JP2017176067A - Production method of live bacterial preparation, live bacterial preparation, and wastewater treatment method using same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生菌製剤の製造方法、ならびに生菌製剤およびこれを用いた排水処理方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a viable bacterial preparation, a viable bacterial preparation, and a wastewater treatment method using the same.
生きた微生物を有効成分として含む製剤（生菌製剤）は、食品や医薬品分野のみならず、環境、農薬、公衆衛生など、産業界において抗範囲で応用が検討されている。 Preparations containing live microorganisms as active ingredients (live bacteria preparations) are being examined in a range of fields not only in the food and pharmaceutical fields, but also in the industry, such as the environment, agricultural chemicals, and public health.
生菌製剤の利用方法の一つとして、排水処理技術への応用が検討されており、一例としては、油分分解能を有する微生物のグリーストラップへの利用である。厨房や食品工場などの施設において、油分を集積して上層部に浮上した油分を分離して廃棄するためのグリーストラップが敷設されている。グリーストラップに油分分解能を有する微生物を投入することにより、油分の分解・資化を行うことができる。これにより、固形化した油分がグリーストラップの水面にスカム（油の塊）として残留したり、グリーストラップの内壁面や配管内部に集積・付着して配管を閉塞したりすることを低コストで予防できる。このため、油分の酸化・腐敗による悪臭・害虫の発生の防止方法として期待されている。かような油分分解能を有する微生物の一つとして、特許文献１には、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に属し、ｐＨ３．５〜１０．５の条件で、１％（ｗ／ｖ）の油分を２０時間で５０重量％以上低減する、微生物が開示されている。 As one of the utilization methods of live bacteria preparations, application to wastewater treatment technology is being studied. One example is the utilization of microorganisms having oil-degrading ability in grease traps. In facilities such as kitchens and food factories, grease traps are installed to collect oil components and separate and dispose of the oil components floating on the upper layer. By introducing microorganisms having oil resolution into the grease trap, the oil can be decomposed and assimilated. This prevents solidified oil from remaining as scum (lumps of oil) on the water surface of the grease trap or from accumulating and adhering to the inner wall surface of the grease trap or inside the pipe to prevent the pipe from being blocked at low cost. it can. For this reason, it is expected as a method for preventing the generation of malodors and pests due to oxidation and rot of oil. As one of the microorganisms having such an oil content resolution, Patent Document 1 describes that 1% (w / v) oil content belongs to Yarrowia lipolytica and has a pH of 3.5 to 10.5. Microorganisms are disclosed that reduce by 50% by weight or more in 20 hours.
生菌製剤に関する問題点として、製剤化工程や製品の保存中に微生物の生存率が低下するという技術的課題が存在していた。このような問題に対し、微生物農薬組成物中の芽胞を長期間安定して、生存した状態で保存する技術として、特許文献２には、バシルス・サチリス及び／又はバシルス・アミロリケファシエンスの生芽胞と金属酸化物、金属水酸化物、金属酸化物ケイ酸塩、金属水酸化物ケイ酸塩から選択される少なくとも１種以上を配合してなる微生物農薬組成物が記載されている。 As a problem regarding the viable bacterial preparation, there has been a technical problem that the survival rate of microorganisms is reduced during the preparation process and storage of the product. As a technique for preserving the spore in the microbial pesticide composition in a stable and viable state for a long period of time, Patent Document 2 discloses the production of Bacillus subtilis and / or Bacillus amyloliquefaciens. There is described a microbial pesticide composition comprising at least one selected from spores and metal oxides, metal hydroxides, metal oxide silicates, and metal hydroxide silicates.
芽胞を形成する微生物は、芽胞を利用することによって過酷な環境においても生存する能力に長けているため、優れた耐熱性や乾燥耐性などを示す。 Microorganisms that form spores have excellent ability to survive in harsh environments by using spores, and thus exhibit excellent heat resistance and drought resistance.
しかしながら、特許文献１に記載されるような芽胞を形成しない微生物（無芽胞菌）の場合、芽胞を形成する微生物に比べて耐熱性や乾燥耐性に優れていないため、製剤化工程や、その後の保存期間中に生存率が顕著に低下する場合が存在していた。このため、特許文献２に記載されるような芽胞を形成する微生物向けの製剤化技術では、依然として製剤化工程や保存中における無芽胞菌の生存率を十分に高くできない場合が存在していた。 However, in the case of microorganisms that do not form spores as described in Patent Document 1 (non-spore bacteria), since they are not superior in heat resistance and drought resistance compared to microorganisms that form spores, the formulation process, There was a case where the survival rate decreased significantly during the storage period. For this reason, in the formulation technology for microorganisms that forms spores as described in Patent Document 2, there still exist cases where the survival rate of the spore-free bacteria during the formulation process or during storage cannot be sufficiently high.
したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、製剤化工程および保存中における微生物の生存率が向上された、無芽胞菌を含む生菌製剤の製造方法を提供することを課題とする。 Therefore, the present invention has been made in view of the above circumstances, and it is an object of the present invention to provide a method for producing a viable microbial preparation containing a spore-free bacterium, in which the survival rate of the microorganism during the preparation step and storage is improved. And
本発明者らは、上記の問題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、無芽胞菌を含む生菌製剤の製造方法工程において、トレハロース、乳タンパク質、アミノ酸、金属塩、および水を含む噴霧液を、多孔質担体に噴霧することを含み、さらに噴霧液における無芽胞菌に対するトレハロースの含量を所定範囲とすることで上記課題が解決されることを見出し、本発明の完成に至った。 The present inventors have intensively studied to solve the above problems. As a result, in the method for producing a viable bacterial preparation containing a spore-free bacterium, a spray liquid containing trehalose, milk protein, amino acid, metal salt, and water is sprayed onto the porous carrier. It has been found that the above-mentioned problems can be solved by setting the trehalose content in the spore bacteria to a predetermined range, and the present invention has been completed.
本発明によれば、製剤化工程および保存中における微生物の生存率が向上された、無芽胞菌を含む生菌製剤の製造方法が提供される。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the manufacturing method of the living microbe formulation containing an asospore microbe with which the survival rate of the microorganisms in a formulation process and a preservation | save was improved is provided.
本発明の一側面は、生菌製剤の製造方法であって、無芽胞菌、トレハロース、乳タンパク質、アミノ酸、金属塩、および水を含む噴霧液を、多孔質担体に噴霧することを含み、前記噴霧液は、乾燥菌体として１重量部の前記無芽胞菌に対して、０．８重量部以上１．５重量部未満の前記トレハロースを含む、生菌製剤の製造方法である。本発明によれば、製剤化工程および保存中における微生物の生存率が向上された、無芽胞菌を含む生菌製剤の製造方法を提供することができる。本発明により上記のような効果が得られる詳細なメカニズムは依然として明確ではないが、以下のように推測される。すなわち、本発明では無芽胞菌の担体として多孔質担体を用い、これに直接無芽胞菌を噴霧している。これにより、製剤化後及び保存中の含水率が微生物にとって最適な値となるため、微生物の生存率が向上するものと考えられる。また、本発明では、噴霧液に存在するトレハロース、乳タンパク質、およびアミノ酸が微生物の安定化剤として製剤化工程における微生物に対するダメージを軽減するため、製剤化工程における生存率を高く維持することができるものと考えられる。さらに、本発明では、噴霧液中の無芽胞菌に対するトレハロース含有量の最適化により、製剤化工程のみならず、保存期間中における微生物の高い生存率をも達成される。本発明者らは、製剤中の微生物に対するトレハロースの含有量を多くすると、製剤化工程後の微生物の生存率は高くなるものの、保存期間中における微生物の生存率が低下してしまうという両立しがたい問題が存在することを見出した。これは、トレハロースの含有量が多い場合、おそらくはトレハロースによって微生物の生存に必要な自由水が奪われること、またはトレハロースの存在により製剤全体としての含水量が多くなり微生物が休眠状態にならないためであると推測される。 One aspect of the present invention is a method for producing a viable bacterial preparation, comprising spraying a porous carrier with a spray solution containing a spore bacterium, trehalose, milk protein, amino acid, metal salt, and water, A spray liquid is a manufacturing method of a living microbe formulation which contains the said trehalose more than 0.8 weight part and less than 1.5 weight part with respect to 1 weight part of the said non-spore bacteria as a dry cell. ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the manufacturing method of the living microbe formulation containing an aspore-form bacteria by which the survival rate of the microorganisms in a formulation process and a preservation | save was improved can be provided. The detailed mechanism by which the above-described effects can be obtained by the present invention is still unclear, but is presumed as follows. In other words, in the present invention, a porous carrier is used as a carrier for the sporeless bacteria, and the sporeless bacteria are directly sprayed on the porous carrier. Thereby, since the moisture content after formulation and during storage becomes an optimum value for the microorganism, it is considered that the survival rate of the microorganism is improved. In the present invention, trehalose, milk protein, and amino acids present in the spray solution reduce the damage to microorganisms in the formulation process as a microorganism stabilizer, so that the survival rate in the formulation process can be maintained high. It is considered a thing. Furthermore, in the present invention, by optimizing the trehalose content for the spore-free bacteria in the spray solution, not only the formulation process but also a high survival rate of microorganisms during the storage period can be achieved. When the trehalose content relative to the microorganisms in the preparation is increased, the present inventors increase the survival rate of the microorganisms after the formulation step, but the compatibility of the microorganisms during the storage period decreases. I found that there was a problem. This is because if the trehalose content is high, the free water necessary for the survival of the microorganism is probably taken away by the trehalose, or the presence of trehalose increases the water content of the whole preparation and the microorganism does not enter the dormant state. It is guessed.
