JP2017195871A - Reagents for extraction and amplification of nucleic acid from virus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、簡便、迅速かつ高効率にウイルスから核酸を抽出して増幅するための試薬、および前記試薬を用いた核酸抽出および増幅方法に関する。 The present invention relates to a reagent for extracting and amplifying a nucleic acid from a virus simply, rapidly and with high efficiency, and a nucleic acid extraction and amplification method using the reagent.
感染症の臨床検査分野においては、外来での診療中に正確な検査結果を得て適切な治療を施す等の目的から、簡便、迅速かつ高感度に病原体を検出することが重要である。例えば、毎年冬季に流行を繰り返すインフルエンザウイルス感染症の検査では、感染初期での投与で高い効果を発揮する治療薬が存在することもあり、迅速検査キットが広く普及している。 In the field of clinical examination of infectious diseases, it is important to detect pathogens simply, quickly and with high sensitivity for the purpose of obtaining accurate test results during outpatient treatment and providing appropriate treatment. For example, in the inspection of influenza virus infections, which are prevalent every winter, rapid therapeutic kits are widely used because there may be therapeutic agents that exert high effects when administered at the early stage of infection.
このような迅速検査法の原理としては、イムノクロマト法による検出法が最も用いられている。しかしながら、イムノクロマト法による検出法は検出感度が低いため、感染初期など検体中の病原体数が少ない場合には検出できないことが課題となっている。 As the principle of such a rapid inspection method, a detection method by an immunochromatography method is most used. However, since the detection method by the immunochromatography method has low detection sensitivity, there is a problem that it cannot be detected when the number of pathogens in the sample is small, such as in the early stage of infection.
イムノクロマト法よりも高感度に病原体を検出する方法として、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＴＭＡ法（特許文献１）、ＴＲＣ法（特許文献２、非特許文献１）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献３および４）等の核酸増幅法を利用した検出法が知られている。核酸増幅法を利用した検出法は、病原体の有する核酸を特異的に増幅して検出するため、当該病原体を迅速かつ高感度に検出できる可能性を有している。 RT-PCR method, TMA method (Patent Document 1), TRC method (Patent Document 2, Non-Patent Document 1), NASBA method (Patent Documents 3 and 4), etc. A detection method using the nucleic acid amplification method is known. Since the detection method using the nucleic acid amplification method specifically detects and detects the nucleic acid contained in the pathogen, the pathogen can be detected quickly and with high sensitivity.
核酸増幅法を利用した検出法で病原体の検出を行なう際は、一般に病原体を含む試料から核酸を抽出する操作を事前に行なう。病原体、特にウイルスから核酸を抽出する方法としては、界面活性剤やグアニジンといったタンパク質変性剤や、フェノールやクロロホルムといった有機溶媒を使用する方法が知られている（特許文献５および６）。しかしながら、これらタンパク質変性剤や有機溶媒は核酸増幅反応を阻害するため、抽出工程の後にこれらを除去するための精製工程が必要となり、煩雑で時間のかかる操作を要する。 When a pathogen is detected by a detection method using a nucleic acid amplification method, an operation of extracting nucleic acid from a sample containing the pathogen is generally performed in advance. Known methods for extracting nucleic acids from pathogens, particularly viruses, include methods using protein denaturing agents such as surfactants and guanidine, and organic solvents such as phenol and chloroform (Patent Documents 5 and 6). However, since these protein denaturants and organic solvents inhibit the nucleic acid amplification reaction, a purification step for removing them is necessary after the extraction step, which requires complicated and time-consuming operations.
このような核酸抽出および精製操作を簡略化するため、種々のキットや装置が市販されている。一例として、ＥＸＴＲＡＧＥＮ ＩＩ（東ソー製）といった核酸を不溶化させる試薬と遠心分離を利用したキットや、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン製）といったスピンカラムを利用したキット、Ｃｈｅｍａｇｉｃ Ｐｒｅｐｉｔｏ（パーキンエルマー製）といった磁性ビーズを利用した自動抽出装置等が挙げられる。しかしながら、前述のキットや装置を用いても１０分から１時間程度の時間を要し、また作業工数も多く、遠心分離機や自動抽出装置といった特殊な装置も必要となるため、より迅速かつ簡便な方法が求められていた。 In order to simplify such nucleic acid extraction and purification operations, various kits and devices are commercially available. For example, a kit that uses a reagent such as EXTRAGEN II (manufactured by Tosoh) and a centrifugal separator, a kit that uses a spin column such as QIAamp Virtual RNA Mini Kit (manufactured by Qiagen), and a magnet such as a chemical prepit (manufactured by PerkinElmer) Examples thereof include an automatic extraction device using beads. However, even if the above-described kit or device is used, it takes about 10 minutes to 1 hour, requires a lot of work, and requires special devices such as a centrifuge and an automatic extraction device. A method was sought.
一方、非特許文献２に記載の方法のように、核酸を抽出し精製する操作をせずに核酸増幅を行ない、標的核酸を検出する方法も知られているが、感度面で不十分であった。 On the other hand, a method for detecting a target nucleic acid by performing nucleic acid amplification without extracting and purifying the nucleic acid as in the method described in Non-Patent Document 2 is also known, but the sensitivity is insufficient. It was.
核酸の抽出操作のみを行い、精製せずに核酸増幅反応へ供する方法として、界面活性剤を用いて核酸を抽出した後、シクロデキストリンを用いて界面活性剤を中和して核酸増幅工程に供する方法が知られている。特許文献７においては、酵母および大腸菌から０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて核酸を抽出し、α−シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬を用いてＰＣＲ法またはＲＣＡ法により核酸増幅する方法が示されている。しかしながら、当該特許文献に記載の方法は、核酸抽出に際して９５℃で５〜１５分間の加熱を要しており、簡便性・迅速性・安全性等の点で好ましくない。また当該特許文献では、前記ＳＤＳ以外の界面活性剤が添加された条件においても、シクロデキストリンを含むＰＣＲ反応液により、酵母由来ゲノムＤＮＡを核酸増幅可能なことも示されている。しかしながら前記ＳＤＳを用いた場合を除いて、界面活性剤によって細胞やウイルスから核酸を抽出した例は示されていない。 As a method for performing nucleic acid amplification reaction without performing purification, only nucleic acid extraction operation is performed. After extracting nucleic acid with a surfactant, the surfactant is neutralized with cyclodextrin and used for the nucleic acid amplification step. The method is known. In Patent Document 7, nucleic acid is extracted from yeast and Escherichia coli using 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS), and nucleic acid amplification is performed by PCR or RCA using a nucleic acid amplification reagent containing α-cyclodextrin. The method is shown. However, the method described in the patent document requires heating at 95 ° C. for 5 to 15 minutes at the time of nucleic acid extraction, which is not preferable in terms of simplicity, quickness, safety, and the like. The patent document also shows that yeast-derived genomic DNA can be amplified with a PCR reaction solution containing cyclodextrin even under conditions where a surfactant other than SDS is added. However, except for the case where SDS is used, no example of extracting nucleic acids from cells or viruses with a surfactant is shown.
また特許文献８においては、インフルエンザウイルス感染患者由来の鼻腔スワブを０．２％のＳＤＳを含む溶液に懸濁し、シクロデキストリンを含む酵素試薬と混合させてＲＴ−ＬＡＭＰ法により検出した例が示されている。しかしながら当該特許文献においては検出感度や抽出効率に関しての記述は認められず、高効率にウイルスから核酸を抽出して増幅するための試薬については知られていなかった。 Patent Document 8 shows an example in which a nasal swab derived from an influenza virus-infected patient is suspended in a solution containing 0.2% SDS, mixed with an enzyme reagent containing cyclodextrin, and detected by the RT-LAMP method. ing. However, in the patent document, description about detection sensitivity and extraction efficiency is not recognized, and a reagent for extracting and amplifying nucleic acid from a virus with high efficiency is not known.
また、特許文献７および８の核酸増幅方法は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、比較的高温でＤＮＡを増幅する方法であり、比較的低温でＲＮＡポリメラーゼと逆転写酵素の協奏反応によって核酸増幅を行う方法（ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法など）におけるウイルスからの核酸抽出および増幅条件は、知られていなかった。 Further, the nucleic acid amplification methods of Patent Documents 7 and 8 are methods for amplifying DNA at a relatively high temperature using a DNA-dependent DNA polymerase, and a nucleic acid amplification by a concerted reaction of RNA polymerase and reverse transcriptase at a relatively low temperature. The conditions for nucleic acid extraction and amplification from viruses in methods (TMA method, TRC method, NASBA method, etc.) that perform the above-mentioned were not known.
