JP2017148071A - Octenidine composition - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ある種の制限内にあって、人工的に上方制御（上流）又は下方制御（下流）され得る、植物におけるコード配列の発現レベルを調節するために、プロモーター領域配列における特定点におけるＡＴ(n)挿入物の使用に関する。 The present invention is within certain limits and at specific points in the promoter region sequence to regulate the expression level of the coding sequence in plants that can be artificially upregulated (upstream) or downregulated (downstream). Relates to the use of AT (n) inserts.
遺伝子のプロモーター領域は、一般には、遺伝子転写開始部位から上流に１〜１００及び２００塩基対を有するＤＮＡ配列に含まれ、典型的には、１以上の転写因子結合部位を含み、及び／又はそれに隣接している。全ての遺伝子は、転写開始部位の上流（上側）及び下流（下側）に転写調節を有する。転写因子は、これらの調節配列を認識及び結合し、転写されたメッセンジャーＲＮＡの合成を制御する。これらの配列には、プロモーター、エンハンサー及び調節配列が含まれる。プロモーターは、遺伝子構築物において使用され、構成様式において、遺伝子を過剰発現させ、阻害し、若しくはその発現を調節するために、遺伝子工学の手段によって操作され、ある種の環境によって誘導され得る。 The promoter region of a gene is generally contained in a DNA sequence having 1 to 100 and 200 base pairs upstream from the gene transcription start site, typically comprising one or more transcription factor binding sites and / or Adjacent. All genes have transcriptional regulation upstream (upper) and downstream (lower) of the transcription start site. Transcription factors recognize and bind these regulatory sequences and control the synthesis of transcribed messenger RNA. These sequences include promoters, enhancers and regulatory sequences. Promoters are used in genetic constructs and can be manipulated by genetic engineering means and induced by certain environments to overexpress, inhibit or regulate the expression of genes in a constitutive manner.
遺伝子を過剰発現させるための種々の技術は、現在、バイオテクノロジーの分野において利用可能であり、そのうち、主な技術は、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）から単離された、構成的プロモーター３５Ｓを含む発現カセットの構築物を含む。しかしながら、遺伝子構築物におけるこのプロモーターの使用にはいくつかの例外がある。短鎖ウイスルＤＮＡ、及び植物ゲノムへのその挿入物の使用により、植物に感染しているウイルスゲノム間、又はより正確には、メッセンジャーＲＮＡ転写物間に、遺伝子組換えの潜在的なリスクの存在が実験的に明らかになった。このリスクは、新規なウイルス株、できればより悪性のタイプの創生に至る。 Various techniques for overexpression of genes are currently available in the field of biotechnology, of which the main technique is the constitutive promoter 35S isolated from cauliflower mosaic virus (CaMV). Containing expression cassette constructs. However, there are some exceptions to the use of this promoter in gene constructs. The presence of a potential risk of genetic recombination between viral genomes that infect plants or, more precisely, between messenger RNA transcripts, through the use of short viral DNA and its insert into the plant genome Became clear experimentally. This risk leads to the creation of new virus strains, preferably more malignant types.
プロモーター３５Ｓ ＣａＭＶは、偶然的であると考えられ、全ての植物において、及び緑藻類、酵母、大腸菌において効果的に機能する。それは、他の植物及び動物ウイルスのプロモーターと共通して、相互交換できる対を有するモジュラー構造を有する。また、それは組換えホットスポットを有し、他の組換えホットスポットに類似した組換えプロセスに関与する複数の誘因物によって位置づけられ、トランスジェニック植物においてしばしば用いられる、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種のＴ−ＤＮＡベクターの境界が含まれる。このホットスポットは、分割し、他のＤＮＡに結合する傾向にあり、それにより、遺伝子の水平移動及び組換えプロセスの可能性を増加させる。したがって、侵襲的な外来性ＤＮＡのゲノムへの挿入、野生型ウイルスと比較して、いくつかの選択的利点を貢献する場合に安定であるだけである、休眠ウイルスの再活性化及び新規ウイルスの発生に起因して、潜在的なリスクは突然変異生成及び発癌である。 The promoter 35S CaMV is considered to be accidental and functions effectively in all plants and in green algae, yeast and E. coli. It has a modular structure with interchangeable pairs in common with other plant and animal virus promoters. It also has a recombination hotspot, is located by multiple inducers involved in the recombination process similar to other recombination hotspots, and is often used in transgenic plants of the Agrobacterium species T-DNA vector boundaries are included. This hot spot tends to split and bind to other DNA, thereby increasing the potential for horizontal gene transfer and recombination processes. Therefore, insertion of invasive foreign DNA into the genome, reactivation of dormant viruses and new viruses that are only stable when contributing some selective advantage compared to wild-type viruses Due to development, the potential risks are mutagenesis and carcinogenesis.
内因性ホモロガスの発現の部分的若しくは完全転写イベント及び／又は阻害は、プロモーター３５Ｓ ＣａＭＶを用いて観察された（Ｎａｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２ ２９１−２９９）。この不活性化は、メチル化及びエピジェネティックな変化を伴う複雑な機構に起因して起こる（Ｒｅｎｃｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３３：５３−６４；Ｎｅｕｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４４：２３０−２４１；Ｍｅｙｅｒ ＆ Ｈｅｉｄｍａｎｎ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４３：３９０−３９９；Ｔｈｉｅｒｒｙ ＆ Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１０７５−１０８３）。メチルトランスフェラーゼ又はエピジェネティックな変化に関与する他の酵素にある種の配列を指示する現実の機構は未知のままであるが、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡ間の依存したホモロガスの相互作用の関与を示唆するという仮説がある（Ｇｒｉｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１２２−１２３）；Ｍａｔｚｋｅ ＆ Ｍａｔｚｋｅ（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １０７：６７９−６８５）。 Partial or complete transcriptional events and / or inhibition of endogenous homologous expression were observed using the promoter 35S CaMV (Napoli et al (1990) The Plant Cell 2: 279-289; Van der Krol et al (1990). ) Plant Cell 2 291-299). This inactivation occurs due to a complex mechanism involving methylation and epigenetic changes (Renckens et al (1992) Mol. Gen. Genet. 233: 53-64; Neuhuber et al (1994) Mol. Gene.Genet.244: 230-241; Meyer & Heidmann (1994) Mol.Gen.Genet.243: 390-399; Thierry & Vaucheret (1996) Plant Mol.Biol.32: 1075-1083). Although the actual mechanism directing certain sequences to methyltransferases or other enzymes involved in epigenetic changes remains unknown, dependent homologous interactions between DNA-DNA, DNA-RNA and RNA-RNA There is a hypothesis to suggest involvement of action (Grierson et al. (1991) Trends in Biotechnology 9: 122-123); Matzke & Matzke (1995) Plant Physiology 107: 679-685).
文献では、ＣａＭＶ遺伝子が、感染ウイルスのゲノムで組換えられたキャノーラ（ｃａｎｏｌａ）染色体に組み込まれ、新規な複数の悪性ウイルスを生じさせたことを証明するデータがある。ＣａＭＶウイルス間のこれらの組換えはプロモーター領域を含み（Ｖａｄｅｎ ＆ Ｍｅｌｃｈｅｒ（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７７：１１１）、ＤＮＡとＤＮＡとの間、又はＲＮＡとＲＮＡとの間で起こる場合があり、しばしば、親の対応物よりも重度である感染を生じさせる（Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ５：４８，１９９２）。 In the literature, there is data demonstrating that the CaMV gene has been integrated into the canola chromosome that has been recombined with the genome of the infecting virus, resulting in multiple novel malignant viruses. These recombination between CaMV viruses include a promoter region (Vaden & Melcher (1992) Virology 177: 111) and may occur between DNA and DNA or between RNA and RNA, often the parental Causes infections that are more severe than their counterparts (Mol. Plant-Microbe Interactions 5:48, 1992).
さらに、プロモーター３５Ｓ ＣａＭＶの使用は、通常、全タンパク質の１％より低い比率で内因性遺伝子の生成物の発現をもたらす。このプロモーターにおけるいくつかの改善、例えば、ある配列の重複やエンハンサーの追加は、その発現を増加させたが、いくつかの用途については、内因性遺伝子生成物の発現レベルはさらに増加させる必要がある。 Furthermore, the use of the promoter 35S CaMV usually results in the expression of the endogenous gene product at a rate of less than 1% of the total protein. Some improvements in this promoter, such as certain sequence duplications and the addition of enhancers, increased its expression, but for some applications, the expression level of the endogenous gene product needs to be further increased .
一般に、生物的ストレス及び非生物的ストレスへの耐性の特徴に関して、遺伝子操作された植物を得るために、構成的プロモーター３５Ｓ ＣａＭＶを用いて行われた実験では、この耐性はいくつかのケースでは増加するが、このプロモーターの使用から導かれる望ましくない効果の１つは、植物の大きさの減少であり、植物の成長及び発育が通常影響され、形質転換された植物種とは無関係に小植物に至る（Ｋａｓｕｇａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．２８７−２９１）。 In general, in experiments conducted with the constitutive promoter 35S CaMV to obtain genetically engineered plants with respect to characteristics of resistance to biological and abiotic stress, this resistance is increased in some cases. However, one undesired effect derived from the use of this promoter is a reduction in plant size, where plant growth and development are usually affected and can affect plantlets independent of the transformed plant species. (Kasuga et al. (1999) Nature America Inc. 287-291).
したがって、植物成長における遅延などのある種の負の効果が起こる可能性があるが、遺伝子発現を調節するストレス誘導性プロモーターの使用のようなストラテジーはこのような効果を妨げるか又は軽減する場合がある。 Thus, certain negative effects such as delays in plant growth may occur, but strategies such as the use of stress-inducible promoters that regulate gene expression may prevent or reduce such effects. is there.
別の作業では、Ｇｅｌｖｉｎら（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｏｒｗｅｌｌ，ＭＡ：Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃｅｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）は、細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の２つの遺伝子：オパインシンターゼ（ｏｃｓ）及びマンノパインシンターゼ（ｍａｓ）の配列を調節する種々の組み合わせを用いて構築された、いくつかのプロモーターによって検出されるＧＵＳの発現を分析した。そして、種々の組み合わせのうち、ｍａｓ活性化エレメントとｍａｓプロモーター領域を用いて融合されたｏｃｓ遺伝子活性化配列の３反復によって形成されたハイブリッドプロモーターは、「（Ａｏｃｓ）３ＡｍａｓＰｍａｓ」と呼ばれ、プロモーターＣａＭＶ ３５Ｓを含む細胞と比較した場合、１０倍大きいＧＵＳマーカー遺伝子の、形質転換タバコ細胞の発現レベルにおいて提示された。この新規なプロモーターは、形質転換効率に影響を及ぼさなかったが、しかし、高レベルのマーカー遺伝子発現は、より大きな比率の形質転換細胞の同定を促進した。発現レベルは、葉、根、及び種々の細胞型において高かった。また、このプロモーターは、マニオク（ｍａｎｉｏｃ）及びエンドウ植物において非常に活性があり、２つの穀物はアグロバクテリウム種を用いて形質転換することが困難であった。このグループは、さらにこのプロモーター「（Ａｏｃｓ）３ＡｍａｓＰｍａｓ」を用いて、タバコ及びコーン植物に導入された（１８時間後）遺伝子の迅速転写の研究における成功を記載し、プロモーターＣａＭＶ ３５Ｓによって調節された発現とは異なり、その活性は弱く、この時期内での遺伝子発現のいずれの検出も可能にしない。 In another work, Gelvin et al. (Plant Molecular Biology Manual. Norwell, MA: Kluwer Academic Publishers, 1995) insects of two genes in the bacterium Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens: The expression of GUS detected by several promoters constructed using various combinations that regulate the sequence of synthase (mas) was analyzed. Among various combinations, a hybrid promoter formed by three repeats of the ocs gene activation sequence fused using the mas activation element and the mas promoter region is called “(Aocs) 3AmasPmas”, and the promoter CaMV When compared to cells containing 35S, a 10-fold greater GUS marker gene was presented at the expression level of transformed tobacco cells. This novel promoter did not affect transformation efficiency, but high levels of marker gene expression facilitated the identification of a greater proportion of transformed cells. Expression levels were high in leaves, roots and various cell types. This promoter was also very active in manioc and pea plants and the two cereals were difficult to transform with Agrobacterium species. This group further describes success in the study of rapid transcription of genes introduced into tobacco and corn plants (after 18 hours) using this promoter “(Aocs) 3AmasPmas” and expression regulated by the promoter CaMV 35S Unlike that, its activity is weak and does not allow any detection of gene expression within this period.
遺伝子構築物における遺伝子の過剰発現に対してストレス誘導性プロモーターを用いるというさらなるオプションがあり、これに関して、アラビドプシス・タリアーナ（Ａｒａｂｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）から単離されたプロモーターｒｄ２９は、非生物的ストレスに対して良好な耐性を有する植物のサーチに最も使用されている。概して、これらの遺伝子構築物は、通常、干ばつ、塩分、並びに低温及び高温などの環境ストレスに応答した遺伝子発現を調節するファミリーＤＲＥＢ（脱水応答エレメント結合）の遺伝子に融合される。異なる植物種を使用したいくつかの作業では、誘導されたストレスプロモーターを用いた遺伝子形質転換の結果として、非生物的ストレスにより耐性な植物が報告された（Ｏｏｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，３４：８６８−８８７；Ｋａｓｕｇａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ４５（３）：３４６−３５０）。 There is a further option to use a stress-inducible promoter for overexpression of the gene in the gene construct, in this regard the promoter rd29 isolated from Arabidopsis thaliana is good for abiotic stress. It is most often used to search for resistant plants. In general, these gene constructs are usually fused to genes in the family DREB (Dehydration Response Element Binding) that regulate gene expression in response to drought, salinity, and environmental stresses such as low and high temperatures. In some work using different plant species, plants that have been tolerated by abiotic stress have been reported as a result of gene transformation with induced stress promoters (Oono et al. (2003) The Plant Journal. 34: 868-887; Kasuga et al. (2004) Plant Cell Physiol 45 (3): 346-350).
Ｆｕｇａｎｔｉら（２００４）は、シスト線虫に耐性であり、影響を受けやすい大豆遺伝子型を用いた。この文献には、シスト線虫に耐性な大豆遺伝子型の支援選択に使用された分子マーカーに関する初期データが含まれる。しかしながら、ＤＮＡ配列のレベル又はこの遺伝子によってコードされたｍＲＮＡの発現に関して、試験された個体間の分子相違のいかなるタイプも検出されなかった。 Fuganti et al. (2004) used a soybean genotype that is resistant to and susceptible to cyst nematodes. This document contains initial data on molecular markers used for the assisted selection of soybean genotypes resistant to cyst nematodes. However, no type of molecular difference between individuals tested was detected with respect to the level of the DNA sequence or the expression of the mRNA encoded by this gene.
Ｆｕｇａｎｔｉ（Ｍａｓｔｅｒ’ｓ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｎｄｒｉｎａ［Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ Ｅｓｔａｄｕａｌ ｄｅ Ｌｏｎｄｒｉｎａ］，２００４）は、耐性菌株の選択を示し、ここでは、対象遺伝子を含むゲノム領域の耐性遺伝子及び分子的特徴のある遺伝子と関連した分子マーカーを用いた。この研究では、遺伝子プロモーターにおけるＡＴ(n)挿入物のサイズとそのｍＲＮＡ又はタンパク質の発現の得られたレベルとの間の可能な相関を示す定性的及び定量的データが開示されていない。本発明は、ある種の数のＡＴ(n)挿入物がプロモーター領域に挿入されているという条件で、いずれかの発現レベルと調節し、及び／又は上方制御若しくは下方制御する能力を提案する。このような提案はこの研究には示されておらず、試験されていない。 Fuganti (Master's Thesis, State University of Londrina [Universidad Estadual de Londrina], 2004) indicates the selection of resistant strains, and here, resistance genes and molecular features of the genomic region containing the gene of interest. Molecular markers were used. This study does not disclose qualitative and quantitative data showing a possible correlation between the size of the AT (n) insert in the gene promoter and the resulting level of expression of its mRNA or protein. The present invention proposes the ability to regulate and / or up-regulate or down-regulate any expression level, provided that a certain number of AT (n) inserts are inserted into the promoter region. Such a proposal has not been shown in the study and has not been tested.
