JP2017221133A - Cellulose three-dimensional structure and method for producing the same - Google Patents
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Description
本発明は、例えば人工的に合成したセルロース三次元構造体並びにその製造方法及び利用に関する。 The present invention relates to, for example, an artificially synthesized cellulose three-dimensional structure and a production method and use thereof.
セルロースは、地球上で最も豊富に存在する有機高分子である。セルロースは、その資源性に加え、高いサステイナビリティをもつことから、注目されているマテリアル素材である。機械的処理や化学的処理によって天然物から得られるセルロースは、繊維状の形態であることが知られており、その構造や物性に応じた利用が展開されている。また、天然資源を酸処理することによって得られるセルロースナノ結晶(CNC)は、新たなセルロース素材としての利用が期待されている。CNCは、セルロース鎖が平行に配列したI型結晶構造を有し、高いアスペクト比や優れた機械的強度、熱的安定性等から複合材料のフィラーとして注目されている。 Cellulose is the most abundant organic polymer on earth. Cellulose is a material material attracting attention because of its high sustainability in addition to its resource. Cellulose obtained from natural products by mechanical treatment or chemical treatment is known to be in a fibrous form, and its use according to its structure and physical properties is being developed. In addition, cellulose nanocrystals (CNC) obtained by acid treatment of natural resources are expected to be used as new cellulose materials. CNC has an I-type crystal structure in which cellulose chains are arranged in parallel, and is attracting attention as a filler for composite materials because of its high aspect ratio, excellent mechanical strength, and thermal stability.
一方、結晶性のセルロースが人工的にも合成できることが知られている（人工合成で得られるセルロースは一般にオリゴマーであることから、このようなセルロースはセロデキストリンと呼ばれる。ここでは、区別せずにすべてセルロースと呼ぶ）。下記の反応は、セロデキストリンホスホリラーゼ(CDP)の逆反応を利用したセルロースの酵素合成を示す。 On the other hand, it is known that crystalline cellulose can also be synthesized artificially (since cellulose obtained by artificial synthesis is generally an oligomer, such cellulose is called cellodextrin. All called cellulose). The following reaction shows the enzymatic synthesis of cellulose using the reverse reaction of cellodextrin phosphorylase (CDP).
上記反応に示すように、加リン酸分解酵素であるCDPの逆反応を利用した酵素合成により、長さ数μm、幅数百nm、厚さ4.5nmのナノシート構造を有するセルロース結晶(セルロースナノシート；CNS)が得られる(非特許文献１)。当該合成においては、プライマーとして働くD-(+)-グルコースに対して、α-D-グルコース一リン酸(αG1P)がモノマーとして逐次的に重合される。CDPが本来加水分解する基質に対する認識能と比較し、セルロース合成に用いられるD-(+)-グルコースは認識されにくいものの、結果として首尾良く重合反応が進む。また、CNSは、天然由来のI型結晶とは異なり、より安定な逆平行鎖のII型結晶構造を有する。そのため、CNS内でセルロース鎖は厚さ方向に逆平行に配列しており、結果としてセルロースの還元末端及び非還元末端がシート表面に規則的に露出している。また、CNSは純水に安定に分散するが、NaOH水溶液に溶解する性質を有する。 As shown in the above reaction, a cellulose crystal having a nanosheet structure (cellulose nanosheet; CNS) is obtained (Non-patent Document 1). In the synthesis, α-D-glucose monophosphate (αG1P) is sequentially polymerized as a monomer with respect to D-(+)-glucose acting as a primer. D-(+)-glucose used for cellulose synthesis is difficult to recognize compared with the ability to recognize a substrate that CDP inherently hydrolyzes, but as a result, the polymerization reaction proceeds successfully. Also, CNS has a more stable antiparallel chain type II crystal structure, unlike naturally occurring type I crystals. Therefore, the cellulose chains are arranged in the thickness direction antiparallel in the CNS, and as a result, the reducing ends and non-reducing ends of cellulose are regularly exposed on the sheet surface. CNS is stably dispersed in pure water, but has a property of dissolving in an aqueous NaOH solution.
さらに、本発明者の一部は、上記CDPを利用したセルロースの酵素合成において、プライマーとしてC2-5-直鎖状アルキル基又はC2-5を主鎖とする分岐状アルキル基を有するグルコース誘導体を用いることで、スポンジ状の構造等の溶媒を含む三次元網目構造を有するセルロースナノ構造体を作製できること(国際出願番号PCT/JP2015/071047)、また水溶性高分子存在下で同様にセルロースを合成すると、その二次元結晶がさらに成長し、ナノリボン状のネットワーク構造を形成することを見出した(国際出願番号PCT/JP2016/057253)。 Furthermore, some of the present inventors, in the enzymatic synthesis of cellulose using the above CDP, C 2-5 as a primer - glucose having branched alkyl group be straight-chain alkyl group or a C 2-5 main chain By using a derivative, it is possible to produce a cellulose nanostructure having a three-dimensional network structure containing a solvent such as a sponge-like structure (International Application No.PCT / JP2015 / 071047), and similarly in the presence of a water-soluble polymer It has been found that the two-dimensional crystal grows further to form a nanoribbon-like network structure (International Application No. PCT / JP2016 / 057253).
上述のCDPを用いたセルロースの合成において、多様な置換基を有するグルコース誘導体を利用することで、セルロース分子間の相互作用が変化し、新規な特性を有するセルロース構造体を合成できると考えられる。 In the cellulose synthesis using the above-mentioned CDP, it is considered that the interaction between cellulose molecules is changed by using glucose derivatives having various substituents, and a cellulose structure having novel characteristics can be synthesized.
そこで、本発明は、これらの実情に鑑み、CDPを用いたセルロースの合成において、多様な置換基を有するグルコース誘導体を利用することで、新規な特性を有するセルロース構造体を合成することを目的とする。 Therefore, in view of these circumstances, the present invention aims to synthesize a cellulose structure having novel characteristics by utilizing glucose derivatives having various substituents in the synthesis of cellulose using CDP. To do.
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、CDPを用いたセルロースの合成において、繰り返し単位を有する親水性置換基を有するグルコース誘導体を利用することで、新規な特性を有するセルロース三次元構造体を合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent research to solve the above problems, a cellulose three-dimensional structure having novel properties is obtained by utilizing a glucose derivative having a hydrophilic substituent having a repeating unit in the synthesis of cellulose using CDP. The present invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）次式(I):
Aは、繰り返し単位を有する親水性置換基であり、
mは、5〜10である]
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース三次元構造体。
That is, the present invention includes the following.
(1) The following formula (I):
A is a hydrophilic substituent having a repeating unit;
m is 5-10]
The cellulose three-dimensional structure which contains the compound shown by these as a structural component.
（２）繰り返し単位を有する親水性置換基がオリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルホスホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリアクリルアミド、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(N-メチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジメチルアクリルアミド)、ポリ(N-エチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ヒドロキシエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ビニルアセトアミド)、ポリ(N-ビニルホルムアミド)、ポリ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）及びポリビニルピロリドン、又はそれらのオリゴマーから成る群より選択される、（１）記載のセルロース三次元構造体。
（３）繰り返し単位を有する親水性置換基が分子量30〜2000を有する、（１）又は（２）記載のセルロース三次元構造体。
(2) The hydrophilic substituent having a repeating unit is oligoethylene glycol, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinyl phosphonic acid, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polystyrene sulfonic acid, polyvinyl sulfonic acid, polyethyleneimine, polyallylamine, polyacrylamide , Poly (N-isopropylacrylamide), poly (N-methylacrylamide), poly (N, N-dimethylacrylamide), poly (N-ethylacrylamide), poly (N, N-diethylacrylamide), poly (N-hydroxy) (Ethylacrylamide), poly (N-vinylacetamide), poly (N-vinylformamide), poly (2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine) and polyvinylpyrrolidone, or their oligomers, according to (1) Ceruleau Three-dimensional structure.
(3) The cellulose three-dimensional structure according to (1) or (2), wherein the hydrophilic substituent having a repeating unit has a molecular weight of 30 to 2,000.
（４）オリゴエチレングリコールが次式(II)：
で示される化合物である、（２）又は（３）記載のセルロース三次元構造体。
(4) Oligoethylene glycol is represented by the following formula (II):
The cellulose three-dimensional structure according to (2) or (3), which is a compound represented by:
（５）nが2〜8である、（４）記載のセルロース三次元構造体。
（６）溶媒を含む三次元網目構造を有する、（１）〜（５）のいずれか１記載のセルロース三次元構造体。
（７）溶媒を含む三次元網目構造が、溶媒を含むスポンジ状である、（６）記載のセルロース三次元構造体。
（８）三次元網目構造におけるリボン構造が10〜800nmの幅を有する、（６）又は（７）記載のセルロース三次元構造体。
（９）（１）〜（８）のいずれか１記載のセルロース三次元構造体を含む足場材。
（１０）（１）〜（８）のいずれか１記載のセルロース三次元構造体を含むセンサー。
(5) The cellulose three-dimensional structure according to (4), wherein n is 2 to 8.
(6) The cellulose three-dimensional structure according to any one of (1) to (5), which has a three-dimensional network structure containing a solvent.
(7) The three-dimensional cellulose structure according to (6), wherein the three-dimensional network structure containing a solvent is a sponge-like structure containing a solvent.
(8) The cellulose three-dimensional structure according to (6) or (7), wherein the ribbon structure in the three-dimensional network structure has a width of 10 to 800 nm.
(9) A scaffold comprising the cellulose three-dimensional structure according to any one of (1) to (8).
(10) A sensor comprising the cellulose three-dimensional structure according to any one of (1) to (8).
（１１）αG1Pと、プライマーとして次式(III):
で示されるグルコース誘導体を、CDPと反応させる工程を含む、次式(I):
Aは、前記と同一であり、
mは、5〜10である]
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース三次元構造体の製造方法。
(11) αG1P and the following formula (III) as a primer:
Comprising the step of reacting a glucose derivative represented by formula (I) with CDP:
A is the same as above,
m is 5-10]
The manufacturing method of the cellulose three-dimensional structure which contains the compound shown by these as a structural component.
（１２）繰り返し単位を有する親水性置換基がオリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルホスホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリアクリルアミド、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(N-メチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジメチルアクリルアミド)、ポリ(N-エチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ヒドロキシエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ビニルアセトアミド)、ポリ(N-ビニルホルムアミド)、ポリ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）及びポリビニルピロリドン、又はそれらのオリゴマーから成る群より選択される、（１１）記載の方法。
（１３）繰り返し単位を有する親水性置換基が分子量30〜2000を有する、（１１）又は（１２）記載の方法。
(12) The hydrophilic substituent having a repeating unit is oligoethylene glycol, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinyl phosphonic acid, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polystyrene sulfonic acid, polyvinyl sulfonic acid, polyethyleneimine, polyallylamine, polyacrylamide , Poly (N-isopropylacrylamide), poly (N-methylacrylamide), poly (N, N-dimethylacrylamide), poly (N-ethylacrylamide), poly (N, N-diethylacrylamide), poly (N-hydroxy) (Ethylacrylamide), poly (N-vinylacetamide), poly (N-vinylformamide), poly (2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine) and polyvinylpyrrolidone, or oligomers thereof, described in (11) Method
(13) The method according to (11) or (12), wherein the hydrophilic substituent having a repeating unit has a molecular weight of 30 to 2,000.
（１４）オリゴエチレングリコールが次式(II)：
で示される化合物である、（１２）又は（１３）記載の方法。
(14) Oligoethylene glycol is represented by the following formula (II):
The method of (12) or (13), which is a compound represented by:
（１５）nが2〜8である、（１４）記載の方法。
（１６）セルロース三次元構造体が溶媒を含む三次元網目構造を有する、（１１）〜（１５）のいずれか１記載の方法。
（１７）溶媒を含む三次元網目構造が、溶媒を含むスポンジ状である、（１６）記載の方法。
（１８）三次元網目構造におけるリボン構造が10〜800nmの幅を有する、（１６）又は（１７）記載の方法。
(15) The method according to (14), wherein n is 2 to 8.
(16) The method according to any one of (11) to (15), wherein the cellulose three-dimensional structure has a three-dimensional network structure containing a solvent.
(17) The method according to (16), wherein the three-dimensional network structure containing the solvent is sponge-like containing the solvent.
(18) The method according to (16) or (17), wherein the ribbon structure in the three-dimensional network structure has a width of 10 to 800 nm.
本発明によれば、足場材等の医療分野、及びセンサー等の環境・エネルギー分野において有用なセルロース三次元構造体を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a cellulose three-dimensional structure useful in the medical field such as a scaffold and the environment / energy field such as a sensor.
１．本発明に係るセルロース三次元構造体
本発明に係るセルロース三次元構造体は、次式(I):
Aは、繰り返し単位を有する親水性置換基であり、
mは、5〜10である]
で示される化合物を構成成分として含有するものである。天然由来のセルロース鎖が平行に配列したI型セルロース構造とは異なり、本発明に係るセルロース三次元構造体は、より安定な逆平行鎖のII型セルロース構造を有する。
1. Cellulose three-dimensional structure according to the present invention Cellulose three-dimensional structure according to the present invention is represented by the following formula (I):
A is a hydrophilic substituent having a repeating unit;
m is 5-10]
Is contained as a constituent component. Unlike the type I cellulose structure in which naturally occurring cellulose chains are arranged in parallel, the cellulose three-dimensional structure according to the present invention has a more stable antiparallel chain type II cellulose structure.
また、本発明に係るセルロース三次元構造体は、構成成分のセルロース誘導体における繰り返し単位を有する親水性置換基の存在により、溶媒を含む三次元構造体、より具体的には、溶媒を含むスポンジ状の構造(リボン状セルロースのネットワーク)等の溶媒を含む三次元網目構造を有する三次元構造体となる。当該三次元構造体においては、網目構造中の空隙が外面につながっている(よって、溶媒(水分)が外に出る)状態である。従って、当該三次元構造体は、押す(圧力をかける)と、圧力に応じた構造の崩壊を伴いながら、溶媒(水分)が外面に出る構造を有する。 The cellulose three-dimensional structure according to the present invention is a three-dimensional structure containing a solvent due to the presence of a hydrophilic substituent having a repeating unit in the cellulose derivative as a constituent component, more specifically, a sponge-like structure containing a solvent. Thus, a three-dimensional structure having a three-dimensional network structure containing a solvent such as the structure (ribbon-like cellulose network) is obtained. In the three-dimensional structure, the voids in the network structure are connected to the outer surface (thus, the solvent (moisture) goes out). Therefore, the three-dimensional structure has a structure in which when pressed (applied with pressure), the solvent (moisture) comes out on the outer surface with the collapse of the structure corresponding to the pressure.
さらに、本発明に係るセルロース三次元構造体は、置換基としてオリゴエチレングリコール等の繰り返し単位を有する親水性置換基を有することで、国際出願番号PCT/JP2016/057253に記載するように天然セルロース、PEG等を合成中に添加しなくても三次元網目構造を形成できる。 Furthermore, the cellulose three-dimensional structure according to the present invention has a hydrophilic substituent having a repeating unit such as oligoethylene glycol as a substituent, so that natural cellulose as described in International Application No. PCT / JP2016 / 057253, A three-dimensional network structure can be formed without adding PEG or the like during synthesis.
また、国際出願番号PCT/JP2015/071047に記載するように、アルキル基の直鎖数が大きくなると、三次元網目構造体を形成せずに、沈殿物を生じる問題があった。一方、本発明に係るセルロース三次元構造体によれば、繰り返し単位を有する親水性置換基の長さを調整する事で構造体のスポンジ形状を維持したまま、当該リボン構造の幅を変える事ができる。本発明に係るセルロース三次元構造体の三次元網目構造におけるリボン構造は、例えば10〜800nm、好ましくは50〜500nmの幅を有する。 Further, as described in International Application No. PCT / JP2015 / 071047, when the straight chain number of the alkyl group is increased, there is a problem that a precipitate is formed without forming a three-dimensional network structure. On the other hand, according to the cellulose three-dimensional structure according to the present invention, it is possible to change the width of the ribbon structure while maintaining the sponge shape of the structure by adjusting the length of the hydrophilic substituent having the repeating unit. it can. The ribbon structure in the three-dimensional network structure of the cellulose three-dimensional structure according to the present invention has a width of, for example, 10 to 800 nm, preferably 50 to 500 nm.
