JP2017500044A - DHAを有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属の微細藻類のバイオマスを濃縮する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
mangrovei)の微細藻類のバイオマスを濃縮する新規の発酵法、およびまたこの微細藻類バイオマスから抽出された油に関する。
− トリグリセリド(トリアシルグリセロール、トリアシルグリセリド、またはTAGとも呼ばれる)は、グリセロールの3つのヒドロキシル基が脂肪酸によりエステル化されているグリセリドである。これは、植物油および動物性脂肪の主要な構成素である。
− リン脂質は、両親媒性脂質、すなわち、極性の(親水性の)「ヘッド」および2つの脂肪族の(疎水性の)「テール」からなる脂質である。
− 不可欠脂肪酸。これは、人体の発達および正確な機能に必要とされるが、人体が生産することはできない;
− 「条件的」不可欠脂肪酸。これは、細胞の正常な成長および生理学的機能に必須であるが、食事によって提供される場合、前駆体から生産され得る。したがって、必須の前駆体が不在である場合、絶対的に必要とされる;
− 非不可欠脂肪酸。
− ω−3脂肪酸ファミリーのエイコサペンタエン酸(EPA)、
− オレイン酸(ヒトの食事における主な一価不飽和脂肪酸)およびパルミトレイン酸、
− 飽和脂肪酸、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、またはパルミチン酸。
多価不飽和脂肪酸は、最後のメチル機能から出発して最初の二重結合の位置に従って分類される。
PUFA)(その前駆体および主要な代表はリノール酸(LA)である)、およびω−3脂肪酸(またはn−3 PUFA)(その前駆体はα−リノレン酸(ALA)である)。
飽和脂肪酸のうち、パルミチン酸(ヘキサデカン酸またはセチル酸とも呼ばれる)は、動植物において最も一般的なC16:0飽和脂肪酸の1つである。
一価不飽和脂肪酸の前駆体として、パルミチン酸がパルミトレイン酸(16:1、n−7)をもたらし、これは天然にシーバックソーンの果実または果肉中に大量に存在する。
シゾキトリウム(Schizochytrium)属の微細藻類は従来、発酵槽(従属栄養条件:暗所、炭素源の存在下)において培養されている。
(a)バイオマスを増大させるために、微生物、炭素源、および制限した栄養源を含む培地の発酵を実行し、かつ前記発酵培地における溶解酸素含有量を、飽和の少なくともおよそ4%に維持するのに十分な条件を確実にすることと;
(b)その後、前記発酵培地における溶解酸素含有量を、飽和のおよそ1%以下に維持するのに十分な条件を提供し、かつ前記微生物に前記脂質を生産させるのに十分な条件を提供することと;
(c)少なくとも15%が多価不飽和脂質からなる前記微生物脂質を収集することと
からなる工程を含み、
少なくともおよそ100g/Lのバイオマス密度が発酵を通じて得られる。
888において、より詳細には、第1の成長相が炭素源および窒素源の存在下で酸素を制限することなく実行されて、高細胞密度の獲得が促進され、その後、第2の相において、窒素の供給が止められ、かつ酸素の供給が徐々に減速され(溶解酸素圧またはpO2を10%から4%に、その後、0.5%に管理)、微細藻類にストレスを与えてその成長を減速させ、注目する脂肪酸の生産を誘発する。
然として満たされていない。
qO2標的は、脂肪酸を別とするバイオマス1グラムあたりの毎時の酸素のグラム量であり;
qmは、脂肪酸を別とするバイオマス1gあたりの毎時のグルコースのgで表される維持係数であり;
qベース脂質は、脂肪酸を別とするバイオマス1gあたりの毎時のベース脂質のgで表されるベース脂質の蓄積速度であり;
yO2 /脂質は、脂質1gあたりの酸素のgで表される脂質形成に対する酸素消費の係数であり;
μは、脂肪酸を別とするバイオマス1gあたりの毎時または(h−1)の、脂肪酸を別として形成されるバイオマスのgで表される成長速度であり;
yO2 /xは、脂肪酸を別とするバイオマス1gあたりの酸素のgで表される、脂肪酸を別とするバイオマス形成に対する酸素消費の係数である)
によって算出されることを特徴とする。
− 総脂肪酸の重量で、少なくとも40%のDHA;および/または
− 総脂肪酸の重量で、最大で40%のパルミチン酸;および/または
− バイオマスの乾燥重量で、少なくとも25%の脂肪酸。
− 微細藻類成長相を脂質生産相から切り離すことが必須ではなく、反対に、脂質生産は細胞成長と両立するため、単一の相において実行され、
− 先行技術において記載されるように、窒素制限または他のあらゆる栄養素の制限を誘導することが不可欠ではなく、および
− pO2によって発酵を制御することも不可欠ではない。
− 維持のためのエネルギー生産、
− DHAが支配的である、ベース脂質と呼ばれる脂肪酸のアレイの生産、
− 脂肪酸を別とするバイオマスの成長、および
− 余剰酸素によるパルミチン酸の生産。
reduction)(飽和の10%、その後4%、その後0.5%)による管理操作と同じである)。
