８ ｍＡｂおよびα−ヒトＮＧＦＲ ｍＡｂとコンジュゲートした５０μｇ／ｍＬ Ａ２４／ＷＴ１ヘテロクリティックなペプチド四量体またはＡ２４／サバイビン四量体で染色した。ΔＮＧＦＲ陽性細胞にゲートをかけ、四量体／ＣＤ８陽性を分析した。７名のドナーのうち１名のＡ２４＋ドナーおよび１名のＡ２４−ドナーから得られた、Ｍｏｃｋ（上）、ＴＡＫ１α（中）およびＴＡＫ１β（下）で形質導入されたＴ細胞の代表的な四量体染色データを示す。 図８は、ＴＡＫ１βで形質導入され、Ａ２４−ａＡＰＣで刺激されたＴ細胞は、再現性をもって、拡大増殖し、Ａ２４／ＷＴ１を認識することを示すＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。Ｍｏｃｋ、ＴＡＫ１αおよびＴＡＫ１βで形質導入されたＴ細胞に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、１μｇ／ｍＬ ＷＴ１_{２３５−２４３}ヘテロクリティックペプチドを負荷したＡ２４−ａＡＰＣ細胞で刺激した。各遺伝子改変Ｔ細胞における形質導入効率はおよそ７０％であった。２回の刺激の後、７名のドナーのうち７名由来のＴＡＫ１βで形質導入されたＴ細胞が拡大増殖した。２．０×１０４遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞を１μｇ／ｍＬ ＨＩＶ−１ ｅｎｖ５８４−５９２ペプチドを負荷したＨＬＡヌル−ａＡＰＣ、Ａ２４−ａＡＰＣ、Ａ２４−ａＡＰＣ、１μｇ／ｍＬ ＷＴ１_{２３５−２４３}ヘテロクリティックペプチドを負荷したＡ２４−ａＡＰＣと共培養した場合、またはａＡＰＣ細胞不在で培養した場合でＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴを行った（各バーで示す）。７名の全ドナー由来の、ＴＡＫ１βで形質導入されたＴ細胞は、ＷＴ１ペプチドでパルス処理したＡ２４−ａＡＰＣに対して強いＩＦＮ−γ産生を示した。７名のドナーのうち２名のＡ２４＋ドナーおよび１名のＡ２４−ドナーからの代表的な結果を示す。実験は総て３反復で行い、エラーバーはＳＤを示す。 図９は、ＴＡＫ１βで形質導入されたＴ細胞のＡ２４−ａＡＰＣ刺激は、高いアビディティーを有するＡ２４／ＷＴ１ Ｔ細胞を負荷し得ることを示すフローサイトメトリー分析およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。７名のドナーのうち２名からの代表的な結果を示す。ＴＡＫ１βで形質導入されたＴ細胞は、α−ヒトＣＤ８ ｍＡｂおよびα−ヒトＮＧＦＲ ｍＡｂとコンジュゲートした５０μｇ／ｍＬ Ａ２４／ＷＴ１ヘテロクリティックペプチド四量体またはＡ２４／サバイビン四量体で染色した。ΔＮＧＦＲ＋ 細胞にゲートをかけ、四量体／ＣＤ８陽性を分析した。ＷＴ１_{２３５−２４３}ヘテロクリティックペプチドを負荷したＡ２４−ａＡＰＣ細胞で２回の刺激を行った後の、１名のＡ２４＋ドナー（左上）および１名のＡ２４−（左下）ドナー由来のＴＡＫ１βで形質導入されたＴ細胞の四量体染色データを示す。２．０×１０^４のＣＤ８＋遺伝子改変Ｔ細胞を用いた２回の刺激後のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴは、標的細胞として示されたａＡＰＣ細胞の存在下または不在下で行った。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは３反復で行った。１名のＡ２４＋ドナー（右上）および１名のＡ２４−（右下）ドナー由来のこれらのＴＡＫ１βで形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、２回の刺激の後、両方とも、本来のプロセシングを行い、細胞表面にＡ２４／ＷＴ１を提示したＡ２４−ａＡＰＣ細胞に対してＩＦＮ−γを産生した。１μｇ／ｍＬ ＨＩＶ−１ ｅｎｖ５８４−５９２ペプチドまたは１μｇ／ｍＬ ＷＴ１２３５−２４３ヘテロクリティックペプチドを負荷したＡ２４−ａＡＰＣ細胞を、ＷＴ１２３５−２４３ペプチド特異性の陰性対照および陽性対照として用いた。実験は総て３反復で行い、エラーバーはＳＤを示す。 図１０は、ＴＡＫ１βとペアとした場合にＡ２４／ＷＴ１を認識し得るＴＣＲαクロノタイプのレパートリーを示す棒グラフである。ＴＣＲαクロノタイプの可変領域およびＪ領域はＩＭＧＴ命名法により表した。この結果は３名のＨＬＡ−Ａ２４＋ドナーと１名のＨＬＡ−Ａ２４−ドナーを統合したものであり、４１の異なるＴＣＲαクロノタイプが示される。各ＴＲＡＶのＪ領域（Ａ）およびＣＤＲ３αアミノ酸配列長（Ｂ）を重畳した棒グラフでまとめる。 図１１は、新規なＴＣＲα／ＴＡＫ１β ＴＣＲが、内在的にプロセシングされ、異なるアビディティーでＡ２４により提示されたＷＴ１由来ペプチドを認識することを示すＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。ＣＤ８αβおよび固有のＴＣＲの発現を欠くＪｕｒｋａｔ７６細胞に、レトロウイルスにより、ＣＤ８αβおよびＴＡＫ１β遺伝子で形質導入した。これらの遺伝子の形質導入後に、Ｊｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８αβ／ＴＡＫ１βトランスフェクト体に、ＴＣＲα遺伝子（クローン：Ｔ５３、Ａ２６２、Ｔ２４３、Ｔ２６２）または親ＴＡＫ１α遺伝子でさらなる形質導入を行った。総てのトランスフェクト体がＣＤ３に関して＞９５％陽性であった。４．０×１０４のＪｕｒｋａ７６／ＣＤ８αβ／ＴＡＫ１β／ＴＣＲα細胞をａＡＰＣ細胞の存在下または不在下でインキュベートすることによりＩＬ−２ ＥＬＩＳＰＯＴを行った。Ｊｕｒｋａｔ７６トランスフェクト体（クローン：Ｔ５３、Ａ２６２、Ｔ２４３、Ｔ２６２）は、本来のプロセシングを行い、細胞表面にＡ２４／ＷＴ１を提示したＡ２４−ａＡＰＣ細胞に対してＩＬ−２を産生した（左）。１μｇ／ｍＬ ＨＩＶ−１ ｅｎｖ５８４−５９２ペプチドまたはＷＴ１_{２３５−２４３}ヘテロクリティックペプチドを負荷したＡ２４−ａＡＰＣ細胞をＷＴ１_{２３５−２４３}ペプチド特異性に関する陰性対照および陽性対照として用いた（右）。実験は総て３反復で行い、エラーバーはＳＤを示す。 図１２は、クローンＳＩＧ３５α ＴＣＲα鎖のヌクレオチド（上、配列番号１）およびアミノ酸（下、配列番号２）の配列を示す。クローニングされたＳＩＧ３５α α鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１７、３３、４９、１８、３４および５０で表す。 図１３は、クローン７９４ ＴＣＲβ鎖のヌクレオチド（上、配列番号３）およびアミノ酸（下、配列番号４）の配列を示す。ヌクレオチドおよびアミノ酸のＣＤＲ領域を下線で示す。クローニングされた７９４ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１９、３５、５１、２０、３６および５２で表す。 図１４は、クローン８３０ ＴＣＲβ鎖のヌクレオチド（上、配列番号５）およびアミノ酸（下、配列番号６）の配列を示す。ヌクレオチドおよびアミノ酸のＣＤＲ領域を下線で示す。クローニングされた８３０ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２１、３７、５３、２２、３８および５４で表す。 図１５は、クローンＴ５３ ＴＣＲα鎖のヌクレオチド（上、配列番号７）およびアミノ酸（下、配列番号８）の配列を示す。ヌクレオチドおよびアミノ酸のＣＤＲ領域を下線で示す。クローニングされたＴ５３ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２３、３９、５５、２４、４０および５６で表す。 図１６は、クローンＡ２６２ ＴＣＲα鎖のヌクレオチド（上、配列番号９）およびアミノ酸（下、配列番号１０）の配列を示す。ヌクレオチドおよびアミノ酸のＣＤＲ領域を下線で示す。クローニングされたＡ２６２ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２５、４１、５７、２６、４２および５８で表す。 図１７は、クローンＴ２４３ ＴＣＲα鎖のヌクレオチド（上、配列番号１１）およびアミノ酸（下、配列番号１２）の配列を示す。ヌクレオチドおよびアミノ酸のＣＤＲ領域を下線で示す。クローニングされたＴ２４３ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２７、４３、５９、２８、４４および６０で表す。 図１８は、クローンＴ２６２ ＴＣＲα鎖のヌクレオチド（上、配列番号１３）およびアミノ酸（下、配列番号１４）の配列を示す(Fig. 18 shows the sequences of nucleotide (top, SEQ ID NO: 13) and amino acid (bottom, SEQ ID NO: 14) of clone T262 TCR alpha chain are shown.)。ヌクレオチドおよびアミノ酸のＣＤＲ領域を下線で示す。クローニングされたＴ２６２ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２９、４５、６１、３０、４６および６２で表す。 図１９は、クローンＴＡＫ１ ＴＣＲβ鎖のヌクレオチド（上、配列番号１５）およびアミノ酸（下、配列番号１６）の配列を示す。クローニングされたＴＡＫ１ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３１、４７、６３、３２、４８および６４で表す。 図２０は、ＴＣＲ一本鎖形質導入により生じたｄｅ ｎｏｖｏ ＴＣＲが胸腺により選択されないことを示す。 図２１は、ベイトＴＣＲ構築物の模式図である。 図２２は、抗腫瘍ＴＣＲ遺伝子療法を表すチャートである。 図２３は、ＨＬＡ−Ａ２^＋およびＡ２⁻の両末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞が鎖中心ＳＩＧ３５αで形質導入された際にＡ２／ＭＡＲＴ１を認識し得ることを示すフローサイトメトリー分析である。ＨＬＡ−Ａ２^＋およびＡ２⁻の両末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、鎖中心ＳＩＧ３５αの形質導入時にＡ２／ＭＡＲＴ１反応性となった。１名のＨＬＡ−Ａ２^＋ドナー＃７および１名のＡ２⁻ドナー＃３から新たに単離した末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞に、レトロウイルスにより、ＳＩＧ３５αまたはＭｏｃｋを形質導入した。トランスフェクト体を、１０μｇ／ｍｌ ＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドでパルス刺激したＩＬ−２１分泌ｍｕｔＡ２−ａＡＰＣで１週間に１回刺激した。刺激と刺激の間に、３日毎にＩＬ−２（１０ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えた。２回目の刺激の後に行ったＡ２／ＭＡＲＴ１またはＡ２／ＨＩＶ多量体染色を示す。 図２４は、Ａ２／ＭＡＲＴ１を認識するためには、ＳＩＧ３５αをＣＤ４^＋Ｔ細胞の主としてＴＲＢＶ５−１、２７および２とともに選択することを示す棒グラフである。ＳＩＧ３５αで形質導入されたＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、Ａ２^＋ドナーまたはＡ２⁻ドナーのｍｕｔＡ２−ａＡＰＣでの２回目の刺激の後に、Ａ２／ＭＡＲＴ１多量体、ＴＣＲ Ｖβサブタイプに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびα−ヒトＣＤ４ ｍＡｂまたはα−ヒトＣＤ８ ｍＡｂで共染色した。各サブタイプを発現するＡ２／ＭＡＲＴ１多量体^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＡ２／ＭＡＲＴ１多量体^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。 図２５は、ＳＩＧ３５αとコンジュゲートしたＡ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲを構成し得るＴＲＢＶ２、５−１および２７クロノタイプが極めてヘテロかつユニークであることを示す棒グラフである。Ａ２^＋ドナーまたはＡ２⁻ドナーの、ＳＩＧ３５αで形質導入されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍｌ ＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドでパルス処理したｍｕｔＡ２−ａＡＰＣで刺激した。Ａ２／ＭＡＲＴ１多量体^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーセルソーティングにより回収した。Ａ２／ＭＡＲＴ１多量体^＋Ｔ細胞から単離されたＴＲＢＶ２、５−１および２７ ＴＣＲβ鎖を配列決定した。単離された各ＴＲＢＶ鎖のＪβ遺伝子セグメントおよびＣＤＲ３長を示す。 図２６は、再構成されたＣＤ４^＋Ａ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲがＣＤ８に非依存的にＡ２／ＭＡＲＴ１を認識することを示すフローサイトメトリー分析である。ＣＤ８αβおよび内在性ＴＣＲの発現を欠くＪｕｒｋａｔ ７６細胞に、レトロウイルスにより、ＣＤ８αβを形質導入し、Ｊｕｒｋａｔ ７６／ＣＤ８αβを作出した。Ｊｕｒｋａｔ ７６またはＪｕｒｋａｔ ７６／ＣＤ８αβ細胞にそれぞれ、ＳＩＧ３５α鎖とともに、ＣＤ４^＋ Ａ２／ＭＡＲＴ１ Ｔ細胞から単離されたＴＲＢＶ２、５−１、または２７ ＴＣＲβ鎖（クローン：６Ｂ、６Ｘ、１１Ｃ、９Ｉ、９Ｊ、４Ｋ、７Ｅ、７Ｑ、または８Ｈ）を形質導入した。Ｊｕｒｋａｔ ７６またはＪｕｒｋａｔ ７６／ＣＤ８αβトランスフェクト体は総て、抗ＣＤ３ ｍＡｂまたは抗ＣＤ８ ｍＡｂとともに２μｇ／ｍｌ Ａ２／ＭＡＲＴ１またはＡ２／ＨＩＶ多量体で染色された。Ｊｕｒｋａｔ ７６トランスフェクト（上）またはＪｕｒｋａｔ ７６／ＣＤ８αβトランスフェクト体（下）の多量体染色に関するデータを示す。 図２７は、再構成されたＣＤ４^＋ Ａ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲが広範囲の機能的および構造的アビディティーを有することを示す一連のチャートである。ＳＩＧ３５αおよびＤＭＦ５とのペアとして９種類の異なるＡ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲβ鎖を発現するＪｕｒｋａｔ ７６細胞またはＪｕｒｋａｔ ７６／ＣＤ８αβ細胞の機能的アビディティーを、漸増濃度のＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドでパルス処理したＴ２細胞を刺激細胞として用いてＩＬ−２ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより決定した％ＩＬ−２分泌能として表す（左）。同じトランスフェクト体の構造的アビディティーを、漸増濃度のＡ２／ＭＡＲＴ１多量体での染色により決定した多量体染色パーセンテージとして示す（右）。 図２８は、クローン８Ｈ ＴＣＲβ鎖のヌクレオチド（上、配列番号９３）およびアミノ酸（下、配列番号９４）の配列を示す。ヌクレオチドおよびアミノ酸のＣＤＲ領域を下線で示す。クローニングされた８Ｈ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９９、１０５、１１１、１００、１０６および１１４で表す。 図２９は、クローン７Ｑ ＴＣＲβ鎖のヌクレオチド（上、配列番号９５）およびアミノ酸（下、配列番号９６）の配列を示す。ヌクレオチドおよびアミノ酸のＣＤＲ領域を下線で示す。クローニングされた７Ｑ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１０１、１０７、１１３、１０２、１０８および１１４で表す。 図３０は、クローン９Ｊ ＴＣＲβ鎖のヌクレオチド（上、配列番号９７）およびアミノ酸（下、配列番号９８）の配列を示す。ヌクレオチドおよびアミノ酸のＣＤＲ領域を下線で示す。クローニングされた９Ｊ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１０３、１０９、１１５、１０４、１１０および１１６で表す。