ここで、置換基Aの繰り返し単位を有する親水性置換基としては、例えばオリゴエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルホスホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリアクリルアミド、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(N-メチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジメチルアクリルアミド)、ポリ(N-エチルアクリルアミド)、ポリ(N,N-ジエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ヒドロキシエチルアクリルアミド)、ポリ(N-ビニルアセトアミド)、ポリ(N-ビニルホルムアミド)、ポリ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）及びポリビニルピロリドン、又はそれらのオリゴマー等が挙げられる。また、当該繰り返し単位を有する親水性置換基は、例えば分子量30〜2000、好ましくは60〜1000を有するものであって良い。特に、オリゴエチレングリコールとしては、次式(II)：
で示される化合物が挙げられる。
Here, as the hydrophilic substituent having the repeating unit of the substituent A, for example, oligoethylene glycol, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinyl phosphonic acid, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polystyrene sulfonic acid, polyvinyl sulfonic acid, polyethylene Imine, polyallylamine, polyacrylamide, poly (N-isopropylacrylamide), poly (N-methylacrylamide), poly (N, N-dimethylacrylamide), poly (N-ethylacrylamide), poly (N, N-diethylacrylamide) ), Poly (N-hydroxyethylacrylamide), poly (N-vinylacetamide), poly (N-vinylformamide), poly (2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine) and polyvinylpyrrolidone, or oligomers thereof. Moreover, the hydrophilic substituent which has the said repeating unit may have molecular weight 30-2000, for example, Preferably it is 60-1000. In particular, as oligoethylene glycol, the following formula (II):
The compound shown by these is mentioned.
式(I)の化合物の重合度は、例えば7以上、好ましくは8以上(すなわち、式(I)の化合物において、mが5以上、好ましくは6以上)であり、且つ12以下、好ましくは11以下(すなわち、式(I)の化合物において、mが10以下、好ましくは9以下)である。 The degree of polymerization of the compound of formula (I) is, for example, 7 or more, preferably 8 or more (that is, m is 5 or more, preferably 6 or more in the compound of formula (I)), and is 12 or less, preferably 11 (Ie, in the compound of formula (I), m is 10 or less, preferably 9 or less).
２．本発明に係るセルロース三次元構造体の製造方法
以上に説明した本発明に係るセルロース三次元構造体は、以下に示される反応に準じて製造することができる。
2. Production method of cellulose three-dimensional structure according to the present invention The cellulose three-dimensional structure according to the present invention described above can be produced according to the reaction shown below.
αG1P及び式(III)のグルコース誘導体は、市販品として入手できるものであってよい。また、式(III)のグルコース誘導体は、例えばZ. Shiら, J. Agric. Food Chem., 2014年, 62, 3287-3292等に記載の方法に準じて合成することもできる。特に、繰り返し単位を有する親水性置換基Aとしてオリゴエチレングリコールを有する式(III)のグルコース誘導体(本明細書では、「Glc-EGn」(式中、Glcはグルコースであり、EGnは上記式(II)の化合物であり、且つnは当該式(II)の化合物におけるnと同一である)と称する場合がある)は、例えば下記実施例に示すように、B. Raoら, Chem. Commun., 2013年, 49, 10808-10810に記載の方法を参考にして合成することができる(なお、本明細書では、Glc-EGnをプライマーとして用いて作製した本発明に係るセルロース三次元構造体を、「OEG(オリゴエチレングリコール)化セルロース」と称する場合がある)。 αG1P and the glucose derivative of formula (III) may be commercially available. The glucose derivative of formula (III) can also be synthesized according to the method described in, for example, Z. Shi et al., J. Agric. Food Chem., 2014, 62, 3287-3292. In particular, a glucose derivative of formula (III) having oligoethylene glycol as hydrophilic substituent A having a repeating unit (herein, `` Glc-EG n '' ( where Glc is glucose and EG n is Is a compound of the formula (II), and n is sometimes the same as n in the compound of the formula (II))), for example, as shown in the examples below, B. Rao et al., Chem. Commun., 2013, 49, 10808-10810 can be synthesized with reference to the method (in this specification, the three-dimensional cellulose according to the present invention prepared using Glc-EG n as a primer) The structure may be referred to as “OEG (oligoethylene glycol) -modified cellulose”).
一方、CDPは、例えばM. Krishnareddyら, J. Appl. Glycosci., 2002年, 49, 1-8に記載の方法に準じて調製することができる。具体的には、M. Krishnareddyら, J. Appl. Glycosci., 2002年, 49, 1-8によれば、Clostridium thermocellum YM4株由来のCDPを調製することができる。 On the other hand, CDP can be prepared according to the method described in, for example, M. Krishnareddy et al., J. Appl. Glycosci., 2002, 49, 1-8. Specifically, according to M. Krishnareddy et al., J. Appl. Glycosci., 2002, 49, 1-8, CDP derived from Clostridium thermocellum YM4 strain can be prepared.
また、CDPの酵素量は、例えばαG1PとD-(+)-セロビオース及びCDPをインキュベーションし、CDPにより生成されるリン酸を定量し、1分間当たり1 μmolのリン酸を遊離する酵素量を1Uとして求めることができる。 The enzyme amount of CDP is determined by, for example, incubating αG1P with D-(+)-cellobiose and CDP, quantifying the phosphate produced by CDP, and determining the amount of enzyme that releases 1 μmol of phosphate per minute to 1 U. Can be obtained as
例えば、10〜1000mM(好ましくは100〜300mM)のαG1P、10〜200 mM(好ましくは50〜60 mM)の式(III)のグルコース誘導体、及び0.01〜1.5U/mL(好ましくは0.05〜0.50 U/mL)のCDPを、100〜1000mM(好ましくは250〜750 mM)の2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES)緩衝液(pH 7.0〜8.0（好ましくはpH 7.5）)中で混合し、10〜80℃(好ましくは、20〜60 ℃)で0.5〜30日間(好ましくは、1〜14日間)インキュベートし、反応させる。このようにして、本発明に係るセルロース三次元構造体を製造することができる。 For example, 10-1000 mM (preferably 100-300 mM) αG1P, 10-200 mM (preferably 50-60 mM) glucose derivative of formula (III), and 0.01-1.5 U / mL (preferably 0.05-0.50 U). CDP of 100-1000 mM (preferably 250-750 mM) 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) buffer (pH 7.0-8.0 (preferably Are mixed at pH 7.5)), incubated at 10-80 ° C. (preferably 20-60 ° C.) for 0.5-30 days (preferably 1-14 days) and allowed to react. In this manner, the cellulose three-dimensional structure according to the present invention can be manufactured.
３．本発明に係るセルロース三次元構造体の用途
３−１．医療分野
３−１−１．細胞培養足場材
本発明に係るセルロース三次元構造体は、その表面に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。
3. 3. Use of cellulose three-dimensional structure according to the present invention 3-1. Medical field 3-1-1. Cell culture scaffold The cellulose three-dimensional structure according to the present invention can be used as a scaffold for growing animal cells on the surface thereof.
生育させる細胞としては、動物由来であれば良く、例えば哺乳類、爬虫類、又は昆虫由来の細胞が挙げられる。また、心臓、肝臓、脾臓、表皮等の臓器や組織から分離した初代培養細胞でも、継代培養した株化細胞、腫瘍細胞でも良い。さらに、間葉系幹細胞(MSC)等の体性幹細胞、人工多能性幹細胞、CHO細胞、BHK細胞、Vero細胞等の細胞株(Cell Line)等でも良い。 The cells to be grown may be derived from animals, and examples include cells derived from mammals, reptiles, or insects. Further, primary cultured cells isolated from organs and tissues such as heart, liver, spleen and epidermis, subcultured established cells and tumor cells may be used. Furthermore, somatic stem cells such as mesenchymal stem cells (MSC), induced pluripotent stem cells, cell lines such as CHO cells, BHK cells, and Vero cells (Cell Line) may be used.
細胞培養に用いる培地としては、平衡塩類溶液にアミノ酸やビタミン等の低分子化合物を加えた基礎培地が挙げられる。さらに、血清或いは血清・組織抽出物、加水分解物、成長因子、ホルモン、搬送体タンパク質、脂質、ポリアミン酸、微量元素、ビタミン、増粘剤、界面活性剤、細胞接着因子等を添加した培地を使用することもできる。 Examples of the medium used for cell culture include a basal medium in which low molecular weight compounds such as amino acids and vitamins are added to a balanced salt solution. In addition, a medium supplemented with serum or serum / tissue extract, hydrolyzate, growth factor, hormone, carrier protein, lipid, polyamic acid, trace element, vitamin, thickener, surfactant, cell adhesion factor, etc. It can also be used.
当該セルロース三次元構造体を、薄膜状に成形して、薄膜の表面で細胞を培養できる。栄養成分を薄膜底面からも供給することで培養効率を高めることができる。 The cellulose three-dimensional structure can be formed into a thin film and cells can be cultured on the surface of the thin film. The culture efficiency can be increased by supplying the nutrient components also from the bottom surface of the thin film.
当該セルロース三次元構造体上に単層状に生育した細胞は、細胞剥離剤にて剥離し回収することができる。細胞剥離剤には、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)等の2価カチオン除去のためのキレート剤、細胞・基質間、細胞・細胞間接着タンパク質のためのトリプシン等のプロテアーゼを用いることもできるし、セルラーゼにより当該セルロース三次元構造体の一部又は全部を分解し、可溶化することで細胞を剥離することもできる。プロテアーゼを用いない後者の方法では、細胞・細胞間の接着は剥離することなく、また細胞への影響も無いことから、活性の高い懸濁細胞又は細胞シートを得ることができる。 Cells grown in a monolayer on the cellulose three-dimensional structure can be detached and recovered with a cell release agent. For cell detachment agents, chelating agents for removing divalent cations such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), proteases such as trypsin for cell-matrix, cell-cell adhesion proteins, and cellulase can be used. The cell can also be detached by decomposing and solubilizing part or all of the cellulose three-dimensional structure. In the latter method using no protease, the cell-cell adhesion does not peel off and does not affect the cells, so that a highly active suspension cell or cell sheet can be obtained.
得られた細胞シートは、同様に得られた細胞シートと積層するか、或いは細胞シートの表面を細胞間接着タンパク質等でコートし、さらに細胞を培養することで、三次元的に厚みを持った細胞塊を得ることができる。 The obtained cell sheet was laminated with the obtained cell sheet in the same manner, or the surface of the cell sheet was coated with an intercellular adhesion protein or the like, and further cultured, the cells were three-dimensionally thick. A cell mass can be obtained.
３−１−２．高濃度細胞培養用足場材
本発明に係るセルロース三次元構造体は、その内部に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。当該セルロース三次元構造体を、細胞が入ることができる大きさ程度又はそれ以上の空隙を持つ構造体に成形し、構造体の中で細胞を培養することができる。
3-1-2. Scaffold for high-concentration cell culture The cellulose three-dimensional structure according to the present invention can be used as a scaffold for growing animal cells therein. The cellulose three-dimensional structure can be formed into a structure having voids of a size that allows cells to enter or larger, and the cells can be cultured in the structure.
生育させる細胞は、上記の第３−１−１節に記載するように、動物由来であればどのような細胞でも良い。また、培養に用いる培地は、上記の第３−１−１節に記載するように、基礎培地、血清添加培地又はその他成分を添加した培地でも良い。 The cells to be grown may be any cells as long as they are derived from animals, as described in Section 3-1-1 above. The medium used for the culture may be a basal medium, a serum-added medium, or a medium supplemented with other components, as described in Section 3-1-1 above.
当該セルロース三次元構造体中で細胞を培養することで、浮遊懸濁培養の際に起こる撹拌のせん断応力による細胞の傷害が起こらず、培養液当たりの細胞の高濃度化が可能となる。 By culturing the cells in the cellulose three-dimensional structure, cell damage due to shearing stress generated during suspension suspension culture does not occur, and the concentration of cells per culture solution can be increased.
また、抗体やタンパク質等のバイオ医薬品の生成能を付与したrCHO細胞等を当該セルロース三次元構造体で高濃度に培養すれば、バッチ当たりの抗体やタンパク質等の生産量が増大し、バイオ医薬品の製造コスト低減が可能である。さらに、目的生産物を回収後、新しい培地を添加し、再度培養を行うか、或いは連続的に目的生産物を含む培地を回収し、新しい培地を追加添加することで、バッチ連続式又は連続式に生産物を得ることができる。 In addition, if rCHO cells, etc. that have been given the ability to produce biopharmaceuticals such as antibodies and proteins, are cultured at a high concentration in the cellulose three-dimensional structure, the production amount of antibodies and proteins per batch will increase, Manufacturing cost can be reduced. Furthermore, after collecting the target product, a new medium is added and cultured again, or a medium containing the target product is continuously collected and a new medium is additionally added. You can get a product.
さらに、高濃度培養した細胞は、足場材として利用したセルロース三次元構造体をセルラーゼ処理に供することで、プロテアーゼ処理の際に起こるような細胞への傷害を起こさずに細胞を遊離させ、回収することができる。iPS細胞やES細胞等の全能性幹細胞を当該手法で大量に培養し、再生医療や創薬産業のために必要な細胞を供給することができる。 Furthermore, cells that have been cultured at a high concentration can be recovered by subjecting the three-dimensional cellulose structure used as a scaffold to cellulase treatment to release the cells without causing damage to the cells as occurs during protease treatment. be able to. Totipotent stem cells such as iPS cells and ES cells can be cultured in large quantities by this method, and cells necessary for regenerative medicine and drug discovery industry can be supplied.
３−１−３．三次元構造体足場材
本発明に係るセルロース三次元構造体は、その内部に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。当該セルロース三次元構造体を、細胞が入ることができる大きさ程度又はそれ以上の空隙を持つ構造体に成形し、構造体の中で細胞を培養することができる。
3-1-3. Three-dimensional structure scaffold The cellulose three-dimensional structure according to the present invention can be used as a scaffold for growing animal cells therein. The cellulose three-dimensional structure can be formed into a structure having voids of a size that allows cells to enter or larger, and the cells can be cultured in the structure.
生育させる細胞は、上記の第３−１−１節に記載するように、動物由来であればどのような細胞でも良い。培養に用いる培地は、上記の第３−１−１節に記載するように、基礎培地、血清添加培地又はその他成分を添加した培地でも良い。 The cells to be grown may be any cells as long as they are derived from animals, as described in Section 3-1-1 above. The medium used for the culture may be a basal medium, a serum-added medium, or a medium to which other components are added, as described in Section 3-1-1 above.
当該セルロース三次元構造体を、細胞培養の前、途中又は後に、目的組織に合わせた形状に成形し、生体組織又は臓器の再生のために用いることができる。細胞培養の前に成形する場合、当該セルロース三次元構造体の重合反応時に目的の形状の型枠で反応させることもできるし、成形後に切断、積層、編み込み等で目的の形状にすることができる。 The cellulose three-dimensional structure can be formed into a shape suitable for a target tissue before, during or after cell culture and used for regeneration of a living tissue or organ. In the case of molding before cell culture, the cellulose three-dimensional structure can be reacted in a mold having a desired shape during the polymerization reaction, or can be formed into a desired shape by cutting, laminating, weaving, etc. after molding. .
当該セルロース三次元構造体は、セルラーゼ処理により、細胞へ影響することなく分解可溶化することができる。臓器への移植する前に、セルラーゼ処理に供し、部分的に、又は全部を分解可溶化しても良いし、セルラーゼ処理に供することなく足場材と共に移植しても良い。 The cellulose three-dimensional structure can be decomposed and solubilized by cellulase treatment without affecting the cells. Prior to transplantation into the organ, it may be subjected to cellulase treatment, and part or all may be decomposed and solubilized, or may be transplanted together with the scaffold without being subjected to cellulase treatment.
さらに、細胞を生育させた三次元構造体は、組織又は臓器の形状や機能を生体外(ex vivo)で再現したものとして、癌転移の機構解明、制癌剤の薬効評価等の基礎医学研究用、或いは、近年動物試験が禁止された化粧品の皮膚等の生体組織への影響を検討するための素材として利用することができる。 Furthermore, the three-dimensional structure in which the cells are grown is an ex vivo reproduction of the shape and function of the tissue or organ, elucidating the mechanism of cancer metastasis, and evaluating the efficacy of anticancer drugs. Alternatively, it can be used as a material for studying the effects of cosmetics, which have been prohibited from animal tests in recent years, on living tissues such as skin.
