JP2017216980A - Oligonucleotide - Google Patents
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Abstract
Description
本技術は、オリゴヌクレオチドに関する。より詳しくは、本技術は、特定の配列を有するオリゴヌクレオチド及び当該オリゴヌクレオチドからなる核酸増幅用プライマーに関する。 The present technology relates to oligonucleotides. More specifically, the present technology relates to an oligonucleotide having a specific sequence and a nucleic acid amplification primer comprising the oligonucleotide.
ビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌であり、腸内細菌叢を構成する主要な菌の１つである。ビフィズス菌は、ヒトでは特に離乳前の乳児腸管内に多く生息しており、乳児の腸内環境を良好に維持することに貢献していると考えられている。また、ビフィズス菌は、乳糖やブドウ糖を分解して乳酸と酢酸を産生することによって、大腸の蠕動運動を促進させ、大腸菌やウェルシュ菌などの有害菌を抑制し、さらに、腐敗産物を抑制するなど、便性を適性に保つことに貢献していると考えられている。このため、ビフィズス菌を添加した発酵乳を飲用すること、又は、製剤化したビフィズス菌を投与することにより、腸内環境を良好に維持することが考案されている。 Bifidobacterium is a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium and is one of the main bacteria constituting the intestinal flora. Bifidobacteria are particularly abundant in human intestinal tracts before weaning in humans, and are thought to contribute to the good maintenance of the intestinal environment of infants. In addition, Bifidobacteria promotes peristaltic movement of the large intestine by degrading lactose and glucose to produce lactic acid and acetic acid, thereby suppressing harmful bacteria such as Escherichia coli and Clostridium perfringens. It is believed that it contributes to maintaining the convenience of stool. For this reason, it has been devised to maintain a good intestinal environment by drinking fermented milk to which bifidobacteria have been added or by administering a formulated bifidobacteria.
ヒトに投与されるビフィズス菌としては、生理的観点からヒト腸管に生息するものであることが望ましい。ヒト腸管に生息するビフィズス菌として、例えばビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）が知られている。非特許文献１及び特許文献１には、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）が肥満誘導モデルマウスにおいて体重増加や体脂肪の蓄積を抑制し、血糖値や総コレステロール値を低下させる作用を有することが示されている。また、非特許文献２には、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）が、ＢＭＩ（Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ Ｉｎｄｅｘ）値が高めの被験者において、体脂肪量を減少させると共に肝機能の悪化を改善するなどの抗メタボリックシンドローム効果を有することが示されている。 The bifidobacteria administered to humans are preferably those that inhabit the human intestinal tract from a physiological viewpoint. For example, Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) is known as a bifidobacteria inhabiting the human intestinal tract. In Non-Patent Document 1 and Patent Document 1, Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) suppresses body weight gain and accumulation of body fat in an obesity induction model mouse, and decreases blood glucose level and total cholesterol level. It has been shown to have an effect. In Non-Patent Document 2, Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) reduces body fat mass and improves deterioration of liver function in subjects with high BMI (Body Mass Index) values. It has been shown to have an anti-metabolic syndrome effect.
ところで、ビフィズス菌の有用性をより詳細に評価するためには、糞便などに含まれるビフィズス菌の菌種や菌株を特定し、菌種ごとや菌株ごとの存在量を算出した上で、臨床的な効果を判定する必要がある。これにより、摂取されたビフィズス菌の腸への移行や腸内での生存状況を評価し、その臨床的な効果を判定することが可能となる。 By the way, in order to evaluate the usefulness of bifidobacteria in more detail, after identifying the species and strains of bifidobacteria contained in feces, etc., calculating the abundance for each species and strain, It is necessary to judge the effective effect. As a result, it is possible to evaluate the transition of the ingested bifidobacteria into the intestine and the survival state in the intestine and determine the clinical effect.
従来、糞便中や環境中のビフィズス菌は、検体を嫌気培養してコロニーを分離した後、グラム染色や検鏡による菌型の観察などの形態学検査、又は、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ活性、酸素耐性、糖発酵性などの生化学検査により同定が行われてきた。上述した検体の培養は、菌数測定や菌種の同定に通常用いられる標準的な方法で行われるが、必ずしも糞便中の全てのビフィズス菌を培養できるわけではない。また、当該培養は、嫌気装置を用いる必要があり、数日から１週間程度の期間を要するため、手間がかかり複雑である。加えて、検体に含まれるビフィズス菌は嫌気的かつ低温で保存され、生菌のまま分析に供される必要があるため、分析を行う者は習熟した技術を必要とされる。 Conventionally, bifidobacteria in feces and environment have been subjected to anaerobic culture of specimens to isolate colonies, followed by morphological examinations such as Gram staining and microscopic observation of fungal type, or fructose-6-phosphate phosphoketolase activity Identification has been performed by biochemical tests such as oxygen tolerance and sugar fermentability. The above-described culture of the specimen is performed by a standard method usually used for measuring the number of bacteria and identifying the bacterial species, but not all bifidobacteria in stool can be cultured. In addition, the culture requires an anaerobic apparatus and requires a period of several days to about one week, which is troublesome and complicated. In addition, the bifidobacteria contained in the specimen must be stored anaerobically and at a low temperature and used for the analysis in a live state, so that the person who performs the analysis requires a skillful skill.
そこで近年、微生物の同定法としてリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子を用いる手法が提案されている。非特許文献３には、被検菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した後、これと近縁の菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を整列させ、塩基配列の違いを解析する方法が開示されている。 Therefore, in recent years, a method using a ribosomal RNA (rRNA) gene has been proposed as a method for identifying microorganisms. Non-Patent Document 3 discloses a method for analyzing a difference in base sequence by determining the base sequence of a 16S rRNA gene of a test bacterium and then aligning the base sequence of a 16S rRNA gene of a related bacterium with a related bacterium. ing.
また、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特異的配列が既に知られている菌と被検菌とが同一種であるか否かを、その特異的配列を検出するプローブを用いて判断する方法が知られている。特許文献２には、ビフィドバクテリウム属細菌であるビフィドバクテリウム・ロンガムの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出するオリゴヌクレオチド及びその誘導体を、プローブとして用いる方法が開示されている。 In addition, a method is known in which whether or not a bacterium whose specific sequence of 16S rRNA gene is already known and a test bacterium are the same species is determined using a probe that detects the specific sequence. . Patent Document 2 discloses a method of using, as a probe, an oligonucleotide for detecting the 16S rRNA gene of Bifidobacterium longum, a Bifidobacterium genus bacterium, and a derivative thereof.