上記問題に対し、本発明では、製剤化工程における噴霧液に金属塩を存在させることで、噴霧液中に含まれるトレハロースの含量をある程度高くしても、保存期間中における微生物の生存率の低下を防止し得ることを見出した。これは、トレハロースのみならず、金属塩が製剤中に共存することにより、製剤中の浸透圧が微生物にとって有利となるためであると推測される。なお上記メカニズムは推測であり、本発明の技術的範囲を制限するものでは無い。また、トレハロース、乳タンパク質、アミノ酸、および金属塩を、総称して「微生物保護剤」とも称する。 In response to the above problems, in the present invention, the presence of a metal salt in the spray solution in the formulation step reduces the survival rate of microorganisms during the storage period even if the trehalose content contained in the spray solution is increased to some extent. It has been found that can be prevented. This is presumed to be because not only trehalose but also a metal salt coexists in the preparation, so that the osmotic pressure in the preparation is advantageous for microorganisms. In addition, the said mechanism is estimation and does not restrict | limit the technical scope of this invention. Trehalose, milk protein, amino acids, and metal salts are also collectively referred to as “microbe protective agents”.
以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。また、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。 Embodiments of the present invention will be described below. In addition, this invention is not limited only to the following embodiment. In addition, the dimensional ratios in the drawings are exaggerated for convenience of explanation, and may be different from the actual ratios.
本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０〜２５℃）／相対湿度４０〜５０％ＲＨの条件で測定する。 In this specification, “X to Y” indicating a range means “X or more and Y or less”. Unless otherwise specified, measurement of operation and physical properties is performed under conditions of room temperature (20 to 25 ° C.) / Relative humidity 40 to 50% RH.
＜生菌製剤の製造方法＞
本発明では、無芽胞菌、トレハロース、乳タンパク質、アミノ酸、金属塩、および水を含む噴霧液を、多孔質担体に噴霧することを含み、噴霧液中のトレハロースの量が、１重量部の無芽胞菌（乾燥菌体換算）に対して、０．８重量部以上１．５重量部未満であることを特徴とする。
<Production method of viable bacterial preparation>
The present invention includes spraying a porous carrier with a spray solution containing a spore bacterium, trehalose, milk protein, amino acid, metal salt, and water, and the amount of trehalose in the spray solution is 1 part by weight. It is 0.8 parts by weight or more and less than 1.5 parts by weight with respect to spore bacteria (in terms of dry cells).
本発明においては種々の無芽胞菌（芽胞非形成菌）を用いることができる。本明細書における「無芽胞菌」には酵母、細菌、かび等が含まれ、例えば、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｒａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、ウェイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカニボラックス属（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ）、アルカリバクテリウム属（Ａｌｋａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ステノトロフォモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、モルティエレラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）等に属する無芽胞菌が例示できるが、これらに限定されない。無芽胞菌は１種を単独で、または２種以上を混合して用いることができる。本発明においては、無芽胞菌として酵母が好適に用いられる。 In the present invention, various sporeless bacteria (non-spore-forming bacteria) can be used. As used herein, “aspore-free bacteria” include yeast, bacteria, fungi, and the like, for example, Yarrowia, Candida, Pichia, Hansenura, Saccharomyces (Saccharomyces), Kluyveromyces, Trichosporon, Lipomyces, Rhodotorula genus, Schizosaccharomyces, Schizosaccharomyces , Lactococcus, Bifidbacterium (Bifid) bacterium, Streptococcus, Enterobacter, Sphingomonas, Burkholderia, Weissella, and Acinetobacter. Acetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Corynebacterium, Flavobacterium, Alcanivolax, Alkalinebacteria Alkalibacterium, Stenotrophomonas, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizomucor, Mortierum, Mortierum, Mortiella ), Pseudomonas, Rhizopus, Humicola, Acremonium, Aeromonas, Aeromonas, Brevibacterium, Trichoderma, Trichodoma Examples include, but are not limited to, spore bacteria . One spore-forming bacterium can be used alone or in combination of two or more. In the present invention, yeast is preferably used as the sporeless bacterium.
後述の排水処理方法に生菌製剤を用いる場合には、無芽胞菌としては、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｒａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）等の酵母が好ましく用いられ、油分分解活性の高さから、ヤロウィア・リポリティカ ＡＴＣＣ４８４３６、ヤロウィア・リポリティカ ＮＢＲＣ１５４８、ヤロウィア・リポリティカ ＬＭ０２−０１１（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１３）、ヤロウィア・リポリティカ ＮＢＲＣ０７４６、ヤロウィア・リポリティカ ＮＢＲＣ１２０９のようなヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ヤロウィア ＹＨ−０１のようなヤロウィア スピーシーズ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．）等のヤロウィア属の酵母を含むことがより好ましく、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を含むことが更に好ましく、広範囲のｐＨ領域で高い油分分解活性を有するという観点から、ヤロウィア・リポリティカ ＬＭ０２−０１１（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１３）が特に好ましい。 In the case where a viable preparation is used in the wastewater treatment method described later, as sporeless bacteria, the genus Yarrowia, Candida, Pichia, Hansenura, Saccharomyces (Saccharomyces) ), Kluyveromyces, Trichosporon, Lipomyces, Rhodotorula, Schizosaccharomyces n, Lactobacillus cc, Lactobacilli Yeast is preferably used, and due to its high oil-degrading activity, Yarrowia lipolytica ATC 48436, Yarrowia Liporitica NBRC 1548, Yarrowia Liporitica LM02-011 (Accession Number NITE P-01813), Yarrowia Liporitica NBRC0746, Yarrowia Liporitia NBRC1209 It is more preferable to include yeast of the genus Yarrowia such as Yarrowia sp., More preferably to include Yarrowia lipolytica, and from the viewpoint of having high oil decomposition activity in a wide pH range. Lipolytica LM02-011 (Accession number NITE P-01813) is particularly preferred.
上記微生物の培養方法は、当該微生物が生育・増殖できるものであれば、いずれのものであってよい。例えば、微生物の培養に使用する培地は、固体または液体培地のいずれでもよく、また、使用する微生物が資化しうる炭素源、適量の窒素源、無機塩及びその他の栄養素を含有する培地であれば、合成培地または天然培地のいずれでもよい。通常、培地は、炭素源、窒素源および無機物を含む。 Any microorganism culture method may be used as long as the microorganism can grow and proliferate. For example, the medium used for culturing the microorganism may be either a solid or liquid medium, and any medium containing a carbon source, an appropriate amount of nitrogen source, an inorganic salt, and other nutrients that can be assimilated by the microorganism used. Either a synthetic medium or a natural medium may be used. Usually, the culture medium contains a carbon source, a nitrogen source and an inorganic substance.
微生物の培養において使用できる炭素源としては、使用する菌株が資化できる炭素源であれば特に制限されない。具体的には、微生物の資化性を考慮して、グルコース、フラクトース、セロビオース、ラフィノース、キシロース、マルトース、ガラクトース、ソルボース、グルコサミン、リボース、アラビノース、ラムノース、スクロース、α−メチル−Ｄ−グルコシド、サリシン、メリビオース、ラクトース、メレジトース、イヌリン、エリスリトール、グルシトール、マンニトール、ガラクチトール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、デンプン、デンプン加水分解物、糖蜜、廃糖蜜等の糖類、麦、米等の天然物、グリセロール、メタノール、エタノール等のアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸、グルコン酸、ピルピン酸、クエン酸等の有機酸類、ヘキサデカン等の炭化水素などが挙げられる。上記炭素源は、培養する微生物による資化性を考慮して適宜選択される。 The carbon source that can be used in the culture of microorganisms is not particularly limited as long as it is a carbon source that can be assimilated by the strain used. Specifically, in consideration of microbial assimilation, glucose, fructose, cellobiose, raffinose, xylose, maltose, galactose, sorbose, glucosamine, ribose, arabinose, rhamnose, sucrose, α-methyl-D-glucoside, salicin , Melibiose, lactose, melezitose, inulin, erythritol, glucitol, mannitol, galactitol, N-acetyl-D-glucosamine, saccharides such as starch, starch hydrolysate, molasses, molasses, natural products such as wheat, rice, glycerol Alcohols such as methanol and ethanol, organic acids such as acetic acid, lactic acid, succinic acid, gluconic acid, pyrpinic acid and citric acid, and hydrocarbons such as hexadecane. The carbon source is appropriately selected in view of assimilation by the microorganism to be cultured.
また、微生物の培養において使用できる窒素源としては、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、カゼイン、ミルクカゼイン、カザミノ酸、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸等の各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物等の有機窒素源；アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩、尿素等の無機窒素源などが挙げられる。上記窒素源は、培養する微生物による資化性を考慮して適宜選択される。 Examples of nitrogen sources that can be used in the culture of microorganisms include meat extract, peptone, polypeptone, yeast extract, malt extract, soybean hydrolysate, soybean powder, casein, milk casein, casamino acid, glycine, glutamic acid, aspartic acid, etc. Organic nitrogen sources such as various amino acids, corn steep liquor, other animal, plant, microorganism hydrolysates; ammonium salts such as ammonia, ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride, nitrates such as sodium nitrate, nitrites such as sodium nitrite And inorganic nitrogen sources such as urea. The nitrogen source is appropriately selected in view of assimilation by the microorganism to be cultured.
微生物の培養に使用できる無機物としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などの、リン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、塩化物等のハロゲン化物などが挙げられる。上記無機物は、培養する微生物による資化性を考慮して適宜選択される。また、上記無機物を１種または２種以上選択して使用することができる。また、培地中に、必要に応じて、界面活性剤等を添加してもよい。 Inorganics that can be used for culturing microorganisms include phosphates, hydrochlorides, sulfates, acetates, carbonates, bicarbonates, chlorides, such as magnesium, manganese, calcium, sodium, potassium, copper, iron and zinc. And the like. The said inorganic substance is suitably selected in consideration of the assimilation property by the microorganisms to culture. In addition, one or more of the above inorganic materials can be selected and used. Moreover, you may add surfactant etc. in a culture medium as needed.