Ｆｕｇａｎｔｉ（ＰｈＤ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｉｎｇａ［Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ Ｅｓｔａｄｕａｌ ｄｅ Ｍａｒｉｎｇａ］，２００７）は、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーター領域内の異なるサイズのＡＴ(n)挿入物と、種々の非生物的ストレス及び生物的ストレス（寒さ、暑さ、干ばつ、塩、線虫の幼虫による感染）に反応したその発現レベルとの間の可能な相関を示す定量的及び定性的データを示した。しかしながら、コード領域が、生物的ストレス及び非生物的ストレスの不存在及び／又は存在下、異なるＡＴ(n)サイズを含むプロモーター領域に融合されてもよい、任意の遺伝子の発現レベルを上方制御又は下方制御する可能性は、示されず、及び検討されていない。 Fuganti (PhD Thesis, State University of Maringa [Universidad Estadual de Maringa], 2007) is different from AT (n) inserts of different sizes and abiotic stresses within the promoter region of the gene Gmhsp17.6-L. Quantitative and qualitative data showing possible correlations between their expression levels in response to mechanical stress (cold, hot, drought, salt, nematode larvae infection) were presented. However, the coding region may up-regulate the expression level of any gene that may be fused to promoter regions containing different AT (n) sizes in the absence and / or presence of biological and abiotic stresses or The possibility of down-regulation has not been shown or discussed.
特許文献米国第２００５０５９６２３号は、選択された細胞に発現される、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーターに融合した、治療遺伝子の発現を調節するために、超音波の制御された応用を用いて、局所発熱を使用する方法を提供する。提案された発明は、遺伝子配列において、全ての形質転換された細胞において発現された種々のサイズのＡＴ(n)挿入物を有する熱ショックタンパク質のプロモーター領域に融合した任意の遺伝子の発現レベルを調節し、及び上方制御又は下方制御することを目的とする。生物的ストレス又は非生物的ストレスは植物全体に適用されてもよい。同一物がそのプロモーター領域に挿入されることを条件として、遺伝子発現の調節におけるＡＴ挿入物の役割、及び任意の遺伝子発現を制御するためのツールとしてその使用の可能についてのいずれの指示も開示されていない。 U.S. Patent No. 20050596623 uses a controlled application of ultrasound to regulate the expression of a therapeutic gene fused to a heat shock protein (HSP) promoter expressed in selected cells. Provide a way to use fever. The proposed invention regulates in gene sequence the expression level of any gene fused to the promoter region of heat shock protein with various size AT (n) inserts expressed in all transformed cells And the purpose is to perform upward control or downward control. Biological stress or abiotic stress may be applied to the entire plant. Any instruction on the role of the AT insert in the regulation of gene expression and its possible use as a tool to control any gene expression is provided, provided that the same is inserted into its promoter region. Not.
特許文献米国第２００３１９０７０６号は、遺伝子産物（タンパク質）の総量の増加を促進する、プロモーター活性を示すＤＮＡ配列に融合された内因性遺伝子に関する。プロモーター活性を有するこの領域は、窒素を化合した塩基の置換及び欠失を含む変異変更から生成させた。本発明は、ｍＲＮＡの合成を誘導するために必要される全ての遺伝子エレメントを含む、完全な遺伝子プロモーターの使用を必要とする。遺伝子発現の調節は、遺伝子のプロモーター領域におけるランダム突然変異というよりはむしろ、ＡＴ(n)挿入物のサイズに従って分化されたレベルをもたらすことは、本発明において明らかである。 Patent document US2003190706 relates to an endogenous gene fused to a DNA sequence exhibiting promoter activity that promotes an increase in the total amount of gene product (protein). This region with promoter activity was generated from mutational modifications including nitrogen combined base substitutions and deletions. The present invention requires the use of a complete gene promoter that contains all the genetic elements required to direct mRNA synthesis. It is clear in the present invention that regulation of gene expression results in differentiated levels according to the size of the AT (n) insert, rather than random mutations in the promoter region of the gene.
特許文献欧州第１９３０４２３号は、発現レベルが他の従来のプロモーターによって調節されない、異種タンパク質を生成するためのシステムにおいて使用される、異なる最終サイズに分けられた熱ショックタンパク質のプロモーター領域を開示する。発現を活性化するために、非生物的又は化学的な特定のストレスが使用される。本発明は、試験された遺伝子型において既存のバリエーション、文献ＥＰ１９３０４２３において使用された１０００ｂｐより小さい断片を用い、これは、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーター領域において検出される。このバリエーションは、プロモーターの特定領域における異なる数のＡＴ（ｎ）挿入物によって提供され、ＡＴ（ｎ）挿入物に依存した３１２ｂｐ（ＡＴ9）と３５８ｂｐ（ＡＴ33）の間にサイズバリエーションをもたらす。 Patent document EP 1930423 discloses heat shock protein promoter regions divided into different final sizes used in systems for producing heterologous proteins whose expression levels are not regulated by other conventional promoters. To activate expression, abiotic or chemical specific stress is used. The present invention uses an existing variation in the tested genotype, a fragment smaller than 1000 bp used in document EP 1930423, which is detected in the promoter region of the gene Gmhsp17.6-L. This variation is provided by a different number of AT (n) inserts in a particular region of the promoter, resulting in a size variation between 312 bp (AT 9 ) and 358 bp (AT 33 ) depending on the AT (n) insert.
特許文献米国第５９２９３０２号は、葉及び花托などの組織において、成熟時に遺伝子発現を制御する一過性の組織特異的なプロモーターを使用する。プロモーターは、キメラ遺伝子を発現するために、ラズベリーにおけるｄｒｕ遺伝子自体から、又はそのホモログから単離された。このプロモーターと、特異的な遺伝子、例えば、色及び香りの変化を制御する遺伝子、植物細胞プロセスを修飾する酵素又は触媒産物の遺伝子、生成物がエチレン合成に影響を及ぼす遺伝子、代替の真菌調節遺伝子、並びにスクロース蓄積遺伝子との組み合わせを示唆している。本発明は、全ての細胞において、及び植物のライフサイクル全体を通じて、いずれかの遺伝子の発現を変更するために、その遺伝子のプロモーター領域における変更を有する。遺伝子産物の発現レベルのバリエーションは、プロモーターへの種々の数のＡＴ(n)挿入物と相関し、結果として、異なるサイズのプロモーターと相関する。本発明は、これらの変更を含む任意の遺伝子発現を調節することを提案する。 US Pat. No. 5,929,302 uses transient tissue-specific promoters that control gene expression during maturation in tissues such as leaves and flower buds. The promoter was isolated from the dru gene itself in raspberry or from its homolog to express the chimeric gene. This promoter and specific genes, such as genes that control color and scent changes, genes of enzymes or catalyst products that modify plant cell processes, genes whose products affect ethylene synthesis, alternative fungal regulatory genes , As well as combinations with sucrose accumulation genes. The present invention has alterations in the promoter region of any gene in order to alter the expression of any gene in all cells and throughout the plant life cycle. Variations in the expression level of the gene product correlate with different numbers of AT (n) inserts into the promoter, and consequently correlate with different sized promoters. The present invention proposes to regulate any gene expression including these changes.
したがって、本発明は、遺伝子を過剰発現する科学論文において利用可能な現在既存の全ての方法とは異なるため、革新的である。そうするために、本発明は、多数及び少数の繰り返しを有するＡＴ配列の挿入を用い、遺伝子発現のレベルの調節を可能にし、それを増加又は減少させることができる。 Thus, the present invention is innovative because it differs from all currently existing methods available in scientific papers that overexpress genes. To do so, the present invention uses the insertion of AT sequences with a large and small number of repeats, allowing for the regulation of the level of gene expression, which can be increased or decreased.
本発明は、植物におけるコード配列の発現レベルを調節するためのプロモーターエレメントにおけるＡＴ(n)挿入物の使用に関する。また、本発明は、大豆胚を形質転換するために、ＧＵＳタンパク質に融合した、異なる数のＡＴ挿入物を有する遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子発現カセットに関する。 The present invention relates to the use of AT (n) inserts in promoter elements to regulate the expression level of coding sequences in plants. The present invention also relates to a gene expression cassette comprising the promoter region of a gene having a different number of AT inserts fused to a GUS protein to transform soybean embryos.
本発明は、植物におけるコード配列の発現レベルを制御する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）対象遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターエレメント内のＡＴ(n)挿入物を担持する発現カセットを用いて植物細胞を安定に形質転換し；
（ｉｉ）植物細胞の増殖条件下で安定に形質転換された植物細胞を培養し；
（ｉｉｉ）（ｉ）のカセットがそのゲノムに安定に組み込まれたトランスジェニック植物を再生する
ことを含み、ここで、該トランスジェニック植物は、対照植物と比較した場合に、異なるレベルの遺伝子発現を示す。
The present invention provides a method of controlling the expression level of a coding sequence in a plant, the method comprising:
(I) stably transforming plant cells with an expression cassette carrying an AT (n) insert in a promoter element operably linked to the gene of interest;
(Ii) culturing plant cells stably transformed under the growth conditions of the plant cells;
(Iii) regenerating a transgenic plant in which the cassette of (i) is stably integrated into its genome, wherein said transgenic plant exhibits different levels of gene expression when compared to a control plant. Show.
さらに、本発明は、Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーター領域に連結された異なる数のＡＴ挿入物を有する２つのプロモーター領域を含む発現カセットを提供する。 Furthermore, the present invention provides an expression cassette comprising two promoter regions with different numbers of AT inserts linked to the promoter region of the Gmhsp17.6-L gene.
本発明の別の態様では、ＡＴ(n)−挿入物を含む遺伝子的に改変された植物を得るための方法が提供され、該方法は、
（ｉ）対象遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターエレメント内にＡＴ(n)挿入物を担持する発現カセットを用いて植物細胞を安定に形質転換し；
（ｉｉ）植物細胞の増殖条件下で安定に形質転換された植物細胞を培養し；
（ｉｉｉ）安定に遺伝子的に改変された植物を再生する
ことを含む前記方法。
In another aspect of the invention, there is provided a method for obtaining a genetically modified plant comprising an AT (n) -insert, the method comprising:
(I) stably transforming plant cells using an expression cassette carrying an AT (n) insert in a promoter element operably linked to the gene of interest;
(Ii) culturing plant cells stably transformed under the growth conditions of the plant cells;
(Iii) The method comprising regenerating a stably genetically modified plant.
結果は、ある種の遺伝子の発現レベルが、遺伝子工学的ツールを介して、プロモーター領域内にＡＴ(n)繰り返し塩基を挿入することによって、ある種の制限内で、人工的に上方制御（上流）又は下方制御（下流）され得る。 The result is that the expression level of certain genes is artificially up-regulated (upstream) within certain limits by inserting AT (n) repeat bases into the promoter region via genetic engineering tools. ) Or down-regulated (downstream).
本発明は、植物におけるコード配列の発現レベルを調節するためのプロモーターエレメントにおけるＡＴ(n)挿入物の使用に関する。集団における耐性及び感受性の個体のうちで、熱ショックタンパク質（Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ）の発現レベルについて比較し、定量的ＰＣＲあたりの最大発現レベルは、プロモーター領域における最大ＡＴ挿入物を含む個体に存在していた。大豆胚を形質転換するために、ＧＵＳタンパク質に融合した異なる数のＡＴ挿入物をとともに、遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子発現カセットを構築した。本発明の実験結果により、ある種の遺伝子の発現レベルは、遺伝子工学的ツールを介して、プロモーター領域内にＡＴ(n)繰り返し塩基を挿入することによって、ある種の制限内で人工的に情報制御（上流）又は下方制御（下流）され得たことが示唆される。したがって、本発明において開発された技術は、ＡＴ(n)繰り返し挿入物がプロモーター領域の配列内の特異的な点で挿入されるという条件で、遺伝子の発現レベルの調節を可能にする。 The present invention relates to the use of AT (n) inserts in promoter elements to regulate the expression level of coding sequences in plants. Among resistant and susceptible individuals in the population, the expression level of heat shock protein (Gmhsp17.6-L) is compared and the maximum expression level per quantitative PCR is present in individuals containing the largest AT insert in the promoter region Was. To transform soybean embryos, gene expression cassettes containing the promoter region of the gene were constructed with different numbers of AT inserts fused to the GUS protein. According to the experimental results of the present invention, the expression level of certain genes can be artificially reported within certain limitations by inserting AT (n) repeat bases into the promoter region via genetic engineering tools. It is suggested that it could be controlled (upstream) or down-controlled (downstream). Thus, the technology developed in the present invention allows the regulation of gene expression levels, provided that AT (n) repeat inserts are inserted at specific points within the promoter region sequence.
線虫メロイドギネ・ジャワニカに耐性な大豆遺伝子型の支援された選択における使用のための分子マーカーを特定しようとする従来の研究に基づいて、Ｆ結合基のマイクロサテライトマーカーＳＯＹＨＳＰ１７６は、試験された集団について高い有意性を示し、根におけるシストの特徴的数について説明し、表現型バリエーションは４３％、記入尺度法でそのバリエーションの７０％を示した。このマーカーによって増幅した断片は、感受性個体にのみ存在し、耐性個体では存在しないことを指摘するのは重要である。 Based on previous studies seeking to identify molecular markers for use in assisted selection of soybean genotypes resistant to the nematode meloid guinea javanica, the F-linked microsatellite marker SOYHSP176 is It showed high significance and explained the characteristic number of cysts in the roots, showing 43% phenotypic variation and 70% of that variation on the entry scale. It is important to point out that the fragment amplified by this marker is present only in susceptible individuals and not in resistant individuals.
このマーカーを配列決定し、その後、遺伝子バンクに寄託された核酸の他の配列との類似性について探索され、この配列は、低分子量の熱ショックタンパク質（Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ）のプロモーター領域と高い相同性を示し、大豆に見出され、ＧｅｎＢａｎｋ（受入番号：Ｍ１１３１７）で寄託された。ＧｅｎＢａｎｋで利用可能であるこの遺伝子の完全な配列を用いて、新しいプライマー対は、両方の遺伝子型における断片を増幅するために設計された。 This marker was sequenced and then searched for similarities with other sequences of nucleic acids deposited in the gene bank, which sequence is high with the promoter region of the low molecular weight heat shock protein (Gmhsp17.6-L) It showed homology and was found in soybeans and deposited with GenBank (accession number: M11317). Using the complete sequence of this gene available at GenBank, a new primer pair was designed to amplify fragments in both genotypes.
このストラテジーは成功し、断片は、感受性個体と耐性個体の両方で得られた。得られた断片の全てをクローニング及び配列決定し、また、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの同じプロモーター領域と相同性を示した。しかしながら、配列のアラインメントは、感受性植物と比較した場合、耐性植物は、ＡＴ(n)繰り返しによって特徴付けられる、マイクロサテライトのより大きな挿入物を遺伝子のプロモーター領域に有していた。このようにして、耐性親ＰＩ５９５０９９起源の断片は、ＧｅｎＢａｎｋで利用可能である遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの配列と比較した場合に、１５及び１３のＡＴのさらなる繰り返しを示した。他方、感受性親ＢＲＳ１３３起源の断片は、ＧｅｎＢａｎｋで利用可能である配列よりも６回少ないＡＴ繰り返しを有する。これらの結果は、配列決定もされたこの異種交配に起因した集団の耐性及び感受性の個体について繰り返された。 This strategy was successful and fragments were obtained in both susceptible and resistant individuals. All of the resulting fragments were cloned and sequenced and showed homology with the same promoter region of the gene Gmhsp17.6-L. However, when the sequence alignment was compared to susceptible plants, resistant plants had a larger insert of microsatellite in the promoter region of the gene, characterized by AT (n) repeats. Thus, the fragment originating from the resistant parent PI 595099 showed further repeats of 15 and 13 ATs when compared to the sequence of the gene Gmhsp17.6-L available in GenBank. On the other hand, the fragment from the sensitive parent BRS133 has 6 fewer AT repeats than the sequence available in GenBank. These results were repeated for the resistant and susceptible individuals of the population resulting from this cross-breeding that was also sequenced.
また、アラインメントは、増幅された断片の全ては、マイクロサテライトマーカーＳＯＹＨＳＰ１７６のプライマーに相補的な配列を有することを示した。これを達成した場合、次に以下の疑問が生じる：マイクロサテライトプライマーのアニーリング領域が高い確立で存在するとしても、増幅が初期に耐性な植物に生じなかったのか？１つの可能性は、例えばヘアーピンなどのある種の三次構造の形成を与える、耐性個体においてより多数のＡＴ繰り返しであり、その結果、ＤＮＡポリメラーゼを増幅プロセス中にプライマーがアニーリングすることを困難にし、結論として、これらの植物においてアンプリコンの形成を阻害したのであろう。 Alignment also showed that all of the amplified fragments had a sequence complementary to the primer of the microsatellite marker SOYHSP176. If this is achieved, then the following question arises: Even if the annealing region of the microsatellite primer was present at a high probability, did amplification not occur in the initially resistant plants? One possibility is a larger number of AT repeats in resistant individuals that give rise to the formation of certain tertiary structures, such as hairpins, which makes it difficult for the primer to anneal the DNA polymerase during the amplification process, In conclusion, it may have inhibited the formation of amplicons in these plants.