本発明の目的は、簡便、迅速および高効率にウイルスから核酸を抽出し、かつ核酸増幅反応の阻害を最小限とすることを特徴とする、核酸抽出および増幅試薬を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a nucleic acid extraction and amplification reagent characterized in that a nucleic acid is extracted from a virus simply, rapidly and with high efficiency, and inhibition of the nucleic acid amplification reaction is minimized.
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含む抽出試薬とウイルスとを接触させ、その後さらにシクロデキストリンと接触させることで、複雑な抽出および／または精製操作を行なうことなく、高効率に核酸を抽出および増幅できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors contacted an extraction reagent containing at least a surfactant having a steroid skeleton with a virus, and then contacted with a cyclodextrin, thereby performing complicated extraction. In addition, the inventors have found that nucleic acids can be extracted and amplified with high efficiency without performing purification operations, and the present invention has been completed.
すなわち本発明は以下の態様を包含する：
［１］ 以下の（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）を含む、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
（ｉ）ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬
（ｉｉ）シクロデキストリン
（ｉｉｉ）核酸増幅試薬
［２］当該シクロデキストリンが核酸増幅試薬に含まれている、［１］に記載のウイルス核酸を抽出及び増幅するためのキット。
［３］ 当該ウイルスがエンベロープを有するウイルスである、［１］または［２］に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［４］ 当該ウイルスがインフルエンザウイルスである、［１］から［３］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［５］ シクロデキストリンがγ−シクロデキストリンである、［１］から［４］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［６］ 界面活性剤が胆汁酸である、［１］から［５］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［７］ 界面活性剤が、コール酸、タウロコール酸、グリココール酸、タウロウルソデオキシコール酸又はそれらの塩のいずれかである、［６］に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［８］ シクロデキストリンの濃度が、ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度の３倍以上である、［１］から［７］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［９］ 抽出試薬におけるステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度が０．４（ｗ／ｗ）％以上である、［１］から［８］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［１０］ さらに非イオン界面活性剤を含む、［１］から［９］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［１１］ 核酸増幅試薬が乾燥形態である［１］から［１０］のいずれか１項に記載のウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット。
［１２］ 以下の（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）の工程を含む、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出および増幅する方法。
（ｉ）当該ウイルスを、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬と接触させる核酸抽出工程
（ｉｉ）（ｉ）によって抽出されたウイルス核酸抽出液にシクロデキストリンを接触させる工程
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の工程で得られた溶液の一部又は全部を核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程
［１３］以下の（ｉ）（ｉｉ）の工程を含む、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出および増幅する方法。
（ｉ）当該ウイルスを、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬と接触させる核酸抽出工程
（ｉｉ）（ｉ）によって抽出されたウイルス核酸抽出液を、シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程。
That is, the present invention includes the following embodiments:
[1] A kit for extracting and amplifying viral nucleic acid from a virus-containing sample, including the following (i), (ii), and (iii):
(I) Viral nucleic acid extraction reagent containing at least a surfactant having a steroid skeleton (ii) Cyclodextrin (iii) Nucleic acid amplification reagent [2] The cyclodextrin is contained in the nucleic acid amplification reagent according to [1] A kit for extracting and amplifying viral nucleic acid.
[3] A kit for extracting and amplifying the viral nucleic acid according to [1] or [2], wherein the virus is an enveloped virus.
[4] A kit for extracting and amplifying the viral nucleic acid according to any one of [1] to [3], wherein the virus is an influenza virus.
[5] The kit for extracting and amplifying the viral nucleic acid according to any one of [1] to [4], wherein the cyclodextrin is γ-cyclodextrin.
[6] A kit for extracting and amplifying a viral nucleic acid according to any one of [1] to [5], wherein the surfactant is a bile acid.
[7] The kit for extracting and amplifying the viral nucleic acid according to [6], wherein the surfactant is any one of cholic acid, taurocholic acid, glycocholic acid, taursodeoxycholic acid, or a salt thereof.
[8] A kit for extracting and amplifying a viral nucleic acid according to any one of [1] to [7], wherein the concentration of cyclodextrin is at least three times the concentration of a surfactant having a steroid skeleton .
[9] Extraction and amplification of the viral nucleic acid according to any one of [1] to [8], wherein the concentration of the surfactant having a steroid skeleton in the extraction reagent is 0.4 (w / w)% or more. Kit to do.
[10] The kit for extracting and amplifying the viral nucleic acid according to any one of [1] to [9], further comprising a nonionic surfactant.
[11] A kit for extracting and amplifying the viral nucleic acid according to any one of [1] to [10], wherein the nucleic acid amplification reagent is in a dry form.
[12] A method for extracting and amplifying viral nucleic acid from a virus-containing sample, comprising the following steps (i), (ii) and (iii):
(I) a step of bringing a cyclodextrin into contact with a viral nucleic acid extract extracted by the nucleic acid extraction step (ii) (i) in which the virus is brought into contact with a viral nucleic acid extraction reagent containing at least a surfactant having a steroid skeleton (iii) ) Nucleic acid amplification step of contacting part or all of the solution obtained in the step (ii) with a nucleic acid amplification reagent [13] The virus nucleic acid from a sample containing a virus, comprising the following steps (i) and (ii): How to extract and amplify.
(I) A nucleic acid amplification reagent containing a cyclodextrin, wherein the virus nucleic acid extract extracted by the nucleic acid extraction step (ii) (i) is brought into contact with the virus nucleic acid extraction reagent containing at least a surfactant having a steroid skeleton. A nucleic acid amplification step to be contacted.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明においてステロイド骨格を有する界面活性剤とは、シクロペンタノペルヒドロフェナントレン構造を有する化合物であり、界面活性作用を有するものである。天然に存在するステロイド骨格を有する界面活性剤としては、胆汁酸が例示される。胆汁酸はコラン酸骨格を持つステロイド誘導体であり、しばしばグリシンやタウリンと結合して抱合胆汁酸を形成する。天然に存在する胆汁酸および胆汁酸誘導体の一例として、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びそれらの塩などが例示できる。塩としては特に限定されるものではないが、例えばナトリウム塩等をあげることができる。また、本発明における界面活性剤は天然に存在するステロイド誘導体や胆汁酸誘導体に限らず、人工的に合成したステロイド骨格やコラン酸骨格を有する界面活性剤でもよい。中でも、本発明における好適な界面活性剤としてコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、タウロウルソデオキシコール酸及びそれらの塩が、より好ましくはコール酸及びその塩、特にコール酸ナトリウムが例示される。なお、コール酸骨格を有する界面活性剤の濃度については特に限定しないが、好ましくは０．４（ｗ／ｗ）％以上、より好ましくは０．８（ｗ／ｗ）％以上である。 In the present invention, the surfactant having a steroid skeleton is a compound having a cyclopentanoperhydrophenanthrene structure and has a surfactant activity. As a surfactant having a naturally occurring steroid skeleton, bile acid is exemplified. Bile acids are steroid derivatives with a colanic acid skeleton and often bind to glycine and taurine to form conjugated bile acids. Examples of naturally occurring bile acids and bile acid derivatives include cholic acid, chenodeoxycholic acid, deoxycholic acid, lithocholic acid, tauroursodeoxycholic acid, taurocholic acid, glycocholic acid and salts thereof. Although it does not specifically limit as a salt, For example, a sodium salt etc. can be mention | raise | lifted. The surfactant in the present invention is not limited to a naturally occurring steroid derivative or bile acid derivative, but may be a surfactant having an artificially synthesized steroid skeleton or a cholanic acid skeleton. Among these, cholic acid, taurocholic acid, glycocholic acid, taurursodeoxycholic acid and salts thereof are more preferable as the surfactant in the present invention, and cholic acid and salts thereof, particularly sodium cholate, are exemplified. The concentration of the surfactant having a cholic acid skeleton is not particularly limited, but is preferably 0.4 (w / w)% or more, more preferably 0.8 (w / w)% or more.