３−１−４．骨欠損部位への移植材料
本発明に係るセルロース三次元構造体は、動物の骨欠損部位への移植材料、歯周組織の再生誘導材料としても使用することができる。当該セルロース三次元構造体は、容易に望む形に成形加工することができ、高圧蒸気による滅菌も可能である。当該セルロース三次元構造体は、移植する前に細胞を生着させても良いし、そのまま移植しても良い。
3-1-4. Transplant Material to Bone Defect Site The cellulose three-dimensional structure according to the present invention can also be used as a transplant material to an animal bone defect site and a periodontal tissue regeneration-inducing material. The cellulose three-dimensional structure can be easily molded into a desired shape and can be sterilized by high-pressure steam. The cellulose three-dimensional structure may be engrafted with cells before transplantation, or may be transplanted as it is.
３−２．環境・エネルギー分野
下記に説明するように、本発明に係るセルロース三次元構造体は、フィルム(例えば、微多孔性のフィルム(用途例：セパレータ、吸着材、バイオセンサー等）、緻密なフィルム(用途例：バリアフィルム等))として環境・エネルギー分野において使用することができる。
3-2. Environment / Energy Field As described below, the cellulose three-dimensional structure according to the present invention includes a film (for example, a microporous film (application examples: separator, adsorbent, biosensor, etc.), a dense film (application). Example: barrier film etc.)) can be used in the environment / energy field.
３−２−１．電池セパレータ用途
本発明に係るセルロース三次元構造体は、例えばリチウムイオン電池等の二次電池向けのセパレータとしても用いることができる。セパレータとして用いることにより、従来のポリオレフィン製のセパレータに比べ、高い耐熱性を有するため、例えば、過充電等により、電池が異常発熱した場合に、セパレータが融解し、内部短絡することを防ぐことができ、安全性を向上させることができる。また、親水性置換基の存在により、一般的に電池に用いられる極性溶媒等をより保持しやすく、安定したイオン伝導性、すなわち電池の入出力特性の維持が期待でき、寿命を向上させることが可能である。
3-2-1. Application to Battery Separator The three-dimensional cellulose structure according to the present invention can be used as a separator for a secondary battery such as a lithium ion battery. By using it as a separator, it has higher heat resistance than conventional polyolefin separators. For example, when the battery overheats due to overcharging, etc., it prevents the separator from melting and causing an internal short circuit. And safety can be improved. In addition, the presence of hydrophilic substituents makes it easier to retain polar solvents and the like that are generally used in batteries, and can be expected to maintain stable ion conductivity, that is, the input / output characteristics of the battery, thereby improving the lifetime. Is possible.
３−２−２．吸着材、濃縮(生分解性)
本発明に係るセルロース三次元構造体は、シリカ、アルミナ、ゼオライト、プルシアンブルー等の吸着材微粒子を分散、担持させることにより、アンモニア、アルデヒド等の有毒ガス、放射性廃棄物等の有害物質、海水中の有価金属等を吸着回収することが可能である。
3-2-2. Adsorbent, concentration (biodegradable)
The cellulose three-dimensional structure according to the present invention is obtained by dispersing and supporting adsorbent fine particles such as silica, alumina, zeolite, Prussian blue, etc., toxic gases such as ammonia and aldehydes, harmful substances such as radioactive waste, It is possible to absorb and recover valuable metals.
また、当該セルロース三次元構造体は、分解酵素を用いて簡単に分解可能であることから、吸着回収した物質を必要に応じて簡単に濃縮することができるといった特長も有する。 In addition, since the cellulose three-dimensional structure can be easily decomposed using a degrading enzyme, it has an advantage that the substance collected by adsorption can be easily concentrated as necessary.
３−２−３．バイオセンサー
本発明に係るセルロース三次元構造体は、酵素や抗体を担持することによってバイオセンサーとして使用することができる。例えば、グルコースオキシダーゼ等の酵素を担持すればグルコースセンサーとして使用することが可能であり、親水性置換基を活用し、例えば、ナトリウムイオン等のイオン伝導特性を観測すれば、血中のナトリウムイオン濃度等を計測するセンサーとして使用することが可能である。
3-2-3. Biosensor The three-dimensional cellulose structure according to the present invention can be used as a biosensor by supporting an enzyme or an antibody. For example, if an enzyme such as glucose oxidase is supported, it can be used as a glucose sensor. By utilizing hydrophilic substituents and observing ion conduction characteristics such as sodium ions, the concentration of sodium ions in the blood It can be used as a sensor that measures the above.
３−２−４．ガスバリアシート(構造体も含む)
本発明に係るセルロース三次元構造体に無機ナノ材料を緻密に担持させることにより、例えば水蒸気等のガスを遮断するガスバリアシートとすることができる。無機ナノ材料としては、シリカ等のナノ粒子、又はモンモリロナイト等のクレイが挙げられる。これら無機ナノ材料と親水性置換基とは親和性が高く、強く相互作用するため、無機ナノ材料を強固に取り込んだ複合材料を形成し、バリア性を向上させることが可能である。
3-2-4. Gas barrier sheet (including structure)
By densely supporting the inorganic nanomaterial on the cellulose three-dimensional structure according to the present invention, for example, a gas barrier sheet that blocks gas such as water vapor can be obtained. Examples of the inorganic nanomaterial include nanoparticles such as silica or clay such as montmorillonite. Since these inorganic nanomaterials and hydrophilic substituents have high affinity and interact strongly, it is possible to form a composite material that strongly incorporates inorganic nanomaterials and improve barrier properties.
３−２−５．放熱シート
本発明に係るセルロース三次元構造体に高熱伝導率を持つ材料を緻密に担持させることにより、放熱材料として使用することが可能である。高熱伝導率を持つ材料としては、ダイヤモンド、グラフェン、カーボンナノチューブ等の炭素系材料、銀、銅、金、アルミニウム等の金属材料、アルミナ、マグネシア、六方晶窒化ホウ素等の無機材料等が挙げられる。また、親水性置換基により、シート表面を柔らかくすることが可能であり、発熱体との密着性を改善させ、熱界面抵抗を低減することにより、放熱性を改善することが可能である。
3-2-5. Heat-dissipating sheet It is possible to use as a heat-dissipating material by densely supporting a material having high thermal conductivity on the three-dimensional cellulose structure according to the present invention. Examples of the material having high thermal conductivity include carbon-based materials such as diamond, graphene, and carbon nanotubes, metal materials such as silver, copper, gold, and aluminum, and inorganic materials such as alumina, magnesia, and hexagonal boron nitride. In addition, the hydrophilic substituent can soften the sheet surface, and can improve heat dissipation by improving adhesion to the heating element and reducing thermal interface resistance.
３−２−６．蓄熱シート
本発明に係るセルロース三次元構造体に蓄熱性を有する材料を分散、担持させることにより、蓄熱材として使用することが可能である。蓄熱材としては、エリスリトール、酢酸ナトリウム3水塩、硫酸ナトリウム10水塩、パラフィン、Fe-Co合金等の潜熱蓄熱材、その他、顕熱蓄熱材、化学蓄熱材等が挙げられる。潜熱蓄熱材は物質の相転移を利用するものであり、固液相転移を利用する蓄熱材の場合は、液状となった場合に漏洩が生じないように工夫する必要があり、例えば石油樹脂等のカプセル内に包含させる方法がある。
3-2-6. Thermal storage sheet It is possible to use as a thermal storage material by disperse | distributing and carrying the material which has thermal storage property in the cellulose three-dimensional structure which concerns on this invention. Examples of the heat storage material include erythritol, sodium acetate trihydrate, sodium sulfate decahydrate, latent heat storage material such as paraffin, Fe-Co alloy, sensible heat storage material, chemical heat storage material, and the like. The latent heat storage material uses the phase transition of the substance, and in the case of the heat storage material using the solid-liquid phase transition, it is necessary to devise so that no leakage occurs when it becomes liquid, such as petroleum resin There is a method of inclusion in the capsule.
３−２−７．分離精製の基材(カラムの充填剤、電気泳動)
本発明に係るセルロース三次元構造体は、ナノサイズの空間を有しているため、当該空間を利用して分離精製カラムや電気泳動の充填剤として用いることが可能である。
3-2-7. Separation and purification substrate (column packing, electrophoresis)
Since the three-dimensional cellulose structure according to the present invention has a nano-sized space, it can be used as a separation / purification column or a packing for electrophoresis using the space.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to these Examples.
〔OEG化セルロースオリゴマーからなる三次元構造体の酵素合成〕
１．実験方法
１−１．試薬
LB-BROTH LENNOX及びLB-AGAR LENNOXはフナコシより購入した。
グリセロール、カナマイシン硫酸塩、イソプロピル-β-D(-)-チオガラクトピラノシド (Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside: IPTG)、N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン (N,N,N',N'-Tetramethyl ethylenediamine: TEMED)、ジチオトレイトール (Dithiothreitol: DTT)、1-ブタノール、αG1P二ナトリウム・n水和物、40％重水酸化ナトリウム重水溶液、モレキュラーシーブス4A、ダウエクスTM50WX4 100-200メッシュ強酸性陽イオン交換樹脂は和光純薬より購入した。
[Enzymatic synthesis of three-dimensional structures composed of OEG-modified cellulose oligomers]
1. Experimental method 1-1. reagent
LB-BROTH LENNOX and LB-AGAR LENNOX were purchased from Funakoshi.
Glycerol, Kanamycin sulfate, Isopropyl-β-D (-)-thiogalactopyranoside (IPTG), N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine (N , N, N ', N'-Tetramethyl ethylenediamine: TEMED), Dithiothreitol (DTT), 1-butanol, αG1P disodium n-hydrate, 40% sodium bicarbonate aqueous solution, molecular sieves 4A, Dowex TM 50WX4 100-200 mesh strong acid cation exchange resin was purchased from Wako Pure Chemical.
ジクロロメタン、酢酸エチル、シリカゲル60N (40-100 μm, 球状、中性) は関東化学より購入した。 Dichloromethane, ethyl acetate and silica gel 60N (40-100 μm, spherical, neutral) were purchased from Kanto Chemical.
O-ペンタアセチル-β-D-グルコシド、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、テトラエチレングリコールモノメチルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノメチルエーテル、オクタエチレングリコールモノメチルエーテル、三ふっ化ホウ素ジエチルエーテル、p-アニスアルデヒドは東京化成より購入した。 O-pentaacetyl-β-D-glucoside, diethylene glycol monomethyl ether, tetraethylene glycol monomethyl ether, hexaethylene glycol monomethyl ether, octaethylene glycol monomethyl ether, boron trifluoride diethyl ether, and p-anisaldehyde were purchased from Tokyo Kasei. .
ニッケル-ニトリロ三酢酸 (Ni-NTA) アガロースゲルはQIAGENより購入した。
Protein Molecular Weight Marker (Broad) はタカラバイオより購入した。
Nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) agarose gel was purchased from QIAGEN.
Protein Molecular Weight Marker (Broad) was purchased from Takara Bio.
アクリルアミド、N-N'-メチレンビスアクリルアミド、ドデシル硫酸ナトリウム (Sodium dodecyl sulfate: SDS)、過硫酸アンモニウム (Ammonium persulfate: APS)、重水、2,5-ジヒドロキシ安息香酸 (2,5-Dihydroxybenxonic acid: DHBA)、ProteoMassTMBradykinin fragment 1-7 MALDI-MSスタンダード (Bradykinin)、ProteoMassTM P14R MALDI-MSスタンダード(P14R)、ProteoMassTMACTH Fragment 18-39 MALDI-MSスタンダード (ACTH)、トリフルオロ酢酸 (TFA)、アセトニトリルはSigma-Aldrichより購入した。 Acrylamide, N-N'-methylenebisacrylamide, sodium dodecyl sulfate (SDS), ammonium persulfate (APS), heavy water, 2,5-dihydroxybenxonic acid (DHBA) , ProteoMass TM Bradykinin fragment 1-7 MALDI-MS standard (Bradykinin), ProteoMass TM P 14 R MALDI-MS standard (P 14 R), ProteoMass TM ACTH Fragment 18-39 MALDI-MS standard (ACTH), trifluoroacetic acid ( TFA) and acetonitrile were purchased from Sigma-Aldrich.
カーボンテープ、ドータイトは日新EMより購入した。
その他の試薬は、特に表記しない限りナカライテスクより購入し、特級以上の試薬を使用した。
Carbon tape and dotite were purchased from Nissin EM.
Other reagents were purchased from Nacalai Tesque unless otherwise noted, and special grade or better reagents were used.
超純水は、Milli-Qシステム (Milli-Q Advantage A-10, Merck Millipore) で精製された水を使用した。 As the ultrapure water, water purified by the Milli-Q system (Milli-Q Advantage A-10, Merck Millipore) was used.
純水はTANK 60 Lite PE (Merck Millipore) で精製された水を使用した。
乾燥ジクロロメタンはGlass Contour有機溶剤精製装置 (Nikko Hansen) で精製されたジクロロメタンを使用した。
Pure water used was purified by TANK 60 Lite PE (Merck Millipore).
As the dry dichloromethane, dichloromethane purified with a Glass Contour organic solvent purifier (Nikko Hansen) was used.
１−２．CDPの調製及び酵素活性評価
CDPは、M. Krishnareddyら, J. Appl. Glycosci., 2002年, 49, 1-8に記載の方法と同様の方法により調製した。
1-2. Preparation of CDP and evaluation of enzyme activity
CDP was prepared by a method similar to that described in M. Krishnareddy et al., J. Appl. Glycosci., 2002, 49, 1-8.