本発明の微生物の培養は、通常の方法によって行える。例えば、微生物の種類によって、好気的条件下または嫌気的条件下で、微生物を培養する。前者の場合には、微生物の培養は、振盪あるいは通気攪拌などによって行われる。また、微生物を連続的にまたはバッチで培養してもよい。培養条件は、培地の組成や培養法によって適宜選択され、本発明の微生物が増殖できる条件であれば特に制限されず、培養する微生物の種類に応じて適宜選択されうる。通常は、培養温度が、好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２５〜３５℃である。また、培養に適当な培地のｐＨは、好ましくは３〜１１、より好ましくは３．５〜１０．５である。 The microorganism of the present invention can be cultured by a usual method. For example, depending on the type of microorganism, the microorganism is cultured under aerobic conditions or anaerobic conditions. In the former case, the culture of microorganisms is performed by shaking or aeration stirring. Alternatively, the microorganisms may be cultured continuously or in batches. The culture conditions are appropriately selected depending on the composition of the medium and the culture method, and are not particularly limited as long as the microorganisms of the present invention can grow, and can be appropriately selected according to the type of microorganism to be cultured. Usually, culture | cultivation temperature becomes like this. Preferably it is 15-40 degreeC, More preferably, it is 25-35 degreeC. The pH of the medium suitable for culture is preferably 3 to 11, more preferably 3.5 to 10.5.
なお、本発明では、無芽胞菌を湿菌体として噴霧液に用いてもよいし、凍結乾燥等により乾燥した菌体として噴霧液に用いてもよいが、後述する各微生物保護剤の添加量は、無芽胞菌を乾燥菌体に換算した量に対する値である。 In the present invention, the spore-free bacterium may be used as a wet cell in the spray solution, or may be used in the spray solution as a cell dried by lyophilization or the like. Is a value relative to the amount of sporeless bacteria converted to dry cells.
噴霧液中の無芽胞菌の量は特に制限されないが、例えば、噴霧液中に乾燥菌体として１〜２０質量％となる量であり、好ましくは５〜１５重量％となる量である。 The amount of non-spore-forming bacteria in the spray liquid is not particularly limited. For example, the amount is 1 to 20% by mass, preferably 5 to 15% by weight as dry cells in the spray liquid.
本発明で用いる噴霧液はトレハロースを含み、噴霧液中のトレハロースの量が、乾燥菌体として１重量部の無芽胞菌に対して、０．８重量部以上１．５重量部未満であることを特徴とする。噴霧液中のトレハロースの量が０．８重量部未満であると製剤化工程直後における微生物の生存率が低下し、１．５重量部以上であると生菌製剤の保存期間中の微生物の生存率が低下する。微生物の製剤化工程後における生存率と保存期間中の生存率とのさらなる好適なバランスの観点から、噴霧液中のトレハロース含有量は、乾燥菌体換算で１重量部の無芽胞菌に対して、好ましくは０．９重量部を超えて１．５重量部未満であり、より好ましくは１重量部以上１．４重量部以下である。 The spray solution used in the present invention contains trehalose, and the amount of trehalose in the spray solution is 0.8 parts by weight or more and less than 1.5 parts by weight with respect to 1 part by weight of non-spore bacteria as dry cells. It is characterized by. If the amount of trehalose in the spray solution is less than 0.8 parts by weight, the survival rate of the microorganisms immediately after the formulation process is reduced, and if it is 1.5 parts by weight or more, the survival of the microorganisms during the storage period of the live cell preparation The rate drops. From the viewpoint of a further suitable balance between the survival rate after the formulation step of the microorganism and the survival rate during the storage period, the trehalose content in the spray solution is 1 part by weight of non-spore-forming bacteria in terms of dry cells. , Preferably more than 0.9 parts by weight and less than 1.5 parts by weight, more preferably 1 part by weight or more and 1.4 parts by weight or less.
なお、本発明においては、トレハロース以外の二糖類、たとえばスクロース、ラクトース、マルトース等のトレハロース以外の二糖類を、１種単独でまたは２種以上を混合して、トレハロースと併用してもよい。この場合、トレハロース以外の二糖類の含有量は、乾燥菌体として１重量部の無芽胞菌に対して、例えば０．０１質量部以上０．８質量部未満であり、好ましくは０．１質量部以上０．５質量部以下である。 In the present invention, disaccharides other than trehalose, for example, disaccharides other than trehalose such as sucrose, lactose, and maltose may be used alone or in combination of two or more and used together with trehalose. In this case, the content of disaccharides other than trehalose is, for example, 0.01 parts by mass or more and less than 0.8 parts by mass with respect to 1 part by weight of non-spore bacteria as dry cells, preferably 0.1 parts by mass. Part to 0.5 parts by weight.
噴霧液が含む乳タンパク質としては特に制限されず、従来公知の各種の乳タンパク質を含む材料を用いることができる。全脂粉乳のような乳脂肪分の多い原料を用いることもできるが、グリーストラップで使用するような油脂分解用生菌製剤を製造する場合は、製剤中の油分は少ない方が好ましいので、例えば、好ましい具体例としては、カゼイン、カゼインナトリウム、ホエイ、濃縮ホエイ、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質分離物（ＷＰＩ）、ホエイパウダー、スキムミルク、乳タンパク濃縮物（ＭＰＣ）、脱脂粉乳、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン等が例示でき、これらを１種単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。乳タンパク質原料としてスキムミルクや脱脂粉乳のようなラクトースを含む材料を用いることで、二糖類としてラクトースを噴霧液に添加する原料としても使用できる。 The milk protein contained in the spray liquid is not particularly limited, and conventionally known materials containing various milk proteins can be used. Although raw materials with a high milk fat content such as whole milk powder can be used, when producing a live bacterial preparation for fat and oil decomposition such as that used in a grease trap, it is preferable that the oil content in the preparation is low, for example Preferred examples include casein, sodium caseinate, whey, concentrated whey, whey protein concentrate (WPC), whey protein isolate (WPI), whey powder, skim milk, milk protein concentrate (MPC), nonfat dry milk, α -Lactalbumin, (beta) -lactoglobulin etc. can be illustrated, These can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types. By using a material containing lactose such as skim milk or skimmed milk powder as a milk protein raw material, it can also be used as a raw material for adding lactose as a disaccharide to a spray solution.
噴霧液中の乳タンパク質の含有量は、本発明の所望の効果が達成される限りにおいて、特に制限されない。製剤化工程における微生物の生存率の観点から、好ましくは、噴霧液が、乾燥菌体として１重量部の前記無芽胞菌に対して、０．０１〜５重量部の乳タンパク質を含み、より好ましくは０．０２〜１重量部の乳タンパク質を含み、更に好ましくは０．０５〜０．５重量部の乳タンパク質を含む。 The content of milk protein in the spray liquid is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention is achieved. From the viewpoint of the survival rate of the microorganisms in the preparation step, the spray solution preferably contains 0.01 to 5 parts by weight of milk protein with respect to 1 part by weight of the absorptive bacteria as dry cells. Contains 0.02 to 1 part by weight of milk protein, more preferably 0.05 to 0.5 part by weight of milk protein.
噴霧液が含むアミノ酸は、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、リジン、セリン、スレオニン、メチオニン、トリプトファン、ヒスチジン、アルギン、プロリン、チロシン、およびこれらの誘導体が例示できる。噴霧液がアミノ酸を含むことにより、製剤化工程における微生物の生存率が向上する。アミノ酸の誘導体としては、アミノ酸の塩（例えば、カリウム塩、ナトリウム塩）、エステル体、水和物、溶媒和物等が例示できる。上記のアミノ酸は、１種を単独で、または２種以上を混合して用いることができる。上記のうち、製剤化工程における微生物の生存率の観点から、アミノ酸はグリシン、アラニン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される１種以上であることが好ましく、グリシンおよびその誘導体から選択される１種以上であることが更に好ましい。 The amino acids contained in the spray solution are, for example, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, glutamine, glutamic acid, asparagine, aspartic acid, cysteine, lysine, serine, threonine, methionine, tryptophan, histidine, arginine, proline, tyrosine, and These derivatives can be exemplified. When the spray liquid contains an amino acid, the survival rate of microorganisms in the formulation process is improved. Examples of amino acid derivatives include amino acid salts (for example, potassium salts and sodium salts), ester forms, hydrates, solvates and the like. The above amino acids can be used alone or in combination of two or more. Among the above, from the viewpoint of the survival rate of microorganisms in the formulation step, the amino acid is preferably at least one selected from the group consisting of glycine, alanine, and derivatives thereof, and is selected from glycine and derivatives thereof. More preferably, it is at least one.
噴霧液中のアミノ酸の含有量は、本発明の所望の効果が達成される限りにおいて、特に制限されない。製剤化工程における微生物の生存率の観点から、好ましくは、噴霧液が、乾燥菌体として１重量部の前記無芽胞菌に対して、０．０３〜１０重量部のアミノ酸を含み、より好ましくは０．１〜５重量部のアミノ酸を含み、さらに好ましくは０．１〜３重量部のアミノ酸を含む。なお、噴霧液が２種以上のアミノ酸を含む場合、上記数値は、２種以上の合計量を示す。 The content of the amino acid in the spray liquid is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention is achieved. From the viewpoint of the survival rate of microorganisms in the formulation step, preferably, the spray solution contains 0.03 to 10 parts by weight of amino acid with respect to 1 part by weight of the absorptive bacteria as dry cells, more preferably It contains 0.1 to 5 parts by weight of amino acid, more preferably 0.1 to 3 parts by weight of amino acid. In addition, when a spray liquid contains 2 or more types of amino acids, the said numerical value shows 2 or more types of total amount.
