JP2017215210A - Enzyme electrode with gluconate oxidation catalytic ability, fabrication method of enzyme electrode, bio battery, and bio sensor - Google Patents

Enzyme electrode with gluconate oxidation catalytic ability, fabrication method of enzyme electrode, bio battery, and bio sensor Download PDF

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an enzyme electrode having an oxidation catalytic ability of gluconic acid suitable for use as an anode electrode of a bio battery or a working electrode of bio sensor, and a fabrication method of the enzyme electrode; further to provide a bio battery and a bio sensor using the enzyme electrode which has an oxidation catalytic ability of gluconic acid.SOLUTION: There is provided an enzyme electrode with gluconate oxidation catalytic ability 1 in which a gluconate dehydratase from sulfolobus bacterium 11 is fixed to an electrode material 10, and a fabrication method of the enzyme electrode 1, a bio battery, and a bio sensor A using the enzyme electrode 1.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明は、グルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極、及び当該酵素電極の作製方法に関し、更に、当該酵素電極を利用したバイオ電池及びバイオセンサーに関する。   The present invention relates to an enzyme electrode having gluconic acid oxidation catalytic ability, a method for producing the enzyme electrode, and further relates to a biobattery and a biosensor using the enzyme electrode.

酵素は、生体内の化学反応（代謝）を進行させる生体触媒であり、アミノ酸の鎖からなるタンパク質を基本構造とする。酵素の特性としては、（１）常温、常圧付近の温和な条件で触媒作用を示す、（２）特定の基質にのみ作用する基質特異性と特定の化学反応に対して触媒作用を示し、副反応を起こさない反応特異性とを併せ持つ、ことが挙げられる。電極表面にある種の酵素を固定すると、酵素の触媒作用によって電極上で特定の反応のみが選択的に進行し、かかる反応による物質の変化を電極により電気信号に変換することができる。このような電極は酵素電極と呼ばれており、バイオ電池やバイオセンサーの電極等に利用されている。   An enzyme is a biocatalyst that promotes a chemical reaction (metabolism) in a living body, and has a protein composed of an amino acid chain as a basic structure. The characteristics of the enzyme are as follows: (1) Catalytic action under mild conditions near room temperature and normal pressure, (2) Catalytic action on substrate specificity and specific chemical reaction acting only on specific substrates, It has a reaction specificity that does not cause a side reaction. When a certain enzyme is immobilized on the electrode surface, only a specific reaction proceeds selectively on the electrode by the catalytic action of the enzyme, and a change in the substance due to the reaction can be converted into an electric signal by the electrode. Such an electrode is called an enzyme electrode, and is used for an electrode of a bio battery or a biosensor.

バイオ電池は、生体内のエネルギー変換系を応用した燃料電池であり、電極触媒として生体触媒を用いて、生体触媒による酸化還元反応と電極反応を共役させて電気エネルギーを取り出す発電装置である。バイオプロセスを利用するバイオ電池は、緩和な条件かつ高い選択性を有し、燃料として糖やアルコール等の環境中に存在する多様な物質を利用できるという利点を有する。そのため、安全で環境負荷が小さいことから、携帯型機器や体内埋込型機器等の小型電子機器等の次世代電源としての更なる発展が期待されている。一方、バイオセンサーは、酵素等の生体内分子の優れた分子識別能力を利用して、物質を検出及び検量する装置である。   A biobattery is a fuel cell that applies an in vivo energy conversion system, and is a power generation device that uses a biocatalyst as an electrode catalyst and extracts electrical energy by conjugating a redox reaction by the biocatalyst and an electrode reaction. A biobattery using a bioprocess has advantages that it has mild conditions and high selectivity, and can use various substances existing in the environment such as sugar and alcohol as fuel. Therefore, since it is safe and has a low environmental load, further development as a next-generation power source for small electronic devices such as portable devices and implantable devices is expected. On the other hand, a biosensor is a device that detects and calibrates a substance by utilizing the excellent molecular discrimination ability of in vivo molecules such as enzymes.

酵素の触媒機能を利用したバイオ電池及びバイオセンサーの実用化に当たっては、酵素の選択、及び電極上でかかる酵素がその触媒機能を最大限に発揮し得る状態で存在することが成否を左右する。バイオ電池としては、特に、自然界に多く存在し、エネルギー変換効率も高いグルコースを燃料とするバイオ電池の構築が実用性の高い技術として注目されている。グルコースを二酸化炭素と水にまで分解する完全酸化系の構築により、グルコースから最大限のエネルギーを取り出すことができる。しかしながら、人工的な完全酸化系の構築には、各段階における酵素反応により基質（燃料）から効率的にエネルギーを取り出せること、及び、前段の酵素反応によって生成した生成物が後段の酵素反応の基質となるように複数の酵素を適切に組み合わせること等が必要となる。   In the practical application of a biobattery and a biosensor using the catalytic function of an enzyme, the success or failure of the selection of the enzyme and the presence of the enzyme on the electrode in a state where the catalytic function can be maximized are determined. As a bio battery, in particular, construction of a bio battery using glucose as a fuel, which exists in nature and has high energy conversion efficiency, has attracted attention as a highly practical technology. By constructing a complete oxidation system that decomposes glucose into carbon dioxide and water, maximum energy can be extracted from glucose. However, for the construction of an artificial complete oxidation system, energy can be efficiently extracted from the substrate (fuel) by the enzyme reaction in each stage, and the product generated by the previous enzyme reaction is the substrate for the subsequent enzyme reaction. It is necessary to appropriately combine a plurality of enzymes so that

例えば、非特許文献１には、グルコースの完全酸化系の第１段階目の酵素として利用できるグルコース脱水素酵素を電極触媒とする酵素電極の性能向上に関して報告されている。当該酵素電極は、過ヨウ素酸ナトリウムでの化学的処理により脱糖鎖化されたフラビンアデニンヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素（以下、「FAD-GDH」と略する）を多孔性カーボン電極材に固定化したバイオアノード（負極）用酵素電極であり、脱糖鎖化されていないFAD-GDHを固定化した酵素電極に比べて、グルコース酸化における電流密度が5倍（100 mA/cm2）と優れた電極性能を有することが確認されている（非特許文献１を参照）。 For example, Non-Patent Document 1 reports on an improvement in the performance of an enzyme electrode using glucose dehydrogenase, which can be used as the first stage enzyme of the complete glucose oxidation system, as an electrode catalyst. The enzyme electrode is fixed to a porous carbon electrode material with flavin adenine nucleotide-dependent glucose dehydrogenase (hereinafter abbreviated as “FAD-GDH”) deglycosylated by chemical treatment with sodium periodate. Compared to the enzyme electrode for bioanode (negative electrode), which is immobilized FAD-GDH that is not deglycosylated, the current density in glucose oxidation is 5 times higher (100 mA / cm 2 ). (See Non-Patent Document 1).

非特許文献２には、グルコース脱水素酵素によるグルコースの分解産物であるグルコン酸を酸化分解できる酸化触媒能を有する酵素電極が報告されている。当該酵素電極は、酢酸菌の一種であるグルコノバクター属細菌由来のカスケード（グルコース脱水素酵素及びグルコン酸-2-デヒドロゲナーゼ）により、グルコースをグルクロン酸に分解する。また、非特許文献２には、グルコース完全酸化触媒能を有する酵素電極についての報告もある。酢酸菌や大麦由来の酵素等を電極触媒とすることでグルコース完全酸化系を実現可能な酵素電極が構築できたことが報告されている。   Non-Patent Document 2 reports an enzyme electrode having an oxidation catalytic ability capable of oxidizing and decomposing gluconic acid, which is a degradation product of glucose by glucose dehydrogenase. The enzyme electrode decomposes glucose into glucuronic acid by a cascade (glucose dehydrogenase and gluconate-2-dehydrogenase) derived from Gluconobacter bacteria which are a kind of acetic acid bacteria. Non-Patent Document 2 also reports on an enzyme electrode having a glucose complete oxidation catalytic ability. It has been reported that an enzyme electrode capable of realizing a complete glucose oxidation system has been constructed by using an acetic acid bacterium, an enzyme derived from barley, or the like as an electrode catalyst.

Tsujimura S 他著、“Exceptionally high glucose current on a hierarchically structured porous carbon electrode with "wired" flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase.”、J Am Chem Soc. 、2014年、第136巻、第41号、第14432-14437頁（インターネット〈URL:http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja5053736〉）Tsujimura S et al., “Exceptionally high glucose current on a hierarchically structured porous carbon electrode with“ wired ”flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase.”, J Am Chem Soc., 2014, Vol. 136, No. 41, No. 14432 -14437 pages (Internet <URL: http: //pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja5053736>) Shuai Xu 及び Shelley D. Minteer著、“Enzymatic Biofuel Cell for Oxidation of Glucose to CO2.”、ACS Catal., 2012年、第２巻、第1号、第91-94頁Shuai Xu and Shelley D. Minteer, “Enzymatic Biofuel Cell for Oxidation of Glucose to CO2.”, ACS Catal., 2012, Vol. 2, No. 1, pp. 91-94

しかしながら、非特許文献１の酵素電極に利用されている酵素は、池田糖化工業（株）から入手した未市販品のアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のFAD-GDHである。したがって、非特許文献１の技術は、糖鎖の種類及び物性から特殊な酵素についての一例にすぎないと考えられ、糖鎖付加酵素の全般に適用することは困難であると予想される。また、脱糖鎖化処理のために使用される過ヨウ素酸ナトリウムは強酸化力を有する無機塩である。そのため、脱糖鎖化だけでなく、酵素の活性部位における立体構造に影響を与え、酵素を劣化させることが容易に推定できる。   However, the enzyme used for the enzyme electrode of Non-Patent Document 1 is FAD-GDH derived from Aspergillus terreus, which is an uncommercial product obtained from Ikeda Saccharification Co., Ltd. Therefore, it is considered that the technique of Non-Patent Document 1 is only an example of a special enzyme because of the type and physical properties of the sugar chain, and it is expected that it is difficult to apply it to all glycosylation enzymes. Moreover, sodium periodate used for the deglycosylation treatment is an inorganic salt having strong oxidizing power. Therefore, it can be easily estimated that not only deglycosylation but also the steric structure in the active site of the enzyme is affected and the enzyme is deteriorated.

非特許文献２で報告されているグルコース完全酸化系は、人工的な糖代謝反応系に関する仮想の情報に過ぎない。例えば、当該グルコース完全酸化系を構成する大麦由来のシュウ酸酸化酵素による反応について検証実験を行ったところ、非特許文献２で報告されている反応を確認することができなかった。したがって、非特許文献２で開示されている知見に従って酵素を選抜しても、同じグルコース完全酸化の触媒能を有する酵素電極を構築することは困難であり、また現実的ではないと考えられる。   The glucose complete oxidation system reported in Non-Patent Document 2 is only virtual information regarding an artificial sugar metabolism reaction system. For example, when a verification experiment was conducted on a reaction by oxalate oxidase derived from barley constituting the glucose complete oxidation system, the reaction reported in Non-Patent Document 2 could not be confirmed. Therefore, even if an enzyme is selected according to the knowledge disclosed in Non-Patent Document 2, it is difficult to construct an enzyme electrode having the same catalytic ability for complete glucose oxidation, and it is not practical.

また、バイオ電池やバイオセンサーの酵素電極は、電極材に固定化する酵素として組換えタンパク質の可溶性の問題等から糖鎖付加酵素を選択する必要がある場合がある。例えば、スルホロバス属細菌由来のグルコン酸脱水酵素は、糖鎖修飾能を持たない宿主で培養した場合には、組換え酵素は不溶性の封入体を形成し本来の生理活性を十分に発揮できない。しかしながら、糖鎖付加酵素をそのままの状態で電極材に固定化すると、糖鎖が絶縁体となり、燃料→酵素→（メディエータ）→電極への電子伝達効率が著しく低下し、酵素触媒電流は数ミリアンペア以下と小さなものになる等の問題が知られていた。   In addition, in the case of an enzyme electrode for a bio battery or a biosensor, it may be necessary to select a glycosylated enzyme as an enzyme to be immobilized on an electrode material because of the problem of the solubility of the recombinant protein. For example, when a gluconate dehydrase derived from a bacterium belonging to the genus Sulfolobus is cultured in a host that does not have the ability to modify sugar chains, the recombinant enzyme forms an insoluble inclusion body and cannot fully exhibit its original physiological activity. However, if the glycosylation enzyme is immobilized as it is on the electrode material, the sugar chain becomes an insulator, and the efficiency of electron transfer from the fuel → enzyme → (mediator) → electrode is significantly reduced, and the enzyme catalytic current is several milliamperes. There were known problems such as the following and becoming small.

そこで、本発明は、バイオ電池の負極側電極やバイオセンサーの作用電極での使用に適した、グルコン酸の酸化触媒能を有する酵素電極、及び当該酵素電極の作製方法を提供することを目的とする。更に、グルコン酸の酸化触媒能を有する酵素電極を利用したバイオ電池及びバイオセンサーの提供を目的とする。   Therefore, the present invention aims to provide an enzyme electrode having an oxidation catalytic ability of gluconic acid suitable for use in a negative electrode of a bio battery or a working electrode of a biosensor, and a method for producing the enzyme electrode. To do. Furthermore, it aims at provision of the bio battery and biosensor using the enzyme electrode which has the oxidation catalyst ability of gluconic acid.

本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、スルホロバス属細菌由来のグルコン酸脱水酵素を、大腸菌のタンパク質発現系を用いて糖鎖が付加しない状態で組換え発現させ、組換えグルコン酸脱水酵素を含む発現菌体の溶菌液の濃縮液を電極材に固定化することにより、グルコン酸酸化触媒能を十分に発揮することができる酵素電極を作製できるとの知見を得た。更に、当該酵素電極がバイオ電池の負極側電極やバイオセンサーの作用電極として機能し得ることを見出した。これらの知見に基づいて、本発明を完成した。   As a result of repeated studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors recombinantly expressed gluconate dehydrase derived from a sulfolobas bacterium using a protein expression system of Escherichia coli without adding a sugar chain. We obtained knowledge that an enzyme electrode capable of fully exhibiting the ability to catalyze gluconic acid oxidation can be produced by immobilizing a concentrated solution of the lysate containing expressed gluconate dehydrase on the electrode material. . Furthermore, the present inventors have found that the enzyme electrode can function as a negative electrode for a biobattery and a working electrode for a biosensor. Based on these findings, the present invention has been completed.

すなわち、上記課題を解決するため、以下の〔１〕〜〔７〕に示す発明を提供する。   That is, in order to solve the above-described problems, the following inventions [1] to [7] are provided.

〔１〕スルホロバス属細菌由来のグルコン酸脱水酵素を電極材に固定したグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極。 [1] An enzyme electrode having a gluconic acid oxidation catalytic ability, wherein a gluconic acid dehydrating enzyme derived from a sulfolobas bacterium is immobilized on an electrode material.

上記〔１〕の構成によれば、グルコン酸酸化触媒能を十分に発揮することができる酵素電極を提供することができる。従来において、例えばスルホロバス属細菌由来のグルコン酸脱水酵素を、大腸菌等の糖鎖修飾経路を有しないタンパク質合成系を使用して、糖鎖が付加しない状態で合成することは、封入体が形成する等の問題があり困難であった。一方、糖鎖修飾経路を有するタンパク質合成系を使用して合成する場合、糖鎖が付加することで、酵素分子の疎水面同士の会合が低減され可溶性の酵素として合成され、結果的に、酵素の合成効率が向上する。しかしながら、付加する糖鎖の種類や、付加する状態によっても合成酵素の物性は影響を受けることから、糖鎖が付与した酵素の扱いは、産業利用の上でも大きな障害になることが多い。また、糖鎖付加酵素をそのままの状態で電極材に固定化すると、糖鎖が絶縁体となり、燃料→酵素→（メディエータ）→電極への電子伝達効率が著しく低下し、酵素触媒電流は数ミリアンペア以下と小さなものになる等の問題もある。そのため、従来においては、グルコン酸脱水酵素を利用したグルコン酸酸化の触媒機能を有する酵素電極を作製することは困難であった。上記構成により、初めてグルコン酸脱水酵素を利用したグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極を提供することが可能となる。   According to the configuration of the above [1], an enzyme electrode that can sufficiently exhibit the gluconic acid oxidation catalytic ability can be provided. Conventionally, for example, synthesis of gluconic anhydrase derived from a sulfolobas bacterium using a protein synthesis system that does not have a sugar chain modification pathway such as Escherichia coli without adding a sugar chain forms an inclusion body. It was difficult due to problems such as On the other hand, when synthesizing using a protein synthesis system having a sugar chain modification pathway, the addition of a sugar chain reduces the association between the hydrophobic surfaces of the enzyme molecule and synthesizes it as a soluble enzyme. The synthesis efficiency of is improved. However, since the physical properties of the synthetic enzyme are also affected by the type of sugar chain to be added and the state of addition, the handling of the enzyme provided with the sugar chain often becomes a major obstacle in industrial use. Also, if the glycosylation enzyme is immobilized as it is on the electrode material, the sugar chain becomes an insulator, and the efficiency of electron transfer from the fuel → enzyme → (mediator) → electrode is significantly reduced, and the enzyme catalyst current is several milliamperes. There are also problems such as the following becoming small. Therefore, conventionally, it has been difficult to produce an enzyme electrode having a catalytic function of gluconate oxidation using gluconate dehydrase. By the said structure, it becomes possible to provide the enzyme electrode which has gluconic acid oxidation catalytic ability using the gluconic acid dehydrase for the first time.

上記構成により提供される酵素電極は、バイオ電池の負極側電極、及びバイオセンサーの作用電極として利用することができ、電子、医療、食品、環境分野等の産業分野において利用可能である。   The enzyme electrode provided by the above configuration can be used as a negative electrode for a biobattery and a working electrode for a biosensor, and can be used in industrial fields such as electronics, medicine, food, and the environment.

〔２〕前記電極材が、平均直径が30〜40nmの細孔を備える多孔質構造を有する炭素基材を含む。 [2] The electrode material includes a carbon substrate having a porous structure with pores having an average diameter of 30 to 40 nm.

上記〔２〕の構成によれば、グルコン酸酸化触媒能を更に効率よく発揮することができる酵素電極を提供することができる。電極材を、多孔質構造を有する炭素基材とすることで、酵素の電極材への固定化時に酵素分子が炭素基材の細孔内に入り込むことで言わば酵素の精製効果が得られ、また、酵素分子同士の会合が抑制される。これにより、凝集しやすい酵素種であっても酵素電極化を実現でき、グルコン酸酸化の触媒機能を効率よく発揮することができる酵素電極を提供できる。   According to the configuration of [2] above, it is possible to provide an enzyme electrode that can exhibit the gluconic acid oxidation catalytic ability more efficiently. By making the electrode material a carbon base material having a porous structure, an enzyme purification effect can be obtained because enzyme molecules enter the pores of the carbon base material when the enzyme is immobilized on the electrode material. , The association between enzyme molecules is suppressed. Thereby, even an enzyme species that easily aggregates can be realized as an enzyme electrode, and an enzyme electrode that can efficiently exhibit a catalytic function of gluconic acid oxidation can be provided.

〔３〕スルホロバス属細菌由来のグルコン酸脱水酵素を電極材に固定したグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極の作製方法であって、
（i）糖鎖修飾能を有しない細菌をスルホロバス属細菌由来のグルコース脱水酵素をコードする遺伝子で形質転換し、組換えグルコン酸脱水酵素を発現した発現菌体を調製する工程、
（ii）前記発現菌体を界面活性剤と接触させる工程、
（iii）前記界面活性剤処理後の発現菌体を破砕して、発現菌体破砕液を調製する工程、
（iv）前記発現菌体破砕液中の菌体残渣を分離除去して、発現菌体の溶菌液を調製する工程、
（v）前記発現菌体の溶菌液を濃縮し、発現菌体の溶菌液の濃縮液を調製する工程、
（vi）前記発現菌体の溶菌液の濃縮液を前記電極材に固定化する工程、を備えるグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極の作製方法。 [3] A method for producing an enzyme electrode having gluconic acid oxidation catalytic ability, wherein a gluconic acid dehydrating enzyme derived from a bacterium belonging to the genus Sulfolobus is immobilized on an electrode material,
(I) a step of transforming a bacterium having no sugar chain-modifying ability with a gene encoding glucose dehydrase derived from a bacterium belonging to the genus Sulfolobus, and preparing an expression cell expressing recombinant gluconate dehydrase;
(Ii) a step of bringing the expressed cells into contact with a surfactant;
(Iii) a step of crushing the expressed bacterial cells after the surfactant treatment to prepare an expressed bacterial cell disruption solution,
(Iv) a step of separating and removing the bacterial cell residue in the expressed bacterial cell disruption solution to prepare a lysate of the expressed bacterial cell;
(V) a step of concentrating the lysate of the expressed cells to prepare a concentrated solution of the lysate of the expressed cells,
(Vi) A method for producing an enzyme electrode having a gluconic acid oxidation catalytic ability, comprising a step of immobilizing a concentrated solution of the lysate of the expressed cells on the electrode material.

