JP2017181404A - Analysis sample preparation method, maldi-ms sample plate, and analysis method - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a sample for MALDI-MS analysis comprising a mixture of a sample to be analyzed and a matrix accommodated in each of a plurality of wells provided on a sample plate.SOLUTION: Portions of a sample solution containing identical components are spotted onto two or more wells (38). The two or more portions of the sample solution spotted onto different wells go through different treatments that are well-dependent before and/or after being spotted onto the wells. The different treatments herein include a treatment for giving different m/z ratios to an identical specific component, and a treatment for giving different peak intensities to an identical specific component.SELECTED DRAWING: Figure 2

Description

本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法により質量分析を行うための試料の調製方法、および調製された試料の分析方法に関する。さらに、本発明はＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析用試料の調製に用いられるサンプルプレートに関する。本発明は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）とＭＡＬＤＩ質量分析装置（ＭＳ）とを組み合わせたＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に適用可能である。   The present invention relates to a sample preparation method for performing mass spectrometry by a matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) method, and a method for analyzing the prepared sample. Furthermore, the present invention relates to a sample plate used for preparing a sample for MALDI-MS analysis. The present invention is applicable to LC / MALDI-MS analysis in which a liquid chromatograph (LC) and a MALDI mass spectrometer (MS) are combined.

生命科学の研究や医療、医薬品開発等の分野において、質量分析によりタンパク質を網羅的に解析するプロテオーム解析が盛んに行われるようになっている。質量分析では、イオン化された試料を質量および電荷に基づいて分離する。第一段階で分離されたイオンを、衝突誘起解離（ＣＩＤ）等によりフラグメント化し、さらに質量分析を行う多段の質量分析（ＭＳ^ｎ分析）は、タンパク質やペプチドの質量だけでなく、様々な構造情報を得ることができる。 In fields such as life science research, medical care, and drug development, proteome analysis that comprehensively analyzes proteins by mass spectrometry has been actively performed. In mass spectrometry, an ionized sample is separated based on mass and charge. Multistage mass spectrometry (MS ⁿ analysis), in which ions separated in the first stage are fragmented by collision-induced dissociation (CID), etc., and mass analysis is performed, is not only the mass of proteins and peptides, but also various structural information Can be obtained.

質量分析における試料のイオン化法として、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法やマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法等が実用化されている。ＭＡＬＤＩ法は、マトリックスの選択により様々な生体分子の分析が可能であることや、ＥＳＩ法よりも少量の試料や低純度の試料でも分析が可能であるとの利点を有する。   Electrospray ionization (ESI) method, matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) method, and the like have been put into practical use as sample ionization methods in mass spectrometry. The MALDI method has an advantage that various biomolecules can be analyzed by selecting a matrix, and analysis can be performed even with a smaller amount of sample or a sample with lower purity than the ESI method.

多くの成分を含む生体試料を網羅的に解析するために、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と質量分析（ＭＳ）とを組み合わせた分析手法が用いられている。ＬＣとＥＳＩ−ＭＳとを組み合わせたＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳでは、試料溶液中のタンパク質やペプチド等の試料成分を直接的にイオン化することが可能であるため、前段のＬＣからＭＳへの試料導入が自動化されている。一方、ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、試料をイオン化するために、液体試料をマトリックスと混合する必要がある。そのため、ＬＣとＭＡＬＤＩ−ＭＳとを組み合わせたＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、ＬＣで分離された試料をその溶出の時間順序に従って分画し、スポッティング装置によりサンプルプレート上の異なるウェルにスポットする。この際サンプルプレートのウェル上にあらかじめマトリックスを収容しておくか、試料のスポット時にマトリックスを添加することにより、ウェル上で試料とマトリックスとが混合される。その後、サンプルプレートをＭＡＬＤＩ質量分析装置にセットし、各サンプルに対する質量分析を順次行うことにより、マススペクトルが得られる。   In order to comprehensively analyze a biological sample containing many components, an analysis technique combining liquid chromatography (LC) and mass spectrometry (MS) is used. In LC / ESI-MS, which combines LC and ESI-MS, sample components such as proteins and peptides in the sample solution can be directly ionized, so sample introduction from the previous LC to MS is possible. It is automated. On the other hand, in MALDI-MS, it is necessary to mix a liquid sample with a matrix in order to ionize the sample. Therefore, in LC / MALDI-MS in which LC and MALDI-MS are combined, a sample separated by LC is fractionated according to the time sequence of elution, and spotted on different wells on a sample plate by a spotting device. At this time, the sample and the matrix are mixed on the well by storing the matrix in advance on the well of the sample plate or adding the matrix at the time of spotting the sample. Then, a mass spectrum is obtained by setting a sample plate in a MALDI mass spectrometer and sequentially performing mass analysis on each sample.

多くの成分を含む生体試料の解析には、ＭＳの前段として高分離能のＬＣを利用することが有用である。ＬＣの分解能を高めることにより、１つの分画に含まれる成分の数を減少させ、ノイズ要因の少ない良好なマススペクトルが得られる。タンパク質やペプチド等の微量のサンプルの質量分析の感度を向上するために、微小流量でも安定した分離を実現可能なナノＬＣ技術も実用化されている。   For analysis of biological samples containing many components, it is useful to use LC with high resolution as a pre-stage of MS. By increasing the resolution of the LC, the number of components contained in one fraction can be reduced, and a good mass spectrum with few noise factors can be obtained. In order to improve the mass spectrometry sensitivity of a very small amount of sample such as protein or peptide, nano LC technology capable of realizing stable separation even at a minute flow rate has been put into practical use.

一方、ＬＣの分解能を高めると、試料の分画数（サンプルプレートのウェル上にスポットされる試料の数）が多くなるため、質量分析に要する時間が長くなり、データの解析も複雑となる。このような問題を解決するために、ＬＣでの保持時間やＭＳでの質量等の先験情報に基づいて、ウェルにスポットする分画試料を選別する方法や、ＭＳの解析対象を選別する方法が提案されている（例えば特許文献１）。   On the other hand, when the resolution of the LC is increased, the number of sample fractions (the number of samples spotted on the wells of the sample plate) increases, so the time required for mass analysis increases and the data analysis becomes complicated. In order to solve such problems, a method of selecting a fraction sample to be spotted on a well based on a priori information such as a retention time in LC and a mass in MS, and a method of selecting an analysis target of MS Has been proposed (for example, Patent Document 1).

特開２０１３−１７８１９６号公報JP 2013-178196 A

先験情報に基づく分析対象の選別は、分析対象のタンパクやペプチドのＬＣ溶出時間等が未知の場合には、適用できない。また、ナノＬＣは、溶出時間に非線形の歪が生じやすく、正確な溶出時間の予測が困難であるため、分析対象の分画数を十分に絞り込むことは容易ではない。特に、ＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、ＬＣによる分離と質量分析とがオフラインであるため、マスクロマトグラムを確認しながらＬＣ条件の調整や分取分画の選択を行うことができず、分析条件の調整に試行錯誤が求められる場合が多い。また、ＭＡＬＤＩ法では、マトリックスの種類や濃度が異なると試料のイオン化効率が変化するため、マトリックスを最適化するための知見や予備実験を要する場合が多い。   The selection of the analysis target based on the prior information is not applicable when the LC elution time of the protein or peptide to be analyzed is unknown. In addition, since nano LC tends to cause nonlinear distortion in the elution time and it is difficult to accurately predict the elution time, it is not easy to sufficiently narrow down the number of fractions to be analyzed. In particular, since LC / MALDI-MS is offline for LC separation and mass spectrometry, it is not possible to adjust LC conditions or select preparative fractions while checking mass chromatograms. Trial and error are often required for adjustment. Further, in the MALDI method, the ionization efficiency of the sample changes when the type and concentration of the matrix are different, and thus knowledge and preliminary experiments for optimizing the matrix are often required.

上記のように、ＭＡＬＤＩ法は、高分子量のタンパク質をそのまま分析可能であるため、ＥＳＩ法に比べて試料の前処理が簡便であり、分析対象に関する多くの情報を得られるとの利点を有する。その反面、マトリックスの種類および濃度の最適化や、分析対象とするＬＣ分画の選別に試行錯誤を要することが多く、分析条件の設定が煩雑となりやすい。   As described above, since the MALDI method can analyze a high molecular weight protein as it is, pretreatment of the sample is simpler than the ESI method, and it has an advantage that a lot of information on the analysis target can be obtained. On the other hand, optimization of the type and concentration of the matrix and selection of the LC fraction to be analyzed often require trial and error, and the setting of analysis conditions tends to be complicated.

上記に鑑み、本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおけるマトリックスの選択や、分析対象の選択を容易に行い得る分析用試料の提供を目的とする。   In view of the above, an object of the present invention is to provide an analytical sample that can easily select a matrix in MALDI-MS and an analysis target.

本発明は、サンプルプレートに設けられた複数のウェル上のそれぞれに、分析対象試料とマトリックスとの混合物が収容されたＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析用試料の調製方法に関する。分析用試料は、サンプルプレート上の２以上のウェルのそれぞれに、同一の成分を含む試料溶液がスポットされている。異なるウェルにスポットされた同一の成分を含む２以上の試料溶液は、ウェル上へのスポット前およびスポット後の少なくとも一方において、スポット対象のウェルごとに異なる処理が行われる。   The present invention relates to a method for preparing a sample for MALDI-MS analysis in which a mixture of a sample to be analyzed and a matrix is accommodated in each of a plurality of wells provided in a sample plate. In the sample for analysis, a sample solution containing the same component is spotted in each of two or more wells on the sample plate. Two or more sample solutions containing the same component spotted in different wells are subjected to different treatments for each well to be spotted before and after spotting on the well.

ＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を行う場合、液体クロマトグラフィーにより分画された試料をサンプルプレートのウェル上にスポットすればよい。液体クロマトグラフィーの溶出時間が同一または近接する試料は、同一の成分を含む。そのため、２以上の異なるウェルにスポットするための試料溶液を容易に調製できる。   When performing LC / MALDI-MS analysis, a sample fractionated by liquid chromatography may be spotted on the well of a sample plate. Samples having the same or close elution times in liquid chromatography contain the same components. Therefore, a sample solution for spotting in two or more different wells can be easily prepared.

スポット対象のウェルごとに行われる異なる処理としては、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析において同一の特定成分に対して異なるｍ／ｚを与える２種以上の処理や、同一の特定成分に対して異なるピーク強度を与える２種以上の処理が挙げられる。   Different treatments performed for each well to be spotted include two or more treatments that give different m / z to the same specific component in MALDI-MS analysis, and different peak intensities for the same specific component Two or more kinds of treatments can be mentioned.