１−２−１．試薬の調製
(1) 滅菌精製水
500 mL広口メディウム瓶に超純水500 mLを採取してオートクレーブ (121 ℃、20 min、BS-245、TOMY) して室温で保存した。
(2) 50 mg/mLカナマイシンストック溶液
カナマイシン硫酸塩1.5 gを滅菌精製水に溶解させ、30 mLにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内でポリフッ化ビニリデン (Polyvinylidene difluoride: PVDF) 製0.22 μmフィルターで濾過滅菌し、1.7 mLチューブに1 mLずつ分注して-20 ℃で保存した。
(3) 10 mM IPTGストック溶液
IPTG 71.5 mgを滅菌精製水に溶解させ、30 mLにメスアップした。調製した溶液をクリーンベンチ内でPVDF製0.22 μmフィルターで濾過滅菌した。1.7 mLチューブに1 mLずつ分注して-20 ℃で保存した。
(4) LB-AGAR/カナマイシンプレート
250 mL広口メディウム瓶にLB-AGAR LENNOX 2.8 gを採取し、超純水80 mLを添加して溶解させてオートクレーブした。60 ℃以下まで室温で冷却した後、クリーンベンチ内で50 mg/mLカナマイシンストック溶液80 μLを加えて混合した。滅菌済みシャーレに分注して室温で固化させた後、4 ℃で保存した。調製後1ヶ月以内に使用した。
(5) 50％グリセロール溶液
250 mL広口メディウム瓶にグリセロール50 mL、超純水50 mLを加えて混合した後、オートクレーブして室温で保存した。
(6) LB培地
500 mL広口メディウム瓶にLB-BROTH LENNOX 10 gを純水500 mLに溶解させ、オートクレーブして室温で保存した。
(7) MOPS-Na緩衝液(20 mM、pH 7.5)
3-モルホリノプロパンスルホン酸 (MOPS) 4.18 gを約600 mLの超純水に溶解させた。4 N水酸化ナトリウム水溶液によりpH 7.5に調整後、1 Lにメスアップした。PVDF製0.10 μmフィルターで濾過滅菌して4 ℃で保存した。
(8) 70％エタノール (バイオテクノロジーグレード)
エタノール (バイオテクノロジーグレード) 140 mL及び超純水60 mLを250 mL広口メディウム瓶に採取して混合した後、室温で保存した。
(9) 洗浄バッファー (20 mM MOPS、300 mM NaCl、10 mMイミダゾール、pH 7.5)
MOPS 2.09 g、塩化ナトリウム8.77 g、イミダゾール340 mgを約350 mLの超純水に溶解させた。4 N水酸化ナトリウム水溶液によりpH 7.5に調整後、500 mLにメスアップした。PVDF製0.10 μmフィルターで濾過滅菌して4 ℃で保存した。
(10) 溶出バッファー (20 mM MOPS、300 mM NaCl、250 mMイミダゾール、pH 7.5)
MOPS 2.09 g、塩化ナトリウム8.77 g、イミダゾール8.51 gを約350 mLの超純水に溶解させた。4 N水酸化ナトリウム水溶液によりpH 7.5に調整後、500 mLにメスアップした。PVDF製0.10 μmフィルターで濾過滅菌して4 ℃で保存した。
(11) 5％ (w/v) アジ化ナトリウムストック溶液
アジ化ナトリウム500 mgをプラスチック製スパチュラにより秤量してMOPS-Na緩衝液 (20 mM、pH 7.5) を添加して全量が10 mLとなるよう溶解させて4 ℃で遮光保存した。
(12) 30％アクリルアミド/ビス混合溶液
アクリルアミドは劇物であるため、調製には細心の注意を払った。アクリルアミド29.2 g、N-N'-メチレンビスアクリルアミド0.8 gを約70 mLの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が100 mLになるようにメスアップして4 ℃で遮光保存した。
(13) Tris-HCl緩衝液 (1.5 M、pH 8.8)
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris) 18.17 gを約80 mLの超純水に撹拌しながら溶解させた。6 N塩酸によりpH 8.8に調整後、全量が100 mLになるようにメスアップして4℃で保存した。
(14) Tris-HCl緩衝液 (0.5 M、pH 6.8)
Tris 6.06 gを約80 mLの超純水に撹拌しながら溶解させた。6 N塩酸によりpH 6.8に調整後、全量が100 mLになるようにメスアップして4 ℃で保存した。
(15) 10％ SDS水溶液
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS） 10 gを約90 mLの超純水に撹拌しながら溶解させた。全量が100 mLになるようにメスアップして室温で保存した。
(16) 10％ APS水溶液
過硫酸アンモニウム (APS) 0.1 gを約1 mLの超純水に溶解させて4℃で保存した。
(17) 飽和1-ブタノール
1-ブタノールと超純水を2：1の割合で混合して室温で保存した。
(18) 5×泳動バッファー(125 mM Tris、960 mM グリシン、0.5％ SDS)
Tris 15.1 g、グリシン72.1 g、SDS 5.0 gを全量が1 Lとなるように超純水に溶解させて4 ℃で保存した。使用の際は超純水で5倍に希釈した。一度使用した泳動バッファーは回収して再度使用し、使用回数は最大で2回とした。
(19) 5×Loadingバッファー (200 mM Tris、0.05％ブロモフェノールブルー、10％SDS、50％グリセロール)
Tris 2.42 g、SDS 10.0 g、ブロモフェノールブルー50 mgを50 mLのグリセロールと約40 mLの超純水を添加して溶解させた。6 N塩酸を用いてpH 6.8に調整後、100 mLにメスアップした。1.7 mLチューブに1 mLずつ分注して4 ℃で保存した。
(20) 1 M DTT溶液
ジチオトレイトール (DTT) 約150 mgを1 Mとなるように約1 mLの超純水を添加して溶解させ、-20 ℃で保存した。
(21) 固定液
酢酸50 mL、エタノール200 mLを混合した後、超純水で500 mLにメスアップして室温で保存した。
(22) 脱色液
酢酸40 mL、エタノール125 mLを混合した後、超純水で500 mLにメスアップして室温で保存した。
(23) 染色液
クマシーブリリアントブルー R-250 0.25 gを脱色液100 mLに加え、撹拌して溶解させて室温で遮光保存した。
1-2-1. Reagent preparation
(1) Sterile purified water
500 mL of ultrapure water was collected in a 500 mL wide-mouthed medium bottle and autoclaved (121 ° C., 20 min, BS-245, TOMY) and stored at room temperature.
(2) 50 mg / mL kanamycin stock solution 1.5 g of kanamycin sulfate was dissolved in sterilized purified water and made up to 30 mL. The prepared solution was sterilized by filtration through a 0.22 μm filter made of polyvinylidene difluoride (PVDF) in a clean bench, dispensed in 1 mL portions into 1.7 mL tubes, and stored at −20 ° C.
(3) 10 mM IPTG stock solution
71.5 mg of IPTG was dissolved in sterilized purified water and made up to 30 mL. The prepared solution was sterilized by filtration through a PVDF 0.22 μm filter in a clean bench. 1 mL was dispensed into 1.7 mL tubes and stored at −20 ° C.
(4) LB-AGAR / Kanamycin plate
2.8 g of LB-AGAR LENNOX was collected in a 250 mL wide-mouthed medium bottle, dissolved by adding 80 mL of ultrapure water, and autoclaved. After cooling to 60 ° C. or less at room temperature, 80 μL of a 50 mg / mL kanamycin stock solution was added and mixed in a clean bench. After dispensing into a sterilized petri dish and solidifying at room temperature, it was stored at 4 ° C. Used within 1 month after preparation.
(5) 50% glycerol solution
After adding and mixing 50 mL of glycerol and 50 mL of ultrapure water in a 250 mL wide-mouthed medium bottle, the mixture was autoclaved and stored at room temperature.
(6) LB medium
LB-BROTH LENNOX 10 g was dissolved in 500 mL of pure water in a 500 mL wide-mouthed medium bottle, autoclaved and stored at room temperature.
(7) MOPS-Na buffer (20 mM, pH 7.5)
4.18 g of 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) was dissolved in about 600 mL of ultrapure water. The pH was adjusted to 7.5 with 4N aqueous sodium hydroxide solution, and the volume was adjusted to 1 L. The solution was sterilized by filtration through a PVDF 0.10 μm filter and stored at 4 ° C.
(8) 70% ethanol (biotechnology grade)
Ethanol (biotechnology grade) 140 mL and ultrapure water 60 mL were collected in a 250 mL wide-mouthed medium bottle, mixed, and stored at room temperature.
(9) Washing buffer (20 mM MOPS, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 7.5)
MOPS 2.09 g, sodium chloride 8.77 g, and imidazole 340 mg were dissolved in about 350 mL of ultrapure water. The pH was adjusted to 7.5 with 4N aqueous sodium hydroxide solution, and the volume was adjusted to 500 mL. The solution was sterilized by filtration through a PVDF 0.10 μm filter and stored at 4 ° C.
(10) Elution buffer (20 mM MOPS, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 7.5)
MOPS 2.09 g, sodium chloride 8.77 g, and imidazole 8.51 g were dissolved in about 350 mL of ultrapure water. The pH was adjusted to 7.5 with 4N aqueous sodium hydroxide solution, and the volume was adjusted to 500 mL. The solution was sterilized by filtration through a PVDF 0.10 μm filter and stored at 4 ° C.
(11) 5% (w / v) sodium azide stock solution Weigh 500 mg of sodium azide with a plastic spatula and add MOPS-Na buffer (20 mM, pH 7.5) to a total volume of 10 mL. It was dissolved so that it was stored in the dark at 4 ° C.
(12) 30% acrylamide / bis mixed solution Since acrylamide is a deleterious substance, great care was taken in its preparation. Acrylamide (29.2 g) and N—N′-methylenebisacrylamide (0.8 g) were dissolved in about 70 mL of ultrapure water with stirring. The volume was increased to 100 mL and stored in the dark at 4 ° C.
(13) Tris-HCl buffer (1.5 M, pH 8.8)
18.17 g of tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) was dissolved in about 80 mL of ultrapure water with stirring. After adjusting to pH 8.8 with 6 N hydrochloric acid, the volume was adjusted to 100 mL and stored at 4 ° C.
(14) Tris-HCl buffer (0.5 M, pH 6.8)
Tris 6.06 g was dissolved in about 80 mL of ultrapure water with stirring. After adjusting to pH 6.8 with 6 N hydrochloric acid, the volume was adjusted to 100 mL and stored at 4 ° C.
(15) 10% SDS aqueous solution 10 g of sodium dodecyl sulfate (SDS) was dissolved in about 90 mL of ultrapure water with stirring. The volume was made up to 100 mL and stored at room temperature.
(16) 10% APS aqueous solution 0.1 g of ammonium persulfate (APS) was dissolved in about 1 mL of ultrapure water and stored at 4 ° C.
(17) Saturated 1-butanol
1-butanol and ultrapure water were mixed at a ratio of 2: 1 and stored at room temperature.
(18) 5 × running buffer (125 mM Tris, 960 mM glycine, 0.5% SDS)
Tris 15.1 g, glycine 72.1 g, and SDS 5.0 g were dissolved in ultrapure water to a total volume of 1 L and stored at 4 ° C. When used, it was diluted 5 times with ultrapure water. The electrophoresis buffer used once was collected and used again, and the maximum number of use was two.
(19) 5 × Loading buffer (200 mM Tris, 0.05% bromophenol blue, 10% SDS, 50% glycerol)
Tris 2.42 g, SDS 10.0 g, and bromophenol blue 50 mg were dissolved by adding 50 mL of glycerol and about 40 mL of ultrapure water. The pH was adjusted to 6.8 with 6 N hydrochloric acid, and the volume was adjusted to 100 mL. 1 mL was dispensed into 1.7 mL tubes and stored at 4 ° C.
(20) 1 M DTT solution About 150 mg of dithiothreitol (DTT) was dissolved by adding about 1 mL of ultrapure water to 1 M and stored at −20 ° C.
(21) Fixing solution After mixing 50 mL of acetic acid and 200 mL of ethanol, it was made up to 500 mL with ultrapure water and stored at room temperature.
(22) Decoloring solution After mixing 40 mL of acetic acid and 125 mL of ethanol, it was made up to 500 mL with ultrapure water and stored at room temperature.
(23) Staining solution Coomassie brilliant blue R-250 (0.25 g) was added to 100 mL of decoloring solution, dissolved by stirring, and stored at room temperature in a dark place.
１−２−２．大腸菌の培養及びCDPの発現
(1) E. coli BL21-CDPグリセロールストックの調製
ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、CDPの遺伝子を含むプラスミドをもつEscherichia coli BL21-Gold(DE3)株 (E. coli BL21-CDP) のグリセロールストックからLB-AGAR/カナマイシンプレートに植菌し、37 ℃で8-12 h培養した。加熱した白金耳を用いてシングルコロニーから、予め乾熱滅菌した試験管に加えた50 mg/mLカナマイシンストック溶液5 μLとLB培地5 mLの混合溶液に植菌した。OD660が0.6-0.8に達するまで振盪培養機（BR-23FP、TAITEC）で37 ℃で振盪培養（往復、200 rpm）した。その後、培養液800 μLを1.7 mLチューブに採取し、50 ％グリセロール溶液100 μLを添加して混合した。液体窒素で凍結して-80℃で保存した。
1-2-2. E. coli culture and CDP expression
(1) Preparation of E. coli BL21-CDP glycerol stock Escherichia coli BL21-Gold (DE3) strain carrying a plasmid containing the CDP gene using a platinum loop sterilized by heating with a gas burner and allowed to cool (E. coli BL21-CDP) glycerol stocks were inoculated into LB-AGAR / kanamycin plates and cultured at 37 ° C. for 8-12 h. Using a heated platinum loop, a single colony was used to inoculate a mixed solution of 5 μL of 50 mg / mL kanamycin stock solution and 5 mL of LB medium added to a test tube previously sterilized by dry heat. Shaking culture (reciprocating, 200 rpm) was performed at 37 ° C. in a shaking incubator (BR-23FP, TAITEC) until OD 660 reached 0.6-0.8. Thereafter, 800 μL of the culture solution was collected in a 1.7 mL tube, and 100 μL of a 50% glycerol solution was added and mixed. It was frozen with liquid nitrogen and stored at -80 ° C.
(2) E. coli BL21-CDPマスタープレートの調製
ガスバーナーで加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、E. coli BL21-CDPのグリセロールストックもしくは作製後1ヶ月以内のマスタープレートからLB-AGAR/カナマイシンプレートに植菌して37 ℃で8-12 h培養した。マスタープレートから植菌した場合はそのまま4 ℃で保存した。グリセロールストックから植菌した場合は、さらにLB-AGAR/カナマイシンプレートに植菌して37 ℃で8-12 h培養して4 ℃で保存した。
(2) Preparation of E. coli BL21-CDP master plate Use a platinum loop that has been sterilized by heating with a gas burner and left to cool, from the glycerol stock of E. coli BL21-CDP or the master plate within one month after preparation. AGAR / kanamycin plates were inoculated and cultured at 37 ° C. for 8-12 h. When inoculated from the master plate, it was stored at 4 ° C. When inoculated from a glycerol stock, it was further inoculated into an LB-AGAR / kanamycin plate, cultured at 37 ° C for 8-12 h, and stored at 4 ° C.
(3) E. coli BL21-CDP前培養液の調製
乾熱滅菌した試験管にLB培地3 mLを採取して50 mg/mLカナマイシンストック溶液3 μLを加えた。加熱滅菌し、放冷した白金耳を用いて、E. coli BL21-CDPマスタープレートのシングルコロニーから植菌した。振盪培養機を用いて37℃で10-12 h振盪培養 (往復、200 rpm） した。
(3) Preparation of E. coli BL21-
(4) E. coli BL21-CDPの培養とCDPの発現
2本の1 Lバッフル付きフラスコにLB-BROTH LENNOX 6 gをそれぞれ秤量して純水300 mLを加えてオートクレーブして放冷した。50 mg/mLカナマイシンストック溶液300 μLをそれぞれに添加して混合した後、E. coli BL21-CDP前培養液300 μLを加えた。振盪培養機を用いて30 ℃で振盪培養 (回転、600 rpm) してOD660が0.55-0.60に達したことを確認後、10 mM IPTGストック溶液3 mLをそれぞれ加えて25 ℃で20 h振盪培養 (回転、200 rpm) してCDPを発現させた。
(4) E. coli BL21-CDP culture and CDP expression
LB-BROTH LENNOX 6 g was weighed into two 1 L baffled flasks, 300 mL of pure water was added, and autoclaved to cool. After adding and mixing 300 μL of 50 mg / mL kanamycin stock solution to each, 300 μL of E. coli BL21-CDP preculture was added. After shaking culture (rotation, 600 rpm) using a shaking incubator and confirming that OD 660 reached 0.55-0.60, add 3 mL each of 10 mM IPTG stock solution and shake at 25 ° C for 20 h. CDP was expressed by culturing (rotation, 200 rpm).
１−２−３．Hisタグ精製及び緩衝液置換
(1) E. coli BL21-CDPの破砕によるCDPの抽出
１−２−２項(2)で調製したCDPを発現させたE. coli BL21-CDP懸濁液を50 mLチューブ12本に約50 mLずつ均等に分注し、遠心機 (遠心機：EX-126、TOMY、ローター：3850-04P、TOMY) を用いて遠心 (3500 rpm、20 min、4 ℃) した。上清をデカンテーションにより除去し、沈澱したE. coli BL21-CDPペレットにMOPS-Na緩衝液 (20 mM、pH 7.5) を加えてそれぞれ約15 mLにメスアップし、手で激しく振盪して懸濁させた。E. coli BL21-CDP懸濁液を4本の100 mL自立式チューブに約45 mLずつ分注し、氷浴しながらプローブ式超音波照射器 (Sonifier 250、BRANSON) を用いて超音波照射してE. coli BL21-CDPを破砕した。超音波照射は、power: 200 W (ダイヤル10)、duty cycle: 30％の条件で2サイクル (5 s超音波照射と25 sインターバルの4回繰り返しを1サイクル) 行った。E. coli BL21-CDP破砕液にはCDPの他にプロテアーゼ等が含まれていることから、それらによるCDPの分解を防ぐために、以降はE. coli破砕液は常に氷浴した。4本の100 mLチューブ中のE. coli BL21-CDP破砕液をそれぞれ50 mLチューブに移して遠心 (3500 rpm、>20 min、4℃)した。沈澱したE. coliペレットが舞わないよう注意を払いながら、デカンテーションにより上清を50 mLチューブに回収した。
1-2-3. His tag purification and buffer replacement
(1) Extraction of CDP by disruption of E. coli BL21-CDP About 50 suspensions of E. coli BL21-CDP suspension expressing CDP prepared in 1-2-2 (2) were prepared in 12 50 mL tubes. The solution was equally dispensed in mL, and centrifuged (3500 rpm, 20 min, 4 ° C.) using a centrifuge (centrifuge: EX-126, TOMY, rotor: 3850-04P, TOMY). Remove the supernatant by decantation, add MOPS-Na buffer (20 mM, pH 7.5) to the precipitated E. coli BL21-CDP pellet, make up to about 15 mL each, and shake vigorously by hand. Made cloudy. Dispense approximately 45 mL of E. coli BL21-CDP suspension into four 100 mL self-supporting tubes, and irradiate with a probe type ultrasonic irradiator (Sonifier 250, BRANSON) while immersing in an ice bath. E. coli BL21-CDP was disrupted. The ultrasonic irradiation was performed under the conditions of power: 200 W (dial 10) and duty cycle: 30% (2 cycles of 5 s ultrasonic irradiation and 4 repetitions of 25 s interval). Since the E. coli BL21-CDP disruption solution contains protease and the like in addition to CDP, the E. coli disruption solution was always kept in an ice bath to prevent the degradation of CDP by them. Each E. coli BL21-CDP disruption solution in four 100 mL tubes was transferred to a 50 mL tube and centrifuged (3500 rpm,> 20 min, 4 ° C.). The supernatant was collected into a 50 mL tube by decantation while paying attention not to allow the precipitated E. coli pellet to flutter.