本発明の抽出対象は、いずれの種類のウイルスであってもよい。ウイルスは、カプシドと呼ばれるタンパク質の殻により核酸が包接された構造を有し、構造や大きさの点で細菌や微生物、細胞などと明確に区別される。本発明における好ましい抽出対象の一例として、エンベロープを有するウイルスや一本鎖ＲＮＡを有するウイルスが例示される。エンベロープを有するウイルスとは、ウイルスカプシドが主に脂質から構成されるエンベロープにより覆われたウイルスのことをいい、一例として、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ）があげられる。一本鎖ＲＮＡを有するウイルスとは、ボルティモア分類における第４群（１本鎖ＲＮＡ ＋鎖）、第５群（１本鎖ＲＮＡ −鎖）、第６群（１本鎖ＲＮＡ 逆転写）に属するウイルスであり、一例として、コロナウイルス、ＲＳウイルス、ヒト・メタニューモウイルス、インフルエンザウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ）があげられる。一本鎖ＲＮＡを有するウイルスは、ＴＲＣ法等のＲＮＡを出発物質とする核酸増幅法に適する点で好ましい。中でもインフルエンザウイルスは、本発明の抽出試薬における抽出対象ウイルスとして特に好ましい。 The extraction target of the present invention may be any type of virus. Viruses have a structure in which nucleic acids are included by a protein shell called capsid, and are clearly distinguished from bacteria, microorganisms, cells, and the like in terms of structure and size. Examples of preferable extraction targets in the present invention include viruses having an envelope and viruses having a single-stranded RNA. An enveloped virus refers to a virus whose viral capsid is covered by an envelope mainly composed of lipids, and examples include herpes simplex virus, influenza virus, RS virus, and AIDS virus (HIV). Viruses having single-stranded RNA belong to the fourth group (single-stranded RNA + strand), the fifth group (single-stranded RNA-strand), and the sixth group (single-stranded RNA reverse transcription) in the Baltimore classification. Examples thereof include coronavirus, RS virus, human metapneumovirus, influenza virus, and AIDS virus (HIV). Viruses having single-stranded RNA are preferred because they are suitable for nucleic acid amplification methods using RNA as a starting material, such as the TRC method. Among them, influenza virus is particularly preferable as a virus to be extracted in the extraction reagent of the present invention.
本発明においてウイルスを含む試料とは、単にウイルスを水、生理食塩水や緩衝液に溶解したものや、ウイルスを含んだ生体試料そのものや、前記生体試料を含んだ濾紙、スワブ等があげられる。前記生体試料の一例として、血液、糞便、尿、痰、リンパ液、血漿、***液、肺吸引物、脳脊髄液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、うがい液、唾液、涙液があげられる。 In the present invention, a virus-containing sample includes a virus simply dissolved in water, physiological saline or a buffer, a virus-containing biological sample itself, a filter paper containing the biological sample, a swab, and the like. Examples of the biological sample include blood, stool, urine, sputum, lymph, plasma, ejaculate, lung aspirate, cerebrospinal fluid, pharyngeal wipe, nasal wipe, gargle, saliva, and tears.
本発明のウイルス核酸抽出試薬は、ステロイド骨格を有する界面活性剤の他に、種々の成分をさらに含んでいてもよい。後の核酸増幅反応に必要な成分、例えば酵素や、マグネシウム塩、カリウム塩等の塩類や、トレハロース等の糖類や、グリセロール等の糖アルコールや、核酸成分や、有機溶媒等を含むことは、核酸抽出工程から核酸増幅工程に至る操作を簡略化できる意味で好ましい。中でも有機溶媒は、ウイルス核酸の抽出を促進させる効果を有している点で特に好ましい。本発明の抽出試薬にさらに含ませる有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を例示できる。また、ステロイド骨格を有する界面活性剤の他に、さらに１種類以上の界面活性剤やタンパク質変性剤を、核酸増幅反応を妨害しない範囲で添加することもできる。添加する界面活性剤の一例として、ＳＤＳ等の陰イオン界面活性剤や、ＣＨＡＰＳ等の両イオン界面活性剤や、Ｓｐａｎ ２０（商品名）、ＭＥＧＡ−８（商品名）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ ４０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ ６０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ ８０（商品名）など）等の非イオン性界面活性剤があげられる。中でも非イオン性界面活性剤は、ウイルス核酸の抽出を促進する効果を有する点や、核酸増幅反応への影響が少ない点で好ましい。添加する界面活性剤の一例として、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ２０（商品名）を例示できる。 The viral nucleic acid extraction reagent of the present invention may further contain various components in addition to the surfactant having a steroid skeleton. Containing components necessary for subsequent nucleic acid amplification reactions, such as enzymes, salts such as magnesium salts and potassium salts, sugars such as trehalose, sugar alcohols such as glycerol, nucleic acid components, organic solvents, etc. This is preferable in the sense that the operation from the extraction step to the nucleic acid amplification step can be simplified. Among them, the organic solvent is particularly preferable because it has an effect of promoting the extraction of viral nucleic acid. Examples of the organic solvent further contained in the extraction reagent of the present invention include dimethyl sulfoxide (DMSO). In addition to the surfactant having a steroid skeleton, one or more kinds of surfactants and protein denaturants may be added within a range that does not interfere with the nucleic acid amplification reaction. Examples of surfactants to be added include anionic surfactants such as SDS, amphoteric surfactants such as CHAPS, Span 20 (trade name), MEGA-8 (trade name), polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester Non-ionic surfactants such as (Tween 20 (trade name), Tween 40 (trade name), Tween 60 (trade name), Tween 80 (trade name), etc.) are listed. Among these, nonionic surfactants are preferable in that they have an effect of promoting the extraction of viral nucleic acids and have little influence on the nucleic acid amplification reaction. As an example of the surfactant to be added, Tween 20 (trade name), which is a polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester surfactant, can be exemplified.
本発明のウイルス核酸抽出試薬を用いて、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出するには、単に本発明のウイルス核酸抽出試薬とウイルスを含む試料とを接触させればよい。接触時間はウイルスを含む試料の性状、試料中のウイルス濃度、ウイルス核酸抽出試薬に含まれる成分等を考慮し、適宜決定すればよいが、多くの場合接触後４分以内で十分にウイルス核酸を抽出でき、接触後すぐにシクロデキストリンと接触させる工程等の後工程へ供することもできる。 In order to extract the viral nucleic acid from a virus-containing sample using the viral nucleic acid extraction reagent of the present invention, the viral nucleic acid extraction reagent of the present invention and the virus-containing sample are simply brought into contact with each other. The contact time may be appropriately determined in consideration of the properties of the virus-containing sample, the virus concentration in the sample, the components contained in the virus nucleic acid extraction reagent, etc. It can be extracted and used for a subsequent step such as a step of contacting with cyclodextrin immediately after contact.
本発明のウイルス核酸抽出液とは、ウイルスを含む試料とウイルス核酸抽出試薬を用いることによって得られる。また、ウイルス核酸抽出液は、シクロデキストリンと接触することで、ウイルス核酸抽出液中のステロイド骨格を有する界面活性剤がシクロデキストリンに包接され、核酸増幅反応への阻害作用が緩和される。シクロデキストリンには、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンなど環の大きさが異なるものや、種々の誘導体が知られている。本発明に用いるシクロデキストリンは、ステロイド骨格を有する界面活性剤を包接可能なものであればいずれの種類でもよいが、環の大きさの点からγ−シクロデキストリンおよびその誘導体の使用が好ましい。また、ウイルス核酸抽出液と接触させるシクロデキストリンは、溶液状や固体状など、いずれの性状であってもよい。さらに、シクロデキストリンと同時に、他の種々の成分をも添加してもよい。 The viral nucleic acid extract of the present invention can be obtained by using a virus-containing sample and a viral nucleic acid extraction reagent. Further, when the viral nucleic acid extract is brought into contact with cyclodextrin, the surfactant having a steroid skeleton in the viral nucleic acid extract is included in cyclodextrin, and the inhibitory action on the nucleic acid amplification reaction is alleviated. As cyclodextrins, those having different ring sizes, such as α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, and γ-cyclodextrin, and various derivatives are known. The cyclodextrin used in the present invention may be of any type as long as it can include a surfactant having a steroid skeleton, but γ-cyclodextrin and its derivatives are preferably used from the viewpoint of the ring size. Further, the cyclodextrin to be brought into contact with the viral nucleic acid extract may have any property such as a solution or a solid. Further, other various components may be added simultaneously with the cyclodextrin.