噴霧液が含む金属塩は、例えばナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）、銅（Ｃｕ）などの金属元素の、硫酸塩、亜硫酸塩、次亜硫酸塩、過硫酸塩、チオ硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、ピロリン酸、塩酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、ハロゲン化物（たとえば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物）等が例示できるが、これらに限定されない。噴霧液が金属塩を含むことにより、噴霧液中におけるトレハロースの含量を０．８重量部以上１．５重量部未満としても、保存期間中における微生物の生存率の低下を防止し得る。金属塩は、より具体的には、例えば、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、過硫酸ナトリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、酢酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸カリウム、亜硫酸カリウム、次亜硫酸カリウム、チオ硫酸カリウム、炭酸カリウム、過硫酸カリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸三カリウム、酢酸カリウム、硝酸カリウム、亜硝酸カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、シュウ酸カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、亜硫酸マグネシウム、チオ硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、第一リン酸マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、第三リン酸マグネシウム、ピロリン酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、亜硝酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸カルシウム、亜硫酸カルシウム、チオ硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、硝酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、塩化カルシウム等が例示できる。上記の金属塩は、１種を単独で、または２種以上を混合して用いることができる。 The metal salt contained in the spray liquid is, for example, sodium (Na), potassium (K), magnesium (Mg), calcium (Ca), manganese (Mn), iron (Fe), nickel (Ni), zinc (Zn), copper (Cu) and other metal elements such as sulfate, sulfite, hyposulfite, persulfate, thiosulfate, carbonate, phosphate, pyrophosphate, hydrochloride, nitrate, nitrite, acetate, propionic acid Examples thereof include, but are not limited to, salts, butyrate, citrate, oxalate, halide (eg, fluoride, chloride, bromide, iodide). By containing the metal salt in the spray solution, even if the trehalose content in the spray solution is 0.8 parts by weight or more and less than 1.5 parts by weight, it is possible to prevent a decrease in the survival rate of microorganisms during the storage period. More specifically, the metal salt is, for example, sodium sulfate, sodium sulfite, sodium hyposulfite, sodium thiosulfate, sodium carbonate, sodium persulfate, monosodium phosphate, disodium phosphate, trisodium phosphate, sodium acetate. , Sodium nitrate, sodium nitrite, sodium acetate, sodium citrate, sodium oxalate, sodium chloride, potassium sulfate, potassium sulfite, potassium hyposulfite, potassium thiosulfate, potassium carbonate, potassium persulfate, monopotassium phosphate, phosphoric acid Dipotassium, tripotassium phosphate, potassium acetate, potassium nitrate, potassium nitrite, potassium acetate, potassium citrate, potassium oxalate, potassium chloride, magnesium sulfate, magnesium sulfite, magnesium thiosulfate, magnesium carbonate, primary li Magnesium phosphate, dibasic magnesium phosphate, tribasic magnesium phosphate, magnesium pyrophosphate, magnesium nitrate, magnesium nitrite, magnesium acetate, magnesium citrate, magnesium oxalate, magnesium chloride, calcium sulfate, calcium sulfite, calcium thiosulfate, Examples include calcium carbonate, calcium nitrate, calcium nitrite, calcium acetate, calcium citrate, calcium oxalate, and calcium chloride. Said metal salt can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types.
保存期間中における微生物の生存率が特に優れるという観点から、金属塩が、Ｎａ、Ｋ、ＭｇおよびＣａからなる群から選択される元素の、硫酸塩、炭酸塩、リン酸塩、またはそれらの組み合わせであることが好ましく、Ｍｇおよび／またはＣａの硫酸塩であることがより好ましい。なお、上記の「金属塩」には、金属塩の水和物や溶媒和物も含まれる。 From the viewpoint that the survival rate of microorganisms during the storage period is particularly excellent, sulfate, carbonate, phosphate, or a combination thereof, wherein the metal salt is selected from the group consisting of Na, K, Mg and Ca It is preferable that it is Mg and / or Ca sulfate. The “metal salt” includes hydrates and solvates of metal salts.
噴霧液中の金属塩の含有量は、本発明の所望の効果が達成される限りにおいて、特に制限されない。保存期間中における微生物の生存率の観点から、好ましくは、噴霧液が、乾燥菌体として１重量部の前記無芽胞菌に対して、０．０２〜１０重量部の金属塩を含み、より好ましくは０．０５〜１．５重量部の金属塩を含み、更に好ましくは０．１〜１重量部の金属塩を含む。なお、噴霧液が２種以上の金属塩を含む場合、上記数値は、２種以上の合計量を示す。 The content of the metal salt in the spray liquid is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention is achieved. From the viewpoint of the survival rate of microorganisms during the storage period, the spray solution preferably contains 0.02 to 10 parts by weight of a metal salt with respect to 1 part by weight of the non-spore bacteria as dry cells, and more preferably. Contains 0.05 to 1.5 parts by weight of metal salt, more preferably 0.1 to 1 part by weight of metal salt. In addition, when a spray liquid contains 2 or more types of metal salts, the said numerical value shows 2 or more types of total amount.
噴霧液が含む水は、水道水、蒸留水、イオン交換水、純水、超純水など、いずれを使用してもよいが、不純物の少ない蒸留水、イオン交換水、純水、または超純水を用いることが好ましい。メタノール、エタノール、プロパノール等の低級アルコールや、アセトンなどの極性溶媒を、本発明の目的効果が損なわれない程度において水に添加した混合液を用いてもよい。 The water contained in the spray liquid may be any of tap water, distilled water, ion exchange water, pure water, ultrapure water, etc., but distilled water, ion exchange water, pure water, or ultrapure water with less impurities. It is preferable to use water. A mixed solution in which a lower alcohol such as methanol, ethanol or propanol or a polar solvent such as acetone is added to water to such an extent that the objective effect of the present invention is not impaired may be used.
噴霧液には、上記の各成分のほか、本発明の目的効果が阻害されない範囲において、任意に、例えばグルコース、フルクトース等の単糖類；スクロース、ラクトース、マルトース等のトレハロース以外の二糖類；シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、結晶セルロース、コーンスターチ等の多糖類；大豆タンパク等のタンパク質；大豆ペプチド、ゼラチン、ペプトン、トリプトン等のタンパク加水分解物やペプチド；大豆油、菜種油、パーム油、ゴマ油、オリーブ油等の油脂；アスコルビン酸やその塩、トコフェロール等のビタミン類；ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等の界面活性剤；ポリエチエレングリコール、グリセリンなどを添加してもよい。 In the spray solution, in addition to the above-described components, a monosaccharide such as glucose and fructose; a disaccharide other than trehalose such as sucrose, lactose and maltose; Polysaccharides such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, carboxymethylcellulose, crystalline cellulose, corn starch, etc .; proteins such as soy protein; protein hydrolysates and peptides such as soy peptide, gelatin, peptone, tryptone; soy oil, rapeseed oil, palm Oils and fats such as oil, sesame oil and olive oil; Vitamins such as ascorbic acid and its salts and tocopherol; Surfactants such as polyglycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester and sorbitan fatty acid ester; Recall, or the like may be added glycerin.
噴霧液の固形分量は、多孔質担体への噴霧が可能であれば特に制限されないが、生産性等の観点から、噴霧液全体中の例えば３〜７０重量％であり、好ましくは２０〜５０重量％である。噴霧液の調製方法も特に制限されず、上記した噴霧液に含まれる各成分を水に添加し、必要に応じて撹拌して調製する。 The solid content of the spray liquid is not particularly limited as long as spraying onto the porous carrier is possible, but from the viewpoint of productivity and the like, it is, for example, 3 to 70% by weight, preferably 20 to 50% by weight in the entire spray liquid. %. The method for preparing the spray liquid is not particularly limited, and each component contained in the spray liquid described above is added to water, and is prepared by stirring as necessary.
本発明においては、有機または無機の多孔質担体を広く利用することができる。多孔質担体に上記のような微生物保護剤を含む噴霧液を噴霧すると、多孔質担体を用いない場合や、多孔質以外の担体に噴霧した場合と比較して、製剤化工程後の微生物の生存率を向上できる。 In the present invention, organic or inorganic porous carriers can be widely used. When a spray solution containing the above-mentioned microbial protective agent is sprayed on a porous carrier, the survival of microorganisms after the formulation process is compared to when the porous carrier is not used or when sprayed on a carrier other than the porous carrier. The rate can be improved.
本発明において用いられうる多孔質担体の材料としては、特に制限されるものではないが、例えば、珪藻土、パーライト、バーミキュライト、タルク、クレー、ゼオライト、ベントナイト、カオリン、炭酸カルシウム、活性白土、二酸化チタン、珪砂、軽石、活性炭、カーボンブラック、グラファイト、ポリ乳酸、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等が例示できるが、これらに限定されない。製剤化工程後の微生物の生存率の観点から、多孔質担体としては、珪藻土、および活性炭からなる群から選択されることが好ましい。 The material of the porous carrier that can be used in the present invention is not particularly limited. For example, diatomaceous earth, perlite, vermiculite, talc, clay, zeolite, bentonite, kaolin, calcium carbonate, activated clay, titanium dioxide, Examples thereof include, but are not limited to, quartz sand, pumice, activated carbon, carbon black, graphite, polylactic acid, polystyrene, and polyvinyl chloride. From the viewpoint of the survival rate of microorganisms after the formulation step, the porous carrier is preferably selected from the group consisting of diatomaceous earth and activated carbon.
なお、本明細書において「多孔質」とは、担体の表面に多数の小さな気泡状の空隙を有する状態をいう。好ましくは、多孔質担体の嵩密度（タッピング嵩密度）が０．０１〜２ｇ／ｍｌである。上記のような嵩密度の多孔質担体を用いることにより、製剤化工程後の微生物の生存率をより一層向上できる。多孔質担体の嵩密度は、より好ましくは０．０５〜１．５ｇ／ｍｌであり、更に好ましくは０．２〜１ｇ／ｍｌである。なお、上記の嵩密度は、タッピング嵩密度測定法により測定した値である。 In the present specification, the term “porous” refers to a state in which a large number of small cellular voids are present on the surface of the carrier. Preferably, the porous carrier has a bulk density (tapping bulk density) of 0.01 to 2 g / ml. By using a porous carrier having a bulk density as described above, the survival rate of microorganisms after the formulation step can be further improved. The bulk density of the porous carrier is more preferably 0.05 to 1.5 g / ml, still more preferably 0.2 to 1 g / ml. In addition, said bulk density is the value measured by the tapping bulk density measuring method.