例えば、特定成分がジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドである場合、ジスルフィド結合が還元された成分を与える処理およびジスルフィド結合が維持される成分を与える処理を行えば、同一のタンパク質またはペプチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析においてｍ／ｚの異なるピークが得られる。   For example, when the specific component is a protein or peptide having a disulfide bond, the MALDI-MS of the same protein or peptide can be obtained by performing a treatment that gives a component in which the disulfide bond is reduced and a treatment that gives a component that maintains the disulfide bond. In the analysis, peaks with different m / z are obtained.

ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析において同一の特定成分に対して異なるピーク強度を与える処理としては、スポット対象のウェルごとに種類および／または濃度が異なるマトリックスを用い、試料溶液と混合する処理が挙げられる。種類および／または濃度が異なるマトリックスを用いて、ｍ／ｚの異なるピークが得られるように処理を行ってもよい。   In the MALDI-MS analysis, a process of giving different peak intensities to the same specific component includes a process of using a matrix having a different kind and / or concentration for each well to be spotted and mixing with a sample solution. Processing may be performed using different types and / or concentrations of matrices so as to obtain different m / z peaks.

種類および／または濃度が異なる２以上のマトリックスを用いる場合、異なるマトリックスが、異なるウェルに収容されたサンプルプレートを利用できる。マトリックスが収容されたウェル上に試料溶液をスポットすることにより、マトリックスと試料溶液との混合を行い得る。なお、異なる２以上のマトリックスは、１枚のプレートのウェルに収容されていてもよく、２枚以上のプレートのウェルに収容されていてもよい。   If two or more matrices of different types and / or concentrations are used, sample plates can be used in which different matrices are housed in different wells. The matrix and sample solution can be mixed by spotting the sample solution on the well containing the matrix. Two or more different matrices may be accommodated in wells of one plate or may be accommodated in wells of two or more plates.

さらに、本発明は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより、上記で調製された分析用試料の分析を実施する分析方法に関する。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（一段のＭＳ）分析により得られたマススペクトルの解析において、異なるウェルにスポットされ同一の成分を含む２以上の試料のマススペクトルを対比する。同一の特定成分に対して、２種以上の異なる処理が行われている場合、これらの試料のマススペクトルは、特定成分のピークのｍ／ｚおよび／またはピーク強度が相違する。この対比結果に基づいて、ＭＳ^ｎ分析の対象とする試料（ウェル）を選別できる。 Furthermore, this invention relates to the analysis method which implements the analysis of the sample for analysis prepared above by MALDI-MS. In the analysis of mass spectra obtained by MALDI-MS (one-stage MS) analysis, the mass spectra of two or more samples spotted in different wells and containing the same component are compared. When two or more different treatments are performed on the same specific component, the m / z and / or peak intensity of the peak of the specific component is different in the mass spectrum of these samples. Based on this comparison result, a sample (well) to be subjected to MS ⁿ analysis can be selected.

本発明によれば、同一の特定成分に対して異なる処理を実施した２以上の試料のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を実施し、マススペクトルの対比を行うことにより、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおけるマトリックスの選択や、分析対象の選択を容易に行い得る。また、特定成分のＬＣ溶出時間や質量等の先験情報がない場合でも、マススペクトルの対比結果に基づいてＭＳ^ｎ分析対象試料を容易に選定できる。分析対象試料を選定してＭＳ^ｎ分析を実施することにより、分析に要する時間を短縮できるとともに、データの解析が容易となる。マススペクトルの対比結果に基づいて、ピーク強度の大きい試料をＭＳ^ｎ分析対象として選別すれば、Ｓ／Ｎの高い良質の分析結果が得られるため、分析精度を向上できる。 According to the present invention, by performing MALDI-MS analysis of two or more samples subjected to different treatments on the same specific component and comparing mass spectra, matrix selection and analysis in MALDI-MS can be performed. It is possible to easily select a target. In addition, even when there is no prior information such as LC elution time or mass of a specific component, the MS ⁿ analysis target sample can be easily selected based on the result of comparison of mass spectra. By selecting the sample to be analyzed and performing the MS ⁿ analysis, the time required for the analysis can be shortened and the data can be easily analyzed. If a sample having a high peak intensity is selected as an MS ⁿ analysis target based on the comparison result of the mass spectrum, a high-quality analysis result with a high S / N can be obtained, so that the analysis accuracy can be improved.

ＬＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳ装置の構成概略図である。1 is a schematic configuration diagram of an LC / MALDI-MS apparatus. ウェル上に複数種のマトリックスが収容されたＭＡＬＤＩ用サンプルプレートの一形態を表す概念図である。It is a conceptual diagram showing one form of the sample plate for MALDI in which the multiple types of matrix was accommodated on the well. 複数のサンプルプレート上に溶出液をスポットするためのスポッティング装置の構成概略図である。It is the structure schematic of the spotting apparatus for spotting an eluate on a some sample plate.

図１は、本発明に用いられるＬＣ／ＭＳ装置の一形態の概略構成図である。ＬＣ／ＭＳ装置は、液体試料中の各種成分を保持時間に応じて分離するＬＣ部１０と、ＬＣ部で分離された成分を含む試料を分取・分画してサンプルプレート上のそれぞれ異なるウェル上へスポットするスポッティング装置２０と、サンプルプレート上にスポットされた分画試料をイオン化して質量分析を実行する質量分析部４０とを備える。   FIG. 1 is a schematic configuration diagram of an embodiment of an LC / MS apparatus used in the present invention. The LC / MS apparatus includes an LC unit 10 that separates various components in a liquid sample according to the holding time, and a sample containing components separated by the LC unit, and separates and fractionates samples on the sample plate. A spotting device 20 for spotting upward and a mass analysis unit 40 for ionizing the fractionated sample spotted on the sample plate and executing mass spectrometry are provided.

ＬＣ部１０は、移動相が貯留された移動相容器１１と、移動相中に試料を注入するインジェクタ１３と、カラム１５とを備える。移動相容器１１中の移動相は、不図示の送液ポンプにより一定流速でカラム１５に送液される。カラム１５は、移動相に乗って導入される試料中の各種成分を時間方向に分離して溶出する。   The LC unit 10 includes a mobile phase container 11 in which a mobile phase is stored, an injector 13 for injecting a sample into the mobile phase, and a column 15. The mobile phase in the mobile phase container 11 is sent to the column 15 at a constant flow rate by a liquid feed pump (not shown). The column 15 separates and elutes various components in the sample introduced on the mobile phase in the time direction.

スポッティング装置２０は、カラム１５からの溶出液を所定の時間間隔で分画し、分注ヘッド２５から、スポッティング装置内に配置されたサンプルプレート３１上にスポットする。分注ヘッド２５は移動可能に構成されており、サンプルプレート３１上の異なるウェル３８に溶出液を順次スポットする。各ウェル３８にスポットされた溶出液は、カラム１５での保持時間が所定範囲内である溶出液を含む。すなわち、ウェル３８の位置は、ＬＣ保持時間と関連付けられている。   The spotting device 20 fractionates the eluate from the column 15 at a predetermined time interval, and spots the sample from a dispensing head 25 on a sample plate 31 disposed in the spotting device. The dispensing head 25 is configured to be movable, and the eluate is sequentially spotted in different wells 38 on the sample plate 31. The eluate spotted in each well 38 includes an eluate whose retention time in the column 15 is within a predetermined range. That is, the position of the well 38 is associated with the LC retention time.

溶出液中の各成分の溶出時間には幅があるため、分画時間間隔が特定成分の溶出時間の幅よりも小さい場合には、１つの成分が位置の異なる複数のウェル３８上にスポットされる。１つのウェルへのスポット量は、例えば、０．１〜２μＬ程度である。ＬＣ部からの溶出液の量が多い場合は、カラム１５と分注ヘッド２５との間に設けられたバルブ２１を調整することにより、必要量のみを分注ヘッド２５に送液し、他の溶出液を貯液部２３へ送液してもよい。貯液部２３は、カラム１５から送液された溶出液を分画分取できるように構成されていてもよい。また、カラム１５からの溶出液を不図示の溶出液トラップに送液して貯留し、トラップに貯留された溶出液を、分析必要量のみ分注ヘッド２５へ送液して、ウェル３８上にスポットしてもよい。   Since the elution time of each component in the eluate has a range, when the fractionation time interval is smaller than the elution time width of a specific component, one component is spotted on a plurality of wells 38 at different positions. The The spot amount to one well is, for example, about 0.1 to 2 μL. When the amount of the eluate from the LC section is large, by adjusting a valve 21 provided between the column 15 and the dispensing head 25, only the necessary amount is sent to the dispensing head 25, The eluate may be sent to the liquid storage unit 23. The liquid storage unit 23 may be configured to fractionate and collect the eluate sent from the column 15. In addition, the eluate from the column 15 is sent to an eluate trap (not shown) and stored, and only the necessary amount of the eluate stored in the trap is sent to the dispensing head 25 to be placed on the well 38. You may spot.

サンプルプレートのウェル３８上では、溶出液とＭＡＬＤＩマトリックスとの混合物が得られる。ウェル上で溶出液とマトリックスとの混合物を得る方法としては、ウェル上にスポットされた溶出液上にマトリックスをスポットする方法、溶出液にマトリックスを混合してスポットする方法、ウェル上に予めマトリックスがスポットされたサンプルプレートを準備しておき、その上に溶出液をスポットする方法等がある。   On the well 38 of the sample plate, a mixture of eluate and MALDI matrix is obtained. As a method of obtaining a mixture of an eluate and a matrix on a well, a method of spotting a matrix on an eluate spotted on a well, a method of mixing and spotting a matrix on an eluate, or a matrix in advance on a well There is a method of preparing a spotted sample plate and spotting the eluate thereon.

ウェル上に試料成分を含む溶出液がスポットされたサンプルプレート３１は、質量分析部４０のステージ４１上に搬送される。スポッティング装置２０から質量分析部４０へのサンプルプレート３１の搬送操作は、搬送装置等により自動化されていてもよい。サンプルプレート３１の搬送が手動で行われる場合、スポッティング装置２０と質量分析部４０とは離れた場所に設置されていてもよい。   The sample plate 31 on which the eluate containing the sample component is spotted on the well is transported onto the stage 41 of the mass spectrometer 40. The transport operation of the sample plate 31 from the spotting device 20 to the mass spectrometer 40 may be automated by a transport device or the like. When the transport of the sample plate 31 is performed manually, the spotting device 20 and the mass analyzer 40 may be installed at a remote location.