(2) Ni-NTAアフィニティーカラムによるCDPの精製
コンタミネーションを避けるため、以後の精製操作で用いるマイクロピペットのチップ及び1.7 mLチューブはオートクレーブ後乾燥して用いた。
(2) Purification of CDP using Ni-NTA affinity column In order to avoid contamination, the micropipette tip and 1.7 mL tube used in the subsequent purification operation were used after autoclaving and drying.
予め70％エタノールで滅菌し、超純水で置換した直径1.8 cm、長さ10 cmのプラスチック製カラムに、Ni-NTAアガロースゲル （GE Healthcare） 分散液9.8 mLを充填した。カラム内を１−２−１項(8)で調製した70％エタノールで満たして流すことでNI-NTAアガロースゲルを殺菌・洗浄した。この操作を2回繰り返した。MOPS-Na緩衝液 (20 mM、pH 7.5) 3 mLをアプライして流し、さらに3 mLアプライした。スパチュラで撹拌もしくはマイクロピペットでピペッティングしてNi-NTAアガロースゲルを再分散させて気泡を取り除いた。その後、MOPS-Na緩衝液 (20 mM、pH 7.5) 5 mLで4回置換した。 A 1.9 mL Ni-NTA agarose gel (GE Healthcare) dispersion was packed in a plastic column with a diameter of 1.8 cm and a length of 10 cm that had been sterilized with 70% ethanol in advance and replaced with ultrapure water. The NI-NTA agarose gel was sterilized and washed by filling the column with 70% ethanol prepared in 1-2-1 (8) and flowing it. This operation was repeated twice. MOPS-Na buffer (20 mM, pH 7.5) 3 mL was applied and flowed, and then 3 mL was applied. Ni-NTA agarose gel was redispersed by stirring with a spatula or pipetting with a micropipette to remove bubbles. After that, it was replaced four times with 5 mL of MOPS-Na buffer (20 mM, pH 7.5).
E. coli BL21-CDP破砕液の上清をカラムにアプライし、カラムより流出した溶液を回収してフロースルー溶液とした。洗浄バッファー3-5 mLをアプライして置換し、さらに3-5 mLアプライした。ピペッティングによりNi-NTAアガロースゲルを再分散させてゲル層の表面を均一にした後アプライした洗浄バッファーを流した。さらに洗浄バッファー5 mLをアプライして置換する操作を繰り返し、合計で30 mL以上をアプライした。洗浄バッファーをアプライした際に通過した溶液は全て回収し、洗浄液とした。その後、溶出バッファー3-5 mLをアプライし、1.7 mLチューブに1 mLずつフラクションに分けて回収し、溶出液とした。この操作を繰り返し、合計で溶出バッファー25 mLをアプライした。それぞれのフラクションの吸光度を微量紫外可視分光光度計(NanoDrop 2000c、Thermo Scientific) で測定し、280 nmの吸光度を指標にタンパク質の溶出を確認した。この際、バックグラウンド測定には超純水を用いた。タンパク質の溶出が完了していない場合は、280 nmの吸収が無くなるまでカラムに溶出バッファーをアプライした。回収した溶出液のうち、吸光度が高いフラクションを回収し、CDP溶液とした。 The supernatant of the E. coli BL21-CDP disruption solution was applied to the column, and the solution that flowed out of the column was collected to obtain a flow-through solution. 3-5 mL of washing buffer was applied and replaced, and 3-5 mL was further applied. The Ni-NTA agarose gel was redispersed by pipetting to make the surface of the gel layer uniform, and then the applied washing buffer was flowed. Furthermore, the operation of applying and replacing 5 mL of washing buffer was repeated, and a total of 30 mL or more was applied. All solutions that passed when the washing buffer was applied were collected and used as a washing solution. Thereafter, 3-5 mL of elution buffer was applied, and each 1 mL fraction was collected in a 1.7 mL tube and collected as an eluate. This operation was repeated, and a total of 25 mL of elution buffer was applied. The absorbance of each fraction was measured with a micro ultraviolet-visible spectrophotometer (NanoDrop 2000c, Thermo Scientific), and protein elution was confirmed using the absorbance at 280 nm as an index. At this time, ultrapure water was used for background measurement. If protein elution was not complete, elution buffer was applied to the column until there was no absorbance at 280 nm. Among the collected eluate, a fraction having high absorbance was collected and used as a CDP solution.
(3) CDP溶液の緩衝液置換
CDP溶液の緩衝液置換はPD10カラム (Sephadex G-25、GE Healthcare) を用いて、付属の説明書に従って行った。CDP溶液の容量に応じて、必要な数のPD10カラムを用いた。付属のアダプターを用いてPD10カラムを50 mLチューブに固定した。70％エタノール (バイオテクノロジーグレード) で満たし、遠心機 (MX-305、TOMY) を用いて遠心(1000 g、2 min、4℃) した。この操作を2回繰り返すことでカラムを殺菌及び洗浄した。5％ (w/v) アジ化ナトリウムストック溶液をMOPS-Na緩衝液 (20 mM、pH 7.5) で250倍希釈して調製した0.02％アジ化ナトリウム/20 mM MOPS-Na緩衝液で満たし、静置して溶液を流す操作を4回繰り返すことでPD10カラムを緩衝液で置換した。さらに0.02％アジ化ナトリウム/20 mM MOPS-Na緩衝液を加え、遠心した。
(3) Buffer replacement of CDP solution
Buffer replacement of the CDP solution was performed using a PD10 column (Sephadex G-25, GE Healthcare) according to the attached instructions. The required number of PD10 columns was used depending on the volume of the CDP solution. The PD10 column was fixed to a 50 mL tube using the attached adapter. It was filled with 70% ethanol (biotechnology grade) and centrifuged (1000 g, 2 min, 4 ° C.) using a centrifuge (MX-305, TOMY). The column was sterilized and washed by repeating this operation twice. Fill a 5% (w / v) sodium azide stock solution with 0.02% sodium azide / 20 mM MOPS-Na buffer prepared by diluting 250-fold with MOPS-Na buffer (20 mM, pH 7.5). The PD10 column was replaced with the buffer by repeating the operation of placing and flowing the solution four times. Further, 0.02% sodium azide / 20 mM MOPS-Na buffer was added and centrifuged.
PD10カラムを新たな50 mLチューブに移し、遠心によるSephadexの斜面を崩さないようにCDP溶液をPD10カラム1本につき1.75-2.5 mLアプライした。前述の遠心時と同じ角度で遠心機に固定し、遠心した。溶出した溶液を回収してCDPストック溶液とし、CDPストック溶液の280 nmの吸光度をNanoDrop 2000cにより測定し、1.7 mLチューブに1 mLずつ分注して4℃で保存した。なおCDPストック溶液を使用する際は、必要量を適宜クリーンベンチ内で分注した。 The PD10 column was transferred to a new 50 mL tube, and 1.75-2.5 mL of CDP solution was applied to each PD10 column so as not to break the slope of Sephadex by centrifugation. It fixed to the centrifuge at the same angle as the above-mentioned centrifugation, and centrifuged. The eluted solution was recovered and used as a CDP stock solution. The absorbance at 280 nm of the CDP stock solution was measured with NanoDrop 2000c, dispensed 1 mL each into a 1.7 mL tube, and stored at 4 ° C. When using the CDP stock solution, the necessary amount was appropriately dispensed in a clean bench.
カラム1本につき30 mLのMOPS-Na緩衝液 (20 mM、pH 7.5) を加えて静置してカラムを洗浄した。次いで超純水で満たし、遠心する操作を2回繰り返した。同様に50%エタノール水溶液で2回洗浄した。PD-10カラムを50%エタノール水溶液で満たして4℃で保存した。 30 mL of MOPS-Na buffer (20 mM, pH 7.5) was added to each column, and the column was washed by allowing to stand. Subsequently, the operation of filling with ultrapure water and centrifuging was repeated twice. Similarly, it was washed twice with 50% ethanol aqueous solution. The PD-10 column was filled with 50% aqueous ethanol and stored at 4 ° C.
１−２−４．ポリアクリルアミドゲル電気泳動法 (SDS-PAGE) によるCDPの精製の確認
(1) 10％アクリルアミドゲルの調製
50 mLチューブに30％アクリルアミド/ビス混合溶液3.33 mL、Tris-HCl緩衝液 (1.5 M、pH 8.8) 2.5 mL、超純水4.01 mLを加え、超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。10％ SDS水溶液100 μL、10％ APS水溶液50 μL、TEMED 10 μLを加え、泡立たないようピペッティングして混合した。混合した溶液3.5 mLを2枚のガラスプレートの間隙 (0.75 mm) に加え、飽和1-ブタノール900 μLを静かに重層し、室温で1 h静置して重合した。マイクロピペットを用いて飽和1-ブタノールを除去し、次いで超純水で洗浄し、分離ゲルとした。
1-2-4. Confirmation of CDP purification by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
(1) Preparation of 10% acrylamide gel
Add 3.33 mL of 30% acrylamide / bis mixed solution, 2.5 mL of Tris-HCl buffer (1.5 M, pH 8.8), and 4.01 mL of ultrapure water to a 50 mL tube, and deaerate by aspirating with ultrasonic irradiation. . 100 μL of 10% SDS aqueous solution, 50 μL of 10% APS aqueous solution, and 10 μL of TEMED were added and mixed by pipetting so as not to foam. 3.5 mL of the mixed solution was added to the gap (0.75 mm) between two glass plates, 900 μL of saturated 1-butanol was gently layered, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 h for polymerization. Saturated 1-butanol was removed using a micropipette, and then washed with ultrapure water to obtain a separation gel.
50 mLチューブに30％アクリルアミド/ビス混合溶液0.44 mL、Tris-HCl緩衝液(0.5 M、pH 6.8) 0.44 mL、超純水2.03 mLを加え、超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。10％ SDS水溶液33 μL、10％ APS水溶液16.7 μL、TEMED 1.65 μLを加え、泡立たないようピペッティングして混合した。溶液を分離ゲルの上に十分に加え、10ウェルのコームを空気が入らないように注意しながらセットし、室温で1 h静置して重合した。生成したゲルはガラスプレートごと十分に湿らせたキムワイプで挟み、さらにラップで包み4℃で保存した。ゲルは調製後1ヶ月以内に使用した。 Add 0.44 mL of 30% acrylamide / bis mixed solution, 0.44 mL of Tris-HCl buffer (0.5 M, pH 6.8), and 2.03 mL of ultrapure water to a 50 mL tube, and deaerate by aspirating with ultrasonic irradiation. . 33 μL of 10% SDS aqueous solution, 16.7 μL of 10% APS aqueous solution, and 1.65 μL of TEMED were added, and mixed by pipetting so as not to foam. The solution was sufficiently added onto the separation gel, and a 10-well comb was set with care not to allow air to enter, and allowed to stand at room temperature for 1 h for polymerization. The resulting gel was sandwiched between fully wiped Kimwipes with a glass plate, wrapped in a wrap and stored at 4 ° C. The gel was used within one month after preparation.
(2) 電気泳動による評価
1.7 mLチューブにProtein Molecular Weight Marker (Broad) 5 μL、1 M DTT溶液2 μL、5×Loading バッファー 20 μL、滅菌精製水173 μLを加えて混合し、これをマーカーとし、-20℃で保存した。CDPストック溶液及びCDPの精製において回収したフロースルー液、洗浄液それぞれ1 μLを5×Loadingバッファー2 μL、1 M DTT 1 μL、超純水6 μLと混合した。これらと室温で解凍したマーカー10 μLを105 ℃で熱処理し、卓上小型遠心機(R5-AQBD02、Recenttec) によりスピンダウンした。本項(1)で調製したポリアクリルアミドゲルを電気泳動用容器 (ミニプロティアン Tetraセル、BIO RAD) にセットし、超純水で5倍希釈した5×泳動バッファーを500 mL注ぎ、コームを外した。１ウェルずつに電気泳動サンプルをロードし、電気泳動装置 (ミニプロティアンTetraシステム、BIO RAD) を用いて電圧150 Vで約40 min泳動した。バンドがゲルの下端より約1 cm上に達したところで泳動を止め、ゲルをガラスプレートから取り出して固定液に浸漬させ、遮光してシェイカー (Wave-PR、TAITECH) で30 min振盪した。固定液を除去し、染色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して60 min振盪した。染色液を回収し、脱色液を加えてゲルを浸漬させ、遮光して30 min振盪した。脱色液を除去して新たに脱色液を加えて振盪する操作を、マーカーに含まれるタンパク質のバンドが明確に見えるまで繰り返した。超純水でゲルを洗浄し、Gel Doc EZ Imager (BIO RAD) により撮影して付属のソフトウェアで解析した。
(2) Evaluation by electrophoresis
Protein Molecular Weight Marker (Broad) 5 μL, 1
１−２−５．CDPの酵素活性測定
CDPの活性は以下のように測定した。αG1P 50mMとD-(+)-セロビオース50 mM、及び所定倍率希釈されたCDPを含む3-モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液 (50 mM、pH7.5)を37 ℃でインキュベーションした。CDPにより生成されるリン酸を定量し、1分間あたり1 μmolのリン酸を遊離する酵素量を1Uと定義した際のU/mLを求め、酵素活性とした。CDPの希釈率は、反応時間が100分の際におけるαG1Pの転化率が10％以下になるように決定した。
1-2-5. Measurement of CDP enzyme activity
The activity of CDP was measured as follows. αG1P 50 mM, D-(+)-cellobiose 50 mM, and 3-morpholinopropanesulfonic acid buffer (50 mM, pH 7.5) containing CDP diluted at a predetermined magnification were incubated at 37 ° C. Phosphoric acid produced by CDP was quantified, and U / mL was defined as the amount of enzyme that liberates 1 μmol of phosphoric acid per minute as 1 U, and was defined as the enzyme activity. The dilution rate of CDP was determined so that the conversion rate of αG1P was 10% or less when the reaction time was 100 minutes.
１−３．OEG-bearing β-D-グルコース (Glc-EGn; n = 2, 4, 6, 8) プライマーの合成
Glc-EGnプライマーは、B. Raoら, Chem. Commun., 2013年, 49, 10808-10810に記載の方法を参考にして合成した。
1-3. OEG-bearing β-D-glucose (Glc-EG n ; n = 2, 4, 6, 8) Primer synthesis
The Glc-EG n primer was synthesized with reference to the method described in B. Rao et al., Chem. Commun., 2013, 49, 10808-10810.