発明の具体的説明

本開示の範囲を理解する上で、用語「を含んでなる」およびその派生語は、本明細書で使用する場合、示された特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を明示するが、示されていない他の特徴、要素、成分、群、整数および／または工程の存在を排除しないというオープンエンドの用語であるものとする。前記のことはまた「含む」、「有する」という用語およびそれらの派生語などの類似の意味を有する用語にも当てはまる。最後に、「実質的に」、「約」および「およそ」などの程度の用語は本明細書で使用する場合、修飾された用語の、最終結果が有意な変化を受けないような合理的な偏差の量を意味する。これら程度の用語は、この偏差が、それが修飾する用語の意味を否定しない限り、修飾された用語の少なくとも±５％の偏差を含むと解釈されるべきである。本開示の範囲を理解する上で、用語「からなる」およびその派生語は、本明細書で使用する場合、示された特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を明示し、かつ／または示されていない他の特徴、要素、成分、群、整数および／または工程の存在を排除するというクローズエンドの用語であるものとする。本明細書において終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される総ての数値および分数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５を含む）。また、総ての数値およびその分数は「約」という用語によって修飾されると考えられることも理解されるべきである。さらに、「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、内容がそうではないことを明示しない限り、複数の指示語を含むと理解されるべきである。用語「約」は、参照される数値のプラスまたはマイナス０．１〜５０％、５〜５０％、または１０〜４０％、好ましくは１０〜２０％、より好ましくは１０％または１５％を意味する。さらに、特定の節に記載される定義および実施態様は、当業者により理解されるような好適である、本明細書に記載の他の実施態様にも当てはまるものとする。例えば、下段で、本発明の種々の面が詳細に定義される。このようにして定義される各面は、そうではないことが明示されない限り、他のいずれの１または複数の面と組み合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利であるとして示されているいずれの特徴も、好ましいまたは有利であるとして示されている他のいずれの１または複数の特徴と組み合わせてよい。

（１）目的ペプチドに特異的なＴＣＲを構成し得るＴＣＲポリペプチド鎖を同定するため、および目的ペプチドに特異的なＴＣＲをコードする１以上の核酸を生産するための方法
一面は、目的ペプチドに特異的な高親和性ＴＣＲ を生産するための方法であって、
ａ）ＴＣＲを発現し得る細胞および／またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなる細胞集団に、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖をコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、前記ベイトＴＣＲポリペプチド鎖は、前記目的ペプチドと特異的に結合するカウンター鎖ＴＣＲポリペプチド鎖とともに親ＴＣＲを構成し得る；ならびに
ｂ）前記ベイトＴＣＲの発現を許容する条件下で培養すること
を含んでなる方法を含む。

一実施態様では、前記方法は、工程（ａ）または（ｂ）で得られた形質導入された細胞集団から、前記目的ペプチドと選択的に結合する、前記ベイトＴＣＲポリペプチド鎖およびプレイＴＣＲポリペプチド鎖を含んでなるＴＣＲを発現する細胞を選択することをさらに含んでなる。

別の実施態様では、前記方法は、前記選択された細胞から、プレイＴＣＲポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を単離することをさらに含んでなる。

別の面では、本開示は、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを構成し得るＴＣＲポリペプチド鎖、または前記ＴＣＲポリペプチドを含んでなる細胞を同定および／または得るための方法であって、
ｃ）工程（ａ）または（ｂ）で得られた形質導入された細胞集団から、前記目的ペプチドと選択的に結合する、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖およびプレイＴＣＲポリペプチド鎖を含んでなるＴＣＲを発現する組換え細胞を得ること；および
ｄ）前記選択された細胞から、プレイＴＣＲポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を単離すること
をさらに含んでなる方法を含む。

別の実施態様では、前記方法は、ｅ）単離されたプレイ核酸と、発現された際に高親和性ＴＣＲを提供するベイト核酸をペアとする工程をさらに含んでなる(e) pairing the isolated prey nucleic acid isolated with the bait nucleic acid which when expressed provide a high affinity TCR)。

本明細書で使用する場合、用語「ＴＣＲ」は、単一の融合ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の可変領域（ＣＤＲ１／２／３）またはＴＣＲδ鎖およびＴＣＲγ鎖の可変領域を含んでなるＴＣＲ鎖の融合、ＴＣＲα：ＴＣＲβ、ＴＣＲβ：ＴＣＲα、ＴＣＲδ：ＴＣＲγおよびＴＣＲγ：ＴＣＲδ融合物を含む）を含んでなる分子、および／または各分子がＴＣＲ鎖を含んでなる最低でも２分子を含んでなる複合体（各ＴＣＲ鎖は最低でも可変領域を含んでなり、ここで、各ＴＣＲ鎖は他のカウンター鎖である）（例えば、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖またはＴＣＲγ鎖とＴＣＲδ鎖）を意味する。本明細書で使用する場合、「ＴＣＲ」は、ＴＣＲポリペプチド鎖、例えば、ＴＣＲα鎖およびβ鎖ポリペプチド、または単一の融合ＴＣＲおよび／もしくはＴＣＲポリペプチド鎖、例えば、融合したまたは分離したポリペプチドを含んでなるＴＣＲα鎖およびβ鎖をコードし得る核酸分子を意味し得る。

本明細書で使用する場合、用語「ＴＣＲ鎖」は、１）ＴＣＲ鎖ポリペプチドをコードするおよび／もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、ならびに／または２）カウンター鎖ＴＣＲ鎖とともにＴＣＲを構成し得る、例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδおよびＴＣＲγから選択されるＴＣＲ鎖ポリペプチドおよび／もしくはその機能的フラグメント（前記機能的フラグメントは最低でもＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなる）を意味する。ＴＣＲは、１以上の哺乳動物、場合によりヒトＴＣＲ鎖、および／またはハイブリッドＴＣＲ鎖、例えば、マウス：ヒトハイブリッド鎖を含んでなり得、場合により、ＴＣＲ鎖は、ヒトＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域とマウス定常領域および／またはマウスＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域とヒトＴＣＲ定常領域を含んでなる。マウスＣＤＲ１／２／３領域とヒト定常領域を含んでなるハイブリッドＴＣＲが報告されている(Parkhurst et al. 2009、Theoret et al. 2008)。

ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）（すなわち、ヒト型主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）（例えば、ＨＬＡ：ペプチド複合体）による提示に関しては、一般に、約９アミノ酸長のペプチドがＴＣＲにより認識される。いくつかのペプチドは無差別性であり、２以上のＨＬＡ型によって提示され得る。抗原提示細胞（ＡＰＣ）（真正および人工の両方）は、例えば、目的ペプチドを、ＨＬＡ分子に関して、目的ペプチドを認識するＴＣＲを含んでなるＴ細胞などのエフェクター細胞に提示する。カウンター鎖ＴＣＲを同定するための方法で使用可能な人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）は、ＨＬＡの単一の対立遺伝子を発現し得る。例えば、本明細書で示されるように、下記の実験に使用したａＡＰＣは、ＭＡＲＴ１目的ペプチドに対するＨＬＡ−Ａ２とＷＴ１目的ペプチドに対するＨＬＡ−Ａ２４を含んでなる。

ＴＣＲ鎖に関して用語「その機能的フラグメント」とは、少なくとも可変ＣＤＲ３領域を含んでなり、場合により、一緒になって目的ペプチド特異性を付与する働きをし得るＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなってもよい分子を意味する。機能的フラグメントは場合により細胞外部分（ＥＣ部分）を、場合によりＴＣＲ鎖の膜貫通部分（例えば、細胞内部分が削除されている）と組み合わせて含んでなる。機能的フラグメントは、例えば、治療薬などの薬剤中に含めることもできる。例えば、ＥＣ部分を、場合により各ＴＣＲカウンター鎖（例えば、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）の膜貫通部分と組み合わせて、一本鎖ＴＣＲ融合物を形成するように融合させることもでき、これを次に、場合により細胞傷害性部分を含んでなる抗体などのエフェクターとコンジュゲートさせる。このＴＣＲエフェクターコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することができる。

一実施態様では、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖は、ベイトＴＣＲαポリペプチド鎖またはベイトＴＣＲβポリペプチド鎖から選択される。

別の実施態様では、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖は、ベイトＴＣＲγポリペプチド鎖またはベイトＴＣＲδポリペプチド鎖から選択される。

用語「ベイト核酸」は、本明細書で使用する場合、ＴＣＲポリペプチド鎖、場合によりαもしくはβ、またはδもしくはγ（一実施態様では、従前に単離された（例えば、同定およびクローニングされた）、および／またはそのＣＤＲ領域（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）の配列が従前に決定された）をコードする核酸を意味する。例えば、ＣＤＲ領域の配列が決定されているＴＣＲ鎖の場合、ベイト核酸をクローン化し、および／または場合により、組換え産生したＣＤＲ領域核酸を既知の定常領域と組み合わせ、および／または既知のＴＣＲ鎖（例えば、既知の配列）のＣＤＲ領域を置換することによって構築することができる。

用語「プレイ核酸」は、本明細書で使用する場合、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖とともにＴＣＲを構成し得るプレイＴＣＲポリペプチド鎖、場合によりＴＣＲαまたはＴＣＲβポリペプチド鎖、をコードする核酸を意味し、いくつかの実施態様では、有利には、第２のＴＣＲポリペプチド鎖、場合によりベイトＴＣＲポリペプチド鎖、と組み合わせて、親ＴＣＲなどの対照ＴＣＲに比べて目的ペプチドに対するアビディティーおよび／または親和性が増大または低減されたＴＣＲを構成するＴＣＲポリペプチド鎖をコードするものである。

形質導入されたベイト核酸は、形質導入細胞または組換え細胞でベイトポリペプチドＴＣＲ鎖として発現され、プレイポリペプチドＴＣＲ鎖をペアとなってＴＣＲを形成する。ベイトＴＣＲポリペプチド鎖とともに、目的ペプチド（ＨＬＡ／ペプチド複合体に関して）を認識し得るＴＣＲを構成するプレイＴＣＲポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を選択することができ、例えば、それらは例えば、細胞および／またはクローニングされたプレイ核酸に関して単離することができる。

用語「核酸」は、本明細書で使用する場合、天然に存在する塩基、糖類、および糖間（骨格）結合からなるヌクレオチドモノマーまたはヌクレオシドモノマーの配列を意味し、場合により、一本鎖および二本鎖分子、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、ここで、ＤＮＡは非天然ｃＤＮＡであり、場合により、コドンが最適化されたＤＮＡである。この用語はまた、同等に機能する非天然モノマーまたはその一部を含んでなる修飾または置換オリゴマーも含む。このような修飾または置換核酸は、細胞取り込みの増大またはヌクレアーゼの存在下での安定性の増大などの特性のために天然型よりも好ましい場合がある。この用語はまた、２つ以上の化学的に異なる領域を含むキメラ核酸を含む。例えば、キメラ核酸は、有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増大、細胞取り込みの増大）を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域を含んでよく、または本開示の２以上の核酸が連結されたキメラ核酸を形成してもよい。

用語「単離された核酸」は、本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には、細胞材料または培養培地を、化学的に合成された場合には他の化学物質を実質的に含まない核酸を意味する。単離された核酸はまた、その核酸が誘導されるその核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）も実質的に含まない。

単離されたおよび／または組換え核酸および／またはポリペプチドは、１以上の保存的置換を含んでなり得る。

用語「保存的置換」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸配列に変化をもたらさないヌクレオチド置換、ならびに保存的アミノ酸置換または前記ヌクレオチドから翻訳されるポリペプチドの特徴に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を含む。

アミノ酸配列の保存的置換は、出発ペプチドに比べて変異体ポリペプチドの特徴に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸置換または欠失を含む。例えば、ポリペプチドの特徴は、それらの置換または欠失が変異体ペプチドと、出発ペプチドの特定の結合相手との特異的結合を妨げなければ、実質的に影響を受けない。この定義には、当業者に自明であり、本発明の範囲内に入ると考えられるグリコシル化その他の変異体および誘導体が含まれる。また、この定義には、出発ペプチドに比べてポリペプチドの特徴に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸挿入、置換、欠失および末端切断が含まれる。

一実施態様では、置換は、下記のリストの分子を含む：
アラニンＡ Ｄ−−Ａｌａ、Ｇｌｙ、β−Ａｌａ、Ｌ−−Ｃｙｓ、Ｄ−Ｃｙｓ
アルギニンＲ Ｄ−−Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｄ−−Ｌｙｓ、ホモ−Ａｒｇ、Ｄ−ホモ−Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｄ−−Ｍｅｔ、Ｄ−−Ｉｌｅ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ
アスパラギンＮ Ｄ−−Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｄ−−Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｄ−−Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｄ−−Ｇｌｎ
アスパラギン酸Ｄ Ｄ−−Ａｓｐ、Ｄ−−Ａｓｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｄ−−Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｄ−−Ｇｌｎ
システインＣ Ｄ−−Ｃｙｓ、Ｓ−−Ｍｅ−−Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｄ−−Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｄ−−Ｔｈｒ
グルタミンＱ Ｄ−−Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｄ−−Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｄ−−Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｄ−−Ａｓｐ
グルタミン酸Ｅ Ｄ−−Ｇｌｕ、Ｄ−−Ａｓｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｄ−−Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｃｉｄ Ｄ−−Ｇｌｎ
グリシンＧ Ａｌａ、Ｄ−−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｄ−−Ｐｒｏ、β−Ａｌａ Ａｃｐ
イソロイシンＩ Ｄ−−Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｄ−−Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｄ−−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ Ｄ−−Ｍｅｔ
ロイシンＬ Ｄ−−Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｄ−−Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｄ−−Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｄ−−Ｍｅｔ
リシンＫ Ｄ−−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−−Ａｒｇ、ホモ−Ａｒｇ、Ｄ−ホモ−Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｄ−−Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｄ−−Ｉｌｅ、Ｏｒｎ、Ｄ−−Ｏｒｎ
メチオニンＭ Ｄ−−Ｍｅｔ、Ｓ−−Ｍｅ−−Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｄ−−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｄ−−Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｄ−−Ｖａｌ
フェニルアラニンＦ Ｄ−−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｄ−−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｄｏｐａ、Ｈｉｓ、Ｄ−−Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｄ−−Ｔｒｐ、トランス−３，４，または５−フェニルプロリン、シス−３，４，または５−フェニルプロリン
プロリンＰ Ｄ−−Ｐｒｏ、Ｌ−−Ｉ−チオアゾリジン−４−カルボン酸、Ｄ−−またはＬ−１オキサゾリジン−４−カルボン酸
セリンＳ Ｄ−−Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｄ−−Ｔｈｒ、アロ−Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｄ−−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ（Ｏ）、Ｄ−−Ｍｅｔ（Ｏ）、Ｌ−−Ｃｙｓ、Ｄ−−Ｃｙｓ
トレオニンＴ Ｄ−−Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｄ−−Ｓｅｒ、アロ−Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｄ−−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ（Ｏ）、Ｄ−−Ｍｅｔ（Ｏ）、Ｖａｌ、Ｄ−−Ｖａｌ
チロシンＹ Ｄ−−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｄ−−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｄｏｐａ、Ｈｉｓ、Ｄ−−Ｈｉｓ
バリンＶ Ｄ−−Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｄ−−Ｉ，ｅｕ Ｉｌｅ、Ｄ−−Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｄ−Ｍｅｔ。

一実施態様では、以下の置換：ＳとＴ；ＩとＶとＬ；および／またはＦとＹを行うことができる。

一実施態様では、保存的置換は、互いに保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含む以下の６つの群から選択される：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

形質導入された細胞集団から、前記目的ペプチドと選択的に結合する、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖とプレイＴＣＲポリペプチド鎖を含んでなるＴＣＲを発現する組換え細胞を得る工程は、形質導入されたベイトポリペプチドを発現し、および、目的ペプチドと結合する１以上の細胞（例えば、１以上のクローン）を単離することを含んでなり得る。

本明細書で使用する場合、「カウンター鎖ＴＣＲ鎖」は、ＴＣＲを構成するために明示されたＴＣＲ鎖型と会合させ得るＴＣＲ鎖に関する。例えば、ベイトＴＣＲα鎖に対して、カウンター鎖プレイＴＣＲ鎖はプレイＴＣＲβ鎖であり、またその逆である。同様に、ベイトＴＣＲγ鎖に対して、カウンター鎖プレイＴＣＲ鎖はプレイＴＣＲδ鎖であり、またその逆である。

一実施態様では、得る工程は、非形質導入細胞を除去すること、プレイ核酸を、例えば、ベクターにクローニングすること、ならびにベイトとプレイ核酸を含んでなる再構成されたＴＣＲの、目的ペプチドに対するアビディティーおよび／または親和性を決定することを含んでなる。アビディティーおよび／または親和性は、他のクローニング核酸および／または対照との相対など、相対的なものでも、また絶対的なものでもよい。例えば、ベイト核酸（または他の同じタイプのＴＣＲ鎖）とともに所望のまたは従前に選択された親和性／アビディティーを有するＴＣＲを構成するプレイ核酸が単離され得る。例えば、このプレイ核酸を増幅させることができ、かつ／または従前に選択されたクローンを、使用するベクターのタイプに適当な方法を用いて複製することができる。