製剤化工程後の微生物の生存率の観点から、担体は、平均粒径（直径、体積基準）が１〜３００μｍの粒子状であることが好ましく、平均粒径（直径、体積基準）が１０〜２００μｍの粒子状であることがより好ましく、３０〜１５０μｍであることが更に好ましい。なお、担体の粒径は、レーザー回折法にて測定した値である。 From the viewpoint of the survival rate of microorganisms after the formulation step, the carrier is preferably in the form of particles having an average particle diameter (diameter, volume basis) of 1 to 300 μm, and the average particle diameter (diameter, volume basis) is 10 to 10. More preferably, it is in the form of 200 μm particles, and more preferably 30 to 150 μm. The particle size of the carrier is a value measured by a laser diffraction method.
上記の多孔質担体に対して、上述した無芽胞菌と微生物保護剤とを含む噴霧液を噴霧して製剤化する。多孔質担体への噴霧液の噴霧は、流動層造粒機を用いて行うことが好ましい。すなわち、本発明の一実施形態では、生菌製剤の製剤化が流動層造粒法によって行われる。流動層造粒法により製剤化することにより、無芽胞菌と微生物保護剤とを含む無芽胞菌含有層を比較的低温で多孔質担体上に形成することができる。このため、製剤化工程における生存率の向上の観点から有利である。また、流動層造粒法により製剤化することにより、上記の無芽胞菌含有層を均一に多孔質担体上に形成することができる、という点においても有利である。 The above-mentioned porous carrier is formulated by spraying a spray solution containing the above-mentioned non-spore bacterium and a microbial protective agent. The spraying of the spray liquid onto the porous carrier is preferably performed using a fluidized bed granulator. That is, in one embodiment of the present invention, the preparation of the viable bacterial preparation is performed by a fluidized bed granulation method. By formulating by a fluidized bed granulation method, a non-spore-containing layer containing non-spore-forming bacteria and a microbial protective agent can be formed on a porous carrier at a relatively low temperature. For this reason, it is advantageous from the viewpoint of improving the survival rate in the formulation process. In addition, it is advantageous in that the above-mentioned non-spore-containing layer can be uniformly formed on the porous carrier by formulating by a fluidized bed granulation method.
多孔質担体に対する噴霧液の噴霧量は任意に設定でき、特に制限されるものではないが、１重量部の多孔質担体に対して、噴霧液の固形分として、例えば、０．１〜１０重量部となる割合であり、好ましくは０．５〜２重量部となる割合である。 The spray amount of the spray liquid with respect to the porous carrier can be arbitrarily set, and is not particularly limited. However, for example, 0.1 to 10 weights as the solid content of the spray liquid with respect to 1 part by weight of the porous carrier. The ratio is preferably 0.5 to 2 parts by weight.
噴霧液は、通常は５０〜３００ｇ／分程度の速度で多孔質担体へ噴霧される。 The spray liquid is usually sprayed onto the porous carrier at a rate of about 50 to 300 g / min.
流動層造粒法により製剤化する場合は、温風の温度は微生物の耐熱性等を考慮して適宜設定すればよいが、例えば、入口温度３０〜６０℃であり、好ましくは３５〜５０℃である。流動層の温度も微生物の耐熱性等を考慮して適宜設定すればよいが、例えば、温度３０〜６０℃であり、好ましくは３５〜５０℃である。噴霧後、噴霧液を噴霧した多孔質担体を流動層造粒機内でそのまま乾燥してもよいし、別途乾燥機で乾燥してもよい。 In the case of formulation by a fluidized bed granulation method, the temperature of the hot air may be appropriately set in consideration of the heat resistance of microorganisms, etc., for example, the inlet temperature is 30 to 60 ° C., preferably 35 to 50 ° C. It is. The temperature of the fluidized bed may be appropriately set in consideration of the heat resistance of microorganisms, but is, for example, 30 to 60 ° C, and preferably 35 to 50 ° C. After spraying, the porous carrier sprayed with the spray liquid may be dried as it is in a fluidized bed granulator, or may be dried separately in a dryer.
粉末化した生菌製剤は、用途に応じて、公知のコーティング剤で表面の一部または全部を被覆してもよい。また、滑沢剤（例えば、タルク、マイカ、シリカ、ステアリン酸マグネシウム）、乾燥剤（酸化カルシウム、シリカゲル）、フィラーなどの粉末を、任意の割合で生菌製剤と混合し、混合製剤としてもよい。また、所望の粒度となるように製剤を粉砕したり、分級をしたりしてもよい。 The powdered viable bacterial preparation may be partially or entirely coated with a known coating agent depending on the use. In addition, powders such as lubricants (for example, talc, mica, silica, magnesium stearate), desiccants (calcium oxide, silica gel), fillers, etc. may be mixed with the viable cell preparation at an arbitrary ratio to form a mixed preparation. . Further, the preparation may be pulverized or classified so as to have a desired particle size.
保存期間中の微生物の生存率の観点から、製剤化後の生菌製剤の水分含量は、３〜８重量％であることが好ましく、４．５〜７．５重量％であることがより好ましい。 From the viewpoint of the survival rate of microorganisms during the storage period, the water content of the viable preparation after preparation is preferably 3 to 8% by weight, more preferably 4.5 to 7.5% by weight. .
＜生菌製剤＞
本発明の第二の側面は、多孔質担体上に無芽胞菌含有層が形成されてなる生菌製剤であって、前記無芽胞菌含有層が、乾燥菌体として１重量部の前記無芽胞菌に対して、０．８重量部以上１．５重量部未満のトレハロース、０．０１〜５重量部の乳タンパク質、０．０３〜１０重量部のアミノ酸、および０．０２〜１０重量部の金属塩を含む、生菌製剤に関する。かような生菌製剤は、製剤化工程および保存中における生存率に優れたものとなる。本発明の第二の側面における無芽胞菌、トレハロース、乳タンパク質、アミノ酸、金属塩、および多孔質担体を含む各構成要素については、第一の側面について上記した内容が適宜改変されて適用され得る。無芽胞菌含有層における各微生物保護剤の量としても、噴霧液について上記した乾燥菌体換算した無芽胞菌に対する相対量を採用することができる。
<Live bacteria preparation>
The second aspect of the present invention is a viable preparation in which a non-spore-containing layer is formed on a porous carrier, wherein the non-spore-containing layer is 1 part by weight of the non-spore as a dry cell. 0.8 to 1.5 parts by weight of trehalose, 0.01 to 5 parts by weight of milk protein, 0.03 to 10 parts by weight of amino acids, and 0.02 to 10 parts by weight of the fungus The present invention relates to a viable bacterial preparation containing a metal salt. Such a viable bacterial preparation has excellent survival rate during the preparation process and storage. The contents described above with respect to the first aspect can be appropriately modified and applied to each component including the sporeless bacteria, trehalose, milk protein, amino acid, metal salt, and porous carrier in the second aspect of the present invention. . As the amount of each microorganism-protecting agent in the non-spore-containing layer, the relative amount to the non-spore-form bacteria converted to dry cells described above for the spray solution can be employed.
上記のような生菌製剤は、本発明の第一の側面に係る製造方法により製造することができる。 The viable preparation as described above can be produced by the production method according to the first aspect of the present invention.
＜排水処理方法＞
本発明の第三の側面は、本発明の第二の側面に係る生菌製剤を、油分を含む排水に接触させる工程を含み、生菌製剤中の無芽胞菌として、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を含む、排水処理方法に関する。ヤロウィア属の酵母は油分分解活性が高い油分分解性微生物であるため、排水処理用の生菌製剤に含まれる無芽胞菌として適している。以下、図１を参酌しながら、本側面に係る排水処理方法についてより詳細に説明する。なお、本発明の排水処理方法が、図１に限定されるものでは無い。
<Wastewater treatment method>
The third aspect of the present invention includes a step of bringing the viable preparation according to the second aspect of the present invention into contact with wastewater containing oil, and as a non-spore bacterium in the viable preparation, Yarrowia lipolytica (Yarrowia lipolytica) ). Yarrowia yeast is an oil-degrading microorganism having a high oil-degrading activity, and is therefore suitable as a spore-free bacterium contained in a viable bacterial preparation for wastewater treatment. Hereinafter, the waste water treatment method according to this aspect will be described in more detail with reference to FIG. In addition, the waste water treatment method of this invention is not limited to FIG.
図１は、グリーストラップ１０による排水処理（廃水処理）の仕組みを模式的に表している。本発明に係る方法において、上記の生菌製剤は、グリーストラップ１０に排出する前の排水にあらかじめ添加されていても良いが、典型的には、排水処理槽１中の排水へ添加される。但し、本発明に係る排水処理方法は、上記生菌製剤と油分含有排水とを接触させることができる限り特に限定されない。 FIG. 1 schematically shows a mechanism of waste water treatment (waste water treatment) by the grease trap 10. In the method according to the present invention, the above-mentioned viable microbe preparation may be added in advance to the waste water before being discharged to the grease trap 10, but is typically added to the waste water in the waste water treatment tank 1. However, the waste water treatment method according to the present invention is not particularly limited as long as the above-mentioned viable microbe preparation can be brought into contact with the oil-containing waste water.
グリーストラップ１０は、埋設式、可動式など、設置形態は特に制限されない。埋設式の場合、例えば厨房や食品加工場において、排水路に流出した排水が残渣受け３に注ぎ込まれるように、グリーストラップ１０を埋設する。可動式の場合、例えば、シンクの排水溝の下部に残渣受け３が位置するようにグリーストラップ１０を設置する。 The installation form of the grease trap 10 is not particularly limited, such as an embedded type and a movable type. In the case of the buried type, for example, in a kitchen or a food processing plant, the grease trap 10 is buried so that the wastewater that has flowed into the drainage channel is poured into the residue receiver 3. In the case of the movable type, for example, the grease trap 10 is installed so that the residue receiver 3 is positioned below the drainage groove of the sink.