上記〔３〕の構成によれば、グルコン酸酸化触媒能を十分に発揮することができる酵素電極の作製方法を提供することができる。従来において、糖鎖が付加しない状態及び糖鎖が付加した状態の何れにもおいても、スルホロバス属細菌由来のグルコン酸脱水酵素のグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極を作製することは困難であった。これに対して、上記構成によれば、スルホロバス属細菌由来のグルコン酸脱水酵素を、大腸菌のタンパク質発現系を用いて糖鎖が付加しない状態で組換え発現させ、組換えグルコン酸脱水酵素を含む発現菌体の溶菌液の濃縮液を電極材に固定化することにより、グルコン酸酸化触媒能を十分に発揮することができる酵素電極を提供できる。上記の構成により作製される酵素電極は、バイオ電池の負極側電極、及びバイオセンサーの作用電極として利用することができ、電子、医療、食品、環境分野等の産業分野において利用可能である。   According to the configuration of [3] above, it is possible to provide a method for producing an enzyme electrode that can sufficiently exhibit the gluconic acid oxidation catalytic ability. Conventionally, it is difficult to produce an enzyme electrode having a gluconic acid oxidation catalytic ability of a gluconic acid dehydrating enzyme derived from a bacterium belonging to the genus Sulfolobus, in either a state where a sugar chain is not added or a state where a sugar chain is added. there were. On the other hand, according to the above configuration, the gluconate dehydrase derived from the bacterium of the genus Sulfolobus is recombinantly expressed in a state in which no sugar chain is added using the E. coli protein expression system, and includes the recombinant gluconate dehydrase. By immobilizing the concentrated solution of the lysate of the bacterial cells on the electrode material, an enzyme electrode that can sufficiently exhibit the gluconic acid oxidation catalytic ability can be provided. The enzyme electrode produced by the above configuration can be used as a negative electrode for a biobattery and a working electrode for a biosensor, and can be used in industrial fields such as electronics, medicine, food, and the environment.

〔４〕前記電極材が、平均直径が30〜40nmの細孔を備える多孔質構造を有する炭素基材を含む。 [4] The electrode material includes a carbon base material having a porous structure with pores having an average diameter of 30 to 40 nm.

上記〔４〕の構成によれば、グルコン酸酸化触媒能を更に効率よく発揮することができる酵素電極の作製方法を提供することができる。電極材を、多孔質構造を有する炭素基材とすることで、発現菌体の溶菌液の濃縮液を電極材に固定化する際に、酵素分子が炭素基材の細孔内に入り込むことで言わば酵素の精製効果が得られ、更に、酵素分子同士の会合が抑制される。これにより、凝集しやすい酵素種であっても酵素電極化を実現でき、グルコン酸酸化の触媒機能を効率よく発揮することができる酵素電極を提供することができる。   According to the configuration of [4] above, it is possible to provide a method for producing an enzyme electrode that can exhibit the gluconic acid oxidation catalytic ability more efficiently. By making the electrode material a carbon base material having a porous structure, enzyme molecules enter the pores of the carbon base material when the lysate concentrate of the expressed cells is immobilized on the electrode material. In other words, an enzyme purification effect is obtained, and further, association between enzyme molecules is suppressed. Thereby, even if it is an enzyme kind which is easy to aggregate, an enzyme electrode can be implement | achieved and the enzyme electrode which can exhibit the catalytic function of gluconic acid oxidation efficiently can be provided.

〔５〕前記多孔質構造を有する炭素基材を、炭素前駆体と酸化マグネシウム前駆体との混合物を焼成し、得られた焼成物から酸化マグネシウムを除去することによって調製する工程、を有する。 [5] A step of preparing the carbon substrate having the porous structure by firing a mixture of a carbon precursor and a magnesium oxide precursor and removing magnesium oxide from the obtained fired product.

上記〔５〕の構成によれば、酸化マグネシウム粒子を鋳型として作製した多孔質の炭素基材を電極材として用いることにより、多数の均一の大きさの細孔が規則正しく整列した炭素基材の細孔に、酵素や必要に応じて酵素と共に固定化されるメディエータを安定的かつ強固に固定することができ、酵素及びメディエータの当該電極材から脱離を抑制することができる。これにより、当該電極材の劣化を抑制し、酵素触媒電流の安定性を図ることができる。また、酵素と導電性基材間の電子の授受を円滑に進めることができることから、酵素触媒電流を向上させることができ、電極性能の向上を図ることができる。   According to the configuration of [5] above, by using a porous carbon base material prepared using magnesium oxide particles as a template as an electrode material, a fine carbon base material in which a large number of pores of uniform size are regularly aligned is used. It is possible to stably and firmly fix the enzyme and, if necessary, the mediator immobilized together with the enzyme in the pores, and the detachment of the enzyme and the mediator from the electrode material can be suppressed. Thereby, deterioration of the said electrode material can be suppressed and the stability of an enzyme catalyst electric current can be aimed at. In addition, since the transfer of electrons between the enzyme and the conductive base material can proceed smoothly, the enzyme catalyst current can be improved, and the electrode performance can be improved.

〔６〕グルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極、若しくは、グルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極の作製方法によって作製されたグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極を負極側電極として備えるバイオ電池。 [6] A biobattery provided with an enzyme electrode having a gluconic acid oxidation catalytic ability or an enzyme electrode having a gluconic acid oxidation catalytic ability produced by a method for producing an enzyme electrode having a gluconic acid oxidation catalytic ability as a negative electrode.

上記〔６〕の構成によれば、グルコン酸等を燃料としたバイオ電池を提供することができる。燃料としては、グルコン酸等のグルコン酸脱水酵素の基質なる物質を利用できる。更に、グルコースの多段階酸化系において、グルコン酸酸化の前段階の反応を触媒するグルコース脱水素酵素等のグルコースを酸化しグルコン酸を生成する酵素と組み合わせることにより、グルコース等を燃料として利用することができる。多段階酸化系の構築により、グルコース等の燃料から取り出せる電子数が増しバイオ電池の出力を向上させることができる。よって、医療、食品、環境等の分野において特に利用価値が高いバイオ電池を構築することができる。   According to the configuration of [6] above, it is possible to provide a bio battery using gluconic acid or the like as a fuel. As the fuel, a substance serving as a substrate for gluconic anhydrase such as gluconic acid can be used. Furthermore, in a multistage oxidation system of glucose, glucose or the like is used as fuel by combining glucose such as glucose dehydrogenase that catalyzes the reaction in the previous stage of gluconate oxidation with an enzyme that generates gluconic acid. Can do. By constructing a multi-stage oxidation system, the number of electrons that can be extracted from a fuel such as glucose can be increased and the output of the biocell can be improved. Therefore, it is possible to construct a biobattery that has a particularly high utility value in fields such as medicine, food, and the environment.

〔７〕グルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極、若しくは、グルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極の作製方法によって作製されたグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極を作用電極として備えるバイオセンサー。 [7] A biosensor comprising, as a working electrode, an enzyme electrode having a gluconic acid oxidation catalytic ability or an enzyme electrode having a gluconic acid oxidation catalytic ability produced by a method for producing an enzyme electrode having a gluconic acid oxidation catalytic ability.

上記〔７〕の構成によれば、試料中のグルコン酸等のグルコン酸脱水酵素の基質となる物質を検出するためのバイオセンサーを提供することができる。また、上記構成によるバイオセンサーの酵素電極がグルコース脱水素酵素等と共に多段階反応系を形成するものである場合には、グルコースの酸化還元反応においてグルコン酸脱水酵素の前段階のグルコース脱水素酵素の基質となる物質の検出に利用することもでき、例えば血糖値等のグルコースの検出に利用することができる。よって、医療、食品、環境等の分野において特に利用価値が高いバイオセンサーを構築することができる。   According to the configuration of [7] above, it is possible to provide a biosensor for detecting a substance that is a substrate for a gluconic anhydrase such as gluconic acid in a sample. In addition, when the enzyme electrode of the biosensor having the above structure forms a multistage reaction system together with glucose dehydrogenase, etc., the glucose dehydrogenase in the previous stage of gluconate dehydrase in the oxidation-reduction reaction of glucose It can also be used for detection of a substance serving as a substrate, for example, for detection of glucose such as blood glucose level. Therefore, it is possible to construct a biosensor that is particularly useful in fields such as medicine, food, and the environment.

本実施形態のバイオセンサーの一例を示す模式図。The schematic diagram which shows an example of the biosensor of this embodiment. グルコン酸酸化酵素の選択と合成確認を行った実施例１の結果を示す電気泳動図。The electrophoretic diagram which shows the result of Example 1 which performed selection and synthesis | combination confirmation of the gluconate oxidase. 多孔質電極材の検討を行った実施例２の結果を示すグラフ。The graph which shows the result of Example 2 which examined the porous electrode material. 多孔質電極材の検討を行った実施例２の結果を示すグラフ。The graph which shows the result of Example 2 which examined the porous electrode material. グルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極の電気化学性能の検証を行った実施例３の結果を示すグラフ。The graph which shows the result of Example 3 which verified the electrochemical performance of the enzyme electrode which has gluconic acid oxidation catalyst ability. グルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極の反応生成物解析を行った実施例４の結果を示すグラフ。The graph which shows the result of Example 4 which performed the reaction product analysis of the enzyme electrode which has gluconic acid oxidation catalyst ability.

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。しかしながら、本発明は当該実施形態に限定されるものではない。   Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the embodiment.

〔酵素電極〕
本発明の実施形態に係る酵素電極は、電極材にグルコン酸脱水酵素が固定されてある。前記グルコン酸脱水酵素は、好酸好熱性古細菌に属するスルホロバス（Sulfolobus）属細菌由来である。特に好ましくは、スルホロバス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）由来である。 [Enzyme electrode]
In the enzyme electrode according to the embodiment of the present invention, gluconic acid dehydrase is immobilized on an electrode material. The gluconate dehydrase is derived from a bacterium belonging to the genus Sulfolobus belonging to an acidophilic thermophilic archaea. Particularly preferred is from Sulfolobus solfataricus.

スルホロバス属細菌は、好酸好熱性古細菌に属する細菌である。スルホロバス属細菌のような古細菌では、グルコースの分解機構である解糖系においてエムデン−マイヤーホフ（Embden-Meyerhof）経路ではなく、エントナー−ドウドロフ（Entner-Doudoroff）経路とピロ解糖系（Pyroglycolysis）を利用する（参考文献１：解糖、代謝マップ、個別の反応／福岡大学理学部化学科（http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/glyclysis.htm）を参照）。ピロ解糖系では、グルコースは、グルコン酸を経て2-ケト-3-デオキシグルコン酸へと分解され、2-ケト-3-デオキシグルコン酸は、ピルビン酸又はグリセルアルデヒドに分解される。続いて、グリセルアルデヒドは、グリセリンを経て2-ホスホグリセリン酸、又はグリセロールに分解され、グリセロールはグリセロール 3-リン酸に分解されていく。   Sulfolobus bacteria belong to the acidophilic thermophilic archaea. In archaebacteria such as the genus Sulfolobus, the Entner-Doudoroff pathway and pyroglycolysis are not used in the glycolysis system, which is the mechanism of glucose degradation, but in the Emden-Meyerhof pathway. Use (Reference 1: Glycolysis, Metabolic Map, Individual Reactions / Faculty of Science, Fukuoka University (http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/glyclysis.htm)) ). In the pyroglycolytic system, glucose is decomposed into 2-keto-3-deoxygluconic acid via gluconic acid, and 2-keto-3-deoxygluconic acid is decomposed into pyruvic acid or glyceraldehyde. Subsequently, glyceraldehyde is decomposed into 2-phosphoglyceric acid or glycerol via glycerol, and glycerol is decomposed into glycerol 3-phosphate.

グルコン酸脱水酵素は、グルコン酸を2-ケト-3-デオキシグルコン酸へと分解する反応を触媒する酵素であり、特に好ましくは、スルホロバス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）P2株由来のD-グルコン酸脱水酵素（D-gluconate dehydratase、ACCESSION Number:Q97U27）である。かかる酵素をコードするDNAの配列情報を配列表の配列番号１に、推定アミノ酸配列情報を配列番号２に記載する。   Gluconic acid dehydrase is an enzyme that catalyzes a reaction of decomposing gluconic acid into 2-keto-3-deoxygluconic acid, and particularly preferably, D-glucone derived from Sulfolobus solfataricus P2 strain. It is an acid dehydrase (D-gluconate dehydratase, ACCESSION Number: Q97U27). The sequence information of DNA encoding such an enzyme is described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the deduced amino acid sequence information is described in SEQ ID NO: 2.

グルコン酸脱水酵素としては、グルコン酸脱水酵素の触媒機能を有する限り、配列番号１の示す塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるものや、配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも80％、好ましくは90％、特に好ましくは95％、又は98％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を有するもの、配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、数個（1〜9個）のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するものも好適に利用することができる。このような改変を有するグルコン酸脱水酵素は自然又は人工の突然変異により生じたものであってもよいし、上記配列番号１に示す塩基配列等の公知のスルホロバス属細菌由来のグルコン酸脱水酵素をコードする核酸分子に対して公知の方法で改変を施すことによっても取得できる。例えば、改変の基となるグルコン酸脱水酵素をコードする核酸分子に変異部位を挿入する方法としては、部位特異的突然変異誘発法、PCR法等を利用して変異を導入するPCR突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法等の公知の変異導入技術を利用することができる。また、市販の変異導入用キット（例えば、QuikChange（登録商標） Site-directed Mutagenesis Kit（Stratagene社製））を利用してもよい。   As long as the gluconate dehydrase has the catalytic function of gluconate dehydrase, one encoded by a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, or SEQ ID NO: 2 Of amino acids having at least 80%, preferably 90%, particularly preferably 95% or 98% amino acid sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, Those having an amino acid sequence in which 9 amino acid residues are substituted, deleted, and / or added can also be suitably used. The gluconic anhydrase having such a modification may be a natural or artificial mutation, or a known gluconic anhydrase derived from a sulfolobas bacterium such as the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It can also be obtained by modifying the nucleic acid molecule to be encoded by a known method. For example, as a method of inserting a mutation site into a nucleic acid molecule encoding a gluconate dehydrase as a modification group, site-directed mutagenesis, PCR abrupt induction in which mutation is introduced using PCR, Alternatively, known mutagenesis techniques such as transposon insertion mutagenesis can be used. A commercially available mutation introduction kit (for example, QuikChange (registered trademark) Site-directed Mutagenesis Kit (manufactured by Stratagene)) may be used.

スルホロバス属細菌由来のグルコン酸脱水酵素は、下記の実施例の実施例１でも示した通り、大腸菌等のタンパク質発現系で効率よく発現するが、酵素溶液の精製度が上がると不溶性となる。これは、大腸菌等の宿主において、異物である組換え発現したグルコン酸脱水酵素が、封入体と称される不溶性の凝集体を形成したことによるものと考えられる。封入体が形成されると、クロマトグラフィー等による精製が困難となり、また、本来の生理活性を十分に発揮できない等の問題が生じ、結果的に、グルコン酸脱水酵素の触媒機能を有する酵素電極を作製することは困難であった。   The gluconate dehydrase derived from the bacterium of the genus Sulfolobus is efficiently expressed in a protein expression system such as Escherichia coli as shown in Example 1 of the following Examples, but becomes insoluble when the purity of the enzyme solution increases. This is considered to be due to the fact that the recombinantly expressed gluconate dehydrase, which is a foreign substance, formed an insoluble aggregate called an inclusion body in a host such as Escherichia coli. When the inclusion body is formed, purification by chromatography or the like becomes difficult, and problems such as inability to fully exhibit the original physiological activity occur. As a result, an enzyme electrode having a catalytic function of gluconate dehydrase is produced. It was difficult to produce.

従来においては、タンパク質発現系において封入体が形成される場合には、可溶性発現系の構築を模索することになる。可溶性発現系の構築にあたって、例えば、真核生物を宿主として用いる等により、翻訳後修飾により糖鎖の付加がなされ、発現した組換えタンパク質分子の疎水面同士での会合が低減され可溶性タンパク質として合成することができる。糖鎖が付加した酵素を合成する場合、合成時の糖鎖の付加が合成効率に大きく影響することが知られており（参考文献２：Kataoka K他著、“High-level expression of Myrothecium verrucaria bilirubin oxidase in Pichia pastoris, and its facile purification and characterization.”Protein Expr Purif.、2005年、第41巻、第１号、第77-83頁 (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046592805000380)を参照）、上記した理由等により結果的に、タンパク質の合成効率が向上する。その一方で、タンパク質の合成効率や物性は、付加する糖鎖の種類や、付加する状態によっても影響を受け、当業者でも、試行錯誤を余儀なくされる。例えば、糖鎖の付加の状態を変更することで、タンパク質の物性が大きく変化することが報告され（参考文献３：パナソニック ヘルスケア株式会社、ニュース、2011年、 プレスリリース：「2011年度農芸化学技術賞」を共同受賞 （http://www.panasonic-healthcare.com/jp/news/2011/0506）を参照）、糖鎖が付加したタンパク質の扱いは、産業利用の上でも大きな障害になることが多いことが知られている。   Conventionally, when an inclusion body is formed in a protein expression system, the construction of a soluble expression system will be sought. In the construction of a soluble expression system, for example, by using a eukaryote as a host, a sugar chain is added by post-translational modification, and the association between the hydrophobic surfaces of the expressed recombinant protein molecule is reduced and synthesized as a soluble protein. can do. When synthesizing an enzyme with a sugar chain added, it is known that the addition of a sugar chain during the synthesis greatly affects the synthesis efficiency (Reference 2: Kataoka K et al., “High-level expression of Myrothecium verrucaria bilirubin oxidase in Pichia pastoris, and its facile purification and characterization. ”Protein Expr Purif., 2005, Vol. 41, No. 1, pp. 77-83 (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii / S1046592805000380)), and as a result, the protein synthesis efficiency is improved as a result. On the other hand, protein synthesis efficiency and physical properties are also affected by the type of sugar chain to be added and the state of addition, and even those skilled in the art are forced to make trial and error. For example, it has been reported that changing the state of sugar chain addition significantly changes the physical properties of proteins (Reference 3: Panasonic Healthcare Co., Ltd., News, 2011, Press Release: “Agricultural Chemistry Technology 2011 (See http://www.panasonic-healthcare.com/jp/news/2011/0506)) Handling of proteins with sugar chains can be a major obstacle to industrial use. It is known that there are many.

更に、グルコン酸脱水酵素を、真核生物等の糖鎖修飾能を有する生物を宿主として利用するタンパク質発現系において組換え発現させた場合、糖鎖が付与した状態の酵素をそのままの状態で電極に固定化すると、糖鎖が絶縁体となり、燃料→酵素→（メディエータ）→電極への電子伝達効率が著しく低下し、酵素触媒電流は数ミリアンペア以下と小さいものとなることが想定される。   Furthermore, when the gluconate dehydrase is recombinantly expressed in a protein expression system using a living organism having a sugar chain-modifying ability such as a eukaryote as a host, the enzyme with the sugar chain attached is used as it is. It is assumed that the sugar chain becomes an insulator, the efficiency of electron transfer from fuel → enzyme → (mediator) → electrode is remarkably lowered, and the enzyme catalyst current is as small as several milliamperes or less.