一方、特許文献３及び非特許文献４には、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出しうるＰＣＲプライマーを用いてビフィズス菌を解析する方法が開示されている。また、非特許文献５では、ビフィズス菌の菌種間の比較を行うために、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中間に位置するＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒの塩基配列を使用することが可能であると報告されている。 On the other hand, Patent Literature 3 and Non-Patent Literature 4 disclose methods for analyzing bifidobacteria using PCR primers capable of detecting a 16S rRNA gene. In addition, Non-Patent Document 5 reports that it is possible to use the base sequence of an intergenic transcribed spacer located between the 16S rRNA gene and the 23S rRNA gene in order to compare the strains of bifidobacteria. ing.
また、染色体ＤＮＡの多型性を用いて菌株を同定する方法も知られている。例えば、非特許文献６には、制限酵素を用いて染色体ＤＮＡを切断し、その切断ＤＮＡをパルスフィールドゲル電気泳動（Ｐｕｌｓｅｄ−Ｆｉｅｌｄ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって分離後、染色を行い、泳動パターンにより菌株の違いを比較するＰＦＧＥ法が開示されている。また、非特許文献７には、１０塩基長程度のＰＣＲプライマーを用いＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）によってＰＣＲを行い、アガロース電気泳動によって分離後、染色を行い、泳動パターンを比較する方法が開示されている。 In addition, a method for identifying a strain using polymorphisms of chromosomal DNA is also known. For example, in Non-Patent Document 6, a chromosomal DNA is cleaved using a restriction enzyme, the cleaved DNA is separated by pulse field gel electrophoresis (Pulsed-Field Gel Electrophoresis), then stained, and the strains differ depending on the electrophoretic pattern. A PFGE method for comparing the two is disclosed. Non-Patent Document 7 discloses a method of performing PCR by RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) using PCR primers having a length of about 10 bases, separating by agarose electrophoresis, staining, and comparing the migration patterns. ing.
前述の通り、非特許文献１、２及び特許文献１においてビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の有用性が示されている。このような有用性を臨床的に評価するためには、摂取されたビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）が腸内に到達したか否かを判断する必要がある。そこで、糞便などの試料からビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）のみを検出することが可能な技術が求められている。 As described above, the usefulness of Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) is shown in Non-Patent Documents 1 and 2 and Patent Document 1. In order to clinically evaluate such usefulness, it is necessary to determine whether or not the ingested Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) has reached the intestine. Therefore, a technique capable of detecting only Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) from a sample such as feces is demanded.
しかしながら、非特許文献３の方法は、比較対照として、土壌、汚泥、糞便、食品などに存在する菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列を決定し、多数配列間での系統的な解析を行う必要があり、多大な労力と時間を要する。特許文献３及び非特許文献４の方法は、ビフィドバクテリウム・ブレーベを検出することは可能であるが、ビフィドバクテリウム・ブレーベの中から特定の菌株のみを検出することはできない。非特許文献５に記載されているＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒの塩基配列は、同属同種異株間の比較に応用可能であるか詳細に検討されてはいない。非特許文献６の方法は、複雑な工程が必要であり、実施に数日要するなどルーティーンワークには適していない。非特許文献７の方法は、短いＰＣＲプライマーを使用して低温でアニーリングを行うため、再現性に劣る場合や使用する機器によって結果が異なる場合がある。 However, in the method of Non-Patent Document 3, it is necessary to determine the sequence of 16S rRNA gene of fungi existing in soil, sludge, feces, food, etc. as a comparison control, and to perform systematic analysis among a large number of sequences. It takes a lot of labor and time. The methods of Patent Literature 3 and Non-Patent Literature 4 can detect Bifidobacterium breve, but cannot detect only a specific strain from Bifidobacterium breve. The base sequence of the intergenetic transcribed spacer described in Non-Patent Document 5 has not been examined in detail as to whether it can be applied to comparison between homologous and allogeneic strains. The method of Non-Patent Document 6 requires a complicated process and is not suitable for routine work because it takes several days to implement. In the method of Non-Patent Document 7, annealing is performed at a low temperature using a short PCR primer, so that the result may be different depending on the case where the reproducibility is poor or the equipment used.
そこで、本技術は、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の検出に関する技術を提供することを目的とする。 Then, this technique aims at providing the technique regarding the detection of Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175).
本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
また、本技術は、配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対も提供する。
The present technology provides an oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
Moreover, this technique provides the oligonucleotide which consists of a base sequence of sequence number 2.
The present technology also provides an oligonucleotide pair that is a combination of an oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2.
本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対からなる核酸増幅用プライマーも提供する。
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）を検出する為のものでありうる。
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム属細菌との交差反応を示さないものでありうる。
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌との交差反応を示さないものでありうる。
The present technology also provides a nucleic acid amplification primer comprising an oligonucleotide pair that is a combination of an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 2.
The primer for nucleic acid amplification of the present technology may be for detecting Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175).
The primer for nucleic acid amplification of the present technology may be one that does not show a cross-reaction with Bifidobacterium bacteria other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175).
The primer for nucleic acid amplification of the present technology may not exhibit a cross-reaction with bacteria belonging to Bifidobacterium breve other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175).
本技術は、前記核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用キットも提供する。
本技術の核酸増幅用キットは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）を検出する為のものでありうる。
The present technology also provides a nucleic acid amplification kit containing the nucleic acid amplification primer.
The kit for nucleic acid amplification of the present technology may be for detecting Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175).
本技術は、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の検出方法も提供する。当該検出方法は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、増幅産物の有無により、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）又はビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）由来核酸の前記試料中における有無を判断することを含む。
また、本技術は、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の定量方法も提供する。当該定量方法は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、前記試料中のビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）又はビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）由来核酸の量を、前記処理後の試料のＣｔ値に基づき定量することを含む。
The present technology also provides a method for detecting Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175). In this detection method, a sample is subjected to a nucleic acid amplification process using an oligonucleotide pair that is a combination of an oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2. And determining the presence or absence of a nucleic acid derived from Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) or Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) in the sample depending on the presence or absence of an amplification product.