質量分析部４０は、ステージ４１上のサンプルプレート３１にレーザー光を照射するレーザー光源４２、イオンを内部に保持するイオントラップ４３、イオントラップから放出された各種イオンをｍ／ｚに応じて分離する質量分離器４５、分離されたイオンを順次検出する検出器４７等を含む。   The mass spectrometric unit 40 separates the laser light source 42 for irradiating the sample plate 31 on the stage 41 with laser light, the ion trap 43 for holding ions inside, and various ions emitted from the ion trap according to m / z. It includes a mass separator 45, a detector 47 that sequentially detects the separated ions, and the like.

ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析装置の多くは、飛行時間（ＴＯＦ）型の質量分析器を備えている。ＭＳ部は、イオントラップ４３に、イオンを分離する機能および衝突誘起解離（ＣＩＤ）によりイオンを解離させる機能を持たせることにより、イオン選択とイオン解離とを１または複数回繰り返すＭＳ^ｎ分析が可能である。ＭＳ^ｎ分析を実施することにより、タンパク質やペプチド等の試料成分の質量だけでなく、アミノ酸配列や糖鎖の同定等、様々な構造解析が可能となる。 Many of the MALDI-MS analyzers include a time-of-flight (TOF) type mass analyzer. The MS unit allows the MS ⁿ analysis to repeat ion selection and ion dissociation one or more times by providing the ion trap 43 with the function of separating ions and the function of dissociating ions by collision-induced dissociation (CID). It is. By performing MS ⁿ analysis, various structural analyzes such as identification of amino acid sequences and sugar chains as well as masses of sample components such as proteins and peptides can be performed.

ＬＣ部１０、スポッティング装置２０および質量分析部４０は、各部の動作を制御する制御部や、得られたデータを処理するためのデータ処理部と接続されている。データ処理部では、ＬＣ部での溶出時間と、サンプルプレート上のウェルの位置情報との対応付けや、質量分析部の検出器４７で得られたマススペクトルデータの記憶等を行う。   The LC unit 10, the spotting device 20, and the mass analysis unit 40 are connected to a control unit that controls the operation of each unit and a data processing unit that processes the obtained data. The data processing unit associates the elution time in the LC unit with the position information of the wells on the sample plate, stores the mass spectrum data obtained by the detector 47 of the mass analysis unit, and the like.

本発明の分析方法では、サンプルプレート３１上の複数のウェルに、同一の成分を含む試料溶液（溶出液）がスポットされる。同一の成分を含む試料溶液は、スポット対象のウェルごとに２種以上の異なる処理が行われる。これにより、サンプルプレートの複数のウェル上に、同一の試料成分が異なる条件で調製された試料がスポットされた分析用試料が形成される。この試料を質量分析部４０で分析することにより、分析対象試料の確定やマトリックスの最適化等を行い得る。   In the analysis method of the present invention, a sample solution (eluent) containing the same component is spotted in a plurality of wells on the sample plate 31. The sample solution containing the same component is subjected to two or more different treatments for each well to be spotted. As a result, an analysis sample in which the same sample components prepared under different conditions are spotted is formed on a plurality of wells of the sample plate. By analyzing this sample by the mass spectrometer 40, it is possible to determine the sample to be analyzed, optimize the matrix, and the like.

上記処理は、ウェル上への試料溶液のスポット前およびスポット後のいずれに実施してもよい。異なる処理としては、同一の試料成分を含む試料成分を、種類および／または濃度の異なるマトリックスと混合することや、２種以上の異なる反応を行うことが挙げられる。なお、処理を行わない場合と特定の処理を行う場合も、「２種以上の異なる処理」に含まれる。   The above treatment may be performed either before or after spotting the sample solution on the well. Different treatments include mixing sample components containing the same sample component with matrices of different types and / or concentrations, or performing two or more different reactions. Note that the case where the process is not performed and the case where the specific process is performed are also included in the “two or more different processes”.

［第一形態］
本発明の第一形態では、特定成分のＭＳ分析において異なるｍ／ｚを与える複数種のマトリックスが用いられる。ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおいて、レーザー照射により生成するイオンの大半は１価イオン（ｚ＝１）であるため、特定成分の分子量を変化させることにより、ＭＳ分析において異なるｍ／ｚのピークが得られる。すなわち、異なるｍ／ｚを与える複数種のマトリックスとは、同一の試料成分に対して分子量の異なる成分を生成させる複数種のマトリックスの組み合わせである。このような組み合わせの典型例は、タンパク質やペプチドと反応して分子量を増加または減少させるマトリックスと、タンパク質やペプチドの分子量を変化させないマトリックスとの組み合わせである。 [First form]
In the first embodiment of the present invention, a plurality of types of matrices that give different m / z in the MS analysis of specific components are used. In MALDI-MS, since most of the ions generated by laser irradiation are monovalent ions (z = 1), different m / z peaks can be obtained in MS analysis by changing the molecular weight of the specific component. That is, the plurality of types of matrices that give different m / z are combinations of a plurality of types of matrices that generate components having different molecular weights for the same sample component. A typical example of such a combination is a combination of a matrix that reacts with a protein or peptide to increase or decrease the molecular weight and a matrix that does not change the molecular weight of the protein or peptide.

以下、特定成分がジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を有するタンパク質またはペプチドである場合を例として説明する。ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、ジスルフィド結合が残存したタンパク質やペプチド断片を試料として、マトリックスの種類を適切に選択することにより、ジスルフィド結合の有無や数を、マススペクトルにおけるｍ／ｚの差としてとして検出できるため、ジスルフィド結合含有タンパク質の構造解析に適している。   Hereinafter, the case where the specific component is a protein or peptide having a disulfide (SS) bond will be described as an example. MALDI-MS can detect the presence or number of disulfide bonds as a difference in m / z in the mass spectrum by appropriately selecting the type of matrix using a protein or peptide fragment with disulfide bonds remaining as a sample. It is suitable for structural analysis of disulfide bond-containing proteins.

図２は、２種類の異なるマトリックスが異なるウェルに交互に収容されたサンプルプレート３１０を示している。このサンプルプレートは、横方向に１〜１０の１０列、縦方向にＡ〜Ｆの８行、計８０個のウェルを備える。奇数列のウェル３８ａには、マトリックスとして１，５−ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）が収容されており、偶数列のウェル３８ｂにはマトリックスとして２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）が収容されている。   FIG. 2 shows a sample plate 310 in which two different matrices are alternately housed in different wells. This sample plate has 10 wells of 1 to 10 in the horizontal direction and 8 rows of A to F in the vertical direction, for a total of 80 wells. The odd-numbered wells 38a contain 1,5-diaminonaphthalene (DAN) as a matrix, and the even-numbered wells 38b contain 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) as a matrix.

ＤＨＢは、最も一般的なＭＡＬＤＩマトリックスの１つであり、ジスルフィド結合には特段の影響を与えない。一方、ＤＡＮは試料をイオン化するための窒素レーザー照射時に還元剤として作用し、ジスルフィド結合部分を還元する。還元により、ジスルフィド結合が切断され、２つのシステイン残基の硫黄原子が水素化されるため、分子量が２Ｄａ増加する。したがって、Ｎ個のジスルフィド結合を有するタンパク質試料をＤＡＮマトリックスと混合してＭＳ分析を行うと、ＤＨＢマトリックスを用いた場合に比べてｍ／ｚが２Ｎ大きくなる（ｚ＝１の場合）。   DHB is one of the most common MALDI matrices and has no particular effect on disulfide bonds. On the other hand, DAN acts as a reducing agent during irradiation with a nitrogen laser for ionizing a sample, and reduces the disulfide bond portion. Reduction reduces the disulfide bond and hydrogenates the sulfur atoms of the two cysteine residues, increasing the molecular weight by 2 Da. Therefore, when a protein sample having N disulfide bonds is mixed with a DAN matrix and subjected to MS analysis, m / z is increased by 2N compared to the case of using a DHB matrix (when z = 1).

横方向に並ぶウェルにＤＡＮとＤＨＢが交互に収容されたサンプルプレート３１０を、スポッティング装置２０にセットし、ＬＣ部１０からの溶出時間に沿って、試料溶液をＡ１、Ａ２，Ａ３，Ａ４…Ａ１０，Ｂ１，Ｂ２…と、順にウェルにスポットする。これにより、溶出試料は、ＤＡＮマトリックス上およびＤＨＢマトリックス上に交互にスポットされる。このように、マトリックスが収容されたウェル上に試料溶液をスポットすることにより、複数のウェルのそれぞれに、分析対象試料とマトリックスとの混合物が収容された分析用試料が得られる。   A sample plate 310 in which DAN and DHB are alternately accommodated in wells arranged in the horizontal direction is set in the spotting device 20, and sample solutions are A1, A2, A3, A4... A10 along the elution time from the LC unit 10. , B1, B2,... This causes the eluted sample to be spotted alternately on the DAN matrix and on the DHB matrix. Thus, by spotting the sample solution on the well in which the matrix is accommodated, an analysis sample in which the mixture of the sample to be analyzed and the matrix is accommodated in each of the plurality of wells is obtained.

隣接するウェルには、ＬＣ溶出時間の近い試料がスポットされている。そのため、特定成分の溶出時間の幅よりも分画の時間間隔（隣接するウェル間の溶出時間の差）を小さくすれば、同一の試料成分（タンパク質またはペプチド）を含む試料溶液が、ＤＡＮマトリックスが収容されたウェルとＤＨＢマトリックスが収容されたウェルの両方にスポットされる。カラム１５からの溶出液をモニタするためのＵＶ検出器等が設けられている場合は、検出器で検出されるピーク幅を特定成分の溶出時間の幅として、同一の試料成分を含む試料溶液を複数のウェルにスポットするための分画時間間隔を設定してもよい。   In the adjacent well, a sample with a near LC elution time is spotted. Therefore, if the time interval of fractionation (difference in elution time between adjacent wells) is made smaller than the elution time width of the specific component, the sample solution containing the same sample component (protein or peptide) becomes the DAN matrix. Spotted in both the contained well and the well containing the DHB matrix. When a UV detector or the like for monitoring the eluate from the column 15 is provided, a sample solution containing the same sample component is used with the peak width detected by the detector as the width of the elution time of the specific component. A fractionation time interval for spotting a plurality of wells may be set.