シクロデキストリンは、ウイルス核酸抽出試薬とウイルスを含む試料とを接触させた後、核酸増幅工程開始までの間に接触させればよく、必要な抽出効率に応じて上述の範囲内で適宜選択することができる。特に本発明の好適な実施形態の一例としてシクロデキストリンとの接触を、核酸増幅工程の開始と同時に行う方法が例示できる。さらに、シクロデキストリンは核酸増幅試薬に必要な成分と同時に加えられることは操作を簡便にする観点からさらに好ましいため、シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬を用いることも出来る。 The cyclodextrin may be contacted between the viral nucleic acid extraction reagent and the virus-containing sample and before the start of the nucleic acid amplification process, and should be appropriately selected within the above range depending on the required extraction efficiency. Can do. In particular, as an example of a preferred embodiment of the present invention, a method of contacting with cyclodextrin simultaneously with the start of the nucleic acid amplification step can be exemplified. Furthermore, since it is more preferable that cyclodextrin is added simultaneously with the components necessary for the nucleic acid amplification reagent from the viewpoint of simplifying the operation, a nucleic acid amplification reagent containing cyclodextrin can also be used.
特に核酸増幅反応に必要な成分、例えば酵素や、マグネシウム塩、カリウム塩等の塩類や、トレハロース等の糖類や、グリセロール等の糖アルコールや、核酸成分や、有機溶媒や、プライマーやプローブ等の核酸類や、緩衝液成分等を含むことは、操作を簡略化できる点で好ましい。すなわち、本発明の好適な実施形態の一例として、ステロイド骨格を有する界面活性剤を含むウイルス核酸抽出試薬によりウイルス核酸を抽出し、当該ウイルス核酸抽出液をシクロデキストリンを含む核酸増幅試薬へ添加することで核酸増幅反応を行う試薬があげられる。なお、シクロデキストリンの濃度については特に限定しないが、好ましくはコール酸骨格を有する界面活性剤の濃度の３倍以上、より好ましくは６倍以上である。 In particular, components necessary for nucleic acid amplification reaction, such as enzymes, salts such as magnesium salts and potassium salts, sugars such as trehalose, sugar alcohols such as glycerol, nucleic acid components, organic solvents, nucleic acids such as primers and probes It is preferable that the composition contains a buffer component or the like in that the operation can be simplified. That is, as an example of a preferred embodiment of the present invention, a viral nucleic acid is extracted with a viral nucleic acid extraction reagent containing a surfactant having a steroid skeleton, and the viral nucleic acid extract is added to a nucleic acid amplification reagent containing cyclodextrin. And a reagent for performing a nucleic acid amplification reaction. The concentration of cyclodextrin is not particularly limited, but is preferably at least 3 times, more preferably at least 6 times the concentration of the surfactant having a cholic acid skeleton.
本発明における核酸増幅法は、いずれの核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法）であってもよい。等温で核酸増幅を行う方法は、温度の昇降を行う比較的複雑な装置が不要である点で好ましい。このような核酸増幅法として、ウイルス核酸の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、ウイルス核酸の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を有する酵素と、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを用いて、標的核酸を増幅する方法であって、前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーのいずれかには、その５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応したプロモーター配列を付加している方法（例えば、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法）が例示される。当該方法は一本鎖ＲＮＡを標的として核酸増幅する方法であるが、特開２０１５−１１６３６号公報等に開示される方法を用いることで、二本鎖ＤＮＡ等を増幅することもできる。 The nucleic acid amplification method in the present invention may be any nucleic acid amplification method (for example, PCR method, TMA method, TRC method, NASBA method). The method of performing nucleic acid amplification isothermally is preferable in that a relatively complicated apparatus for raising and lowering the temperature is unnecessary. Such a nucleic acid amplification method includes a first primer having a sequence homologous to part of a viral nucleic acid, a second primer having a sequence complementary to a part of the viral nucleic acid, and RNA-dependent DNA polymerase activity. A method for amplifying a target nucleic acid using an enzyme having a DNA-dependent DNA polymerase activity, an enzyme having a ribonuclease H (RNase H) activity, and an enzyme having an RNA polymerase activity, A method in which a promoter sequence corresponding to the enzyme having RNA polymerase activity is added to either the first primer or the second primer on the 5 ′ end side thereof (for example, TMA method, TRC method, NASBA Method). This method is a method of amplifying a nucleic acid using a single-stranded RNA as a target, but a double-stranded DNA or the like can also be amplified by using a method disclosed in JP-A-2015-11636.
本発明における核酸増幅試薬は、乾燥形態であってもよい。核酸増幅試薬には酵素が含まれるため、乾燥状態にすることで液状の場合よりも保存期間を延ばし、保存に適する温度もより室温に近い状態にすることが出来る。さらに乾燥状態にすることで輸送や使う際の操作がし易いという利点がある。 The nucleic acid amplification reagent in the present invention may be in a dry form. Since the nucleic acid amplification reagent contains an enzyme, when it is in a dry state, the storage period can be extended as compared with a liquid state, and the temperature suitable for storage can be made closer to room temperature. Furthermore, there exists an advantage that it is easy to operate at the time of transportation and use by making it dry.
乾燥形態とする方法としては酵素の活性を失わない方法であればいずれの方法であってもよく、凍結乾燥法、蒸発乾燥法などを例示できる。 Any method may be used as a method for obtaining a dry form as long as it does not lose the activity of the enzyme, and examples thereof include a freeze drying method and an evaporation drying method.
本発明は、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬により、ウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出し、さらにシクロデキストリンと接触させることを特徴とする、ウイルス核酸を抽出および増幅するための試薬に係る発明である。本発明により、当該ウイルス核酸の抽出および増幅を、精製操作を行なうことなく、簡便、迅速かつ高効率に行なうことができる。 The present invention extracts and amplifies viral nucleic acid, wherein the viral nucleic acid is extracted from a virus-containing sample with a viral nucleic acid extraction reagent containing at least a surfactant having a steroid skeleton, and further contacted with cyclodextrin It is invention concerning the reagent for doing. According to the present invention, extraction and amplification of the viral nucleic acid can be carried out simply, rapidly and with high efficiency without performing a purification operation.
具体的には、本願の構成を採用するウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出および増幅するためのキット及び方法によって、煩雑な抽出ステップが不要であり、かつＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉと同等の検出感度を達成することができた。 Specifically, the kit and method for extracting and amplifying the virus nucleic acid from a virus-containing sample adopting the configuration of the present application eliminates the need for a complicated extraction step and has a detection sensitivity equivalent to that of QIAamp Virtual RNA Mini. Could be achieved.
以下、ウイルスとしてインフルエンザウイルスを用いたときの実施例および参考例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら例により限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples and reference examples when an influenza virus is used as a virus, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１ 標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用したインフルエンザウイルスＲＮＡ（以下、標準ＲＮＡと表記）は下記に示す方法で調製した。
（１）配列番号１（Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４１０番目から９３０番目まで）、配列番号２（Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＣ＿００７３６９の４５５番目から９７５番目まで（ただし６６３番目のＣはＴ））および配列番号３（Ｂ型インフルエンザウイルス、セグメント７、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の２０６番目から７３５番目まで）に記載の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを調製し、それぞれＴ−Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０（タカラバイオ製）へ挿入した（なお、当該ｃＤＮＡ配列の相補鎖の５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調製したプラスミドＤＮＡを、挿入したインフルエンザウイルスｃＤＮＡの５’末端側で制限酵素消化し、直鎖状のＤＮＡを調製した。
（３）（２）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写を行なった。その後、ＤＮａｓｅ Ｉ処理により前記鋳型ＤＮＡを完全消化し、精製することで標準ＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
Example 1 Preparation of Standard RNA Influenza virus RNA (hereinafter referred to as standard RNA) used in Examples described later was prepared by the method shown below.
(1) SEQ ID NO: 1 (type A (H1N1 subtype) influenza virus, segment 5, cDNA partial sequence, GenBank No. FJ969536, positions 410 to 930), SEQ ID NO: 2 (type A (H3N2 subtype) influenza virus , Segment 5, cDNA partial sequence, 455th to 975th of GenBank No. NC — 007369 (where 663rd C is T)) and SEQ ID NO: 3 (influenza B virus, segment 7, cDNA partial sequence, GenBank No. CY115184 Double-stranded DNAs having the base sequences described in (No. 206 to 735) are inserted into T-Vector pMD20 (manufactured by Takara Bio Inc.) (note that the 5 ′ end side of the complementary strand of the cDNA sequence) SP6 Promo It is added ter).
(2) The plasmid DNA prepared in (1) was digested with restriction enzymes at the 5 ′ end side of the inserted influenza virus cDNA to prepare linear DNA.
(3) In vitro transcription with SP6 RNA polymerase was performed using the DNA prepared in (2) as a template. Thereafter, the template DNA was completely digested by DNase I treatment and purified to prepare standard RNA. The prepared RNA was quantified by measuring the absorbance at 260 nm.