また、可溶性発現系の構築のために、従来において、適当な親水性ペプチド等のTagが目的タンパク質に融合してN末端またはC末端側に発現するような配列を有する適当なベクターを利用することも行われている。特に、親水性ペプチドのTagを大きくすることで封入体を形成せず、可溶性タンパク質として合成できる可能性があるが、上記した糖鎖と同様に酵素電極の電極触媒としての使用には適さない。   In order to construct a soluble expression system, conventionally, an appropriate vector having a sequence such that a tag such as an appropriate hydrophilic peptide is fused to the target protein and expressed at the N-terminal or C-terminal side should be used. Has also been done. In particular, it may be possible to synthesize a soluble protein without forming inclusion bodies by increasing the tag of the hydrophilic peptide, but it is not suitable for use as an electrode catalyst of an enzyme electrode as in the case of the sugar chain described above.

そこで、本実施形態の酵素電極においては、グルコン酸酸化能を保持させた酵素電極を構築するため、大腸菌等に代表される原核生物等の糖鎖修飾能を有しない生物を宿主として利用するタンパク質発現系で、糖鎖が付加しないタンパク質として酵素を合成し、当該酵素を含む発現菌体の溶菌液の濃縮液が電極材に固定化されている。なお、ここで、糖鎖修飾能を有さないとは、翻訳後修飾としての糖鎖修飾経路が完全欠如している場合のみならず、糖鎖修飾能が未熟である場合も含むものとする。   Therefore, in the enzyme electrode of this embodiment, in order to construct an enzyme electrode that retains the ability to oxidize gluconate, a protein that uses an organism that does not have sugar chain-modifying ability such as prokaryotes such as Escherichia coli as a host In the expression system, an enzyme is synthesized as a protein to which no sugar chain is added, and a concentrated solution of a lysate of an expression cell containing the enzyme is immobilized on an electrode material. Here, the phrase “having no sugar chain modification ability” includes not only the case where the sugar chain modification pathway as a post-translational modification is completely lacking but also the case where the sugar chain modification ability is immature.

グルコン酸脱水酵素を含む発現菌体の溶菌液の濃縮液は、（i）糖鎖修飾能を有しない細菌の菌体内での組換えグルコン酸脱水酵素の発現、（ii）発現菌体と界面活性剤との接触、（iii）界面活性剤処理後の発現菌体の破砕、（iv）発現菌体破砕液から発現菌体の溶菌液の分離、（v）前記発現菌体の溶菌液の濃縮、によって調製される   The concentrated solution of the lysate containing gluconate dehydrase contains (i) the expression of recombinant gluconate dehydrase in the bacterium without sugar chain modification, and (ii) the interface between the bacterium and the interface. Contact with an activator, (iii) disruption of the expressed cell after treatment with the surfactant, (iv) separation of the lysate of the expressed cell from the disrupted solution of the expressed cell, (v) lysis of the lysate of the expressed cell Prepared by concentration,

（ｉ）糖鎖修飾能を有しない細菌の菌体内での組換えグルコン酸脱水酵素の発現
大腸菌等に代表される原核生物等の糖鎖修飾能を有しない細菌を宿主として利用するタンパク質発現系での組換えグルコン酸脱水酵素を発現させる。 (I) Expression of recombinant gluconate dehydrase in bacteria having no sugar chain-modifying ability Protein expression system using bacteria having no sugar chain-modifying ability such as prokaryotes such as Escherichia coli as a host To express recombinant gluconate dehydrase in

具体的には、グルコン酸脱水酵素をコードする核酸分子を適当な発現ベクター中に挿入し、これを、宿主に導入することによって形質転換体を作製する。利用可能なベクターとしては、外来DNAを組み込め、かつ宿主細胞中で自律的に複製可能なものであれば特に制限はない。そして、ベクターは、外来遺伝子がその機能を発現できるように組み込まれ、機能発現に必要な他の既知の塩基配列が含まれていてもよい。例えば、プロモータ配列、リーダー配列、シグナル配列、並びにリボソーム結合配列等が挙げられる。更に、宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等をも含ませることができる。   Specifically, a transformant is prepared by inserting a nucleic acid molecule encoding gluconate dehydrase into an appropriate expression vector and introducing it into a host. The vector that can be used is not particularly limited as long as it can incorporate foreign DNA and can replicate autonomously in a host cell. The vector may be incorporated so that the foreign gene can express its function, and may contain other known base sequences necessary for function expression. For example, a promoter sequence, a leader sequence, a signal sequence, a ribosome binding sequence and the like can be mentioned. Furthermore, a marking sequence or the like that can confer phenotypic selection in the host can also be included.

グルコン酸脱水酵素をコードする核酸分子は、配列情報が開示されていることから、当該配列情報に基づいて当該技術分野で公知の方法により取得することができる。   Since nucleic acid molecules encoding gluconate dehydrase have disclosed sequence information, they can be obtained by methods known in the art based on the sequence information.

ベクターへの外来遺伝子の挿入は、例えば、適当な制限酵素で所望のグルコン酸脱水酵素をコードする核酸分子を切断し、適当なベクターの制限酵素部位、又はマルチクローニング部位に挿入して連結する方法等を用いることができるが、これに限定されない。   The insertion of a foreign gene into a vector is, for example, a method in which a nucleic acid molecule encoding a desired gluconate dehydrase is cleaved with an appropriate restriction enzyme and inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of an appropriate vector for ligation However, the present invention is not limited to this.

形質転換体の作製に際して宿主となる細胞としては、糖鎖修飾能有しない生物であって、外来遺伝子を効率的に発現できるものであれば、特に制限はない。原核生物細胞を好適に利用でき、特には大腸菌を利用することができる。その他、枯草菌、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。形質転換法としては、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソームフェクション法、マイクロインジェクション法等を既知の方法を利用することができる。   There are no particular limitations on the cells that serve as hosts for the production of transformants, as long as they are organisms that do not have the ability to modify sugar chains and can efficiently express foreign genes. Prokaryotic cells can be preferably used, and in particular, E. coli can be used. In addition, Bacillus subtilis, Bacillus bacteria, Pseudomonas bacteria, and the like can also be used. As a transformation method, a known method such as a calcium chloride method, an electroporation method, a liposome transfection method, a microinjection method, or the like can be used.

続いて、得られた形質転換体を、導入された核酸分子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養し、宿主細胞内で組換えグルコン酸脱水酵素を合成する。培養は、常法に準じて行うことができ、宿主細胞の栄養生理学的性質を勘案して、培養条件を選択すればよい。利用される培地としては、宿主細胞が資化し得る栄養素を含み、形質転換体におけるタンパク質の発現を効率的に行えるものであれば特に制限はない。また、培養形態についても特に制限はないが、大量培養の観点から液体培地が好適に利用できる。   Subsequently, the obtained transformant is cultured in an appropriate nutrient medium under conditions that allow expression of the introduced nucleic acid molecule, and recombinant gluconate dehydrase is synthesized in the host cell. The culture can be performed according to a conventional method, and the culture conditions may be selected in consideration of the nutritional physiological properties of the host cells. The medium to be used is not particularly limited as long as it contains nutrients that can be assimilated by the host cells and can efficiently express the protein in the transformant. Moreover, although there is no restriction | limiting in particular also about a culture | cultivation form, A liquid medium can be utilized suitably from a viewpoint of mass culture.

所望の組換えベクターを保持する形質転換体の選別は、例えば、マーキング配列の発現の有無により行なうことができる。例えば、マーキング配列として薬剤耐性遺伝子を利用する場合には、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤含有培地で培養することによって行うことができる。   Selection of a transformant carrying a desired recombinant vector can be performed by, for example, the presence or absence of expression of a marking sequence. For example, when a drug resistance gene is used as the marking sequence, it can be performed by culturing in a drug-containing medium corresponding to the drug resistance gene.

（ii）発現菌体と界面活性剤との接触
前記（i）の工程でのグルコン酸脱水酵素を発現した発現菌体を界面活性剤と接触させる。発現菌体と界面活性剤の接触は、菌体の培養液に所望量の界面活性剤を添加することによって行ってもよいし、遠心分離等により集菌した発現菌体を適当な緩衝液に分散させた分散液中に界面活性剤を添加することによって行ってもよい。発現菌体と界面活性剤の接触時間は、発現菌体量、及び界面活性剤の種類や濃度によって適宜変更することができる。また、界面活性剤の添加量は、発現菌体量や界面活性剤の種類等によって適宜変更できるが、菌体懸濁液に0.08％〜2.0％（w/vol : 重量％）となるように添加することが好ましい。 (Ii) Contact between expressed microbial cells and surfactant The expressed microbial cells expressing the gluconate dehydrase in the step (i) are brought into contact with a surfactant. The contact between the expressed cells and the surfactant may be performed by adding a desired amount of a surfactant to the culture solution of the cells, or the expressed cells collected by centrifugation or the like in an appropriate buffer. You may carry out by adding surfactant in the disperse | distributed dispersion liquid. The contact time between the expressed cells and the surfactant can be appropriately changed depending on the amount of expressed cells and the type and concentration of the surfactant. The addition amount of the surfactant can be appropriately changed depending on the amount of the expressed cells, the kind of the surfactant, etc., but 0.08% to 2.0% (w / vol: wt%) in the cell suspension. It is preferable to add.

界面活性剤は、非イオン性界面活性剤及びイオン性界面活性剤等の別を問わない。タンパク質の可溶性を高めることが従来において公知の界面活性剤を利用することができ、例えば、和光純薬工業、試薬ホーム、製品情報、生化学一般、界面活性剤(http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/life/article/kaimenkassei1.htm）に挙げられるものを使用できる。具体的には、非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル（Brij（登録商標）58）、ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル（Brij（登録商標）35等のポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ポリ(オキシエチレン)＝オクチルフェニルエーテル（Nonidet（商標）P-40）、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル（Triton（登録商標）X-100等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系、N,N-ビス(3-D-グルコンアミドプロピル)コールアミド（BIGCHAP）、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート(Tween20)、やポリオキシエチレン(40)ソルビタンモノパルミタート(Tween40)等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系を挙げることができる。イオン性界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤に分類され、例えば、アニオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、両イオン性界面活性剤としては、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート（CHAPS）や3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホナート（CHAPSO）、3-[ジメチル(テトラデシル) アンモニオ]プロパン-1-スルホナート（Zwittergent（登録商標）3-14）、3-(N,N-ジメチルパルミチルアンモニオ)プロパンスルホナート（Zwittergent（登録商標）3-16）等のZwittergent（登録商標）系等を挙げることができる。好ましくは、Brij（登録商標）58である。   The surfactant may be a nonionic surfactant, an ionic surfactant or the like. Conventionally known surfactants can be used to enhance protein solubility, such as Wako Pure Chemical Industries, reagent home, product information, biochemistry in general, surfactants (http: //www.wako- chem.co.jp/siyaku/info/life/article/kaimenkassei1.htm) can be used. Specifically, examples of the nonionic surfactant include polyoxyethylene (20) cetyl ether (Brij (registered trademark) 58), polyoxyethylene (23) lauryl ether (Brij (registered trademark) 35, and other polyoxyethylenes. Polyoxyethylene alkylphenyl ethers such as ethylene alkyl ether, poly (oxyethylene) = octylphenyl ether (Nonidet ™ P-40), polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (Triton® X-100) System, N, N-bis (3-D-gluconamidopropyl) coleamide (BIGCHAP), polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (Tween20), and polyoxyethylene (40) sorbitan monopalmitate (Tween40) Polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester system such as an ionic surfactant is an anionic surfactant, a cationic field For example, anionic surfactants include sodium dodecyl sulfate (SDS), and zwitterionic surfactants include 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammoni. O] -1-propanesulfonate (CHAPS), 3-[(3-Colamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxy-1-propanesulfonate (CHAPSO), 3- [dimethyl (tetradecyl) ammonio] propane Zwittergent (registered trademark) systems such as -1-sulfonate (Zwittergent (registered trademark) 3-14), 3- (N, N-dimethylpalmitylammonio) propane sulfonate (Zwittergent (registered trademark) 3-16), etc. Preferably, Brij (registered trademark) 58 is used.

（iii）界面活性剤処理後の発現菌体の破砕
前記（ii）の工程の界面活性剤処理後の発現菌体の破砕を行う。菌体破砕は、物理的手法により、菌体の細胞構造を破壊して細胞からタンパク質成分を抽出できれば、公知の何れの菌体破砕方法を利用することができる。例えば、超音波のせん断力によって菌体を破砕する超音波破砕や、菌体懸濁液を高圧下で強制的に***から噴射させ、せん断力によって菌体を破砕するフレンチプレス等を利用することができる。また、ホモジナイザーや研磨作用のあるガラスビーズ、乳鉢、凍結／融解を利用することによっても菌体を破砕することができる。好ましくは、超音波破砕であり、通常の菌体破砕条件下で行うことができる。なお、菌体破砕の際に熱が発生するため、氷上等で冷却しながら破砕処理を行うことが好ましい。 (Iii) Crushing of the expressed cells after the surfactant treatment The expressed cells after the surfactant treatment in the step (ii) are crushed. For cell disruption, any known cell disruption method can be used as long as the cell structure of the cells can be disrupted and the protein component can be extracted from the cells by a physical method. For example, using ultrasonic crushing that breaks down bacterial cells with ultrasonic shear force, or a French press that forcibly sprays bacterial cell suspensions from small holes under high pressure and crushes bacterial cells with shear force Can do. The cells can also be crushed by using a homogenizer, a glass bead having a polishing action, a mortar, or freezing / thawing. Preferably, it is ultrasonic crushing, and can be performed under normal cell crushing conditions. In addition, since heat | fever generate | occur | produces in microbial cell crushing, it is preferable to perform a crushing process, cooling on ice etc.

（iv）発現菌体破砕液から発現菌体の溶菌液の分離
前記（iii）の工程で得られた菌体破砕液を遠心分離やろ過等により、菌体残渣と分離して、発現菌体の溶菌液を得る。好ましくは、遠心分離であり、例えば、5,000〜50,000×gで、5〜60分間、遠心分離する。ろ過の場合は、重力圧によるろ過であり、ろ紙としては、例えば、セルロースろ紙（グレードI：粒子保持能11μｍ）等を使用できる。遠心分離後の上澄み側及びろ過後のろ液側の発現菌体の溶菌液には、界面活性剤との接触により可溶化した酵素、及び不溶性だが沈殿していない酵素が含まれる。 (Iv) Separation of the lysate of the expressed cell from the disrupted cell of the expressed cell The cell lysate obtained in the step (iii) is separated from the cell residue by centrifugation, filtration, etc. Obtain a lysate. Centrifugation is preferable, for example, centrifugation is performed at 5,000 to 50,000 × g for 5 to 60 minutes. In the case of filtration, it is filtration by gravity pressure, and as the filter paper, for example, cellulose filter paper (grade I: particle retention capacity 11 μm) or the like can be used. The lysate of the expressed cells on the supernatant side after centrifugation and the filtrate side after filtration contains an enzyme solubilized by contact with a surfactant and an insoluble but not precipitated enzyme.

（v）発現菌体の溶菌液の限外ろ過等での濃縮
前記（iv）の工程で得られた発現菌体の溶菌液を限外ろ過や塩析等により濃縮することにより、発現菌体の溶菌液の濃縮液を得ることができる。限外ろ過は、半透過膜である限外ろ過膜を使用した分子量分画である。加圧や遠心操作により、限外ろ過膜の細孔径に対して低分子側の水や低分子の物質やイオン等は膜面を透過させ、目的となる高分子側の物質は膜面を透過阻止され濃縮される。限外ろ過膜は、0.1μm〜2nmの範囲の粒子や高分子を阻止することができる膜である。例えば、分画分子量（NMWL）が1〜50K、好ましくは3〜30 K、特に好ましくは8〜10Kの多孔質膜として構成することができる。限外ろ過膜の材質は、再生セルロール、トリアセチルセルロース、酢酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニルアルコール、ポリスルフォン、ポリフッ化ビニリデン、芳香族ポリアミド等、限界ろ過膜として公知の材質を利用することができる。膜の形状についても特に制限はなく、中空糸膜やスパイラル膜、平膜等の公知の形状のものを利用することができる。 (V) Concentration of lysate of expressed cells by ultrafiltration and the like By concentrating the lysate of expressed cells obtained in the step (iv) by ultrafiltration and salting out, the expressed cells A concentrated solution of the lysate can be obtained. Ultrafiltration is a molecular weight fraction that uses an ultrafiltration membrane that is a semi-permeable membrane. By pressing or centrifuging, water on the low molecular side, low molecular weight substances, ions, etc. permeate the membrane surface relative to the pore size of the ultrafiltration membrane, and the target polymer side material permeates the membrane surface. Blocked and concentrated. The ultrafiltration membrane is a membrane capable of blocking particles and polymers in the range of 0.1 μm to 2 nm. For example, it can be constituted as a porous membrane having a fractional molecular weight (NMWL) of 1 to 50K, preferably 3 to 30K, particularly preferably 8 to 10K. The material of the ultrafiltration membrane may be a known material such as regenerated cellulose, triacetylcellulose, cellulose acetate, polyacrylonitrile, polyvinyl chloride alcohol, polysulfone, polyvinylidene fluoride, or aromatic polyamide. it can. There is no restriction | limiting in particular also about the shape of a film | membrane, The thing of well-known shapes, such as a hollow fiber membrane, a spiral membrane, and a flat membrane, can be utilized.

限外ろ過方式は、デッドエンド方式及びクロスフロー様式等で行うことができる。限外ろ過には、膜の細孔に対して低分子側の物質を、膜の細孔から透過させるために加圧又は遠心分離等が必要となるが、加圧に際して送液ポンプ等を利用することができ、操作圧力は0.1から１MPaの範囲で行うことができる。また、遠心分離に適したスピンカラムとして構成することができる。市販品を利用することができ、Amicon Ultra-4 10等を好ましく利用できる。   The ultrafiltration method can be performed by a dead end method, a cross flow method, or the like. For ultrafiltration, pressurization or centrifugation is required to allow substances on the low molecular side of the membrane pores to permeate through the membrane pores. The operating pressure can be in the range of 0.1 to 1 MPa. Moreover, it can comprise as a spin column suitable for centrifugation. Commercially available products can be used, and Amicon Ultra-4 10 and the like can be preferably used.

限外ろ過等により、好ましくは、菌体破砕液を2〜20倍まで濃縮する。限外ろ過により、水や低分子の物質やイオンは膜の反対側に押し出されることにより、グルコン脱水素酵素濃度が高くなる。一連の工程により、グルコン酸脱水酵素の可溶化及びリホールディングが進行し、グルコン酸脱水酵素がその触媒活性を発揮し得る形態となる。   Preferably, the cell disruption solution is concentrated 2 to 20 times by ultrafiltration or the like. By ultrafiltration, water and low-molecular substances and ions are pushed out to the opposite side of the membrane, thereby increasing the concentration of glucone dehydrogenase. Through a series of steps, solubilization and refolding of the gluconate dehydrase proceeds, and the gluconate dehydrase can exhibit its catalytic activity.

電極材としては、外部回路に接続可能で電子を伝達できる導電性基材を利用することができ、その材質に制限はない。カーボンクロス、カーボンフェルト、カーボンペーパー、グラファイト、及びグラッシーカーボン等のカーボン材、アルミニウム、銅、金、白金、銀、ニッケル、パラジウム等の金属又は合金、SnO2、In2O3、WO3、TiO2等の導電性酸化物等が例示できるが、これらに限定するものではない。従来公知の材質の導電性基材を使用することができる。また、これを単層又は２種以上の積層構造をもって構成してもよい。 As the electrode material, a conductive base material that can be connected to an external circuit and can transmit electrons can be used, and the material is not limited. Carbon materials such as carbon cloth, carbon felt, carbon paper, graphite, and glassy carbon, metals or alloys such as aluminum, copper, gold, platinum, silver, nickel, palladium, SnO 2 , In 2 O 3 , WO 3 , TiO Examples include conductive oxides such as 2, but are not limited thereto. Conventionally known conductive base materials can be used. Moreover, you may comprise this with a single layer or a 2 or more types of laminated structure.