− 溶解酸素圧に影響を及ぼし;かつ
− 「完全に撹拌されない」発酵槽において、複雑な現象を引き起こす。
− 注目する脂質、とりわけDHAの含有量全体の増大、および
− 臭気の縮小(CNCM I−4469の収穫バイオマスの特に強烈な臭気の縮小は注目に値する)
という注目に値する結果を得た。
本発明の方法において用いられる系統は、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属、より詳細にはシゾキトリウム(Schizochytrium)属種またはシゾキトリウム・マングローベイ(Schizochytrium mangrovei)のものである。そのような系統は、当業者に知られている。例えば、国際公開第01/54510号において記載かつ研究されているシゾキトリウム(Schizoc
hytrium)属種の系統ATCC第20888番に言及することができる。
COLLECTION(CCTCC)(番号M 209118)に寄託された。この系統は、主にDHAと、より少ない程度でパルミチン酸およびパルミトレイン酸とを生産する。これは、18S RNAをコードする遺伝子の部分配列によって特徴付けられた(配列番号1)。
rovei)タイプの系統であると同定することを可能にした。この系統は、本出願において以降「CNCM I−4702」と表される。
培地に導入される全体的な酸素流は調整可能であり、本質的に:
− 導入される空気の流速、および
− 培地における酸素の溶解を促進する撹拌の速度
に依存する。
1.細胞維持。
2.ベース脂質の生産。
3.脂肪酸を別とするバイオマスの形成。
4.代謝過剰にリンクする脂質蓄積。
細胞維持は、細胞の維持のために細胞によって必要とされるエネルギーに相当し、あらゆる脂質生産またはバイオマス成長から独立している。
本出願人は、脂質蓄積が成長と両立すること、および単に成長が止まると生じる現象ではないことを観察した。脂質蓄積は、ほぼ細胞膜形成のためであるが、成長の前駆体である。
総バイオマスは、脂質の蓄積を含む。
て)のgを表す。
成長は連続的である。なぜなら、本発明の方法に従えば、栄養の制限がないからである。しかしながら、成長速度の減速が観察される。これは培地の消費から独立している。
本出願人は、上述の要件が満たされて、必要な酸素が供給されると、後者の流れのみが存在すると結論した。
O2変換収率は、O2消費を、F.Aを別とするバイオマスまたは脂質の生産の関数として知ることを可能にする。
DHA含有量を上げるために、本出願人は、最初の3つの酸素使用(維持、ベース脂質生産、およびF.Aを別とするバイオマスの成長)を満たすためにのみ酸素供給を制御することが適切であることを確認した。この供給は、標的qO2を決定することによって定義され得、これは、細胞1グラムあたりで毎時必要とされるO2のグラム量に相当する。
の各瞬間で適用される。
細胞溶解物に関する。特に、この抽出物または溶解物は、発酵後に回収されるバイオマスから調製される。この抽出物または溶解物は、DHA、ならびに任意選択的にパルミチン酸および/またはパルミトレイン酸が豊富である。細胞は、脂質内容物を抽出するために、機械、化学、および酵素による方法が挙げられる種々の方法によって破られてもよい。
培養条件
プロトコルは、発酵槽の接種のためにエルレンマイヤーフラスコ内で、系統CNCM I−4469について0.1gのバイオマス/L、および系統CNCM I−4702について少なくとも5gのバイオマス/Lを前培養することを含む。
500mLの調節済みエルレンマイヤーフラスコ内での前培養(100mLの培地)を、28℃の温度で24時間持続させる。
培地を3部にして滅菌する。
特異的生産速度を評価するために、10%のpO2において第1の培養を実行した。これは、培地中に常に酸素が溶解していることを意味する。この培養は、栄養源を制限することなく実行した。
トル「他の脂肪酸」の下に包括して、DHAおよびパルミチン酸に及ぼす影響を実証する。しかしこれは、標的qO2の計算において、DHAと共にベース脂質に含める。
同じ培養条件を用いたが、酸素供給を制御した。
− 酸素供給は、パルミチン酸の生産速度を低下させることを可能にし、
− パルミチン酸の生産速度は、系統CNCM I−4469について9倍、および系統CNCM I−4702について3倍低下した。
表Xにおける脂質生産速度はここで、DHAが主な構成素であるが少量のパルミチン酸も含有するベース脂質の一定の流れ(式1および式2におけるqベース脂質)を表す。
l、およびCNCM I−4469について7g/Lに維持され得る。
式2:
qO2標的x=0.006×1.07+(0.011+0.001+0.009)×0.17+0.08×0.8=0.106g/g/h
である。これは、以下に相当する:
OTR標的=0.106×7=0.74g O2(培養1lあたり、毎時)
または
OTR標的=0.106×7×1000/32=毎時23mmol O2/培養L。
式2:
qO2標的=0.006×1.07+(0.02+0.018+0.07)×0.17+0.17×0.8=0.218g/g/h