図１において、排水は、矢印の方向へ流れる。なお、グリーストラップ１０への排水の投入は、回分式であっても連続式であっても良い。油分含有排水は、残渣受け３を通じて排水処理槽１へと流れ込む。このとき、生ゴミ等の残渣の全部または一部は残渣受け３で捕集されるが、大部分の油分は残渣受け３を通過して排水処理槽１へと流入する。排水処理槽１へ流入した油分６は水面５へ向かって浮上し、仕切り板２ａと２ｃとで仕切られた空間に集まる。従って、油分分解性微生物を含む生菌製剤を排水に加えない場合、仕切り板２ａと２ｃとで仕切られた空間で油分６が次第に凝集し、スカムを形成することとなる。 In FIG. 1, drainage flows in the direction of the arrow. The drainage to the grease trap 10 may be a batch type or a continuous type. Oil-containing wastewater flows into the wastewater treatment tank 1 through the residue receiver 3. At this time, all or a part of the residue such as garbage is collected in the residue receiver 3, but most of the oil passes through the residue receiver 3 and flows into the waste water treatment tank 1. The oil 6 flowing into the waste water treatment tank 1 floats toward the water surface 5 and collects in a space partitioned by the partition plates 2a and 2c. Therefore, when a viable preparation containing oil-degrading microorganisms is not added to the waste water, the oil 6 gradually aggregates in the space partitioned by the partition plates 2a and 2c to form a scum.
生菌製剤をグリーストラップ１０に適用した場合、排水処理槽１にて（主として、仕切り板２ａと２ｃとで仕切られた空間にて）、油分を含む排水と生菌製剤（油分分解性微生物）とが接触することとなる。本発明に係る生菌製剤に含まれるヤロウィア・リポリティカは油分の分解活性が高く、資化性を有するため、油分６の凝集を抑制し、スカムが形成されることを有効に防止し得る。特に、ヤロウィア・リポリティカ ＬＭ０２−０１１株は、広範なｐＨ領域（例えば、ｐＨ３．０〜１１．０）においても高い油分分解活性を備える。これにより、排水のｐＨに依存せず、油分がトラップ管４を通じて外部環境へ流出することを防止し、環境保全の観点からも利点がある。 When the live bacteria preparation is applied to the grease trap 10, in the waste water treatment tank 1 (mainly in the space partitioned by the partition plates 2a and 2c), the waste water containing oil and the live bacteria preparation (oil-degrading microorganisms) Will come into contact. Since Yarrowia lipolytica contained in the viable preparation according to the present invention has a high oil decomposing activity and has an assimilation property, it can suppress aggregation of oil 6 and effectively prevent scum from being formed. In particular, the Yarrowia lipolytica LM02-011 strain has high oil decomposition activity even in a wide pH range (for example, pH 3.0 to 11.0). This prevents the oil from flowing out to the external environment through the trap pipe 4 without depending on the pH of the waste water, and is advantageous from the viewpoint of environmental conservation.
本発明に係る方法において使用される生菌製剤は、例えば、排水中へ添加され、排水と接触させられる。生菌製剤を容器に収容してグリーストラップ内に設置し、容器に排水を通液させることにより生菌製剤と排水とを接触させることもできる。これにより、排水と共に油分分解性微生物が流出して菌数が低下することを防止し得る。 The viable cell preparation used in the method according to the present invention is, for example, added to waste water and brought into contact with waste water. The viable preparation and the waste water can be brought into contact with each other by placing the viable preparation in a container and placing it in a grease trap, and allowing the waste water to flow through the container. Thereby, it is possible to prevent the oil-decomposable microorganisms from flowing out together with the waste water and reducing the number of bacteria.
本発明にかかる方法において、排水に生菌製剤を添加して接触させる場合、添加する菌量は任意に設定できる。排水に添加する生菌製剤の量は、特に制限されるものではないが、排水に含まれる油分１ｇに対して、製剤中の生菌数として例えば１×１０４〜１×１０１２ＣＦＵであり、好ましくは１×１０５〜１×１０１１ＣＦＵである。あるいは、排水に含まれる油分１ｇに対して、生菌製剤を、例えば０．１ｍｇ〜１００ｇであり、好ましくは１ｍｇ〜５ｇである。または、グリーストラップ内の排水に対して、製剤中の生菌数として例えば１×１０６〜１×１０１２ＣＦＵ／Ｌ、より好ましくは１×１０７〜１×１０１１ＣＦＵ／Ｌとなるような量であってもよい。あるいは、グリーストラップ内の排水に対して、生菌製剤を、例えば１０ｍｇ〜１０００ｇ／Ｌであり、好ましくは０．５ｇ〜５０ｇ／Ｌである。 In the method according to the present invention, when a viable microbe preparation is added to and contacted with waste water, the amount of the added fungus can be arbitrarily set. The amount of the viable bacterial preparation added to the wastewater is not particularly limited, but is 1 × 10 4 to 1 × 10 12 CFU as the number of viable bacteria in the preparation with respect to 1 g of oil contained in the wastewater. , Preferably 1 × 10 5 to 1 × 10 11 CFU. Or it is 0.1 mg-100 g, for example, Preferably it is 1 mg-5 g with respect to 1 g of oil contained in waste water. Alternatively, for the wastewater in the grease trap, the number of viable bacteria in the preparation is, for example, 1 × 10 6 to 1 × 10 12 CFU / L, more preferably 1 × 10 7 to 1 × 10 11 CFU / L. Any amount may be used. Or it is 10 mg-1000 g / L with respect to the waste_water | drain in a grease trap, for example, Preferably it is 0.5g-50g / L.
排水を外部環境へ排出する際、生菌製剤が排水と共にグリーストラップ外へと排出される場合があるので、本発明においては、グリーストラップ（排水）に、定期的に生菌製剤を添加してもよい。添加する間隔は特に制限されないが、例えば、１回／３時間、１回／２４時間、または２〜３日に１回の間隔で添加するのが好ましい。添加する方法は特に制限されず、排水が連続的にグリーストラップに流入する場合には、排水に混在させて添加してもよいし、グリーストラップ内の排水に直接、添加してもよい。厨房のシンクなどの排水口から生菌製剤を添加すれば、洗浄により排出される排水とともに、生菌製剤をグリーストラップ内に導入することができる。 When draining wastewater to the external environment, the viable bacterial preparation may be discharged out of the grease trap along with the drainage. Therefore, in the present invention, the live bacterial preparation is periodically added to the grease trap (drainage). Also good. The addition interval is not particularly limited, but for example, it is preferably added once every 3 hours, once every 24 hours, or once every 2 to 3 days. The method of adding is not particularly limited, and when the wastewater flows continuously into the grease trap, it may be added to the wastewater or may be added directly to the wastewater in the grease trap. If the viable preparation is added from a drain outlet such as a kitchen sink, the viable preparation can be introduced into the grease trap together with the waste water discharged by washing.
本明細書において「油分」とは、トリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドのようなアシルグリセロールを５０重量％以上含む（例えば、６５重量％以上、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上（上限１００重量％）のグリセリド類を含む）食用または工業用油脂、ならびに脂肪酸を指す。油脂は、ステロール、リン脂質等のアシルグリセロール以外の脂質を含むものであっても良い。 In the present specification, “oil” includes 50% by weight or more of acylglycerol such as triglyceride, diglyceride and monoglyceride (for example, 65% by weight or more, preferably 80% by weight or more, more preferably 90% by weight or more (upper limit) Edible or industrial oils and fats (including 100% by weight) glycerides. The fats and oils may contain lipids other than acylglycerols such as sterols and phospholipids.
油脂としては、各種の動植物性油脂が含まれ、例えば、オリーブ油、キャノーラ油、ココナッツ油、ごま油、米油、米ぬか油、サフラワー油、大豆油、トウモロコシ油、菜種油、パーム油、パーム核油、ひまわり油、綿実油、やし油、落花生油、カカオ脂、牛脂、ラード、鶏油、魚油、鯨油、バター、マーガリン、ファットスプレッド、ショートニング等の食用油脂；およびアマニ油、ジャトロファ油、トール油、ハマナ油、ひまし油、ホホバ油等の工業用油脂；が例示できるが、好ましくはグリーストラップが設置されることが多いレストラン等で頻繁に排出される食用油脂である。 The fats and oils include various animal and vegetable fats and oils such as olive oil, canola oil, coconut oil, sesame oil, rice oil, rice bran oil, safflower oil, soybean oil, corn oil, rapeseed oil, palm oil, palm kernel oil, Sunflower oil, cottonseed oil, palm oil, peanut oil, cacao butter, beef tallow, lard, chicken oil, fish oil, whale oil, butter, margarine, fat spread, shortening, etc .; and linseed oil, jatropha oil, tall oil, hamana Industrial fats and oils such as oil, castor oil, jojoba oil and the like can be exemplified, but edible fats and oils that are frequently discharged in restaurants and the like where a grease trap is often installed are preferable.
脂肪酸としては、特に限定されるものではないが、例えば、酪酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸等の飽和脂肪酸；デセン酸、ミリストレイン酸、ペンタデセン酸、パルミトレイン酸、ヘプタデセン酸、オレイン酸、イコセン酸、ドコセン酸、テトラコセン酸、ヘキサデカジエン酸、ヘキサデカトリエン酸、ヘキサデカテトラエン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、オクタデカテトラエン酸、イコサジエン酸、イコサトリエン酸、イコサテトラエン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、ヘンイコサペンタエン酸、ドコサジエン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等の不飽和脂肪酸；が挙げられる。脂肪酸は、食用または工業用油脂が分解されて生じたものであっても良い。 The fatty acid is not particularly limited, for example, butyric acid, hexanoic acid, heptanoic acid, octanoic acid, decanoic acid, lauric acid, tridecanoic acid, myristic acid, pentadecanoic acid, pentadecanoic acid, palmitic acid, heptadecanoic acid, Saturated fatty acids such as stearic acid, arachidic acid, behenic acid, lignoceric acid; decenoic acid, myristoleic acid, pentadecenoic acid, palmitoleic acid, heptadecenoic acid, oleic acid, icosenic acid, docosenoic acid, tetracosenoic acid, hexadecadienoic acid, hexa Decatrienoic acid, hexadecatetraenoic acid, linoleic acid, α-linolenic acid, γ-linolenic acid, octadecatetraenoic acid, icosadienoic acid, icosatrienoic acid, icosatetraenoic acid, arachidonic acid, icosapentaenoic acid, henicosapentaenoic acid, docosadienoic acid , And unsaturated fatty acids such as docosatetraenoic acid, docosapentaenoic acid, docosapentaenoic acid, and docosahexaenoic acid. Fatty acids may be produced by decomposing edible or industrial fats and oils.