あるいは、プレイ核酸を発現する組換え細胞を増殖および／またはパッケージングすることができる。

一実施態様では、プレイ核酸は、例えば、クローニングにより単離される。プレイ核酸をクローニングする方法は特に限定されず、選択された細胞のＴＣＲ Ｖβレパートリーを決定すること、および以下にさらに記載されるように、同定されたＴＣＲ Ｖβ鎖およびＴＣＲβ定常領域プライマーに特異的なプライマーを用いてｃＤＮＡを作製するためにプレイ核酸を増幅させることを含んでなり得る。プレイ核酸がＴＣＲα鎖である場合、選択された細胞のＴＣＲ Ｖαレパートリーは上記のように決定することができる。加えて、５’ＲＡＣＥに基づく方法も使用可能である。一実施態様では、ＰＣＲ、特にクローンＴＣＲ遺伝子の特異性を高めるために、実施例に記載の通りに、２つの定常領域リバースプライマーが使用される。

図２では、胸腺選択は、プレイＴＣＲα核酸とともにペプチド特異的ＴＣＲを構成し得るＴＣＲβレパートリーに影響を及ぼすとは思われない（例えば、ＳＩＧ３５αで実証される通り）ことが示される。

図２０は、一本鎖形質導入（例えば、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖またはその機能的部分のいずれかの形質導入）で得ることのできるＴＣＲの模式図を示す。一本鎖形質導入（例えば、１本のＴＣＲ鎖の形質導入）は、特異的ペプチドに対する親和性／アビディティーがより大きいまたはより小さいＴＣＲを含む、非生理学的範囲の親和性を有する、胸腺選択されないＴＣＲレパートリーを生成する。

図２２に示されるように、一本鎖適用は、例えば、αまたはβＴＣＲポリペプチド鎖の形質導入を必要とし、極めてポリクローナルなＴＣＲクローン性と極めて広いＴＣＲ親和性／アビディティーをもたらす。

例えば、一本鎖遺伝子導入は、高いアビディティーの抗腫瘍Ｔ細胞を生成し得る。実施例２に示されるように、末梢Ｔ細胞由来の高親和性腫瘍反応性ＴＣＲは、胸腺選択されないＴ細胞レパートリーを作製することにより同定された。ＣＤ８＋Ｔ細胞に、ＴＣＲα鎖、ＳＩＧ３５αを形質導入したところ、Ａ２／ＭＡＲＴ１ペプチドを認識することができた。クロノタイプＴＲＢＶ２７ ＴＣＲβ鎖は、ＣＤ８共受容体の存在下または不在下、ヒトＴＣＲαβ欠損Ｔ細胞上でＳＩＧ３５αを伴って再構成された。６つのトランスフェクト体、クローン８Ｈ、７Ｑ、９Ｊ、４Ｋ、７Ｅ、９Ｉおよび６Ｘは、Ａ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲを発現するもの、すなわち、ＤＭＦ５よりも高いアビディティーを呈した。これらのトランスフェクト体はまた、ＣＤ８非依存的にＡ２＋ ＭＡＲＴ１＋腫瘍細胞を認識した（表７参照）。

よって、本方法は、対照、場合により親ＴＣＲ、または従前に選択されたアビディティーおよび／もしくは親和性に比べて増大または低下したアビディティーおよび／または親和性を有するＴＣＲを構成するためにベイトＴＣＲ鎖とペアとする種々のプレイＴＣＲ鎖の同定を可能とする。

一実施態様では、ＣＤＲ３領域を含んでなるプレイＴＣＲ鎖ポリペプチドは、対照ＴＣＲ鎖ポリペプチドＣＤＲ３領域のＣＤＲ３領域、場合により親ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３領域、と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含んでなる。ＴＣＲの最大の超可変領域であるＣＤＲ３は６〜２０個のアミノ酸を含んでなり得、ペプチド特異性の主要決定基である。少なくとも１つのアミノ酸修飾は、例えば、ＣＤＲ３領域を構成する領域におけるアミノ酸変化およびアミノ酸残基数の増加または減少であり得る。

単離されたプレイ核酸は、一実施態様では、修飾される。一実施態様では、ペプチド親和性／アビディティーを増大および／または低下させるためにＣＤＲ３に突然変異を導入することができる。

ＣＤＲ１およびＣＤＲ２もまた、一般にＣＤＲ３よりも低い程度ではあるが、ペプチド認識（例えば、配列および長さ）の決定基である。ＣＤＲ１は、例えば、他のＣＤＲ１領域と交換することができる。ペプチド認識に直接関与しない定常領域などの他の領域は、ペプチド結合のアビディティーおよび／または親和性に影響を及ぼさないか、または最小の影響しか及ぼさない変化を許容し得る。一実施態様では、単離されたプレイ核酸は修飾され、プレイＣＤＲ３領域を、ＣＤＲ２およびＣＤＲ１領域および定常領域と組み合わせて含んでなり、ここで、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域、および／または定常領域は１以上のアミノ酸変化を含んでなり、場合により、ＣＤＲ１領域が交換され、かつ／または定常領域もしくは他の非ＣＤＲ領域の一部が欠失されて、例えば、末端切断型機能的フラグメントが作出される。

一実施態様では、ベイト核酸がひと度単離されると、場合により、単離されたプレイＴＣＲ鎖または修飾ＴＣＲプレイ鎖およびベイトＴＣＲ鎖を用いて、融合ＴＣＲおよび／またはヘテロＴＣＲを構成することができる。

単離されたプレイ核酸はまた、一実施態様では、単離されたプレイ核酸に対するカウンター鎖を同定するため、例えば、親ＴＣＲのいずれの鎖も含まない、構成されたＴＣＲを提供するために、ベイト核酸として使用することができる。

一実施態様では、ベイトポリペプチド鎖およびプレイＴＣＲポリペプチド鎖は、ｉ）増大したアビディティーおよび／もしくは親和性（例えば、従前に選択された標準よりも高い）；ならびに／またはｉｉ）目的ペプチドに対して親ＴＣＲよりも高いアビディティーおよび／もしくは親和性を有するＴＣＲを構成する。

一実施態様では、得る工程は、ペプチド結合アビディティーおよび／または親和性に対する構成されたＴＣＲ（例えば、ベイトおよびクローニングされたプレイ核酸）のアビディティーおよび／または親和性を試験すること、例えば、決定することを含んでなる。

一実施態様では、得る工程は、例えば、プレイＴＣＲ核酸をクローニングする前に、場合により、Ｔ細胞を突然変異ＨＬＡ、場合により突然変異ＨＬＡ−Ａ２を含んでなるａＡＰＣで刺激することにより、高アビディティーＴ細胞を富化することを含んでなる。例えば、突然変異ＨＬＡ−Ａ２はＴＣＲ／ＨＬＡ相互作用の親和性に影響を及ぼすことなくＣＤ８分子への結合を排除し、高いアビディティーおよび／または親和性のＴＣＲを富化するために使用することができる。突然変異ＨＬＡ−Ａ２を発現する人工ＡＰＣは高アビディティーの抗原特異的Ｔ細胞を選択的に拡大増殖し得ることが従前に示されている(Imataki et al., 2012)。

別の実施態様では、取得工程は、形質導入／組換え細胞を単離すること、１以上のプレイＴＣＲ鎖核酸をクローニングすること、およびクローニングされたプレイＴＣＲ鎖核酸の１つを細胞内で発現させてヘテロＴＣＲを提供すること、および目的ペプチドに対するヘテロＴＣＲのアビディティーおよび／または親和性を試験することのうちの１以上を含んでなる。一実施態様では、ＴＣＲにおいて構成された際に高いアビディティーおよび／または親和性を付与するプレイＴＣＲ鎖核酸が単離される。

一実施態様では、本方法は、目的ペプチドに対して高いアビディティーおよび／もしくは親和性を有する、ならびに／またはアビディティーおよび／もしくは親和性が増大されたＴＣＲを構成するＴＣＲポリペプチド鎖を同定するためのものであり、本方法は、クローニングされたプレイ核酸およびベイト核酸を、ＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現し得る細胞に分化し得る細胞に導入し、プレイＴＣＲポリペプチド鎖とベイトＴＣＲポリペプチド鎖を含んでなるＴＣＲのアビディティーおよび／または親和性を測定すること；ベイトＴＣＲαまたはＴＣＲβポリペプチド鎖とプレイＴＣＲポリペプチド鎖が、目的ペプチドに対して、対照、場合により親ＴＣＲ、に比べて増大された（あるいはまた低減された）アビディティーおよび／または親和性を有するＴＣＲを構成するクローンを同定することをさらに含んでなる。

一実施態様では、ヘテロＴＣＲを発現する細胞は、細胞をペプチドで外因的にパルス処理することなく細胞上に提示される目的ペプチドを認識するのに十分なアビディティーを有する。例えば、目的ペプチドが腫瘍抗原ペプチドである場合には、ヘテロＴＣＲは、修飾の不在下で、例えば、腫瘍細胞を目的ペプチドで外因的にパルス処理することなく、腫瘍抗原を提示する腫瘍細胞を認識することができる。

一実施態様では、ヘテロＴＣＲのアビディティーおよび／または親和性は、親ＴＣＲなどの対照に比べて、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％またはそれ以上増大される(the avidity and/or affinity of the heterogeneous TCR in increased at least 25%, at least 50%, at least 75%, at least 100%, at least 200%, at least 500% or more compared to a control such as the parent TCR)。

一実施態様では、ヘテロＴＣＲのアビディティーおよび／または親和性は、親ＴＣＲなどの対照に比べて、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％またはそれ以上低減される(the avidity and/or affinity of the heterogeneous TCR in decreased at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80% or more compared to a control such as the parent TCR)。

一実施態様では、増大したアビディティーは、増大した構造的アビディティーおよび／または増大した機能的アビディティーである。

本明細書で使用する場合、用語「アビディティー」は、本明細書で使用する場合、多重親和性、場合により抗原提示細胞により提示される抗原決定基（例えば、目的ペプチド）を有する抗原と、場合によりＴＣＲまたは抗体を発現する細胞に関する(in the contest of) ＴＣＲまたは抗体などの(such an)結合タンパク質との間の結合の総合的強度例えば、腫瘍関連抗原などの提示されたペプチドとＴＣＲとの間の総合的結合強度、または腫瘍関連抗原などのａＡＰＣにより提示されたペプチドとＴＣＲを発現する細胞との間の総合的結合強度の指標(a measure off)を意味する。用語「機能的アビディティー」は、本明細書で使用する場合、機能アッセイにおいて最大応答の５０％を達成するのに必要な抗原（例えば、ペプチド）の濃度である。各機能アッセイに関して、最大応答が決定される。測定される機能としては、例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなどのサイトカインを分泌する能力および細胞溶解能が含まれる。最大応答は、Ｔ細胞が最大に刺激された際に得られる。よって、最大応答は、所与の１または複数のＴ細胞の機能的容量に依存し、例えば、μＭまたは他の分子単位でＥＣ５０として表すことができる。用語「構造的アビディティー」は、本明細書で使用する場合、およびμｇ／ｍＬまたは他の濃度単位でＥＣ５０として表し得る場合、最大の半分の抗原染色（例えば、多量体染色）を達成するのに必要な抗原（例えば、ペプチド多量体）の濃度である。機能的および構造的アビディティーは、例えば、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ ６ソフトウエアで計算することができる。

用語「親和性」は、本明細書で使用する場合、例えば、ペプチド（ＨＬＡに関して提示）とＴＣＲとの間の単一の相互作用の強度を意味する。親和性は、例えば、目的ペプチドが無細胞系で提示される場合、例えば、ＨＬＡにより提示されるペプチドが表面またはビーズに結合される場合に評価される。

本明細書で使用する場合、「高アビディティー」は、外因性ペプチドのパルス処理などの修飾なく、目的ペプチドを提示する標的細胞を認識するために十分高いアビディティーを意味する。

機能的アビディティーは、例えば、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよび実施例に記載されるような例えばインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）および／またはＩＬ−２産生の測定、および／またはそれらの組合せを用いて測定することができる。構造的アビディティーは、ＴＣＲ発現細胞、場合によりＴ細胞を、漸増濃度のＨＬＡ／ペプチド多量体を用いて染色することによって測定することができる。いくつかの実施態様では、アビディティーは、蛍光色素標識多量体合成ＨＬＡ／ペプチド複合体に対する特異的ＴＣＲ結合のフローサイトメトリー分析、ならびに／または末梢血リンパ球の形質導入と、ペプチドによりパルス処理したＨＬＡ適合ＡＰＣによるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激および標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはＥＬＬＩＳＰＯＴアッセイを用いたＩＦＮ−γ産生のスクリーニングを介した機能的評価によって評価される。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞アビディティーは、ＩＦＮ−γに対する細胞内染料と組み合わせた、蛍光標的多量体に結合した細胞を検出する二重染料セルソーティングプロトコールによって検出され、これにより、ＴＣＲ多量体複合体の認識によって細胞が活性化されていたことが示される。

一実施態様では、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖、場合によりベイトＴＣＲαポリペプチド鎖および／またはベイトＴＣＲβポリペプチド鎖は、前記目的ペプチドを認識するＴ細胞から発現され、従前に単離されたものである。別の実施態様では、ベイトポリペプチドは、既知のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を用いて構築される。

一実施態様は、カウンター鎖ＴＣＲポリペプチドとともに目的ペプチドに特異的なＴＣＲを構成するＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸を生産するための方法であって、以下の工程：
（ａ）ＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなる細胞集団に、ＴＣＲαポリペプチド鎖またはＴＣＲβポリペプチド鎖から選択されるＴＣＲポリペプチド鎖をコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、ＴＣＲポリペプチド鎖は、カウンター鎖ＴＣＲポリペプチド鎖とともに、発現ＴＣＲを構成し、前記ベイトＴＣＲポリペプチド鎖は、前記目的ペプチドを認識するＴ細胞から従前に単離されたものであり、
（ｂ）形質導入された細胞集団をベイトＴＣＲポリペプチド鎖の発現を許容する条件下で培養し、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた形質導入された細胞集団から、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する１以上の細胞を得、かつ
（ｄ）工程（ｃ）で得られた(obtainedd)細胞から、前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸によりコードされるＴＣＲポリペプチド鎖とともにＴＣＲを構成するプレイＴＣＲポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を単離すること
を含んでなる方法を含む。

別の面では、本開示は、目的ペプチドに特異的なＴＣＲをコードする核酸のペアを生産するための方法であって、
（ａ）細胞集団に、前記目的ペプチドを認識するＴ細胞から発現され、従前に単離された、ＴＣＲを構成するＴＣＲαポリペプチド鎖またはＴＣＲβポリペプチド鎖のうちのいずれか１つをコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、前記細胞集団は、ＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなるものであり、
（ｂ）形質導入された細胞集団をベイトＴＣＲポリペプチド鎖の発現を許容する条件下で培養し、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた形質導入された細胞集団から、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する１以上の細胞を選択し、
（ｄ）工程（ｃ）で選択された１以上の細胞から、ベイト核酸によりコードされるＴＣＲポリペプチド鎖とともにＴＣＲを構成し得るＴＣＲポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を単離し、かつ
（ｅ）工程（ａ）で前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸または同鎖ＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸と、工程（ｄ）で単離されたプレイ核酸をペアとすること
を含んでなる方法に関する。

本開示の核酸ペアを生産するための方法の上記に示される例えば、（ａ）（ｂ）および（ｃ）の工程は、本明細書に記載の方法論によって行うことができる。単離工程は、ＴＣＲ鎖遺伝子を単離するための一般的な方法、例えば、ＴＣＲペプチドの定常領域をコードする核酸配列と相補的なプライマーを用いたＰＣＲによって行うことができる。プレイ核酸が例えば工程（ｃ）でクローニングされたならば、単離工程は、例えば、プレイ核酸を含んでなるベクターを増殖させ、かつ／または選択された細胞からプレイ核酸を増幅されることによって、親ＴＣＲよりも望ましいアビディティーを有するクローンプレイ核酸を選択することを含んでなり得る。

ＴＣＲポリペプチド鎖をコードするベイト核酸は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および／または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から従前に単離することができる。一実施態様では、ＣＴＬは、癌（例えば、白血病、および固形腫瘍など）、肝炎、ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、またはＨＩＶなど）、細菌（例えば、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、ＭＲＳＡ、またはＶＲＥなど）、真菌（例えば、アスペルギルス属(Aspergillus)、カンジダ属(Candida)、およびクリプトコッカス属(Cryptococcus)など）により引き起こされる感染性疾患などの障害を有する患者から単離され、例として示される。