電極材は、好ましくは多孔質構造を備え、例えば、平均直径が20〜50nm、好ましくは30〜40 nmの細孔を有する多孔質構造を備える。平均径は、顕微鏡写真等の画像解析によって得られた細孔の投影面積と同等の投影面積を有する球の径として算出することができる。多孔質構造とは、多数の細孔が分散した構造を意味し、例えば、スポンジ状の構造が挙げられる。細孔は、他の細孔とは独立した単独孔の他、細孔の一部又は全部が隣接する細孔と相互に連通して連続孔を形成してもよい。三次元的な網目構造を有することが好ましい。   The electrode material preferably has a porous structure, for example, a porous structure having pores having an average diameter of 20 to 50 nm, preferably 30 to 40 nm. The average diameter can be calculated as the diameter of a sphere having a projected area equivalent to the projected area of the pores obtained by image analysis such as a micrograph. The porous structure means a structure in which a large number of pores are dispersed, and examples thereof include a sponge-like structure. In addition to a single hole independent of other pores, a part or all of the pores may communicate with adjacent pores to form continuous pores. It preferably has a three-dimensional network structure.

多孔質構造を備える電極材は、例えば、導電性繊維の集合体として構成することができ、導電性繊維よりなる織布及び不織布等が挙げられる。導電性繊維の材質としては、炭素、アルミニウム、銅、金、白金、銀、ニッケル、パラジウム等の金属又は合金、SnO2、In2O3、WO3、TiO2等の導電性酸化物等、当該技術分野で公知の材質の導電性の物質を利用することができる。これらの物質は１種類で利用してもよく、また２種類以上を混合して利用してもよい。好ましくは、上記したカーボンクロス等の炭素繊維の織布やカーボンフェルト等の炭素繊維の不織布等やグラッシーカーボン等の炭素基材を利用することができる。また、これらは、単層又は２種以上の積層構造をもって構成することができる。 The electrode material having a porous structure can be configured as an aggregate of conductive fibers, and examples thereof include woven fabrics and nonwoven fabrics made of conductive fibers. Examples of the conductive fiber material include metals, alloys such as carbon, aluminum, copper, gold, platinum, silver, nickel, palladium, and conductive oxides such as SnO 2 , In 2 O 3 , WO 3 , TiO 2, etc. A conductive material known in the art can be used. These substances may be used alone or in combination of two or more. Preferably, a carbon substrate such as the above-described carbon fiber woven fabric such as carbon cloth, carbon fiber nonwoven fabric such as carbon felt, or glassy carbon can be used. Moreover, these can be comprised with a single layer or a laminated structure of 2 or more types.

多孔質構造を備える電極材は、導電性の炭素微粒子を上述した導電性基材に塗布したものとして構成することができ、つまり、集電体としての電極基材上に多孔質炭素材が積層したものとして構成することができる。炭素粒子としては、市販のケッチェンブラック等のカーボンブラック、活性炭粉末等が利用でき、好ましくは、多孔質構造を備える多孔質の炭素微粒子を好ましく利用することができる。   The electrode material having a porous structure can be configured as the conductive carbon fine particles applied to the conductive substrate described above, that is, the porous carbon material is laminated on the electrode substrate as a current collector. Can be configured. As the carbon particles, commercially available carbon black such as ketjen black, activated carbon powder or the like can be used, and preferably, porous carbon fine particles having a porous structure can be preferably used.

多孔質の炭素微粒子は多孔質構造体として構成され、細孔の一部又は全部が相互に連通されている。細孔は、メソ又はマクロ細孔であり、メソ細孔とは平均径が2〜50 nmの細孔であり、マクロ細孔とは平均径が50 nm 以上の細孔を意味するものとする。   The porous carbon fine particles are configured as a porous structure, and some or all of the pores are in communication with each other. The pores are mesopores or macropores. Mesopores mean pores with an average diameter of 2 to 50 nm, and macropores mean pores with an average diameter of 50 nm or more. .

多孔質構造体とは、多数の細孔が分散した構造体を意味する。したがって、多孔質の炭素微粒子は、炭素が細孔の外郭部分を構成し、スポンジ状の構造をとることが好ましい。細孔は、他の細孔とは独立した単独孔の他、細孔の一部又は全部が隣接する細孔と相互に連通して連続孔を形成してもよい。三次元的な網目構造を有することが好ましい。   The porous structure means a structure in which a large number of pores are dispersed. Therefore, it is preferable that the porous carbon fine particles have a sponge-like structure with carbon constituting the outer portion of the pores. In addition to a single hole independent of other pores, a part or all of the pores may communicate with adjacent pores to form continuous pores. It preferably has a three-dimensional network structure.

かかる多孔質の炭素微粒子は、炭素前駆体と酸化マグネシウム（以下、「MgO」と略する場合がある。）前駆体との混合物を焼成し、得られた焼成物からMgO粒子を除去することによって作製されるMgO粒子を鋳型とする多孔質の炭素微粒子（以下、「MgO鋳型炭素微粒子」と称する場合がある。）として構成することができる。かかるMgO鋳型炭素微粒子は、MgO粒子が鋳型となり、MgO粒子が除去された後に同じ大きさ及び形状の細孔が形成されることとなる。これにより均質な細孔が規則的に整列しているMgO鋳型炭素微粒子が形成することができる。例えば、メソ孔とこのメソ孔の外郭を構成する炭素質壁を備えた多孔質炭素及びその製造方法が開示される特開2012-188309号公報に記載の方法で作製することができる。   Such porous carbon fine particles are obtained by firing a mixture of a carbon precursor and a magnesium oxide (hereinafter sometimes abbreviated as “MgO”) precursor, and removing MgO particles from the obtained fired product. It can be configured as porous carbon fine particles (hereinafter sometimes referred to as “MgO template carbon fine particles”) using the MgO particles to be produced as a template. In such MgO-templated carbon fine particles, MgO particles serve as templates, and pores having the same size and shape are formed after the MgO particles are removed. As a result, MgO-templated carbon fine particles in which uniform pores are regularly arranged can be formed. For example, it can be produced by the method described in JP 2012-188309 A which discloses porous carbon having mesopores and carbonaceous walls constituting the outline of the mesopores and a method for producing the same.

炭素前駆体としては、炭素を含有し、加熱により炭素化するものである限り特に限定はされない。例えば、炭素前駆体としては、ポリエチレンテレフタラート等のポリエステル系高分子、ポリアクリルアミドやポリアクリロニトリル等のアクリル系、及びポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリエチレンやポリビニルピロリドン等のビニル系高分子、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース系高分子、ポリアミド系高分子、ポリイミド系高分子、フェノール系高分子、エポキシ系高分子、並びに、石油系ピッチや石炭系ピッチ等のピッチ等が挙げられる。また、ナフタレン、フェナントレン、アントラセン等の縮合多環炭化水素化合物、インドール、イソインドール、キノリン等の縮合複素環化合物、及びこれらの誘導体も利用可能である。   The carbon precursor is not particularly limited as long as it contains carbon and is carbonized by heating. Examples of carbon precursors include polyester polymers such as polyethylene terephthalate, acrylic polymers such as polyacrylamide and polyacrylonitrile, vinyl polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, polyethylene and polyvinyl pyrrolidone, and hydroxypropyl cellulose. And the like, such as cellulose polymers such as cellulose polymers, polyamide polymers, polyimide polymers, phenol polymers, epoxy polymers, and pitches such as petroleum pitches and coal pitches. In addition, condensed polycyclic hydrocarbon compounds such as naphthalene, phenanthrene and anthracene, condensed heterocyclic compounds such as indole, isoindole and quinoline, and derivatives thereof can also be used.

MgO前駆体としては、加熱による熱分解により、MgO粒子を生成するものである限りは特に限定されない。MgOそのもののほか、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、塩基性炭酸マグネシウム、更に、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムやグルコン酸マグネシウム等のマグネシウムの有機酸塩を利用することができる。   The MgO precursor is not particularly limited as long as it generates MgO particles by thermal decomposition by heating. In addition to MgO itself, magnesium hydroxide, magnesium carbonate, basic magnesium carbonate, and magnesium organic acid salts such as magnesium acetate, magnesium citrate, magnesium oxalate and magnesium gluconate can be used.

炭素前駆体とMgO前駆体との混合は、両者を粉末どうしで混合してもよいし、両者を水溶液等の溶液として混合してもよく、また一方を粉末、他方を溶液として混合してもよい。混合は両者を均一に分布するように行うことが好ましい。   Mixing of the carbon precursor and the MgO precursor may be performed by mixing both powders, mixing both as a solution such as an aqueous solution, or mixing one as a powder and the other as a solution. Good. Mixing is preferably performed so that both are uniformly distributed.

加熱処理は、好ましくは不活性ガス雰囲気下、例えば、アルゴンや窒素雰囲気下、又は、減圧雰囲気下、例えば133Pa以下の雰囲気下で行う。加熱温度は、炭素前駆体から炭素以外の元素を脱離させて炭素化すると共に、MgO前駆体が熱分解によりMgO粒子を生成する温度で加熱する。加熱温度は低すぎると炭素化が進まないことから、好ましくは500〜1500℃、又は500〜1000℃、特に好ましくは、600〜800℃で加熱する。かかる温度で焼成することで、焼成後に炭素前駆体由来の官能基の一部がMgO鋳型炭素微粒子に残存し酵素の触媒活性の発現に好適な親水性環境を提供することできる。   The heat treatment is preferably performed in an inert gas atmosphere, for example, an argon or nitrogen atmosphere, or a reduced pressure atmosphere, for example, an atmosphere of 133 Pa or less. The heating temperature is such that elements other than carbon are desorbed from the carbon precursor and carbonized, and the MgO precursor is heated at a temperature at which MgO particles are generated by thermal decomposition. When the heating temperature is too low, carbonization does not proceed. Therefore, heating is preferably performed at 500 to 1500 ° C, or 500 to 1000 ° C, particularly preferably 600 to 800 ° C. By firing at such a temperature, a part of the functional group derived from the carbon precursor remains in the MgO-templated carbon fine particles after firing, thereby providing a hydrophilic environment suitable for the expression of the catalytic activity of the enzyme.

続いて、得られた焼成物からMgO粒子を除去する。MgO粒子の除去は、MgO粒子を溶解可能な溶液を用いて行うことができ、例えば硫酸、塩酸、酢酸、クエン酸、ギ酸等の酸性溶液、又はお湯等で洗浄又は浸漬等を行い、MgO粒子を溶解し除去する。酸性溶液を用いる場合には、炭素の性状の変化を抑制すべく弱酸性溶液を用いることが好ましい。   Subsequently, MgO particles are removed from the obtained fired product. The removal of MgO particles can be performed using a solution capable of dissolving MgO particles. For example, the MgO particles are washed or immersed in an acidic solution such as sulfuric acid, hydrochloric acid, acetic acid, citric acid, formic acid, hot water, etc. Dissolve and remove. When using an acidic solution, it is preferable to use a weakly acidic solution in order to suppress a change in the properties of carbon.

MgO粒子の除去後に、更に炭素を結晶化させるため追加の加熱処理を行ってもよい。ここでの加熱処理も好ましくは不活性ガス雰囲気下、例えば、アルゴンや窒素雰囲気下、又は、減圧雰囲気下、例えば133Pa以下の雰囲気下で行う。加熱温度は、非晶質の炭素が結晶化する温度で加熱する。好ましくは800℃以上で加熱する。熱効率の観点から2500℃以下で行うことが好ましいが、酵素の触媒活性の発現に好適な親水性環境が付与されたMgO鋳型炭素微粒子を提供するためには、800〜1000℃で行うことが特に好ましい。   After removing the MgO particles, additional heat treatment may be performed to further crystallize the carbon. The heat treatment here is also preferably performed in an inert gas atmosphere, for example, in an argon or nitrogen atmosphere, or in a reduced pressure atmosphere, for example, in an atmosphere of 133 Pa or less. The heating temperature is a temperature at which amorphous carbon crystallizes. Preferably it heats at 800 degreeC or more. From the viewpoint of thermal efficiency, it is preferably carried out at 2500 ° C. or less, but in order to provide MgO-templated carbon fine particles imparted with a hydrophilic environment suitable for the expression of the catalytic activity of the enzyme, it is particularly preferably carried out at 800 to 1000 ° C. preferable.

加熱処理後の炭素は、微粒子として成形するため粉砕処理を行うことが好ましい。粉砕処理は、圧縮力、剪断力、衝撃力、摩擦力を利用して行うことができ、これらの2以上の複数の力を組みわせてもよい。具体的には、ボールミル、遊星ミル、ジェットミル、乳鉢等を利用することができる。   The carbon after the heat treatment is preferably subjected to a pulverization treatment in order to form it as fine particles. The pulverization treatment can be performed using a compression force, a shear force, an impact force, and a friction force, and a plurality of these two or more forces may be combined. Specifically, a ball mill, a planetary mill, a jet mill, a mortar, or the like can be used.

MgO粒子を鋳型とすることで、その表面及び内部に均質な多数の細孔が分散したMgO鋳型炭素粒子を得ることができる。ここで、均質な細孔とは、均一の細孔径を有する細孔が規則的に整列していることを意味する。   By using MgO particles as a template, MgO-templated carbon particles having a large number of homogeneous pores dispersed on the surface and inside thereof can be obtained. Here, the term “homogeneous pore” means that pores having a uniform pore diameter are regularly arranged.

MgO鋳型炭素微粒子の細孔の平均径は、鋳型であるMgO粒子によって決定され、MgO粒子と同じ大きさの細孔が形成される。細孔の平均径は、大きすぎると細孔に固定した酵素やメディエータの脱離を効果的に抑制できず、また、小さすぎると細孔に酵素やメディエータを固定することができない。したがって、細孔の大きさは、細孔に固定する酵素やメディエータの種類に応じて適宜設定することができるが、メソ又はマクロスケール程度の細孔として構成される。ここで、メソ細孔とは平均径が2〜50 nmの細孔であり、マクロ細孔とは平均径が50 nm 以上の細孔である。具体的には、平均径が30〜100 nmであることが好ましく、特に好ましくは30〜40 nmである。このように構成することにより、MgO鋳型炭素微粒子の細孔に酵素やメディエータを安定的かつ強固に固定することができる。   The average diameter of the pores of the MgO-templated carbon fine particles is determined by the MgO particles as the template, and pores having the same size as the MgO particles are formed. If the average diameter of the pores is too large, the detachment of the enzyme or mediator immobilized on the pores cannot be effectively suppressed, and if it is too small, the enzyme or mediator cannot be immobilized on the pores. Accordingly, the size of the pore can be appropriately set according to the type of enzyme or mediator immobilized on the pore, but is configured as a meso- or macro-scale pore. Here, mesopores are pores having an average diameter of 2 to 50 nm, and macropores are pores having an average diameter of 50 nm or more. Specifically, the average diameter is preferably 30 to 100 nm, particularly preferably 30 to 40 nm. By comprising in this way, an enzyme or a mediator can be stably and firmly fixed to the pores of the MgO template carbon fine particles.

また、細孔の形状についても、鋳型であるMgO粒子の形状に応じて決定される。形状について特に制限はないが、略球状、多面体状等とすることができ、等方形状及び異方形状の別は問わない。また、略球状とは、完全な球状の他、楕円球状、球状に近い多面体状等を含む。多面体状とは、多角錘状、多角柱状等を含む。更に、細孔分布についても、鋳型であるMgO粒子の混合割合を変更することにより適宜調整することができる。   The shape of the pores is also determined according to the shape of the MgO particles that are the template. Although there is no restriction | limiting in particular about a shape, It can be set as a substantially spherical shape, polyhedron shape, etc., and distinction of isotropic shape and anisotropic shape is not ask | required. The substantially spherical shape includes not only a perfect spherical shape but also an elliptical spherical shape, a polyhedral shape close to a spherical shape, and the like. The polyhedral shape includes a polygonal pyramid shape, a polygonal columnar shape, and the like. Furthermore, the pore distribution can be adjusted as appropriate by changing the mixing ratio of the MgO particles as the template.

MgO鋳型炭素微粒子の粒子径は、固定する酵素やメディエータの種類や固定する導電性基材の種類等に応じて適宜設定することができるが、好ましくは、0.3〜2μmであり、特に好ましくは、0.5〜1μmである。   The particle diameter of the MgO-templated carbon fine particles can be appropriately set according to the type of enzyme or mediator to be fixed, the type of conductive substrate to be fixed, etc., preferably 0.3 to 2 μm, particularly preferably 0.5-1 μm.

MgO鋳型炭素微粒子は、市販品を利用することができ、例えば東洋炭素株式会社から入手できるCNovel（登録商標）（Mesoporous Carbon）サンプルキット grade: P(4)050を利用することが好ましい。   A commercially available product can be used as the MgO-templated carbon fine particles. For example, CNovel (registered trademark) (Mesoporous Carbon) sample kit grade: P (4) 050 available from Toyo Tanso Co., Ltd. is preferably used.

導電性基材への炭素微粒子の固定は、当該技術分野で公知の方法の何れを用いて行ってもよい。例えば、炭素微粒子を適当な溶媒に分散させた分散液を、導電性基材に塗布、含浸することにより固定することができる。分散液は、超音波処理等により懸濁させてスラリーとして調製してもよい。また、必要に応じて、結着剤を用いてもよい。塗布の方法としては、スクリーンプリント法、ロールコート法、ドクターブレード法、スピンコート法、スプレーによる噴霧法等を利用することができる。また、電着法を利用することもでき、例えば、炭素微粒子を適当な溶媒に分散させた分散液中に導電性基材と対向電極とを浸漬し、当該導電性基材と対向電極との間に電流を流して導電性基材に炭素微粒子を固定することもでき、必要に応じて結着剤を用いてもよい。   The carbon fine particles may be fixed to the conductive substrate using any method known in the art. For example, the dispersion can be fixed by applying and impregnating a conductive substrate with a dispersion in which carbon fine particles are dispersed in a suitable solvent. The dispersion may be prepared as a slurry by suspending it by ultrasonic treatment or the like. Moreover, you may use a binder as needed. As a coating method, a screen printing method, a roll coating method, a doctor blade method, a spin coating method, a spraying method using a spray, or the like can be used. An electrodeposition method can also be used. For example, the conductive substrate and the counter electrode are immersed in a dispersion in which carbon fine particles are dispersed in an appropriate solvent, and the conductive substrate and the counter electrode are An electric current can be passed between them to fix the carbon fine particles to the conductive substrate, and a binder may be used as necessary.

結着剤は、導電性基材上と炭素微粒子を結着させ導電性基材から炭素微粒子の脱離を抑制することができる。結着剤は、炭素微粒子を導電性基材に結着させ得る物質であれば、当該技術分野で公知の物質を利用することができる。例えば、ポリテトラフルオロエチレン（以下、「PTFE」と略する）、ポリフッ化ビニリデンやポリヘキサフルオロプロピレン等のフッ素系高分子、ポリシロキサン系高分子等を利用することができる。結着剤は１種類を単独で用いてもよいし、又は２種類以上併用してもよい。   The binder can bind the carbon fine particles on the conductive substrate and suppress the detachment of the carbon fine particles from the conductive substrate. As the binder, any substance known in the technical field can be used as long as it is a substance capable of binding the carbon fine particles to the conductive substrate. For example, polytetrafluoroethylene (hereinafter abbreviated as “PTFE”), fluoropolymers such as polyvinylidene fluoride and polyhexafluoropropylene, polysiloxane polymers, and the like can be used. A binder may be used individually by 1 type, or may be used together 2 or more types.

導電性基材への炭素微粒子の固定量は、導電性基材の種類及び炭素微粒子の形状等により適宜変更することができるものであるが、導電性基材1cm2当たり、0.05〜0.5 mgの炭素微粒子を固定することが好ましい。また、結着剤を用いる場合には、結着剤が多すぎると電極材の電子移動抵抗が大きくなり円滑な電子の移動を妨げるために好ましくないことから、炭素微粒子に対して10〜60％で結着剤を混合することが好ましい。 The amount of carbon fine particles fixed to the conductive substrate can be appropriately changed according to the type of the conductive substrate and the shape of the carbon fine particles, but 0.05 to 0.5 mg per 1 cm 2 of the conductive substrate. It is preferable to fix the carbon fine particles. When using a binder, too much binder is not preferable because it increases the electron transfer resistance of the electrode material and hinders smooth electron transfer. It is preferable to mix a binder.