The present technology also provides a method for quantifying Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175). The quantification method uses a pair of oligonucleotides, which is a combination of an oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2, to perform a nucleic acid amplification process on the sample. The amount of nucleic acid derived from Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) or Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) in the sample is quantified based on the Ct value of the sample after the treatment. Including that.
本技術により、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）を特異的に検出することができる。本技術により、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）を他のビフィドバクテリウム属細菌から区別して検出でき且つ他のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌からも区別して検出できる。なお、本技術により奏される効果は、ここに記載された効果に必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。 By this technique, Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) can be specifically detected. According to the present technology, Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) can be detected separately from other Bifidobacterium bacteria and can also be detected separately from bacteria belonging to other Bifidobacterium breve. In addition, the effect show | played by this technique is not necessarily limited to the effect described here, and may be the any effect described in this specification.
以下、本技術を実施するための好適な実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。 Hereinafter, preferred embodiments for carrying out the present technology will be described. In addition, embodiment described below shows an example of typical embodiment of this technique, and, thereby, the scope of this technique is not interpreted narrowly.
＜１．オリゴヌクレオチド＞
本技術は、以下の配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。また、本技術は、以下の配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
これらオリゴヌクレオチドによって、他方のオリゴヌクレオチドと組み合わせて核酸増幅に用いた場合にビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の検出ができるという効果が奏される。なお、本明細書内に記載の塩基配列は、他に言及されない限り、左端が５’端であり、右端が３’端である。
<1. Oligonucleotide>
The present technology provides an oligonucleotide having the following base sequence of SEQ ID NO: 1. The present technology also provides an oligonucleotide consisting of the following base sequence of SEQ ID NO: 2.
These oligonucleotides have an effect that Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) can be detected when used in nucleic acid amplification in combination with the other oligonucleotide. In addition, unless otherwise indicated, the left end is the 5 ′ end and the right end is the 3 ′ end in the base sequences described in the present specification.
本技術のオリゴヌクレオチドは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の染色体ＤＮＡに特異的な配列に対応する。その結果、本技術のオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅を行うことによって、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の染色体ＤＮＡ中の特定の領域が増幅される。ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４は、２００９年８月２５日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許生物寄託センター（旧名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５として寄託されている。 The oligonucleotides of the present technology correspond to sequences specific for the chromosomal DNA of Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175). As a result, a specific region in the chromosomal DNA of Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) is amplified by performing nucleic acid amplification using the oligonucleotide of the present technology. Bifidobacterium breve MCC1274 is a patent biological deposit center of the National Institute of Technology and Evaluation Biotechnology Center (former name: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center) on August 25, 2009 ( Deposited as FERM BP-11175 at Kazusa Kamashichi 2-5-8) in Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan.
本技術のオリゴヌクレオチドを用いて核酸増幅を行うことによって、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の核酸、特には染色体ＤＮＡが特異的に増幅される。当該核酸増幅において、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム属細菌の核酸は増幅されないか、増幅されたとしても検出限界以下となり検出されない。また、当該核酸増幅において、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌の核酸は増幅されないか、増幅されたとしても検出限界以下となり検出されない。よって、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）を特異的に検出することが可能になるという効果が奏される。 By performing nucleic acid amplification using the oligonucleotide of the present technology, the nucleic acid of Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175), particularly chromosomal DNA, is specifically amplified. In the nucleic acid amplification, nucleic acids of Bifidobacterium other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) are not amplified, or even if amplified, they are below the detection limit and are not detected. In the nucleic acid amplification, nucleic acids of bacteria belonging to Bifidobacterium breve other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) are not amplified, or even if amplified, they are below the detection limit and are not detected. Therefore, there is an effect that Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) can be specifically detected.
また、本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対も提供する。当該オリゴヌクレオチド対を核酸増幅に用いることで、上記で述べた効果が奏される。 The present technology also provides an oligonucleotide pair that is a combination of an oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2. By using the oligonucleotide pair for nucleic acid amplification, the effects described above can be achieved.
また、本技術は、配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに、これらオリゴヌクレオチドの組合せであるオリゴヌクレオチド対も提供する。これらオリゴヌクレオチドについても、上記で述べた効果が奏されうる。 Further, the present technology provides an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1, an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 2, and a combination of these oligonucleotides. Certain oligonucleotide pairs are also provided. These oligonucleotides can also have the effects described above.
本技術のオリゴヌクレオチドは、当業者に既知の合成方法や装置により製造されうる。合成方法としては例えば固相法が挙げられ、装置としては自動オリゴヌクレオチド合成装置が挙げられるがこれらに限定されない。 Oligonucleotides of the present technology can be produced by synthetic methods and equipment known to those skilled in the art. Examples of the synthesis method include a solid phase method, and examples of the apparatus include, but are not limited to, an automatic oligonucleotide synthesizer.
＜２．核酸増幅用プライマー＞
本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対からなる核酸増幅用プライマーを提供する。本技術の核酸増幅用プライマーを用いて核酸増幅を行うことにより、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の核酸、特にはＤＮＡ、より特には染色体ＤＮＡ中の特定の領域が特異的に増幅されるので、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の検出が可能となる。よって、本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）を検出する為のものでありうる。
<2. Primer for nucleic acid amplification>
The present technology provides a primer for nucleic acid amplification consisting of an oligonucleotide pair which is a combination of an oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2. By performing nucleic acid amplification using the nucleic acid amplification primer of the present technology, a specific region in Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) nucleic acid, particularly DNA, more particularly chromosomal DNA is specific. Therefore, Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) can be detected. Therefore, the primer for nucleic acid amplification of the present technology may be for detecting Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175).
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム属細菌との交差反応を示さないものでありうる。すなわち、本技術の核酸増幅用プライマーを用いた核酸増幅では、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の核酸が特異的に増幅され、それ以外の核酸は増幅されないか、増幅されたとしても検出限界以下となり検出されない。 The primer for nucleic acid amplification of the present technology may be one that does not show a cross-reaction with Bifidobacterium bacteria other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175). That is, in the nucleic acid amplification using the nucleic acid amplification primer of the present technology, the nucleic acid of Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) was specifically amplified, and other nucleic acids were not amplified or were amplified. However, it is below the detection limit and is not detected.