ペアとすることは、ベイト核酸とプレイ核酸を１つのベクター中にまたは別個のベクター中にクローニングすること、および細胞に、クローニングされたプレイ核酸およびベイト核酸を形質導入することを含み得る。それはまた、融合された一本鎖ＴＣＲをコードするようにこれらの核酸を組み合わせることも含み得る。ベクターは、クローニングされた核酸の量産のためまたは宿主細胞での発現のためのいずれの種類のベクターであってもよい。

ペアをなす核酸を含む本明細書に記載の核酸は種々の実施態様で使用可能である。これらの核酸のそれぞれは、転写または翻訳を制御する１以上の要素と組み合わせ、かつ／または機能的に連結してもよいし、または例えば（２）に記載されるようにベクターに挿入してもよい。特に好ましい実施態様は、（ｉ）単離され、および／またはペアとされた核酸の一方または両方が挿入された１つのベクター、ならびに（ｉｉ）ペアとされた核酸のそれぞれが挿入されたベクターの組合せを含む。（ｉ）の面では、ＴＣＲポリペプチド鎖またはその他のポリペプチドをコードする核酸はそれぞれ別のプロモーターによって転写および翻訳されてもよいし、または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または前記ポリペプチド鎖の間にフューリン切断部位もしくは自己消化性***ウイルスＦ２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）などの切断部位を用い、１つのプロモーターにより転写および翻訳されてもよい。

用語「得ること(obtaining)」および「生産」は、本明細書で使用する場合、少なくとも１つの物理的工程を含み、選択アッセイ、場合によりＦＡＣＳ、例えば選択マーカーを用いた化学的選択、抗原負荷抗原提示細胞を用いたＴＣＲ選択などを含み得る。

用語「機能的に連結される」とは、ある核酸と別の核酸配列の機能的関係を意味する。プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、およびその他のシグナル配列が、他の配列に機能的に連結される核酸配列の例である。例えば、転写制御要素へのＤＮＡの機能的連結は、そのＤＮＡの転写がプロモーターから、そのプロモーターを特異的に認識し、それと結合し、そのＤＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼによって開始されるようなＤＮＡとプロモーターの間の物理的および機能的関係を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「Ｆ２Ａ」は、***ウイルスペプチドおよび隣接する配列間のタンパク質切断を媒介し得る、最適化されたＦ２Ａ様配列を意味する。例えば、Ｆ２Ａペプチド配列は、単一のオープンリーディングフレームから複数のタンパク質の発現を可能とするポリペプチドをコードする核酸分子間にクローニングすることができる。Ｆ２Ａペプチドは配列番号７０で表され、例えば、配列番号６９を含んでなる核酸によりコードされる。

用語「フューリン切断部位配列」または「フューリン切断部位」は、本明細書で使用する場合、例えば、アミノ酸ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒ（配列番号１２３）、場合により、例えば配列番号６５を含んでなる核酸配列によりコードされているＲＡＫＲ（配列番号６６）を含む、フューリン酵素により切断されるアミノ酸配列をコードする核酸（またはコードされるアミノ酸配列）を意味する。

用語「フューリン」は、本明細書で使用する場合、一般にＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ（配列番号１２３）を有するスブチリシン様プロタンパク質コンベルターゼファミリーのメンバーを意味し、限定されるものではないが、天然変異体、例えば、引用することにより具体的に組み込まれるＧｅｎｂａｎｋに受託番号ＣＡＡ２７８６０ ＣＡＡ２７８６０．１、ＣＡＡ３７９８８．１、ＮＰ＿０６２２０４．１、ＮＰ＿００３７８２．１、ＮＰ＿００１１６１３８２．１で寄託されているものを含む、総ての既知のフューリン分子を含む。フューリンはまた、ＰａｃｅおよびＰＣ１、ＰＣＳＫ３ ＳＰＣ１としても知られる。

加えて、別個の実体の間、例えば、ＴＣＲ鎖とマーカーの間に、例えば配列番号６７を含んでなる核酸によりコードされる例えば配列番号６８により表されるｓｇｓｇ配列などのリンカー配列を付加することもできる。

本明細書で使用する場合、用語「ｓｇｓｇ」は、例えば、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）（配列番号１２４）などのショートリンカー、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）×２などのミドルリンカー、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）×３などのロングリンカーを含むフレキシブルスペーサー／リンカーとして使用可能な「グリシン」および「セリン」アミノ酸の配列を意味する。他のリンカーとしては、International Genetically Engineered Machine (iGEM) repository of Standard Biological partsに記載されているリンカーが含まれる。

一実施態様では、ＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸は、配列番号７２で表される（例えば、配列番号７１を含んでなる核酸によりコードされている）または末端切断型ＮＧＦＲポリペプチド（ΔＮＧＦＲ）または例えば、ＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸が細胞に形質導入される実施態様では、他のいずれかの有用なマーカーをコードする核酸などの、選択マーカーポリペプチドをコードする核酸と組み合わせられ、好適な選択マーカーには、ＥＧＦＰおよび関連分子などの蛍光タンパク質、ならびに形質導入される細胞には見られず、かつ、好ましくはシグナル伝達活性を欠いている細胞表面タンパク質、例えば、ΔＮＧＦＲ、末端切断型ＥＧＦＲ、末端切断型ＣＤ１９などが含まれる。選択マーカーは、例えば、単一のＯＲＦにおいてＴＣＲと融合させることもでき、および／またはベクター内の別々のＯＲＦとして含まれてもよい。例えば、ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸は、選択マーカーをさらに含んでなるベクター内に含まれ得る。

フューリン切断部位またはＦ２Ａペプチドなどの１以上の切断部位をコードする核酸配列は、ＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸と選択マーカーポリペプチドをコードする核酸の間に導入することができ、所望の際にマーカー切断を可能とする。

融合構築物作製の当業者ならば、例えばＴＣＲ鎖配列に見られるような終止コドンが例えば図２１に示されるように欠失されることを認識するであろう。

一実施態様では、細胞集団形質導入は、例えば、ベイトとなり得るプレイＴＣＲ鎖の多様性を増すために２回、３回、４回、５回または６回繰り返される。

（２）目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する細胞
一面において、本開示は、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する細胞を生産するための方法であって、細胞集団に、ＴＣＲを構成する２つのカウンター鎖ポリペプチド鎖（例えば、ＴＣＲαまたはβ）のうちいずれか一方をコードする核酸を形質導入する工程を含んでなる方法に関し、場合により、前記核酸は、前記目的ペプチドを認識するＴ細胞から発現され、および、従前に単離されたものであり、ならびに、前記細胞集団は、ＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなる。例えば、図２２参照。一実施態様では、本方法は、付加的ＴＣＲポリペプチド鎖、場合により、導入されたまたは共導入されたＴＣＲポリペプチド鎖のカウンター鎖（例えば、ＴＣＲβが共導入された、またはされる場合にはＴＣＲα）または異なるＴＣＲポリペプチド鎖（例えば、ＴＣＲαおよびＴＣＲδ）をコードする核酸を導入することをさらに含んでなる。

一実施態様では、プレイＴＣＲポリペプチド鎖をコードする単離されたプレイ核酸が、ＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなる細胞の集団に形質導入され、場合により、前記単離されたプレイ核酸が、プレイＴＣＲポリペプチド鎖とともにＴＣＲを構成するＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸、場合によりベイトＴＣＲ核酸、とともに形質導入されて、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する細胞を含んでなる形質導入された細胞集団が生産される。

一実施態様では、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖をコードする単離されたベイト核酸が、ＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなる細胞の集団に形質導入され、場合により、前記単離されたベイト核酸は、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖とともにＴＣＲを構成するＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸、場合によりプレイＴＣＲ核酸、で形質導入されて、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する細胞を含んでなる形質導入された細胞集団が生産される。前記ベイト核酸は、ベイトポリペプチドをコードすることに加え、本明細書に記載の１以上の要素を含んでなり得る。例えば、前記ベイト核酸（および／または例えば、ＴＣＲもしくは組換え細胞を生産するために使用される場合にはプレイ核酸）は、［０１２６］（英文明細書［００１５５］）に記載の１以上の要素を含んでなり得る。ＴＣＲ ＳＩＧ３５α遺伝子およびＴＡＫ１β遺伝子がベイトとして使用される例では、ベイト核酸は、そのＮ末端に昆虫由来フィブロイン軽鎖シグナル配列をコードする配列を含んでなり、これは効率的に切断される。よって、一実施態様では、ベイト核酸（および／またはプレイ核酸）は、昆虫フィブロイン(fibrion)軽鎖シグナル配列などの非天然シグナル配列を含んでなる。

細胞集団は、一実施態様では、プレイ核酸および／またはベイト核酸を発現する細胞に関して選択される。

用語「ＴＣＲを発現し得る細胞」は、本明細書で使用する場合、例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋および二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞を含む任意のＴ細胞、ならびに／またはＴＣＲを発現するための細胞機構を含んでなる任意の細胞を意味し、前記ＴＣＲが一般に前記細胞種に内在的に存在する場合または内在せず細胞に導入される（例えば、ウイルス感染による）場合のいずれかである。

用語「ＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞」は、本明細書で使用する場合、Ｔ細胞前駆細胞、胸腺細胞、造血幹細胞、骨髄細胞、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞などのＴ細胞に分化し得る細胞を意味する。

目的ペプチドに特異的なＴＣＲを構成する各ポリペプチド鎖（ＴＣＲ鎖）をコードするベイト核酸は、例えば、上記のように同定され、および／または従前に単離され得る。一例として、従来の方法により、目的ペプチドを認識するＴ細胞、例えば、ＣＴＬからＲＮＡを作製した後、ｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡを鋳型として用い、ＴＣＲ定常領域をコードする核酸と相補的なアンチセンスプライマーを使用してｃＤＮＡ末端の５’−迅速増幅（ＲＡＣＥ）を行う。５’−ＲＡＣＥは、既知の方法によって実施され得る。例えば、５’−ＲＡＣＥは、ＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈにより製造）などの市販のキットを用いて実施され得る。上述の手順によって増幅されたＤＮＡのヌクレオチド配列を決定し、ＴＣＲ鎖をコードするＤＮＡを選択する。ＴＣＲを構成するポリペプチド鎖のアミノ酸配列が既知であれば、そのポリペプチド鎖をコードする核酸が化学的に合成できる。

「ｃＤＮＡ」は、コピー−ＤＮＡまたは相補的−ＤＮＡと定義され、ｍＲＮＡ転写産物からの逆転写反応の産物である。「ＲＴ−ＰＣＲ」は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を意味し、１または複数のｍＲＮＡ鋳型に相補的なｃＤＮＡの生産をもたらす。

本開示の一面において、細胞に、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖のいずれかをコードする核酸が形質導入される。あるＴＣＲ鎖が主としてＴＣＲによるペプチド認識に寄与する場合、そのようなＴＣＲ鎖をコードする核酸が本開示で好ましく使用される。ペプチド認識のＴＣＲ中心性は、結晶構造解析に決定され得る。

ＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸の例としては、限定されるものではないが、前記核酸が細胞に導入される際に付加される、核酸によりコードされるポリペプチドの翻訳を可能とする様々な要素を含む核酸が含まれる。例えば、ＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸は、プロモーター配列（例えば、哺乳動物由来プロモーター、例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、Ｘｉｓｔプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターなど、ウイルス由来プロモーター、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、種々のレトロウイルスのＬＴＲプロモーターなど）、ターミネーター配列、エンハンサー配列、または他の転写制御領域を含み得る。さらに、核酸はＴＣＲ鎖の翻訳に寄与する配列（Ｋｏｚａｋ配列など）を有してもよい。当然のことながら、上述の要素は、核酸のＲＮＡへの転写またはポリペプチドの翻訳に好適となるように互いに機能的に関連する位置に配置される。核酸がＲＮＡである場合、転写制御に関連する要素は核酸に付加しなくてよい。

ＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸を、本明細書に記載のベクターに組み込むことができる。加えて、ＤＮＡまたはＲＮＡである核酸は、１または複数のＴＣＲポリペプチド鎖を発現する細胞に直接形質導入することもできる。

用語「ベクター」は、本明細書で使用する場合、宿主細胞内で自律的に複製することができ、かつ、外来ＤＮＡを許容し得る核酸分子である。ベクターは、その固有の複製起点、外来ＤＮＡの挿入のために使用することができる、制限エンドヌクレアーゼに対する１以上のユニークな認識部位、および通常には、抗生物質耐性をコードする遺伝子などの選択マーカー、および多くの場合には、挿入されたＤＮＡの発現のための認識配列（例えば、プロモーター）を有する。一般的なベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターが挙げられる。

細胞に核酸を形質導入する方法は特に限定されず、既知の方法であり得る。例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、陽イオン脂質またはリポソームを用いる方法 が使用可能である。市販のトランスフェクション試薬を使用することより、核酸は高効率で細胞に容易に導入することができる。

本明細書で使用する場合、用語「形質導入(transducing)」あるいはまた「形質転換(transforming)」は互換的に使用可能であり、場合により、細胞のゲノムへの導入（例えば、レトロウイルス法を使用）による、細胞への核酸の導入を意味する。細胞への核酸の導入方法は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、陽イオン脂質またはリポソームに基づく方法、ならびに遺伝子銃、ソノポレーション(sonoporation)、マグネットフェクション(magnetofection)などのようなウイルスまたは非ウイルス的方法を含み得る。例えば、核酸は、市販のトランスフェクション試薬を使用することにより、高効率で細胞に導入することができる。核酸はベクターに組み込むことができる。ベクターは特に限定されず、目的に応じてプラスミドベクターおよびウイルスベクターなどの既知のベクターから好適なベクターが選択され、次いで、使用され得る。

細胞に感染して細胞に外来ＤＮＡを導入する能力を有するウイルスベクターが本開示に好適である。本開示においては、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター、偽型ベクターなど）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどのような既知のウイルスベクターが使用可能である。ＴＣＲ鎖をコードする核酸が挿入されたウイルスベクターは、各ウイルスに好適な条件下で標的細胞に感染すること、およびその細胞に核酸を形質導入することを可能とする。挿入された外来核酸を染色体に組み込む能力を有するレトロウイルスベクターは、本開示に好適である。

一実施態様では、ＰＢＭＣ細胞集団などの細胞集団は、形質導入されたＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸と相互作用する内在性ＴＣＲ鎖のヘテロ性を増大させるために、２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上形質導入される。形質導入されたＴＣＲポリペプチド鎖を内在性ＴＣＲよりも効率で発現するＴ細胞を得る方法は既知である。この方法では、Ｔ細胞が元々発現する内在性ＴＣＲ鎖の発現を、内在性ＴＣＲ鎖に特異的に標的化されるｓｉＲＮＡなどのアンチセンス技術によって抑制される（ＷＯ２００８／１５３０２９参照）。上述の方法が本開示に適用される場合、形質導入された１または複数のＴＣＲポリペプチド鎖を発現する細胞は、形質導入される核酸とは配列が異なる内在性ＴＣＲ ＲＮＡをｓｉＲＮＡ（またはその他の手段）で標的化することにより、高率で得ることができる。形質導入されるヌクレオチド配列は、使用するｓｉＲＮＡによってノックダウンされないように、遺伝コードの縮重に基づいて作製することができる。一実施態様では、形質導入されるヌクレオチド配列（例えば、ベイト核酸またはカウンター鎖ＴＣＲ鎖核酸と組み合わせて形質導入される核酸を含む）はコドンを最適化することができる。

ＴＣＲはＴ細胞による抗原の認識において重要な役割を果たすので、ＴＣＲ鎖をコードする核酸で形質導入されたＴ細胞は、本開示の好ましい面の１つである。この面において、核酸は、ＴＣＲを発現し得る細胞に分化可能な細胞に形質導入されてよく、従って、この細胞はＴ細胞に分化し得る。ＴＣＲを発現し得る細胞に分化可能な細胞の例としては、造血幹細胞、リンパ系共通前駆細胞、およびＴ細胞前駆体が挙げられる。加えて、上記形質導入に使用される細胞は単一の細胞種に分画される必要はない。その細胞を含有する細胞集団、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）集団を、核酸が形質導入される対象から得ることができる。一実施態様では、形質導入は、２回、３回、４回、５回または６回繰り返される。加えて、このような細胞集団を、例えば形質導入前に、Ｔ細胞の増殖を高めるため、例えば、形質導入効率を高めるために、ＣＤ３リガンド、およびレクチンなどで刺激することもできる。

用語「対象」には、ヒトを含む動物界の総てのメンバーが含まれる。一実施態様では、対象は動物である。別の実施態様では、対象はヒトである。

好ましい開示では、ＣＤ３リガンドは、特に、それがＣＤ３に結合するという特徴を有する物質である限り限定されないが、例えば、それは抗ＣＤ３抗体であってよく、特に好ましくは、抗ＣＤ３モノクローナル抗体が使用され得る。例えば、モノクローナル抗体ＯＫＴ３(Kuneg et al., 1979)が一例として示される。培養培地中のＣＤ３リガンドの濃度 には特に制限はないが、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を使用する場合、例えば、０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に、０．０１〜１００μｇ／ｍＬ濃度が好ましい。