この遺伝子のプロモーター領域内のマイクロサテライトの挿入は、これらの個体においてのみマーカーＳＯＹＨＳＰ１７６が増幅したことから、感受性植物においてそれを非活性化すると考えられた。しかしながら、研究は、全ての試料はマイクロサテライトの挿入を示したことを表し、おそらくは、それは線虫に対する大豆の応答において干渉している可能性があるプロモーター領域内にＡＴ繰り返し数である。遺伝子のプロモーター領域への繰り返し配列のより多くの又はより少ない挿入の存在が、このプロモーターによって調節されるタンパク質を非活性化し、活性化し、又はその発現レベルを変更する場合がある。 The insertion of microsatellite within the promoter region of this gene was thought to inactivate it in susceptible plants because the marker SOYHSP176 was amplified only in these individuals. However, studies indicate that all samples showed microsatellite insertions, presumably it is the number of AT repeats in the promoter region that may interfere in the soybean response to nematodes. The presence of more or less repetitive insertions into the promoter region of a gene may inactivate, activate or alter the expression level of a protein regulated by this promoter.
文献によると、熱ショックタンパク質の遺伝子発現の調節において繰り返しされるこれらのＡＴ−エレメントの主な機能の１つは、転写開始部位へのＲＮＡポリメラーゼのアクセスを促進することであり、さらに、転写の誘導に関与する、熱ショックタンパク質の結合を促進するためにヒストンを排除することである。文献によれば、熱ショックタンパク質は、細胞内で分子シェペロンとして作用し、新生ポリペプチド鎖を確立し、それらの正しいフォールディングを支援し、タンパク質及び／又は変性した膜を再確立し、さらにシグナル伝達において重要な役割を果たす。 According to the literature, one of the main functions of these AT-elements that is repeated in the regulation of heat shock protein gene expression is to promote RNA polymerase access to the transcription start site, The elimination of histones to promote the binding of heat shock proteins involved in induction. According to the literature, heat shock proteins act as molecular shepherons in cells, establish nascent polypeptide chains, support their correct folding, re-establish proteins and / or denatured membranes, and further signal transduction Plays an important role.
したがって、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーター領域への挿入の長さがＭ．ジャワニカによって影響される耐性及び感受性個体におけるタンパク質Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの発現レベルを変更するという仮説を調べるために、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用した。結果は、全ての個体は、耐性である又は感受性であるかに関係なく、そして、処置に関わらず、線虫を接種されるか又はされないかに関係なく、タンパク質を発現することを示した。遺伝子制御におけるＡＴ配列の生物学的機能、及びプロモーター内の繰り返し数に関する個体間に存在する差異により、リボヌクレアーゼ保護アッセイは、異なる個体において遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの発現鎖を示すと考えられたが、なお、その結果は、理論的には、線虫による感染に応答して、この遺伝子の発現に差異がないことを示し、少なくとも使用された技術によって検出可能なレベルではなかった。 Therefore, the length of insertion of the gene Gmhsp17.6-L into the promoter region is M.p. A ribonuclease protection assay was used to test the hypothesis of altering the expression level of the protein Gmhsp17.6-L in resistant and susceptible individuals affected by Javanica. The results showed that all individuals expressed the protein regardless of whether they were resistant or sensitive, and regardless of treatment, whether or not they were inoculated with nematodes. Due to the biological function of the AT sequence in gene regulation and the differences that exist between individuals regarding the number of repeats in the promoter, the ribonuclease protection assay was thought to show the expression strand of the gene Gmhsp17.6-L in different individuals. However, the results theoretically showed no difference in the expression of this gene in response to infection by nematodes, at least not at a level detectable by the technique used.
これらの結果を確認する試みにおいて、新たな研究は、遺伝子発現レベルを定量するための正確かつ精密な技術であるリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて案出された。親ＢＲＳ１３３（感受性）及びＰＩ５９５０９９（耐性）、さらに、この異種交配に由来する感受性集団の個体（２５６−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓ）並びに耐性集団の個体（ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６）に線虫を接種した。メロイドギネ・ジャワニカで接種された及び接種されていない処置の根は、ＲＮＡの抽出に回収され、全ｃＤＮＡ合成は、その後、相対的定量のためのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用された。 In an attempt to confirm these results, a new study was devised using real-time PCR (RT-PCR), an accurate and precise technique for quantifying gene expression levels. Parent BRS133 (susceptibility) and PI595099 (resistance), as well as individuals from the susceptible population (256-S, 259-S and 266-S) and individuals from the resistant population (JF7002, JF7027 and JF7056) derived from this cross-breeding Inoculated with insects. Treatment roots inoculated and uninoculated with Meloidugine javanica were recovered for RNA extraction and total cDNA synthesis was then used in RT-PCR reactions for relative quantification.
結果は、全ての耐性の親個体ＰＩ５９５０９９、その集団のＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６は、シスト線虫で接種処理された遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのより高い発現を提示することが示された。この集団のこれらの個体は、配列決定において、遺伝子のプロモーター領域内のより高いＡＴ(n)繰り返しを示したのと同じである。我々の仮説は、線虫によって感染させた場合、細胞内のシャペロンの機能を有するその転写を活性化する、耐性植物の遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−ＬのプロモーターのＡＴリッチ領域と相互作用するある種の因子を生成するということである。ＡＴ領域などの因子の相互作用に感受性のある植物において、それはこのような激しいやり方で生じなく、これは、タンパク質Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの発現レベルが線虫に感受性のある植物においてより低いことを意味する。 The results showed that all resistant parent individuals PI595050, the populations of JF7002, JF7027 and JF7056 exhibited higher expression of the gene Gmhsp17.6-L inoculated with cyst nematodes. These individuals of this population are the same as those that showed higher AT (n) repeats in the promoter region of the gene in sequencing. Our hypothesis is that certain species interact with the AT-rich region of the promoter of the resistant plant gene Gmhsp17.6-L, which when activated by nematodes activates its transcription with the function of an intracellular chaperone. The factor is to generate. In plants that are sensitive to the interaction of factors such as the AT region, it does not occur in this intense manner, which indicates that the expression level of the protein Gmhsp17.6-L is lower in plants that are sensitive to nematodes. means.
本発明の技術を通じて、プロモーター領域の特定の点における異なるサイズのＡＴ挿入物を含む、異なる遺伝子の発現レベルを制御することが可能となる。また、ＡＴ挿入のサイズに比例して、プロモーター領域に存在する、遺伝子を過剰発現又は低発現するＧＭ植物を開発することが可能となる。 Through the techniques of the present invention, it becomes possible to control the expression levels of different genes, including different sized AT inserts at specific points in the promoter region. Further, it becomes possible to develop a GM plant that is overexpressed or underexpressed in a promoter region in proportion to the size of AT insertion.
生物材料
構築物は、根こぶ（ｇａｌｌ）線虫であるメロイドギネ・ジャワニカ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｊａｖａｎｉｃａ）にそれぞれ耐性であり、影響を受けやすい大豆遺伝子型の親ＰＩ５９５０９９及びＢＲＳ１３３を用いて生じさせた。この高配から、Ｆ４世代において、感受性集団の個体２５６−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓ、並びに耐性集団である個体ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６を選択し、本試験に用いた。
Biomaterial constructs were generated using the susceptible soybean genotypes PI 595099 and BRS 133, respectively, which are resistant to and susceptible to the gall nematode Meloidogyne javanica. From this high distribution, individuals 256-S, 259-S, and 266-S of the susceptible population and individuals JF7002, JF7027, and JF7056 of the resistant population were selected and used in this study in the F4 generation.
また、線虫に感受性である品種ピンタド（Ｐｉｎｔａｄｏ）は、異なる試料から構築され、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｍ１１３１７）のプロモーター領域における異なるＡＴ(n)を含む発現カセットを用いて大豆胚の形質転換工程において、粒子衝突を介して用いられた。 Also, the cultivar Pintado, which is sensitive to nematodes, is constructed from different samples and uses an expression cassette containing different AT (n) in the promoter region of the gene Gmhsp17.6-L (GenBank accession number: M11317). Used through particle bombardment in the transformation process of soybean embryo.
実施例１：プロモーター及び完全遺伝子の単離及び特徴付け
マイクロサテライトマーカーＳＯＹＨＳＰ１７６プライマーを用いて感受性材料の増幅断片の初期配列決定から得た遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの完全配列を用いて、初期に、感受性遺伝子型だけがマイクロサテライトマーカーＳＯＹＨＳＰ１７６を増幅したことを考慮して、分析中の全ての遺伝子型におけるバンドを得るために、新規なプライマーセットを設計した（図１）。
Example 1: Isolation and characterization of promoter and complete gene Initially, using the complete sequence of gene Gmhsp17.6-L obtained from initial sequencing of amplified fragments of sensitive material using microsatellite marker SOYHSP176 primer, Considering that only the sensitive genotype amplified the microsatellite marker SOYHSP176, a novel primer set was designed to obtain bands in all genotypes under analysis (FIG. 1).
プライマー（ｐＳｏｙＨｓｐ ＡｌｅＩ Ｆ ５’ＣＡＣ ＣＧＣ ＧＧＴ Ｇ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＧＧ ＧＴＣ ＴＴＴ ＴＴＧ３’；ｐＳｏｙＨｓｐ ＮｃｏＩ Ｒ ５’ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＡＴ ＧＧＧ ＧＡＣ ＡＣＴ ＣＧＡ ＧＧＴ ＡＴＴ３’）は、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーター領域の開始において合成され、後のクローニング用に制限部位を付した。図２は、ＧｅｎＢａｎｋで利用可能である遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの配列におけるプライマーアニーリング部位を示す。 Primer (pSoyHsp AleI F 5 ′ CAC CGC GGT G GAA TTC TGA AAT TGG GTC TTT TTG3 ′; pSoyHsp NcoI R 5′CCA TGG AAT GGG GAC ACT CGA GGT ATT 3 ′) was synthesized at the start of the promoter region of the gene Gmhsp17.6-L, with a restriction site for later cloning. FIG. 2 shows the primer annealing site in the sequence of the gene Gmhsp17.6-L available in GenBank.
より新しいプライマーセット（ｐＳｏｙＨＳＰ ＰｓｔＩ Ｆ ５’ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＧＧ ＧＴＣ ＴＴＴ ＴＴＧ３’；ＳｏｙＨＳＰＣＬ Ｒ ５’ＣＣＣ ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＴＡ ＡＣＣ ＡＧＡ ＧＡＴ ＴＴＣ ＴＡＴ ＡＧＣ ＣＴ３’）を設計し、これは、コード領域のプロモーターの開始から終止コドンまでの全遺伝子を増幅し、根こぶ線虫であるＭ．ｊａｖａｎｉｃａに感受性である遺伝子型と耐性である遺伝子型との間のプロモーター良識のＡＴ(n)挿入物以外に、遺伝子配列における他の相違の存在を確認するためであった。図３は、完全な遺伝子を増幅し、配列決定するために設計された、ＧｅｎＢａｎｋで利用可能である、遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌの配列におけるプライマーアニーリング部位を示す。 Newer primer set (pSoyHSP PstI F 5 ′ GGG CTG CAG GAA TTC TGA AAT TGG GTC TTT TTG3 ′; SoyHSPCL R 5′CCC CCC GGG TTA ACC AGA GAT TTC TAT AGC CT3 ′), which amplifies the entire gene from the start of the promoter in the coding region to the stop codon and is a root-knot nematode This was to confirm the existence of other differences in the gene sequence besides the promoter sensible AT (n) insert between the genotype sensitive to javanica and the genotype resistant. FIG. 3 shows the primer annealing sites in the sequence of the gene Gmhsp17.6-L, available in GenBank, designed to amplify and sequence the complete gene.
種子由来のゲノムＤＮＡを全ての分析された試料から抽出した。各々の分析した試料からの約５０ｍｇの種子は、カミソリの刃で薄片にスライスし、１．５ｍＬマイクロチューブに回収し、３００μＬの抽出緩衝液を添加した。材料を粉砕し、さらに７００μＬの抽出緩衝液を添加した。以下の表に示されたプロトコールに従って抽出緩衝液を調製した：
表１：ゲノムＤＮＡ抽出緩衝液の調製に使用された試薬：
Seed-derived genomic DNA was extracted from all analyzed samples. Approximately 50 mg of seed from each analyzed sample was sliced into slices with a razor blade, collected into a 1.5 mL microtube, and 300 μL of extraction buffer was added. The material was ground and an additional 700 μL of extraction buffer was added. Extraction buffer was prepared according to the protocol shown in the following table:
Table 1: Reagents used to prepare the genomic DNA extraction buffer:
３０秒〜１分間、ボルテックスを用いて溶液をホモジナイズし、４分間、１６，０００×ｇで室温にて遠心分離した。懸濁液を新しい１．５ｍＬチューブに移し、前回と同じ条件で新たに遠心分離工程に提供し、新しい１．５ｍＬチューブに移した。 The solution was homogenized using a vortex for 30 seconds to 1 minute and centrifuged at 16,000 × g for 4 minutes at room temperature. The suspension was transferred to a new 1.5 mL tube, provided to the new centrifugation step under the same conditions as before, and transferred to a new 1.5 mL tube.
タンパク質を排除するために、０．１ｍｇのプロテイナーゼＫと０．０１ｍＭのＣａＣｌ2を試料に添加し、水浴中で３７℃にて９０分間インキュベートした。９００μＬの冷イソプロパノールを添加し、２分間インキュベーション後、７分間、１６，０００×ｇで遠心分離を行った。上清を捨て、ペレットを９０分間乾燥させた。４０μｇ／μＬのＲＮａｓｅ Ａを含む３００μＬのＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １Ｍ、ｐＨ８．０、ＥＤＴＡ ０．５Ｍ、ｐＨ８．０）にペレットを再懸濁させ、ＲＮＡを排除するために、もう一度、水浴中で３７℃にて９０分間、試料をインキュベートした。次に、新たに沈殿工程を行い、最終的に、ＤＮＡペレットを３００μＬのＴＥ緩衝液に再懸濁させ、分光偏光計を用いて定量し、その質及び完全性を０．８％アガロースゲルにおいて確認した。 To exclude protein, 0.1 mg proteinase K and 0.01 mM CaCl 2 were added to the sample and incubated for 90 minutes at 37 ° C. in a water bath. 900 μL of cold isopropanol was added, incubated for 2 minutes, and then centrifuged at 16,000 × g for 7 minutes. The supernatant was discarded and the pellet was dried for 90 minutes. To resuspend the pellet in 300 μL TE buffer (Tris-HCl 1M, pH 8.0, EDTA 0.5M, pH 8.0) containing 40 μg / μL RNase A, once again in a water bath to eliminate RNA Samples were incubated for 90 minutes at 37 ° C. Next, a new precipitation step was performed, and finally the DNA pellet was resuspended in 300 μL of TE buffer and quantified using a spectropolarimeter to determine its quality and integrity on a 0.8% agarose gel. confirmed.
全ての耐性試料及び感受性試料から、プロモーター領域と完全遺伝子配列を増幅するために、ＰＣＲ反応をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００サーモサイクラーを用いて行い、３０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１０×反応緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５００ｍＭのＫＣｌ、及び４００μＬの超純水）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．３ｍＭのｄＮＴＰ、１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、及び５μＭの各ＦとＲプライマーから構成され、超純水を用いて最終体積を１０μＬにして完了した。 In order to amplify the promoter region and complete gene sequence from all resistant and sensitive samples, PCR reactions were performed using a Perkin Elmer 9600 thermocycler, 30 ng template DNA, 10 × reaction buffer (100 mM Tris-HCl). pH 8.3, 500 mM KCl, and 400 μL of ultrapure water), 1.5 mM MgCl2, 1.3 mM dNTP, 1 U Taq DNA polymerase, and 5 μM of each F and R primer. Used to final volume of 10 μL to complete.
ＤＮＡ試料を増幅するために使用した熱サイクルプログラムは、以下のように構成される：９４℃で７分間の初期変性段階、続く、９４℃で１分間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で２分間の伸長の３０サイクル。７２℃で７分間のサイクルを最終に行った。増幅生成物を１％アガロースゲルで分離し、１×ＴＢＥ緩衝液（１０８ｇ Ｔｒｉｓ塩基、５５ｇボロン酸、４０ｍＬのＥＤＴＡ ０．５Ｍ ｐＨ８．０、及び蒸留水、最終体積を１Ｌとして完了する）を用いて調製され、エチジウムブロマイド（１０ｍｇ／ｍＬ）で染色した。Ｋｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ ＤＣ２９０システムを用いてイメージを得た。 The thermocycling program used to amplify the DNA sample is constructed as follows: initial denaturation step at 94 ° C for 7 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 60 ° C for 1 minute, And 30 cycles of extension at 72 ° C. for 2 minutes. A 7 minute cycle at 72 ° C. was finally performed. Amplified products are separated on a 1% agarose gel and using 1 × TBE buffer (108 g Tris base, 55 g boronic acid, 40 mL EDTA 0.5M pH 8.0, and distilled water, completed to 1 L final volume). And stained with ethidium bromide (10 mg / mL). Images were acquired using a Kodak Digital DC290 system.