である。これは、以下に相当する:
OTR標的=0.218×4=0.87(培養1lあたり、毎時のO2g)
OTR標的=0.218×4×1000/32=毎時27.4mmol O2/培養L。
実施例1および実施例2において、栄養源を制限することなく実行した試験により、式2によって定義される標的qO2(これは、毎時27.4mmol O2/培養Lに等しい。実施例2参照)を考慮に入れることによって脂質生産を制御することが可能であるモデルを生じさせることが可能になる。
試験を、以下により実行した:
− コントロールとして、国際公開第01/54510号からなる先行技術において定義される条件下で、すなわち成長相および生産相(後者は、窒素供給を制限する工程中に誘導される)を切り離して培養した系統CNCM I−4702。この制限はここで、培養の3分の1の終了時にアンモニア水によるpH調節を中断することによって誘導した。
− 培養の全期間を通して、系統はあらゆる栄養的制限を受けず、およびまたpO2を10%に調節した発酵。
培養プロトコルは、国際公開第01/54510号の実施例4に記載されている。用いた系統は、シゾキトリウム(Schizochytrium)属種のATCC 20888である。
1.10%を超える不変の調節。
2.0%の一定のpO2。
Claims (10)
- ドコサヘキサエン酸(DHA)が濃縮された、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属の微細藻類のバイオマスを生産する方法において、従属栄養条件下での培養相中に、酸素の供給が、1)細胞維持に必要なエネルギー生産、2)ベース脂質生産、および3)脂肪酸を別とする前記バイオマスの成長のための酸素要件のみを満たすように制御されることを特徴とする、方法。
- 前記要件1)、2)、および3)のみを満たすのに必要な前記酸素の供給が、以下の式2
qO2標的は、脂肪酸を別とするバイオマス1グラムあたりの毎時の酸素のグラム量であり;
qmは、脂肪酸を別とするバイオマス1gあたりの毎時のグルコースのgで表される維持係数であり;
qベース脂質は、脂肪酸を別とするバイオマス1gあたりの毎時のベース脂質のgで表されるベース脂質の蓄積速度であり;
yO2 /脂質は、脂質1gあたりの酸素のgで表される脂質形成に対する酸素消費の係数であり;
μは、脂肪酸を別とするバイオマス1gあたりの毎時または(h−1)の、脂肪酸を別として形成されるバイオマスのgで表される成長速度であり;
yO2 /xは、脂肪酸を別とするバイオマス1gあたりの酸素のgで表される、脂肪酸を別とするバイオマス形成に対する酸素消費の係数である)
によって算出されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 栄養素、とりわけ炭素源または窒素源が、発酵法中に制限されないことを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 成長相およびDHA生産相が両立することを特徴とする、請求項1ないし請求項3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微細藻類は、シゾキトリウム(Schizochytrium)属種またはシゾキトリウム・マングローベイ(Schizochytrium mangrovei)のものであることを特徴とする、請求項1ないし請求項4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微細藻類は、2011年4月14日および2012年11月22日にそれぞれパスツール研究所のCollection Nationale de Cultures de Microorganismes[French National Collection of Microorganism Cultures]に寄託された系統CNCM I−4469およびCNCM I−4702から選択された系統であることを特徴とする、請求項1ないし請求項5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオマスを収穫することと、任意選択的に前記バイオマスから細胞抽出物または細胞溶解物を調製することと、その後、任意選択的にDHAの豊富な粗油を抽出することとも含むことを特徴とする、請求項1ないし請求項6のいずれか一項に記載の方法。
- 得られた前記バイオマスは、総脂肪酸の重量で、少なくとも40%のDHAを含むことを特徴とする、請求項1ないし請求項7のいずれか一項に記載の方法。
- 得られた前記バイオマスは、総脂肪酸の重量で、最大で40%のパルミチン酸を含むことを特徴とする、請求項1ないし請求項8のいずれか一項に記載の方法。
- 得られた前記バイオマスは、バイオマスの乾燥重量で、少なくとも25%の脂肪酸を含むことを特徴とする、請求項1ないし請求項9のいずれか一項に記載の方法。
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