本技術の核酸増幅用プライマーは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌との交差反応を示さないものでありうる。すなわち、本技術の核酸増幅用プライマーを用いた核酸増幅では、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌の核酸は増幅されないか、増幅されたとしても検出限界以下となり検出されない。 The primer for nucleic acid amplification of the present technology may not exhibit a cross-reaction with bacteria belonging to Bifidobacterium breve other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175). That is, in the nucleic acid amplification using the nucleic acid amplification primer of the present technology, the nucleic acid of bacteria belonging to Bifidobacterium breve other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) was not amplified or was amplified. However, it is below the detection limit and is not detected.
このように、本技術の核酸増幅用プライマーを用いることにより、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の核酸が特異的に増幅されうる。より特には、本技術の核酸増幅用プライマーを用いることにより、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の核酸のみが増幅されうる。 Thus, the nucleic acid of Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) can be specifically amplified by using the primer for nucleic acid amplification of this technique. More specifically, only the nucleic acid of Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) can be amplified by using the nucleic acid amplification primer of the present technology.
本技術において、核酸増幅とは、試料中の核酸のうち増幅したい核酸（標的核酸）を、当該標的核酸の塩基配列の相補性を利用して増幅することをいう。核酸増幅方法の具体例として、例えばＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、及び３ＳＲなどが挙げられるがこれらに限定されない。本技術において、核酸増幅は好ましくはＰＣＲである。 In the present technology, nucleic acid amplification refers to amplification of a nucleic acid to be amplified (target nucleic acid) among nucleic acids in a sample by utilizing complementarity of the base sequence of the target nucleic acid. Specific examples of the nucleic acid amplification method include, but are not limited to, PCR, LAMP, NASBA, SDA, TMA, and 3SR. In the present technology, the nucleic acid amplification is preferably PCR.
本技術において、ＰＣＲは、一般的に行われているＰＣＲと同様の方法により行われてよい。典型的には、ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ、プライマー、及びＤＮＡポリメラーゼ、並びにその他の必要成分を含む反応液を用意し、変性工程、アニーリング工程、及び伸長反応工程に各々適した温度で当該反応液を所定時間保温するという一連の工程を２０〜４０サイクル繰り返すことにより行われうる。各工程における温度や保温時間並びにサイクル数は当業者により適宜定められうる。 In the present technology, PCR may be performed by the same method as PCR that is generally performed. Typically, PCR prepares a reaction solution containing a template DNA, a primer, a DNA polymerase, and other necessary components, and the reaction solution is applied at temperatures suitable for the denaturation step, annealing step, and extension reaction step, respectively. It can be performed by repeating a series of steps of keeping the temperature for a predetermined time 20 to 40 cycles. The temperature, the heat retention time, and the number of cycles in each step can be appropriately determined by those skilled in the art.
ＰＣＲの反応条件は、使用する酵素や装置等に応じて当業者により適宜設定されうる。具体的には、例えば９５℃３分間加温後、変性工程：９０〜９８℃で１０〜４０秒、アニーリング工程：５０〜６５℃で２０〜４０秒、及び伸長反応工程：７０〜７５℃で２０〜４０秒の一連の工程を２０〜４０サイクル繰返し、最後に７２℃で１０分間加熱する反応条件が挙げられる。鋳型ＤＮＡとプライマーの量比は、１０２〜１０８コピーの染色体ＤＮＡに対しプライマー０．２〜２μｍｏｌであることが好ましい。 The reaction conditions for PCR can be appropriately set by those skilled in the art depending on the enzyme, apparatus, etc. used. Specifically, for example, after heating at 95 ° C. for 3 minutes, denaturation step: 90 to 98 ° C. for 10 to 40 seconds, annealing step: 50 to 65 ° C. for 20 to 40 seconds, and extension reaction step: 70 to 75 ° C. A reaction condition of repeating a series of steps of 20 to 40 seconds for 20 to 40 cycles and finally heating at 72 ° C. for 10 minutes can be mentioned. The amount ratio of the template DNA to the primer is preferably 0.2 to 2 μmol of primer with respect to 10 2 to 10 8 copies of chromosomal DNA.
ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲに用いることができるものであれば特に制限されない。ＤＮＡポリメラーゼとしては例えば、市販入手可能なＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）、Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ、及びＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ）などのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）及びＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）などのＤＮＡポリメラーゼを挙げることができるがこれらに限定されない。上記ＰＣＲにおいて用いられるＤＮＡポリメラーゼは、これらの酵素と緩衝液とからなる組成物であってもよい。 The DNA polymerase is not particularly limited as long as it can be used for PCR. Examples of the DNA polymerase include commercially available AmpliTaq Gold, Platinum Taq DNA polymerase (Thermo Fisher SCIENTIFIC), Takara Taq and Takara Ex Taq (Takara Bio), and Plameh Platinum Platum. Examples thereof include, but are not limited to, DNA polymerases such as SCIENTIFIC) and Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio). The DNA polymerase used in the PCR may be a composition comprising these enzymes and a buffer solution.
本技術の核酸増幅用プライマーによる細菌の検出は、細菌の核酸が増幅されることにより行われるので、細菌の培養が行われなくてもよい。その結果、本技術により、細菌の検出を迅速、簡便、低コスト且つ高精度に行うことが可能になる。 Bacteria detection using the primer for nucleic acid amplification according to the present technology is performed by amplifying bacterial nucleic acid, so that bacterial culture does not have to be performed. As a result, according to the present technology, bacteria can be detected quickly, simply, at low cost and with high accuracy.
また、検出に先立ち細菌の培養が行われてもよい。細菌の培養を行う場合は、例えば糞便、食品、又は土壌から得た細菌が、適当な培地、例えば３％グルコースを添加したＧＡＭ寒天培地で、二酸化炭素存在下で嫌気的に培養されうる。また、必要に応じて、水、緩衝液、有機溶媒等によって培地から細菌を抽出してもよい。 Further, prior to detection, bacteria may be cultured. When culturing bacteria, for example, bacteria obtained from stool, food, or soil can be anaerobically cultured in the presence of carbon dioxide on a suitable medium, such as a GAM agar medium supplemented with 3% glucose. Moreover, you may extract bacteria from a culture medium with water, a buffer solution, an organic solvent, etc. as needed.