電極材の大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用目的に応じて適宜調整することができる。マイクロメートルオーダーに電極面積を小さくした微小電極として構成することができる。   The magnitude | size, shape, etc. of an electrode material are not specifically limited, According to the intended purpose, it can adjust suitably. It can be configured as a microelectrode having an electrode area reduced to the micrometer order.

本実施形態の酵素電極は、電極材にグルコン酸脱水酵素だけではなく、他の種類の酵素を組みわせて固定してもよい。例えば、他の酵素を組み合わせて多段階反応系を構築することが好ましい。例えば、グルコン酸を生成するグルコース脱水素酵素と組み合わせて、グルコースの多段階反応系を構築するように構成してもよい。   The enzyme electrode of the present embodiment may be fixed by combining not only gluconic acid dehydrase but also other types of enzymes on the electrode material. For example, it is preferable to construct a multistage reaction system by combining other enzymes. For example, a glucose multi-stage reaction system may be constructed in combination with glucose dehydrogenase that produces gluconic acid.

本実施形態の酵素電極は、酵素反応と電極間の電子伝達を媒介するメディエータ等の酵素の触媒活性の発現に必要な物質を、必要に応じて電極材に固定することができる。   In the enzyme electrode of this embodiment, a substance necessary for the expression of the catalytic activity of an enzyme such as a mediator that mediates an enzyme reaction and electron transfer between the electrodes can be fixed to the electrode material as necessary.

メディエータは、酵素の触媒反応に応じて酸化還元される低分子の酸化還元物質であり、酵素と導電性基材間の電子移動を媒介する。したがって、メディエータは、酵素と電子を授受することができる共に、導電性基材とも電子を授受することができる物質である限り何れも利用することができる。例えば、メディエータは、一重結合と二重結合が交互に並んだπ共役系化合物であることが好ましい。具体的には、2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)（以下、「ABTS」と略する）、フェリシアン化カリウム等のフェリシアン化物、5-メチルフェナジニウムメチルスルファート（フェナジンメトスルファート：PMS）、5-エチルフェナジニウムメチルスルファート（フェナジンエトスルファート：PES）等のフェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物、フェロセンやジメチルフェロセン、フェロセンカルボン酸等のフェロセン系化合物、ナフトキノン、アントラキノン、ハイロドキノン、ピロロキノリンキノン等のキノン系化合物、シトクロム系化合物、ベンジルビオロゲンやメチルビオロゲン等のビオロゲン系化合物、ジクロロフェノールインドフェノール等のインドフェノール系化合物等が挙げられる。ナフトキノンを特に好ましく利用することができる。   A mediator is a low-molecular redox substance that is redoxed in response to the catalytic reaction of an enzyme, and mediates electron transfer between the enzyme and a conductive substrate. Therefore, any mediator can be used as long as it can exchange electrons with an enzyme and can also exchange electrons with a conductive substrate. For example, the mediator is preferably a π-conjugated compound in which single bonds and double bonds are alternately arranged. Specifically, 2,2′-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (hereinafter abbreviated as “ABTS”), ferricyanides such as potassium ferricyanide, 5-methylphenazinium Phenazine compounds such as methyl sulfate (phenazine methosulfate: PMS), 5-ethylphenazinium methyl sulfate (phenazine etsulfate: PES), phenothiazine compounds, ferrocene such as ferrocene, dimethyl ferrocene, and ferrocene carboxylic acid And quinone compounds such as naphthoquinone, anthraquinone, hydrodoquinone and pyrroloquinoline quinone, cytochrome compounds, viologen compounds such as benzyl viologen and methyl viologen, and indophenol compounds such as dichlorophenol indophenol. Naphthoquinone can be particularly preferably used.

本実施形態の酵素電極によれば、グルコン酸酸化触媒能を十分に発揮することができる酵素電極を提供することができる。従来において、例えばスルホロバス属細菌由来のグルコン酸脱水酵素を、大腸菌等の糖鎖修飾経路を有しないタンパク質合成系を使用して、糖鎖が付加しない状態で合成することは、封入体が形成する等の問題があり困難であった。一方、糖鎖修飾経路を有するタンパク質合成系を使用して合成する場合、糖鎖が付加することで、酵素分子の疎水面同士の会合が低減され可溶性の酵素として合成され、結果的に、酵素の合成効率が向上する。しかしながら、付加する糖鎖の種類や、付加する状態によっても合成酵素の物性は影響を受けることから、糖鎖が付与した酵素の扱いは、産業利用の上でも大きな障害になることが多い。また、糖鎖付加酵素をそのままの状態で電極材に固定化すると、糖鎖が絶縁体となり、燃料→酵素→（メディエータ）→電極への電子伝達効率が著しく低下し、酵素触媒電流は数ミリアンペア以下と小さなものになる等の問題もある。そのため、従来においては、グルコン酸脱水酵素を利用したグルコン酸酸化の触媒機能を有する酵素電極を作製することは困難であった。本実施形態の酵素電極によって、初めてグルコン酸脱水酵素を利用したグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極を提供することが可能となる。   According to the enzyme electrode of the present embodiment, an enzyme electrode that can sufficiently exhibit the gluconic acid oxidation catalytic ability can be provided. Conventionally, for example, synthesis of gluconic anhydrase derived from a sulfolobas bacterium using a protein synthesis system that does not have a sugar chain modification pathway such as Escherichia coli without adding a sugar chain forms an inclusion body. It was difficult due to problems such as On the other hand, when synthesizing using a protein synthesis system having a sugar chain modification pathway, the addition of a sugar chain reduces the association between the hydrophobic surfaces of the enzyme molecule and synthesizes it as a soluble enzyme. The synthesis efficiency of is improved. However, since the physical properties of the synthetic enzyme are also affected by the type of sugar chain to be added and the state of addition, the handling of the enzyme provided with the sugar chain often becomes a major obstacle in industrial use. Also, if the glycosylation enzyme is immobilized as it is on the electrode material, the sugar chain becomes an insulator, and the efficiency of electron transfer from the fuel → enzyme → (mediator) → electrode is significantly reduced, and the enzyme catalyst current is several milliamperes. There are also problems such as the following becoming small. Therefore, conventionally, it has been difficult to produce an enzyme electrode having a catalytic function of gluconate oxidation using gluconate dehydrase. With the enzyme electrode of this embodiment, it is possible to provide an enzyme electrode having gluconic acid oxidation catalytic ability using gluconic dehydrase for the first time.

本実施形態の酵素電極は、バイオ電池の負極側電極、及びバイオセンサーの作用電極として利用することができ、電子、医療、食品、環境分野等の産業分野において利用可能である。   The enzyme electrode of the present embodiment can be used as a negative electrode of a bio battery and a working electrode of a biosensor, and can be used in industrial fields such as electronics, medicine, food, and the environment.

本実施形態の酵素電極は、特に、電極材を多孔質構造を有する炭素基材とすることで、グルコン酸酸化の触媒機能を効率よく発揮することができる酵素電極を提供できる。つまり、酵素発現菌体の溶菌液の濃縮液を直接的に多孔質構造を有する炭素基材に含浸させることで、酵素分子が炭素基材の細孔内に入り込み、言わば酵素の精製効果が得られ、更に、酵素分子同士の会合が抑制される利点がある。これにより、凝集しやすい酵素種であっても酵素電極化を実現できる。   The enzyme electrode of the present embodiment can provide an enzyme electrode that can efficiently exhibit the catalytic function of gluconic acid oxidation, in particular, by using a carbon substrate having a porous structure as the electrode material. In other words, by impregnating a carbon substrate having a porous structure directly with a concentrated solution of enzyme-lysed lysate, the enzyme molecules enter the pores of the carbon substrate, so that an enzyme purification effect is obtained. Furthermore, there is an advantage that association between enzyme molecules is suppressed. Thereby, an enzyme electrode can be realized even if the enzyme species easily aggregate.

（酵素電極の作製方法）
本実施形態に係る酵素電極の作製方法は、大腸菌等に代表される原核生物等の糖鎖修飾能を有しない生物を宿主として利用するタンパク質発現系で、糖鎖が付加しないタンパク質としてグルコン酸脱水酵素を合成し、当該酵素を含む発現菌体の溶菌液の濃縮液を電極材に固定化することにより酵素電極を作製するものである。 (Production method of enzyme electrode)
The method for producing an enzyme electrode according to the present embodiment is a protein expression system that uses an organism having no sugar chain modification ability, such as prokaryotes such as Escherichia coli as a host, and dehydrates gluconate as a protein to which no sugar chain is added. An enzyme electrode is produced by synthesizing an enzyme and immobilizing a concentrated solution of a lysate of an expression cell containing the enzyme on an electrode material.

本実施形態に係る酵素電極の作製方法は、詳細には、（i）糖鎖修飾能を有しない細菌をスルホロバス属細菌由来のグルコース脱水酵素をコードする遺伝子で形質転換し、組換えグルコン酸脱水酵素を発現した発現菌体を調製する工程、（ii）前記発現菌体を界面活性剤と接触させる工程、（iii）前記界面活性剤処理後の発現菌体を破砕して、発現菌体破砕液を調製する工程、（iv）前記発現菌体破砕液中の菌体残渣を分離除去して、発現菌体の溶菌液を調製する工程、（v）前記発現菌体の溶菌液を濃縮し、発現菌体の溶菌液の濃縮液を調製する工程、（vi）前記発現菌体の溶菌液の濃縮液を電極材に固定化する工程、を備える。なお、グルコン酸脱水酵素を含む発現菌体の溶菌液の濃縮液の調製、及び電極材については上述した。   In detail, the method for producing an enzyme electrode according to this embodiment includes (i) transforming a bacterium having no sugar chain-modifying ability with a gene encoding a glucose dehydrase derived from a sulfolobas bacterium, A step of preparing an expression cell expressing the enzyme; (ii) a step of bringing the expression cell into contact with a surfactant; and (iii) crushing the expression cell after the surfactant treatment to crush the expression cell. A step of preparing a solution, (iv) a step of separating and removing cell residue in the disrupted solution of the expressed cells to prepare a lysate of the expressed cells, and (v) concentrating the lysate of the expressed cells. A step of preparing a concentrated solution of the lysate of the expressed cells, and (vi) a step of immobilizing the concentrated solution of the lysate of the expressed cells on the electrode material. In addition, preparation of the concentrate of the lysate of the expression microbial cell containing a gluconic acid dehydrase, and electrode material were mentioned above.

グルコン酸脱水酵素を含む発現菌体の溶菌液の濃縮液の電極材への固定化は、当該技術分野で公知の方法の何れを用いて行うことができる。例えば、物理的吸着、共有結合、イオン結合、抗体等の生物化学的特異的結合による担体結合法、２以上の官能基をもつ試薬による架橋法、ゲル内に封入する包括法等によって固定することができる。また、これらを組み合わせてもよく、最適な酵素固定法を適宜選択することが望ましい。電極材として炭素微粒子を利用する場合には、酵素の固定は炭素微粒子を導電性基材に固定した後に行ってもよいし、炭素微粒子を導電性基材に固定する前に、予め酵素を鋳型炭素微粒子に固定してもよい。   Immobilization of the concentrated lysate of the lysate containing gluconate dehydrase to the electrode material can be performed using any method known in the art. For example, fixation by physical adsorption, covalent bond, ionic bond, carrier binding method by biochemical specific bond such as antibody, cross-linking method by reagent having two or more functional groups, inclusion method encapsulating in gel, etc. Can do. These may be combined, and it is desirable to select an optimal enzyme immobilization method as appropriate. When carbon fine particles are used as the electrode material, the enzyme may be fixed after the carbon fine particles are fixed to the conductive base material, or the enzyme is preliminarily cast before the carbon fine particles are fixed to the conductive base material. You may fix to carbon microparticles.

特に好ましくは、物理的吸着であり、酵素を適当な溶媒に溶解又は分散した発現菌体の溶菌液の濃縮液を電極材表面に接触させることにより行うことができる。接触は噴霧、滴下、含浸等の公知の方法で行うことができる。また、スピンコート、スプレー法、スクリーン法、ディップコート、ブレード法等の塗布方法を利用することができる。   Particularly preferred is physical adsorption, which can be carried out by bringing a concentrated solution of a lysate of an expressed cell obtained by dissolving or dispersing an enzyme in an appropriate solvent into contact with the electrode material surface. The contact can be carried out by a known method such as spraying, dripping or impregnation. Also, a coating method such as spin coating, spraying, screen method, dip coating, blade method or the like can be used.

電極材に、酵素反応と電極間の電子伝達を媒介するメディエータ等の酵素の触媒活性の発現に必要な物質を固定する場合には、メディエータ等の固定は、酵素と混合して固定してもよいし、酵素の固定の前、若しくは後に固定してもよい。   When a substance necessary for the expression of the catalytic activity of an enzyme such as a mediator that mediates an enzyme reaction and electron transfer between electrodes is fixed to the electrode material, the mediator or the like may be fixed by mixing with the enzyme. It may be fixed before or after the enzyme is fixed.

本実施形態の酵素電極の作製方法によれば、グルコン酸酸化触媒能を十分に発揮することができる酵素電極を作製することが。従来において、糖鎖が付加しない状態及び糖鎖が付加した状態の何れにもおいても、スルホロバス属細菌由来のグルコン酸脱水酵素のグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極を作製することは困難であった。本実施形態において、スルホロバス属細菌由来のグルコン酸脱水酵素を、大腸菌のタンパク質発現系を用いて糖鎖が付加しない状態で組換え発現させ、組換えグルコン酸脱水酵素を含む発現菌体の溶菌液を電極材に固定化することにより、グルコン酸酸化触媒能を十分に発揮することができる酵素電極の作製方法を提供できる。本実施形態の酵素電極の作製方法により作製される酵素電極は、バイオ電池の負極側電極、及びバイオセンサーの作用電極として利用することができ、電子、医療、食品、環境分野等の産業分野において利用可能である。   According to the method for producing an enzyme electrode of the present embodiment, it is possible to produce an enzyme electrode that can sufficiently exhibit gluconic acid oxidation catalytic ability. Conventionally, it is difficult to produce an enzyme electrode having a gluconic acid oxidation catalytic ability of a gluconic acid dehydrating enzyme derived from a bacterium belonging to the genus Sulfolobus, in either a state where a sugar chain is not added or a state where a sugar chain is added. there were. In the present embodiment, a gluconate dehydrase derived from a bacterium belonging to the genus Sulfolobus is recombinantly expressed using a protein expression system of Escherichia coli without adding a sugar chain, and a lysate of an expression cell containing the recombinant gluconate dehydrase By immobilizing to the electrode material, it is possible to provide a method for producing an enzyme electrode that can sufficiently exhibit the gluconic acid oxidation catalytic ability. The enzyme electrode produced by the method for producing an enzyme electrode according to the present embodiment can be used as a negative electrode for a biobattery and a working electrode for a biosensor, and can be used in industrial fields such as electronics, medical care, food, and environmental fields. Is available.

特に、電極材を、多孔質構造を有する炭素基材とすることで、発現菌体の溶菌液の濃縮液を電極材に固定化する際に、酵素分子が炭素基材の細孔内に入り込むことで言わば酵素の精製効果が得られ、また、酵素分子同士の会合が抑制されることにより、グルコン酸酸化の触媒機能を効率よく発揮することができる酵素電極の作製方法を提供することができる。更に、多孔質構造を有する炭素基材を、酸化マグネシウム粒子を鋳型として作製することにより、多数の均一の大きさの細孔が規則正しく整列した炭素基材の細孔に酵素やメディエータを安定的かつ強固に固定することができ、酵素及びメディエータの当該電極材から脱離を抑制することができる。これにより、当該電極材の劣化を抑制し、酵素触媒電流の安定性を図ることができる。また、酵素と導電性基材間の電子の授受を円滑に進めることができ、これにより、作製される酵素触媒電流を向上させることができ、電極性能の向上を図ることができる。   In particular, when the electrode material is a carbon base material having a porous structure, the enzyme molecule enters the pores of the carbon base material when the lysate concentrate of the expressed cells is immobilized on the electrode material. In other words, it is possible to provide a method for producing an enzyme electrode that can provide an enzyme purification effect and that can effectively exhibit the catalytic function of gluconic acid oxidation by inhibiting the association between enzyme molecules. . Furthermore, by producing a carbon base material having a porous structure using magnesium oxide particles as a template, enzymes and mediators can be stably and efficiently placed in the pores of the carbon base material in which a large number of uniform pores are regularly arranged. It can fix firmly and can suppress detachment | desorption from the said electrode material of an enzyme and a mediator. Thereby, deterioration of the said electrode material can be suppressed and the stability of an enzyme catalyst electric current can be aimed at. In addition, the transfer of electrons between the enzyme and the conductive substrate can proceed smoothly, whereby the enzyme catalyst current produced can be improved, and the electrode performance can be improved.

（バイオ電池）
本実施形態のバイオ電池は、正極側電極、負極側電極、及び電解質層を１組含んで構成されるバイオ燃料電池用セルを含んで構成される。セルは、バイオ燃料電池の最小単位であり、これを積層することによりセルスタックを形成することができ、これによりバイオ燃料電池を構築することができる。 (Bio battery)
The biobattery of this embodiment is configured to include a biofuel battery cell that includes one set of a positive electrode, a negative electrode, and an electrolyte layer. A cell is a minimum unit of a biofuel cell, and a cell stack can be formed by stacking the cells, whereby a biofuel cell can be constructed.

本実施形態のバイオ電池は、例えば、負極側電極と正極側電極とが、電解質層を挟んで対向するように配置され、負極側電極と正極側電極は外部回路によって接続されている。負極側は、負極側電極に燃料を供給できるように燃料タンクが取り付けられ、正極側は、大気中の酸素を取り入れられるように空気取り込み口等が形成されている。例えば、セルは、セパレーター、燃料タンク、負極側電極、電解質層、正極側電極、セパレーターの順で積層される。   In the biobattery of this embodiment, for example, the negative electrode side electrode and the positive electrode side electrode are arranged so as to face each other with the electrolyte layer interposed therebetween, and the negative electrode side electrode and the positive electrode side electrode are connected by an external circuit. A fuel tank is attached to the negative electrode side so that fuel can be supplied to the negative electrode, and an air intake port or the like is formed on the positive electrode side so that oxygen in the atmosphere can be taken in. For example, the cells are laminated in the order of a separator, a fuel tank, a negative electrode, an electrolyte layer, a positive electrode, and a separator.

負極側電極は、燃料の酸化反応を行うように構成され、本実施形態の酵素電極を用いて構成される。正極側電極は、酸素の還元反応を行うように構成される。正極側電極ではオキシダーゼ等の酸素の還元反応を行う酵素を選択することが好ましい。正極側電極は、適当な電極材上の少なくとも一部に生体触媒を含んだ生物電極の他、金属の触媒反応を利用する白金等の金属電極等として構成しても良い。ここで、生体触媒とは、生物体内に存在する物質変換能を有する物質である。生体由来の天然物質のほか、それを模した人工の物質をも含む。例えば、酵素、微生物、細胞小器官及び細胞等が含まれる。生物電極として正極側電極を構成する場合には、適当な電極材上に酵素を固定化した酵素電極することが好ましい。電極材については、上記負極側電極で説明したものと同様の導電性の基材を用いることができる。   The negative electrode is configured to perform a fuel oxidation reaction, and is configured using the enzyme electrode of the present embodiment. The positive electrode is configured to perform an oxygen reduction reaction. For the positive electrode, it is preferable to select an enzyme that performs an oxygen reduction reaction, such as oxidase. The positive electrode may be configured as a metal electrode such as platinum using a catalytic reaction of metal in addition to a bioelectrode including a biocatalyst in at least a part of an appropriate electrode material. Here, the biocatalyst is a substance having a substance conversion ability existing in the living body. In addition to natural substances derived from living organisms, artificial substances that mimic it are also included. For example, enzymes, microorganisms, organelles and cells are included. When a positive electrode is configured as a biological electrode, it is preferable to use an enzyme electrode in which an enzyme is immobilized on an appropriate electrode material. As the electrode material, the same conductive base material as that described for the negative electrode can be used.