なお、本例で調製した標準ＲＮＡの全長は約５００塩基と、インフルエンザウイルスＲＮＡの全長（セグメント５：約１５００塩基、セグメント７：約１１００塩基）の一部であるが、インフルエンザウイルスＲＮＡの測定には十分適用可能である。 The full length of the standard RNA prepared in this example is about 500 bases, which is a part of the full length of influenza virus RNA (segment 5: about 1500 bases, segment 7: about 1100 bases). Is fully applicable.
実施例２ インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの作製
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６））により、配列番号４に記載の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７２４番目から７４６番目までの塩基配列の相補配列）の５’末端から１７番目のＴと１８番目のＴの間、および配列番号５に記載の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４６３番目から４８３番目までの塩基配列の相補配列）の５’末端から８番目のＡと９番目のＴの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させ、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと表記）を調製した。その構造式を以下に示す。
Example 2 Production of Intercalating Fluorescent Dye-Labeled Nucleic Acid Probe The sequence described in SEQ ID NO: 4 (GenBank) by the method of Ishiguro et al. (Ishiguro, T. et al, Nucleic Acids Res., 24, 4992-4997 (1996)). No. KJ741989, the complementary sequence of the nucleotide sequence from the 724th to the 746th base sequence) between the 17th T and the 18th T from the 5 ′ end, and the sequence described in SEQ ID NO: 5 (GenBank No. CY115184, 463rd) To the phosphodiester moiety between the 8th A and the 9th T from the 5 'end of the base sequence from the 5' to the 483th base) via a linker and labeled with an intercalating fluorescent dye Nucleic acid probes (hereinafter referred to as INAF probes) ) Was prepared. Its structural formula is shown below.
参考例１ スピンカラムを用いた核酸抽出によるインフルエンザウイルスの検出
以下の方法により、スピンカラムを用いた核酸抽出によるインフルエンザウイルスの検出を試みた。
（１）表１に示すインフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を注射用
水を用いて表３に記載の濃度に希釈し、ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて当該キットのマニュアルに従い抽出することで、インフルエンザウイルスＲＮＡを得た。
Reference Example 1 Detection of influenza virus by nucleic acid extraction using a spin column Detection of influenza virus by nucleic acid extraction using a spin column was attempted by the following method.
(1) The influenza virus solution shown in Table 1 (manufactured by ZeptoMetrix) is diluted to the concentrations shown in Table 3 using water for injection, and extracted according to the manual of the kit using QIAamp Virtual RNA Mini Kit (manufactured by QIAGEN). As a result, influenza virus RNA was obtained.
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
Composition of virus extract: final concentration after addition of virus sample (in 15 μL) 42.4 mM magnesium chloride 205.4 mM potassium chloride 2.3% glycerol 23.0% DMSO
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー。
Composition of reaction mixture: concentration is 60 mM Tris-HCl (pH 8.6) after addition of viral RNA extract (in 30 μL)
0.25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP each
2.6mM ATP, CTP, UTP, GTP each
3.06 mM ITP
70 mM trehalose 9.1 U AMV reverse transcriptase 142 U T7 RNA polymerase each 20 nM INAF probe (prepared in Example 2) (SEQ ID NOs: 4 and 5)
The first primer at the concentration described in Table 2. The second primer at the concentration described in Table 2.
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。 (4) Using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function (TRCRapid-160, manufactured by Tosoh Corp.) capable of directly measuring a PCR tube, the reaction solution is reacted at 46 ° C. and simultaneously the fluorescence intensity of the reaction solution (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm). ) Was measured over time for 30 minutes. When the start solution was added for 0 minute, the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (the value obtained by dividing the fluorescence intensity value at a predetermined time by the fluorescence intensity ratio of the background) exceeded 1.2 was determined as positive.
結果を表３に示す。スピンカラムを用いた核酸抽出法では、概ね４．７×１０−２ＴＣＩＤ５０／ｍＬのインフルエンザウイルスを検出できることを確認した。 The results are shown in Table 3. In the nucleic acid extraction method using a spin column, it was confirmed that approximately 4.7 × 10 −2 TCID 50 / mL of influenza virus could be detected.
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬に添加するシクロデキストリンの種類を検討した。
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号１）を、注射用水を用いて１０３コピー／５μＬとなるように希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成からなる反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注した後、前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
(1) Type A (H1N1 subtype) influenza virus standard RNA (SEQ ID NO: 1) prepared in Example 1 was diluted to 10 3 copies / 5 μL with water for injection and used as an RNA sample.
(2) After dispensing 15 μL of the reaction solution having the following composition into a 0.5 mL volume PCR tube (Individual Dome Cap PCR Tube, manufactured by SSI), 5 μL of the RNA sample was added.
反応液の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
表４に記載の濃度のシクロデキストリン。
Composition of reaction solution: Concentration is 60 mM Tris-HCl (pH 8.6) final concentration after addition of initiator (in 30 μL)
0.25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP each
2.6mM ATP, CTP, UTP, GTP each
3.06 mM ITP
70 mM trehalose 9.1 U AMV reverse transcriptase 142 U T7 RNA polymerase each 20 nM INAF probe (prepared in Example 2) (SEQ ID NOs: 4 and 5)
The first primer of the concentration described in Table 2 The second primer of the concentration described in Table 2 The cyclodextrin of the concentration described in Table 4.
（３）上記の反応液を４６℃で４分間保温後、以下の組成からなる開始剤１０μＬを添加した。 (3) After incubating the above reaction solution at 46 ° C. for 4 minutes, 10 μL of an initiator having the following composition was added.
開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
２１．２ｍＭ 塩化マグネシウム
１０２．７ｍＭ 塩化カリウム
１．２％ グリセロール
１１．５％ ＤＭＳＯ。
Initiator composition: concentration is 21.2 mM magnesium chloride 102.7 mM potassium chloride after addition of initiator (in 30 μL)
1.2% Glycerol 11.5% DMSO.
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。 (4) Using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function (TRCRapid-160, manufactured by Tosoh Corp.) capable of directly measuring a PCR tube, the reaction solution is reacted at 46 ° C. and simultaneously the fluorescence intensity of the reaction solution (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm). ) Was measured over time for 30 minutes. When the start solution was added for 0 minute, the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (the value obtained by dividing the fluorescence intensity value at a predetermined time by the fluorescence intensity ratio of the background) exceeded 1.2 was determined as positive.
結果を表４に示す。α−シクロデキストリン（α−ＣＤ）またはγ−シクロデキストリン（γ−ＣＤ）を核酸増幅試薬に添加しても、反応が進行することが確認できた。特にγ−シクロデキストリンは高濃度に添加しても核酸増幅反応への影響が少ないことから、以下の実験においてはγ−ＣＤを用いた。 The results are shown in Table 4. It was confirmed that the reaction proceeded even when α-cyclodextrin (α-CD) or γ-cyclodextrin (γ-CD) was added to the nucleic acid amplification reagent. In particular, γ-CD was used in the following experiments because γ-cyclodextrin has little influence on the nucleic acid amplification reaction even when added at a high concentration.
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬に添加する界面活性剤の種類を検討した。
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡを、注射用水を用いて１０３コピー／２．５μＬとなるように希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）表１に示すＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を注射用水で４．７×１００ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈することでウイルス試料を調製した。
（３）（１）で調製したＲＮＡ試料または（２）で調製したウイルス試料２．５μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
(1) The type A (H1N1 subtype) influenza virus standard RNA prepared in Example 1 was diluted with water for injection to 10 3 copies / 2.5 μL and used as an RNA sample.
(2) A virus sample was prepared by diluting a type A (H1N1 subtype) influenza virus solution (manufactured by ZeptoMetrix) shown in Table 1 to 4.7 × 10 0 TCID 50 / mL with water for injection.
(3) A solution (hereinafter referred to as virus extract) containing a surfactant having the following composition, prepared by heating 2.5 μL of the RNA sample prepared in (1) or the virus sample prepared in (2) to 46 ° C. ) Added to 12.5 μL, stirred, and incubated at 46 ° C. for 4 minutes to prepare 15 μL of viral RNA extract.
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
表５に記載の濃度の界面活性剤。
Composition of virus extract: final concentration after addition of virus sample (in 15 μL) 42.4 mM magnesium chloride 205.4 mM potassium chloride 2.3% glycerol 23.0% DMSO
Surfactants with the concentrations listed in Table 5.