増幅した断片（図４及び５）は、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを用いて、製造業者の使用説明書に従って抽出された。ＤＮＡを精製後、−２０℃にて保存した。次に、ＤＮＡを定量し、断片とプラスミドベクターとの間の連結反応をＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。連結反応は以下の構成であった：２μＬ超純水；１μＬ塩溶液（７μＬの塩溶液の希釈：２１μＬの超純水）；１μＬのＴＯＰＯ（登録商標）ベクター及び２μＬ（約１０ｎｇ）の精製バンド。試料を室温にて５分間インキュベートした。 Amplified fragments (FIGS. 4 and 5) were extracted using the PureLink ™ Quick Gel Extraction (Invitrogen) kit according to the manufacturer's instructions. The DNA was purified and stored at -20 ° C. Next, DNA was quantified, and a ligation reaction between the fragment and the plasmid vector was performed using a TOPO (registered trademark) TA cloning kit (Invitrogen). The ligation reaction consisted of: 2 μL ultrapure water; 1 μL salt solution (7 μL salt solution dilution: 21 μL ultrapure water); 1 μL TOPO® vector and 2 μL (about 10 ng) purification band. . Samples were incubated for 5 minutes at room temperature.
得られたベクターは、エレクトロポレーションを通じて、大腸菌（ＤＨ１０Ｂ菌株）細胞形質転換のために使用された。エレクトロコンピテント細胞を調製し、グリセロールストックからプレートストリーキングを通じて単離されたコロニーを得た。次に、５個の単一コロニーは、一晩、１０ｍＬのＬＢ培地−Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（１Ｌの蒸留水に対して、トリプトファン、酵母エキス及びＮａＯＨの２０ｇ混合物）中で３７℃にて２００ｒｐｍで培養された（プレ接種）５ｍＬのプレ接種は、ＯＤ５００が０．５〜０．７に到達するまで、３７℃にて３００ｒｐｍ回転した５００ｍＬのＬＢ培地に添加された。この期間後、氷上で２０分間、細胞をインキュベートし、無菌状態で、氷で予め冷やした２５０ｍＬ遠沈管に移した。４，２７８×ｇで１５分間、４℃での遠心分離工程を行い、上清を捨て、ペレットを冷却した１０％グリセロールの５００ｍＬ中に再懸濁させた。同じ条件下で新たに遠心分離を行い、上清を捨て、ペレットを冷却した１０％グリセロールの２５０ｍＬに再懸濁させた。もう一度、遠心分離工程を行い、ペレットを冷却した１０％グリセロールの２０ｍＬに再懸濁させた。溶液を５０ｍＬの滅菌チューブに移し、３９９７×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離を行った。最終行程として、ペレットを冷却した１０％グリセロールの１ｍＬ〜２ｍＬに再懸濁させた。エレクトロコンピテント細胞を５００μＬのマイクロチューブに分注し、−８０℃の冷凍庫で保存した。 The resulting vector was used for E. coli (DH10B strain) cell transformation through electroporation. Electrocompetent cells were prepared and colonies isolated from glycerol stocks were obtained through plate streaking. Next, 5 single colonies are grown overnight at 200 rpm at 37 ° C. in 10 mL LB medium-Luria Bertani (20 g mixture of tryptophan, yeast extract and NaOH against 1 L distilled water). (Pre-inoculation) 5 mL of pre-inoculation was added to 500 mL of LB medium rotated at 300 rpm at 37 ° C until OD500 reached 0.5-0.7. After this period, the cells were incubated for 20 minutes on ice and transferred under aseptic conditions to 250 mL centrifuge tubes pre-chilled with ice. A centrifugation step was performed at 4,278 × g for 15 minutes at 4 ° C., the supernatant was discarded, and the pellet was resuspended in 500 mL of chilled 10% glycerol. Fresh centrifugation was performed under the same conditions, the supernatant was discarded, and the pellet was resuspended in 250 mL of chilled 10% glycerol. Once again, a centrifugation step was performed and the pellet was resuspended in 20 mL of chilled 10% glycerol. The solution was transferred to a 50 mL sterile tube and centrifuged at 3997 × g for 15 minutes at 4 ° C. As a final step, the pellet was resuspended in 1 mL to 2 mL of chilled 10% glycerol. Electrocompetent cells were dispensed into 500 μL microtubes and stored in a −80 ° C. freezer.
２．５ｋＶ、２５μＦに設定したＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）エレクトロポレーター、及び２００又は４００オームに設定したパルスコントローラーでエレクトロポレーションを行った。２μＬの連結反応物及び１００μＬのエレクトロコンピテント細胞を用いた。細胞救出は、１５ｍＬの滅菌Ｆａｌｃｏｎチューブにおいて、１ｍＬのＳＯＣ培地 （０．５ｇ酵母エキス、２ｇトリプトファン、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、２０ｍＭグルコース、及び９６ｍＭの蒸留水）中の細菌懸濁液を培養し、３７℃にて１時間２００ｒｐｍでインキュベートすることによって得られた。この期間後、３００μＬのエレクトロポレーションした細胞は、アンピシリン（１００μｇ／３０ｍＬ）を補足し、ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌ（５０μｌのＩＰＴＧ−イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド０．１Ｍ、及び１０μＬのＸ−Ｇａｌ− −ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（５０ｍｇ／ｍＬ）／プレート）を含む固体ＬＢ培地に播種した。プレートを３７℃にて、一晩、コロニー増殖のためにインキュベートした。組換えコロニーの選択はｌａｃＺシステムを用いて行い、組換えコロニーは、白いコロニーを示し、非組換えコロニーは青いコロニーを示す。これは、ｌａｃＺ遺伝子産物と基質（Ｘ−Ｇａｌ）との反応の得られる生産物に起因している。 Electroporation was performed with a MicroPulser (BioRad) electroporator set to 2.5 kV, 25 μF, and a pulse controller set to 200 or 400 ohms. 2 μL of ligation reaction and 100 μL of electrocompetent cells were used. Cell rescue was performed in 1 mL SOC medium (0.5 g yeast extract, 2 g tryptophan, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl 2 , 10 mM MgSO 4 , 20 mM glucose, and 96 mM in a 15 mL sterile Falcon tube. Obtained by culturing a bacterial suspension in distilled water) and incubating at 200 rpm for 1 hour at 37 ° C. After this period, 300 μL of the electroporated cells were supplemented with ampicillin (100 μg / 30 mL), IPTG / X-Gal (50 μl of IPTG-isopropyl-β-thiogalactopyranoside 0.1 M, and 10 μL of X -Gal--Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (50 mg / mL) / plate) was seeded on solid LB medium. Plates were incubated overnight at 37 ° C. for colony growth. Recombinant colonies are selected using the lacZ system, with recombinant colonies showing white colonies and non-recombinant colonies showing blue colonies. This is due to the product resulting from the reaction of the lacZ gene product with the substrate (X-Gal).
次に、断片のクローニング及びサイズを確認するために、プラスミドＤＮＡ抽出物は、１ｍＬのＣＧ培地−サイクルグロー（１００ｍＬの水に対して４ｇの市販混合物）及び１００μＬ／ｍＬのアンピシリン（５０ｍＬのＣＧ培地に対して５０μＬのアンピシリン（１００ｍｇ／ｍＬ））を含む、９６ウェルマイクロプレート中に単一の白色コロニーの接種によって実施された。プレートを密封し、３７℃にて３２０ｒｐｍで２２時間、材料をインキュベートした。 Next, to confirm the cloning and size of the fragments, the plasmid DNA extract was prepared using 1 mL CG medium-cycle glow (4 g commercial mixture for 100 mL water) and 100 μL / mL ampicillin (50 mL CG medium). Was performed by inoculation of a single white colony in a 96-well microplate containing 50 μL of ampicillin (100 mg / mL). The plate was sealed and the material was incubated for 22 hours at 320 rpm at 37 ° C.
プラスミド抽出を進める前に、成長細菌の永続培養を得て、一晩増殖させたＣＧ培地７５ｍｌと５０％無菌グリセロールを滅菌プレートに含む。この培養物を−８０℃で超冷凍庫にて保存し、ストックとした。 Before proceeding with plasmid extraction, a permanent culture of growing bacteria is obtained and 75 ml of CG medium grown overnight and 50% sterile glycerol are included in a sterile plate. This culture was stored at −80 ° C. in a super freezer and used as a stock.
ミニプレップを続行し、細胞の堆積物を得るために、マイクロプレートを６分間、１，３１０×ｇ、１０℃で遠心分離した。上清を捨て、吸収ペーパー上にプレートを素早く逆さにした。次に、２００μＬのＧＥＴ（２０％グルコース、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４及び５００ｍＬに満たすための水）を各植えるに添加し、プレートを密封し、２分間、ボルテックスを用いて激しく振とうし、細胞を再懸濁させた。新たに９分間、１，３１０×ｇ、１０℃の遠心分離を行い、上清を捨て、吸収ペーパー上にプレートを素早く逆さにし、乾燥させた。 The microplate was centrifuged at 1,310 × g, 10 ° C. for 6 minutes to continue the miniprep and obtain cell deposits. The supernatant was discarded and the plate was quickly inverted on absorbent paper. Next, 200 μL of GET (20% glucose, 0.5 M EDTA pH 8.0, 1 M Tris-HCl pH 7.4 and water to fill 500 mL) is added to each plant, the plate is sealed and vortexed for 2 minutes. Shake vigorously with to resuspend the cells. Centrifugation was performed at 1,310 × g and 10 ° C. for a new 9 minutes, the supernatant was discarded, and the plate was quickly inverted on the absorbent paper and dried.
ＲＮａｓｅ Ａ（１０ｍｇ／ｍＬ）を含む６５μＬのＧＥＴをマイクロプレートの各ウェルに添加した。全ての材料は、ボルテックスを用いて再懸濁させ、「Ｕ」底のプレートに移した。次に、各ウェルに６５μＬのＮａＯＨ ０．２Ｎ／ＳＤＳ １％（０．５ｍＬ ＮａＯＨ ４Ｍ＋１ｍＬ ＳＤＳ １０％＋超純水、１０ｍＬの体積になるようにする）を添加した。この溶液は、使用される工程の直前に調製された。プレートを密封し；材料を５〜１０分間の反転により混合し、１０分間室温にてインキュベートした。接着シールに溶液が残らなくなるまで、数秒の迅速遠心分離を行った。 65 μL GET containing RNase A (10 mg / mL) was added to each well of the microplate. All materials were resuspended using a vortex and transferred to a “U” bottom plate. Next, 65 μL of NaOH 0.2N / SDS 1% (0.5 mL NaOH 4M + 1 mL SDS 10% + ultra pure water, 10 mL volume) was added to each well. This solution was prepared just before the process used. The plate was sealed; the material was mixed by inversion for 5-10 minutes and incubated for 10 minutes at room temperature. Rapid centrifugation for several seconds was performed until no solution remained on the adhesive seal.
各ウェルに、４℃で保存した３Ｍ酢酸カリウム（ＫＯＡｃ）６０ｍＬを添加し、プレートを密封し、材料を１０回反転することによって混合し、１０分間のインキュベートを氷上で行った。１５分間、１，３１０×ｇ、４℃の遠心分離工程を行い、８０μＬの上清をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）（ＭＡＧＶ Ｎ２２）プレートに移し、２５０μＬの「Ｖ」底ポリプロピレン製マイクロプレートの上部に予め固定した。プレートを５分間、１，３１０×ｇ、４℃にて遠心分離し、又は全容積が底プレート（Ｖ底）に移されるまで行われた。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）プレートを取り出し、捨て、「Ｖ」底プレートに移されるろ過された溶液に８０μＬのイソプロパノールを添加した。 To each well, 60 mL of 3M potassium acetate (KOAc) stored at 4 ° C. was added, the plate was sealed, the material was mixed by inverting 10 times, and a 10 minute incubation was performed on ice. Centrifuge for 15 minutes at 1,310 × g, 4 ° C., transfer 80 μL of the supernatant to a Millipore® (MAGV N22) plate and place it on top of a 250 μL “V” bottom polypropylene microplate in advance. Fixed. Plates were centrifuged for 5 minutes at 1,310 × g, 4 ° C., or until the entire volume was transferred to the bottom plate (V bottom). The Millipore® plate was removed, discarded, and 80 μL of isopropanol was added to the filtered solution that was transferred to the “V” bottom plate.
「Ｖ」底プレートをアルコール耐性接着剤を用いて密封し、材料を反転して混合した。４５分、１，３１０×ｇ、４℃の遠心分離工程を行い、上清をプレートを反転することによって捨て、１５０μＬの冷７０％エタノールを各試料に添加した。プレートを再度、５分間、１，３１０×ｇ、４℃にて遠心分離し、上清を捨てた後、吸収ペーパー上にプレートを反転させ、素早く８２×ｇ、４℃でスピンダウンした。プレートをペーパータオルで覆い、６０分間室温にて乾燥させ、最終的には、ＤＮＡを３０μＬの超純水に再懸濁させた。プレートを密封し、プラスミドＤＮＡの完全な溶出のために室温にて一晩インキュベートした。この期間の経過後、プラスミドＤＮＡを含むプレートを−２０℃の冷凍庫に保存した。 The “V” bottom plate was sealed with an alcohol resistant adhesive and the material was inverted and mixed. A 45 min, 1,310 × g, 4 ° C. centrifugation step was performed, the supernatant was discarded by inverting the plate, and 150 μL of cold 70% ethanol was added to each sample. The plate was again centrifuged for 5 minutes at 1,310 × g at 4 ° C. and the supernatant was discarded, then the plate was inverted on absorbent paper and quickly spun down at 82 × g at 4 ° C. The plate was covered with a paper towel, dried for 60 minutes at room temperature, and finally the DNA was resuspended in 30 μL of ultrapure water. The plate was sealed and incubated overnight at room temperature for complete elution of plasmid DNA. After this period, the plate containing the plasmid DNA was stored in a -20 ° C freezer.
試料は、配列決定のために調製される前に、挿入物の存在及びそのサイズを確認するために、制限酵素を用いて消化反応に供された。消化反応物は、１．５μＬの試薬３酵素緩衝液；０．５μＬのＥｃｏＲＩ（１０Ｕ／μＬ）；５μＬのプラスミドＤＮＡ（約１０ｎｇ）及び８μＬの超純水から構成させ、３７℃で２時間インキュベートした。この期間の経過後、反応物のアリコートを１％アガロースゲル電気泳動に供した。 Before the samples were prepared for sequencing, they were subjected to a digestion reaction using restriction enzymes to confirm the presence of the insert and its size. The digestion reaction consisted of 1.5 μL reagent 3 enzyme buffer; 0.5 μL EcoRI (10 U / μL); 5 μL plasmid DNA (approximately 10 ng) and 8 μL ultrapure water and incubated at 37 ° C. for 2 hours did. After this period, an aliquot of the reaction was subjected to 1% agarose gel electrophoresis.
断片は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００（Ａｐｐｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）キャピラリーシークエンサーによって配列決定され、この場合、ＤＮＡ二本鎖の両配向に基づいて、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅターミネーターサイクルシークエンシング（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）キットを使用し、異なる反応物と異なる配列決定実験、Ｍ１３Ｒ及びＦプライマーを用いた。配列決定反応は、各試料から１．５μＬのＤＮＡをプレート上に置き、以下の表に記載のプロトコールに従って調製した反応混合物の８．５μＬを用いた。 Fragments were sequenced by an ABI Prism 3100 (Applied Biosystems) capillary sequencer, in this case using an ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystem) kit based on both orientations of the DNA duplex Different sequencing experiments, M13R and F primers were used. The sequencing reaction used 1.5 μL of DNA from each sample on a plate and 8.5 μL of the reaction mixture prepared according to the protocol described in the table below.
表２：配列決定反応のために使用した反応混合物の調製に用いた試薬 Table 2: Reagents used to prepare reaction mixtures used for sequencing reactions
配列決定反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍサーモサイクラーを以下の条件で行った：９６℃で２分間；９６℃で１５秒間、５０℃で１５秒間、及び６０℃で４分間の３０サイクル。最終的に、ＤＮＡ沈殿のための反応は、各試料に７５％のイソプロパノールを８０μＬ添加して行い、次に、１５分間、室温にてインキュベートし、遮光し、４５分間、１，３１０×ｇの遠心分離を行った。 Sequencing reactions were performed on an Applied Biosystem thermocycler under the following conditions: 96 ° C for 2 minutes; 96 ° C for 15 seconds, 50 ° C for 15 seconds, and 60 ° C for 4 minutes for 30 cycles. Finally, the reaction for DNA precipitation was performed by adding 80 μL of 75% isopropanol to each sample, then incubating for 15 minutes at room temperature, protected from light, and 45 minutes, 1,310 × g Centrifugation was performed.