加えて、本開示では、細胞を必要であれば、ＣＤ２８リガンドなどの他の共刺激因子を加えることにより細胞を共刺激することもできる。

核酸が形質導入される対象細胞を含有する細胞集団は、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物の末梢血、骨髄または臍帯血から採取され得る。必要に応じて、Ｔ細胞および／または、Ｔ細胞に分化し得る細胞を分画または富化した後に本開示に使用することができる。核酸が例えば癌の治療に使用される細胞に導入される場合、細胞集団は、治療される患者、またはＨＬＡ型が患者ものと一致するもしくは類似するドナーから採取することができる。非ＨＬＡ適合ドナー細胞も、形質導入されたＴＣＲがレシピエントの細胞上の、例えば、目的ペプチドが腫瘍関連抗原由来である場合には癌細胞上の、ＨＬＡ／ペプチド複合体を認識する限り、使用することができる。

本開示では、ＴＣＲ鎖をコードする核酸を形質導入された細胞集団は、目的ペプチドに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞を含み得る。このようなＴ細胞で発現されるＴＣＲは、形質導入された核酸から発現されるＴＣＲ鎖およびＴ細胞で内在的に発現される別のＴＣＲ鎖からなる。このようにして得られる細胞集団は、目的ペプチド、目的ペプチド、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカインを提示する抗原提示細胞およびサイトカインまたはケモカイン産生能を有する細胞からなる群から選択される少なくとも１つの刺激因子で刺激することができる。

適当な目的ペプチドが付加されたペプチド提示能を有する細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、およびＢ細胞など）、目的ペプチドを発現するように遺伝子が導入された細胞、または目的ペプチドを提示する、生物体から採取された細胞を抗原提示細胞として使用することができる。加えて、人工抗原提示細胞（ＷＯ２００３／０６５９７７参照）が本開示において使用することができる。

本明細書で使用する場合、用語「ａＡＰＣ」は、人工抗原提示細胞を意味する。ａＡＰＣは、抗原ペプチド（例えば、ＨＬＡに対する目的ペプチド）および場合により共刺激分子を、ペプチドおよび／または共刺激分子がＴＣＲ活性化のために接近可能となるように表面に提示するように改変された任意の細胞（線維芽細胞、またはその抗原提示フラグメントを含む）であり得る。ａＡＰＣはまた、目的ペプチド（例えば、ＨＬＡの対して）を含んでなるビーズもしくは担体、またはペプチド特異的様式でＴ細胞を刺激し得る任意の薬剤であってもよい。使用するａＡＰＣに共刺激分子が存在しない場合には、例えば、異種ＴＣＲを発現するＴ細胞に対して抗原を提示するアッセイにおいて、例えばａＡＰＣ機能を促進するために、抗ＣＤ３抗体などのサイトカイン抗体および他のＴＣＲシグナル伝達エフェクターを加えることができる。ａＡＰＣはＨＬＡの単一の対立遺伝子を含んでなり得、例えば、ＭＡＲＴ１についてはＨＬＡ−Ａ２およびＷＴ１についてはＨＬＡ−Ａ２４を含んでなるａＡＰＣが本明細書に記載される。

実施例に記載されるように、ａＡＰＣは、ＣＤ８０およびＣＤ８３などの共刺激リガンド、ならびにＨＬＡ分子および／またはＩＬ−２１、抗ＣＤ３抗体でされた、例えば、Ｋ５６２細胞などのＨＬＡヌル細胞を含み、例えば、ここで、前記刺激分子およびＨＬＡ複合ペプチドはビーズに結合される。

本明細書では、目的ペプチドは、腫瘍抗原、細菌抗原またはウイルス抗原に由来するペプチドまたはグリコペプチドである。目的ペプチドは、精製または単離されたペプチドであり得る。目的ペプチドは、抗原ペプチドを含有する腫瘍細胞抽出物、もしくは腫瘍細胞音波処理物および腫瘍細胞温水抽出物、または細菌もしくはウイルスの処理材料から得られるペプチドであり得る。目的ペプチドには、腫瘍抗原ペプチド、例えば、任意のＴ細胞定義腫瘍抗原（例えば、癌生殖細胞系遺伝子由来ペプチドを含む）、悪性腫瘍において発現される分化抗原、腫瘍において過剰発現される抗原（例えば、Schultz et al., 2000; Vigneron et al., 2005; Tomita et al., 2011; Vigneron et al., 2012; Ma et al., 2011; Corbiere et al., 2011; Dalet, Stroobant et al., 2011; Charpiro et al., 2006; Guillaume et al., 2010; Dalet, Robbins et al., 2011; Vigneron et al., 2004; Skipper et al., 1996; Hanada et al., 2004; Chaux et al., 1999;およびZarour et al., 2000に記載される抗原）が含まれる。例えば、癌細胞により発現されるが正常細胞によっては発現されず、かつ、Ｔ細胞に提示され得るいずれの抗原に由来するペプチドも使用可能である。

細胞を生産するための本開示の方法では、細胞培養に必要な、例えば、リンパ球培養に好適な成分を混合することにより調製される周知の培養培地、例えば、市販の培養培地を適宜選択し使用することができる。これらの培養培地は、その原成分に加えてサイトカイン、適当なタンパク質およびその他の成分を含んでよい。好ましくは、ＩＬ−２サイトカインを含有する培養培地が使用される。培養培地中のＩＬ−２の濃度には特に制限はないが、それは例えば、好ましくは、０．０１〜１×１０^５Ｕ／ｍＬ、より好ましくは１〜１×１０^４Ｕ／ｍＬであり得る。加えて、例えば、フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたは抗ＩＬ−４抗体が適当なタンパク質として使用可能である。

本開示において選択される細胞の生産方法に使用される細胞培養器具には特に制限はない。例えば、プレート、フラスコ、バッグ、大培養容器、またはバイオリアクターなどが使用可能である。例えば、ＣＯ_２ガス透過細胞培養バッグをバックとして使用することができる。加えて、培養は開放系または閉鎖系で行うことができるが、選択される細胞の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。

培養培地中に含まれるＣＤ３リガンドまたはフィブロネクチンフラグメント、適当なタンパク質、サイトカインまたはその他の成分などの共刺激因子は、培養培地中に共存させるために溶解させることに加え、適当な固相、例えば、プレート、フラスコおよびバッグ、細胞培養支持体、例えば、ビーズ、膜またはスライドガラスなどの細胞培養器具上に固定化されてもよい。これらの固相の材料には、それが細胞培養に使用可能である限り、特に制限はない。

本明細書では、サイトカインは、それがリンパ球に作用してリンパ球を活性化し得る限り、特に制限はないが、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、ＣＤ４０Ｌ、およびＩＬ−２７などが例として示され、細胞性免疫の増強の観点からは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１が例として特に好ましく示される。

本明細書では、サイトカインを産生し得る細胞には特に制限はないが、例えば、細胞性免疫の増強の観点からは、Ｔｈ１細胞が例として示される。

本開示の方法により得られる細胞に抗原刺激を加えることにより、極めて高い細胞傷害活性と高い抗原認識能を有する有用な抗原特異的リンパ球の誘導が可能である。本開示で生産される細胞は生物体内で長期にわたって生存可能であり、高い治療効果を有する極めて有用な細胞であり得る。

本明細書では、細胞または細胞集団の生産は細胞または細胞集団の培養と同義であり、細胞または細胞集団の誘導（活性化）、維持、拡大増殖の各工程、および／またはこれらを組み合わせた工程を含んでなるプロセスを意味する。

本開示において細胞を生産するための方法は、核酸で形質導入された細胞集団から、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する細胞を選択、分離または単離する工程をさらに含んでなり得る。この工程は、目的ペプチドおよび主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の複合体（四量体または多量体）（例えば、ＭＨＣ四量体アッセイを使用）を使用することにより、または細胞の特性、例えば、目的ペプチドを提示する細胞に対する応答（細胞傷害性またはサイトカインの放出など）に基づく方法により行うことができる。加えて、本開示は、低い同種異系応答を有するＴＣＲを発現する細胞を選択、分離または単離する工程を含んでなる。

例えば、実施例３に示されるように、ヒトＴ細胞における抗原反応性および同種異系反応性は、ＴＣＲの一次構造を調整することにより分子レベルで分離することができる。ＷＴ１−特異的ＴＣＲクローンであるＴＡＫ１は、ＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２／ＷＴ１２３５−２４３（Ａ２４／ＷＴ１）を認識するとともに、ＨＬＡ−Ｂ^＊５７：０１（Ｂ５７）に対するアロ反応性を有する。ＴＲＡＶ３６ ＴＣＲα鎖とともに再構成されたＴＡＫ１β鎖で形質導入されたＴ細胞はＡ２４／ＷＴ１とＢ５７の両方に対して反応性であることが示されているが、非ＴＲＡＶ３６ ＴＣＲα鎖とともに再構成されたＴＡＫ１β鎖はＡ２４／ＷＴ１に対して反応性を示したがＢ５７に対しては反応性を示さず、よって、クロノタイプＴＣＲの抗原特異的反応性とアロ反応性は、ＴＣＲの一次構造を調整することによって分離可能である。

例えば、同種異系反応性の低いＴ細胞は、サイトカインＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて特異的な同種異系（非自己）ＨＬＡ分子を発現する抗原提示細胞に対する反応性の低下に基づいて(based based on)選択することができる。アロ反応性を決定するためには、種々の同種異系ＨＬＡ分子を発現する抗原提示細胞のパネルに対して、どの特異的ＨＬＡ分子がアロ反応性に関連するかを特定するためのスクリーニングを行うことができる。実施例に示されるように、Ｂ５７は、Ａ２４拘束性ＷＴ１（２３５−２４３）ペプチド特異的ＴＣＲとしてのクローンＴＡＫ１にアロ反応性を付与する。Ｂ５７は、未知のＨＬＡ拘束性および抗原特異性を有する他のクローン性ＴＣＲにアロ反応性を付与することができる。

（３）ＴＣＲを発現する細胞を含んでなる細胞集団および障害を治療するための方法
本開示は、（２）に記載される方法により得られた目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する細胞を含んでなる細胞集団に関する。加えて、本開示は、（１）に記載される方法によって得られた核酸ペアによりコードされるＴＣＲを発現する細胞を含んでなる細胞集団に関する。

さらに、本開示は、対象に治療上有効な量の前記細胞集団を投与する工程を含んでなる、障害を治療するための方法に関する。

また、障害を治療するための、本明細書に記載の方法を用いて生産された核酸、組成物および／または細胞集団の使用も提供する。もう１つの面は、障害を治療するための、本明細書に記載の方法を用いて生産された核酸、組成物または細胞集団である。

本開示の方法により生産された細胞集団は、目的ペプチドを認識する細胞を含んでなる細胞集団である。例えば、このような細胞集団は、それがＴＣＲにより認識されるペプチドを提示する細胞に対して細胞傷害活性を提供することから、種々の障害の治療に有用である。細胞集団または細胞集団を含んでなる組成物が投与される障害には特に制限はないが、例えば、癌（白血病、および固形腫瘍など）、肝炎、ウイルス（インフルエンザウイルス、またはＨＩＶなど）、細菌（結核菌、ＭＲＳＡ、またはＶＲＥなど）、真菌（アスペルギルス属、カンジダ属、およびクリプトコッカス属など）により引き起こされる感染性疾患が例として示される。加えて、本開示の方法により生産された細胞集団はまた、再発性白血病の寛解を達成することを目的とするドナーリンパ球注入などにも使用可能である。

一例では、ＥＢＶ血清反応陽性血液ドナーから生成されたエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を使用して、最良のＨＬＡ適合と特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性に基づき、ＥＢＶ陽性移植リンパ増殖性疾患を有する患者の治療に成功している(Barker et al., 2010, Haque et al., 2007)。Haque et al, 2007は、３３名の患者のうち１４名が完全寛解を達成し、３名が部分寛解を示し、１６名が応答しなかったことを報告している。ＣＴＬを受容した、より近いＨＬＡ適合を有する患者は、より良好に応答した。

感染細胞、例えば、形質導入され、かつ、ヘテロＴＣＲを発現する組換えＴ細胞は、レシピエント由来、ＨＬＡ適合性でなくてもよい。しかしながら、形質導入されたＴＣＲは、レシピエントの細胞、例えば、目的ペプチドが癌ペプチドである場合には癌細胞上のＨＬＡ／ペプチド複合体を認識しなければならない。ゆえに、対象細胞（例えば、癌細胞）は、目的ペプチドを認識するためにヘテロＴＣＲにより使用されるＨＬＡ型を発現しなければならない。ペプチドおよびＨＬＡに応じて、ドナー細胞は、例えば、６、７、８または９の適合ＨＬＡを含んでなり得る。

浸潤したまたは浸潤するであろう細胞の集団は、場合により同じまたは異なる目的ペプチドに向けられる、種々のヘテロＴＣＲＳを発現する細胞を含んでなり得る。

さらに、本開示は、有効成分として上記細胞集団および／または単離された、かつ／または組換え操作された核酸を、場合により薬学上許容可能な担体と組み合わせて含んでなる医薬組成物（治療薬）を提供する。用語「薬学的に許容可能な」とは、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合って、過度な毒性、刺激作用、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症なく、ヒトおよび動物の組織と接触させる場合の使用に好適な化合物、材料、組成物、および／または投与形を意味する。

前記細胞集団を含有する治療薬は、免疫療法における使用に適当である。免疫療法では、患者の治療に適当な細胞が、例えば、経静脈、経動脈、皮下、または腹膜内注射または点滴などを介して投与される。前記治療薬は、上述の障害またはドナーリンパ球注入に使用され得る。前記治療薬は、有効成分としての本開示の方法により作製された細胞集団と非経口投与に適当な周知の有機または無機担体、希釈剤、または安定剤などを混合することにより、製薬分野で周知の方法に従う例えば点滴剤または注射剤として調製することができる。治療薬中の本開示の細胞集団の含量は、治療薬の用量および治療薬の条件は、周知の免疫療法に従って適宜決定することができる。例えば、医薬中の本開示の細胞集団の含量に特に制限はないが、細胞濃度は好ましくは、１×１０^３〜１×１０^１１細胞／ｍＬ、より好ましくは１×１０^４〜１×１０^１０細胞／ｍＬ、いっそうより好ましくは１×１０^５〜１×１０^９細胞／ｍＬであり得る。加えて、本開示の医薬の用量に特に制限はないが、例えば、成人用量は、好ましくは１×１０^６〜１×１０^１２細胞／日、より好ましくは１×１０^７〜５×１０^１１細胞／日、いっそうより好ましくは１×１０^８〜２×１０^１１細胞／日であり得る。加えて、免疫療法と治療薬および周知の医薬の投与による医薬療法または放射線療法もしくは外科術による処置の組合せが使用可能である。

本開示はさらに、対象に上述の方法により得られる有効量の細胞集団を投与することを含んでなる障害の治療または予防方法を提供する。本明細書において対象に特に制限はないが、好ましくは、本開示の方法により作製された細胞集団が投与される上述の障害を有する生物（例えば、ヒト患者、または非ヒト動物）が示される。有効成分として、ＴＣＲをコードする核酸が導入される細胞集団を含有する本開示の治療薬は、細胞集団により発現されるＨＬＡ分子と同一であるか、または３つまでの遺伝子座ミスマッチを有するＨＬＡ分子を発現する対象に投与される。

一実施態様では、細胞集団は、投与前に精製される。

本明細書で使用する場合、用語「精製された細胞集団」とは、本明細書で使用する場合、混合されたまたはヘテロな細胞集団および／または培養培地などの他の成分から取り出され、かつ、分離された（例えば、単離された）細胞集団を意味する。いくつかの実施態様では、精製された細胞集団は、細胞がそれから単離または付加されたヘテロな集団に比べて、形質導入細胞の実質的に純粋な集団である。

特定の細胞集団に関して用語「実質的に純粋な」とは、全細胞集団を構成する細胞に対して少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の純度である細胞集団を意味する。同様に、「実質的に純粋な」集団に関して、形質導入されていない細胞を約３０％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％、１０％、８％、７％未満、最も好ましくは約５％、４％、３％、２％、１％未満、または１％未満しか含まない細胞集団を意味する。