（４）以下の組成からなるγ−ＣＤを含む反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（３）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号６）が付加されている。 (4) Dispense 15 μL of a reaction solution containing γ-CD having the following composition into a 0.5 mL PCR tube (Individual Dome Cap PCR Tube, manufactured by SSI), and incubate at 46 ° C. for 4 minutes. Immediately add 15 μL of the resulting viral RNA extract. Note that a combination of oligonucleotides having the sequences and concentrations shown in Table 2 was used for the first primer and the second primer. In addition, a T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 6) is added to the first primer on the 5 ′ end side of the base sequence described in each SEQ ID NO shown in Table 2.
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
１（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ。
Composition of reaction mixture: concentration is 60 mM Tris-HCl (pH 8.6) after addition of viral RNA extract (in 30 μL)
0.25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP each
2.6mM ATP, CTP, UTP, GTP each
3.06 mM ITP
70 mM trehalose 9.1 U AMV reverse transcriptase 142 U T7 RNA polymerase each 20 nM INAF probe (prepared in Example 2) (SEQ ID NOs: 4 and 5)
First primer with the concentration described in Table 2 Second primer 1 (w / w)% γ-CD with the concentration described in Table 2.
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。 (5) Using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function (TRCRapid-160, manufactured by Tosoh Corp.) capable of directly measuring a PCR tube, the reaction solution is reacted at 46 ° C. and at the same time the fluorescence intensity of the reaction solution (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm). ) Was measured over time for 30 minutes. When the start solution was added for 0 minute, the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (the value obtained by dividing the fluorescence intensity value at a predetermined time by the fluorescence intensity ratio of the background) exceeded 1.2 was determined as positive.
ＲＮＡ試料を用いた場合およびウイルス試料を用いた場合の結果を、表５に示す。ＲＮＡ試料を用いた場合の結果から、種々の界面活性剤に対して、γ−シクロデキストリンにより核酸増幅反応の阻害を緩和できることが認められた。またウイルス試料を用いた場合の結果から、陰イオン性界面活性剤、特にデオキシコール酸ナトリウムやコール酸ナトリウムといったステロイド骨格を有する界面活性剤を用いることで、ウイルスから核酸を高効率に抽出して増幅可能であることが示された。 Table 5 shows the results when RNA samples were used and when virus samples were used. From the results when RNA samples were used, it was confirmed that inhibition of nucleic acid amplification reaction can be alleviated by γ-cyclodextrin for various surfactants. From the results when using virus samples, nucleic acid can be extracted from viruses efficiently by using anionic surfactants, especially surfactants with a steroid skeleton such as sodium deoxycholate and sodium cholate. It was shown that it can be amplified.
実施例４で調製したウイルス抽出液を、室温で１２時間静置し、保存安定性を評価した。結果を表６に示す。ＳＤＳ、ＬＤＳ、デオキシコール酸ナトリウムを用いた場合には、結晶状の沈殿が形成された。一方、コール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウムを用いた場合は、沈殿の形成は認められず、本発明における好ましい界面活性剤であることが分かった。
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬に添加するシクロデキストリンの濃度を検討した。
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡを、注射用水を用いて１０３コピー／２．５μＬとなるように希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）（１）で調製したＲＮＡ試料２．５μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
(1) The type A (H1N1 subtype) influenza virus standard RNA prepared in Example 1 was diluted with water for injection to 10 3 copies / 2.5 μL and used as an RNA sample.
(2) Add 2.5 μL of the RNA sample prepared in (1) to 12.5 μL of a solution (hereinafter referred to as a virus extract) containing a surfactant having the following composition heated to 46 ° C. in advance and stirred. By incubating at 46 ° C. for 4 minutes, 15 μL of viral RNA extract was prepared.
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
表７から表８に記載の濃度の界面活性剤。
Composition of virus extract: final concentration after addition of virus sample (in 15 μL) 42.4 mM magnesium chloride 205.4 mM potassium chloride 2.3% glycerol 23.0% DMSO
Surfactants having the concentrations described in Table 7 to Table 8.
（３）以下の組成からなるγ−ＣＤを含む反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（２）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号６）が付加されている。 (3) Dispense 15 μL of a reaction solution containing γ-CD having the following composition into a 0.5 mL PCR tube (Individual Dome Cap PCR Tube, manufactured by SSI), and incubate at 46 ° C. for 4 minutes. Immediately add 15 μL of the resulting viral RNA extract. Note that a combination of oligonucleotides having the sequences and concentrations shown in Table 2 was used for the first primer and the second primer. In addition, a T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 6) is added to the first primer on the 5 ′ end side of the base sequence described in each SEQ ID NO shown in Table 2.
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
表７から表８に記載の濃度のγ−ＣＤ。
Composition of reaction mixture: concentration is 60 mM Tris-HCl (pH 8.6) after addition of viral RNA extract (in 30 μL)
0.25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP each
2.6mM ATP, CTP, UTP, GTP each
3.06 mM ITP
70 mM trehalose 9.1 U AMV reverse transcriptase 142 U T7 RNA polymerase each 20 nM INAF probe (prepared in Example 2) (SEQ ID NOs: 4 and 5)
1st primer of the density | concentration described in Table 2 2nd primer of the density | concentration described in Table 2 γ-CD of the density | concentration as described in Table 7-8.
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。 (4) Using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function (TRCRapid-160, manufactured by Tosoh Corp.) capable of directly measuring a PCR tube, the reaction solution is reacted at 46 ° C. and simultaneously the fluorescence intensity of the reaction solution (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm). ) Was measured over time for 30 minutes. When the start solution was added for 0 minute, the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (the value obtained by dividing the fluorescence intensity value at a predetermined time by the fluorescence intensity ratio of the background) exceeded 1.2 was determined as positive.
界面活性剤としてタウロウルソデオキシコール酸ナトリウムを添加した場合の結果を表７に、コール酸ナトリウムを添加した場合の結果を表８に示す。表７および表８の結果から、シクロデキストリンがステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度の３倍以上、好ましくは６倍以上の濃度で含まれる場合に、核酸増幅反応の阻害を十分に緩和できることがわかる。 Table 7 shows the results when sodium tauroursodeoxycholate was added as a surfactant, and Table 8 shows the results when sodium cholate was added. From the results of Tables 7 and 8, when the cyclodextrin is contained at a concentration of 3 times or more, preferably 6 times or more the concentration of the surfactant having a steroid skeleton, inhibition of the nucleic acid amplification reaction can be sufficiently alleviated. Recognize.
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬に添加する界面活性剤の濃度を検討した。
（１）表１に示すＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を注射用水で４．７×１０−１ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈することでウイル
ス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料２．５μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
(1) A virus sample was prepared by diluting a solution of A type (H1N1 subtype) influenza virus shown in Table 1 (manufactured by ZeptoMetrix) with water for injection to 4.7 × 10 −1 TCID 50 / mL.
(2) Add 2.5 μL of the virus sample prepared in (1) to 12.5 μL of a solution (hereinafter referred to as virus extract) containing a surfactant having the following composition and heated to 46 ° C. in advance and stirred. By incubating at 46 ° C. for 4 minutes, 15 μL of viral RNA extract was prepared.
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
表９に記載の濃度のコール酸ナトリウム。
Composition of virus extract: final concentration after addition of virus sample (in 15 μL) 42.4 mM magnesium chloride 205.4 mM potassium chloride 2.3% glycerol 23.0% DMSO
Sodium cholate at the concentration described in Table 9.
（３）以下の組成からなるγ−ＣＤを含む反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（２）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号６）が付加されている。 (3) Dispense 15 μL of a reaction solution containing γ-CD having the following composition into a 0.5 mL PCR tube (Individual Dome Cap PCR Tube, manufactured by SSI), and incubate at 46 ° C. for 4 minutes. Immediately add 15 μL of the resulting viral RNA extract. Note that a combination of oligonucleotides having the sequences and concentrations shown in Table 2 was used for the first primer and the second primer. In addition, a T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 6) is added to the first primer on the 5 ′ end side of the base sequence described in each SEQ ID NO shown in Table 2.
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
６（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー。
Composition of reaction mixture: concentration is 60 mM Tris-HCl (pH 8.6) after addition of viral RNA extract (in 30 μL)
0.25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP each
2.6mM ATP, CTP, UTP, GTP each
3.06 mM ITP
70 mM trehalose 6 (w / w)% γ-CD
9.1U AMV reverse transcriptase 142U T7 RNA polymerase 20nM each INAF probe (prepared in Example 2) (SEQ ID NOs: 4 and 5)
The first primer at the concentration described in Table 2. The second primer at the concentration described in Table 2.