あるいは、事前に分取した１つの分画に含まれる試料溶液を、奇数列のウェルと偶数列のウェルのそれぞれにスポットしてもよい。この場合、ＤＡＮマトリックスが収容された奇数列（２ｍ−１列）のウェルとＤＨＢマトリックスが収容された偶数列（２ｍ列）のウェルには、同一の（平均）溶出時間を有する試料溶液がスポットされる（ｍは自然数）。   Alternatively, the sample solution contained in one fraction collected in advance may be spotted in each of the odd-numbered wells and the even-numbered wells. In this case, the sample solution having the same (average) elution time is spotted on the odd row (2m-1 row) well containing the DAN matrix and the even row (2m row) well containing the DHB matrix. (M is a natural number).

試料溶液をスポット後のサンプルプレートを質量分析部４０にセットし、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによるＭＳ分析を実施する。隣接する２つのウェル（奇数列のウェルと偶数列のウェル）に、同一のタンパク質またはペプチドが含まれている場合、当該タンパク質またはペプチドがジスルフィド結合を有していなければ、２つのウェル上の試料のマススペクトルに、同一のｍ／ｚを有するピークが観測される。一方、Ｎ個のジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドが２つのウェルの両方に含まれている場合、ＤＡＮマトリックスを有するウェルのマススペクトルには、ＤＨＢマトリックスを有するウェルよりも、ｍ／ｚが２Ｎ大きいピークが観測される。   The sample plate after spotting the sample solution is set in the mass spectrometer 40, and MS analysis by MALDI-MS is performed. When two adjacent wells (an odd-numbered well and an even-numbered well) contain the same protein or peptide, the sample on the two wells unless the protein or peptide has a disulfide bond Peaks having the same m / z are observed in the mass spectrum. On the other hand, if a protein or peptide having N disulfide bonds is contained in both of the two wells, the mass spectrum of the well having the DAN matrix has a m / z 2N greater than that of the well having the DHB matrix. A peak is observed.

このように、１つのプレート上に２種類のマトリックスを配置し、ＬＣ溶出時間が同一または近接する液体試料を２種類のマトリックスのそれぞれと混合し、ＭＡＬＤＩ測定により得られるマススペクトルを比較することにより、ジスルフィド結合を含むタンパク質またはペプチドがスポットされたウェル（およびそれに対応するＬＣ溶出時間）を容易に確認できる。このようにして、ジスルフィド結合を含むタンパク質のＬＣ溶出時間が既知となるため、次回以降の分析において、ＭＡＬＤＩ−ＭＳの分析対象とすべき分画の選定が容易となる。   In this way, by arranging two types of matrices on one plate, mixing liquid samples with the same or close LC elution time with each of the two types of matrices, and comparing mass spectra obtained by MALDI measurement , Wells (and corresponding LC elution times) spotted with proteins or peptides containing disulfide bonds can be easily identified. Thus, since the LC elution time of a protein containing a disulfide bond is known, selection of a fraction to be analyzed by MALDI-MS is facilitated in the subsequent analysis.

上記で得られた結果に基づく知見は、次回以降の分析に利用できるのみならず、さらなる分析に供する試料の選定にも利用できる。ＭＡＬＤＩ法では、サンプルプレートのウェルに収容された試料を繰り返し分析可能である。そのため、ＤＡＮマトリックスを用いたマススペクトルとＤＨＢマトリックスを用いたマススペクトルのｍ／ｚの差からジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドの存在が確認されたウェルの試料を、分析対象として選別し、さらなる分析に供することができる。   The knowledge based on the results obtained above can be used not only for the next and subsequent analyses, but also for selecting samples for further analysis. In the MALDI method, a sample stored in a well of a sample plate can be repeatedly analyzed. Therefore, a sample of a well in which the presence of a protein or peptide having a disulfide bond has been confirmed from the difference in m / z between the mass spectrum using the DAN matrix and the mass spectrum using the DHB matrix is selected for further analysis. Can be used.

例えば、ジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドの存在が確認されたウェルの試料をＭＳ^ｎ分析対象試料として選別すれば、ジスルフィド結合を有する成分が含まれる試料に対して選択的にＭＳ^ｎ分析（ｎは２以上）を実施できる。また、特定の数のジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドをＭＳ^ｎ分析対象試料として選別することもできる。例えば、３個のジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドを特定成分として選別する場合、ＤＡＮマトリックスを用いたマススペクトルとＤＨＢマトリックスを用いたマススペクトルのｍ／ｚの差が６であるウェルの組み合わせを分析対象として選択すればよい。 For example, if a sample of a well in which the presence of a protein or peptide having a disulfide bond is confirmed as an MS ⁿ analysis target sample, an MS ⁿ analysis (n is a selective value for a sample containing a component having a disulfide bond) is selected. 2 or more). It is also possible to select a protein or peptide having a specific number of disulfide bonds as a sample for MS ⁿ analysis. For example, when a protein or peptide having 3 disulfide bonds is selected as a specific component, a combination of wells in which the m / z difference between the mass spectrum using the DAN matrix and the mass spectrum using the DHB matrix is 6 is analyzed. What is necessary is just to select as an object.

ＭＳ^ｎ分析は、分析の目的に応じて、ＤＡＮマトリックスを有するウェル上の試料に対して行ってもよく、ＤＨＢマトリックスを有するウェル上の試料に対して行ってもよい。ＤＡＮとＤＨＢの両方のマトリックス上の試料をＭＳ^ｎ分析対象としてもよい。 MS ⁿ analysis may be performed on a sample on a well having a DAN matrix or on a sample on a well having a DHB matrix, depending on the purpose of the analysis. Samples on both the DAN and DHB matrices may be ^MSn analysis targets.

このように、ＭＳ分析（一段の質量分析）の結果から、マトリックスの相違に起因してｍ／ｚが相違する試料群（ウェル）を抽出することにより、特定成分が含まれる分画試料のみを選択的にＭＳ^ｎ分析に供することができる。特定成分が含まれるウェルを抽出するためのＭＳ分析により、分析対象のプリカーサイオンのｍ／ｚが既知となっているため、抽出されたウェル上の試料のＭＳ^ｎ分析においては、分析対象のプリカーサイオンを選択的にＣＩＤ等によるイオン解離の対象とすればよい。そのため、ＭＳ^ｎの分析対象の数を大幅に低減して、合計分析時間を短縮可能であるとともに、得られたデータの解析も容易となる。 As described above, by extracting a sample group (well) having different m / z due to the difference in matrix from the result of MS analysis (one-stage mass spectrometry), only a fraction sample containing a specific component is extracted. It can be selectively subjected to MS ⁿ analysis. Since the m / z of the precursor ion to be analyzed is known by the MS analysis for extracting the well containing the specific component, in the MS ⁿ analysis of the sample on the extracted well, the precursor to be analyzed is included. The ions may be selectively subjected to ion dissociation by CID or the like. Therefore, the number of analysis targets of MS ⁿ can be greatly reduced, the total analysis time can be shortened, and the obtained data can be easily analyzed.

ジスルフィド結合を有する試料に対して異なるｍ／ｚを与えるマトリックスの組み合わせとして、ジスルフィドの還元により分子量を増加させるＤＡＮと、分子量を増加させないＤＨＢの組み合わせを例示したが、マトリックスの種類はこれらに限定されない。分子量を増加させないマトリックスと分子量を減少させるマトリックスの組み合わせや、分子量の増加量あるいは減少量が異なるマトリックスの組み合わせ等でもよい。   Examples of matrix combinations that give different m / z to a sample having a disulfide bond include DAN that increases molecular weight by reduction of disulfide and DHB that does not increase molecular weight, but the type of matrix is not limited thereto . A combination of a matrix that does not increase the molecular weight and a matrix that decreases the molecular weight, or a combination of matrices that increase or decrease the molecular weight may be used.

ｍ／ｚの差を検出する特定成分は、ジスルフィド結合を有するタンパク質やペプチドに限定されず、マトリックスの種類を変更することにより、ＭＳ分析において異なるｍ／ｚを与えるものであればよい。   The specific component for detecting the difference in m / z is not limited to a protein or peptide having a disulfide bond, and may be any component that gives a different m / z in MS analysis by changing the type of matrix.

例えば、マトリックスとして３−アミノキノリン／ｐ−クマル酸（３−ＡＱ／ＣＡ）を用いると、一般的な固体マトリックスよりもソフトなイオン化が可能であり、リン酸や糖鎖等の翻訳後修飾基の脱離が抑制される傾向がある。そのため、糖ペプチドやリン酸化ペプチドを分析対象（ｍ／ｚの差を検出すべき特定成分）とする場合、異種のマトリックスとして３−ＡＱ／ＣＡと、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）等の一般的な固体マトリックスを用いると、ＭＡＬＤＩ測定により得られるマススペクトルは、前者のマトリックスでは翻訳後修飾基が残存したタンパク質またはペプチドのピークが主となるのに対して、後者のマトリックスでは翻訳後修飾基が脱離したタンパク質またはペプチドのピークが主となる。例えば、１個のリン酸基が脱離すると分子量が９８Ｄａ減少し、1個のシアル酸が脱離すると分子量が２９１Ｄａ減少するため、これらの分子量の差が、マススペクトルにおけるｍ／ｚの差として現れる。３−ＡＱ／ＣＡマトリックスを用いたマススペクトルとＣＨＣＡマトリックスを用いたマススペクトルのｍ／ｚの差に基づいて、糖ペプチドやリン酸化ペプチド等の存在が確認されたウェルの試料を分析対象として選別し、さらなる分析に供することができる。   For example, when 3-aminoquinoline / p-coumaric acid (3-AQ / CA) is used as a matrix, softer ionization is possible than a general solid matrix, and post-translational modification groups such as phosphoric acid and sugar chains are possible. Tends to be suppressed. Therefore, when a glycopeptide or a phosphorylated peptide is used as an analysis target (a specific component for which a difference in m / z is to be detected), 3-AQ / CA and α-cyano-4-hydroxycinnamic acid ( When a general solid matrix such as CHCA) is used, the mass spectrum obtained by MALDI measurement is mainly the protein or peptide peak in which the post-translational modification group remains in the former matrix, whereas the latter matrix. Then, the peak of the protein or peptide from which the post-translational modification group is eliminated is the main. For example, when one phosphate group is eliminated, the molecular weight decreases by 98 Da, and when one sialic acid is eliminated, the molecular weight decreases by 291 Da. Therefore, the difference between these molecular weights is the difference in m / z in the mass spectrum. appear. Based on the difference in m / z between the mass spectrum using 3-AQ / CA matrix and the mass spectrum using CHCA matrix, samples of wells in which the presence of glycopeptides, phosphorylated peptides, etc. are confirmed are selected for analysis. And can be subjected to further analysis.