本技術の核酸増幅用プライマーを用いて増幅される核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、特には染色体ＤＮＡ又はその断片でありうる。増幅される核酸は、細菌から抽出されたものでありうる。細菌からの核酸の抽出は、当業者に既知の方法により行われてよい。例えば、ＱＩＡＧＥＮ社のＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ＫｉｔやＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、日本バイオラッド社のインスタジーンマトリックス（ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ）などの市販のＤＮＡ抽出キットを使用することができる。また、Ｍｕｒｍｕｒの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３ ｐ２０８−２１８（１９６１））やベンジルクロライド法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．２１ ｐ５２７９−５２８０（１９９３））などにより細胞からＤＮＡを抽出し、さらにはリボヌクレアーゼによりＲＮＡを除去することによっても、ＤＮＡを抽出することができる。核酸の抽出に際しては、ＰＣＲ阻害物質を除去する物質、例えば牛血清アルブミン等を加えることが好ましい。ＤＮＡの抽出法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ″，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等にも記載されている。 The nucleic acid amplified using the nucleic acid amplification primer of the present technology is DNA or RNA, and in particular may be chromosomal DNA or a fragment thereof. The nucleic acid to be amplified can be extracted from bacteria. Extraction of nucleic acids from bacteria may be performed by methods known to those skilled in the art. For example, commercially available DNA extraction kits such as QIAGEN's DNeasy Blood & Tissue Kit, QIAamp DNA Stool Mini Kit, and Japan BioRad's instagene matrix (InstaGene Matrix) can be used. In addition, DNA is extracted from cells by the Murmur method (Journal of Molecular Biology Vol. 3 p208-218 (1961)), the benzyl chloride method (Nucleic Acid Research Vol. 21 p5279-5280 (1993)), and ribonuclease. DNA can also be extracted by removing RNA. At the time of nucleic acid extraction, it is preferable to add a substance that removes a PCR inhibitor, such as bovine serum albumin. DNA extraction methods are also described in Sambrook et al., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and the like.
本技術の核酸増幅用プライマーを用いてビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）のＤＮＡがＰＣＲにより増幅される場合、例えば１００〜２００ｂｐ、特には１１０〜１７０ｂｐ、より特には１２０〜１５０ｂｐの増幅産物が得られうるが、通常は１３８ｂｐの増幅産物が得られる。そのため、得られた増幅産物がビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）由来のものであるかをより確かに確認するために、増幅産物の長さが決定されてもよい。増幅産物の長さの決定は、当業者により適宜行われてよく、例えばアガロースゲル電気泳動により行われうる。 When DNA of Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) is amplified by PCR using the primer for nucleic acid amplification of the present technology, for example, 100 to 200 bp, particularly 110 to 170 bp, more particularly 120 to 150 bp. An amplification product of 138 bp is usually obtained. Therefore, the length of the amplified product may be determined in order to more surely confirm whether the obtained amplified product is derived from Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175). The length of the amplification product may be determined appropriately by those skilled in the art, for example, agarose gel electrophoresis.
＜３．核酸増幅用キット＞
本技術は、核酸増幅用キットも提供する。当該核酸増幅用キットは、本技術の核酸増幅用プライマーを含む。当該核酸増幅用キットは、核酸増幅に必要な他の要素も含みうる。当該他の要素として、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び／又は緩衝剤が挙げられるがこれらに限定されない。本技術の核酸増幅用キットは、陽性対照として、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の染色体ＤＮＡ又は本技術の核酸増幅用プライマーによって増幅され得る染色体ＤＮＡ断片、及び／又は、陰性対照として、本技術の核酸増幅用プライマーの塩基配列のうち１、２、３、４又は５塩基についてミスマッチを有する塩基配列を含むＤＮＡ断片を含んでいてもよい。
<3. Nucleic acid amplification kit>
The present technology also provides a kit for nucleic acid amplification. The nucleic acid amplification kit includes a primer for nucleic acid amplification of the present technology. The nucleic acid amplification kit may also include other elements necessary for nucleic acid amplification. Examples of such other elements include, but are not limited to, DNA polymerase, dNTP, and / or buffer. The nucleic acid amplification kit of the present technology is a chromosomal DNA fragment of Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) or a chromosomal DNA fragment that can be amplified by the nucleic acid amplification primer of the present technology, and / or a negative control. As a control, a DNA fragment containing a base sequence having a mismatch with respect to 1, 2, 3, 4 or 5 bases among the base sequences of the nucleic acid amplification primer of the present technology may be included.
本技術の核酸増幅用キットは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）を検出する為のものでありうる。すなわち、本技術の核酸増幅用キットは、試料中にビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）が存在するか又はこの細菌由来の核酸が存在するかを調査する為に用いられうる。当該調査の為に、本技術の核酸増幅用キットによる試料の核酸増幅反応が行われうる。当該核酸増幅反応によって増幅産物が得られた場合は、試料中にビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）又はこの細菌由来の核酸が存在することが確認され、増幅産物が得られない場合は、試料中にビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）又はこの細菌由来の核酸が存在しないことが確認されうる。本技術において、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）由来の核酸とは、例えばこの細菌に含まれるＤＮＡ又はＲＮＡ、特には染色体ＤＮＡ又はその断片でありうる。 The kit for nucleic acid amplification of the present technology may be for detecting Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175). That is, the kit for nucleic acid amplification of the present technology can be used to investigate whether Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) or nucleic acid derived from this bacterium is present in the sample. For the investigation, a nucleic acid amplification reaction of a sample using the nucleic acid amplification kit of the present technology can be performed. When an amplification product is obtained by the nucleic acid amplification reaction, it is confirmed that Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) or nucleic acid derived from this bacterium is present in the sample, and no amplification product is obtained. In some cases, it can be confirmed that Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) or nucleic acid derived from this bacterium is not present in the sample. In the present technology, the nucleic acid derived from Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) may be, for example, DNA or RNA contained in this bacterium, particularly chromosomal DNA or a fragment thereof.