用語「治療」は、本明細書で使用する場合、対象に適用される場合、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得ることを目的としたアプローチを意味し、例えば、薬学的介入、手術、放射線療法および自然療法的介入ならびに検査処置を含む医療行為および適用が含まれる。有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、検出可能であれ検出不能であれ、１以上の症状または病態の緩和または改善、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（すなわち、増悪しない）状態、疾患の拡散の回避、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または軽減、および寛解（部分的であれ完全であれ）を含み得る。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予想される生存期間に比べて生存期間を延長することを意味し得る。

加えて、用語「有効量」とは、本明細書で使用する場合、細胞集団が投与されなかった対象に比べて、細胞集団が対象に投与される場合に、治療または予防効果を発揮する細胞集団の量である。具体的な有効量は投与形、投与方法、使用目的、対象の齢および体重、および症状などに応じて異なる場合があり、好ましくは、それは上述の医薬と同様である。投与方法も限定されないが、上記医薬と同様に、例えば、点滴、または注射などによる投与が好ましい。

本明細書では、別の面において、ヘテロＴＣＲを含んでなる細胞、前記細胞を含んでなる細胞集団、治療薬、抗体および／または有毒部分などの薬剤とコンジュゲートされたヘテロＴＣＲを含んでなる薬剤、一本鎖ヘテロＴＣＲをコードする核酸および／またはヘテロＴＣＲをともにコードする核酸ペア、または症状を緩和するおよび／または対象、場合により、ヘテロＴＣＲにより認識されるペプチドを発現する癌もしくは他の疾患に罹患している対象を治療するための上述の製品の１つを含んでなる医薬組成物の使用が提供される。

例えば、ＴＣＲ遺伝子改変Ｔ細胞の養子免疫移入が癌免疫療法に使用され得る。実施例２に示されるように、ＳＩＧ３５α形質導入Ｔ細胞の養子免疫移入がＡ２＋ ＭＡＲＴ１＋腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏ増殖を阻害することも示された。この戦略はまた、Ａ２／ＮＹＥＳＯ−１およびＡ２／Ｈｅｒ２を含む、他のタイプの悪性腫瘍で発現されるペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の生成においても使用された。

（４）単離された分子
本開示はまた、例えば、本明細書に記載の配列の１以上を含む、新規なＴＣＲ鎖およびＣＤＲ３領域ポリペプチド、ならびにそのようなＴＣＲ鎖およびＣＤＲ３領域をコードする核酸を提供する。配列番号７３で表されるＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する細胞は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＳＩＧ３５α鎖をコードする核酸を使用することで得ることができる。得られるＴ細胞で発現されるＴＣＲはＳＩＧ３５α鎖および、形質導入細胞で内在的に発現されるβ鎖によって形成される。例えば、クローン７９４およびクローン８３０はそれぞれ、ＳＩＧ３５α鎖および内在的に発現されるＴＣＲβ鎖から構成され、ＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドに対して高いアビディティーを有するＴＣＲを発現する。クローン７９４（配列番号４）およびクローン８３０（配列番号６）のＴＣＲβ鎖をコードする単離されたおよび／または組換え操作された核酸が本開示に含まれる。同様に、配列番号７４で表されるＷＴ１_{２３５−２４３}ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する細胞は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＴＡＫ１β鎖をコードする核酸を使用することにより得ることができる。クローンＴ５３、クローンＡ２６２、クローンＴ２４３およびクローンＴ２６２はそれぞれ、ＴＡＫ１β鎖および内在的に発現されるＴＣＲα鎖から構成され、ＷＴ１_{２３５−２４３}ペプチドに対して高いアビディティーを有するＴＣＲを発現する。クローンＴ５３（配列番号８）、クローンＡ２６２（配列番号１０）、クローンＴ２４３（配列番号１２）およびクローンＴ２６２（配列番号１４）のＴＣＲα鎖をコードする核酸が本開示に含まれる。加えて、クローン８Ｈ、クローン７Ｑおよびクローン９Ｊはそれぞれ、ＳＩＧ３５α鎖および内在的に発現されるＴＣＲβ鎖から構成され、ＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドに対して高いアビディティーを有するＴＣＲを発現する。単離されたおよび／または組換え操作された、クローン８Ｈ（配列番号９４）、クローン７Ｑ（配列番号９６）およびクローン９Ｊ（配列番号９８）のＴＣＲβ鎖をコードする核酸が本開示に含まれる。

用語「組換え操作された」とは、本明細書で使用する場合、例えばｃＤＮＡなどの、組換え技術を用いて作製され、かつ、天然には存在しない実体、形質導入された細胞、標識された核酸（例えば、蛍光または放射性標識による標識）、キメラ核酸およびポリペプチドなどを意味する。

別の面において、本開示は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜９１、９４、９６、９８、１１２、１１４、１１６〜１２２から選択される配列および／または配列番号４、６、８、１０、１２、１４、５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜９１、９４、９６、９８、１１２、１１４、１１６〜１２２から選択される配列から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列またはＣＤＲ領域もしくは非ＣＤＲ領域などのその一部を含んでなる、単離されたおよび／または組換え操作されたポリペプチドを含む。一実施態様では、ポリペプチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、５１、５３、５５、５７、５９、６１、９３、９５、９７、１１１、１１３、１１５のいずれか１つから選択される核酸および／または配列番号３、５、７、９、１１、１３、５１、５３、５５、５７、５９、６１、９３、９５、９７、１１１、１１３、１１５から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、および／または例えばＣＤＲ領域もしくは非ＣＤＲ領域をコードするその一部によりコードされる。一実施態様では、このポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜９１、９４、９６、９８、１１２、１１４、１１６〜１２２のいずれか１つの配列を含んでなる。

さらなる面は、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜９１、９４、９６、９８、１１２、１１４および１１６〜１２２のいずれか１つに特異的な抗体または結合そのフラグメントを含む。抗体を作製するための方法は当技術分野で公知である。一実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。一実施態様では、抗体はポリクローナル抗体である。

さらに別の面では、本開示は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、５１、５３、５５、５７、５９、６１、９３、９５、９７、１１１、１１３および１１５のいずれか１つに示される配列を含んでなる単離されたおよび／または組換え操作された核酸を含む。

別の面は、配列番号５２、５４、５６、５８、６０ ６２および８１〜９１、９４、９６、９８、１１２、１１４および１１６〜１２２から選択されるＣＤＲ３配列を含んでなる、単離されたおよび／または組換えＴＣＲポリペプチド鎖を含む。

さらなる面は、ＣＤＲ３領域が配列番号５２、５４、８１〜９１、１１２、１１４および１１６〜１２２のいずれか１つを含んでなる、単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲβ鎖ポリペプチドを含む。

ＣＤＲ３領域が配列番号５２、５４、８１〜９、１１２、１１４および１１６〜１２２のいずれか１つを含んでなるＴＣＲβ鎖ポリペプチドを含んでなる、単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲを含む。

また、ＣＤＲ３領域が配列番号５６、５８、６０および６２のいずれか１つを含んでなる、単離された、かつ／または組換え操作されたＴＣＲα鎖ポリペプチドも提供される。

別の面は、ＣＤＲ３領域が配列番号５６、５８、６０および６２のいずれか１つを含んでなるＴＣＲα鎖ポリペプチドを含んでなる、単離された、かつ／または組換え操作されたＴＣＲを含む。

一実施態様では、単離されたＴＣＲポリペプチド鎖は、表１に示されるいずれかのアミノ酸配列を含んでなり、および／またはそれらから選択される。

別の実施態様では、ＴＣＲポリペプチド鎖は、表１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、例えば、配列番号１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、１００、１０２または１０４から選択される配列を有するＣＤＲ１領域；表１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、例えば、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、１０６、１０８または１１０から選択される配列を有するＣＤＲ２領域；および表１に示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、例えば、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、８７〜９２および１１１〜１２２から選択される配列を有するＣＤＲ３領域を含んでなる。

一実施態様では、ＴＣＲαポリペプチド鎖は、配列番号２０の配列を含んでなるＣＤＲ１領域、配列番号３６の配列を含んでなるＣＤＲ２領域、および配列番号５２の配列を含んでなるＣＤＲ３領域を含んでなる。別の実施態様では、ＴＣＲβポリペプチド鎖は、配列番号２２の配列を含んでなるＣＤＲ１領域、配列番号３８の配列を含んでなるＣＤＲ２領域、および配列番号５４の配列を含んでなるＣＤＲ３領域を含んでなる。さらに別の実施態様では、ＴＣＲαポリペプチド鎖は、配列番号２４の配列を含んでなるＣＤＲ１領域、配列番号４０の配列を含んでなるＣＤＲ２領域、および配列番号５６配列を含んでなるＣＤＲ３領域を含んでなる。別の実施態様では、ＴＣＲαポリペプチド鎖は、配列番号２６の配列を含んでなるＣＤＲ１領域、配列番号４２の配列を含んでなるＣＤＲ２領域、および配列番号５８の配列を含んでなるＣＤＲ３領域を含んでなる。一実施態様では、ＴＣＲαポリペプチド鎖は、配列番号２８の配列を含んでなるＣＤＲ１領域、配列番号４４の配列を含んでなるＣＤＲ２領域、および配列番号６０の配列を含んでなるＣＤＲ３領域を含んでなる。さらに別の実施態様では、ＴＣＲαポリペプチド鎖は、配列番号３０の配列を含んでなるＣＤＲ１領域、配列番号４６の配列を含んでなるＣＤＲ２領域、および配列番号６２の配列を含んでなるＣＤＲ３領域を含んでなる。

一実施態様では、単離されたＴＣＲポリペプチド鎖は、標識またはタグを含んでなる組換えＴＣＲである。一実施態様では、ポリペプチドは、本明細書に記載の配列から少なくとも１つのアミノ酸の違いを含んでなる。

一実施態様では、単離されたＴＣＲポリペプチド鎖は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、９４、９６および９８から選択される配列を含んでなる。

また、前記ＴＣＲ鎖ポリペプチドのうちの１つ、場合によりタグまたは標識を含んでなるものをコードする単離された核酸分子が提供される。一実施態様では、核酸は、場合により本明細書に記載の配列から少なくとも１つのヌクレオチドの違いを含んでなり、前記ヌクレオチドの違いは、少なくとも１つのアミノ酸鎖をコードする。

一実施態様では、ＴＣＲポリペプチド鎖をコードする単離された核酸は、表１に示されるいずれかの核酸配列を含んでなり、かつそれらから選択される。

別の面は、ＴＣＲαポリペプチドおよびＴＣＲβポリペプチドを含んでなるＴＣＲを含んでなる単離された、および／または組換え操作された細胞を含み、前記ＴＣＲβ鎖ポリペプチドは、配列番号５２、５４、８１〜９１、１１２、１１４および１１６〜１２２のいずれか１つから選択される配列を有するＣＤＲ３領域を含んでなる。

本開示の別の面は、ＴＣＲαポリペプチドおよびＴＣＲβポリペプチドを含んでなるＴＣＲを含んでなる単離されたおよび／または組換え操作された細胞であり、前記ＴＣＲαポリペプチド鎖は、配列番号５６、５８、６０および６２のいずれか１つから選択される配列を有するＣＤＲ３領域を含んでなる。

一実施態様では、単離されたおよび／または組換え操作された細胞は、配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜９１、１１２、１１４および１１６〜１２２のいずれか１つを含んでなるＴＣＲ鎖をコードする核酸を含んでなる。

一実施態様では、核酸は、場合により、水および／またはバッファーなどの希釈剤と組み合わせた組成物中に含まれる。

一実施態様では、前記ポリペプチドは、場合により脂質膜を含んでなる組成物中に含まれる。一実施態様では、前記ポリペプチドは、ＣＤ３との複合体中に含まれる。一実施態様では、前記複合体は、ＴＣＲ（場合により、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）と、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２本のＣＤ３ε鎖からなるＣＤ３を含んでなる。

一実施態様では、細胞は、場合により等張バッファーを含んでなる組成物中に含まれる。

別の面は、ペアをなす核酸は、単離された、組換え操作されたＴＣＲを提供するために使用される。

本明細書では、「ＩＭＧＴ命名法」を参照する。ＩＭＧＴ命名法は、本明細書で使用する場合、免疫グロブリン、ＴＣＲ、ＨＬＡを含むＭＨＣの命名に関しては、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍにより使用されている命名法を意味し、また、ＨＬに関しては下記の規則に従う。最初の３文字は遺伝子座を示す。４番目の文字は、Ｖ、Ｄ、Ｊ、またはＣ領域を示す。次の数字または文字の組合せで遺伝子の明確な同定ができる。対立遺伝子は、アスタリスクとその後の２桁の数字で表される(D1222-D1227 Nucleic Acids Research, 2013, Vol. 41, Database issue, The IMGT/HLA database, James Robinson)。上記の開示は一般に本出願を記載する。より完全な理解は下記の具体例を参照することにより得られる。これらの例は単に例示のために記載され、本出願の範囲を限定するものではない。状況が得策であることを示唆または表す限り、形態の変更および等価物の置換が企図される。特定の用語が本明細書で使用されているが、このような用語は記述を意図するものであって、限定を目的とするものではない。

以下の限定されない例は本開示の例である。

本開示をさらに実施例によりさらに詳しく説明するが、本開示はそれらに限定されない。

実施例１
細胞
ＰＧ１３細胞株およびｐｈｏｅｎｉｘ−ｅｃｏ細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭ培地で培養した。ＣＤ８αβおよび固有のＴＣＲ分子の発現を欠くＪｕｒｋａｔ細胞サブクローンであるＪｕｒｋａｔ７６細胞株を、１０％ＦＣＳおよび５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。ＣＤ８０遺伝子およびＣＤ８３遺伝子で形質導入されたＨＬＡ−ヌルＫ５６２細胞を、ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１遺伝子またはＨＬＡ−Ａ^＊２でさらに形質導入し、ａＡＰＣとして使用した。いくつかの実験では、２２７および２２８の位置に２つのアミノ酸置換（Ｄ２２７Ｋ／Ｔ２２８Ａ）を有する突然変異ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１遺伝子および野生型ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１遺伝子の代わりにヒトＩＬ−２１遺伝子で形質導入された突然変異ａＡＰＣ細胞を使用した。ａＡＰＣ細胞もまた、１０％ＦＣＳおよび５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。特に、ＨＬＡクラスＩ分子の代わりにα−ヒトＣＤ３ ｍＡｂ（クローンＯＫＴ３）の膜型の重鎖および軽鎖で形質導入されたｍＯＫＴ３−ａＡＰＣ細胞を、１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８スルフェート（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、２．５μｇ／ｍＬピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得たＳｕｐＴ１細胞およびＴ２細胞を、１０％ＦＣＳおよび５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０で培養した。ＡＴＣＣから得た黒色腫細胞株Ａ３７５（ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１^＋、ＭＡＲＴ１⁻）およびＭａｌｍｅ−３Ｍ（ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１^＋、ＭＡＲＴ１^＋）を、１０％ＦＣＳおよび５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭで培養した。健常ボランティアから末梢血単核細胞を単離し、使用まで液体窒素中で保存した。

ＳＩＧ３５α、ＴＡＫ１αおよびＴＡＫ１βレトロウイルスベクターの構築
ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１拘束およびＭＡＲＴ１_{２７−３５}（Ａ２／ＭＡＲＴ１）特異的ＴＣＲからクローニングされ、ＳＩＧ３５αと呼称されるＴＣＲα鎖が、公開されたＴＣＲα鎖として報告されている(Dietrich et al., 2003, Trautmann et al., 2002, Li et al., 2010)。ＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２拘束およびＷＴ１_{２３５−２４３}（Ａ２４／ＷＴ１）特異的ＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子を確立されたＣＴＬクローンＴＡＫ１から、５’ ＲＡＣＥ法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてクローニングした。ＳＩＧ３５α遺伝子はＴＲＡＶ１２−２／ＴＲＡＪ３５／Ｃαであり、ＴＡＫ１のＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子はそれぞれＴＲＡＶ２０／ＴＲＡＪ３３／ＣαおよびＴＲＢＶ５．１／ＴＲＢＤ２／ＴＲＢＪ２−１／Ｃβ２である。ＳＩＧ３５α、ＴＡＫ１αおよびＴＡＫ１β遺伝子のコドンを最適化し、各遺伝子をフューリン切断配列、ｓｇｓｇリンカーおよび***ウイルス（Ｆ２Ａ）ペプチド、次いで、末端切断型ＮＧＦＲ遺伝子（ΔＮＧＦＲ）と連結し、この構築物をｐＭＸレトロウイルスベクターに組み込んだ。エコトロピックレトロウイルスベクターを、ＴｒａｎｓＩＴ２９３（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を用いた、ＳＩＧ３５α／ΔＮＧＦＲ、ＴＡＫ１α／ΔＮＧＦＲまたはＴＡＫ１β／ΔＮＧＦＲレトロウイルスプラスミドのｐｈｏｅｎｉｘ−ｅｃｏ細胞株への一時的トランスフェクションにより得、次いで、ＰＧ１３細胞株に前記エコトロピックレトロウイルスベクターで形質導入し、クローニングした。安定なＰＧ１３細胞株から高力価ＧａＬＶ偽型レトロウイルスベクターを得、ヒト末梢Ｔ細胞への形質導入に用いた。