分析対象をラベル化可能なマトリックスを用いて、分析対象を特定することもできる。例えば、マトリックスとして３−ＡＱ／ＣＨＣＡを用いると、糖鎖の還元末端に３−ＡＱが脱水付加し、分子量が１２６Ｄａ増加する。そのため、異種のマトリックスとして３−ＡＱ／ＣＨＣＡと、ＤＨＢ等のラベル化を行わないマトリックスとの組み合わせを用い、前者と後者のＭＡＬＤＩ測定により得られるマススペクトルを対比すると、前者では糖ペプチド由来の糖鎖や遊離糖鎖等の糖鎖由来ピークが高質量側にシフトしている。このようなｍ／ｚの差が確認されたウェル、すなわち糖鎖の存在が確認されたウェルの試料を、分析対象として選別し、さらなる分析に供することができる。   An analysis target can also be specified using a matrix capable of labeling the analysis target. For example, when 3-AQ / CHCA is used as the matrix, 3-AQ is dehydrated and added to the reducing end of the sugar chain, increasing the molecular weight by 126 Da. Therefore, using a combination of 3-AQ / CHCA as a heterogeneous matrix and a non-labeled matrix such as DHB and comparing the mass spectrum obtained by the former and the latter MALDI measurement, the former is a glycopeptide-derived sugar. Sugar chain-derived peaks such as chains and free sugar chains are shifted to the higher mass side. A sample of a well in which such a difference in m / z is confirmed, that is, a well in which the presence of a sugar chain is confirmed can be selected as an analysis target and subjected to further analysis.

図２では、サンプルプレート３１０のウェルに２種類のマトリックスが横方向に交互に収容された形態を示したが、マトリックスの配置は交互である必要はなく、ウェル上に収容されたマトリックスの配置にあわせて、分注ヘッド２５の移動順序を制御すればよい。また、それぞれのマトリックスが収容されたウェルの数は、同一である必要はなく、分析対象や目的等に応じて、特定のマトリックスが収容されたウェルの数を多くしたり少なくしてもよい。   FIG. 2 shows a form in which two types of matrixes are alternately accommodated in the wells of the sample plate 310 in the lateral direction. However, the arrangement of the matrices does not have to be alternate, and the arrangement of the matrices accommodated on the wells is not necessary. In addition, the movement order of the dispensing head 25 may be controlled. In addition, the number of wells in which each matrix is accommodated does not have to be the same, and the number of wells in which a specific matrix is accommodated may be increased or decreased depending on the analysis object, purpose, and the like.

マトリックスの種類は２種類に限定されず、３種類以上のマトリックスが用いられてもよい。例えば、ＤＡＮ、ＤＨＢおよび３−ＡＱ／ＣＨＣＡの３種のマトリックスを用い、これらのＭＡＬＤＩ測定により得られるマススペクトルを比較すれば、ジスルフィド結合を有する糖ペプチドが含まれているウェルを特定することができる等、分析対象をより詳細に特定することが可能となる。   The type of matrix is not limited to two types, and three or more types of matrices may be used. For example, by using three types of matrices of DAN, DHB, and 3-AQ / CHCA and comparing mass spectra obtained by these MALDI measurements, it is possible to identify a well containing a glycopeptide having a disulfide bond. The analysis target can be specified in more detail.

２種以上のマトリックスは、必ずしも１枚のサンプルプレート上に収容されていなくてもよい。図３は、ＬＣ部１０に、２枚のサンプルプレートを装填可能なスポッティング装置２００が接続された形態を示している。２枚のサンプルプレート３１１，３１２のそれぞれの上には、分注ヘッド２５１，２５２が配置されている。分注ヘッド２５１，２５２は各サンプルプレート３１１，３１２上を移動可能に構成されている。   Two or more kinds of matrices do not necessarily have to be accommodated on one sample plate. FIG. 3 shows a form in which a spotting device 200 capable of loading two sample plates is connected to the LC unit 10. Dispensing heads 251 and 252 are disposed on each of the two sample plates 311 and 312. The dispensing heads 251 and 252 are configured to be movable on the sample plates 311 and 312.

第一サンプルプレート３１１のウェル３８１上には第一種マトリックスが収容されており、第二サンプルプレート３１２のウェル３８２上には第二種マトリックスが収容されている。第一種マトリックスと第二種マトリックスは、異種のマトリックスであり、特定成分のＭＳ分析において異なるｍ／ｚを与える。例えば、第一サンプルプレート３１１のウェル３８１上には第一種マトリックスとしてＤＡＮが収容されており、第二サンプルプレート３１２のウェル３８２上には第二種マトリックスとしてＤＨＢが収容されている。   A first type matrix is accommodated on the well 381 of the first sample plate 311, and a second type matrix is accommodated on the well 382 of the second sample plate 312. The first-type matrix and the second-type matrix are different types of matrix and give different m / z in the MS analysis of a specific component. For example, DAN is accommodated as the first type matrix on the well 381 of the first sample plate 311, and DHB is accommodated as the second type matrix on the well 382 of the second sample plate 312.

カラム１５からの溶出液はバルブ２１０で二分され、第一分注ヘッド２５１および第二分注ヘッド２５２のそれぞれに送液される。第一分注ヘッド２５１は第一サンプルプレート３１１のＡ１位置のウェル３８１に試料溶液をスポットし、第二分注ヘッド２５２は第二サンプルプレート３１２のＡ１位置のウェル３８２に試料溶液をスポットする。これにより、同一保持時間の溶出液が、ウェル３８１の第一マトリックス上およびウェル３８２の第二マトリックス上にスポットされる。その後、第一分注ヘッド２５１および第二分注ヘッド２５２は、それぞれのサンプルプレート３１１，３１２のＡ２位置のウェル上に移動し、各ウェルに試料溶液をスポットする。このように、分注ヘッドは、Ａ１、Ａ２，Ａ３，Ａ４…Ａ１０，Ｂ１，Ｂ２…と、順に移動しながら、ウェル上に試料溶液を順次スポットする。   The eluate from the column 15 is divided into two by the valve 210 and sent to each of the first dispensing head 251 and the second dispensing head 252. The first dispensing head 251 spots the sample solution in the well 381 at the A1 position of the first sample plate 311, and the second dispensing head 252 spots the sample solution in the well 382 at the A1 position of the second sample plate 312. As a result, the eluate having the same retention time is spotted on the first matrix of the well 381 and the second matrix of the well 382. Thereafter, the first dispensing head 251 and the second dispensing head 252 move onto the wells at the position A2 of the respective sample plates 311 and 312 to spot the sample solution in each well. In this manner, the dispensing head sequentially spots the sample solution on the well while moving in order of A1, A2, A3, A4... A10, B1, B2.

複数のサンプルプレート上のそれぞれに分注ヘッドを有するスポッティング装置を用いることにより、同一保持時間を有する溶出試料を、異なるサンプルプレート上の異なるマトリックス上にスポットできる。また、１つの分注ヘッドを、複数のサンプルプレート上に順次移動させることにより、同一または近接する保持時間を有する溶出試料を異なるサンプルプレート上にスポットすることもできる。   By using a spotting device having a dispensing head on each of a plurality of sample plates, eluted samples having the same retention time can be spotted on different matrices on different sample plates. Further, by sequentially moving one dispensing head over a plurality of sample plates, it is possible to spot elution samples having the same or close holding time on different sample plates.

複数のサンプルプレートを使用する形態は、試料とマトリックスを混合後にターゲット上での処理が行われる場合に特に有用である。例えば、前述の３−ＡＱ／ＣＨＣＡを用いて糖鎖の還元末端のＡＱラベル化を行う場合、ターゲット上で一定時間の加温（例えば６０℃、６０分）が必要である。一方、ＤＨＢ等の一般的なマトリックスは、ターゲット上での処理を必要としない。一例として、ウェル上にラベル化を行うためのマトリックス（例えば３−ＡＱ／ＣＨＣＡ）を収容したサンプルプレートと、ウェル上にラベル化を行わないマトリックス（例えばＤＨＢ等）を収容したサンプルプレートとを用いる場合について説明する。この例では、同一または近接する保持時間を有する溶出試料を、それぞれのサンプルプレートにスポットする。その後、ＤＨＢを収容したサンプルプレートはそのままＭＳ分析に供すればよい、３−ＡＱ／ＣＨＣＡを収容したサンプルプレートは一定時間加温して糖鎖のラベル化を行った後にＭＳ分析に供すればよい。このように、プレート上に試料をスポット後、ＭＳ分析までの処理が異なる複数種のマトリックスを用いる場合に複数のサンプルプレートを使用すれば、分析をより効率的に実施できる。   The form using a plurality of sample plates is particularly useful when processing on the target is performed after mixing the sample and the matrix. For example, when AQ labeling of the reducing end of a sugar chain is performed using the aforementioned 3-AQ / CHCA, heating for a certain time (for example, 60 ° C., 60 minutes) is required on the target. On the other hand, a general matrix such as DHB does not require processing on the target. As an example, a sample plate containing a matrix (for example, 3-AQ / CHCA) for labeling on a well and a sample plate containing a matrix (for example, DHB) that is not labeled on a well are used. The case will be described. In this example, eluted samples having the same or close retention times are spotted on each sample plate. Thereafter, the sample plate containing DHB may be used for MS analysis as it is, and the sample plate containing 3-AQ / CHCA may be heated for a certain period of time to label the sugar chain and then used for MS analysis. Good. As described above, when a plurality of sample plates are used in the case where a plurality of types of matrices having different processes up to MS analysis are used after spotting a sample on the plate, the analysis can be performed more efficiently.