＜４．ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の検出方法及び定量方法＞
本技術は、以下に述べるとおり、本技術のオリゴヌクレオチド対を用いたビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の検出方法及び定量方法も提供する。
<4. Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) detection method and quantification method>
As described below, the present technology also provides a method for detecting and quantifying Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) using the oligonucleotide pair of the present technology.
すなわち、本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、増幅産物の有無によりビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）又はビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）由来核酸の当該試料中における有無を判断することを含む、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の検出方法も提供する。本技術の検出方法において、本技術のオリゴヌクレオチド対は核酸を増幅する為のプライマーとして用いられうる。前記核酸増幅の為の処理として、上記２．核酸増幅用プライマーの節において述べた方法が用いられうる。本技術の検出方法において、試料は細菌を１種類だけ含んでもよく、又は複数種類の細菌を含んでもよい。前者の場合、増幅産物が得られることによって、試料の細菌がビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）であると同定される。後者の場合は、増幅産物が得られることによって、試料がこの細菌を含むと判定されうる。 That is, in the present technology, a treatment for nucleic acid amplification is performed on a sample using an oligonucleotide pair that is a combination of an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 2. Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) or Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) -derived nucleic acid in the sample is determined according to the presence or absence of an amplification product. Also provided is a method for detecting Fidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175). In the detection method of the present technology, the oligonucleotide pair of the present technology can be used as a primer for amplifying a nucleic acid. As the treatment for nucleic acid amplification, 2. The methods described in the section on primers for nucleic acid amplification can be used. In the detection method of the present technology, the sample may include only one type of bacteria, or may include a plurality of types of bacteria. In the former case, by obtaining an amplification product, the bacterium of the sample is identified as Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175). In the latter case, it can be determined that the sample contains this bacterium by obtaining an amplification product.
また、本技術は、配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組合せであるオリゴヌクレオチド対を用いて、核酸増幅の為の処理を試料に対して行い、当該試料中のビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）又はビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）由来核酸の量を、当該処理後の試料のＣｔ値に基づき定量することを含む、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の定量方法も提供する。本技術の定量方法において、本技術のオリゴヌクレオチド対は核酸を増幅する為のプライマーとして用いられうる。前記核酸増幅の為の処理として、上記２．核酸増幅用プライマーの節において述べた方法が用いられうる。本技術の定量方法によって、試料中のビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の存在量を定量することが可能となる。 In addition, the present technology uses a pair of oligonucleotides, which is a combination of an oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2, to perform processing for nucleic acid amplification on a sample. The amount of nucleic acid derived from Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) or Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) in the sample is determined based on the Ct value of the sample after the treatment. A method for quantifying Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) is also provided. In the quantification method of the present technology, the oligonucleotide pair of the present technology can be used as a primer for amplifying a nucleic acid. As the treatment for nucleic acid amplification, 2. The methods described in the section on primers for nucleic acid amplification can be used. The quantification method of the present technology makes it possible to quantitate the abundance of Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) in a sample.
前記検出方法又は定量方法が適用されうる試料としては、糞便、食品、及び土壌、並びにこれらから得られた試料、例えばこれらをＤＮＡ抽出キットにより処理して得られたＤＮＡ含有試料などを挙げることができるがこれらに限定されない。試料は、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）のみを含むもの若しくは含まないものであってよく、又はこの細菌と他の細菌とを含むものであってもよい。他の細菌は、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌、又はビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム属細菌でありうる。試料に含まれる細菌は、分離された単一の種類の細菌からなってよく、又は、複数種類の細菌を含むものであってもよい。 Samples to which the detection method or quantification method can be applied include feces, food, and soil, and samples obtained therefrom, such as DNA-containing samples obtained by treating them with a DNA extraction kit. Yes, but not limited to. The sample may or may not contain only Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175), or may contain this and other bacteria. Examples of other bacteria include bacteria belonging to Bifidobacterium breve other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175), or bifido other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175). It can be a bacterium of the genus Bacteria. The bacteria contained in the sample may consist of a single type of separated bacteria, or may contain a plurality of types of bacteria.
前記検出方法において、増幅産物の有無の決定は、当業者に既知の手法により行われうる。例えば、ＱＩＡｘｃｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて増幅反応後の溶液を電気泳動することにより増幅産物を検出することができる。或いは、アガロース電気泳動又はキャピラリ電気泳動によって電気泳動した後、エチジウムブロマイド又はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉで染色することによって、増幅産物を検出することができる。また、予め蛍光染色液を含むアガロースゲルを用いて電気泳動を行うことにより、電気泳動終了後に染色作業を行うことなく増幅産物を検出することもできる。これらの手法により増幅産物の有無を調査し、その結果によりビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）又はこの細菌由来の核酸の当該試料中における有無が判断されうる。必要に応じて、増幅産物をサイクルシーケンスした後、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列と長さを測定することによって、増幅産物の有無又は量を確認することもできる。 In the detection method, the presence or absence of an amplification product can be determined by a technique known to those skilled in the art. For example, the amplification product can be detected by electrophoresis of the solution after the amplification reaction using QIAxcel (QIAGEN). Alternatively, the amplification product can be detected by staining with ethidium bromide or SYBR Green I after electrophoresis by agarose electrophoresis or capillary electrophoresis. In addition, by performing electrophoresis using an agarose gel containing a fluorescent staining solution in advance, the amplification product can be detected without performing a staining operation after the completion of electrophoresis. The presence or absence of an amplification product is investigated by these methods, and the presence or absence of Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) or a nucleic acid derived from this bacterium in the sample can be determined based on the results. If necessary, after the amplification product is cycle-sequenced, the presence or amount of the amplification product can be confirmed by measuring the base sequence and length using a DNA sequencer.