酵素としては、酸素の還元反応が触媒する酵素である限りは、当該技術分野で公知の何れの酵素を利用することができる。ビリルビンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ等の酸化還元酵素の利用が好ましく、酵素は単独で、若しくは複数組み合わせて利用することができる。ここで、ビリルビンオキシダーゼは、銅イオンを活性中心に持つマルチ銅オキシダーゼであり、ビリルビンからビルベルジンへの酸化反応を触媒する酵素である。基質から取り出した電子を用いて分子状酸素を電子還元し水分子を生成する反応を触媒するという性質を有することから、バイオ電池の正極用の電極触媒としての利用価値が高い酵素である。補酵素及び補因子要求性の有無についても特に制限はない。   As the enzyme, any enzyme known in the art can be used as long as it is an enzyme catalyzed by an oxygen reduction reaction. Use of oxidoreductases such as bilirubin oxidase, pyruvate oxidase, laccase, and ascorbate oxidase is preferred, and the enzymes can be used alone or in combination. Here, bilirubin oxidase is a multi-copper oxidase having a copper ion as an active center, and is an enzyme that catalyzes an oxidation reaction from bilirubin to biliverdin. Since it has a property of catalyzing a reaction of generating molecular water by electron reduction of molecular oxygen using electrons taken out from a substrate, it is an enzyme having high utility value as an electrode catalyst for a positive electrode of a bio battery. There is no particular limitation on the presence or absence of coenzyme and cofactor requirements.

正極側電極の触媒として、酵素を用いる場合、酵素の由来は特に制限されない。したがって、天然に存在する生物体から適当なタンパク質の単離精製技術により精製された天然由来のものであってよく、また遺伝子工学的手法により組み換え体として製造されたものあるいは化学的に合成されたものあってもよい。更には、市販品を利用することもできる。例えば、天野エンザイムから入手できるMyrothecium verrucaria由来のビリルビンオキシダーゼ（MvBOD）等を利用することができる。特に好ましくは、UniProtKB / Swiss-Prot: Q12737（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/Q12737）で開示されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼを利用することができる。   When an enzyme is used as the catalyst for the positive electrode, the origin of the enzyme is not particularly limited. Therefore, it may be of natural origin, purified from a naturally occurring organism by a suitable protein isolation and purification technique, or manufactured as a recombinant by a genetic engineering technique or chemically synthesized. There may be things. Furthermore, a commercial item can also be utilized. For example, bilirubin oxidase (MvBOD) derived from Myrothecium verrucaria available from Amano Enzyme can be used. Particularly preferably, bilirubin oxidase having an amino acid sequence disclosed in UniProtKB / Swiss-Prot: Q12737 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/Q12737) can be used.

遺伝子工学的手法により製造する場合には当該技術分野で公知の方法を利用することができる。具体的には、所望の酵素遺伝子の塩基配列を基にして作成したDNAをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、生物体由来のゲノムDNA、全RNAから逆転写反応によって合成したcDNA等から所望の酵素をコードする核酸分子を調製することができる。ここで用いられるプローブは、所望の酵素と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであり、常法に基づいて調製することができる。例えば、化学合成法の他、既に標的となる核酸が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。   In the case of producing by a genetic engineering technique, a method known in the technical field can be used. Specifically, a desired enzyme is obtained from a genomic DNA derived from an organism, cDNA synthesized from a total RNA by a reverse transcription reaction, etc. by a hybridization method using a DNA prepared based on the base sequence of the desired enzyme gene as a probe. A nucleic acid molecule encoding can be prepared. The probe used here is an oligonucleotide containing a sequence complementary to a desired enzyme, and can be prepared based on a conventional method. For example, in addition to chemical synthesis methods, when a target nucleic acid has already been obtained, its restriction enzyme fragment or the like can be used.

また、所望の酵素遺伝子の塩基配列を基にして作成したプライマーとして用いるPCRによっても同様に、生物体由来のゲノムDNA、cDNAを鋳型として所望の酵素をコードする核酸分子を調製することができる。PCRを利用する場合に用いられるプライマーは、所望の酵素をコードする核酸配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであり、上記プローブと同様にして常法に基づいて調製することができる。化学合成法に基づきプローブ又はプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいてプローブ又はプライマーの設計を行う。   Similarly, a nucleic acid molecule that encodes a desired enzyme can be prepared by using PCR as a primer prepared based on the base sequence of the desired enzyme gene, using genomic DNA or cDNA derived from an organism as a template. A primer used when PCR is used is an oligonucleotide containing a sequence complementary to a nucleic acid sequence encoding a desired enzyme, and can be prepared based on a conventional method in the same manner as the above probe. When a probe or primer is prepared based on a chemical synthesis method, the probe or primer is designed based on the sequence information of the target nucleic acid prior to synthesis.

ここで、相補的とは、プローブ又はプライマーと標的核酸分子とが塩基対合則にしたがって特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味する。ここで、完全な相補性のみならず、プローブ又はプライマーと標的核酸分子が互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。プローブ又はプライマーの長さはGC含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件等の多くの因子に依存して決定される。   Here, the term “complementary” means that the probe or primer and the target nucleic acid molecule can specifically bind according to the base pairing rule to form a stable duplex structure. Here, not only perfect complementarity, but only a few nucleobases follow base pairing rules as long as the probe or primer and the target nucleic acid molecule are sufficient to form a stable duplex structure with each other. Even partial complementarity that fits is acceptable. The length of the probe or primer is determined depending on many factors such as target nucleic acid sequence information such as GC content and hybridization reaction conditions such as reaction temperature and salt concentration in the reaction solution.

また、所望の酵素をコードする核酸分子を適当な発現ベクター中に挿入し、これを宿主に導入することによって形質転換体を作製する。ここで、利用可能なベクター、及びベクターへの外来遺伝子の挿入については上述した。   Also, a transformant is prepared by inserting a nucleic acid molecule encoding a desired enzyme into an appropriate expression vector and introducing it into a host. Here, the available vectors and the insertion of foreign genes into the vectors have been described above.

形質転換体の作製に際して宿主となる細胞としては、外来遺伝子を効率的に発現できる宿主細胞であれば、特に制限はない。原核生物細胞を好適に利用でき、特には大腸菌を利用することができる。その他、枯草菌、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。形質転換法、得られた形質転換体の培養方法及び選別方法については上述した。   There is no particular limitation on the cell serving as a host in the production of the transformant as long as it is a host cell that can efficiently express a foreign gene. Prokaryotic cells can be preferably used, and in particular, E. coli can be used. In addition, Bacillus subtilis, Bacillus bacteria, Pseudomonas bacteria, and the like can also be used. Furthermore, eukaryotic cells can be used without being limited to prokaryotes. The transformation method, the method for culturing and selecting the obtained transformant have been described above.

形質転換体の培養物から、所望の酵素を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いることができる。精製は、上記形質転換体の培養物から、所望の酵素の存在する画分に応じて、一般的なタンパク質の単離精製方法に準じた手法を適用すればよい。具体的には、所望の酵素が宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま利用するか、遠心分離、ろ過等の手段により宿主細胞を除去して培養上清を得る。続いて、培養上清に、当該技術分野で公知のタンパク質精製方法を適宜選択することにより、単離精製することができる。   In order to isolate and purify the desired enzyme from the culture of the transformant, usual protein isolation and purification methods can be used. For purification, a method according to a general protein isolation and purification method may be applied from the transformant culture according to the fraction containing the desired enzyme. Specifically, when a desired enzyme is produced outside the host cell, the culture solution is used as it is, or the host cell is removed by means such as centrifugation or filtration to obtain a culture supernatant. Subsequently, the culture supernatant can be isolated and purified by appropriately selecting a protein purification method known in the art.

また、所望の酵素が宿主細胞内で産生される場合には、培養物を遠心分離、ろ過等の手段により宿主細胞を回収する。続いて、酵素的破砕方法、又は超音波処理、凍結融解、浸透圧ショック等の物理的破砕方法等により、宿主細胞を破砕する。破砕後、遠心分離、ろ過等の手段により可溶化画分を収集する。得られた可溶化画分を、前述の細胞外に生産できる場合と同様に処理することにより単離精製することができる。また、グルコン酸脱水酵素と同様に発現菌体の溶菌液の濃縮液等を利用してもよい。   When the desired enzyme is produced in the host cell, the host cell is recovered by means such as centrifugation and filtration of the culture. Subsequently, the host cells are disrupted by an enzymatic disruption method or a physical disruption method such as sonication, freeze-thawing, and osmotic shock. After crushing, the solubilized fraction is collected by means such as centrifugation and filtration. The obtained solubilized fraction can be isolated and purified by treating in the same manner as in the case where it can be produced extracellularly. Moreover, you may utilize the concentrate etc. of the lysate of an expression microbial cell similarly to gluconic acid dehydrase.

また、アミノ酸配列が当該技術分野で公知である酵素については、化学的合成技術によっても製造することができる。例えば、所望の酵素のアミノ酸配列の全部、又は一部を、ペプチド合成機を用いて合成し、得られるポリペプチドを適当な条件の下で、再構築することにより調製することもできる。アミノ酸配列が公知である酵素のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加の改変が加えられたアミノ酸配列を有するもの等、少なくとも80％、90％、95％、又は98％の配列同一性を有する改変体についても、所望の活性を有する限り利用することができる。   An enzyme whose amino acid sequence is known in the art can also be produced by chemical synthesis techniques. For example, all or part of the amino acid sequence of a desired enzyme can be synthesized by using a peptide synthesizer, and the resulting polypeptide can be prepared by reconstructing it under appropriate conditions. Among amino acid sequences of enzymes whose amino acid sequences are known, those having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added, such as at least 80%, 90%, 95%, or 98 A variant having% sequence identity can also be used as long as it has the desired activity.

更に、酸素の還元反応を触媒できる限り、微生物、細胞小器官及び細胞等の生物体自体であってもよい。また、これらの生物体からの粗精製物であってもよい。   Furthermore, organisms such as microorganisms, organelles and cells may be used as long as they can catalyze the oxygen reduction reaction. Further, it may be a crude product from these organisms.

前記電極材には、酵素と共に、酵素がその触媒活性を発揮するのに必要な物質を固定化してもよい。例えば、酵素の触媒反応と電極との間の電子授受を媒介するメディエータを酵素と共に固定化してもよい。使用可能なメディエータに関しては上述した。正極側酵素として、ビリルビンオキシダーゼを使用する場合には、ABTSをメディエータとすることが好ましい。また、酵素の触媒活性の発揮に補酵素等を要求する酵素の場合には、活性化に必要な物質を電極材上に酵素と共に固定化することができる。また、補因子を要求する酵素については、固定化される酵素は、アポ形態及びホロ形態の別を問わないが、電極反応に際しては活性を発揮できるように構成する必要がある。したがって、アポ形態として電極材上に保持した場合には、電極材上に固定化された酵素に補因子を供給する手段を設ける等、アポ形態の酵素を活性型のホロ形態に変換するための手段を設けることが必要となる。   A substance necessary for the enzyme to exhibit its catalytic activity may be immobilized on the electrode material together with the enzyme. For example, a mediator that mediates the catalytic reaction of the enzyme and the transfer of electrons between the electrodes may be immobilized together with the enzyme. Usable mediators are described above. When bilirubin oxidase is used as the positive electrode side enzyme, ABTS is preferably used as a mediator. In the case of an enzyme that requires a coenzyme or the like for exerting the catalytic activity of the enzyme, a substance necessary for activation can be immobilized on the electrode material together with the enzyme. Moreover, about the enzyme which requires a cofactor, the immobilized enzyme does not ask | require a distinction of an apo form and a holo form, but it is necessary to comprise so that activity can be exhibited in an electrode reaction. Therefore, when the apo form is held on the electrode material, a means for supplying a cofactor to the enzyme immobilized on the electrode material is provided, for example, to convert the apo form enzyme into an active holo form. It is necessary to provide means.

本実施形態のバイオ電池の電解質層は、プロトン等を透過できるイオン伝導性を有すると共に、プロトン等のイオン以外の負極構成成分、正極構成成分、及び電子を透過させないという性質を有する限り、その素材及び形状等に制限はない。例えば、固体電解質膜を利用して隔膜として構成することができる。固体電解質膜としては、スルホン基、リン酸基、ホスホン基、及びホスフィン基等の強酸基、カルボキシル基等の弱酸基、及び極性基を有する有機高分子等のイオン交換機能を有する固体膜等が例示されるが、これらに限定するものではない。具体的にはセルロース膜、及びテトラフルオロエチレンとパーフルオロ〔２−（フルオロスルフォニルエトキシ）プロピルビニルエーテル〕：tetrafluoroethyleneとperfluoro[2-(fluorosulfonylethoxy)propylvinyl ether]の共重合体であるナフィオン（登録商標）等のパーフルオロカーボンスルホン酸（PFS）系の樹脂膜を利用することができる。   The electrolyte layer of the biobattery of the present embodiment has its ionic conductivity capable of permeating protons and the like, as long as it has the property of not allowing negative electrode components other than ions such as protons, positive electrode components, and electrons to pass therethrough. There is no limitation on the shape and the like. For example, it can be configured as a diaphragm using a solid electrolyte membrane. Examples of the solid electrolyte membrane include a solid membrane having an ion exchange function such as an organic polymer having a strong acid group such as a sulfone group, a phosphate group, a phosphone group, and a phosphine group, a weak acid group such as a carboxyl group, and a polar group. Although illustrated, it is not limited to these. Specifically, cellulose film, tetrafluoroethylene and perfluoro [2- (fluorosulfonylethoxy) propyl vinyl ether]: Nafion (registered trademark) which is a copolymer of tetrafluoroethylene and perfluoro [2- (fluorosulfonylethoxy) propylvinyl ether], and the like Perfluorocarbon sulfonic acid (PFS) resin membranes can be used.

燃料タンクには、燃料が充填されている。燃料としては、負極側電極の触媒酵素によって進められる酸化還元反応により電子を放出可能な物質であれば特に制限はない。したがって、燃料は、グルコン酸脱水酵素の基質と成り得る物質であり、好ましくはグルコン酸を利用することができる。また、他の酵素と組み合わせて多段階反応系を構築した場合には、他の酵素の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、グルコース脱水素酵素と組み合わせてグルコースの多段階酸化系を構築した場合には、グルコース脱水素酵素の基質となる物質、特に好ましくはグルコース燃料とすることができる。   The fuel tank is filled with fuel. The fuel is not particularly limited as long as it is a substance that can release electrons by an oxidation-reduction reaction advanced by the catalytic enzyme of the negative electrode. Therefore, the fuel is a substance that can serve as a substrate for gluconate dehydrase, and preferably gluconic acid can be used. In addition, when a multistage reaction system is constructed in combination with other enzymes, it can be appropriately selected according to the type of the other enzyme. For example, when a multistage oxidation system of glucose is constructed in combination with glucose dehydrogenase, a substance that is a substrate for glucose dehydrogenase, particularly preferably glucose fuel can be used.

燃料は、適当な溶媒に溶解させた形態で供給する、若しくはゲルに燃料を封入させる等、バイオ燃料電池の構造に応じてその供給形態は適宜選択される。溶媒は、水性媒体であり、蒸留水の他、適当な緩衝液であってもよい。緩衝液に含まれる緩衝液成分としては、例えば、イミダゾール、炭酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）、4-（2-ヒドロキシエチル）−ピペラジン-1-エタン スルホン酸（HEPES）、3-モルフォリノプロパン スルホン酸（MOPS）等を例示することができる。これらは単独で用いてもよいが、２種以上を組み合わせて使用することができる。好ましくは、リン酸緩衝液である。ゲルとしては、アガロース、アガロペクチン、アラビアゴム、カラーギナン、コラーゲン、ゼラチン等の天然高分子、ポリアクリルアミド系重合体、ポリビニルアルコール系重合体、ポリビニルピロリドン系重合体、ポリビニルエーテル系重合体等の合成高分子等を好適に利用することができる。燃料には、活性化に必要な物質を電極材上に固定化された酵素に供給する手段を設けてもよい。必要に応じて、メディエータや補酵素等を含んで構成することができる。   The supply form of the fuel is appropriately selected according to the structure of the biofuel cell, such as being supplied in a form dissolved in an appropriate solvent, or encapsulating the fuel in a gel. The solvent is an aqueous medium, and may be an appropriate buffer in addition to distilled water. Examples of buffer components contained in the buffer include imidazole, carbonate, phosphate, borate, tartrate, citrate, tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS), 4- (2-hydroxy Examples thereof include ethyl) -piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES), 3-morpholinopropane sulfonic acid (MOPS), and the like. These may be used alone or in combination of two or more. A phosphate buffer is preferable. Gels include natural polymers such as agarose, agaropectin, gum arabic, color ginnan, collagen, gelatin, synthetic polymers such as polyacrylamide polymers, polyvinyl alcohol polymers, polyvinyl pyrrolidone polymers, polyvinyl ether polymers, etc. Etc. can be suitably used. The fuel may be provided with means for supplying a substance necessary for activation to the enzyme immobilized on the electrode material. If necessary, a mediator, a coenzyme and the like can be included.

本実施形態のバイオ燃料電池は、当該バイオ燃料電池内を満たす電極緩衝液としては、公知の緩衝液を利用することができる。緩衝液に含まれる緩衝液成分については上述した通りであるが、好ましくは、リン酸緩衝液である。電極触媒である酵素は、溶液のpHに非常に敏感であることから、電極緩衝液により酵素が機能しやすいpH付近に制御することが好ましい。したがって、大多数の酵素が中性付近で最大活性を示すことから、中性付近に調製することが好ましい。   In the biofuel cell of this embodiment, a known buffer solution can be used as the electrode buffer solution filling the biofuel cell. The buffer component contained in the buffer is as described above, and preferably a phosphate buffer. Since the enzyme that is an electrode catalyst is very sensitive to the pH of the solution, it is preferably controlled near the pH at which the enzyme can easily function with an electrode buffer. Therefore, since most enzymes show the maximum activity near neutrality, it is preferable to prepare near neutrality.

本実施形態のバイオ燃料電池の発電機構を説明すると、燃料が負極側に供給されると、負極側電極上の酵素の触媒作用によって燃料が酸化される。酵素の酸化に伴って生じる電子を導電性基材に伝達する。酵素から導電性基材への電子の伝達は、メディエータを介して行ってもよい。   The power generation mechanism of the biofuel cell of this embodiment will be described. When fuel is supplied to the negative electrode side, the fuel is oxidized by the catalytic action of the enzyme on the negative electrode. Electrons generated as a result of enzyme oxidation are transferred to the conductive substrate. The transfer of electrons from the enzyme to the conductive substrate may be performed via a mediator.

続いて、電子は負極側電極から外部回路を通って正極側電極に伝達され、電流が発生する。一方、酵素による燃料の酸化反応に伴い電子と共に生じたプロトンは電解質層を通って正極側に移行する。正極側電極上で、プロトンは大気から取り込んだ酸素と外部回路を通して移動してきた電子との反応により水を生成する。   Subsequently, the electrons are transmitted from the negative electrode to the positive electrode through an external circuit, and a current is generated. On the other hand, protons generated along with electrons accompanying the oxidation reaction of the fuel by the enzyme move to the positive electrode side through the electrolyte layer. On the positive electrode, protons generate water by a reaction between oxygen taken from the atmosphere and electrons moved through an external circuit.