複数のサンプルプレート上の試料の質量分析を行う場合、複数のサンプルプレートを質量分析部４０内のプレート収容部（不図示）に装填し、試料搬送部により、プレート収容部とステージ４１上との間で、サンプルプレートを搬送してもよい。このような搬送機構を設けることにより、ステージ上のサンプルプレートの入れ替えを自動化できる。そのため、各プレート上の試料のマススペクトルの取得や、マススペクトルの対比に基づいてＭＳ^ｎ分析対象を選定後の分析操作も自動化可能となる。 When performing mass analysis of samples on a plurality of sample plates, a plurality of sample plates are loaded into a plate storage unit (not shown) in the mass analysis unit 40, and the sample transport unit connects the plate storage unit with the stage 41. Sample plates may be transported between them. By providing such a transport mechanism, the replacement of the sample plate on the stage can be automated. Therefore, acquisition of mass spectra of samples on each plate and analysis operation after selecting an MS ⁿ analysis target based on comparison of mass spectra can be automated.

以上、ウェル上に予めマトリックスがスポットされたサンプルプレートを用い、その上に試料溶液をスポットする場合について説明したが、ウェル上に試料溶液をスポットした後、その上にマトリックスを添加してもよい。試料溶液がスポットされたウェル上へのマトリックスの添加は、所定量のマトリックスをスポット可能なスポット装置を用いてもよく、手動で行ってもよい。スポット装置を用いる場合、マトリックスのコンタミネーションを低減するために異種のマトリックスのスポットには、別々の分注ヘッドを用いることが好ましい。   As described above, the sample plate on which the matrix is previously spotted on the well is used and the sample solution is spotted thereon. However, after the sample solution is spotted on the well, the matrix may be added thereon. . The addition of the matrix onto the well in which the sample solution is spotted may be performed manually using a spot device capable of spotting a predetermined amount of matrix or manually. When using a spot device, it is preferable to use separate dispensing heads for different matrix spots to reduce matrix contamination.

また、溶出液にマトリックスを混合して、ウェル上にスポットしてもよい。例えば、分注ヘッドを二重管構造として、内管に溶出液を通過させ、外管からマトリックスを添加することにより、溶出液にマトリックスを混合できる。この場合も、異種のマトリックスには、別々の分注ヘッドを用いることが好ましい。   Alternatively, the matrix may be mixed with the eluate and spotted on the well. For example, the matrix can be mixed with the eluate by making the dispensing head into a double tube structure, allowing the eluate to pass through the inner tube, and adding the matrix from the outer tube. Again, it is preferable to use separate dispensing heads for different types of matrices.

［第二形態］
上記の第一形態では、特定成分（例えば、ＭＳ^ｎ分析対象）がＭＳ分析において異なるｍ／ｚを与えるように、異なるマトリックスを用いたが、試料の種類によっては異なるｍ／ｚを与えるマトリックスの組み合わせの選択が困難な場合もある。第二形態では、分画された試料に対して、異なる処理を実施することにより、特定成分がＭＳ分析において異なるｍ／ｚを与えるように試料の調製を行う。前述のように、処理を行わない場合と特定の処理を行う場合も、「異なる処理」に含まれるものとする。 [Second form]
In the first form described above, different matrices are used so that specific components (eg, MS ⁿ analytes) give different m / z in the MS analysis, but depending on the type of sample, the matrix of the matrix that gives different m / z It may be difficult to select a combination. In the second embodiment, the sample is prepared such that a specific component gives a different m / z in the MS analysis by performing different processing on the fractionated sample. As described above, the case where the processing is not performed and the case where the specific processing is performed are also included in the “different processing”.

まず、第一形態と同様に、サンプルプレート上の複数のウェルに、同一の試料成分を含む溶出液がスポットされる。本形態では、サンプルプレート上にスポットされた試料溶液の反応を容易とするために、ウェル上にマトリックスがロードされていないサンプルプレートをスポッティング装置２０に装填することが好ましい。   First, as in the first embodiment, an eluate containing the same sample component is spotted in a plurality of wells on the sample plate. In this embodiment, in order to facilitate the reaction of the sample solution spotted on the sample plate, it is preferable to load the spotting device 20 with a sample plate on which no matrix is loaded on the well.

サンプルプレート上に試料溶液をスポット後に、特定成分の分子量を変化させる処理が行われる。例えば、特定成分がシステイン残基を有するタンパク質またはペプチドである場合、ヨードアセトアミドを添加してアルキル化を行うと、ジスルフィド結合を形成していないシステイン残基がカルバミドメチル化され、システイン１残基あたり分子量が５８Ｄａ増加する。また、還元によりジスルフィド結合を切断した後、カルバミドメチル化を行うと、１個のジスルフィド結合（２個のシステイン残基）あたり分子量が１１６Ｄａ増加する（還元による２Ｄａの増加、および２個のシステイン残基のカルバミドメチル化による１１４Ｄａの増加）。   After spotting the sample solution on the sample plate, a process of changing the molecular weight of the specific component is performed. For example, when the specific component is a protein or peptide having a cysteine residue, when iodoacetamide is added and alkylation is performed, the cysteine residue that does not form a disulfide bond is carbamidomethylated, and per cysteine residue. The molecular weight increases by 58 Da. Further, when carbamidomethylation is performed after cleaving the disulfide bond by reduction, the molecular weight increases by 116 Da per one disulfide bond (two cysteine residues) (increase of 2 Da by reduction and two cysteine residues). 114 Da increase due to carbamidomethylation of the group).

例えば、１個のジスルフィド結合（ジスルフィド結合を形成した２つのシステイン残基）とジスルフィド結合していない１個のシステイン残基（合計３個のシステイン残基）を有するタンパク質を含む試料溶液を３つのウェルにスポットし、第一のウェル上の試料は未処理とし、第二のウェル上の試料はカルバミドメチル化を行い、第三のウェル上の試料は還元カルバミドメチル化を行う。その後、各ウェルにマトリックスをロードし、風乾等による試料調製を行い、質量分析を実施する。   For example, three sample solutions containing a protein having one disulfide bond (two cysteine residues forming a disulfide bond) and one cysteine residue that is not disulfide bonded (three cysteine residues in total) Spot the well, leave the sample on the first well untreated, the sample on the second well undergoes carbamide methylation, and the sample on the third well undergoes reduced carbamide methylation. Thereafter, the matrix is loaded into each well, sample preparation is performed by air drying or the like, and mass spectrometry is performed.

第二のウェル上の試料のマススペクトルでは第一のウェル上の試料よりもｍ／ｚが５８大きいピークが観測され、第三のウェル上の試料のマススペクトルでは、第一のウェル上の試料よりもｍ／ｚが１７４大きいピークが観測される。このように、異なる３種類の処理を実施した試料のＭＡＬＤＩ測定により得られるマススペクトルを比較することにより、ジスルフィド結合の数だけでなく、ジスルフィド結合を形成していないシステイン残基の数も特定可能である。そのため、ＭＳ^ｎ分析の対象とするウェルをさらに絞り込むことが可能となる。 In the mass spectrum of the sample on the second well, a peak whose m / z is 58 larger than that of the sample on the first well is observed, and in the mass spectrum of the sample on the third well, the sample on the first well is observed. A peak with m / z larger by 174 is observed. In this way, by comparing the mass spectra obtained by MALDI measurement of three different types of treatment samples, it is possible to specify not only the number of disulfide bonds but also the number of cysteine residues that have not formed disulfide bonds. It is. Therefore, it is possible to further narrow down the wells to be subjected to MS ⁿ analysis.

マトリックスに依存せず特定成分の分子量を変化させる処理は、分子量を変化させる処理のバリエーションが多いため、適用可能な試料の制限が少ない。例えば、糖タンパクや糖ペプチドを対象とする場合は、酵素処理による脱グルコシル化の有無により、分子量を変化させることができる。また、糖鎖非還元末端のシアル酸等に対する修飾処理を行うことにより、特定の糖鎖を有する糖タンパク質や糖ペプチドを、分子量の変化の有無により選別できる。また、異なる化学反応を行う代わりに、同位体ラベルの有無により、特定成分がＭＳ分析において異なるｍ／ｚを与えるように試料の調製を行ってもよい。   In the process of changing the molecular weight of the specific component without depending on the matrix, there are many variations of the process of changing the molecular weight, so that there are few restrictions on the applicable samples. For example, when a glycoprotein or glycopeptide is targeted, the molecular weight can be changed depending on the presence or absence of deglucosylation by enzyme treatment. Further, by performing a modification treatment on sialic acid or the like at the non-reducing end of the sugar chain, a glycoprotein or glycopeptide having a specific sugar chain can be selected based on whether or not the molecular weight has changed. Further, instead of performing different chemical reactions, a sample may be prepared so that a specific component gives a different m / z in MS analysis depending on the presence or absence of an isotope label.

試料溶液を分画後の処理は、サンプルプレートへのスポッティング前にオフラインで実施してもよい。例えば、ＬＣカラムからの溶出液を、溶出液トラップやフラクションコレクタ等により貯留し、貯留された溶出液を必要量取り出して処理を行った後、サンプルプレートのウェル上にスポットしてもよい。   The processing after fractionating the sample solution may be performed off-line before spotting on the sample plate. For example, the eluate from the LC column may be stored by an eluent trap, a fraction collector, etc., and after the necessary amount of the stored eluate is taken out and processed, it may be spotted on the well of the sample plate.

［第三形態］
上記第一形態および第二形態では、特定成分がＭＳ分析において異なるｍ／ｚを与えるように、異なる処理（異なるマトリックスとの混合や異なる反応等）を行ったが、特定成分に対する異なる処理は、マススペクトルにおけるピーク強度を変化させるものでもよい。その具体例としては、分画後の試料溶液に、種類や濃度の異なるマトリックスを混合する方法が挙げられる。 [Third form]
In the first embodiment and the second embodiment, different processes (mixing with different matrices, different reactions, etc.) were performed so that the specific component gave different m / z in the MS analysis. The peak intensity in the mass spectrum may be changed. Specific examples thereof include a method of mixing different types and concentrations of matrices into the sample solution after fractionation.

特定成分の濃度が同一の試料であっても、マトリックスの種類や濃度が異なると、イオン化効率が異なる。ノイズ要因の少ない良好な分析を行うためには、分析対象成分のイオン化効率が高くなるマトリックスの選択が重要となる。同一の試料成分を含む溶出液に、種類や濃度の異なるマトリックスを混合することにより、サンプルプレートの複数のウェル上に、同一の試料成分が種類および／または濃度の異なるマトリックスと混合された試料がスポットされた分析用試料が形成される。   Even if the concentration of the specific component is the same, the ionization efficiency differs if the type and concentration of the matrix are different. In order to perform a good analysis with few noise factors, it is important to select a matrix that increases the ionization efficiency of the analysis target component. By mixing matrices of different types and concentrations into eluents containing the same sample components, a sample in which the same sample components are mixed with different types and / or concentrations of matrix on multiple wells of the sample plate A spotted analytical sample is formed.