前記定量方法において、Ｃｔ値に基づきビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）又はこの細菌由来の核酸の量を定量することは、当業者により適宜行われうる。Ｃｔ値（Threshold Cycle）は、増幅産物が或る量に達したときのサイクル数である。当該定量は例えば、段階希釈した核酸含有量が既知の複数の参照試料についてリアルタイムＰＣＲを行い、その結果からＣｔ値と核酸含有量との関係を示す検量線を作成し、一方で、被検試料についてもリアルタイムＰＣＲを行ってＣｔ値を得、前記検量線に被検試料のＣｔ値を当てはめることにより行われうる。リアルタイムＰＣＲにより、経時的に増幅反応を検出することができる。 In the quantification method, the amount of Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) or nucleic acid derived from this bacterium based on the Ct value can be appropriately determined by those skilled in the art. The Ct value (Threshold Cycle) is the number of cycles when the amplification product reaches a certain amount. The quantification is performed, for example, by performing real-time PCR on a plurality of reference samples having known nucleic acid contents that are serially diluted, and creating a calibration curve indicating the relationship between the Ct value and the nucleic acid content from the results. Can be performed by performing real-time PCR to obtain a Ct value, and applying the Ct value of the test sample to the calibration curve. The amplification reaction can be detected over time by real-time PCR.
前記定量方法において、増幅産物の検出は蛍光により検出されうる。検出方法としては、インターカレーターを用いる方法と蛍光標識プローブを用いる方法を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光物質としては、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＰ−１３、ＳＹＴＯ−８２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。 In the quantification method, the amplification product can be detected by fluorescence. Examples of the detection method include, but are not limited to, a method using an intercalator and a method using a fluorescently labeled probe. Examples of fluorescent substances include SYBR Green I, SYBR Gold, SYTO-9, SYTP-13, SYTO-82 (Life Technologies), EvaGreen (Biotium), LCGreen (Idaho), LightCyclerRest However, it is not limited to these.
以下、実施例に基づいて本技術を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本技術の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。 Hereinafter, the present technology will be described in more detail based on examples. In addition, the Example described below shows an example of a typical example of the present technology, and the scope of the present technology is not interpreted narrowly.
［プライマーの設計及び合成］
ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、米国国立バイオテクノロジー情報センター）に完全長ゲノム配列が公開されているビフィドバクテリウム・ブレーベ１０株のゲノム配列と、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）のゲノム配列とを、ゲノム配列の比較ソフトであるＭａｕｖｅ（http://darlinglab.org/mauve/mauve.html）を用いて比較した。その結果、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）に特異的であり、他のビフィドバクテリウム・ブレーベにおいて相同性を示す領域が存在しないと判断されたゲノム領域を９１領域抽出した。さらに、上記９１領域の塩基配列を対象として、ＮＣＢＩの塩基配列データベース（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｎｒ／ｎｔ）及びＷｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ｓｈｏｔｇｕｎ ｃｏｎｔｉｇｓ（ｗｇｓ））に対してＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）による相同性検索を行った。当該相同性検索において上記データベース上の塩基配列と相同性が高い（アイデンティティー９５％以上）と判断された領域を除外し、最終的にビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）に特異的な１領域を見出した。ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）に特異的な当該領域を増幅するために用いられるプライマーとして、以下の配列番号１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した（以下それぞれ「プライマー１」及び「プライマー２」という。）。
The genome sequence of 10 strains of Bifidobacterium breve whose full-length genome sequence is disclosed in NCBI (National Center for Biotechnology Information, National Center for Biotechnology Information), and Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175 ) Genomic sequence was compared using Mauve (http://darlinglab.org/mauve/mauve.html) which is a genomic sequence comparison software. As a result, 91 regions of genomic regions that were specific to Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) and were judged to have no homology in other Bifidobacterium breve were extracted. . Furthermore, for the base sequence of the 91 region, BLAST (Basic Local Alignment Search: http: // NCBI base sequence database (Nucleotide collection (nr / nt) and Whole-genome shotgun contigs (wgs))) homology search by blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). In the homology search, the region judged to be highly homologous to the base sequence in the database (identity 95% or more) is excluded, and finally it is specific to Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) One area was found. As a primer used to amplify the region specific to Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175), it consists of an oligonucleotide consisting of the following base sequence of SEQ ID NO: 1 and a base sequence of SEQ ID NO: 2. Oligonucleotides were synthesized (hereinafter referred to as “primer 1” and “primer 2”, respectively).
比較例で用いられるプライマーとして、以下の配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した（以下それぞれ「プライマー３」及び「プライマー４」という。）。プライマー３及びプライマー４は、特許文献３においてそれぞれＢｉＢＲＥ−１及びＢｉＢＲＥ−２として記載されているビフィドバクテリウム・ブレーベを同定するためのプライマーである。
プライマー１〜４として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社において合成されたものを用いた。プライマー１及びプライマー３がフォワードプライマーであり、プライマー２及びプライマー４がリバースプライマーである。 As the primers 1 to 4, those synthesized by Thermo Fisher SCIENTIFIC were used. Primer 1 and primer 3 are forward primers, and primer 2 and primer 4 are reverse primers.
［被検細菌の染色体ＤＮＡの調製］
下記表１に列記したビフィドバクテリウム属細菌をそれぞれＭＲＳ液体培地（０．５％のＬ−システイン塩酸塩一水和物を添加した）中において３７℃で嫌気的に培養した。培養後の菌液１ｍＬを７，５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去した。こうして得られた菌体沈殿物から、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて付属のプロトコールに従いＤＮＡを抽出した。
[Preparation of chromosomal DNA of test bacteria]
The Bifidobacterium species listed in Table 1 below were cultured anaerobically at 37 ° C. in MRS liquid medium (with 0.5% L-cysteine hydrochloride monohydrate added). 1 mL of the cultured bacterial solution was centrifuged at 7,500 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed. From the thus obtained bacterial cell precipitate, DNA was extracted using DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN) according to the attached protocol.
［ＰＣＲによる被検細菌の検出］
下記表２に記載の組成のＰＣＲ反応液を調製し、Ｖｅｒｉｔｉ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）において上記フォワードプライマー及びリバースプライマーを用いてＰＣＲを行った。
[Detection of test bacteria by PCR]
A PCR reaction solution having the composition shown in Table 2 below was prepared, and PCR was performed using Verti Thermal Cycler (Thermo Fisher SCIENTIFIC) using the forward primer and the reverse primer.
上記ＰＣＲで用いたフォワードプライマー及びリバースプライマーの組み合わせは、下記表３に示されるとおりであった。 The combinations of forward primer and reverse primer used in the PCR were as shown in Table 3 below.