ＴＣＲ遺伝子で形質導入されたＴ細胞の確立
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健常なボランティアから単離し、形質導入の３日前に１００ＩＵ／ｍＬヒトＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）の存在下で、５０ｎｇ／ｍＬ α−ヒトＣＤ３ ｍＡｂ（クローンＯＫＴ３）で刺激した。次に、３２℃、１０００ｇで１時間、遠心分離を行うことにより、次の６日間、Ｔ細胞にＳＩＧ３５α／ΔＮＧＦＲレトロウイルスベクターを形質導入した。形質導入後のＡ２／ＭＡＲＴ１特異的Ｔ細胞の頻度を測定するために、細胞をα−ヒトＣＤ８ ｍＡｂ（クローンＢ９．１１；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、α−ヒトＮＧＦＲ ｍＡｂ（クローンＭＥ２０．４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＰＥコンジュゲートＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１／ＭＡＲＴ１_{２６−３５}ヘテロクリティック多量体（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）、ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１／ＨＩＶ ｐｏｌ_{４７６−４８４}多量体（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ）またはＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１／Ｆｌｕ_{５８−６６}多量体で標識した。他の実験では、ＴＡＫ１α／ΔＮＧＦＲ遺伝子またはＴＡＫ１β／ΔＮＧＦＲ遺伝子もどのＴＣＲ鎖がＡ２４／ＷＴ１特異性の指定に主要な役割を持つかを調べるために、上記のように刺激済みのＴ細胞に形質導入した。形質導入後のＷＴ１特異的Ｔ細胞の陽性を評価するために、細胞を上記抗体およびＰＥコンジュゲートＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２／ＷＴ１_{２３５−２４３}ヘテロクリティックな四量体またはＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２／サバイビン−２Ｂ_{８０−８８}四量体で標識した。標識された細胞を、ＣＡＮＴＯ（商標）ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＦｌｏｗＪｏバージョン７．６．４ソフトウエア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて分析した。四量体およびＣＤ８^＋遺伝子改変Ｔ細胞の頻度は、ΔＮＧＦＲ^＋細胞のゲート設定により分析した。

遺伝子改変Ｔ細胞のａＡＰＣ細胞での刺激
抗原特異的Ｔ細胞株を確立するために、ＣＤ８^＋遺伝子改変Ｔ細胞をＣＤ８^＋Ｔ細胞単離キット（ＭＡＣＳ（商標）ビーズ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）により得た。Ａ２／ＭＡＲＴ１特異的ＣＤ８^＋遺伝子改変Ｔ細胞の拡大増殖のために、野生型ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１分子を発現するｗｔＡ２−ａＡＰＣ細胞または野生型ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１の代わりに上記の突然変異ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１分子およびヒトＩＬ−２１を発現するｍｕｔＡ２−ａＡＰＣ細胞を１０μｇ／ｍＬ ＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチド（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列番号７３）でパルス処理した。Ａ２４／ＷＴ１特異的ＣＤ８^＋遺伝子改変Ｔ細胞、ＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２分子を発現するＡ２４−ａＡＰＣ細胞を、１μｇ／ｍＬ ＷＴ１_{２３５−２４３}ヘテロクリティックなペプチド（ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ）（配列番号７４）でパルス処理した。ａＡＰＣ細胞は、無血清ＲＰＭＩ １６４０培地中、室温にて６時間、ペプチドでパルス処理した。次に、ａＡＰＣ細胞に２０，０００ラッドを照射し、洗浄し、２４ウェルプレートの、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１０％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を添加したＲＰＭＩ中に１：２０の比で精製したＣＤ８^＋遺伝子改変Ｔ細胞に加えた。翌日、再指向ＣＤ８^＋Ｔ細胞培養物に、３〜４日毎に低用量のヒトＩＬ−２（１０ＩＵ／ｍＬ）およびヒトＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加した。７日毎に繰り返し刺激を行った。２回目の刺激の後、細胞株を各四量体陽性およびＩＦＮ−γ分泌について評価した。四量体およびＣＤ８^＋遺伝子改変Ｔ細胞の頻度をΔＮＧＦＲ^＋細胞のゲート設定により分析した。

Ａ２／ＭＡＲＴ１特異的遺伝子改変Ｔ細胞におけるＴＲＢＶ利用の分析
表１および２に示されるように、ＴＣＲ Ｖβサブタイプ分析は、Ａ２／ＭＡＲＴ１多量体^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対してＢｅｔａ Ｍａｒｋ ＴＣＲ Ｖβレパートリーキット（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて行った。ＴＣＲ Ｖβサブタイプ分析に用いた命名法は、Wei et al, 1994からのものである。

ＳＩＧ３５αとペアとしたＴＣＲβ鎖およびＴＡＫ１βとペアとしたＴＣＲα鎖のクローニング
ＴＲＩｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）を製造者の説明書に従って用い、ＳＩＧ３５α／ΔＮＧＦＲまたはＴＡＫ１β／ΔＮＧＦＲで形質導入されたＴ細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＴＲＢＶ２７を含み、ＳＩＧ３５αとペアをなした全長ＴＣＲβ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲにより、ＴＲＢＶ２７特異的フォワードプライマー５’−ＴＲＢＶ２７
およびβ定常領域特異的リバースプライマー３’−Ｃβ−１
および３’−Ｃβ−２プライマー
を用いて増幅した。ＴＡＫ１βとペアをなした全長ＴＣＲα遺伝子は次のようにクローニングした。簡単に述べれば、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ｃＤＮＡを作製した。初回のＰＣＲでは、ｃＤＮＡを、５’−ＲＡＣＥプライマーおよび３’−ＴＣＲα ＵＴＲ領域プライマー；
を用いて増幅した。２回目のセミネステッドＰＣＲでは、鋳型として最初のＰＣＲ産物、改変型の５’−ＲＡＣＥプライマー；
および３’−ＴＣＲａ定常領域プライマー；
を用いて行った。各ＴＣＲβまたはＴＣＲα鎖アンプリコンをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ反応によりｐＭＸレトロウイルスベクターにクローニングし、配列決定した。ＴＣＲβ遺伝子またはＴＣＲα遺伝子の名称はＩＭＧＴ独自遺伝子命名法に従う。クローニングされたｐＭＸ／ＴＣＲβプラスミドまたはｐＭＸ／ＴＣＲαプラスミドをそのまま形質導入に使用した。

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
９６ウェル平底ポリビニリデンジフルオリドプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、捕捉α−ヒトインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ｍＡｂ（クローン１Ｄ１Ｋ；ＭＡＢＴＥＣＨ）またはα−ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングし、一晩４℃でインキュベートした。２％ＦＣＳを添加したＰＢＳで洗浄した後、Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ １６４０培地中、ペプチドの存在下または不在下で、２．０×１０^４／ウェルの示されたＡＰＣとともに、３７℃で２０〜２４時間インキュベートした。使用したペプチドは、Ａ２／ＭＡＲＴに対しては１１０μｇ／ｍＬ ＭＡＲＴ１_{２７−３５}または１０μｇ／ｍＬ ＨＩＶ ｐｏｌ_{４７６−４８４}ペプチド、Ａ２４／ＷＴ１に対しては１μｇ／ｍＬ ＷＴ１_{２３５−２４３}ヘテロクリティックペプチドまたはＨＩＶ−１ ｅｎｖ_{５８４−５９２}ペプチドであった。インキュベーション後、プレートを洗浄し、ビオチンコンジュゲート検出α−ヒト ＩＦＮ−γ ｍＡｂ（７−Ｂ６−１；ＭＡＢＴＥＣＨ）またはα−ヒトＩＬ−２ ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）とともに４℃で一晩インキュベートした後、ＩＦＮ−γの場合にはＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（ＳＡ）またはＩＬ−２の場合にはＡＬＰコンジュゲートＳＡに曝した。特異的スポットを明らかにするために、ＩＦＮ−γの場合には３−アミノ−９−エチルカルバゾール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．０１５％Ｈ_２Ｏ_２を含有する１００μＬの０．１Ｍ酢酸バッファーまたはＩＬ−２の場合には１００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２およびニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）バッファーを各ウェルに加えた。４０分後、水で洗浄することにより呈色反応を中断させ、プレートを乾燥させた。拡散性の大きなスポットを、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）バージョン５．０．２ソフトウエア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて計数した。

Ａ２／ＭＡＲＴ１特異的ＴＣＲ反応性およびＡ２４／ＷＴ１特異的ＴＣＲ反応性の評価
Ａ２／ＭＡＲＴ１反応性を調べるために、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞株に、ＣＤ８αβ遺伝子を伴い、または伴わずにＳＩＧ３５α遺伝子でレトロウイルスによる形質導入を行った。これらの遺伝子の形質導入後、Ｊｕｒｋａｔ７６／ＳＩＧ３５αまたはＪｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８αβ／ＳＩＧ３５αトランスフェクト体に、ＴＣＲβ遺伝子（クローン：４１３、５２３、７８８、１０８６、８３０、または７９４）でさらに形質導入を行い、ヒトＣＤ３ ＭＡＣＳ（商標）ビーズシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で選別した。Ｊｕｒｋａｔ７６細胞株にはまた、ＣＤ８αβ遺伝子を伴い、または伴わずに、ＤＭＦ５と呼称されるＡ２／ＭＡＲＴ１特異的ＴＣＲでも形質導入を行った。Ｊｕｒｋａｔ７６／ＤＭＦ５ ＴＣＲトランスフェクト体およびＪｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８αβ／ＤＭＦ５ ＴＣＲトランスフェクト体もまた、ＤＭＦ５ ＴＣＲのＡ２／ＭＡＲＴ１反応性をＳＩＧ３５α／ＴＣＲβ ＴＣＲのそれと比較するために確立した。これらのＪｕｒｋａｔ７６トランスフェクト体を、Ａ２／ＭＡＲＴ１に対するＴＣＲの構造的アビディティーを評価するために、漸増濃度のＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１／ＭＡＲＴ１_{２７−３５}ヘテロクリティック多量体で染色した。機能的アビディティーは、ＩＬ−２ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて漸増濃度のＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドでパルス処理したＴ２細胞を刺激因子として用いて試験した。Ａ２４／ＷＴ１反応性を評価するために、Ｊｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８αβトランスフェクト体に、ＴＡＫ１β遺伝子で形質導入した。Ｊｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８αβ／ＴＡＫ１βトランスフェクト体に、ＴＣＲα遺伝子（クローン：Ｔ５３、Ａ２６２、Ｔ２４３、Ｔ２６２）または親ＴＡＫ１α遺伝子でさらに形質導入し、ＦＩＴＣコンジュゲートα−ヒトＶβ５．１ ｍＡｂ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびα−ＦＩＴＣ−ＭＡＣＳ（商標）ビーズシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で選別した。確立されたＪｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８αβ／ＴＡＫ１β／ＴＣＲα細胞株を、ＩＬ−２ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＡ２４／ＷＴ１反応性に関して評価した。いくつかの実験では、腫瘍細胞表面で天然にプロセシングされ、提示されたＡ２／ＭＡＲＴ１またはＡ２４／ＷＴ１の反応性を調べるためにこれらのＪｕｒｋａｔ７６トランスフェクト体を用いた。Ａ２／ＭＡＲＴ１特異的ＴＣＲに対してはＭａｌｍｅ−３Ｍ細胞を用い、Ａ２４／ＷＴ１特異的ＴＣＲに対してはＡ２４−ａＡＰＣ細胞を用いた。

実施例２：ＴＣＲ一本鎖遺伝子導入は高アビディティー抗腫瘍Ｔ細胞を生成する
ＴＣＲ遺伝子改変Ｔ細胞の養子免疫移入は技術的に実現可能であり、癌免疫療法に有望な処置である。しかしながら、胸腺選択および末梢性免疫寛容が、末梢Ｔ細胞から高親和性腫瘍反応性ＴＣＲを同定することを困難にする。高親和性ＴＣＲを効率的に単離するために、末梢Ｔ細胞に、単独でＨＬＡ拘束ペプチド特異性を指定することができる、単一のＴＣＲ鎖遺伝子（例えば、本明細書ではヘミチェーンとも呼ばれる）を導入することにより、胸腺無選択Ｔ細胞レパートリーを作製した。種々のクロノタイプＴＣＲβ鎖を発現する複数のＨＬＡＡ^＊０２：０１（Ａ２）／ＭＡＲＴ１ ＣＤ８＋ Ｔ細胞クローンから共有されるＴＣＲα遺伝子（クローンＳＩＧ３５α）を単離した。ＳＩＧ３５αで形質導入した場合、Ａ２＋およびＡ２−の両ドナーからの末梢ＣＤ８＋ Ｔ細胞はＡ２／ＭＡＲＴ１を認識し、Ａ２／ＭＡＲＴ１特異的様式で拡大増殖した。試験した総てのドナーで、Ａ２／ＭＡＲＴ１多量体＋細胞は主としてＴＲＢＶ２７ ＴＣＲβ鎖を発現し、それらのＣＤＲ３β配列は極めて多様であった（図２４および２５参照）。１１のクロノタイプＴＲＢＶ２７ ＴＣＲβ鎖が、ＣＤ８共受容体の存在下または不在下で、ヒトＴＣＲαβ欠損Ｔ細胞上でＳＩＧ３５αとともに個々に再構成された。これらのトランスフェクト体は広範な構造的および機能的アビディティー（＞２桁）を有していた。表６に示されるように、１１のトランスフェクト体のうち６つが、Ａ２／ＭＡＲＴ１ ＴＣＲを発現するもの、すなわち、クローンＤＭＦ５よりも高いアビディティーを示し、ＣＤ８非依存的にＡ２＋ ＭＡＲＴ１＋腫瘍細胞を認識した。ポリクローナルＳＩＧ３５α鎖で形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞の養子免疫移入は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡ２＋ ＭＡＲＴ１＋腫瘍細胞の増殖を阻害した。重要なことには、一本鎖ＴＣＲ遺伝子導入戦略は、Ａ２／ＮＹＥＳＯ−１およびＡ２／Ｈｅｒ２に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の生成に上手く拡張された。

実施例３：ヒトＴ細胞における抗原反応性および同種異系反応性の分子分離
同種異系造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）において、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）から白血病（ＧＶＬ）の影響を分離するための慣例の戦略はまだ無い。クロノタイプＴ細胞受容体（ＴＣＲ）はＭＨＣ拘束抗原特異的反応性を持つだけではなく同種異系ＭＨＣ拘束反応性（アロ反応性）も持つことが示されている。ＴＣＲの一次構造を調整することによって、Ｔ細胞によって引き起こされるＧＶＬおよびＧＶＨＤが分子レベルで分離可能であるかどうかが検討された。ビルムス腫瘍１（ＷＴ１）は、多くの腫瘍で過剰発現されるが、正常な細胞では過剰発現されない腫瘍関連抗原である。ＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２／ＷＴ１２３５−２４３（Ａ２４／ＷＴ１）を認識するとともにＨＬＡ−Ｂ^＊５７：０１（Ｂ５７）に対してアロ反応性を有するＷＴ１特異的ＴＣＲ、クローンＴＡＫ１が従前に単離された。ＴＡＫ１β鎖で形質導入されているがＴＡＫ１α鎖を持たない末梢Ｔ細胞は、２名のＡ２４陰性ドナーを含む、６名の供試ドナーの総てで、Ａ２４／ＷＴ１およびＢ５７の両方を認識した。重要なことには、ポリクローナルＴＡＫ１βで形質導入されたＴ細胞により示されたＡ２４／ＷＴ１反応性は、Ｂ５７アロ反応性とは相関が無かった。ＣＤ８α／β＋ ＴＣＲ−Ｔ細胞株上で、ＴＡＫ１β鎖とともに種々のＴＣＲα鎖から構成される４３のＡ２４／ＷＴ１および／またはＢ５７反応性ＴＣＲが再構成されていた。Ａ２４／ＷＴ１の反応性とＴＡＫ１β鎖とペアをなしたＴＲＡＶ３６ ＴＣＲα鎖のＢ５７アロ反応性には相関があったことが判明した（Ｒ２＝０．９０４、ｐ＜０．０００１）。これに対して、ＴＡＫ１β鎖とともに再構成された非ＴＲＡＶ３６ ＴＣＲα鎖のＡ２４／ＷＴ１およびＢ５７反応性は相関していなかった（Ｒ２＝０．０３１、ｐ＜０．４７１）。Ａ２４／ＷＴ１に対するクロノタイプ非ＴＲＡＶ３６ ＴＣＲα鎖の反応性の同定には成功したが、Ｂ５７では成功しなかった。これらの結果は、クロノタイプＴＣＲの抗原特異的反応性およびアロ反応性は、ＴＣＲの一次構造を調整することにより分離可能であることを示唆する。