例えば、図２に示すサンプルプレート３１０の奇数列のウェル３８ａには、マトリックスとしてＣＨＣＡをロードし、偶数列のウェル３８ｂにはマトリックスとしてＤＨＢをロードしておく。ＣＨＣＡはペプチドや低分子量タンパク質に対して高いイオン化効率を与える傾向がある。一方、ＤＨＢは、糖タンパク質に対して高いイオン化効率を与える傾向がある。   For example, the odd-numbered wells 38a of the sample plate 310 shown in FIG. 2 are loaded with CHCA as a matrix, and the even-numbered wells 38b are loaded with DHB as a matrix. CHCA tends to give high ionization efficiency to peptides and low molecular weight proteins. On the other hand, DHB tends to give high ionization efficiency to glycoproteins.

横方向に並ぶウェルにＣＨＣＡとＤＨＢが交互に収容されたサンプルプレート３１０を、スポッティング装置２０にセットし、ＬＣ部１０からの溶出時間に沿って、試料溶液をＡ１、Ａ２，Ａ３，Ａ４…Ａ１０，Ｂ１，Ｂ２…と、順にウェルにスポットする。これにより、溶出試料は、ＣＨＣＡマトリックス上およびＤＨＢマトリックス上に交互にスポットされる。第一形態と同様、隣接するウェルには、ＬＣ溶出時間が近接するか同一である試料溶液がスポットされる。   A sample plate 310 in which CHCA and DHB are alternately accommodated in wells arranged in the horizontal direction is set in the spotting apparatus 20, and sample solutions are A1, A2, A3, A4... A10 along the elution time from the LC unit 10. , B1, B2,... This causes the eluted sample to be spotted alternately on the CHCA matrix and on the DHB matrix. Similar to the first embodiment, adjacent wells are spotted with sample solutions having the same or the same LC elution time.

試料溶液をスポット後のサンプルプレートを質量分析部４０にセットし、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによるＭＳ分析を実施する。ＣＨＣＡマトリックスを適用したウェル上試料のマススペクトルとＤＨＢマトリックスを適用したウェル上の試料のマススペクトルとを対比して、より高いピーク強度を与える試料を選択し、ＭＳ^ｎ分析を実施することにより、Ｓ／Ｎ比の高い分析結果が得られる。なお、低分子量成分が含まれる分画では、ＣＨＣＡマトリックスを適用したウェルの試料がマススペクトルにおいて高いピーク強度を示す傾向があり、糖タンパク質が含まれる分画では、ＤＨＢマトリックスを適用したウェルの試料がマススペクトルにおいて高いピーク強度を示す傾向がある。 The sample plate after spotting the sample solution is set in the mass spectrometer 40, and MS analysis by MALDI-MS is performed. By comparing the mass spectrum of the sample on the well to which the CHCA matrix is applied with the mass spectrum of the sample on the well to which the DHB matrix is applied, selecting a sample that gives a higher peak intensity, and performing MS ⁿ analysis, An analysis result having a high S / N ratio can be obtained. In the fraction containing the low molecular weight component, the sample of the well to which the CHCA matrix is applied tends to show a high peak intensity in the mass spectrum, and in the fraction containing the glycoprotein, the sample of the well to which the DHB matrix is applied. Tends to show high peak intensity in the mass spectrum.

このように、試料がスポットされたウェルの全てに対してＭＳ分析を実施して、マトリックスの相違に起因してピーク強度の高いウェルを抽出することにより、それぞれの試料成分に対してイオン化効率の高いマトリックスを用いたＭＳ^ｎ分析が可能となる。そのため、各分画に含まれるそれぞれの成分に対して、マトリックスを最適化し、分析を効率化できるとともに、Ｓ／Ｎ比の高い良好な分析結果が得られる。 In this way, by performing MS analysis on all of the wells in which the sample is spotted and extracting wells with high peak intensity due to the difference in matrix, the ionization efficiency of each sample component is improved. MS ⁿ analysis using a high matrix becomes possible. Therefore, it is possible to optimize the matrix for each component contained in each fraction, improve the efficiency of analysis, and obtain a good analysis result with a high S / N ratio.

異なるマトリックスの組み合わせとして、ＣＨＣＡとＤＨＢの組み合わせを例示したが、マトリックスの種類はこれらに限定されない。例えば、アルキル化トリヒドロキシアセトフェノン（ＡＴＨＡＰ）は、疎水性の高いペプチド分析に有効なマトリックスとして知られている。ＡＴＨＡＰと他のマトリックスの組み合わせを用い、ＡＴＨＡＰマトリックスを用いたマススペクトルにおいて高いピーク強度を示す成分を抽出することにより、疎水性の高い試料を選択的にＭＳ^ｎ分析に供して、Ｓ／Ｎ比の高い良好な分析結果を得ることができる。 Although the combination of CHCA and DHB was illustrated as a combination of different matrices, the kind of matrix is not limited to these. For example, alkylated trihydroxyacetophenone (ATHAP) is known as an effective matrix for the analysis of highly hydrophobic peptides. By using a combination of ATHAP and another matrix and extracting a component showing a high peak intensity in the mass spectrum using the ATHAP matrix, a sample having high hydrophobicity is selectively subjected to MS ⁿ analysis, and an S / N ratio is obtained. A good analysis result with high can be obtained.

また、３種以上のマトリックスを組み合わせてもよい。試料溶液中には様々なタンパク質やペプチドが含まれているため、質量分析の対象とすべき試料の種類等に応じて、マトリックスの組み合わせを選択すればよい。   Moreover, you may combine 3 or more types of matrices. Since various proteins and peptides are contained in the sample solution, a combination of matrices may be selected according to the type of sample to be subjected to mass spectrometry.

ＭＡＬＤＩによるイオン化効率は、マトリックスの種類だけでなく、マトリックスの濃度（タンパク質やペプチドの量とマトリックスの量の比）によっても変化する。種類の異なるマトリックスを用いる代わりに、濃度の異なるマトリックスを用いることもできる。例えば、奇数列のウェル３８ａには低濃度のマトリックスをロードし、偶数列のウェル３８ｂには高濃度のマトリックスをロードしたサンプルプレートを用い、マトリックス濃度の相違に起因してピーク強度の高いウェルを抽出してもよい。マトリックス濃度は２水準に限定されず、３水準以上としてもよい。   The ionization efficiency by MALDI varies depending not only on the type of matrix but also on the concentration of the matrix (the ratio of the amount of protein or peptide to the amount of matrix). Instead of using different types of matrices, matrices with different concentrations can also be used. For example, a sample plate loaded with a low concentration matrix is loaded into the odd-numbered wells 38a and a high concentration matrix is loaded into the even-numbered wells 38b. It may be extracted. The matrix concentration is not limited to 2 levels, and may be 3 levels or more.

また、マトリックスの種類および濃度の両方を変化させてもよい。例えば、低濃度ＣＨＣＡ、高濃度ＣＨＣＡ、低濃度ＤＨＢ、および高濃度ＤＨＢの４つの水準のマトリックスを、ウェル上に順に繰り返し配置したサンプルプレートを用いてもよい。この場合、４つのウェル上の試料のマススペクトルを対比して、最もピーク強度の高いウェルを抽出して、ＭＳ^ｎ分析を行えばよい。 Further, both the type and concentration of the matrix may be changed. For example, a sample plate in which four levels of matrix of low concentration CHCA, high concentration CHCA, low concentration DHB, and high concentration DHB are repeatedly arranged in order on the well may be used. In this case, MS ⁿ analysis may be performed by comparing the mass spectra of the samples on the four wells and extracting the well with the highest peak intensity.

本形態は、生体試料中の多種多様なタンパク質やペプチドを網羅的に解析する場合に、特に有用である。複数のタンパク質やペプチドをＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析する場合、従来は、分析対象に応じたマトリックスの種類や濃度の選択に専門的な知見や試行錯誤が求められていた。これに対して、本形態では、マトリックスの種類や濃度を分析対象成分ごとに最適化可能である。最もピーク強度の高いウェルの抽出は、質量分析部に接続されたデータ処理部により自動化が可能であるため、専門的な知見がなくとも、各成分のマトリックスを最適化して、良好なマススペクトルを取得できる。   This form is particularly useful when exhaustively analyzing a wide variety of proteins and peptides in a biological sample. In the case of analyzing a plurality of proteins and peptides by MALDI-MS, conventionally, specialized knowledge and trial and error have been required in selecting the type and concentration of the matrix according to the analysis target. In contrast, in this embodiment, the type and concentration of the matrix can be optimized for each component to be analyzed. Extraction of wells with the highest peak intensity can be automated by the data processor connected to the mass spectrometer, so even without expert knowledge, the matrix of each component can be optimized to produce a good mass spectrum. You can get it.

本形態においても、図３に示すように、種類および／または濃度の異なる複数のマトリックスを、複数のサンプルプレート上にロードしてもよい。また、サンプルプレートのウェル上に試料溶液をスポットした後、その上にマトリックスをロードしてもよく、溶出液にマトリックスを混合して、サンプルプレートのウェル上にスポットしてもよい。   Also in this embodiment, as shown in FIG. 3, a plurality of matrices of different types and / or concentrations may be loaded on a plurality of sample plates. Alternatively, after spotting the sample solution on the well of the sample plate, the matrix may be loaded thereon, or the matrix may be mixed with the eluate and spotted on the well of the sample plate.

［各形態の組み合わせ］
上記第一形態、第二形態および第三形態を組み合わせて応用してもよい。例えば、第一形態と第三形態の組み合わせでは、特定成分の分子量を増加または減少させるマトリックスを１種以上、分子量を変化させないマトリックスを１種以上用いる。 [Combination of each form]
You may apply combining the said 1st form, 2nd form, and 3rd form. For example, in the combination of the first form and the third form, at least one matrix that increases or decreases the molecular weight of the specific component and at least one matrix that does not change the molecular weight are used.