排水中の油分の含有量は、特に制限されない。排水中に含まれる油分は、２種類以上であっても良い。 The oil content in the wastewater is not particularly limited. Two or more kinds of oil may be contained in the waste water.
本発明の方法において、本発明に係る生菌製剤に加えて、油分をより効率的に減少させる観点から、他の成分を排水に添加してもよい。他の成分としては、例えば、リパーゼやホスホリパーゼ等の油分分解性酵素、ｐＨ調整剤などが挙げられる。 In the method of the present invention, in addition to the viable cell preparation according to the present invention, other components may be added to the waste water from the viewpoint of more efficiently reducing the oil content. Examples of other components include oil-degrading enzymes such as lipase and phospholipase, and pH adjusters.
油分分解性酵素としては、たとえば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ボーベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）属、クロモバクター（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ハイホジーマ（Ｈｙｐｈｏｚｙｍａ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、メタリジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、および／またはトリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属から得ることができる。 Examples of the oil-degrading enzymes include the genus Pseudomonas, the genus Aspergillus, the genus Bacillus, the genus Penicillium, the genus Rhizopus, and the genus Rhizomucor. , The genus Paecilomyces, the genus Rhizoctonia, the genus Absidia, the genus Achromobacter, the genus Aeromonas, the genus Alternaria, i Beauveria), Cromobacter (Chromobac) er), Coprinus genus, Fusarium genus, Geotricum genus, Humicola genus, Hyphozyma genus, Lactobacillus genus, Metal ridium genus (Rhodosporidium), Trichoderma, Yarrowia, Candida, Pichia, Hansenula, Saccharomyces, and Saccharomyces And / or from the genus Trichosporon Rukoto can.
市販の油分分解性酵素としては、リパーゼＭＹ、リパーゼＯＦ、リパーゼＰＬ、リパーゼＱＬＭ（名糖産業株式会社）；リパーゼＡ「アマノ（登録商標）」６、リパーゼＤＦ「アマノ（登録商標）」１５、リパーゼＧ「アマノ（登録商標）」５０、リパーゼＡＹ「アマノ（登録商標）」３０ＳＤ、リパーゼＲ「アマノ（登録商標）」、リパーゼＭＥＲ「アマノ（登録商標）」、ニューラーゼ（登録商標）Ｆ（アマノエンザイム株式会社）；スミチーム（登録商標）ＮＬＳ、スミチーム（登録商標）ＲＬＳ（新日本化学工業株式会社）；リリパーゼ（登録商標）Ａ−１０Ｄ、リリパーゼ（登録商標）ＡＦ−５、ＰＬＡ２ナガセ（ナガセケムテックス株式会社）；エンチロンＡＫＧ−２０００、エンチロンＬＰ、エンチロンＬＰＧ（洛東化成工業株式会社）；Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｔ、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）１００Ｌ、Ｐａｌａｔａｓｅ２００００Ｌ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標）１００Ｔ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標）１００Ｌ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＲＭＩＭ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＴＬＩＭ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）４３５ＦＧ（ノボザイムズ社製）；ピカンターゼＡ、ピカンターゼＲ８００（ディー・エス・エムジャパン社製）等が挙げられる。これらを２種以上組み合わせて用いることもできる。 Commercially available oil-degrading enzymes include lipase MY, lipase OF, lipase PL, lipase QLM (name sugar industry); lipase A “Amano (registered trademark)” 6, lipase DF “Amano (registered trademark)” 15, Lipase G "Amano (registered trademark)" 50, Lipase AY "Amano (registered trademark)" 30SD, Lipase R "Amano (registered trademark)", Lipase MER "Amano (registered trademark)", Neurase (registered trademark) F ( Amano Enzyme Co., Ltd.); Sumiteam (registered trademark) NLS, Sumiteam (registered trademark) RLS (Shin Nihon Chemical Industry Co., Ltd.); Lilipase (registered trademark) A-10D, Lilipase (registered trademark) AF-5, PLA2 Nagase (Nagase) Chemtex Co., Ltd.); Entilon AKG-2000, Entilon LP, Entilon LPG Lipolase (registered trademark) 100T, Lipolase (registered trademark) 100L, Palatase 20000L, Lipex (registered trademark) 100T, Lipex (registered trademark) 100L, Lipozyme (registered trademark) RMIM, Lipozyme (registered trademark) TLIM, Novozyme Registered trademark) 435FG (manufactured by Novozymes); picantase A, picantase R800 (manufactured by DSM Japan) and the like. Two or more of these may be used in combination.
油分分解性酵素の量は、酵素が油分と反応できれば特に制限されないが、排水に含まれる油分１ｇに対して、１０〜２，０００Ｕで用いることが好ましい。より好ましくは５０〜１，５００Ｕ、さらに好ましくは１００〜１，０００Ｕである。または、グリーストラップの容量に対して、好ましくは１，０００〜１００，０００Ｕ／Ｌ、より好ましくは２，０００〜８０，０００Ｕ／Ｌとなるような量であってもよい。なお、油分分解性酵素の活性単位（Ｕ）は、３７℃、ｐＨ７の条件で１分間に１μモルの脂肪酸を遊離する酵素量である。 The amount of the oil degrading enzyme is not particularly limited as long as the enzyme can react with the oil, but it is preferably used at 10 to 2,000 U with respect to 1 g of the oil contained in the waste water. More preferably, it is 50-1,500U, More preferably, it is 100-1,000U. Alternatively, it may be an amount that is preferably 1,000 to 100,000 U / L, more preferably 2,000 to 80,000 U / L with respect to the capacity of the grease trap. The activity unit (U) of the oil degrading enzyme is the amount of enzyme that liberates 1 μmol of fatty acid per minute under the conditions of 37 ° C. and pH 7.
グリーストラップは、油分含有排水を連続的に導入し、処理後の排水を連続的に排出する形態であってもよいし、油分含有排水を導入し、一括して処理した後に、処理後の排水を一括して排出する形態であってもよい。 The grease trap may be configured to continuously introduce the oil-containing wastewater and continuously discharge the treated wastewater, or after introducing the oil-containing wastewater and treating it all at once, the treated wastewater May be discharged in a batch.
また、本発明の方法において、生菌製剤と油分とを接触させる際の温度、すなわちグリーストラップ内の排水の温度としては、任意に設定することができる。また、生菌製剤と油分とを接触させる際のｐＨ、すなわちグリーストラップ内の排水のｐＨとしても、任意に設定することができる。一般的には、温度は、例えば１０〜６０℃であり、２０〜５０℃が好ましく、２５〜４０℃がより好ましい。ｐＨは例えば３〜１０であり、ｐＨ４〜９が好ましく、ｐＨ５〜８がさらに好ましい。さらに、必要に応じて、排水基準を満たす範囲で、曝気等により排水にエアレーションを行っても良い。 Moreover, in the method of this invention, it can set arbitrarily as temperature at the time of making a viable preparation and an oil component contact, ie, the temperature of the waste_water | drain in a grease trap. Moreover, it can also set arbitrarily as pH at the time of making a viable preparation and an oil component contact, ie, the pH of the waste_water | drain in a grease trap. Generally, temperature is 10-60 degreeC, for example, 20-50 degreeC is preferable and 25-40 degreeC is more preferable. The pH is, for example, 3 to 10, preferably 4 to 9, and more preferably 5 to 8. Furthermore, if necessary, aeration may be performed on the wastewater by aeration or the like within a range satisfying the wastewater standard.
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。 The effects of the present invention will be described using the following examples and comparative examples. However, the technical scope of the present invention is not limited only to the following examples.
（培養液の調製）
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＭ０２−０１１株（平成２６年３月６日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されており、その受託番号は、ＮＩＴＥ Ｐ−０１８１３である。）を下記の液体培地に接種して、ジャーファーメンターにて３０℃で４８時間（撹拌速度：３００ｒｐｍ）培養し、培養液を得た。
(Preparation of culture solution)
Yarrowia lipolytica LM02-011 strain (As of March 6, 2014, deposited with the National Institute of Technology and Evaluation Technology Patent Microorganisms Deposit Center (2-5-8, Kazusa Kamashika, Kisarazu City, Chiba Prefecture) The deposit number is NITE P-01813.) Was inoculated into the following liquid medium and cultured at 30 ° C. for 48 hours (stirring speed: 300 rpm) with a jar fermenter to obtain a culture solution. .
液体培地の作製方法： 終濃度が０．１８％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．１２％（ｗ／ｖ）肉エキス、０．０７％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３、０．００５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．００２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、０．００２％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００３％（ｗ／ｖ））ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏとなるように純水に溶解した。塩酸にてｐＨ５に調整後、オートクレーブ滅菌したものを液体培地とした。 Preparation method of liquid medium: Final concentration is 0.18% (w / v) polypeptone, 0.12% (w / v) meat extract, 0.07% (w / v) NaHCO 3 , 0.005% (w / V) NaCl, 0.002% (w / v) KCl, 0.002% (w / v) CaCl 2 .2H 2 O, 0.003% (w / v)) MgSO 4 .7H 2 O So that it was dissolved in pure water. The liquid medium was adjusted to pH 5 with hydrochloric acid and then autoclaved.