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。 (4) Using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function (TRCRapid-160, manufactured by Tosoh Corp.) capable of directly measuring a PCR tube, the reaction solution is reacted at 46 ° C. and simultaneously the fluorescence intensity of the reaction solution (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm). ) Was measured over time for 30 minutes. When the start solution was added for 0 minute, the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (the value obtained by dividing the fluorescence intensity value at a predetermined time by the fluorescence intensity ratio of the background) exceeded 1.2 was determined as positive.
結果を表９に示す。コール酸ナトリウムを添加した抽出液、好ましくはコール酸ナトリウムを０．８（ｗ／ｗ）％以上添加した抽出液を用いることで、ウイルス核酸を良好に抽出および増幅可能なことがわかる。 The results are shown in Table 9. It can be seen that viral nucleic acid can be extracted and amplified satisfactorily by using an extract added with sodium cholate, preferably an extract added with 0.8 (w / w)% or more of sodium cholate.
以下の方法により、ステロイド骨格を有する界面活性剤に加え、さらに非イオン性界面活性剤を添加した抽出試薬について検討を行った。
（１）表１に示すＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を注射用水で４．７×１０−１ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈することでウイル
ス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料２．５μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなるコール酸ナトリウムおよびＴｗｅｅｎ ２０を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
(1) A virus sample was prepared by diluting a solution of A type (H1N1 subtype) influenza virus shown in Table 1 (manufactured by ZeptoMetrix) with water for injection to 4.7 × 10 −1 TCID 50 / mL.
(2) Add 2.5 μL of the virus sample prepared in (1) to 12.5 μL of a solution (hereinafter referred to as virus extract) containing sodium cholate and Tween 20 having the following composition heated to 46 ° C. in advance. The mixture was stirred and incubated at 46 ° C. for 4 minutes to prepare 15 μL of viral RNA extract.
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
０．１（ｖ／ｖ）％ Ｔｗｅｅｎ ２０
表１０に記載の濃度の界面活性剤。
Composition of virus extract: final concentration after addition of virus sample (in 15 μL) 42.4 mM magnesium chloride 205.4 mM potassium chloride 2.3% glycerol 23.0% DMSO
0.1 (v / v)% Tween 20
Surfactants with the concentrations listed in Table 10.
（３）以下の組成からなるγ−ＣＤを含む反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（２）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号６）が付加されている。 (3) Dispense 15 μL of a reaction solution containing γ-CD having the following composition into a 0.5 mL PCR tube (Individual Dome Cap PCR Tube, manufactured by SSI), and incubate at 46 ° C. for 4 minutes. Immediately add 15 μL of the resulting viral RNA extract. Note that a combination of oligonucleotides having the sequences and concentrations shown in Table 2 was used for the first primer and the second primer. In addition, a T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 6) is added to the first primer on the 5 ′ end side of the base sequence described in each SEQ ID NO shown in Table 2.
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
表１０に記載の濃度のγ−ＣＤ。
Composition of reaction mixture: concentration is 60 mM Tris-HCl (pH 8.6) after addition of viral RNA extract (in 30 μL)
0.25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP each
2.6mM ATP, CTP, UTP, GTP each
3.06 mM ITP
70 mM trehalose 9.1 U AMV reverse transcriptase 142 U T7 RNA polymerase each 20 nM INAF probe (prepared in Example 2) (SEQ ID NOs: 4 and 5)
The first primer at the concentration described in Table 2 The second primer at the concentration described in Table 2 The γ-CD at the concentration described in Table 10.
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。結果を表１０に示す。 (5) Using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function (TRCRapid-160, manufactured by Tosoh Corp.) capable of directly measuring a PCR tube, the reaction solution is reacted at 46 ° C. and at the same time the fluorescence intensity of the reaction solution (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm). ) Was measured over time for 30 minutes. When the start solution was added for 0 minute, the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (the value obtained by dividing the fluorescence intensity value at a predetermined time by the fluorescence intensity ratio of the background) exceeded 1.2 was determined as positive. The results are shown in Table 10.
抽出液中のコール酸ナトリウムの濃度が０．４から１．６（ｗ／ｗ）％の範囲において
、良好にウイルス核酸を抽出および増幅できていることがわかる。また、Ｔｗｅｅｎ ２０を添加していない抽出試薬（表９）に比べ、核酸抽出／増幅効率が向上していることがわかる。
It can be seen that the viral nucleic acid was successfully extracted and amplified when the concentration of sodium cholate in the extract was in the range of 0.4 to 1.6 (w / w)%. It can also be seen that the nucleic acid extraction / amplification efficiency is improved compared to the extraction reagent without addition of Tween 20 (Table 9).
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬を用いた場合の抽出時間について、検討を行った。
（１）表１に示すＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を、注射用水で４．７×１００ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈することでウイルス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料２．５μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で０分から４分間保温することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
(1) A virus sample was prepared by diluting a solution of A type (H1N1 subtype) influenza virus (manufactured by ZeptoMetrix) shown in Table 1 to 4.7 × 10 0 TCID 50 / mL with water for injection.
(2) Add 2.5 μL of the virus sample prepared in (1) to 12.5 μL of a solution (hereinafter referred to as virus extract) containing a surfactant having the following composition and heated to 46 ° C. in advance and stirred. By incubating at 46 ° C. for 0 to 4 minutes, 15 μL of viral RNA extract was prepared.
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
０．１（ｖ／ｖ）％ Ｔｗｅｅｎ ２０
１．０（ｗ／ｗ）％ コール酸ナトリウム。
Composition of virus extract: final concentration after addition of virus sample (in 15 μL) 42.4 mM magnesium chloride 205.4 mM potassium chloride 2.3% glycerol 23.0% DMSO
0.1 (v / v)% Tween 20
1.0 (w / w)% sodium cholate.
（３）以下の組成からなるγ−ＣＤを含む反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（２）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号６）が付加されている。 (3) Dispense 15 μL of a reaction solution containing γ-CD having the following composition into a 0.5 mL PCR tube (Individual Dome Cap PCR Tube, manufactured by SSI), and incubate at 46 ° C. for 4 minutes. Immediately add 15 μL of the resulting viral RNA extract. Note that a combination of oligonucleotides having the sequences and concentrations shown in Table 2 was used for the first primer and the second primer. In addition, a T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 6) is added to the first primer on the 5 ′ end side of the base sequence described in each SEQ ID NO shown in Table 2.
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
６（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ。
Composition of reaction mixture: concentration is 60 mM Tris-HCl (pH 8.6) after addition of viral RNA extract (in 30 μL)
0.25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP each
2.6mM ATP, CTP, UTP, GTP each
3.06 mM ITP
70 mM trehalose 9.1 U AMV reverse transcriptase 142 U T7 RNA polymerase each 20 nM INAF probe (prepared in Example 2) (SEQ ID NOs: 4 and 5)
First primer at the concentration described in Table 2 Second primer 6 (w / w)% γ-CD at the concentration described in Table 2.
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。 (5) Using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function (TRCRapid-160, manufactured by Tosoh Corp.) capable of directly measuring a PCR tube, the reaction solution is reacted at 46 ° C. and at the same time the fluorescence intensity of the reaction solution (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm). ) Was measured over time for 30 minutes. When the start solution was added for 0 minute, the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (the value obtained by dividing the fluorescence intensity value at a predetermined time by the fluorescence intensity ratio of the background) exceeded 1.2 was determined as positive.
結果を表１１に示す。抽出時の加熱時間を０分（ウイルスを抽出試薬と混合後、直ちに反応液と混合する方法）とした場合も、良好にウイルス核酸を抽出／増幅可能であった。 The results are shown in Table 11. Even when the heating time during extraction was 0 minutes (a method in which the virus was mixed with the extraction reagent and then immediately mixed with the reaction solution), the virus nucleic acid could be extracted / amplified satisfactorily.
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬を用いて、各種インフルエンザウイルスの検出を行った。
（１）表１に示すＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス、Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を、注射用水で表１２に記載の濃度に希釈することでウイルス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料２．５μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
(1) A type A (H1N1 subtype) influenza virus, type A (H3N2 subtype) influenza virus, and type B influenza virus solution (manufactured by ZeptoMetrix) shown in Table 1 are diluted to the concentrations shown in Table 12 with water for injection. A virus sample was prepared.
(2) Add 2.5 μL of the virus sample prepared in (1) to 12.5 μL of a solution (hereinafter referred to as virus extract) containing a surfactant having the following composition and heated to 46 ° C. in advance and stirred. By incubating at 46 ° C. for 4 minutes, 15 μL of viral RNA extract was prepared.