一例として、ＤＡＮ、ＤＨＢおよびＣＨＣＡの３種類のマトリックスの組み合わせについて説明する。ジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドが含まれている分画では、ＤＡＮが収容されたウェル上の試料は、ＤＨＢが収容されたウェル上の試料およびＣＨＣＡをロードしたウェル上の試料よりも、ｍ／ｚが２Ｎ大きいピークが観測される（Ｎはジスルフィド結合の数）。このように、マススペクトルにおけるｍ／ｚの差から、特定成分（分析対象）としてジスルフィド結合含有成分が含まれているか否かを判断できる。さらに、３つのマススペクトルの中で、ジスルフィド結合含有成分のピークが最も高いものを選択してＭＳ^ｎ分析を実施すれば、Ｓ／Ｎ比が高いＭＳ^ｎマススペクトルが得られる。また、ＤＡＮが収容されたウェル上の試料のＭＳ^ｎ分析を実施すれば、還元によりジスルフィド結合が切断されているため、構造情報が得られやすくなる。 As an example, a combination of three types of matrices, DAN, DHB, and CHCA will be described. In fractions containing proteins or peptides with disulfide bonds, the sample on the well containing DAN is more m / than the sample on the well containing DHB and the well loaded with CHCA. A peak where z is 2N larger is observed (N is the number of disulfide bonds). Thus, it can be determined from the difference in m / z in the mass spectrum whether a disulfide bond-containing component is included as a specific component (analysis target). Furthermore, if MS ⁿ analysis is performed by selecting the one having the highest disulfide bond-containing component among the three mass spectra, an MS ⁿ mass spectrum having a high S / N ratio can be obtained. If MS ⁿ analysis is performed on a sample on a well containing DAN, the disulfide bond is cleaved by reduction, and thus structural information can be easily obtained.

また、３−ＡＱ／ＣＡ、ＤＨＢおよびＣＨＣＡの３種類のマトリックスの組み合わせを用いた場合、リン酸や糖鎖等の翻訳後修飾基を有するタンパク質またはペプチドが含まれている分画では、３−ＡＱ／ＣＡが収容されたウェル上の試料は、ＤＨＢが収容されたウェル上の試料およびＣＨＣＡをロードしたウェル上の試料よりも、ｍ／ｚが大きいピークが観測される。このｍ／ｚの差に基づいて、特定の翻訳後修飾基を有するタンパク質またはペプチドを特定することが可能である。例えば、３−ＡＱ／ＣＡマトリックスを用いたＭＡＬＤＩ測定により得られるマススペクトルにおいて、ｍ／ｚが９８大きいピークが観測される成分は、１個のリン酸基を有するリン酸化ペプチドであると特定できる。ＤＨＢおよびＣＨＣＡの２つのマススペクトルのうち、当該成分のピークが高い方を選択してＭＳ^ｎ分析を実施すれば、よりＳ／Ｎ比が高いマススペクトルに基づいて、リン酸化ペプチドのペプチド部分の構造解析を実施できる。 In addition, when a combination of three types of 3-AQ / CA, DHB, and CHCA is used, a fraction containing a protein or peptide having a post-translational modification group such as phosphoric acid or sugar chain, In the sample on the well containing AQ / CA, a peak having a larger m / z is observed than the sample on the well containing DHB and the sample on the well loaded with CHCA. Based on this m / z difference, it is possible to identify a protein or peptide having a specific post-translational modification group. For example, in a mass spectrum obtained by MALDI measurement using a 3-AQ / CA matrix, a component in which a peak having a large m / z of 98 is observed can be identified as a phosphorylated peptide having one phosphate group. . If MS ⁿ analysis is performed by selecting the one with the higher peak of the component of the two mass spectra of DHB and CHCA, the peptide portion of the phosphorylated peptide is determined based on the mass spectrum with a higher S / N ratio. Structural analysis can be performed.

上記と同様にして、第二形態と第三形態とを組み合わせることもできる。例えば、第二形態により分画された試料に対して、異なる処理を実施した後、同一の処理が施された試料溶液を複数のウェルにスポットする。同一の処理が施された試料がスポットされたウェルのそれぞれに、種類および／または濃度の異なるマトリックスをロードして質量分析を実施することにより、特定成分（分析対象）が含まれているか否かの判断およびマトリックスの最適化を行い得る。   Similarly to the above, the second form and the third form can be combined. For example, after different processing is performed on the sample fractionated according to the second embodiment, the sample solution subjected to the same processing is spotted in a plurality of wells. Whether or not a specific component (analyte) is included by loading a matrix of different type and / or concentration into each well where samples subjected to the same treatment are spotted and performing mass spectrometry Judgment and matrix optimization.

１０ ＬＣ部
１５ カラム
２０，２００ スポッティング装置
２５，２５１，２５２ 分注ヘッド
３１，３１０，３１１，３１２ サンプルプレート
３８，３８１，３８２ ウェル
４０ 質量分析部 10 LC part 15 column 20,200 spotting device 25,251,252 dispensing head 31,310,311,312 sample plate 38,381,382 well 40 mass analysis part

Claims (14)

サンプルプレートに設けられた複数のウェル上のそれぞれに、分析対象試料とマトリックスとの混合物が収容されたＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析用試料を調製する方法であって、
２以上のウェルのそれぞれに、同一の成分を含む試料溶液がスポットされ、
異なるウェルにスポットされた同一の成分を含む２以上の試料溶液は、ウェル上へのスポット前およびスポット後の少なくとも一方において、スポット対象のウェルごとに異なる処理が行われる、分析用試料の調製方法。 A method for preparing a sample for MALDI-MS analysis in which a mixture of a sample to be analyzed and a matrix is accommodated in each of a plurality of wells provided in a sample plate,
A sample solution containing the same component is spotted in each of two or more wells,
Two or more sample solutions containing the same component spotted in different wells are subjected to different treatments for each well to be spotted before and after spotting on the well, and a method for preparing a sample for analysis . 前記異なる処理は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析において同一の特定成分に対して異なるｍ／ｚを与える２種以上の処理を含む、請求項１に記載の分析用試料の調製方法。   The method for preparing a sample for analysis according to claim 1, wherein the different treatments include two or more treatments that give different m / z to the same specific component in the MALDI-MS analysis. 前記特定成分がジスルフィド結合を有するタンパク質またはペプチドである、請求項２に記載の分析用試料の調製方法。   The method for preparing a sample for analysis according to claim 2, wherein the specific component is a protein or peptide having a disulfide bond. 前記異なる処理は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析においてジスルフィド結合が還元された成分を与える処理およびジスルフィド結合が維持される成分を与える処理を含む、請求項３に記載の分析用試料の調製方法。   The method for preparing a sample for analysis according to claim 3, wherein the different treatment includes a treatment for providing a component in which a disulfide bond is reduced and a treatment for providing a component in which a disulfide bond is maintained in MALDI-MS analysis. 前記異なる処理は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析において同一の特定成分に対して異なるピーク強度を与える２種以上の処理を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分析用試料の調製方法。   The method for preparing a sample for analysis according to any one of claims 1 to 4, wherein the different treatment includes two or more treatments that give different peak intensities to the same specific component in MALDI-MS analysis. サンプルプレートのウェル上にスポットされる試料溶液は、液体クロマトグラフィーにより分画された試料であり、
同一の成分を含む２以上の試料溶液は、液体クロマトグラフィーの溶出時間が同一または近接する試料である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分析方法。 The sample solution spotted on the well of the sample plate is a sample fractionated by liquid chromatography,
The analysis method according to any one of claims 1 to 5, wherein two or more sample solutions containing the same component are samples having the same or close elution times of liquid chromatography. 前記異なる処理は、スポット対象のウェルごとに種類および濃度の少なくとも一方が異なるマトリックスと、試料溶液とを混合する処理を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分析用試料の調製方法。   The sample for analysis according to any one of claims 1 to 6, wherein the different treatment includes a treatment of mixing a sample solution with a matrix having at least one of different kind and concentration for each well to be spotted. Method. 種類および濃度の少なくとも一方が異なる２以上のマトリックスが、異なるウェルに収容されたサンプルプレートを準備し、
種類および濃度の少なくとも一方が異なるマトリックスが収容された２以上のウェルのそれぞれに、同一の成分を含む試料溶液をスポットすることにより、前記異なる処理が行われる、請求項７に記載の分析用試料の調製方法。 Preparing a sample plate in which two or more matrices of different types and concentrations are accommodated in different wells;
The sample for analysis according to claim 7, wherein the different treatment is performed by spotting a sample solution containing the same component in each of two or more wells containing matrices having different types and concentrations. Preparation method. 請求項８に記載の試料の調製方法に用いられるＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析用サンプルプレートであって、
種類および濃度の少なくとも一方が異なる２以上のマトリックスが、異なるウェルに収容されている、サンプルプレート。 A sample plate for MALDI-MS analysis used in the sample preparation method according to claim 8,
A sample plate in which two or more matrices of different types and concentrations are contained in different wells. １枚のサンプルプレート上の異なるウェルに、種類および濃度の少なくとも一方が異なる２以上のマトリックスが収容されている、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析用サンプルプレート。   A sample plate for MALDI-MS analysis, in which two or more matrices of different types and concentrations are housed in different wells on one sample plate. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により調製された分析用試料を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析することを特徴とする分析方法。   An analysis method comprising analyzing an analytical sample prepared by the method according to claim 1 by MALDI-MS. 異なるウェルにスポットされ同一の成分を含む２以上の試料のマススペクトルを対比し、ピークのｍ／ｚの相違、およびピーク強度の相違の少なくともいずれか一方に基づいてＭＳ^ｎ分析対象試料を選別し、
選別された分析対象試料のＭＳ^ｎ分析を実施する、請求項１１に記載の分析方法。 The mass spectra of two or more samples spotted in different wells and containing the same component are compared, and the MS ⁿ analysis target sample is selected based on at least one of the difference in peak m / z and the difference in peak intensity. ,
The analysis method according to claim 11, wherein MS ⁿ analysis of the selected analysis target sample is performed. 異なるウェルにスポットされ同一の成分を含む２以上の試料のマススペクトルを対比し、同一の成分のｍ／ｚが相違する試料をＭＳ^ｎ分析対象試料として選別する、請求項１２に記載の分析方法。 The analysis method according to claim 12, wherein the mass spectra of two or more samples spotted in different wells and containing the same component are compared, and samples having different m / z of the same component are selected as MS ⁿ analysis target samples. . 異なるウェルにスポットされ同一の成分を含む２以上の試料のマススペクトルを対比し、同一の成分のピーク強度が最も高い試料をＭＳ^ｎ分析対象試料として選別する、請求項１２または１３に記載の分析方法。 The analysis according to claim 12 or 13, wherein the mass spectra of two or more samples spotted in different wells and containing the same component are compared, and the sample having the highest peak intensity of the same component is selected as the MS ⁿ analysis target sample. Method.

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