（実施例１）
得られた培養液を１０分間遠心分離（×１０，０００ｇ）し、菌体を回収した。得られた菌体に対して下記表１の比率で各成分を蒸留水に添加し、混合して噴霧液を調製した。なお、乳タンパク質としては、固形分中にタンパク質を３５重量％、乳糖を５２重量％の割合で含むスキムミルクを用いた。
Example 1
The obtained culture broth was centrifuged (× 10,000 g) for 10 minutes, and the cells were collected. Each component was added to distilled water with the ratio of the following Table 1 with respect to the obtained microbial cell, and it mixed and prepared the spray liquid. As milk protein, skim milk containing 35% by weight of protein and 52% by weight of lactose in the solid content was used.
流動層造粒機（ＦＡ−ＬＡＢ−１、株式会社パウレック社）に３００ｇの珪藻土（平均粒径７５μｍ、嵩密度０．３３ｇ／ｍｌ、ラヂオライト（登録商標）♯３０００、昭和化学工業株式会社）をセットした。珪藻土に対して、１０７７ｇの上記噴霧液を１４３ｇ／分の速度で噴霧するとともに、４０℃の温風を送風して内容物を流動させた状態で乾燥させた。噴霧後、引き続いて流動層造粒機内で４０℃の温風を４０分間送風して、造粒物を乾燥させた。これにより、生菌製剤を得た。生菌製剤の水分含量は５．５重量％であった。 300 g of diatomaceous earth (average particle size 75 μm, bulk density 0.33 g / ml, Radiolite (registered trademark) # 3000, Showa Chemical Industry Co., Ltd.) in a fluidized bed granulator (FA-LAB-1, Paulec Co., Ltd.) Set. 1077 g of the spray solution was sprayed on diatomaceous earth at a rate of 143 g / min, and the contents were dried by blowing hot air at 40 ° C. After spraying, hot air at 40 ° C. was then blown for 40 minutes in the fluidized bed granulator to dry the granulated product. As a result, a viable cell preparation was obtained. The water content of the viable preparation was 5.5% by weight.
（実施例２）
実施例１における珪藻土に代えて、活性炭（平均粒径２５μｍ、嵩密度０．３３ｇ／ｍｌ、梅蜂印Ｈ−Ｃ、太平化学産業株式会社）を用いた以外は実施例１と同様の手法により、生菌製剤を得た。生菌製剤の水分含量は５．１重量％であった。
(Example 2)
In place of diatomaceous earth in Example 1, activated carbon (average particle size 25 μm, bulk density 0.33 g / ml, plum bee HC, Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.) was used in the same manner as in Example 1. A live bacterial preparation was obtained. The water content of the viable preparation was 5.1% by weight.
（比較例１）
実施例１における珪藻土に代えて、多孔質ではない麦ふすま（担体の表面に多数の小さな気泡状の空隙を有しない）を用い、噴霧液の組成を下記表１のように変更した以外は実施例１と同様の手法により、生菌製剤を得た。
(Comparative Example 1)
Instead of diatomaceous earth in Example 1, non-porous wheat bran (not having a large number of small cellular voids on the surface of the carrier) was used, except that the composition of the spray solution was changed as shown in Table 1 below. A viable cell preparation was obtained in the same manner as in Example 1.
（比較例２〜７）
噴霧液の組成を下記表１のように変更した以外は実施例１と同様の手法により、それぞれ生菌製剤を得た。
(Comparative Examples 2-7)
Live bacterial preparations were obtained in the same manner as in Example 1 except that the composition of the spray solution was changed as shown in Table 1 below.
（製剤化工程における生存率）
実施例、比較例において用いた噴霧液中の生菌数に対する、製剤化直後（温風乾燥から６０分以内）における生菌製剤中の生菌数を求めた。すなわち、噴霧液および生菌製剤を、１００倍量の蒸留水中（２５℃）で１分間撹拌して段階希釈し、得られた希釈液を寒天培地（組成：上記液体培地に、終濃度２０重量％となるように寒天を添加したもの）の表面に塗布した。菌を３０℃で４８時間培養した後、寒天培地上に形成されたコロニー数を計測した。コロニー数から、噴霧液１ｇ当たりの生菌数および製剤１ｇ当たりの生菌数を算出した。懸濁液１ｇ当たりの生菌数、スプレーした液量、および噴霧液中の菌以外の成分の量から生菌製剤１ｇ当たりの生菌数の理想値（生存率１００％に相当する。）を算出した。製剤化工程における生存率は、生菌数の理想値に対する生菌製剤１ｇ当たりの生菌数を１００分率として算出した。
(Survival rate in the formulation process)
The viable cell count in the viable cell preparation immediately after preparation (within 60 minutes from hot air drying) was determined relative to the viable cell count in the spray solution used in Examples and Comparative Examples. That is, the spray solution and the viable bacterial preparation were serially diluted by stirring for 1 minute in 100 times the amount of distilled water (25 ° C.). % Agar was added to the surface). After culturing the bacteria at 30 ° C. for 48 hours, the number of colonies formed on the agar medium was counted. From the number of colonies, the number of viable bacteria per 1 g of the spray solution and the number of viable bacteria per 1 g of the preparation were calculated. From the number of viable bacteria per gram of suspension, the amount of sprayed liquid, and the amount of components other than bacteria in the spray liquid, the ideal number of viable bacteria per gram of viable preparation (corresponds to 100% survival rate). Calculated. The survival rate in the formulation step was calculated based on the number of viable bacteria per 1 g of the viable cell preparation relative to the ideal value of the viable cell count as 100 minutes.
（生菌製剤の保存中における生存率）
作製後の生菌製剤を、遮光ガラスバイアル瓶内に封入し、２３℃で保存した。保存から７日後、１４日後、および２１日後における生菌製剤１ｇ当たりの生菌数を、上記と同様の手法により求めた。
(Survival rate during storage of live bacterial preparations)
The prepared viable cell preparation was sealed in a light-shielding glass vial and stored at 23 ° C. The number of viable bacteria per 1 g of the viable cell preparation after 7 days, 14 days and 21 days after storage was determined by the same method as described above.
（結果）
図２に示すように、実施例で得られた生菌製剤は、製剤化工程における生菌率に優れていた。また、図３に示すように、実施例で得られた生菌製剤は、製剤化工程のみならず、保存期間中においても高い生存率を示した。特に、多孔質担体として珪藻土を用いた場合、活性炭を用いた場合よりもさらに高い生存率を示した。トレハロース量の多い比較例３や、金属塩を含まない比較例７では、製剤化直後の生存率は高かったものの、保存時の生存率に劣っていた。
(result)
As shown in FIG. 2, the viable cell preparation obtained in the Examples was excellent in the viable cell rate in the preparation step. Moreover, as shown in FIG. 3, the viable cell preparation obtained in the Example showed a high survival rate not only during the preparation process but also during the storage period. In particular, when diatomaceous earth was used as the porous carrier, a higher survival rate was obtained than when activated carbon was used. In Comparative Example 3 with a large amount of trehalose and Comparative Example 7 containing no metal salt, the survival rate immediately after formulation was high, but the survival rate during storage was poor.
本発明に係る生菌製剤の製造方法を利用することで、環境、食品、医薬品、農薬、公衆衛生等の分野において利用可能な生菌製剤を高い生存率で提供できる。好ましくは、本発明に係る生菌製剤の製造方法は、水質環境改善用生菌製剤、特に排水処理用生菌製剤の製造において好適に利用され得る。 By using the method for producing a viable preparation according to the present invention, a viable preparation that can be used in fields such as the environment, food, pharmaceuticals, agricultural chemicals, and public health can be provided with a high survival rate. Preferably, the method for producing a viable microbe preparation according to the present invention can be suitably used in the production of a live microbe formulation for improving the water quality environment, particularly a live microbe formulation for wastewater treatment.
１ 排水処理槽、
２ａ、２ｂ、２ｃ 仕切り板、
３ 残渣受け、
４ トラップ管、
５ 水面、
６ 油分、
１０ グリーストラップ。
1 Wastewater treatment tank,
2a, 2b, 2c partition plate,
3 Receiving residue
4 Trap tube,
5 Water surface,
6 Oil,
10 Grease trap.
Claims (13)
無芽胞菌、トレハロース、乳タンパク質、アミノ酸、金属塩、および水を含む噴霧液を、多孔質担体に噴霧することを含み、
前記噴霧液は、乾燥菌体として１重量部の前記無芽胞菌に対して、０．８重量部以上１．５重量部未満の前記トレハロースを含む、生菌製剤の製造方法。 A method for producing a viable bacterial preparation,
Spraying a porous carrier with a spray solution comprising a spore-free bacterium, trehalose, milk protein, amino acid, metal salt, and water;
The said spray liquid is a manufacturing method of a living microbe formulation which contains the said trehalose more than 0.8 weight part and less than 1.5 weight part with respect to 1 weight part of the non-spore bacteria as a dry microbial cell.
前記無芽胞菌含有層が、乾燥菌体として１重量部の前記無芽胞菌に対して、０．８重量部以上１．５重量部未満のトレハロース、０．０１〜５重量部の乳タンパク質、０．０３〜１０重量部のアミノ酸、および０．０２〜１０重量部の金属塩を含む、生菌製剤。 A viable bacterial preparation in which a non-spore-containing layer is formed on a porous carrier,
The non-spore-containing layer is 0.8 parts by weight or more and less than 1.5 parts by weight of trehalose, 0.01 to 5 parts by weight of milk protein with respect to 1 part by weight of the non-spore-form bacteria as dry cells. A viable preparation comprising 0.03 to 10 parts by weight of an amino acid and 0.02 to 10 parts by weight of a metal salt.
前記無芽胞菌として、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を含む、排水処理方法。 Including the step of bringing the viable preparation according to claim 12 into contact with wastewater containing oil,
A wastewater treatment method comprising Yarrowia lipolytica as the non-spore bacterium.
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