本実施形態のバイオ燃料電池によれば、グルコン酸等を燃料としたバイオ電池を提供することができる。燃料としては、グルコン酸等のグルコン酸脱水酵素の基質となる物質を利用することができる。更に、グルコースの多段階酸化系において、グルコン酸酸化の前段階の反応を触媒するグルコース脱水素酵素等のグルコースを酸化しグルコン酸を生成する酵素と組み合わせることにより、グルコース等を燃料として利用することができる。多段階酸化系の構築により、グルコース等の燃料から取り出せる電子数が増しバイオ電池の出力を向上させることができる。本実施形態のバイオ電池によれば、医療、食品、環境等の分野において特に利用価値が高いバイオ電池を構築することができる。   According to the biofuel cell of this embodiment, a biocell using gluconic acid or the like as a fuel can be provided. As the fuel, a substance that becomes a substrate of gluconic acid dehydrase such as gluconic acid can be used. Furthermore, in a multistage oxidation system of glucose, glucose or the like is used as fuel by combining glucose such as glucose dehydrogenase that catalyzes the reaction in the previous stage of gluconate oxidation with an enzyme that generates gluconic acid. Can do. By constructing a multi-stage oxidation system, the number of electrons that can be extracted from a fuel such as glucose can be increased and the output of the biocell can be improved. According to the biobattery of this embodiment, it is possible to construct a biobattery that has a particularly high utility value in the fields of medicine, food, environment, and the like.

（バイオセンサー）
本実施形態のバイオセンサーＡは、本実施形態の酵素電極１を備え、バイオセンサーＡの電極、好ましくは作用電極として利用することができる。本実施形態のバイオセンサーＡは、本実施形態の酵素電極１を作用電極、及びその対極を設けて二電極方式で構成してもよいし、測定精度の信頼性を高める観点から、銀塩化銀等の参照極を設けた三電極方式として構成してもよい。 (Biosensor)
The biosensor A of the present embodiment includes the enzyme electrode 1 of the present embodiment, and can be used as an electrode of the biosensor A, preferably a working electrode. In the biosensor A of the present embodiment, the enzyme electrode 1 of the present embodiment may be configured by a two-electrode system by providing a working electrode and its counter electrode, and from the viewpoint of improving the reliability of measurement accuracy, silver / silver chloride You may comprise as a 3 electrode system which provided reference poles, such as.

本実施形態のバイオセンサーＡの一例を図１に模式的に示す。図１に示すバイオセンサーＡの酵素電極１は、集電体としての電極基材１０ａ上に多孔質炭素材１０ｂが積層した電極材１０上に酵素１１及びメディエータ１２が固定化されている。測定は、測定試料を本実施形態のバイオセンサーＡと接触させ、電極上の酵素１１と基質（検出対象物１００）の酸化還元反応により発生した電流を検出器２で検知することで行われ、これにより、試料中の基質（検出対象物１００）の存在の有無若しくは濃度を測定することができる。例えば、酸化電流もしくは還元電流を測定するクロノアンペロメトリー(Chrono amperometry)またはクーロメトリー、サイクリックボルタンメトリー(Cyclic voltammetry）法等、公知の方法を利用して測定することができる。   An example of the biosensor A of this embodiment is schematically shown in FIG. The enzyme electrode 1 of the biosensor A shown in FIG. 1 has an enzyme 11 and a mediator 12 immobilized on an electrode material 10 in which a porous carbon material 10b is laminated on an electrode substrate 10a as a current collector. The measurement is performed by bringing the measurement sample into contact with the biosensor A of the present embodiment, and detecting the current generated by the oxidation-reduction reaction between the enzyme 11 on the electrode and the substrate (detection target 100) with the detector 2, Thereby, the presence or absence or concentration of the substrate (detection target 100) in the sample can be measured. For example, it can be measured using a known method such as chronoamperometry, coulometry, or cyclic voltammetry for measuring an oxidation current or a reduction current.

本実施形態のバイオセンサーＡによれば、試料中のグルコン酸等のグルコン酸脱水酵素（酵素１１）の基質となる物質（検出対象物１００）を検出するためのバイオセンサーを提供することができる。また、本実施形態のバイオセンサーＡの酵素電極１の酵素１１がグルコース脱水素酵素等と共に多段階反応系を形成するものである場合には、グルコースの酸化還元反応においてグルコン酸脱水酵素の前段階のグルコース脱水素酵素の基質となる物質（検出対象物１００）の検出に利用することもでき、例えば血糖値等のグルコースの検出に利用することができる。本実施形態のバイオセンサーＡによれば、医療、食品、環境等の分野において特に利用価値が高いバイオセンサーＡを構築することができる。   According to the biosensor A of the present embodiment, it is possible to provide a biosensor for detecting a substance (detection target 100) that is a substrate of a gluconic acid dehydrating enzyme (enzyme 11) such as gluconic acid in a sample. . Further, when the enzyme 11 of the enzyme electrode 1 of the biosensor A of the present embodiment forms a multistage reaction system together with glucose dehydrogenase or the like, the preceding stage of gluconate dehydrase in the oxidation-reduction reaction of glucose It can also be used for the detection of a substance (detection target 100) that is a substrate for glucose dehydrogenase, for example, for the detection of glucose such as blood glucose level. According to the biosensor A of the present embodiment, it is possible to construct a biosensor A that is particularly useful in fields such as medical care, food, and environment.

以下に、本実施形態を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。   Hereinafter, the present embodiment will be described in detail by way of examples, but the present invention is not limited to these examples.

以下、実施例により詳細に説明する。   Hereinafter, the embodiment will be described in detail.

実施例１：グルコン酸酸化酵素の選択と合成確認
本実施例では、以下の実施例で使用するグルコン酸酸化酵素を選択し、当該グルコン酸酸化酵素の合成方法を確立するため、検証を行った。 Example 1: Selection of gluconate oxidase and confirmation of synthesis In this example, gluconate oxidase used in the following examples was selected, and verification was performed to establish a method for synthesizing the gluconate oxidase. .

（方法）
１．グルコン酸酸化酵素の選択
本実施例では、グルコン酸酸化酵素として、スルホロバス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）P2株由来のD-グルコン酸脱水酵素（D-gluconate dehydratase、ACCESSION Number:Q97U27）を選択した。スルホロバス属細菌は、好酸好熱性古細菌に属する細菌である。スルホロバス属細菌のような古細菌では、グルコースの分解機構である解糖系においてエムデン−マイヤーホフ（Embden-Meyerhof）経路ではなく、エントナー−ドウドロフ（Entner-Doudoroff）経路とピロ解糖系（Pyroglycolysis）を利用する。（参考文献３：http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/glyclysis.htmを参照）。ピロ解糖系では、グルコースは、グルコン酸を経て2-ケト-3-デオキシグルコン酸へと分解されていく。 (Method)
1. Selection of gluconate oxidase In this example, D-gluconate dehydratase (Accession Number: Q97U27) derived from Sulfolobus solfataricus P2 strain was selected as the gluconate oxidase. . Sulfolobus bacteria belong to the acidophilic thermophilic archaea. In archaebacteria such as the genus Sulfolobus, the Entner-Doudoroff pathway and pyroglycolysis are not used in the glycolysis system, which is the mechanism of glucose degradation, but in the Emden-Meyerhof pathway. Use. (See Reference 3: http://www.sc.fukuoka-u.ac.jp/~bc1/Biochem/glyclysis.htm). In the pyroglycolytic system, glucose is decomposed into 2-keto-3-deoxygluconic acid via gluconic acid.

２．グルコン酸酸化酵素の合成確認
上記でグルコン酸酸化酵素として選択したスルホロバス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）P2株由来のD-グルコン酸脱水酵素を大腸菌タンパク質合成系で合成するために、前記酵素をコードする遺伝子を発現プラスミドベクター（pET22b）にクローニングして大腸菌BL21(DE3)pLysS株を形質転換した。形質転換後の大腸菌をプレ培養（37℃、吸光度OD600=0.2）培養し、IPTG（0.2mM isopropyl thio-β-galactoside）を添加して、本培養（37℃、4時間）した（25ml）。発現菌体を緩衝液（20 mM Tris-HCl pH7.4）に懸濁し、界面活性剤（0.4％ Brij-58）を加えて氷中で30分間放置した。菌体を超音波破砕し、遠心分離（42,000×g、30分間）後の上澄み液を、酵素発現菌体の溶菌液として分取した。次に、アフィニティー担体を用いて酵素を精製した。具体的には、ヒスチジンタグ融合タンパク質精製用金属アフィニティー担体TALON（クロンテック）をオープンカラムに適当量充填し、50 mM リン酸ナトリウム、0.3 M NaCl溶液で前洗浄後、発現菌体の破砕液に0.3 M NaClを加えてカラムにアプライした。50 mM リン酸ナトリウム、5 mMイミダゾール、0.3 M NaCl溶液で洗浄後、50 mM リン酸ナトリウム、150 mMイミダゾール、0.3 M NaCl溶液で酵素を溶出した。溶出に使用した塩類を除去するために緩衝液（25 mM Tris-HCl pH7.4）に対して透析した。界面活性剤（Brij（登録商標）58）処理後の酵素発現菌体、超音波破砕後の酵素発現菌体破砕液、遠心分離後の上澄み画分、遠心分離後の沈殿画分につき、アクリルアミドゲル電気泳動を行った。また、大腸菌発現菌体の溶菌液を限外ろ過（Amicon Ultra-4 10K）により分子量分画の処理を行ったものについても同様にアクリルアミドゲル電気泳動を行った。 2. Confirmation of synthesis of gluconate oxidase In order to synthesize D-gluconate dehydrase derived from Sulfolobus solfataricus P2 strain selected as gluconate oxidase in the E. coli protein synthesis system, the above enzyme is encoded. The cloned gene was cloned into an expression plasmid vector (pET22b) and transformed into E. coli BL21 (DE3) pLysS. The transformed Escherichia coli was precultured (37 ° C, absorbance OD 600 = 0.2), IPTG (0.2 mM isopropyl thio-β-galactoside) was added, and main culture (37 ° C, 4 hours) was performed (25 ml) . The expressed cells were suspended in a buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4), a surfactant (0.4% Brij-58) was added, and the mixture was allowed to stand in ice for 30 minutes. The cells were sonicated and the supernatant after centrifugation (42,000 × g, 30 minutes) was collected as a lysate of enzyme-expressing cells. Next, the enzyme was purified using an affinity carrier. Specifically, an appropriate amount of a metal affinity carrier TALON (Clontech) for purifying histidine-tagged protein is packed in an open column, pre-washed with 50 mM sodium phosphate, 0.3 M NaCl solution, and then added to the disruption solution of the expressed cells. M NaCl was added and applied to the column. After washing with 50 mM sodium phosphate, 5 mM imidazole, and 0.3 M NaCl solution, the enzyme was eluted with 50 mM sodium phosphate, 150 mM imidazole, and 0.3 M NaCl solution. Dialyzed against buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.4) to remove salts used for elution. Acrylamide gel for enzyme-expressing bacterial cells after treatment with surfactant (Brij (registered trademark) 58), enzyme-expressing bacterial cell disrupted solution after ultrasonic disruption, supernatant fraction after centrifugation, and precipitated fraction after centrifugation Electrophoresis was performed. In addition, acrylamide gel electrophoresis was also performed on a lysate of Escherichia coli-expressing cells that had been subjected to molecular weight fractionation by ultrafiltration (Amicon Ultra-4 10K).

（結果）
結果を図２に示す。図２のレーン１は、界面活性剤（Brij（登録商標）58）処理後の酵素発現菌体、レーン２は、超音波破砕後の酵素発現菌体破砕液、レーン３は、酵素発現菌体破砕液（レーン２）の遠心分離後の上澄み画分（酵素発現菌体の溶菌液）、レーン４は、酵素発現菌体破砕液（レーン２）の遠心分離後の沈殿画分、レーン５は、酵素発現菌体の溶菌液（レーン３）を限外ろ過で２０倍濃縮した酵素発現菌体の溶菌液の濃縮液（酵素溶液１）、レーン６は、酵素発現菌体の溶菌液（レーン３）を限外ろ過で１０倍濃縮し、水で２０倍希釈して、更に２０倍濃縮した酵素発現菌体の溶菌液の濃縮液（酵素溶液２）の電気泳動結果、レーンMは分子量マーカーを示す。また、アフィニティー精製を行ったサンプルについても同様に電気泳動を行ったが、酵素由来のバンドを確認できなかった（結果は図示せず）。これらの結果から、スルホロバス・ソルファタリクス P2株由来のグルコン酸脱水酵素は、大腸菌タンパク質発現系で効率よく発現する。しかしながら、酵素溶液の精製度が上がると不溶性となることが理解できる。さらに、精製した酵素の加熱処理（70℃）や、大腸菌の低温発現も試みたが、まったく同じ結果となった。 (result)
The results are shown in FIG. In FIG. 2, lane 1 is an enzyme-expressing cell after treatment with a surfactant (Brij (registered trademark) 58), lane 2 is an enzyme-expressing cell lysate after ultrasonic disruption, and lane 3 is an enzyme-expressing cell. The supernatant fraction after centrifugation of the disrupted liquid (lane 2) (the lysate of enzyme-expressing bacterial cells), lane 4 is the precipitate fraction after centrifugation of the enzyme-expressed bacterial cell disrupted liquid (lane 2), and lane 5 is Enzyme-expressing bacterial cell lysate (lane 3) was concentrated 20 times by ultrafiltration, enzyme-expressing bacterial cell lysate concentrate (enzyme solution 1), and lane 6 was enzyme-expressing bacterial cell lysate (lane) 3) Concentrated by ultrafiltration 10-fold, diluted 20-fold with water, and further 20-fold concentrated lysate of enzyme-expressing bacterial cell lysate (enzyme solution 2), Lane M is molecular weight marker Indicates. Moreover, although the electrophoresis was similarly performed about the sample which performed affinity purification, the band derived from an enzyme was not able to be confirmed (a result is not shown in figure). From these results, gluconate dehydrase derived from Sulfolobas solfatalix strain P2 is efficiently expressed in the E. coli protein expression system. However, it can be understood that it becomes insoluble as the purity of the enzyme solution increases. Furthermore, heat treatment (70 ° C) of the purified enzyme and low-temperature expression of E. coli were attempted, but the results were exactly the same.

実施例２．多孔質電極材の検討
本実施例では、グルコン酸脱水酵素の発現菌体の溶菌液を、酵素電極の酵素部材として使用するために、酵素分子を内包できる細孔を有する多孔質炭素の電極材を検討した。なお、酵素分子として、グルコース脱水素酵素を用いて多孔質炭素の電極材、及び電極緩衝液の検討を行った。 Example 2 Examination of porous electrode material In this example, in order to use a lysate of bacterial cells expressing gluconic acid dehydrase as an enzyme member of an enzyme electrode, a porous carbon electrode material having pores that can encapsulate enzyme molecules It was investigated. In addition, the electrode material and electrode buffer of porous carbon were examined using glucose dehydrogenase as an enzyme molecule.

（方法）
１．電池セルの作製
電池セルの負極側電極と正極側電極を、以下に示す方法で作製した。 (Method)
1. Production of Battery Cell A negative electrode and a positive electrode of the battery cell were produced by the following method.

1-1．負極側電極の調製
負極側の電極材として、炭素電極材を多孔質炭素微粒子で修飾した電極材（以下、「多孔質炭素電極材」と称する場合がある）と、多孔質炭素微粒子による修飾がなされていない炭素電極材をそのまま電極材としたものを作製した。 1-1. Preparation of Negative Electrode Side Electrode As a negative electrode material, an electrode material obtained by modifying a carbon electrode material with porous carbon fine particles (hereinafter sometimes referred to as “porous carbon electrode material”), and modification with porous carbon fine particles A carbon electrode material that was not made was used as an electrode material.

1-1-1．多孔質炭素電極を利用した負極側電極
多孔質炭素微粒子（0.4 g）、20％PVDF溶液（0.8 g、KFポリマー、クレハ・バッテリー・マテリアルズ・ジャパン）、N-メチル-2-ピロリドン（8 ml）を混合し、超音波処理（15 W、5 分間）して炭素インクを作製した。電極材（日本カーボンGF-20、2 cm × 2 cm）を炭素インクに浸して引き揚げ、ガラス板上で乾熱乾燥（60℃）させた。メディエータ（1,4-ナフトキノン溶液、アセトニトリル中で8 mg）を電極材に滴下し、減圧デシケータ内で乾燥させた。このようにして調製した電極材に、1M リン酸カリウム pH7.0中にグルコース脱水素酵素（2〜10 mg、測定は2 mg）を含んで調製した溶液を滴下し、減圧
デシケータ内で乾燥させた。ここで用いたグルコース脱水素酵素は、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）NBRC12552株由来のPQQ依存可溶性グルコース脱水素酵素である。かかる酵素の作製方法及び配列情報は特開2013-45647号に開示されている。 1-1-1. Negative electrode using porous carbon electrode Porous carbon fine particles (0.4 g), 20% PVDF solution (0.8 g, KF polymer, Kureha Battery Materials Japan), N-methyl-2-pyrrolidone (8 ml) ) Were mixed and sonicated (15 W, 5 minutes) to produce a carbon ink. An electrode material (Nihon Carbon GF-20, 2 cm × 2 cm) was dipped in carbon ink and then lifted and dried on a glass plate by dry heat (60 ° C.). Mediator (1,4-naphthoquinone solution, 8 mg in acetonitrile) was added dropwise to the electrode material and dried in a vacuum desiccator. A solution prepared by containing glucose dehydrogenase (2 to 10 mg, measurement is 2 mg) in 1 M potassium phosphate pH 7.0 is added dropwise to the electrode material thus prepared, and dried in a vacuum desiccator. It was. The glucose dehydrogenase used here is a PQQ-dependent soluble glucose dehydrogenase derived from Acinetobacter calcoaceticus NBRC12552 strain. A method for producing such an enzyme and sequence information are disclosed in JP-A-2013-45647.

1-1-2．多孔質炭素微粒子による修飾がなされていない炭素電極材を利用した負極側電極
多孔質炭素微粒子を使用しなかったことを除いては、上記1-1-1と同様に作製した。 1-1-2. Negative electrode using a carbon electrode material that is not modified with porous carbon fine particles A porous electrode was prepared in the same manner as 1-1-1 above, except that porous carbon fine particles were not used.

1-2．正極側電極の調製
MgO多孔質炭素微粒子（0.4 g：平均細孔径35 nm、東洋炭素）、PTFE（0.4g、PTFE ６J、三井・デュポンフロロケミカル）、イソプロパノール（8 ml）を混合し、超音波処理（15 W、5 分間）してカーボンスラリーを作製した。電極基材としてカーボンクロス（日本カーボンGF-20、2 cm × 2 cm）をカーボンスラリーに浸漬することにより、多孔質炭素微粒子を塗布した。これをガラス板上で乾熱乾燥（60℃、6時間）させた。このようにして調製した電極材に、1M リン酸カリウム pH7.0中に酵素（MvBOD, 2〜10 mg、測定は5 mg：アマノエンザイムBO“Amano”3）とメディエータ（ABTS：2,2'-アジノ-
ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)、Milli-Q水中で5 mg）を含んで調製した溶液を滴下し、減圧デシケータ内で乾燥させた。 1-2. Preparation of positive electrode
MgO porous carbon fine particles (0.4 g: average pore diameter 35 nm, Toyo Tanso), PTFE (0.4 g, PTFE 6J, Mitsui / DuPont Fluorochemical), isopropanol (8 ml) are mixed and sonicated (15 W, 5 minutes) to prepare a carbon slurry. Porous carbon fine particles were applied by immersing carbon cloth (Nihon Carbon GF-20, 2 cm × 2 cm) as an electrode substrate in carbon slurry. This was dry-heat dried (60 ° C., 6 hours) on a glass plate. In the electrode material thus prepared, enzyme (MvBOD, 2 to 10 mg, measurement is 5 mg: Amanoenzyme BO “Amano” 3) and mediator (ABTS: 2,2 ′) in 1M potassium phosphate pH 7.0 -Azino-
A solution containing bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) and 5 mg in Milli-Q water was added dropwise and dried in a vacuum desiccator.

1-3．電池セル
1-3-1．電池セル（負極材：多孔質炭素電極材＋電極緩衝液：イミダゾール）
上記1-1-1で作製した負極側電極（多孔質炭素電極材）及び上記1-2で作製した正極側電極を用い、負極側にはグルコース溶液（1M、400μl）、正極側には電極緩衝液（1 Mイミダゾール、200μl）を添加し、両極をセルロース膜で挟んで、電池セルの筐体の電極部に入れた。 1-3. Battery cell
1-3-1. Battery cell (negative electrode material: porous carbon electrode material + electrode buffer solution: imidazole)
Using the negative electrode (porous carbon electrode material) prepared in 1-1-1 above and the positive electrode prepared in 1-2 above, a glucose solution (1M, 400 μl) on the negative electrode side, and an electrode on the positive electrode side A buffer solution (1 M imidazole, 200 μl) was added, and both electrodes were sandwiched between cellulose membranes and placed in the electrode part of the battery cell casing.