以下の全ての反応は、p-アニスアルデヒドTLC呈色試薬、又は1H NMR測定 (JEOL Model-ECP 400 (JEOL、磁場強度：400 MHz)) により反応の進行を確認しながら進めた。p-アニスアルデヒドTLC呈色試薬は、p-アニスアルデヒド13 mL、酢酸 5 mL、エタノール 478 mLを氷冷しながら混合し、マグネチックスターラーを用いて撹拌しながら濃硫酸 18 mLを滴下し、使用するまで4 ℃で保存した。 All the following reactions were carried out while confirming the progress of the reaction by p-anisaldehyde TLC color reagent or 1 H NMR measurement (JEOL Model-ECP 400 (JEOL, magnetic field strength: 400 MHz)). p-Anisaldehyde TLC color reagent is prepared by mixing 13 mL of p-anisaldehyde, 5 mL of acetic acid and 478 mL of ethanol while cooling with ice, and adding 18 mL of concentrated sulfuric acid dropwise with stirring using a magnetic stirrer. Stored at 4 ° C until.
１−３−１．O-テトラアセチルGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) の合成
O-ペンタアセチル-β-D-グルコシド(1.0等量) とオリゴエチレングリコールモノメチルエーテル(1.2等量) を乾燥ジクロロメタンに溶解させた。脱水剤として350 ℃のヒーターで予め活性化させた粉状モレキュラーシーブ4Aを加え、アルゴン雰囲気下にてマグネチックスターラーを用いて室温で1 h撹拌した。氷冷した反応溶液に三ふっ化ホウ素ジエチルエーテル (5.0等量) を滴下し、反応溶液を室温に戻して一晩撹拌し、O-グリコシル化反応させた。原料であるO-ペンタアセチル-β-D-グルコシドの消失をp-アニスアルデヒド呈色試薬を用いてTLCにより確認した後、氷冷した飽和炭酸水素ナトリウム水溶液/酢酸エチル (50% (v/v)) に反応溶液を滴下し、反応を停止させた。反応溶液を分液漏斗に移し、激しく振盪した後、溶液が二層に分離するまで静置し、上層の油層を回収した。下層の水層を新たな分液漏斗に移し、酢酸エチルによって抽出し、油層を回収する操作を2回繰り返した。回収した油層を再度分液漏斗に移し、飽和食塩水を加え、激しく振盪し、油層に溶解した水を除去した。水層を流去し、乾燥剤として無水硫酸マグネシウムを油層に加えた。ガラスフィルターを用いて硫酸マグネシウムを除去し、ロータリーエバポレーターにより有機溶媒を留去した。展開溶媒をアセトン/ヘキサン(20-50% (v/v))とし、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにアプライし、35-60%の収率でオイル状のO-テトラアセチル Glc-EGnを得た。
1-3-1. Synthesis of O-tetraacetyl Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8)
O-pentaacetyl-β-D-glucoside (1.0 equivalent) and oligoethylene glycol monomethyl ether (1.2 equivalent) were dissolved in dry dichloromethane. Powdered molecular sieve 4A previously activated with a heater at 350 ° C. was added as a dehydrating agent, and the mixture was stirred at room temperature for 1 h using a magnetic stirrer under an argon atmosphere. Boron trifluoride diethyl ether (5.0 equivalents) was added dropwise to the ice-cooled reaction solution, and the reaction solution was allowed to warm to room temperature and stirred overnight for O-glycosylation reaction. After confirming the disappearance of the raw material O-pentaacetyl-β-D-glucoside by TLC using p-anisaldehyde color reagent, ice-cooled saturated aqueous sodium bicarbonate / ethyl acetate (50% (v / v The reaction solution was added dropwise to)) to stop the reaction. The reaction solution was transferred to a separatory funnel, shaken vigorously, and allowed to stand until the solution separated into two layers, and the upper oil layer was collected. The operation of transferring the lower aqueous layer to a new separatory funnel, extracting with ethyl acetate, and collecting the oil layer was repeated twice. The recovered oil layer was again transferred to a separatory funnel, saturated brine was added, and the mixture was shaken vigorously to remove water dissolved in the oil layer. The aqueous layer was washed away, and anhydrous magnesium sulfate was added as a drying agent to the oil layer. Magnesium sulfate was removed using a glass filter, and the organic solvent was distilled off using a rotary evaporator. The developing solvent was acetone / hexane (20-50% (v / v)), and the resulting crude product was applied to silica gel column chromatography to obtain oily O-tetraacetyl Glc in 35-60% yield. -I got EG n .
１−３−２．Glc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) の合成
O-テトラアセチル Glc-EGn (1.0等量) をメタノールに溶解させ、反応溶液を氷冷し、触媒量のナトリウムメトキシド (0.1等量) を添加した。反応溶液を室温に戻して5-8 hマグネチックスターラーを用いて撹拌した後、Dowex陽イオン交換樹脂を加え、反応を停止させた。セライトを載せた濾紙を用いて反応溶液を濾過し、ロータリーエバポレーターにより有機溶媒を留去した。室温で1 d真空乾燥し、90-95%の収率でオイル状のGlc-EGnを得た。Glc-EGnを超純水に溶解させてGlc-EGnストック溶液とし、PVDF製 0.22 μmフィルターで濾過滅菌し、更なる精製操作なしでCDPによる酵素合成反応に用いた。Glc-EGnストック溶液の濃度は、メチル-β-D-グルコシド水溶液 (500 mM) を基準溶液として、1H NMR測定により算出した。Glc-EGnストック溶液およびメチル-β-D-グルコシド水溶液からそれぞれ50 μLずつ分取した混合溶液を凍結乾燥し、重水500 μLに溶解させて1H NMR測定し、それぞれのアノマー位の水素の積分比 (Glc-EGn: δ = 4.51, メチル-β-D-グルコシド: δ = 4.39) からGlc-EGnストック溶液の濃度を算出した。
1-3-2. Synthesis of Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8)
O-tetraacetyl Glc-EG n (1.0 equivalent) was dissolved in methanol, the reaction solution was ice-cooled, and a catalytic amount of sodium methoxide (0.1 equivalent) was added. The reaction solution was returned to room temperature and stirred using a magnetic stirrer for 5-8 h, and then the Dowex cation exchange resin was added to stop the reaction. The reaction solution was filtered using a filter paper on which Celite was placed, and the organic solvent was distilled off by a rotary evaporator. 1d vacuum drying was performed at room temperature to obtain oily Glc-EG n in a yield of 90-95%. Glc-EG n was dissolved in ultrapure water to make a Glc-EG n stock solution, sterilized by filtration through a PVDF 0.22 μm filter, and used for an enzymatic synthesis reaction by CDP without further purification. The concentration of the Glc-EG n stock solution was calculated by 1 H NMR measurement using a methyl-β-D-glucoside aqueous solution (500 mM) as a reference solution. 50 μL of each mixed solution from Glc-EG n stock solution and methyl-β-D-glucoside aqueous solution was lyophilized, dissolved in 500 μL of heavy water and analyzed by 1 H NMR, and the hydrogen of each anomeric position was measured. The concentration of the Glc-EG n stock solution was calculated from the integration ratio (Glc-EG n : δ = 4.51, methyl-β-D-glucoside: δ = 4.39).
１−４．OEG化セルロースオリゴマーからなる三次元構造体の酵素合成
１−４−１．CDPによるOEG化セルロースの酵素合成
2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸(HEPES) 23.8 gを約60 mLの超純水に溶解させた。4 N 水酸化ナトリウム水溶液によりpH 7.5に調整後、100 mLにメスアップしてPVDF製0.22 μmフィルターで濾過滅菌した。これをHEPES緩衝液 (1 M、pH 7.5) とし、4℃で保存した。
αG1P二ナトリウム n水和物を所定量秤量し、1 Mとなるよう超純水に溶解させた。
1-4. Enzymatic synthesis of three-dimensional structure composed of OEG-modified cellulose oligomer 1-4-1. Enzymatic synthesis of OEG cellulose by CDP
23.8 g of 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) was dissolved in about 60 mL of ultrapure water. After adjusting to pH 7.5 with 4 N aqueous sodium hydroxide, the volume was adjusted to 100 mL and sterilized by filtration through a PVDF 0.22 μm filter. This was made into HEPES buffer (1 M, pH 7.5) and stored at 4 ° C.
A predetermined amount of αG1P disodium n-hydrate was weighed and dissolved in ultrapure water to 1 M.
HEPES緩衝液、1 M αG1P水溶液、１−３−２項で合成した所濃度のGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) ストック溶液を反応時の濃度がそれぞれ500 mM、200 mM、50 mMとなるよう4 mLチューブに加え、使用するCDPストック溶液の量を考慮し、超純水でメスアップした。超音波照射しながらアスピレーターで吸引して脱気した。終濃度が0.2 U/mLになるようCDPストック溶液を適量加え、気泡が発生しないようピペッティングにより混合した。1.7 mLチューブあるいは1 mLマイティーバイアルあるいは24穴プレートに所定量分取し、60 ℃で3 dインキュベーションした。 HEPES buffer, 1 M αG1P aqueous solution, Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8) stock solution at the concentration synthesized in section 1-3-2. The concentration during the reaction was 500 mM and 200 mM, respectively. In addition to a 4 mL tube to 50 mM, the volume of the CDP stock solution to be used was taken into consideration, and the volume was increased with ultrapure water. The sample was deaerated by suction with an aspirator while irradiating with ultrasonic waves. An appropriate amount of a CDP stock solution was added to a final concentration of 0.2 U / mL, and mixed by pipetting so that no bubbles were generated. A predetermined amount was taken into a 1.7 mL tube, 1 mL mighty vial or 24-well plate, and incubated at 60 ° C. for 3 d.
１−４−２．酵素合成されたOEG化セルロースの精製
１−４−１項において調製された生成物を各種分析に用いるために超純水で精製した。走査型電子顕微鏡観察に用いる場合は、生成物を超純水に浸漬させ、4 ℃で1 w精製した。その他の測定に用いる場合は、超純水を加えてピペッティングによる水流により生成物を機械的に破壊して分散させ、遠心 (15000 rpm、>10 min、4℃) し、上清を除去した。超純水を加えて沈澱物を再分散させ、遠心する操作を5回以上繰り返し、溶液の置換率が99.999％以上となるまで精製した。精製した分散液を100℃のヒートブロックにより10 min加熱することで、残存するCDPを失活させた。
1-4-2. Purification of enzymatically synthesized OEG-modified cellulose The product prepared in Section 1-4-1 was purified with ultrapure water for use in various analyses. When used for scanning electron microscope observation, the product was immersed in ultrapure water and purified at 4 ° C. for 1 w. When using for other measurements, ultrapure water was added and the product was mechanically disrupted and dispersed by pipetting water flow, centrifuged (15000 rpm,> 10 min, 4 ° C), and the supernatant was removed. . The operation of redispersing the precipitate by adding ultrapure water and centrifuging was repeated 5 times or more and purified until the substitution rate of the solution reached 99.999% or more. The purified dispersion was heated with a heat block at 100 ° C. for 10 min to inactivate the remaining CDP.
生成物の収量は、精製後の水分散液を絶乾し、乾燥前後の重量変化から算出した。予め105℃で24 h乾燥させ、デシケーター内で放冷したサンプル管を秤量し、精製後の水分散液を加えて105℃で24 h乾燥させ、その後デシケーター内で放冷して秤量した。乾燥前後の重量の差から生成物の濃度を算出した。この操作は同時に3回行い、それらの平均値より生成物の収量を算出した。 The yield of the product was calculated from the change in weight before and after drying after completely purifying the aqueous dispersion after purification. The sample tube which had been dried at 105 ° C. for 24 hours and allowed to cool in the desiccator was weighed, and the purified aqueous dispersion was added and dried at 105 ° C. for 24 hours. Thereafter, the sample tube was allowed to cool in the desiccator and weighed. The product concentration was calculated from the difference in weight before and after drying. This operation was performed three times at the same time, and the yield of the product was calculated from the average value thereof.
プロトン核磁気共鳴 (1H NMR) 法、全反射型赤外分光 (ATR/ FTIR) 法、広角X線回折 (WAXD) 法による測定に用いる場合は、精製後の水分散液を1.7 mLチューブに分注し、24 h凍結乾燥した。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析 (MALDI-TOF-MS) 法による測定、原子間力顕微鏡 (AFM) 観察に用いる場合は凍結乾燥することなく、精製後の分散液を超純水により希釈して用いた。 Proton nuclear magnetic resonance (1 H NMR) method, total reflection infrared spectroscopy (ATR / FTIR) method, if used for measurement by wide angle X-ray diffraction (WAXD) method, the aqueous dispersion after purification 1.7 mL tubes Aliquot and lyophilize for 24 h. When used for matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) measurement or atomic force microscope (AFM) observation, the purified dispersion can be treated with ultrapure water without lyophilization. Used diluted.
１−５．生成されたOEG化セルロースの特性評価
１−５−１．生成物の反転倒立試験
1 mLマイティーバイアルを用いて調製したサンプルを用いて、反転倒立試験によりスポンジ化を評価した。バイアルを上下反転して静置し、生成物が流動しなかった場合にスポンジ状セルロース構造体が形成したと判断した。
1-5. Characterization of produced OEG-modified cellulose 1-5-1. Product inverted inverted test
Spongification was evaluated by the inverted inverted test using a sample prepared using a 1 mL mighty vial. The vial was turned upside down and allowed to stand, and it was judged that a sponge-like cellulose structure was formed when the product did not flow.
１−５−２．生成物の化学構造及び結晶構造の評価
(1) 生成物の収量測定
１−４−１項で示した手法で、絶乾により収量を算出した。
1-5-2. Evaluation of the chemical and crystal structure of the product
(1) Yield measurement of product The yield was calculated by absolute drying by the method shown in the section 1-4-1.
(2) 生成物の1H NMRスペクトル測定
40％重水酸化ナトリウム重水溶液50 μL及び重水450 μLを混合して4％重水酸化ナトリウム重水溶液を調製した。凍結乾燥した生成物15 mg以上を4％重水酸化ナトリウム重水溶液500 μLに溶解させた。溶液をNMRチューブに移し、JEOL Model-ECP 400 (JEOL、磁場強度：400 MHz)により測定した。積算回数は128回とした。水のケミカルシフトをリファレンス(4.79 ppm)として校正した。
(2) 1 H NMR spectrum measurement of the product
A 40% sodium bicarbonate aqueous solution (50 μL) and heavy water (450 μL) were mixed to prepare a 4% sodium bicarbonate solution. 15 mg or more of the lyophilized product was dissolved in 500 μL of 4% aqueous sodium bicarbonate solution. The solution was transferred to an NMR tube and measured by JEOL Model-ECP 400 (JEOL, magnetic field strength: 400 MHz). The number of integrations was 128. The water chemical shift was calibrated as a reference (4.79 ppm).
(3) 生成物のMALDI-TOF-MS測定
質量電荷比の校正に用いる標準サンプルはBradykin fragment 1-7水溶液 (10 nmol/mL Bradykinin fragment 1-7、0.05％トリフルオロ酢酸(TFA)、50％アセトニトリル)、P14R水溶液 (10 nmol/mL P14R、0.1％ TFA)、ACTH fragment 18-39水溶液 (10 nmol/mL ACTH fragment 18-39、0.1% TFA) それぞれ5 μL、10 mg/mL DHBA水溶液 5 μL、1.0％ TFA水溶液 1 μL、アセトニトリル 4 μLを1.7 mLチューブ中で混合して調製した。
(3) MALDI-TOF-MS measurement of product The standard sample used for calibration of mass-to-charge ratio is Bradykin fragment 1-7 aqueous solution (10 nmol / mL Bradykinin fragment 1-7, 0.05% trifluoroacetic acid (TFA), 50% Acetonitrile), P 14 R aqueous solution (10 nmol / mL P 14 R, 0.1% TFA), ACTH fragment 18-39 aqueous solution (10 nmol / mL ACTH fragment 18-39, 0.1% TFA) 5 μL, 10 mg / mL, respectively It was prepared by mixing 5 μL of DHBA aqueous solution, 1 μL of 1.0% TFA aqueous solution, and 4 μL of acetonitrile in a 1.7 mL tube.
生成物の測定サンプルは、0.05％ (w/v)とした生成物の水分散液 1 μL、10 mg/mL DHBA水溶液 1 μL、トリフルオロ酢酸/アセトニトリル溶液 (0.2% (v/v)) 3 μLをKOH/メタノール (3.3% (w/v)) により洗浄したマイティーバイアル中で混合して調製した。 The product measurement sample was 0.05% (w / v) product aqueous dispersion 1 μL, 10 mg / mL DHBA aqueous solution 1 μL, trifluoroacetic acid / acetonitrile solution (0.2% (v / v)) 3 μL was prepared by mixing in a mighty vial washed with KOH / methanol (3.3% (w / v)).