上清を捨て、１００μＬの７０％エタノールを用いてペレットを洗浄し、次に、１５分間、１，３１０×ｇの遠心分離工程を行った。上清を捨て、室温にて、遮光し、ペレットを乾燥させた。配列決定機械における試料適用について、１０μＬのｈｉ−ホルムアミドにペレットを再懸濁させ、次に、ＤＮＡ変性を引き起こすために、９５℃、５分間、サーモサイクラーで使用をインキュベートした。ＤＮＡの再アニーリングを回避するために、プレートを即座に氷に移し、その後、配列決定機械に置いた。 The supernatant was discarded and the pellet was washed with 100 μL of 70% ethanol, followed by a 1,310 × g centrifugation step for 15 minutes. The supernatant was discarded, protected from light at room temperature, and the pellet was dried. For sample application in a sequencing machine, the pellet was resuspended in 10 μL hi-formamide and then incubated in a thermocycler at 95 ° C. for 5 minutes to cause DNA denaturation. To avoid DNA re-annealing, the plates were immediately transferred to ice and then placed on a sequencing machine.
プロモーター領域及び完全な遺伝子領域の配列決定後、生物学的配列の配列データベースサーチを行い、得られた断片と既知のＤＮＡ、及びタンパク質配列の間の類似性を検証した（図６）。これを達成するために、プログラムＢＬＡＳＴｎとＢＬＳＡＴｘ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を用いた。ヌクレオチド配列（図７及び図８）並びにアミノ酸配列（図９）のアラインメントはまた、適切なソフトウェア、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅｄ １０．０．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．），ＢｉｏＥｄｉｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｅｄｉｔｏｒ ａｎｄ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて行った。 After sequencing the promoter region and the complete gene region, a sequence database search of biological sequences was performed to verify the similarity between the resulting fragments and known DNA and protein sequences (FIG. 6). In order to achieve this, the programs BLASTn and BLSATx (Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) were used. Alignment of nucleotide sequences (FIGS. 7 and 8) and amino acid sequences (FIG. 9) can also be performed using appropriate software such as Vector NTI Advanced 10.0.1 (Invitrogen Corp.), BioEdit Sequence Alignment Editor and Clustal W. I went.
実施例２：遺伝子発現の調節研究−ＲＰＡ
親遺伝子型ＰＩ５９５０９９（耐性）及びＢＲＳ１３３（感受性）をＲＰＡ実験のために選択した。大豆に存在する熱ショックタンパク質Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｍ１１３１７）の完全配列から、プライマーセットをコード配列に対して設計した（ＲＰＡ２ Ｆ ５’ＧＡＣ ＡＴＣ ＡＴＣ ＡＡＡ ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＡ３’及びＲＰＡ２ Ｒ ５’ＴＣＴ ＣＴＣ ＣＧＣ ＴＡＡ ＴＣＴ ＧＡＡ３’）。
Example 2: Regulation of gene expression-RPA
Parental genotypes PI5995099 (resistant) and BRS133 (sensitive) were selected for RPA experiments. From the complete sequence of the heat shock protein Gmhsp17.6-L (GenBank accession number: M11317) present in soybean, a primer set was designed against the coding sequence (RPA2 F 5 ′ GAC ATC ATC AAA AAA CAA GAG AA3 ′ and RPA2 R 5′TCT CTC CGC TAA TCT GAA 3 ′).
分析した親試料由来の種子ＤＮＡ抽出物、ＰＣＲを通じた断片の増幅、ＰＣＲにより生じた生成物のクローニング及び配列決定は、前述の項目において従前に詳述されたプロトコールに従って行われた。 Seed DNA extracts from the analyzed parent samples, fragment amplification through PCR, cloning and sequencing of products generated by PCR were performed according to the protocol previously detailed in the previous section.
親ＰＩ５９５０９９（耐性）及びＢＲＳ１３３（感受性）由来の総ＲＮＡは、２つの異なる処置（Ｍ．ジャワニカ線虫卵の接種及び非接種）に供された大豆根から抽出された。トリゾール試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）キットを用いて抽出を行った。すり鉢と乳棒を用いて液体窒素中で根を粉砕し、オートクレーブしたファルコンチューブに移し、ドラフトで保存し、これは２０ｍＬのトリゾールを含む。ホモジナイゼーション後、試料を５分間、室温（１５〜３０℃）にて試料をインキュベートした。１ｍＬのトリゾールの各々に対して０．２ｍＬのクロロホルムを添加し、１５秒の激しい撹拌後、溶液を室温（１５〜３０℃）にてさらに３分間インキュベートした。次に、１２．２４０×ｇ、１５分間、４℃の遠心分離工程を行った。ＲＮＡを含む液相を新しいファルコンチューブに移し、最初に使用したトリゾール１ｍＬの各々に対して、０．５ｍＬのイソプロパノールを用いて沈殿させた。溶液を室温（１５〜３０℃）で１０分間インキュベートした。１２．２４０×ｇ、１０分間、４℃の新たな遠心分離工程を行った。チューブの底に形成したペレットには沈殿したＲＮＡが含まれる。全上清を取り除き、ＲＮＡペレットを７５％エタノール（使用したトリゾール１ｍＬの各々に対して１ｍＬエタノール）を用いて洗浄した。溶液を４．２８５×ｇ、５分間、４℃で遠心分離を行い、再度、全上清（エタノール）を除いた。ペレットを溶解するために、４００μＬのＤＥＰＣ水を添加した（必要に応じて、ペレットを溶解するために温度を５０〜６０℃に上昇させた）。抽出後、総ＲＮＡを分光偏光計で定量した；その完全性を２％アガロースゲルで検証し、最後に、−８０℃で超冷凍庫で保存した。 Total RNA from parental PI 595099 (tolerant) and BRS133 (sensitive) was extracted from soybean roots that had been subjected to two different treatments (inoculation and non-inoculation with M. Javanica nematode eggs). Extraction was performed using a Trizol reagent (Life Technology) kit. The roots are ground in liquid nitrogen using a mortar and pestle, transferred to an autoclaved falcon tube and stored in a draft, which contains 20 mL of trizol. After homogenization, the sample was incubated for 5 minutes at room temperature (15-30 ° C.). 0.2 mL of chloroform was added to each 1 mL of trizol, and after 15 seconds of vigorous stirring, the solution was incubated at room temperature (15-30 ° C.) for an additional 3 minutes. Next, a centrifugation step at 12.240 × g for 15 minutes at 4 ° C. was performed. The liquid phase containing RNA was transferred to a new falcon tube and precipitated with 0.5 mL isopropanol for each 1 mL of trizol used initially. The solution was incubated at room temperature (15-30 ° C.) for 10 minutes. A new centrifugation step at 12.240 × g for 10 minutes at 4 ° C. was performed. The pellet formed at the bottom of the tube contains precipitated RNA. The whole supernatant was removed and the RNA pellet was washed with 75% ethanol (1 mL ethanol for each 1 mL of trizole used). The solution was centrifuged at 4.285 × g for 5 minutes at 4 ° C., and the whole supernatant (ethanol) was removed again. 400 μL of DEPC water was added to dissolve the pellet (temperature was raised to 50-60 ° C. to dissolve the pellet, if necessary). After extraction, total RNA was quantified with a spectropolarimeter; its integrity was verified on a 2% agarose gel and finally stored at −80 ° C. in an ultrafreezer.
初期に、対象の断片を含むプラスミドを線状化した。３０．６μＬのＤＥＰＣ水、４μＬの緩衝液、１μｇの精製プラスミド、０．４μＬのＢＳＡ、及び１μＬの制限酵素ＡｐａＩを含む反応物を３７℃、２時間、サーモサイクラーでインキュベートした。この期間の経過後、プラスミドは、１体積のフェノールを用いて精製され、ボルテックスを用いて２分間混合され、１１．７５０×ｇ、１０分間、４℃の遠心分離工程に供された。次に、水相を回収し、酢酸アンモニウム（ＮＨ4ＯＡｃ）を添加して、最終濃度を０．５Ｍにした。３体積の冷９５％エタノールを添加し、溶液を−２０℃にて１時間インキュベートした。１１．７５０×ｇ、４℃、１５分間の新たな遠心分離工程を行い、上清を注意深く捨てた。チューブを開け；ペレットを５分間乾燥させ、次に、３０μＬのＤＥＰＣ水に再懸濁させ、−２０℃にて冷凍庫で保存した。 Initially, the plasmid containing the fragment of interest was linearized. A reaction containing 30.6 μL DEPC water, 4 μL buffer, 1 μg purified plasmid, 0.4 μL BSA, and 1 μL restriction enzyme ApaI was incubated in a thermocycler at 37 ° C. for 2 hours. After this period, the plasmid was purified using 1 volume of phenol, mixed using a vortex for 2 minutes, and subjected to a centrifugation step at 11.750 × g for 10 minutes at 4 ° C. The aqueous phase was then collected and ammonium acetate (NH 4 OAc) was added to a final concentration of 0.5M. Three volumes of cold 95% ethanol were added and the solution was incubated at -20 ° C for 1 hour. A new centrifugation step was performed at 11.750 × g, 4 ° C. for 15 minutes, and the supernatant was carefully discarded. The tube was opened; the pellet was dried for 5 minutes, then resuspended in 30 μL of DEPC water and stored in a freezer at −20 ° C.
プローブを得ること
プローブを得るための転写反応は、ＭＡＸＩＳｃｒｉｐｔ（商標）インビトロ転写（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）キットを用いて行った。ＲＮＡポリメラーゼＴ７とＰ32−標識したホスフェートジデオキシヌクレオチド（ＣＴＰ）を用いた。最初に、全てのキット試薬を解凍し、氷上で維持した。ただし、室温に保存しなければならないＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ緩衝液（登録商標）は除く。全最終体積２０μＬを用いた転写反応は、１．５ｍＬマイクロチューブで、室温にて、以下の表に記載のプロトコールに従って行った。
Obtaining Probes Transcription reactions to obtain probes were performed using a MAXISscript ™ in vitro transcription (Ambion Inc.) kit. RNA polymerase T7 and P 32 -labeled phosphate dideoxynucleotide (CTP) were used. Initially, all kit reagents were thawed and kept on ice. However, the transcription buffer (registered trademark) that must be stored at room temperature is excluded. The transcription reaction using a total final volume of 20 μL was performed in 1.5 mL microtubes at room temperature according to the protocol described in the following table.
表３：放射活性プローブの転写反応に使用される試薬Table 3: Reagents used in the transcription reaction of radioactive probes
次に、全ての試薬をマイクロチューブ中で穏やかに混合し、反応物を３７℃にて１移管、サーモサイクラーを用いてインキュベートした。２ＵのＤＮａｓｅ Ｉ ＲＮａｓｅフリーを添加し、反応物を１５分間、３７℃にてインキュベートした。１体積のゲルローディング緩衝液（９５％ホルムアミド、０．０２５％ブロモフェノールブルー、０．０２５％キシレンシアノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２５ＳＤＳ）を反応物に添加し、チューブを３〜５分間、８５〜９５℃で加熱し、全試料を５％ポリアクリルアミドゲル、尿素８Ｍ、１×ＴＢＥ緩衝液上に適用した。 All reagents were then gently mixed in a microtube and the reaction was transferred at 37 ° C. for 1 transfer and incubated using a thermocycler. 2U DNase I RNase free was added and the reaction was incubated for 15 minutes at 37 ° C. One volume of gel loading buffer (95% formamide, 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene cyanol, 0.5 mM EDTA, 0.025 SDS) is added to the reaction and the tube is placed for 3-5 minutes. All samples were applied on 5% polyacrylamide gel, urea 8M, 1 × TBE buffer.
１２．０１ｇの尿素、３．１２ｍＬの４０％アクリルアミド：ビス−アクリルアミド（１９：１）及び２．５ｍＬの１０×ＴＢＥを用いて、最終体積が２５ｍＬのゲルを調製した。ゲルの最終体積が超えるのを避けるために少量の水をさらに添加した。尿素を溶解するために、ヒーターを備えた磁気撹拌システム中で溶液を維持し、その後、冷却し；シリンダーに移し、最終体積のゲルをＤＥＰＣ水で満たした。次に、１２．５μＬのＴＥＭＥＤを添加し、最後に１５６．２μＬの１０％過硫酸アンモニウムを添加した。 A gel with a final volume of 25 mL was prepared using 12.01 g of urea, 3.12 mL of 40% acrylamide: bis-acrylamide (19: 1) and 2.5 mL of 10 × TBE. A small amount of water was further added to avoid exceeding the final volume of the gel. To dissolve the urea, the solution was maintained in a magnetic stirring system equipped with a heater and then cooled; transferred to a cylinder and the final volume of gel was filled with DEPC water. Next, 12.5 μL of TEMED was added, and finally 156.2 μL of 10% ammonium persulfate was added.
この溶液を即座にガラスプレートに適用し、ウェルコム（ｗｅｌｌ ｃｏｍｂ）を置き、プレートを動かすことなしに重合をさせた。ガラスプレート及び電気泳動チャンバーを洗浄し、ＲＮａｓｅ ＡＷＡＹ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて処理することからなる、これらの材料の前処理を施すことができる。より小さなプレート上で、１〜３ｍＬのＲｅｐｅｌをドラフト中で提供し、５〜１０分間、プレートを乾燥させることができる。この処理は、電気泳動後のゲル除去を促進する。 This solution was immediately applied to a glass plate and a well comb was placed and allowed to polymerize without moving the plate. These materials can be pretreated, consisting of washing the glass plate and electrophoresis chamber and treating with RNase AWAY® (Invitrogen-Life Technology). On smaller plates, 1-3 mL of Repel can be provided in the draft and the plates can be dried for 5-10 minutes. This treatment facilitates gel removal after electrophoresis.
電気泳動を行う前に、プレートを洗浄し、過剰の尿素を排除し、ウェルコムの除去後、注射器の助けでランニング緩衝液を用いてウェルを洗浄した。チャンバーに対して所定電圧を用いたゲルの２０〜３０分の予備駆動を行い、その後、使用を適用した。プローブのサイズに従って、約２時間の電気泳動を２００〜３００ボルトで行った。 Prior to electrophoresis, the plates were washed to exclude excess urea, and after removal of the well comb, the wells were washed with running buffer with the aid of a syringe. The gel was pre-driven for 20-30 minutes using a predetermined voltage to the chamber and then applied for use. Depending on the size of the probe, electrophoresis for about 2 hours was performed at 200-300 volts.
全長プローブだけをゲル精製した。これを達成するために、電気泳動後、プレート開け、ゲルをプラスチックフィルムで覆い、バンド位置の同定をガイドするために記されたオートラジオグラフィーフィルムを約１時間晒した。次に、フィルムを５分間、暗室中で、現像液に浸して現像し、過剰分を除き、洗浄のために約３分間水に浸し、最後に固定溶液中に５分浸した。次に、フィルムを水に浸し、空気乾燥させた。フィルムとゲルを並べて、全長転写物の位置を特定した。ゲルの対象領域を取り出し、３５０ｍＬの溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ）を含むマイクロチューブに移した。プローブを含むチューブを４℃にて一晩インキュベートし、プローブ再生を最大にし、それをハイブリダイゼーションする時まで２０℃で保存した。プローブを標識するためのキットは、その質をモニターするための正の対照を与えた。 Only the full length probe was gel purified. To accomplish this, after electrophoresis, the plate was opened, the gel was covered with a plastic film, and the autoradiographic film described was exposed for about 1 hour to guide band position identification. The film was then developed by immersion in a developer for 5 minutes in a dark room to remove excess, immersed in water for about 3 minutes for cleaning, and finally immersed in the fixing solution for 5 minutes. The film was then immersed in water and allowed to air dry. The film and gel were placed side by side to locate the full length transcript. The target area of the gel was removed and transferred to a microtube containing 350 mL of elution buffer (0.5 M ammonium acetate, 1 mM EDTA, 2% SDS). The tube containing the probe was incubated overnight at 4 ° C. to maximize probe regeneration and stored at 20 ° C. until hybridization. The kit for labeling the probe provided a positive control to monitor its quality.
２５０ｂｐのラットβ−アクチン遺伝子の挿入物を含む対照ＤＮＡ、直線化されたｐＴＲＩＰＬＥｓｃｒｉｐｔプラスミドからプローブを合成し、ラット肝臓総ＲＮＡにハイブリダイズした。それらもキットに与えられた。２つの対照チューブは、酵母総ＲＮＡのみを含み、ＲＮａｓｅ酵素の活性を検証するために使用された。このようにして、酵素陽性対照チューブはＲＮａｓｅと緩衝液を含み、一方、陰性対照チューブは酵素を含まない緩衝液だけを含んだ。 Probes were synthesized from control DNA containing a 250 bp rat β-actin gene insert, linearized pTRIPLEscript plasmid and hybridized to rat liver total RNA. They were also given in the kit. Two control tubes contained only yeast total RNA and were used to verify the activity of the RNase enzyme. Thus, the enzyme positive control tube contained RNase and buffer, while the negative control tube contained only buffer without enzyme.