プライマー１及びプライマー２を用いた実施例１のＰＣＲの反応条件は、９５℃３分間加温後、変性９５℃３０秒、アニーリング６０℃３０秒、及び伸長反応７２℃３０秒の条件で３５サイクル、最後に７２℃で１０分間加熱であった。プライマー３及びプライマー４を用いた比較例１のＰＣＲの反応条件は、９５℃３分間加温後、変性９５℃３０秒、アニーリング５５℃３０秒、及び伸長反応７２℃３０秒の条件で３５サイクル、最後に７２℃で１０分間加熱であった。 The PCR reaction conditions of Example 1 using Primer 1 and Primer 2 were 35 cycles under the conditions of 95 ° C. for 3 minutes, denaturation at 95 ° C. for 30 seconds, annealing at 60 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 72 ° C. for 30 seconds. And finally heating at 72 ° C. for 10 minutes. The PCR reaction conditions of Comparative Example 1 using Primer 3 and Primer 4 were 35 cycles under the conditions of 95 ° C. for 3 minutes, denaturation 95 ° C. for 30 seconds, annealing 55 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 72 ° C. for 30 seconds. And finally heating at 72 ° C. for 10 minutes.
上記ＰＣＲ後、ＱＩＡｘｃｅｌ Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＰＣＲ後の反応液の電気泳動を行った。増幅産物の検出はデータ解析ソフトであるＢｉｏＣａｌｃｕｌａｔｏｒを用いてＤＮＡマーカー（ＱＸ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｍａｒｋｅｒ １５ｂｐ／５ｋｂ（ＱＩＡＧＥＮ））を指標として検出した。比較例１のプライマーを用いたＰＣＲの結果を下記表４に、実施例１のプライマーを用いたＰＣＲの結果を下記表５に示す。表４及５中、「＋」は増幅産物が０．１ＲＦＵ以上の蛍光強度で検出されたことを、「−」は増幅産物が０．１ＲＦＵ以上の蛍光強度で検出されなかったことを示す。なお、「ＲＦＵ」は、ＢｉｏＣａｌｃｕｌａｔｏｒにより補正された蛍光強度の単位を表す。 After the PCR, the reaction solution after PCR was electrophoresed using a QIAxcel System (QIAGEN). The amplification product was detected using a data analysis software BioCalculator with a DNA marker (QX Alignment Marker 15 bp / 5 kb (QIAGEN)) as an index. The results of PCR using the primers of Comparative Example 1 are shown in Table 4 below, and the results of PCR using the primers of Example 1 are shown in Table 5 below. In Tables 4 and 5, “+” indicates that the amplification product was detected with a fluorescence intensity of 0.1 RFU or more, and “−” indicates that the amplification product was not detected with a fluorescence intensity of 0.1 RFU or more. “RFU” represents a unit of fluorescence intensity corrected by the BioCalculator.
表４に示されるとおり、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌において増幅産物が得られた。すなわち、比較例１のプライマーを用いたＰＣＲでは、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）を特異的に検出できなかった。 As shown in Table 4, amplification products were obtained in bacteria belonging to Bifidobacterium breve other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175). That is, in the PCR using the primer of Comparative Example 1, Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) could not be specifically detected.
なお、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌のうち、本出願人が保有する３１種類についても、比較例１のプライマーを用いた上記ＰＣＲを行った。その結果、これら３１種類の細菌を用いたいずれの場合においても、増幅産物が検出された。 Of the bacteria belonging to Bifidobacterium breve other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175), the above PCR using the primers of Comparative Example 1 was also applied to 31 types of bacteria possessed by the present applicant. Went. As a result, amplification products were detected in all cases using these 31 types of bacteria.
表５に示される通り、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）においてのみ増幅産物が得られた。増幅産物の長さは１３８ｂｐであった。この結果から、プライマー１及びプライマー２を用いることで、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム属細菌との交差反応無く、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）が特異的に検出されることが確認された。また、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌との交差反応無く、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）が特異的に検出されることも確認された。 As shown in Table 5, amplification products were obtained only in Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175). The length of the amplified product was 138 bp. From this result, Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM) without using cross-reaction with Bifidobacterium genus other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) by using primer 1 and primer 2. It was confirmed that BP-11175) was specifically detected. Further, Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) is specifically detected without cross-reaction with bacteria belonging to Bifidobacterium breve other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175). It was also confirmed that
なお、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌のうち、本出願人が保有する３１種類についても、実施例１のプライマーを用いた上記ＰＣＲを行った。その結果、これら３１種類の細菌を用いたいずれの場合においても、増幅産物が検出されなかった。この結果からも、プライマー１及びプライマー２を用いることで、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）以外のビフィドバクテリウム・ブレーベに属する細菌との交差反応無く、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）が特異的に検出されることが確認された。 Of the bacteria belonging to Bifidobacterium breve other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175), the above PCR using the primer of Example 1 was also applied to 31 types of bacteria possessed by the present applicant. Went. As a result, no amplification product was detected in any of these 31 types of bacteria. Also from this result, by using the primer 1 and the primer 2, there is no cross reaction with bacteria belonging to Bifidobacterium breve other than Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175), It was confirmed that Breve MCC1274 (FERM BP-11175) was specifically detected.
本技術により、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）の特異的な検出が可能になる。よって、本技術は、この細菌のより確実な有効性評価に利用でき、例えば腸への到達状況や腸内での生存状況の評価に利用できる。また、本技術は、ビフィドバクテリウム・ブレーベＭＣＣ１２７４（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１１７５）又は当該菌を含む飲食品を工業的に製造する場合に菌数の測定や発酵状態の管理にも利用できる。 This technique enables specific detection of Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175). Therefore, the present technology can be used for more reliable evaluation of the effectiveness of this bacterium, and for example, can be used for evaluation of the state of arrival in the intestine and the state of survival in the intestine. In addition, the present technology can also be used for measuring the number of bacteria and managing the fermentation state when industrially producing Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) or a food or drink containing the bacteria.
Claims (11)
Using the oligonucleotide pair that is a combination of the oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2, the sample is subjected to a process for nucleic acid amplification, Quantifying the amount of nucleic acid derived from Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) or Bifidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175) based on the Ct value of the treated sample. Quantitative method of Fidobacterium breve MCC1274 (FERM BP-11175).
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