標準サンプル及び生成物の測定サンプルそれぞれ1 μLをサンプルプレートにマウントし、風乾させる操作を5回繰り返した。1 h以上真空乾燥し、MALDI-TOF-MS(AXIMA-performance、島津製作所)で測定した。測定条件はMode: Liner (positive)、Mass Range: 1.0-3000.0、Max Leaser Rap Rate: 10、power: 100 - 115、profiles: 100、shots: 2、Ion Gate (Da) : Blank 500、Pulsed Extraction optimized at (Da) : 1500.0とした。
The operation of mounting 1 μL each of the standard sample and the measurement sample of the product on the sample plate and air drying was repeated 5 times. After vacuum drying for 1 h or longer, measurement was performed with MALDI-TOF-MS (AXIMA-performance, Shimadzu Corporation). Measurement conditions are Mode: Liner (positive), Mass Range: 1.0-3000.0, Max Leaser Rap Rate: 10, power: 100-115, profiles: 100, shots: 2, Ion Gate (Da):
測定により得られたMSスペクトルは、Smoothing method: Gaussian, Smoothing filter width: 19, Baseline filter width: 1000の条件で処理した。
平均重合度は、生成物のナトリウムイオン、又はカリウムイオン付加体のピーク強度が強い方のピーク面積を用いて算出した。
The MS spectrum obtained by the measurement was processed under the conditions of Smoothing method: Gaussian, Smoothing filter width: 19, Baseline filter width: 1000.
The average degree of polymerization was calculated using the peak area with the higher peak intensity of the product sodium ion or potassium ion adduct.
(4) 生成物のATR/FTIRスペクトル測定
凍結乾燥した生成物を全反射赤外分光光度計 (FT/IR-4100typeA、日本分光) のステージのダイヤモンドセルにスパチュラを用いて乗せ、押しこみユニットを下げてサンプルをダイヤモンドセルに押し付けて測定した。測定条件は、測定波長：350-7800 cm-1、分解能：2 cm-1、積算回数：100とした。
(4) ATR / FTIR spectrum measurement of the product Place the freeze-dried product on the diamond cell of the stage of the total reflection infrared spectrophotometer (FT / IR-4100typeA, JASCO) using a spatula and place the indentation unit. The sample was lowered and pressed against the diamond cell for measurement. The measurement conditions were: measurement wavelength: 350-7800 cm −1 , resolution: 2 cm −1 , and number of integrations: 100.
(5) 生成物のWAXD測定
凍結乾燥した生成物をシリコン無反射試料板の凹部にマウントし、表面を均して卓上粉末X線回折計 (MiniFlex 600、リガク) に設置して測定した。測定条件は、検出器：D/teX Ultra、X線出力：40 kV及び15 mA、フィルター：Kβ、スキャンスピード：2.0000 deg/min、ステップ幅：0.0200 deg、スキャン軸：2 θ/θ、スキャン範囲：5.0000-70.0000 deg、入射スリット：1.250 degとした。
(5) WAXD measurement of the product The freeze-dried product was mounted in a concave portion of a silicon non-reflective sample plate, and the surface was leveled and placed on a tabletop powder X-ray diffractometer (MiniFlex 600, Rigaku). Measurement conditions are: Detector: D / teX Ultra, X-ray output: 40 kV and 15 mA, Filter: Kβ, Scan speed: 2.000 deg / min, Step width: 0.0200 deg, Scan axis: 2 θ / θ, Scan range : 5.000-70.0000 deg, entrance slit: 1.250 deg.
１−５−３．生成物の顕微鏡観察
(1) 生成物のSEM観察
超純水に浸漬させて精製した生成物の一部を薬さじを用いて採取し、24穴プレート中で10％エタノール水溶液2 mLに浸漬させ、15 min静置した。その後、溶液を除去し、20％エタノール水溶液を加えて15 min静置した。同様に30、40、50、60、70、80、90、99.5％エタノール水溶液の順に浸漬させた。次いで溶液を除去し、99.5％エタノール水溶液を加えて15 min静置した。溶液を除去し、99% エタノール/tert-ブチルアルコール (50% (v/v)) 溶液に15 min浸漬させた。溶液を除去して99% tert-ブチルアルコールに15 min浸漬させ、溶液を除去する操作を2回繰り返した。
1-5-3. Microscopic observation of the product
(1) SEM observation of the product Part of the product purified by soaking in ultrapure water was collected using a spoon, soaked in 2 mL of 10% ethanol aqueous solution in a 24-well plate, and left for 15 min. did. Thereafter, the solution was removed, 20% ethanol aqueous solution was added, and the mixture was allowed to stand for 15 min. Similarly, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, and a 99.5% ethanol aqueous solution were immersed in this order. Next, the solution was removed, 99.5% aqueous ethanol solution was added, and the mixture was allowed to stand for 15 min. The solution was removed and immersed in a 99% ethanol / tert-butyl alcohol (50% (v / v)) solution for 15 min. The operation of removing the solution and immersing in 99% tert-butyl alcohol for 15 min and removing the solution was repeated twice.
溶媒が99% tert-ブチルアルコールに置換された生成物をパラフィルムで作製したカプセルに移し、99% tert-ブチルアルコールで満たしてカプセルの封をした。tert-ブチルアルコールの結晶が成長しないように速やかに液体窒素にカプセルごと沈めて10 min以上凍結した。液体窒素中でカプセルごと生成物をカミソリにより割断した。液体窒素中から生成物を取り出し、速やかに凍結乾燥した。 The product in which the solvent was replaced with 99% tert-butyl alcohol was transferred to a capsule made of parafilm and filled with 99% tert-butyl alcohol to seal the capsule. The capsules were quickly submerged in liquid nitrogen so that the tert-butyl alcohol crystals did not grow and frozen for 10 min or longer. The product with capsules was cleaved with razor in liquid nitrogen. The product was taken out from the liquid nitrogen and quickly lyophilized.
SEMのステージ (直径26 mm) 上に小さく切ったカーボンテープを貼り、その上に凍結乾燥した生成物を割断面が上になるようにマウントし、側面にドータイトを塗布することでステージに固定した。3 h以上真空乾燥し、デシケーター内で8 h以上乾燥した。オスミウムコータ (Neoc-Pro、メイワフォーシス) を用いて、SEMのステージにマウントしたサンプルを10 mAで30 sコーティングし、走査型電子顕微鏡 (JSM-7500F、日本電子) により観察した。観察条件は、加速電圧は5 kV、エミッション電流：10 μA、照射電流：No.8、カラムモード：通常、r-フィルタ：SB[0] 、ワーキングディスタンス：8 mm前後とした。 A small piece of carbon tape was pasted on the SEM stage (26 mm in diameter), and the freeze-dried product was mounted on the split section so that it was on the top, and fixed on the stage by applying dotite on the sides. . It was vacuum-dried for 3 hours or longer and then dried for 8 hours or longer in a desiccator. The sample mounted on the SEM stage was coated with 10 mA for 30 s using an osmium coater (Neoc-Pro, Meiwaforsys) and observed with a scanning electron microscope (JSM-7500F, JEOL). The observation conditions were an acceleration voltage of 5 kV, emission current: 10 μA, irradiation current: No. 8, column mode: normal, r-filter: SB [0], working distance: around 8 mm.
(2) 生成物のAFM観察
生成物の濃度が0.001％ (w/v)となるよう希釈し、セロハンテープで表面を5回剥がしたマイカ基板に15 μLマウントして600 rpmで30 minスピンコートした。デシケーター内で12 h以上乾燥し、走査型プローブ顕微鏡 (SPM-9600、島津製作所) を用いてAFMにより観察した。測定条件はタッピングモード、操作速度：0.5-1 Hz、画素数：512×512、Zレンジ：×1、操作モード：力一定とした。それぞれの試料から10個の構造体を観察し、観察された構造体ひとつにつき9点の高さを算出し、それら全てを平均して構造体の高さを算出した。
(2) AFM observation of product Dilute to 0.001% (w / v) of product concentration, mount 15 μL on mica substrate with surface removed 5 times with cellophane tape, spin coat at 600 rpm for 30 min did. The sample was dried in a desiccator for 12 hours or longer and observed with an AFM using a scanning probe microscope (SPM-9600, Shimadzu Corporation). Measurement conditions were tapping mode, operation speed: 0.5-1 Hz, number of pixels: 512 × 512, Z range: × 1, operation mode: constant force. Ten structures were observed from each sample, nine heights were calculated for each observed structure, and all were averaged to calculate the height of the structure.
２．結果及び考察
２−１．OEG化セルロースの酵素合成
２−１−１．酵素合成した生成物の反転倒立試験
異なる鎖長のEG基をもつGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) をCDPによる酵素合成系に適応した。モノマーとしてαG1P、プライマーとしてGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) を用い、CDPを混合して60 ℃で3 dインキュベーションした結果、いずれのプライマーを用いた場合も反応後の溶液全体が白濁し、新たに適応したプライマーがCDPにより認識されることでセルロース誘導体が酵素合成されることが示唆された。さらに、いずれのプライマーを用いた場合も容器を反転させても溶液が流れ落ちず、スポンジ状セルロース構造体が形成することが明らかになった (図１)。
2. Results and discussion 2-1. Enzymatic synthesis of OEG cellulose 2-1-1. Inversion test of enzymatically synthesized products Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8) having EG groups with different chain lengths was applied to an enzyme synthesis system using CDP. Using αG1P as a monomer and Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8) as a primer, mixing with CDP and incubating at 60 ° C for 3 d, the solution after the reaction was obtained regardless of which primer was used. The whole became cloudy, suggesting that the newly adapted primer was recognized by CDP and the cellulose derivative was synthesized enzymatically. Furthermore, it was clarified that when any primer was used, the solution did not flow down even when the container was inverted, and a sponge-like cellulose structure was formed (FIG. 1).
２−１−２．酵素合成されたセルロース誘導体の化学構造の評価
(1) 1H NMRスペクトル
セルロースは重合度15以下の低分子量であれば水酸化ナトリウム水溶液に溶解するため、重水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させることで1H NMR測定できることが知られている (A. Isogai, Cellulose, 1997年, 4, 99-107)。Glc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) プライマーを用いて酵素合成した生成物をピペッティングによる水流で機械的に破壊して遠心-再分散により精製した後、凍結乾燥したサンプルを1H NMR測定することで、生成物の化学構造を解析した。その結果、全てのピークは既報のセルロースオリゴマー (M. Hiraishiら, Carbohydr. Res., 2009年, 344, 2468-2473、L. A. Fluggeら, J. Am. Chem. Soc., 1999年, 121, 7228-7238、H. Sugiyamaら, J. Mol. Struct., 2000年, 556, 173-177、B. Xiongら, Cellulose, 2013年, 20, 613-621、M. U. Roslundら, Carbohydr. Res., 2008年, 343, 101-112) と導入されたOEG鎖 (δ 〜3.5) に帰属でき、OEG化セルロースオリゴマーが酵素合成されていることが明らかになった (図２)。次いでOEG化セルロースオリゴマーの分子内に位置するアノマー位(δ = 4.3)、およびOEG鎖が結合したセルロース分子鎖末端に位置するアノマー位 (δ = 4.2) の水素の積分値を次式に適用して、平均重合度を算出した。
2-1-2. Evaluation of chemical structure of enzymatically synthesized cellulose derivatives
(1) 1 H NMR spectrum Cellulose dissolves in aqueous sodium hydroxide solution with a low molecular weight of 15 or less, and it is known that 1 H NMR measurement can be performed by dissolving in sodium deuterated aqueous solution (A Isogai, Cellulose, 1997, 4, 99-107). Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8) Enzyme-synthesized products using primers were mechanically disrupted by pipetting water and purified by centrifugation-redispersion. The chemical structure of the product was analyzed by 1 H NMR measurement. As a result, all peaks were reported in the previously reported cellulose oligomer (M. Hiraishi et al., Carbohydr. Res., 2009, 344, 2468-2473, LA Flugge et al., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 7228. -7238, H. Sugiyama et al., J. Mol. Struct., 2000, 556, 173-177, B. Xiong et al., Cellulose, 2013, 20, 613-621, MU Roslund et al., Carbohydr. Res., 2008 Year, 343, 101-112) and the introduced OEG chain (δ to 3.5), and it was revealed that OEG-modified cellulose oligomers were synthesized enzymatically (FIG. 2). Next, the integral value of hydrogen at the anomeric position (δ = 4.3) located in the molecule of the OEG-modified cellulose oligomer and the anomeric position (δ = 4.2) located at the end of the cellulose molecular chain to which the OEG chain was bound was applied to the following equation. The average degree of polymerization was calculated.
その結果、プライマーとしてGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) を用いた場合、平均重合度はそれぞれ9、10、10、11と算出され、同条件でD-グルコースをプライマーとして酵素合成した場合のセルロースオリゴマーの平均重合度 (Average DP 〜10) とよく一致した (T. Serizawaら, Polym. J., 2016年, 48, 539-544)。より長鎖のEG基をもつGlc-EGnをプライマーとして用いた場合、セルロース誘導体の平均重合度がわずかながら増大することが明らかとなった。これは、セルロース分子鎖に導入されたEG基がより長鎖である程、合成されたセルロース誘導体の溶解性が増大するため、又はEG基の立体障害の寄与が大きくなることでセルロース誘導体の結晶化もしくは沈殿が抑制されるため、セルロース誘導体がより高重合度まで伸長したと推察される。 As a result, when Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8) was used as a primer, the average degree of polymerization was calculated as 9, 10, 10, and 11, respectively, and D-glucose was used as a primer under the same conditions. It was in good agreement with the average degree of polymerization of cellulose oligomers (Average DP ˜10) when synthesized enzymatically (T. Serizawa et al., Polym. J., 2016, 48, 539-544). When Glc-EG n having a longer EG group was used as a primer, it was revealed that the average degree of polymerization of the cellulose derivative slightly increased. This is because the longer the EG group introduced into the cellulose molecular chain, the higher the solubility of the synthesized cellulose derivative, or the greater the contribution of steric hindrance of the EG group, the crystal of the cellulose derivative. It is presumed that the cellulose derivative has been extended to a higher degree of polymerization because crystallization or precipitation is suppressed.
(2) MALDI-TOF-MSスペクトル
Glc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) プライマーを用いて酵素合成した生成物をピペッティングによる水流で機械的に破壊して遠心-再分散により精製した後、凍結乾燥したサンプルをMALDI-TOF-MSにより測定した。得られたMSスペクトルは、いずれもm/zの間隔がグルコシルユニット (162 Da) に対応する複数のピークを示し、さらに検出されたピークは重合度が 6-12 量体のOEG化セルロースオリゴマーのナトリウム又はカリウムイオン付加体にそれぞれ一致した (図３)。従って、MALDI-TOF-MS測定からもOEG化セルロースオリゴマーが正しく酵素合成されていることが明らかになった。さらに、合成されたOEG化セルロースオリゴマーは、D-グルコースをプライマーとして酵素合成した場合と同様に、分子量分布をもつことが明らかになった。MSスペクトルのピークの積分比から平均重合度を算出した結果、プライマーとしてGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) を用いた場合、それぞれ7.8、8.0、8.2、8.4と算出され、1H NMRから算出した平均重合度と比較して、1-3程度低い値を示した。MALDI-TOF-MS測定ではイオン化された分子のみが検出されるため、測定した条件では高重合度のOEG化セルロースオリゴマーが十分にイオン化していないことが示唆された。本発明者は酵素合成により調製されるセルロースオリゴマーの平均重合度の算出にはこれまで1H NMR測定を用いてきたことから、本実施例でも1H NMR測定により算出した平均重合度を用いることとした。
(2) MALDI-TOF-MS spectrum
Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8) Enzyme-synthesized products using primers were mechanically disrupted by pipetting water and purified by centrifugation-redispersion. Measured by MALDI-TOF-MS. The obtained MS spectra all showed a plurality of peaks whose m / z intervals corresponded to glucosyl units (162 Da), and the detected peaks were of OEG cellulose oligomers having a degree of polymerization of 6-12 monomers. It corresponded to the sodium or potassium ion adduct, respectively (FIG. 3). Therefore, it was revealed from the MALDI-TOF-MS measurement that the OEG-modified cellulose oligomer was synthesized correctly. Furthermore, it was revealed that the synthesized OEG-modified cellulose oligomer had a molecular weight distribution as in the case of enzymatic synthesis using D-glucose as a primer. As a result of calculating the average degree of polymerization from the integration ratio of the peaks of the MS spectrum, when Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8) was used as a primer, it was calculated as 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, respectively. Compared with the average degree of polymerization calculated from 1 H NMR, the value was about 1-3 lower. Since only ionized molecules were detected by MALDI-TOF-MS measurement, it was suggested that the OEG-ized cellulose oligomer with a high degree of polymerization was not sufficiently ionized under the measured conditions. The present inventors have since been used to date 1 H NMR measurements for the calculation of the average degree of polymerization of the cellulose oligomers prepared by enzymatic synthesis, the use of the average polymerization degree calculated by also 1 H NMR measurement in this embodiment It was.