試料ハイブリダイゼーションと消化
ＨｙＳｐｅｅｄ（商標）ＲＰＡ−Ｈｙｇｈ−スピードハイブリダイゼーション・リボヌクレアーゼ保護アッセイ（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）キットを用いて、リボヌクレアーゼ保護アッセイは（ＲＰＡ）を行った。各マイクロチューブに対して、標識プローブを総ＲＮＡ（２０ｍｇ）に（高い比活性を有する、約１００〜８００ｐｇの２５０ｎｔ又は１〜１０ｆｍｏｌの２〜８×１０４ｃｐｍ）添加した。また、３０ｍｇの酵母総ＲＮＡを試料に添加し、最終５０ｍｇ／試料を得た。１０ｍＬの酵母総ＲＮＡ（５０ｍｇ）を含む２つの他の酵素対照チューブを得て、１つは、プローブ陽性対照としてラット肝臓総ＲＮＡを含んだ。プローブ＋試料を共沈させるために、０．５ＭのＮＨ4ＯＡｃと３体積の冷９５％エタノールを添加し、ホモジナイゼーション後、チューブを１５分間−２０℃でインキュベートした。最大速度（最小８．１６０×ｇ）で５分間、４℃にて遠心分離工程を行った。上清を除去し、ペレットを乾燥させた。１０ｍＬのＨｙＳｐｅｅｄハイブリダイゼーション緩衝液（登録商標）（予め９５℃に加熱）を各試料に添加し、このチューブを即座に９５℃（水浴又はサーモサイクラー）でインキュベートした。ペレットを溶解するために、試料を数秒間ボルテックスし、９５℃に戻した。ペレットを完全に溶解後、チューブを９５℃で３分間、６８℃で１０分間インキュベートした。温度を６８℃に維持しなければならず、移動工程は３０秒以下でなければならない。最初に、ＨｙＳｐｅｅｄ ＲＮａｓｅ消化緩衝液（登録商標）を解凍し、ＲＮａｓｅ Ａ／Ｔ１と緩衝液の混合物（１：１００希釈−９９ｍＬの緩衝液中の１ｍＬ ＲＮａｓｅ）を各試料に対して、１００ｍＬの適切な体積で調製し、室温にて保存した。１００ｍＬの混合ＲＮａｓｅ Ａ／Ｔ１＋緩衝液を各試料、及び酵母総ＲＮＡだけを含む対照チューブに添加し、酵素を含まない１００ｍＬのＨｙＳｐｅｅｄ ＲＮａｓｅ消化（登録商標）緩衝液を１つのチューブに添加し、酵素を含む完全な混合物を他の対照チューブに添加した。試料をボルテックスし、３７℃にて３０分間、消化させるためにインキュベートした。１５０ｍＬのＨｙＳｐｅｅｄインキュベーション／沈殿緩衝液（登録商標）を試料に添加し、素早くボルテックスし、チューブを１５分間、−２０℃の冷凍庫でインキュベートした。消化後、試料を１５分間、最大速度、４℃にて遠心分離し、上清を除去し、ゲルローディング緩衝液（通常９〜１０ｍＬの体積）中に再懸濁させた。ピペットによるホモジナイゼーション後、チューブを３〜４分間、９０〜９５℃に加熱し、再生を避けるために即座に氷に移した。５％ポリアクリルアミドゲル、８Ｍ尿素に試料を適用し、１×ＴＢＥ緩衝液に希釈し、２００〜３００ボルトで約２時間の電気泳動を行い、保護された断片を分離した。電気泳動後、前述のプロトコールに詳述されたフィルム露光及び現像について標準的な手法を行った（図１０）。
Sample Hybridization and Digestion The RNase Protection Assay (RPA) was performed using the HySpeed ™ RPA-Hygh-Speed Hybridization Ribonuclease Protection Assay (Ambion Inc.) kit. For each microtube, labeled probe was added to total RNA (20 mg) (about 100-800 pg 250 nt or 1-10 fmol 2-8 × 10 4 cpm with high specific activity). Also, 30 mg yeast total RNA was added to the sample to obtain a final 50 mg / sample. Two other enzyme control tubes containing 10 mL yeast total RNA (50 mg) were obtained, one containing rat liver total RNA as a probe positive control. To co-precipitate the probe + sample, 0.5 M NH 4 OAc and 3 volumes of cold 95% ethanol were added and after homogenization, the tubes were incubated for 15 minutes at −20 ° C. Centrifugation was performed at 4 ° C. for 5 minutes at maximum speed (minimum 8.160 × g). The supernatant was removed and the pellet was dried. 10 mL of HySpeed Hybridization Buffer® (previously heated to 95 ° C.) was added to each sample and the tubes were immediately incubated at 95 ° C. (water bath or thermocycler). To dissolve the pellet, the sample was vortexed for a few seconds and returned to 95 ° C. After complete dissolution of the pellet, the tube was incubated at 95 ° C. for 3 minutes and 68 ° C. for 10 minutes. The temperature must be maintained at 68 ° C. and the transfer process must be no longer than 30 seconds. First, thaw HySpeed RNase Digest Buffer (R) and mix RNase A / T1 with buffer (1: 100 dilution-1 mL RNase in 99 mL buffer) for each sample at 100 mL appropriate. Prepared in a small volume and stored at room temperature. Add 100 mL of mixed RNase A / T1 + buffer to each sample and a control tube containing only yeast total RNA, add 100 mL of HySpeed RNase Digest® buffer without enzyme to one tube, The complete mixture containing was added to the other control tube. Samples were vortexed and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to digest. 150 mL of HySpeed incubation / precipitation buffer® was added to the sample, vortexed quickly, and the tube was incubated for 15 minutes in a −20 ° C. freezer. Following digestion, the samples were centrifuged for 15 minutes at maximum speed at 4 ° C., the supernatant was removed and resuspended in gel loading buffer (usually 9-10 mL volume). After pipette homogenization, the tubes were heated to 90-95 ° C. for 3-4 minutes and immediately transferred to ice to avoid regeneration. Samples were applied to 5% polyacrylamide gel, 8M urea, diluted in 1 × TBE buffer and electrophoresed at 200-300 volts for approximately 2 hours to separate the protected fragments. After electrophoresis, standard procedures for film exposure and development detailed in the above protocol were performed (FIG. 10).
実施例３：遺伝子発現−ＲＴ−ｑＰＣＲ−温室に設定された実験
遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーターの発現試験については、ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、材料ＰＩ５９５０９９、ＢＲＳ１３３、２５６−Ｓ、２５９−Ｓ、２６６−Ｓ、ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６は由来の種子は、成長チャンバーで発芽ペーパー上に播種され、８日後、苗をプラスチック容器に移した。温室で、これらの苗は、発生Ｊ２の感染段階で幼虫のメロイドギネ・ジャワニカで感染させた。使用された線虫集団は、品種Ｄｏｋｏ由来の大豆植物から得た。根からの線虫卵抽出物は、０．５％次亜塩素酸塩溶液中で３０秒間、ブレンダーを用いて材料を挽くことによって得られた。根を水中で洗浄し、排除サイズ５００を有するミニスクリーンを用いて卵を回収した。その後、遊離（ｆｒｅｅ）卵懸濁液を２６℃に設定した孵化チャンバーに移し、２４時間ごとに、ジャワニカ（Ｊ２）を回収して、冷蔵室に保存した。ジャワニカＪ２をＰｅｔｅｒｓチャンバーで定量した。ピペットの助けを得て、６６４のＪ２／ｍｌ（植物あたり）を接種し、接種の第１、３及び６日後に、試験中の８個の材料の各々の３つの大豆植物由来の根をバルクで回収し、ジャワニカで接種されたものと接種されていないもの（対照処理）について液体窒素に移した。ＲＮＡ抽出実験の開始まで、根を超冷凍庫（−８０℃）で保存した。
Example 3: Gene expression-RT-qPCR-Experiment set in a greenhouse For the expression test of the promoter of the gene Gmhsp17.6-L, the material PI595099, BRS133, 256-S, 259- using RT-PCR technology Seeds from S, 266-S, JF7002, JF7027 and JF7056 were sown on germination paper in the growth chamber and after 8 days the seedlings were transferred to plastic containers. In the greenhouse, these seedlings were infected with the larval meloid guinea javanica at the stage of development J2 infection. The nematode population used was obtained from a soybean plant derived from the variety Doko. Nematode egg extract from the roots was obtained by grinding the material with a blender for 30 seconds in 0.5% hypochlorite solution. Roots were washed in water and eggs were collected using a miniscreen with exclusion size 500. Thereafter, the free egg suspension was transferred to an incubation chamber set at 26 ° C., and Javanica (J2) was collected every 24 hours and stored in the refrigerator. Javanica J2 was quantified in the Peters chamber. With the help of a pipette, inoculate 664 J2 / ml (per plant) and bulk the roots from 3 soy plants of each of the 8 materials under test after the first, third and sixth days of inoculation. And those inoculated with Javanica and those not inoculated (control treatment) were transferred to liquid nitrogen. The roots were stored in a super freezer (−80 ° C.) until the start of the RNA extraction experiment.
ＲＴ−ｑＰＣＲプライマー設計
リアルタイムＰＣＲに使用したプライマー（ＳｏｙＨｓｐＰＳＣ Ｆ ５’ＧＣＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＣＡＴ ＴＧＴ ＣＡＴ ＣＧＡ Ａ３’；ＳｏｙＨｓｐＰＳＣ Ｒ５’ＣＡＣ ＧＧＴ ＣＴＡ ＴＴＴ ＣＴＴ ＧＣＣ ＴＡＣ ＡＴＣ３’）は、Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｍ１１３１７）の配列ｐｏｓ終止コドン（ＴＡＡ−ヌクレオチド位置８８４）を用いて、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２．０（Ａｐｐｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プログラムで設計された。これらのプライマーは、約８０ｂｐの断片を増幅するために使用された。プライマーを設計するためにＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓプログラムに適用された選択されたパラメータは、５０ｂｐ〜１５０ｂｐ（１２０ｂｐはＲＴ−ＰＣＲに推奨される）のアンプリコン長、４０％〜６０％のＣＧ含量、最大では一列に４個のＧ塩基、５８℃〜６０℃のプライマーＴｍ（融解温度）、ＦとＲプライマー間のＴｍの最大相違が１℃であり、一列に最大４個の同一塩基を避けるべきである。その後、プライマー二量体の形成を分析するために、プログラムＯＭＩＧＡを使用し、３’末端の６遊離塩基の最小の存在を観察した。
RT-qPCR primer design Primers used for real-time PCR (SoyHspPSC) F 5 ′ GCT GTG TGT CAT TGT CAT CGA A3 ′; SoyHspPSC R5′CAC GGT CTA TTT CTT GCC TAC ATC3 ′) is a primer express 2.0 (Applied) using the sequence pos stop codon (TAA-nucleotide position 884) of the Gmhsp17.6-L gene (GenBank accession number: M11317). Biosystems) program. These primers were used to amplify a fragment of about 80 bp. Selected parameters applied to the Primer Express program to design primers were amplicon lengths of 50 bp to 150 bp (120 bp recommended for RT-PCR), CG content of 40% to 60%, up to one row 4 G bases, 58 to 60 ° C. primer Tm (melting temperature), the maximum difference in Tm between F and R primers is 1 ° C., and up to 4 identical bases in a row should be avoided. The program OMIGA was then used to analyze the formation of primer dimers and the minimal presence of 6 free bases at the 3 ′ end was observed.
ｃＤＮＡ合成用の総ＲＮＡ入手
リアルタイムＰＣＲ実験を行うために、総ＲＮＡをトリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて抽出した。最初に、１ｍＬのトリゾール／試料をファルコンチューブに分注し、５５℃に加熱した。試料の植物組織を液体窒素中でホモジナイズし、０．１ｇを窒素に維持されたチューブに分注された。その後、１ｍＬの加熱したトリゾールを試料に添加し、１分間ボルテックスし、素早くスピンダウンし、２分間５５℃にてインキュベートした。試料を４℃、２０分間、１６．０００×ｇで遠心分離し、２００μＬのクロロホルムを含むチューブに上清を移し、残渣を捨てた。試料を振とうし、室温（２２〜２５℃にて）２分間インキュベートし、次に、１６．０００×ｇ、３０分間、４℃にて遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、８ＭのＬｉＣｌを１／３体積添加した。振とう後、チューブをフリーザー中で−８０℃、１時間インキュベートした。溶液を解凍するために、チューブを４０℃の水浴中に１〜３分維持し、１６．０００×ｇ、４℃にて３０分間遠心分離した。上清を除去し、捨て、ＲＮＡを含むペレットを妨げることを避ける各試料に４００μＬの７５％エタノールを添加し、チューブを穏やかに反転した。４℃、５分間、１６．０００×ｇの遠心分離工程を行い、上清を除去し、完全に捨てた。１００μＬの超純水をペレットに添加し、チューブを穏やかに軽く叩いて、ペレットを溶解した（ペレットが迅速に溶解しない場合、さらに１００μＬの超純水を添加することができるが、次の工程で酢酸ナトリウムとイソプロパノールの体積を２倍にすべきである）。次に、１０μＬの酢酸ナトリウム（３Ｍ）と１００μＬのイソプロパノールを添加し、チューブを穏やかに反転した。試料を−８０℃で３０分間インキュベートし、水浴に３７℃で１〜３分間移し、１６．０００×ｇ、４℃にて１５分間遠心分離した。上清を除去し、４００μＬの７０％エタノールを添加し、もう一度、チューブを１６．０００×ｇ、４℃にて１５分間遠心分離した。上清を除去し、捨て、１０分間、ペレットをベンチで乾燥させた。最後に、５０μＬの超純水（又はペレットがすぐに溶解しない場合には１００μＬ）を添加し、ペレットと溶液を３７℃にて１０分間加熱し、ペレットの溶解を促進した。ＲＮＡを定量し、−８０℃のフリーザー中に保存した。逆転写反応に関して、ＲＮＡを希釈し、ｃＤＮＡ合成は、逆転写酵素（モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルス：Ｍ−ＭＬＶ）を用いて行われた。このようにして、１．５ｍｇの総ＲＮＡをマイクロチューブに分注し、ＤＥＰＣ水を最終体積９ｍＬまで添加し、６ｍＭのランダムプライマーを反応に添加し、次に８０℃にて３分間インキュベーションした。この期間の経過後、チューブを氷上で冷却し、１４ｍＬの混合物を試料に添加した。この混合物は、以下の表に記載されたプロトコールに従って調製された。
Obtaining total RNA for cDNA synthesis To perform real-time PCR experiments, total RNA was extracted using Trizol reagent (Invitrogen-Life Technology). First, 1 mL of Trizol / sample was dispensed into a Falcon tube and heated to 55 ° C. The sample plant tissue was homogenized in liquid nitrogen and 0.1 g was dispensed into tubes maintained at nitrogen. 1 mL of heated Trizol was then added to the sample, vortexed for 1 minute, quickly spun down and incubated for 2 minutes at 55 ° C. The sample was centrifuged at 16.000 × g for 20 minutes at 4 ° C., the supernatant was transferred to a tube containing 200 μL of chloroform, and the residue was discarded. Samples were shaken and incubated for 2 minutes at room temperature (at 22-25 ° C.), then centrifuged at 16.000 × g for 30 minutes at 4 ° C. The supernatant was transferred to a new tube and 1/3 volume of 8M LiCl was added. After shaking, the tubes were incubated in a freezer at -80 ° C for 1 hour. To thaw the solution, the tube was kept in a 40 ° C. water bath for 1-3 minutes and centrifuged at 16.000 × g for 30 minutes at 4 ° C. The supernatant was removed and discarded and 400 μL of 75% ethanol was added to each sample to avoid interfering with the RNA-containing pellet and the tubes were gently inverted. A centrifugation step of 16.000 × g was performed at 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was removed and discarded completely. 100 μL of ultrapure water was added to the pellet, and the tube was gently tapped to dissolve the pellet. (If the pellet does not dissolve quickly, 100 μL of ultrapure water can be added. The volume of sodium acetate and isopropanol should be doubled). Next, 10 μL of sodium acetate (3M) and 100 μL of isopropanol were added and the tube was gently inverted. Samples were incubated at −80 ° C. for 30 minutes, transferred to a water bath at 37 ° C. for 1-3 minutes, and centrifuged at 16.000 × g and 4 ° C. for 15 minutes. The supernatant was removed, 400 μL of 70% ethanol was added, and the tube was again centrifuged at 16.000 × g for 15 minutes at 4 ° C. The supernatant was removed and discarded, and the pellet was dried on the bench for 10 minutes. Finally, 50 μL of ultrapure water (or 100 μL if the pellet does not dissolve immediately) was added and the pellet and solution were heated at 37 ° C. for 10 minutes to facilitate dissolution of the pellet. RNA was quantified and stored in a -80 ° C freezer. For reverse transcription reactions, RNA was diluted and cDNA synthesis was performed using reverse transcriptase (Moloney murine leukemia virus: M-MLV). In this way, 1.5 mg of total RNA was dispensed into microtubes, DEPC water was added to a final volume of 9 mL, 6 mM random primer was added to the reaction, and then incubated at 80 ° C. for 3 minutes. After this period, the tube was cooled on ice and 14 mL of the mixture was added to the sample. This mixture was prepared according to the protocol described in the table below.