Ａ２／ＭＡＲＴ１を認識するためには、クローンＳＩＧ３５αは、複数の明確に識別されるクロノタイプＴＣＲβ鎖とペアとすることができる。

参考文献

Claims (46)

1. 高親和性ＴＣＲ、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する組換え細胞および／または目的ペプチドに特異的なＴＣＲを形成し得るＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチド鎖をコードする核酸を得る方法であって、
   ａ．ＴＣＲを発現し得る細胞、および／またはＴＣＲを発現し得る細胞に分化し得る細胞を含んでなる細胞集団に、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖をコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、前記ベイトＴＣＲポリペプチド鎖は、前記目的ペプチドと特異的に結合するカウンター鎖ＴＣＲポリペプチド鎖とともに親ＴＣＲを構成し得るものである；
   ｂ．形質導入された細胞集団をベイトＴＣＲポリペプチド鎖の発現を許容する条件下で培養すること；ならびに
   ｃ．下記の１以上：
   ｉ）工程（ｂ）で得られた形質導入された細胞集団から、前記目的ペプチドと選択的に結合する、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖とプレイＴＣＲポリペプチド鎖を含んでなるＴＣＲを発現する組換え細胞を得ること；
   ｉｉ）工程（ｃ）（ｉ）で得られた細胞から、プレイＴＣＲポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を単離すること；および／または
   ｉｉｉ）工程（ｃ）（ｉｉ）において単離された、単離されたプレイ核酸と、発現された際に高親和性ＴＣＲを提供するベイト核酸をペアとすること
   を含んでなる、方法。
2. 工程（ｂ）で得られた形質導入された細胞集団から、前記目的ペプチドと選択的に結合する、ベイトＴＣＲポリペプチド鎖とプレイＴＣＲポリペプチド鎖を含んでなるＴＣＲを発現する組換え細胞を得る工程が、形質導入されたベイトＴＣＲポリペプチド鎖を発現し、かつ、目的ペプチドと結合する細胞集団の１以上の細胞を単離することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
3. 前記プレイ核酸が前記プレイ核酸をクローニングすることにより単離される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
4. 前記プレイＴＣＲポリペプチド鎖が、対照ＴＣＲポリペプチドＣＤＲ３領域のＣＤＲ３領域、場合により親ＴＣＲにおける同族ポリペプチド鎖のＣＤＲ３領域、に比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾を含んでなるＣＤＲ３領域を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記方法が、
   ｉ）ベイトＴＣＲポリペプチド鎖の発現を許容する条件下でＴＣＲを発現し得る細胞またはＴＣＲを発現し得る細胞に分化し得る細胞に、単離されたプレイ核酸およびベイト核酸を導入すること；ｉｉ）プレイＴＣＲポリペプチド鎖とベイトＴＣＲポリペプチド鎖とを含んでなるＴＣＲのアビディティーおよび／または親和性を測定すること；ならびに、ｉｉｉ）プレイＴＣＲポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸クローンを単離すること、ここで、前記ベイトＴＲポリペプチド鎖および前記プレイＴＣＲポリペプチド鎖は、対照ＴＣＲ、場合により親ＴＣＲに比べて目的ペプチドに対して増大したアビディティーおよび／または親和性を有するＴＣＲを構成するものである、
   をさらに含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. カウンター鎖ＴＣＲポリペプチドとともに目的ペプチドに特異的なＴＣＲを構成するＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸を得るための請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法であって、以下の工程：
   ａ．ＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現し得る細胞に分化し得る細胞を含んでなる細胞集団に、カウンター鎖ＴＣＲポリペプチド鎖とともにＴＣＲを構成するベイトＴＣＲポリペプチド鎖であって、場合によりＴＣＲαおよびＴＣＲβポリペプチド鎖から選択されるＴＣＲポリペプチド鎖をコードするベイト核酸を形質導入し、ここで、前記ベイトＴＣＲポリペプチド鎖は、前記目的ペプチドを認識するＴ細胞から従前に単離されたものであり、
   ｂ．前記形質導入された細胞集団をベイトＴＣＲポリペプチド鎖の発現を許容する条件下で培養し、
   ｃ．工程（ｂ）で得られた形質導入された細胞集団から目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する細胞を得、かつ
   ｄ．工程（ｃ）で得られた細胞から、前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸によりコードされるポリペプチドとともにＴＣＲを構成するプレイＴＣＲポリペプチド鎖をコードするプレイ核酸を単離すること
   を含んでなる、方法。
7. ＴＣＲを発現する組換え細胞を得る工程が、形質導入された細胞集団を、目的ペプチドを提示する抗原提示細胞とともに培養する工程を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 形質導入された細胞集団から目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する組換え細胞を得る工程が、セルソーティング、場合により蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用することを含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 目的ペプチドに特異的なＴＣＲをコードする核酸のペアを得るための請求項１に記載の方法であって、以下の工程：
   ａ．細胞集団に、ＴＣＲを構成するベイトポリペプチド鎖の群から選択されるベイトＴＣＲポリペプチド鎖をコードするベイト核酸を形質導入すること、ここで、前記ベイトＴＣＲポリペプチド鎖は、目的ペプチドを認識するＴ細胞から発現され、従前に単離されたものであり、前記細胞集団は、ＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現する細胞に分化し得る細胞を含んでなるものであり、
   ｂ．前記形質導入された細胞集団をベイトＴＣＲポリペプチド鎖の発現を許容する条件下で培養し、
   ｃ．工程（ｂ）で得られた形質導入された細胞集団から、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する組換え細胞を得、
   ｄ．工程（ｃ）で得られた細胞から、前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸によりコードされるポリペプチドとともにＴＣＲを構成するポリペプチドをコードするプレイ核酸を単離し、かつ
   ｅ．工程（ａ）で前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸と工程（ｄ）で単離されたプレイ核酸をペアとすること
   を含んでなる、方法。
10. 工程（ｃ）で組換え細胞を得ることが、形質導入された細胞集団を、目的ペプチドを提示する抗原提示細胞とともに培養する工程を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記細胞集団が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、場合によりＣＤ３リガンドで活性化されたＰＢＭＣの集団である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 工程（ａ）で前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸がＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖をコードする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 工程（ａ）で前記細胞集団に形質導入されたベイト核酸が、ＴＣＲによるペプチド認識に主として寄与するＴＣＲ鎖をコードする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 形質導入が２回、３回、４回、５回および／または６回繰り返される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. プレイＴＣＲポリペプチド鎖をコードする単離されたプレイ核酸がＴＣＲを発現し得る細胞、またはＴＣＲを発現し得る細胞に分化し得る細胞に形質導入され、場合により、ここで、前記単離されたプレイ核酸は、プレイＴＣＲポリペプチド鎖とともにＴＣＲを構成するＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸、場合によりベイトＴＣＲ核酸、と組み合わせて形質導入され、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する組換え細胞を含んでなる形質導入された細胞集団を生産する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 細胞集団または細胞がまた、内在性ＴＣＲ鎖の発現を抑制するためのアンチセンス分子でも形質導入される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 形質導入された１以上の前記核酸、場合によりベイト核酸、のコドンが最適化される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 配列番号４、６、８、１０、１２、１４、５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜８６、８８〜９１、９４、９６、９８、１１２、１１４、１１６〜１２２から選択される配列および／または配列番号４、６、８、１０、１２、１４、５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜８６、８８〜９１、９４、９６、９８、１１２、１１４、１１６〜１２２から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列および／または配列番号３、５、７、９、１１、１３、５１、５３、５５、５７、５９、６１、９３、９５、９７、１１１、１１３、１１５のいずれか１つによりコードされる配列および／または３、５、７、９、１１、１３、５１、５３、５５、５７、５９、６１、９３、９５、９７、１１１、１１３、１１５から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含んでなり、ならびに、４、６、８、１０、１２、１４、５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜８６、８８〜９１、９４、９６、９８、１１２、１１４、１１６〜１２２から選択されるポリペプチドをコードするか、またはＣＤＲ領域もしくは非ＣＤＲ領域などのその一部を含んでなり、場合により、本明細書の配列から少なくとも１つのアミノ酸変異を含んでなるか、もしくはコードし、および／または本明細書のいずれかの核酸配列のコドン最適化型を含んでなる配列を含んでなる、単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲポリペプチド。
19. 相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでなり、前記ＣＤＲの配列が、
    ＣＤＲ１：配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、１００、１０２、１０４；
    ＣＤＲ２：配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、１０６、１０８、１１０；および
    ＣＤＲ３：配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜９１、１１２、１１４、１１６〜１２２
    から選択され、ならびに／または
    前記ＣＤＲ配列は、
    ＣＤＲ１：配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、１００、１０２；
    ＣＤＲ２：配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、１０６、１０８、１１０；および
    ＣＤＲ３：配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜９１、１１２、１１４、１１６〜１２２
    から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するものである、
    請求項１８に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲポリペプチド。
20. 前記ＣＤＲ配列が、
    ＣＤＲ１：配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、１００、１０２；
    ＣＤＲ２：配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、１０６、１０８；および
    ＣＤＲ３：配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、８１〜９１、１１２、１１４、１１６〜１２２
    から選択される、請求項１９に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲポリペプチド鎖。
21. 前記ＴＣＲポリペプチド鎖がＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなるＴＲＣβポリペプチド鎖であり、前記ＣＤＲ配列は、
    ＣＤＲ１：配列番号２０、２２、１００、１０２；
    ＣＤＲ２：配列番号３６、３８、１０６、１０８；および
    ＣＤＲ３：配列番号５２、５４、８１〜９１、１１２、１１４、１１６〜１２２
    から選択される、請求項２０に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲポリペプチド鎖。
22. 前記ＴＣＲβポリペプチド鎖が、ＭＡＲＴ１_{２７−３５}ペプチドと特異的に結合するＴＣＲαポリペプチドカウンター鎖とともに親ＴＣＲを構成し得る、請求項２１に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲポリペプチド鎖。
23. ＴＣＲαポリペプチドカウンター鎖が、配列番号２を有するＳＩＧ３５α鎖である、請求項２２に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲポリペプチド鎖。
24. 前記ＴＣＲβポリペプチド鎖が、配列番号４、６、９４、９６および９８から選択される配列を有する、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲポリペプチド鎖。
25. 前記ＴＣＲポリペプチド鎖が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含んでなるＴＲＣαポリペプチド鎖であり、ＣＤＲ配列が、
    ＣＤＲ１：配列番号２４、２６、２８、３０；
    ＣＤＲ２：配列番号４０、４２、４４、４６；および
    ＣＤＲ３：配列番号５６、５８、６０、６２
    から選択される、請求項１９に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲポリペプチド鎖。
26. 前記ＴＣＲα鎖が、ＷＴ１_{２３４−２４３}ペプチドと特異的に結合するＴＣＲβポリペプチドカウンター鎖とともに親ＴＣＲを構成し得る、請求項２５に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲポリペプチド鎖。
27. 前記ＴＣＲβポリペプチドカウンター鎖が配列番号１６を有するＴＡＫ１β鎖である、請求項２５または２６に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲポリペプチド鎖。
28. 前記ＴＣＲαポリペプチド鎖が配列番号８、１０、１２、および１４から選択される配列を有する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲポリペプチド鎖。
29. 前記ＴＣＲポリペプチドがＴＣＲβポリペプチド鎖であり、前記ＣＤＲ３領域が配列番号５２、５４、８１〜９１、１１２、１１４および１１６〜１２２のいずれか１つを含んでなる、請求項１８に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲポリペプチド。
30. 前記ＴＣＲポリペプチドがＴＣＲαポリペプチド鎖であり、前記ＣＤＲ３領域が配列番号５６、５８、６０および６２のいずれか１つを含んでなる、請求項１８に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲポリペプチド。
31. 請求項１８〜３０のいずれか一項に記載の、ＴＣＲポリペプチド鎖をコードする単離されたおよび／または組換え操作された核酸。
32. ｉ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、５１、５３、５５、５７、５９、６１、９３、９５、９７、１１１、１１３および１１５のいずれか１つに示される配列；
    ｉｉ）配列番号５２、５４、８１〜９１、１１２、１１４および１１６〜１２２から選択されるＣＤＲ３領域アミノ酸配列を含んでなるＴＣＲβポリペプチド鎖をコードするもの；
    ｉｉｉ）配列番号４、６、９４、９６または９８から選択されるアミノ酸配列をコードするもの；
    ｉｖ）配列番号５６、５８、６０および６２からなる群から選択されるＣＤＲ３領域アミノ酸配列を含んでなるＴＣＲαポリペプチド鎖をコードするもの；または
    ｖ）配列番号８、１０、１２および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＴＣＲαポリペプチド鎖をコードするもの
    を含んでなる、請求項３１に記載の単離されたおよび／または組換え操作された核酸。
33. ＴＣＲαポリペプチド鎖とＴＣＲβポリペプチド鎖とを含んでなり、前記ＴＣＲβポリペプチド鎖は、配列番号５２、５４、８１〜９１、１１２、１１４および１１６〜１２２のいずれか１つの配列を含んでなるＣＤＲ３領域を含んでなり、ならびに／または前記ＴＣＲαポリペプチド鎖は、配列番号５６、５８、６０および６２のいずれか１つの配列を含んでなるＣＤＲ３領域を含んでなり、場合により、前記ＴＣＲは膜画分に含まれる、単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲ。
34. 前記ＴＣＲαポリペプチド鎖が、配列番号１６を有するＴＡＫ１βポリペプチド鎖とともにＴＣＲを構成する、請求項３３に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲ。
35. 前記ＴＣＲβポリペプチド鎖が、配列番号２を有するＳＩＧ３５αポリペプチド鎖とともにＴＣＲを構成する、請求項３３または３４に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲ。
36. 前記ＴＣＲが１以上の哺乳動物ＴＣＲポリペプチド鎖、場合によりヒトＴＣＲポリペプチド鎖および／またはハイブリッドＴＣＲポリペプチド鎖、を含んでなる、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の単離されたおよび／または組換え操作されたＴＣＲ。
37. 請求項１８〜３６のいずれか一項に記載の単離された核酸、ＴＣＲポリペプチド鎖またはＴＣＲを含んでなる組換え細胞。
38. プレイ核酸を含んでなり、および、目的ペプチドに特異的なＴＣＲを発現し、前記ＴＣＲが対照ＴＣＲに比べて増大した親和性および／またはアビディティーを有し、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法により得られる、請求項３７に記載の組換え細胞。
39. 請求項１８〜３８のいずれか一項に記載の前記ＴＣＲポリペプチド鎖、該ＴＣＲポリペプチド鎖をコードする核酸、ＴＣＲポリペプチド鎖および／または組換え細胞を、場合により薬学上許容可能な担体と組み合わせて含んでなる組成物。
40. 請求項３８に記載の組換え細胞を含んでなる請求項３９に記載の組成物。
41. 必要とする対象に治療上有効な量の請求項３８に記載の組換え細胞または請求項４０に記載の組成物を投与する工程を含んでなる、障害を改善または治療するための方法。
42. 前記細胞集団を投与工程の前にサイトカインおよび／または抗原ペプチドで活性化する工程をさらに含んでなる、請求項４１に記載の方法。
43. 障害を治療するための請求項１８〜４０のいずれか一項に記載の方法を用いて生産された核酸、ＴＣＲポリペプチド、ＴＣＲ、組成物または組換え細胞。
44. 障害を治療するための請求項９〜４０のいずれか一項に記載の方法を用いて生産された核酸のペア、ＴＣＲ、組成物および／または組換え細胞の使用。
45. 前記障害が、白血病、固形腫瘍などの癌、肝炎、インフルエンザウイルスまたはＨＩＶなどのウイルス、結核菌、ＭＲＳＡ、またはＶＲＥなどの細菌）、アスペルギルス属、カンジダ属、およびクリプトコッカス属などの真菌によって引き起こされる感染性疾患から選択される、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法、核酸、ＴＣＲポリペプチド、ＴＣＲ、組成物または組換え細胞。
46. 組換え細胞が同種異系反応性を軽減するように選択されている、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法、核酸、ＴＣＲポリペプチド、ＴＣＲ組成物または組換え細胞または使用。