(3) αG1Pの転化率
絶乾により算出した生成物の収量と1H NMR測定から算出した平均重合度を用いて、モノマーであるαG1Pの転化率を算出した。プライマーとしてGlc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) を用いた場合、αG1Pの転化率はそれぞれ60, 30, 40, 40%と算出された。Glc-EG2をプライマーとした場合、同条件でD-グルコースをプライマーとした場合のαG1Pの転化率 (約35％) よりも明らかに高く (T. Serizawaら, Polym. J., 2016年, 48, 539-544)、Glc-EGn (n = 4, 6, 8) をプライマーとした場合はD-グルコースをプライマーとした場合と同程度であった。従って、プライマーに導入されたEG基の鎖長はCDPによる酵素合成反応に影響を与え、Glc-EG2はその他のプライマーよりもCDPにより認識されやすいことが示唆された。
(3) Conversion rate of αG1P The conversion rate of αG1P as a monomer was calculated using the yield of the product calculated by absolute drying and the average degree of polymerization calculated from 1 H NMR measurement. When Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8) was used as a primer, the conversion rates of αG1P were calculated to be 60, 30, 40, and 40%, respectively. When Glc-EG 2 was used as a primer, it was clearly higher than the αG1P conversion rate (about 35%) when D-glucose was used as a primer under the same conditions (T. Serizawa et al., Polym. J., 2016, 48, 539-544) and Glc-EG n (n = 4, 6, 8) as primers were similar to those when D-glucose was used as a primer. Therefore, it was suggested that the chain length of the EG group introduced into the primer affects the enzyme synthesis reaction by CDP, and that Glc-EG 2 is more easily recognized by CDP than other primers.
２−１−３．OEG化セルロースの結晶構造
(1) ATR/FTIRスペクトル
セルロースは複数の結晶形を形成し得ることが知られているため、ATR/FTIR測定により、生成されたOEG化セルロースオリゴマーが形成する結晶構造を解析した。Glc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) プライマーを用いて酵素合成した生成物をピペッティングによる水流で機械的に破壊して遠心-再分散により精製した後、凍結乾燥したサンプルをATR/FTIR測定した結果、いずれもセルロースのII型結晶に特徴的なOH伸縮振動に由来する2本の鋭いピーク (Q. Wuら, Carbohydr. Polym., 2015年, 133, 438-447) を3441ならびに3490 cm-1付近に示したことから、酵素合成されたOEG化セルロースオリゴマーはセルロースII型結晶形を形成することが明らかとなった (図４)。これは、D-グルコースをプライマーとして酵素合成した場合にセルロースオリゴマーが形成する結晶形と同様であり、セルロース分子鎖に導入されたOEG鎖は形成する結晶形に影響を与えないことがわかった。さらに、850 cm-1付近に無秩序なコンフォメーションをもつOEG鎖の振動モードに由来するブロードなピーク (W. Parakら, Carbohydr. Chem.Mater., 2005年, 17, 4949-4957) を示したことから、OEG鎖はアモルファスであることが示唆された。
2-1-3. Crystal structure of OEG cellulose
(1) ATR / FTIR spectrum Since it is known that cellulose can form multiple crystal forms, the crystal structure formed by the OEG-modified cellulose oligomer was analyzed by ATR / FTIR measurement. Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8) Enzyme-synthesized products using primers were mechanically disrupted by pipetting water and purified by centrifugation-redispersion. As a result of ATR / FTIR measurement, each of the two sharp peaks (Q. Wu et al., Carbohydr. Polym., 2015, 133, 438-447) derived from the OH stretching vibration characteristic of type II crystals of cellulose. From the results shown in the vicinity of 3441 and 3490 cm −1, it was revealed that the enzymatically synthesized OEG-modified cellulose oligomer formed a cellulose II type crystal form (FIG. 4). This is the same as the crystal form formed by the cellulose oligomer when enzymatic synthesis is performed using D-glucose as a primer, and it has been found that the OEG chain introduced into the cellulose molecular chain does not affect the formed crystal form. Furthermore, a broad peak (W. Parak et al., Carbohydr. Chem. Mater., 2005, 17, 4949-4957) derived from the vibrational mode of the OEG chain with disordered conformation around 850 cm -1 was shown. This suggests that the OEG chain is amorphous.
(2) WAXDチャート
Glc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) プライマーを用いて酵素合成した生成物をピペッティングによる水流で機械的に破壊して遠心-再分散により精製した後、凍結乾燥したサンプルをWAXD測定した結果、2θ = 12.3、19.9、 22.1°において鋭い回折ピークを示した (図５)。これらの回折ピークは、それぞれセルロースII型結晶の1-10、110、020面 (M. Hiraishiら, Carbohydr. Res., 2009年, 344, 2468-2473) に帰属された。WAXD測定からもD-グルコースをプライマーとして酵素合成した場合にセルロースオリゴマーが形成する結晶形と同様に、セルロースII型の結晶形を形成することが支持された。さらに、2θ = 19.1、23.3°に結晶性のOEG鎖に由来する2本の回折ピーク (S. Kugaら, Langmuir, 2001年, 17, 21-27) を示さなかったことから、OEG鎖がアモルファスであることが支持された。OEG化セルロースオリゴマーが逆並行に配列することでセルロースII型結晶を形成することを考慮すると、ナノセルロース上のOEG鎖の密度はOEG鎖一分子あたり、約65 A2であると概算される。螺旋状のコンフォメーションをもつ結晶性のPEG鎖の断面積はPEG鎖一分子あたり21.3 A2であることが知られており (P. Labinisら, J. Phys. Chem. B, 1998年 102, 426-436)、概算されたOEG鎖の密度 (約65 A2/OEG chain) は隣接したOEG鎖が密にパッキングして結晶性のコンフォメーションを形成するために十分ではないと推察される。従って、形成する結晶構造からもOEG鎖はアモルファスであることが示唆された。
(2) WAXD chart
Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8) Enzyme-synthesized products using primers were mechanically disrupted by pipetting water and purified by centrifugation-redispersion. As a result of WAXD measurement, sharp diffraction peaks were shown at 2θ = 12.3, 19.9 and 22.1 ° (FIG. 5). These diffraction peaks were assigned to planes 1-10, 110, and 020 of cellulose type II crystals (M. Hiraishi et al., Carbohydr. Res., 2009, 344, 2468-2473), respectively. WAXD measurement also supported the formation of a cellulose II type crystal form similar to the crystal form formed by cellulose oligomers when enzymatic synthesis was performed using D-glucose as a primer. Furthermore, since 2 diffraction peaks derived from crystalline OEG chain at 2θ = 19.1 and 23.3 ° (S. Kuga et al., Langmuir, 2001, 17, 21-27) were not shown, the OEG chain was amorphous. It was supported. Considering the formation of cellulose type II crystals by arranging OEG-modified cellulose oligomers in antiparallel, the density of OEG chains on nanocellulose is estimated to be about 65 A 2 per OEG chain molecule. The cross-sectional area of a crystalline PEG chain with a helical conformation is known to be 21.3 A 2 per PEG chain molecule (P. Labinis et al., J. Phys. Chem. B, 1998 102, 426-436), it is speculated that the estimated OEG chain density (about 65 A 2 / OEG chain) is not sufficient for adjacent OEG chains to pack tightly to form a crystalline conformation. Therefore, the crystal structure formed also suggested that the OEG chain was amorphous.
２−１−４．セルロースのネットワーク構造
(1) SEM像
Glc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) プライマーを用いて酵素合成したセルロース構造体を超純水で1 w精製し、溶媒を超純水から徐々にtert-ブチルアルコールに置換し、凍結乾燥した生成物をSEMにより観察した。その結果、スポンジ状セルロース構造体は、長さが最大で数μmにも渡ってよく発達したリボン状の構造体 (ナノリボン) から構成されることが明らかとなった (図６)。観察されたナノリボン状のナノセルロースの形態は、D-グルコースをプライマーとした場合のプレート状の形態 (M. Hiraishiら, Carbohydr. Res., 2009年, 344, 2468-2473) とは大きく異なっていた。これは、導入されたOEG鎖が形成するコロイド状のナノセルロース前駆体を水中で分散安定化させることで、ナノセルロース前駆体がナノリボンへと３次元的に結晶成長し、スポンジ状セルロース構造体の形成に至ったと推察される。更に、EG基の鎖長の増大に伴い、構成するナノリボンの幅が減少する傾向を示した。SEM像からは枝分かれ構造が観察されず、ナノリボン状のナノセルロースが物理架橋することでスポンジ状セルロース構造体を形成していることが示唆された。
2-1-4. Cellulose network structure
(1) SEM image
Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8) The cellulose structure enzymatically synthesized using the primer was purified with ultrapure water for 1 w, and the solvent was gradually replaced with tert-butyl alcohol from the ultrapure water. The lyophilized product was observed by SEM. As a result, it was revealed that the sponge-like cellulose structure was composed of a ribbon-like structure (nanoribbon) that was well developed over a length of several μm at maximum (FIG. 6). The observed nanoribbon-like nanocellulose morphology is very different from the plate-like morphology when D-glucose is used as a primer (M. Hiraishi et al., Carbohydr. Res., 2009, 344, 2468-2473). It was. This is because the colloidal nanocellulose precursor formed by the introduced OEG chain is dispersed and stabilized in water, so that the nanocellulose precursor grows three-dimensionally into a nanoribbon, and the sponge-like cellulose structure It is inferred that it has formed. Furthermore, the width of the constituent nanoribbons tended to decrease as the chain length of the EG group increased. The branching structure was not observed from the SEM image, suggesting that the nanoribbon-like nanocellulose was physically crosslinked to form a sponge-like cellulose structure.
(2) AFM像
SEMによって観察されたスポンジ状セルロース構造体の構成要素であるナノリボンの形態を詳細に解析するために、Glc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) プライマーを用いて酵素合成したセルロース構造体をピペッティングにより機械的に破壊して遠心-再分散により精製した後、スピンキャストしてAFM観察した。その結果、いずれのサンプルもマイカ基板上でよく分散した短いリボン状の構造体が観察された (図７a-d)。観察されたナノリボンの厚さは、Glc-EGn (n = 2, 4, 6, 8) をプライマーとして用いた場合、それぞれ5.3 ± 0.3, 5.8 ± 0.4, 6.0 ± 0.3, and 6.1 ± 0.4 nmと算出された。厚さはEG基の鎖長の増大に伴い、わずかに上昇し、いずれも合成されたセルロース分子鎖の平均重合度を基に算出した分子鎖長よりもわずかながら大きな値であった (e.g. セルロースII型結晶を形成したセロデカオースの末端構造を除いた分子鎖長は5.2 nmと算出される (M. Hiraishiら, Carbohydr. Res., 2009年, 344, 2468-2473))。これは、ナノリボン表層にOEG鎖が存在していることを示唆しており、酵素合成されたセルロース誘導体はOEG鎖を表層に露出しながら、ナノリボンの底面に対して垂直に配列していることが推察された。ナノリボンの幅はGlc-EG2、Glc-EG4をプライマーとして用いた場合は数百nm、Glc-EG6をプライマーとした場合は100-200 nm、Glc-EG8をプライマーとした場合は100 nm以下であり、EG基の鎖長の増大に伴って減少する傾向を示し (図７e-h)、２−１−４項(1)のSEMにおける観察結果とよく一致した。更に、Glc-EG6、Glc-EG8をプライマーとして用いた場合、フレキシブルに屈曲したナノリボンが観察されており、Glc-EG2、Glc-EG4をプライマーとした場合と明らかに異なっていた。Glc-EGn (n = 4, 6, 8) をプライマーとした場合、２−１−２項(3)で示したαG1Pのコンバージョンは30〜40%であり、OEG化セルロースオリゴマーの生成量はそれぞれほぼ同程度である。従って、形成するナノリボンの形態の変化は、酵素合成されるOEG化セルロースオリゴマーの生成量ではなく、導入されたOEG鎖がセルロース誘導体の集合化に影響を与えていることに由来することが示唆された。
(2) AFM image
Cellulose structure synthesized enzymatically using Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8) primer to analyze in detail the morphology of nanoribbons, which are components of sponge-like cellulose structures observed by SEM The body was mechanically destroyed by pipetting and purified by centrifugation-redispersion, then spin cast and observed with AFM. As a result, a short ribbon-like structure in which all the samples were well dispersed on the mica substrate was observed (FIGS. 7a to 7d). The observed nanoribbon thicknesses were 5.3 ± 0.3, 5.8 ± 0.4, 6.0 ± 0.3, and 6.1 ± 0.4 nm, respectively, when Glc-EG n (n = 2, 4, 6, 8) was used as a primer. Calculated. The thickness slightly increased as the chain length of the EG group increased, and both were slightly larger than the molecular chain length calculated based on the average degree of polymerization of the synthesized cellulose molecular chains (eg cellulose The molecular chain length excluding the terminal structure of cellodekaose forming a type II crystal is calculated to be 5.2 nm (M. Hiraishi et al., Carbohydr. Res., 2009, 344, 2468-2473)). This suggests that OEG chains are present on the surface of the nanoribbon, and that the cellulose derivatives synthesized by enzyme synthesis are aligned perpendicular to the bottom of the nanoribbon while exposing the OEG chains to the surface. Inferred. The width of the nanoribbon is several hundred nm when Glc-EG 2 and Glc-EG 4 are used as primers, 100 to 200 nm when Glc-EG 6 is used as a primer, and 100 when Glc-EG 8 is used as a primer. It was below nm and showed a tendency to decrease as the chain length of the EG group increased (FIGS. 7e-h), which was in good agreement with the SEM observation results in section 2-1-4 (1). Further, when Glc-EG 6 and Glc-EG 8 were used as primers, flexible bent nanoribbons were observed, which were clearly different from those when Glc-EG 2 and Glc-EG 4 were used as primers. When Glc-EG n (n = 4, 6, 8) is used as a primer, the conversion of αG1P shown in section 2-1-2 (3) is 30 to 40%, and the amount of OEG-modified cellulose oligomer produced is Each is about the same level. Therefore, it is suggested that the change in the form of the nanoribbons formed is not due to the amount of OEG-modified cellulose oligomer produced by enzyme synthesis, but because the introduced OEG chain affects the assembly of cellulose derivatives. It was.
Claims (18)
Aは、繰り返し単位を有する親水性置換基であり、
mは、5〜10である]
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース三次元構造体。 Formula (I):
A is a hydrophilic substituent having a repeating unit;
m is 5-10]
The cellulose three-dimensional structure which contains the compound shown by these as a structural component.
で示される化合物である、請求項２又は３記載のセルロース三次元構造体。 Oligoethylene glycol has the following formula (II):
The cellulose three-dimensional structure according to claim 2 or 3, which is a compound represented by the formula:
で示されるグルコース誘導体を、セロデキストリンホスホリラーゼと反応させる工程を含む、次式(I):
Aは、前記と同一であり、
mは、5〜10である]
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース三次元構造体の製造方法。 α-D-glucose monophosphate and the following formula (III) as a primer:
Comprising the step of reacting a glucose derivative represented by the following formula with cellodextrin phosphorylase:
A is the same as above,
m is 5-10]
The manufacturing method of the cellulose three-dimensional structure which contains the compound shown by these as a structural component.
で示される化合物である、請求項１２又は１３記載の方法。 Oligoethylene glycol has the following formula (II):
The method of Claim 12 or 13 which is a compound shown by these.
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