表４：ｃＤＮＡ合成用の混合物調製に使用された試薬
試薬 反応あたりの体積
５×第１鎖緩衝液６ｍＬ ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ） ４ｍＬ
ＤＴＴ（０．１Ｍ） ２ｍＬ
逆転写酵素 ２ｍＬ
Table 4: Reagents used to prepare the mixture for cDNA synthesis Volume per reaction 5 x first strand buffer 6 mL dNTP (2.5 mM) 4 mL
DTT (0.1M) 2mL
Reverse transcriptase 2mL
反応物をサーモサイクラーを用いて、３７℃にて１時間インキュベートし、その後、１０分、６５℃の工程を行った。ｃＤＮＡを−２０℃にて保存した。 The reaction was incubated for 1 hour at 37 ° C. using a thermocycler, followed by a step of 65 ° C. for 10 minutes. The cDNA was stored at -20 ° C.
ＲＴ−ｑＰＣＲ
ＰＣＲ反応は、サーモサイクラー７３００リアルタイムシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＳＹＢＥＲ（登録商標）グリーンｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）キットを用いて行われた。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍによって推奨されるように、増幅効率曲線は、標的遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌと内因性対照遺伝子ｒＲＮＡ １８Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｘ０２６２３．１）（試料標準化のために使用される）について行われた。実験プレートは、両方の遺伝子について３点測定で試料を用いて設定された。曲線は傾きを与え、それは、プライマーの増幅効率を計算するために使用され、両遺伝子について類似し、１００％（値１）に近くなければならない。相対的定量化のための増幅反応は、分析された試料の各々について回収の３日からｃＤＮＡのバルクを用いて行われた。別々の実験において、親使用について２つのリアルタイムＰＣＲ実験、及び集団試料について２つを行った。親菌株ＢＲＳ１３３とＰＩ５９５０９９、及び感受性集団由来の６個の得られた個体、２５９−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓ、並びに耐性ＪＦ７００２、ＪＦ７０２７及びＪＦ７０５６は、線虫接種処理及び非接種処理について分析された。反応は３点測定で行い、８．０μＬの超純水、０．５μＬのＲＯＸ、１２．５μＬのＳＹＢＥＲ（登録商標）グリーンｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ＵＤＧ及び２μＬのバルクＤＮＡ（約１．５μｇ）から成っていた。増幅反応のサイクリングパラメータは以下の通りであった：５０℃にて２分間；９５℃にて２分間；次に、９５℃にて１５秒、６０℃にて３０秒、及び７２℃にて３０秒の４５サイクル。データを伸長工程（７２℃）にて回収した。相対的定量化を結論付けた後、プライマー二量体の形成、非特異的（ｉｎｅｓｐｅｃｉｆｉｃ）増幅、可能なエラー及び汚染を検証するために、解離曲線を行った。ＲＴ−ＰＣＲ−によって生じたデータの解釈は、ＳＤＳ−配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）ソフトウェアを用いて行われた。
RT-qPCR
PCR reactions were performed using a Thermocycler 7300 real-time system (Applied Biosystem) and using a Platinum® SYBER® Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen-Life Technology) kit according to the manufacturer's instructions. It was broken. As recommended by Applied Biosystem, amplification efficiency curves were performed for the target gene Gmhsp17.6-L and the endogenous control gene rRNA 18S (GenBank accession number: X026223.1) (used for sample normalization). It was. Experimental plates were set up with samples with three-point measurements for both genes. The curve gives the slope, which is used to calculate the amplification efficiency of the primer and should be similar for both genes and close to 100% (value 1). Amplification reactions for relative quantification were performed using cDNA bulk from 3 days of collection for each analyzed sample. In separate experiments, two real-time PCR experiments for parental use and two for population samples were performed. Parental strains BRS133 and PI595099, and 6 resulting individuals from the susceptible population, 259-S, 259-S and 266-S, and resistant JF7002, JF7027 and JF7056 were analyzed for nematode inoculation and non-inoculation treatments It was done. The reaction was performed in 3 points and consisted of 8.0 μL ultrapure water, 0.5 μL ROX, 12.5 μL SYBER® Green qPCR SuperMix UDG and 2 μL bulk DNA (approximately 1.5 μg). . The cycling parameters for the amplification reaction were as follows: 50 ° C for 2 minutes; 95 ° C for 2 minutes; then 95 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 minutes. 45 cycles of seconds. Data was collected in the extension step (72 ° C.). After concluding relative quantification, dissociation curves were performed to verify primer dimer formation, inspecific amplification, possible errors and contamination. Interpretation of data generated by RT-PCR- was done using SDS-sequence detection system (Applied Biosystem) software.
これらの分析では、相対的遺伝子発現（ＲＱ）の計算を個別に行い、較正（値１）として、非接種試料を用いて、線虫接種処理及び非接種処理について、別々に試料を比較した。ＲＱ値はΔＣｔ法を用いて計算した。このようにして、遺伝子発現のレベル（ＲＱ）は、各処理の標的試料のＣｔを内因性対照Ｃｔで差し引くことによって計算し、ΔＣｔを生じさせる。この値は、対照試料のΔＣｔから差し引かれ（較正−値１）、ΔΔＣｔの値を得る。ＲＱは式２−ΔΔＣｔを通じて得られる。ここで、２は標的遺伝子効率（１００％＝１）の合計と、１００％効率曲線で得られた内因性対照（１００％＝１）の合成に対応する（Ｌｉｖａｋ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ（２００１），Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４０２−４０８）。標的遺伝子及び内因性遺伝子の効率は、１００％に近くなければならないが、必ずしもそうでなくてもよいが、それらはより低くてもよく、しかしながら、それらは近くなければならない。そして、この場合、式２−ΔΔＣｔの値２は、標的遺伝子と内因性遺伝子の効率の合計によって置換される。根こぶ線虫Ｍ．ジャワニカによる接種及び非接種の治療における親菌株ＢＲＳ１３３及びＰＩ５９５０９９の分析について、非接種の試料ＰＩ５９５０９９を較正（値１Ｘ）として使用し、感受性群（２５６−Ｓ、２５９−Ｓ及び２６６−Ｓ）の分析及び耐性集団（ＪＦ７００２、ＪＦ２０２７及びＪＦ７０５６）について、非接種の感受性試料２５６−Ｓを較正試料として使用した。この材料は、Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーター領域の配列決定において、低数のＡＴ（ｎ）挿入物を示したという事実に起因して選ばれた。 In these analyses, relative gene expression (RQ) calculations were performed separately and the samples were compared separately for nematode inoculation and non-inoculation treatments using a non-inoculation sample as a calibration (value 1). The RQ value was calculated using the ΔCt method. In this way, the level of gene expression (RQ) is calculated by subtracting the Ct of the target sample for each treatment by the endogenous control Ct, yielding ΔCt. This value is subtracted from the ΔCt of the control sample (calibration—value 1) to obtain the value of ΔΔCt. RQ is obtained through Equation 2-ΔΔCt. Where 2 corresponds to the sum of the target gene efficiency (100% = 1) and the synthesis of the endogenous control (100% = 1) obtained with the 100% efficiency curve (Livak and Schmittgen (2001), Methods 25 : 402-408). The efficiency of the target gene and the endogenous gene must be close to 100%, but not necessarily, but they may be lower, however they must be close. In this case, the value 2 of the equation 2-ΔΔCt is replaced by the sum of the efficiency of the target gene and the endogenous gene. Root-knot nematode M. For analysis of parental strains BRS133 and PI5995099 in the treatment of inoculation and non-inoculation with Javanica, the non-inoculated sample PI5995099 was used as a calibration (value 1X) and the sensitivity groups (256-S, 259-S and 266-S) were analyzed. And resistant populations (JF7002, JF2027 and JF7056), non-inoculated sensitive samples 256-S were used as calibration samples. This material was chosen due to the fact that it showed a low number of AT (n) inserts in sequencing the promoter region of the Gmhsp17.6-L gene.
実施例４：Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーター領域における、異なるサイズのＡＴ（ｎ）挿入物を含む発現カセット構築物
耐性個体はＧｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーター領域における高数のＡＴ（ｎ）挿入物を示し、これらの個体は、ＲＴ−ＰＣＲに供された場合、根こぶ線虫Ｍ．ジャワニカで接種されると、高レベルのこの遺伝子発現を示すことが確認されると、発現カセットをＧｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーター領域における、異なる数のＡＴ挿入物を含むように構築されるように決定された。これらの構築物の利用の目的は、これらのプロモーターは、ＡＴ（ｎ）挿入物とともに、他の遺伝子の発現を誘導し、またそれらの遺伝子の応答、異なるストレスによるそれらの活性化若しくは非活性化を評価することができる。粒子衝突を用いて、線虫感受性品種ＢＲＳ１３３とＰｉｎｔａｄｏ由来の大豆胚を形質転換するためにカセットを使用した。得られた構築物において、Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーターは、異なるストレスへの胚の曝露後、組織化学的アッセイを介した発現を有するＧｕｓ遺伝子前に位置している。
Example 4: Expression cassette constructs containing different sized AT (n) inserts in the promoter region of the Gmhsp17.6-L gene. Resistant individuals have a high number of AT (n) insertions in the promoter region of the Gmhsp17.6-L gene. These individuals show that when they were subjected to RT-PCR, the root-knot nematode M. When confirmed to show high levels of expression of this gene when inoculated with Java, the expression cassette will be constructed to contain different numbers of AT inserts in the promoter region of the Gmhsp17.6-L gene. Was decided. The purpose of using these constructs is that these promoters, along with AT (n) inserts, induce the expression of other genes and their response, activation or deactivation by different stresses. Can be evaluated. The cassette was used to transform the nematode sensitive cultivars BRS133 and Pintado-derived soybean embryos using particle bombardment. In the resulting construct, the promoter of the Gmhsp17.6-L gene is located in front of the Gus gene with expression via histochemical assays after exposure of the embryo to different stresses.
８個の分析された試料であるＢＲＳ１３３、ＰＩ５９５０９９、２５６−Ｓ、２６６−Ｓ、ＪＦ７００２、ＪＦ２０２７及びＪＦ７０５６のプロモーター領域を含む発現カセットを得て、全体で９６カセット（各材料について１２個）であった。しかしながら、ただ２つの構築物をこの試験の次の工程に使用し、それは、ＡＴ（９）である、より少ない数の挿入物を有する感受性親ＢＲＳ１３３由来の増幅されたプロモーター領域を含むカセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＢＲＳ１３３と、ＡＴ（３２）を有する耐性集団ＪＦ７０２７由来の個体からの増幅されたプロモーター領域を含むカセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７であった。プラスミドｐＡＧ１は発現カセットを構築するための鋳型として選ばれた。設計されたストラテジーは、プラスミドに存在するアクチン遺伝子由来のａｃｔ２プロモーターの除去、及び感受性親菌株ＢＲＳ１３３と、耐性集団ＪＦ７０２７の個体である、分析されるべき材料由来の増幅されたプロモーターの挿入であった。また、このプラスミドは、それらのカセットを用いた形質転換プロセスが上手くいく場合に、組織化学的アッセイを通じて、トランスジェニック胚における視覚化によって許可さえる、β−グルクロニダーゼ酵素をコードするレポーター遺伝子Ｇｕｓを示す。また、プラスミドｐＡＧ１は、６５３位における突然変異により、除草剤Ｉｍａｚａｐｙｒ（２−［４，５−ジヒドロ−４−メチル−４−（１−メチルエチル）−５−オキソ−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−３−ピリジンカルボン酸）（Ｔｕ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｗｅｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｈａｎｄｂｏｏｋ；Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ）が属するクラスに含まれる除草剤イミダゾリノンに対する耐性を与えるシロイヌナズナ由来の酵素のアセト乳酸ピルビン酸リアーゼ（ＡＨＡＳ）−アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）をコードするａｌｓ／ａｈａｓ遺伝子のプロモーター（ａｈａｓ ５）、コード配列（ａｈａｓ）及びターミネーター（ａｈａｓ ｔ）を含む。このようにして、この遺伝子は、形質転換後、除草剤含有培地において陽性植物の選択を可能にする。図１３はプラスミドマップを示す。このストラテジーを発展させるために、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）キットを用いてプラスミドＤＮＡ抽出を行った。このようにして、単一コロニーは、抗生物質アンピシリン（０．５ｍｇ）を含む２〜５ｍＬのＬＢ培地に植菌され、３７℃にて８時間、２００ｒｐｍで回転させながらインキュベートした（プレ接種物）。１ｍＬのプレ接種物を５００ｍＬのＬＢ／アンピシリン培地に移し、３７℃にて１２〜２０時間、２００ｒｐｍで回転させながらインキュベートした。２５０ｍＬチューブに細胞を分注し、５．０００×ｇで１０分間、室温にて遠心分離し、上清を捨て、１５ｍＬの細胞再懸濁液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１９ｍＭのＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａ）にペレットを完全に再懸濁させた。１５ｍＬの細胞溶解溶液（０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）を添加し、反転して混合し、溶液を２０分間、室温でインキュベートした。次に、１５ｍＬの中和溶液（１．３２Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ４．８）を添加し、溶液を反転して混合し、白色フレークの形成をもたらし、溶解物は粘性が低かった。沈殿した材料は、ゲノムＤＮＡ、タンパク質、細胞残屑及びＳＤＳを含む。１４．０００×ｇ、１５分間、室温での遠心分離工程を行い、上清は、Ｗｈａｔｍａｎ １フィルターペーパーを含むシリンダーでろ過された。体積を測定し、５０ｍＬ遠沈管に移し、室温の０．５体積のイソプロパノールを添加し、反転して混合した。１４．０００×ｇ、１５分間、室温での新たな遠心分離工程を行い、上清を捨て、ペレットを２ｍＬのＴＥ緩衝液に再懸濁させた。このＤＮＡを含む溶液に、１０ｍＬのＷｉｚａｒｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製レジン（登録商標）を添加し、レジン＋ＤＮＡの混合物は、真空ポンプに連結されたＭａｘｉｃｏｌｕｍｎに移された。真空にし、２５ｍＬのカラム洗浄溶液（８０ｍＭ酢酸カリウム、８．３ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４０μＭのＥＤＴＡ、５５％エタノール）を添加し、さらに真空にした。５ｍＬの８０％エタノールをＭａｘｉｃｏｌｕｍｎに適用し、真空にし、その後、全体咳のエタノールをカラムに通過させ、さらに１分間真空を維持した。次に、Ｍａｘｉｃｏｌｕｍｎを５０ｍＬファルコンチューブに移し、１．３００×ｇで５分間遠心分離した。レジンを乾燥させるために、真空をさらに５分間行った。最後に、Ｍａｘｉｃｏｌｕｍｎをキットから与えられるチューブに移し、１．５ｍＬの予熱した水（６５℃〜７０℃）をカラムに添加した。１分経過後、ＤＮＡを溶出するために、遠心分離工程（１．３００×ｇ、５分間、室温）を行った。抽出後、プラスミドＤＮＡを定量し、１％アガロースゲルにおいてその完全性を検証した。ａｃｔ２プロモーター切り出し（−１０００ｂｐ）について、制限酵素消化を行った。第１段階では、ｐＡＧ１を酵素Ｐｓｔ１とＮｏｔ１による二重消化に供した。この消化により、約５．５００ｂｐ（ａｌｓ／ａｈａｓ遺伝子のプロモーター−ａｈａｓ ５、コード配列−ａｈａｓ及びターミネーター−ａｈａｓ ｔに対応する）と６．５００ｐｂ（Ｇｕｓ遺伝子、ａｃｔ２プロモーター及びプラスミド骨格、Ｏｒｉ及びＮｏｓに対応する）の２つの断片を得た。消化反応物は、１０μＬのプラスミドＤＮＡ（約１．５μｇ）、２μＬのＲｅａｃｔ ２緩衝液、５．０μＬのＰｓｔ１酵素（１０Ｕ／μＬ）、及び３μＬの超純水から構成された。チューブを３７℃にて２時間、サーモサイクラーを用いてインキュベートした。この期間の経過後、さらに２μＬのＰｓｔ１酵素（１０Ｕ／μＬ）を溶液に添加し、３７℃にて２時間、サーモサイクラーを用いてインキュベートした。同じマイクロチューブで、Ｎｏｔ１を用いた反応を行い、３．５μＬのＮｏｔ１酵素（１０Ｕ／μＬ）、１．５μＬのＲｅａｔ ２緩衝液及び２μＬのＮａＣｌ（１Ｍ）を添加した。新たに２時間、３７℃のインキュベートし、この期間の経過後、さらに２μＬのＮｏｔ１酵素を添加した。３７℃のサーモサイクラーを用いて反応を一晩維持した。ｐＡＧ１消化した断片を０．８％アガロースゲルにおいて分離し、前述のプロトコールに従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを用いてゲルを抽出した。消化の第２工程では、より大きな断片（６．５００ｐｂ）は、ａｃｔ２プロモーターの切り出しのために制限酵素ＢａｍＨＩで消化された。反応物は、０．５μＬのＢａｍＨＩ酵素、１５μＬのＲｅａｃｔ ３緩衝液、１２μＬのＤＮＡ消化断片、及び１μＬの超純水から構成された。サーモサイクラーを用いて、マイクロチューブを２時間、３７℃にてインキュベートした。この期間の経過後、さらに０．５μＬのＢａｍＨＩ酵素を添加し、反応物をさらに３７℃にて一晩インキュベートした。断片を０．８％アガロースゲルにおいて分離し、より大きな断片（Ｇｕｓ遺伝子、プラスミドＤＮＡ、Ｏｒｉ及びＮｏｓに対応する）は、製造業者の使用説明書に従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを用いてゲル精製した。親菌株ＢＲＳ１３３と耐性個体ＪＦ７０２７から異なる増幅されたプロモーターを含む発現カセット構築物を得るために、連結反応は、１１μＬの超純水、それぞれ試験した試料からの２μＬ（約１０ｎｇ）のＡｈａｓ断片、１μＬ（約１０ｎｇ）のＧｕｓ断片、Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌプロモーター由来の１μＬ（約１０ｎｇ）の精製されたバンド、４μＬのリガーゼ緩衝液及び１μＬのＴ４リガーゼ酵素を混合して行った。反応を一晩、１４℃にてインキュベートした。２つの選択した試料由来のプロモーター領域断片は、プライマーｐＳｏｙＨｓｐＰｓｔＩ Ｆ（５’ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＧＡ ＡＡＴ ＴＧＧ ＧＴＣ ＴＴＴ ＴＴＧ３’）及びｐＳｏｙＨｓｐＢａｍＨＩ Ｒ（５’ＣＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＴ ＧＧＧ ＧＡＣ ＡＣＴ ＣＧＡ ＧＧＴ ＡＴＴ３’）を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅された。プライマーにおいて設計及び合成された制限酵素部位により、ａｃｔ２プロモーターを従前に位置したのと同じ位置で正しい配向のＧｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーターのクローニングが可能になった。