1-3-2．電池セル（負極材：多孔質微粒子を使用しない炭素電極材＋電極緩衝液：イミダゾール）
負極側電極として、上記1-1-2で作製した多孔質炭素微粒子による修飾がなされていない炭素電極材を用いた以外は、上記1-3-1と同様にして作製した（比較例）。 1-3-2. Battery cell (negative electrode material: carbon electrode material not using porous fine particles + electrode buffer solution: imidazole)
A negative electrode was prepared in the same manner as in 1-3-1 above except that the carbon electrode material not modified with the porous carbon fine particles prepared in 1-1-2 was used (Comparative Example).

1-3-3．電池セル（負極側電極材：多孔質炭素電極材＋電極緩衝液：リン酸緩衝液）
電極緩衝液として、リン酸緩衝液（1 M リン酸カリウム pH7.0）を使用した以外は、上記1-3-1と同様にして作製した（比較例）。 1-3-3. Battery cell (negative electrode material: porous carbon electrode material + electrode buffer solution: phosphate buffer solution)
The electrode buffer solution was prepared in the same manner as in 1-3-1 above except that a phosphate buffer solution (1 M potassium phosphate pH 7.0) was used (Comparative Example).

２．測定方法
電子負荷装置を使い、上記で作製した電池セルに一定電流（1 mA/cm2）を付加して電圧変化を測定した。 2. Measurement Method Using an electronic load device, a voltage change was measured by applying a constant current (1 mA / cm 2 ) to the battery cell produced above.

（結果）
上記で作製した電池セルの放電特性を調べた結果を図３及び図４に示す。図３は、波形１及び波形２ともに、電極緩衝液としてイミダゾールを使用した結果であり、波形１は、負極側電極材として多孔質炭素微粒子で修飾して作製したものを使用して作製した電池セル（1-3-1）、波形２は、負極側電極材として多孔質炭素微粒子で修飾せずに作製したものを使用して作製した電池セル（1-3-2）での結果を示す。これらの結果、波形１の方が、高い電気変換効率を得ることができた。多孔質炭素の細孔に酵素分が内包されることで、グルコース→酵素→メディエータ→電極材への電子伝達効率が向上したと理解できる。 (result)
The results of examining the discharge characteristics of the battery cells produced above are shown in FIGS. FIG. 3 shows the results of using imidazole as an electrode buffer solution for both waveform 1 and waveform 2, and waveform 1 is a battery manufactured using a negative electrode material modified with porous carbon fine particles. Cell (1-3-1), waveform 2 shows the results of a battery cell (1-3-2) produced using a negative electrode material produced without modification with porous carbon fine particles. . As a result, the waveform 1 was able to obtain higher electrical conversion efficiency. It can be understood that the efficiency of electron transfer from glucose → enzyme → mediator → electrode material is improved by the inclusion of the enzyme in the pores of the porous carbon.

図４は、波形３及び波形４ともに、負極側電極材として多孔質炭素微粒子で修飾して作製したものを使用して作製した電池セルでの結果であり、波形３は、図３の波形１と同じ電極緩衝液としてイミダゾールを使用した電池セル（1-3-1）での結果、波形４は、電極緩衝液としてリン酸緩衝液を使用した電池セル（1-3-3）での結果を示す。これらの結果、波形４の方が、高い電気変換効率を得ることができた。バイオ電池の電極緩衝液として従来から汎用されているイミダゾールより、リン酸緩衝液の方がグルコース燃料の電気変換効率は1.3倍向上した。   FIG. 4 shows the results of the battery cell produced using both the waveform 3 and the waveform 4 that were prepared by modifying the negative electrode material with the porous carbon fine particles, and the waveform 3 is the waveform 1 of FIG. Results for battery cell (1-3-1) using imidazole as the same electrode buffer as in Fig. 4, waveform 4 shows results for battery cell (1-3-3) using phosphate buffer as the electrode buffer Indicates. As a result, the waveform 4 was able to obtain higher electrical conversion efficiency. Compared to imidazole, which has been widely used as an electrode buffer solution for biocells, the phosphate buffer solution improved the electrical conversion efficiency of glucose fuel by 1.3 times.

実施例３：グルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極の電気化学性能
本実施例では、実施例２にて、酵素電極の性能測定系として、電池セルの放電特性を指標にした測定系が構築できたことから、この測定系を使いグルコン酸脱水酵素の大腸菌発現菌体の溶菌液の濃縮液を、負極側電極材に固定化して、電池セルの放電特性を検討した。 Example 3: Electrochemical performance of an enzyme electrode having gluconic acid oxidation catalytic ability In this example, in Example 2, a measurement system using the discharge characteristics of battery cells as an index can be constructed as a performance measurement system of the enzyme electrode. Therefore, using this measurement system, the lysate of the Escherichia coli expressing cells of gluconic acid dehydrase was immobilized on the negative electrode material, and the discharge characteristics of the battery cells were examined.

（方法）
１．電池セルの作製
負極側電極用の電極触媒として、グルコース脱水素酵素のみを使用した電池セル、及び、グルコース脱水素酵素とグルコン酸脱水酵素を使用した電池セルの２種類を作製した。 (Method)
1. Production of Battery Cell As an electrode catalyst for the negative electrode, two types were produced: a battery cell using only glucose dehydrogenase, and a battery cell using glucose dehydrogenase and gluconate dehydrase.

1-1．電池セル（負極側電極触媒：グルコース脱水素酵素のみ）
負極側に添加したグルコース溶液として、グルコース溶液（1M、200μl）を用いた以外は、実施例２の1-3-1と同様にして電池セルを作製した。 1-1. Battery cell (Negative electrode catalyst: glucose dehydrogenase only)
A battery cell was produced in the same manner as in 1-3 of Example 2 except that a glucose solution (1 M, 200 μl) was used as the glucose solution added to the negative electrode side.

1-2．電池セル（負極側電極触媒：グルコース脱水素酵素＋グルコン酸脱水酵素）
負極側電極材に、実施例１で作製したグルコン酸脱水酵素の大腸菌発現菌体の溶菌液を限外ろ過（Amicon Ultra-4 10K）により分子量分画の処理を行ったものを、グルコース脱水素酵素と共に固定化した以外は、上記1-1と同様にして作製した。ここで用いたグルコン酸脱水酵素の大腸菌発現菌体の溶菌液は、酵素発現菌体の培養液（25 ml）から得られる菌体破砕液（遠心分離後の上澄み液）を全量使用したものであり、これを限外ろ過により20倍に濃縮した（実施例１の酵素溶液１に相当）。 1-2. Battery cell (Negative electrode catalyst: glucose dehydrogenase + gluconate dehydrase)
Glucose dehydrogenation was obtained by subjecting the negative electrode material to a lysate of Escherichia coli expressing gluconate dehydrase prepared in Example 1 by ultrafiltration (Amicon Ultra-4 10K) to molecular weight fractionation. It was prepared in the same manner as 1-1 above except that it was immobilized together with the enzyme. The lysate of Escherichia coli-expressing cells of gluconic acid dehydrase used here is the one using the whole amount of the cell disruption solution (the supernatant after centrifugation) obtained from the enzyme-expressing cell culture (25 ml). Yes, this was concentrated 20 times by ultrafiltration (corresponding to enzyme solution 1 of Example 1).

２．測定方法
実施例２と同様にして、電池セルに一定電流を付加して電圧変化を測定した。 2. Measurement Method In the same manner as in Example 2, a voltage change was measured by applying a constant current to the battery cell.

（結果）
結果を図５に示す。図５の波形１は、負極側電極触媒としてグルコース脱水素酵素のみを使用した電池セル（1-1）での結果（実施例２の結果を示す図４の波形４と同じ条件）を、図５の波形２は、負極側電極触媒としてグルコース脱水素酵素とグルコン酸脱水酵素の２種の酵素を使用した電池セル（1-2）での結果を示す。これらの結果から、グルコース脱水素酵素の１種のみの酵素では約12,300sec（セル電圧0.1V低下時）であるのに対して、グルコース脱水素酵素とグルコン酸脱水酵素の2種の酵素では約24,500sec（同電圧）となり、酵素２種では発電持続時間が２倍になることが判明した。これは、酵素２種を固定化した負極側電極では、メディエータ（1,4-ナフトキノン）との組み合わせで、グルコン酸が酸化される時の電子伝達反応のよるものと推定される。 (result)
The results are shown in FIG. Waveform 1 in FIG. 5 shows the result (same condition as waveform 4 in FIG. 4 showing the result of Example 2) in the battery cell (1-1) using only glucose dehydrogenase as the negative electrode catalyst. Waveform 2 in FIG. 5 shows the results in the battery cell (1-2) using two types of enzymes, glucose dehydrogenase and gluconate dehydrase, as the negative electrode catalyst. From these results, it is about 12,300 seconds (when the cell voltage is reduced by 0.1V) for only one enzyme of glucose dehydrogenase, but about two enzymes, glucose dehydrogenase and gluconate dehydrase, It became 24,500 seconds (same voltage), and it was found that the duration of power generation was doubled with the two enzymes. This is presumably due to the electron transfer reaction when gluconic acid is oxidized in combination with a mediator (1,4-naphthoquinone) in the negative electrode on which two kinds of enzymes are immobilized.

なお、電圧0.1V低下時に付加電流が停止するため、その後の電池セルの電圧は、初期値まで戻ることも確認でき、本実施例で作製した電極は安定性も有していることが理解できる。   In addition, since the additional current stops when the voltage decreases by 0.1 V, it can be confirmed that the voltage of the subsequent battery cell returns to the initial value, and it can be understood that the electrode manufactured in this example also has stability. .

実施例４：グルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極の反応生成物解析
実施例３にて、グルコース脱水素酵素及びグルコン酸脱水酵素を電極触媒とする酵素電極が、グルコースの２段階酸化系が機能していることが確認された。これをうけ、本実施例では、実施例３にて使用したグルコン酸脱水酵素による反応生成物の解析をガスクロマトグラフィー（GCMS）により行った。 Example 4: Analysis of reaction product of enzyme electrode having gluconate oxidation catalytic ability In Example 3, an enzyme electrode using glucose dehydrogenase and gluconate dehydrase as an electrode catalyst functions as a two-stage glucose oxidation system. It was confirmed that In response to this, in this example, the analysis of the reaction product by the gluconic anhydrase used in Example 3 was performed by gas chromatography (GCMS).

（方法）
1．酵素反応
25mMリン酸カリウム pH7.0、1mM グルコン酸（基質）、酵素液、0.1mM DCIPとなるように酵素反応溶液を調製し、40℃で30分間反応させ、等量のクロロホルムを加えて撹拌して反応を停止した。酵素は、実施例３で電極材に固定したものと同じ発現菌体の溶菌液の濃縮液を使用した。また、酵素を添加しないで調製したことを除いては上記と同様にして調製したものをコントロールとした。 (Method)
1． Enzymatic reaction
Prepare 25 mM potassium phosphate pH 7.0, 1 mM gluconic acid (substrate), enzyme solution, and 0.1 mM DCIP. Prepare an enzyme reaction solution, react at 40 ° C for 30 minutes, add an equal volume of chloroform, and stir. The reaction was stopped. The enzyme used was the same lysate concentrate of the bacterial cells that were expressed in Example 3 as fixed to the electrode material. A control prepared in the same manner as above except that the enzyme was not added was used as a control.

2．GCMS試料の調製
反応停止後の酵素反応液の上清10μLを、ガラスバイアルに採取し、N2ガス吹き付けにより乾固処理した。続いて、メトキシアミン塩酸塩/ピリジン（20mg/mL）を50μL添加し、30℃で90分間インキュベートした。MSTFAを50μL添加し、37℃で30分間インキュベートした後、GCMSで解析を行った。 2． Preparation of GCMS sample 10 μL of the supernatant of the enzyme reaction solution after stopping the reaction was collected in a glass vial and dried by N 2 gas blowing. Subsequently, 50 μL of methoxyamine hydrochloride / pyridine (20 mg / mL) was added and incubated at 30 ° C. for 90 minutes. After adding 50 μL of MSTFA and incubating at 37 ° C. for 30 minutes, analysis was performed by GCMS.

3．GCMS条件
GCMS条件は以下の通りである。
GCMS使用機器：SHIMADZU OP-2010 Ultra
Auto Sampler：SHIMADZU AOC-5000 Plus
使用カラム：Agilent Technologies DB-5 30m 0.250mm 1.00μm
気化室温度：280℃
オーブン温度：100℃(Duration 4min)-Rate 4℃/min-320℃(Duration 8min)
連結部温度：280℃
イオン源温度：200℃
イオン化法：EI
試料導入法：Splitless
Flow Rate：39cm/sec(1.1mL/min)
Scan Speed：2000u/sec
MassRange：m/z=45-600
試料注入量：1mL 3． GCMS conditions
GCMS conditions are as follows.
GCMS equipment: SHIMADZU OP-2010 Ultra
Auto Sampler: SHIMADZU AOC-5000 Plus
Column used: Agilent Technologies DB-5 30m 0.250mm 1.00μm
Vaporization chamber temperature: 280 ℃
Oven temperature: 100 ℃ (Duration 4min) -Rate 4 ℃ / min-320 ℃ (Duration 8min)
Connection temperature: 280 ° C
Ion source temperature: 200 ° C
Ionization method: EI
Sample introduction method: Splitless
Flow Rate: 39cm / sec (1.1mL / min)
Scan Speed: 2000u / sec
MassRange: m / z = 45-600
Sample injection volume: 1mL

（結果）
結果を図６に示す。図６は、反応生成物のGCMS解析の結果を示すものである。酵素を添加しなかったコントロールでは、添加基質であるグルコン酸のみが検出した。一方、グルコン酸酸化酵素を添加することにより、グルコン酸脱水酵素の反応生成物である2-ケト-3-デオキシグルコン酸の検出が確認された。これらの結果から、グルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極はグルコン酸の酸化反応を触媒し、実施例３で確認されたグルコースの２段階酸化系は、グルコース脱水素酵素及びグルコン酸脱水酵素によるものであることを証明することができる。 (result)
The results are shown in FIG. FIG. 6 shows the results of GCMS analysis of the reaction product. In the control to which no enzyme was added, only the added substrate, gluconic acid, was detected. On the other hand, the addition of gluconate oxidase confirmed the detection of 2-keto-3-deoxygluconate, which is a reaction product of gluconate dehydrase. From these results, the enzyme electrode having the ability to catalyze gluconate oxidation catalyzes the oxidation reaction of gluconic acid, and the two-stage glucose oxidation system confirmed in Example 3 is based on glucose dehydrogenase and gluconate dehydrase. It can be proved that.

本発明は、酵素電極、酵素電極の作製方法、バイオ電池、及びバイオセンサーに関し、これらが要求されるあらゆる分野、特に、電子、医療、食品、環境分野等の産業分野において利用可能である。   The present invention relates to an enzyme electrode, a method for producing the enzyme electrode, a biobattery, and a biosensor, and can be used in all fields where these are required, particularly in industrial fields such as electronics, medical care, food, and the environment.

バイオセンサー Ａ
酵素電極 １
電極材 １０
電極基材（集電体） １０ａ
多孔質炭素材 １０ｂ
酵素 １１
メディエータ １２
検出器 ２
検出対象物 １００ Biosensor A
Enzyme electrode 1
Electrode material 10
Electrode substrate (current collector) 10a
Porous carbon material 10b
Enzyme 11
Mediator 12
Detector 2
Object to be detected 100

Claims (7)

スルホロバス属細菌由来のグルコン酸脱水酵素を電極材に固定したグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極。   An enzyme electrode having a gluconic acid oxidation catalytic ability, wherein a gluconic acid dehydrating enzyme derived from a bacterium belonging to the genus Sulfolobus is immobilized on an electrode material. 前記電極材が、平均直径が30〜40nmの細孔を備える多孔質構造を有する炭素基材を含む請求項１に記載のグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極。   The enzyme electrode having gluconic acid oxidation catalytic ability according to claim 1, wherein the electrode material includes a carbon base material having a porous structure having pores having an average diameter of 30 to 40 nm. スルホロバス属細菌由来のグルコン酸脱水酵素を電極材に固定したグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極の作製方法であって、
（i）糖鎖修飾能を有しない細菌をスルホロバス属細菌由来のグルコース脱水酵素をコードする遺伝子で形質転換し、組換えグルコン酸脱水酵素を発現した発現菌体を調製する工程、
（ii）前記発現菌体を界面活性剤と接触させる工程、
（iii）前記界面活性剤処理後の発現菌体を破砕して、発現菌体破砕液を調製する工程、
（iv）前記発現菌体破砕液中の菌体残渣を分離除去して、発現菌体の溶菌液を調製する工程、
（v）前記発現菌体の溶菌液を濃縮し、発現菌体の溶菌液の濃縮液を調製する工程、
（vi）前記発現菌体の溶菌液の濃縮液を前記電極材に固定化する工程、を備えるグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極の作製方法。 A method for producing an enzyme electrode having a gluconic acid oxidation catalytic ability in which a gluconic acid dehydrating enzyme derived from a sulfolobas bacterium is immobilized on an electrode material,
(I) a step of transforming a bacterium having no sugar chain-modifying ability with a gene encoding glucose dehydrase derived from a bacterium belonging to the genus Sulfolobus, and preparing an expression cell expressing recombinant gluconate dehydrase;
(Ii) a step of bringing the expressed cells into contact with a surfactant;
(Iii) a step of crushing the expressed bacterial cells after the surfactant treatment to prepare an expressed bacterial cell disruption solution,
(Iv) a step of separating and removing the bacterial cell residue in the expressed bacterial cell disruption solution to prepare a lysate of the expressed bacterial cell;
(V) a step of concentrating the lysate of the expressed cells to prepare a concentrated solution of the lysate of the expressed cells,
(Vi) A method for producing an enzyme electrode having a gluconic acid oxidation catalytic ability, comprising a step of immobilizing a concentrated solution of the lysate of the expressed cells on the electrode material. 前記電極材が、平均直径が30〜40nmの細孔を備える多孔質構造を有する炭素基材を含む請求項３に記載のグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極の作製方法。   The method for producing an enzyme electrode having gluconic acid oxidation catalytic ability according to claim 3, wherein the electrode material includes a carbon base material having a porous structure having pores having an average diameter of 30 to 40 nm. 前記多孔質構造を有する炭素基材を、炭素前駆体と酸化マグネシウム前駆体との混合物を焼成し、得られた焼成物から酸化マグネシウムを除去することによって調製する工程、を有する請求項４に記載のグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極の作製方法。   The carbon substrate having the porous structure is prepared by firing a mixture of a carbon precursor and a magnesium oxide precursor, and removing magnesium oxide from the obtained fired product. Of producing an enzyme electrode having the ability to catalyze gluconic acid oxidation. 請求項１又は２に記載のグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極、若しくは、請求項３〜５の何れか一項に記載のグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極の作製方法によって作製されたグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極を負極側電極として備えるバイオ電池。   Glucon produced by the method for producing an enzyme electrode having gluconic acid oxidation catalytic ability according to claim 1 or 2, or an enzyme electrode having gluconic acid oxidation catalytic ability according to any one of claims 3 to 5. A biocell comprising an enzyme electrode having acid oxidation catalytic ability as a negative electrode. 請求項１又は２に記載のグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極、若しくは、請求項３〜５の何れか一項に記載のグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極の作製方法によって作製されたグルコン酸酸化触媒能を有する酵素電極を作用電極として備えるバイオセンサー。   Glucon produced by the method for producing an enzyme electrode having gluconic acid oxidation catalytic ability according to claim 1 or 2, or an enzyme electrode having gluconic acid oxidation catalytic ability according to any one of claims 3 to 5. A biosensor comprising an enzyme electrode having acid oxidation catalytic ability as a working electrode.
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