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ 塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ 塩化カリウム
２．３％ グリセロール
２３．０％ ＤＭＳＯ
０．１（ｖ／ｖ）％ Ｔｗｅｅｎ ２０
１．０（ｗ／ｗ）％ コール酸ナトリウム。
Composition of virus extract: final concentration after addition of virus sample (in 15 μL) 42.4 mM magnesium chloride 205.4 mM potassium chloride 2.3% glycerol 23.0% DMSO
0.1 (v / v)% Tween 20
1.0 (w / w)% sodium cholate.
（３）以下の組成からなるγ−ＣＤを含む反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（２）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号６）が付加されている。 (3) Dispense 15 μL of a reaction solution containing γ-CD having the following composition into a 0.5 mL PCR tube (Individual Dome Cap PCR Tube, manufactured by SSI), and incubate at 46 ° C. for 4 minutes. Immediately add 15 μL of the resulting viral RNA extract. Note that a combination of oligonucleotides having the sequences and concentrations shown in Table 2 was used for the first primer and the second primer. In addition, a T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 6) is added to the first primer on the 5 ′ end side of the base sequence described in each SEQ ID NO shown in Table 2.
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
７０ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
６（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ。
Composition of reaction mixture: concentration is 60 mM Tris-HCl (pH 8.6) after addition of viral RNA extract (in 30 μL)
0.25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP each
2.6mM ATP, CTP, UTP, GTP each
3.06 mM ITP
70 mM trehalose 9.1 U AMV reverse transcriptase 142 U T7 RNA polymerase each 20 nM INAF probe (prepared in Example 2) (SEQ ID NOs: 4 and 5)
First primer at the concentration described in Table 2 Second primer 6 (w / w)% γ-CD at the concentration described in Table 2.
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。 (5) Using a fluorescence spectrophotometer with a temperature control function (TRCRapid-160, manufactured by Tosoh Corp.) capable of directly measuring a PCR tube, the reaction solution is reacted at 46 ° C. and at the same time the fluorescence intensity of the reaction solution (excitation wavelength: 470 nm, fluorescence wavelength: 520 nm). ) Was measured over time for 30 minutes. When the start solution was added for 0 minute, the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (the value obtained by dividing the fluorescence intensity value at a predetermined time by the fluorescence intensity ratio of the background) exceeded 1.2 was determined as positive.
結果を表１２に示す。概ね４．７×１０−２ＴＣＩＤ５０／ｍＬのインフルエンザウイルスを検出できており、簡便かつ迅速な方法でありながら、スピンカラムを用いた核酸抽出／精製方法（参考例１）と同等の高い効率を有していることが認められた。 The results are shown in Table 12. In general, 4.7 × 10 −2 TCID 50 / mL of influenza virus can be detected, and it is a simple and rapid method, but it has the same high efficiency as the nucleic acid extraction / purification method using a spin column (Reference Example 1). It was found to have
以下の組成からなるγ−ＣＤを含む試薬液１８．５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、Ｖｉｒｔｉｓ ＧＥＮＥＳＩＳ １２ＳＬにて、−４０℃ ２時間、−２０℃ １４時間、２５℃ ２時間で真空下において凍結乾燥した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号６）が付加されている。
試薬液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．７ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ ＩＴＰ
１９８．９ｍＭ トレハロース
９．１Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）（配列番号４および５）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
６．８（ｗ／ｗ）％ γ−ＣＤ。
Composition of reagent solution: concentration is 60 mM Tris-HCl (pH 8.6) at final concentration after addition of viral RNA extract (in 30 μL)
0.25 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP each
2.7 mM each ATP, CTP, UTP, GTP
3.06 mM ITP
198.9 mM trehalose 9.1 U AMV reverse transcriptase 142 U T7 RNA polymerase each 20 nM INAF probe (prepared in Example 2) (SEQ ID NOs: 4 and 5)
First primer with the concentration described in Table 2 6.8 (w / w)% γ-CD of the second primer with the concentration described in Table 2.
実施例１２ 凍結乾燥増幅試薬によるインフルエンザウイルスの検出感度
以下の方法により、本発明の核酸抽出／増幅試薬を用いて、各種インフルエンザウイルスの検出を行った。
（１）表１に示すＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルスを、注射用水で表１３に記載の濃度に希釈することでウイルス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料３μＬを、予め４６℃に加熱した以下の組成からなる界面活性剤を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）２７μＬに添加、撹拌し、４６℃で４分間保温し、３０μＬを実施例１１で作製した凍結乾燥試薬に添加した。
Example 12 Sensitivity of detection of influenza virus by lyophilized amplification reagent Various influenza viruses were detected by the following method using the nucleic acid extraction / amplification reagent of the present invention.
(1) A virus sample was prepared by diluting the type A (H1N1 subtype) influenza virus shown in Table 1 to the concentrations shown in Table 13 with water for injection.
(2) 3 μL of the virus sample prepared in (1) was added to 27 μL of a surfactant-containing solution (hereinafter referred to as virus extract) having the following composition heated to 46 ° C. in advance and stirred at 46 ° C. Incubated for 4 minutes and 30 μL was added to the lyophilized reagent prepared in Example 11.
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後の最終濃度
２２．２ｍＭ 塩化マグネシウム
４７．５ｍＭ 塩化カリウム
１．２％ グリセロール
１０．３％ ＤＭＳＯ
０．０５（ｖ／ｖ）％ Ｔｗｅｅｎ ２０
１．５（ｗ／ｗ）％ コール酸ナトリウム。
Composition of virus extract: final concentration after addition of virus sample 22.2 mM Magnesium chloride 47.5 mM Potassium chloride 1.2% Glycerol 10.3% DMSO
0.05 (v / v)% Tween 20
1.5 (w / w)% sodium cholate.
同時に実施例１０で示した液状試薬（反応液）を用いて、温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。 At the same time, using the liquid reagent (reaction solution) shown in Example 10 and using a fluorescence spectrophotometer with temperature control function (TRCRapid-160, manufactured by Tosoh Corp.), the reaction is performed at 46 ° C. and at the same time the fluorescence intensity (excitation of the reaction solution) Wavelength 470 nm, fluorescence wavelength 520 nm) was measured over time for 30 minutes. When the start solution was added for 0 minute, the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (the value obtained by dividing the fluorescence intensity value at a predetermined time by the fluorescence intensity ratio of the background) exceeded 1.2 was determined as positive.
結果を表１３に示す。乾燥状態の増幅試薬においても、液状の試薬と同程度の検出性能を有していることが示された。 The results are shown in Table 13. It was shown that the amplification reagent in the dry state has the same detection performance as that of the liquid reagent.
Claims (13)
（ｉ）ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬
（ｉｉ）シクロデキストリン
（ｉｉｉ）核酸増幅試薬 A kit for extracting and amplifying a viral nucleic acid from a virus-containing sample, comprising the following (i) (ii) (iii):
(I) viral nucleic acid extraction reagent containing at least a surfactant having a steroid skeleton (ii) cyclodextrin (iii) nucleic acid amplification reagent
（ｉ）当該ウイルスを、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬と接触させる核酸抽出工程
（ｉｉ）（ｉ）によって抽出されたウイルス核酸抽出液にシクロデキストリンを接触させる工程
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の工程で得られた溶液の一部または全部を核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程 A method for extracting and amplifying viral nucleic acid from a virus-containing sample, comprising the following steps (i), (ii) and (iii):
(I) a step of bringing a cyclodextrin into contact with a viral nucleic acid extract extracted by the nucleic acid extraction step (ii) (i) in which the virus is brought into contact with a viral nucleic acid extraction reagent containing at least a surfactant having a steroid skeleton (iii) ) A nucleic acid amplification step in which a part or all of the solution obtained in the step (ii) is brought into contact with a nucleic acid amplification reagent.
（ｉ）当該ウイルスを、ステロイド骨格を有する界面活性剤を少なくとも含むウイルス核酸抽出試薬と接触させる核酸抽出工程
（ｉｉ）（ｉ）によって抽出されたウイルス核酸抽出液を、シクロデキストリンを含む核酸増幅試薬と接触させる核酸増幅工程 A method for extracting and amplifying viral nucleic acid from a virus-containing sample, comprising the following steps (i) and (ii):
(I) A nucleic acid amplification reagent containing a cyclodextrin, wherein the virus nucleic acid extract extracted by the nucleic acid extraction step (ii) (i) is brought into contact with the virus nucleic acid extraction reagent containing at least a surfactant having a steroid skeleton. Nucleic acid amplification step to be contacted
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