前述のプロトコールに従って、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、ＤＨ１０Ｂ菌株は、カセットの連結反応を用いてエレクトロポレートされ、ＬＢ培地中で一晩、３７℃にて増殖させた。得られたコロニーから、特定のプライマーを用いた一連のＰＣＲ増幅、制限酵素を用いた消化反応は、構築物のクローニングが成功したことを検証するために行われた。発現カセットが得られたという成功を証明するこの工程後、Ｇｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーター領域に特異的なプライマー、ｐＡＧ１プラスミドの、Ａｈａｓ遺伝子（６５４ｂｐ）については（Ａｈａｓ１ Ｆ５’ＡＣＴ ＡＧＡ ＧＡＴ ＴＣＣ ＡＧＣ ＧＴＣ ＡＣ３’；Ａｈａｓ２ Ｒ５’ＧＴＧ ＧＣＴ ＡＴＡ ＣＡＧ ＡＴＡ ＣＣＴ ＧＧ３’）、及びＮｏｓターミネーターについては（Ｎｏｓ１ Ｆ５’ＧＡＡ ＴＣＣ ＴＧＴ ＴＧＣ ＣＧＧ ＴＣＴ ＴＧ３’； Ｎｏｓ３ Ｒ５’ＴＴＡ ＴＣＣ ＴＡＧ ＴＴＴ ＧＣＧ ＣＧＣ ＴＡ３’）を用いてＰＣＲ反応は、全ての得られた試料を用いて行われた。図１４、１５及び１６は、それぞれ、得られた発現カセットの各々の１２試料のＧｍｈｓｐ１７．６−Ｌのプロモーター領域の増幅、Ａｈａｓの一部及びＮｏｓ領域の一部を示す。 Eight analyzed samples BRS133, PI59505099, 256-S, 266-S, JF7002, JF2027 and JF7056 expression cassettes were obtained for a total of 96 cassettes (12 for each material). It was. However, only two constructs were used in the next step of this test, which is a cassette pAG1 / promoter containing an amplified promoter region from a susceptible parent BRS133 with a smaller number of inserts, which is AT (9). Gmhsp BRS133 and cassette pAG1 / promoter Gmhsp containing amplified promoter regions from individuals from resistant population JF7027 with AT (32) JF7027. Plasmid pAG1 was chosen as a template for constructing the expression cassette. The strategy designed was the removal of the act2 promoter from the actin gene present in the plasmid and the insertion of an amplified promoter from the material to be analyzed that is an individual of the susceptible parent strain BRS133 and the resistant population JF7027. . This plasmid also represents a reporter gene Gus that encodes a β-glucuronidase enzyme that is permitted by visualization in transgenic embryos through histochemical assays if the transformation process using these cassettes is successful. The plasmid pAG1 was also transformed into the herbicide Imazapyr (2- [4,5-dihydro-4-methyl-4- (1-methylethyl) -5-oxo-1H-imidazol-2-yl) by mutation at position 653. -3-pyridinecarboxylic acid) (Tu et al. (2004), Weed control methods handbook; London: Academic), an acetolactate pyruvate lyase, an enzyme derived from Arabidopsis that imparts resistance to the herbicide imidazolinone It contains the promoter (ahas 5), coding sequence (ahas) and terminator (ahas t) of the als / ahas gene encoding (AHAS) -acetolactic acid synthase (ALS). Thus, this gene allows selection of positive plants in herbicide-containing media after transformation. FIG. 13 shows the plasmid map. To develop this strategy, plasmid DNA extraction was performed using the Wizard Plus Maxipreps DNA Purification System (Promega) kit. Thus, single colonies were inoculated into 2-5 mL LB medium containing the antibiotic ampicillin (0.5 mg) and incubated at 37 ° C. for 8 hours with rotation at 200 rpm (pre-inoculum). . 1 mL of the pre-inoculum was transferred to 500 mL of LB / ampicillin medium and incubated at 37 ° C. for 12-20 hours with rotation at 200 rpm. Dispense the cells into a 250 mL tube, centrifuge at 5.000 × g for 10 minutes at room temperature, discard the supernatant, and add 15 mL cell resuspension (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 19 mM EDTA). The pellet was completely resuspended in 100 μg / mL RNase A). 15 mL of cell lysis solution (0.2 M NaOH, 1% SDS) was added, mixed by inversion, and the solution was incubated for 20 minutes at room temperature. Then 15 mL of neutralizing solution (1.32 M potassium acetate, pH 4.8) was added and the solution was inverted and mixed, resulting in the formation of white flakes and the lysate was less viscous. The precipitated material includes genomic DNA, proteins, cell debris and SDS. A centrifugation step was performed at 14.000 × g for 15 minutes at room temperature, and the supernatant was filtered through a cylinder containing Whatman 1 filter paper. The volume was measured and transferred to a 50 mL centrifuge tube and 0.5 volume of isopropanol at room temperature was added and mixed by inversion. A new centrifugation step was performed at 14.000 × g for 15 minutes at room temperature, the supernatant was discarded, and the pellet was resuspended in 2 mL TE buffer. To this solution containing DNA, 10 mL of Wizard Maxipreps DNA Purification Resin® was added and the resin + DNA mixture was transferred to Maxicoln connected to a vacuum pump. A vacuum was applied and 25 mL of column wash solution (80 mM potassium acetate, 8.3 mM Tris-HCl, pH 7.5, 40 μM EDTA, 55% ethanol) was added and further evacuated. 5 mL of 80% ethanol was applied to the Maxicumum and a vacuum was applied, after which the whole cough ethanol was passed through the column and the vacuum was maintained for an additional minute. Next, Maxicumum was transferred to a 50 mL falcon tube and centrifuged at 1.300 × g for 5 minutes. A vacuum was applied for an additional 5 minutes to dry the resin. Finally, Maxicolum was transferred to the tube provided from the kit and 1.5 mL of preheated water (65 ° C.-70 ° C.) was added to the column. After 1 minute, a centrifugation step (1.300 × g, 5 minutes, room temperature) was performed to elute the DNA. After extraction, plasmid DNA was quantified and verified for its integrity on a 1% agarose gel. Restriction enzyme digestion was performed on the act2 promoter excision (-1000 bp). In the first stage, pAG1 was subjected to double digestion with enzymes Pst1 and Not1. This digestion results in approximately 5.500 bp (corresponding to the promoter / ahas5 of the als / ahas gene, coding sequence-ahas and terminator-ahast) and 6.500 pb (Gus gene, act2 promoter and plasmid backbone, Ori and Nos). Two corresponding fragments were obtained. The digestion reaction consisted of 10 μL plasmid DNA (approximately 1.5 μg), 2 μL React 2 buffer, 5.0 μL Pst1 enzyme (10 U / μL), and 3 μL ultrapure water. Tubes were incubated for 2 hours at 37 ° C. using a thermocycler. After this period, another 2 μL of Pst1 enzyme (10 U / μL) was added to the solution and incubated at 37 ° C. for 2 hours using a thermocycler. In the same microtube, a reaction using Not1 was performed, and 3.5 μL of Not1 enzyme (10 U / μL), 1.5 μL of Reat 2 buffer and 2 μL of NaCl (1M) were added. A new 2 hour incubation at 37 ° C. was performed, after which 2 μL of Not1 enzyme was added. The reaction was maintained overnight using a 37 ° C thermocycler. The pAG1-digested fragments were separated on a 0.8% agarose gel and the gel was extracted using the PureLink ™ Quick Gel Extraction (Invitrogen) kit according to the protocol described above. In the second step of digestion, a larger fragment (6.500 pb) was digested with the restriction enzyme BamHI for excision of the act2 promoter. The reaction consisted of 0.5 μL BamHI enzyme, 15 μL React 3 buffer, 12 μL DNA digested fragment, and 1 μL ultrapure water. The microtube was incubated for 2 hours at 37 ° C. using a thermocycler. After this period, an additional 0.5 μL of BamHI enzyme was added and the reaction was further incubated overnight at 37 ° C. Fragments were separated on a 0.8% agarose gel, and larger fragments (corresponding to Gus gene, plasmid DNA, Ori and Nos) were purified according to the manufacturer's instructions, PureLink ™ Quick Gel Extraction (Invitrogen) kit Was used to purify the gel. To obtain an expression cassette construct containing different amplified promoters from the parental strain BRS133 and the resistant individual JF7027, the ligation reaction consisted of 11 μL ultrapure water, 2 μL (about 10 ng) Ahas fragment from each tested sample, 1 μL ( About 10 ng) Gus fragment, 1 μL (about 10 ng) purified band derived from Gmhsp17.6-L promoter, 4 μL ligase buffer and 1 μL T4 ligase enzyme were mixed. The reaction was incubated overnight at 14 ° C. The promoter region fragment from the two selected samples is the primer pSoyHspPstI. F (5'GGG CTG CAG GAA TTC TGA AAT TGG GTC TTT TTG3 ') and pSoyHspBamHI Amplified from genomic DNA using R (5 'CCC GGA TCC AAT GGG GAC ACT CGA GGT ATT3'). The restriction enzyme site designed and synthesized in the primer allowed the cloning of the correct orientation of the promoter of the Gmhsp17.6-L gene at the same position where the act2 promoter was previously located. According to the protocol described above, E. coli cells, DH10B strain, were electroporated using a cassette ligation reaction and grown overnight at 37 ° C. in LB medium. From the obtained colonies, a series of PCR amplification using specific primers and a digestion reaction using restriction enzymes were performed to verify that the cloning of the construct was successful. After this step demonstrating the success of obtaining an expression cassette, a primer specific for the promoter region of the Gmhsp17.6-L gene, the Ahas gene (654 bp) of the pAG1 plasmid (Ahas1 F5'ACT AGA GAT TCC AGC GTC AC3 '; Ahas2 R5'GTG GCT ATA CAG ATA CCT GG3 ') and the Nos terminator (Nos1 F5'GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG3 '; Nos3 PCR reactions were performed with all the obtained samples using R5'TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA3 '). FIGS. 14, 15 and 16 respectively show amplification of the promoter region of Gmhsp17.6-L, part of Ahas and part of Nos region of each of the 12 samples of the resulting expression cassette.
実施例５：一時的発現又はＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）活性の研究
粒子衝突を介したトランスジェニック植物の取得
発現カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨＳＰ ＢＲＳ１３３及びｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨＳＰ ＪＦ７０２７を用いて形質転換されたトランスジェニック植物を得るために、最初に、プラスミドＤＮＡ抽出を前述のプロトコールに従って行った。この手法により、バイオバリティクス法、遺伝子銃法又は粒子衝突を介した形質転換手法に使用されるのに十分な多量のプラスミドＤＮＡが得られた。この手法では、植物中の遺伝材料の導入は、微粒子を用いて行われ、通常、内因性ＤＮＡで被覆された、０．４〜０．２ｍｍの直径を有する金又はタングステンでできている。粒子を対象のＤＮＡ分子で被覆し、高圧下でのヘリウムガス放電によって引き起こされる衝撃波により高速で加速し、発射する。標的細胞又は組織に衝突した場合、破壊することなしに細胞壁及び原形質膜を貫通し（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３）、内因性ＤＮＡは、細胞液の作用によって微粒子から解離し、植物ゲノムに組み込まれなければならない。インビトロで培養され、再生された後、これらのトランスジェニック組織又は細胞は、遺伝子改変された植物を生じる（Ｂｒａｓｉｌｅｉｒｏ ａｎｄ Ａｒａｇａｏ（２００１），Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．３（３）：１１３−１２１；Ｒｅｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ３：４１０−４１８）。
Example 5: Study of transient expression or GUS (β-glucuronidase) activity Obtaining transgenic plants via particle bombardment Expression cassette pAG1 / promoter GmHSP BRS133 and pAG1 / promoter GmHSP In order to obtain transgenic plants transformed with JF7027, plasmid DNA extraction was first performed according to the protocol described above. This technique yielded large amounts of plasmid DNA sufficient to be used in biovalidics, gene gun techniques, or transformation techniques via particle bombardment. In this approach, the introduction of genetic material into the plant is performed using microparticles and is usually made of gold or tungsten having a diameter of 0.4 to 0.2 mm coated with endogenous DNA. The particles are coated with the DNA molecules of interest, accelerated and launched at high speed by shock waves caused by a helium gas discharge under high pressure. When colliding with a target cell or tissue, it penetrates the cell wall and plasma membrane without destroying (Klein et al. (1987), Nature 327: 70-73), and endogenous DNA is microparticles by the action of cell fluid. Must be dissociated from and integrated into the plant genome. After being cultured and regenerated in vitro, these transgenic tissues or cells give rise to genetically modified plants (Brasileiro and Aragao (2001), Plant Biotechnol J. 3 (3): 113-121; Rech et al. (2008), Nat Protoc 3: 410-418).
種子除染
根こぶ線虫にともに感受性である品種ＢＲＳ１３３及びＰｉｎｔａｄｏ由来の大豆種子を用いた。計量後、種子は、７０％エタノールで１０分間、その後、１％ナトリウム（Ｖ／Ｖ）で２０分間の浸漬により除染された。層流フード中で、オートクレーブした蒸留水で種子を３回洗浄し、種子の２倍量の水に埋め込み、約１６時間〜１８時間、水和のために浸漬し続けた。
Seed decontamination Soybean seeds from cultivars BRS133 and Pintado, both sensitive to root-knot nematodes, were used. After weighing, the seeds were decontaminated by soaking with 70% ethanol for 10 minutes and then with 1% sodium (V / V) for 20 minutes. In a laminar flow hood, the seeds were washed three times with autoclaved distilled water, embedded in twice the amount of seed water and kept immersed for hydration for about 16-18 hours.
胚の単離及び衝突用の支持プレートの調製
除湿機及び低い部屋の湿度にするエアコンを用いて、水和された種子から胚を単離した。無菌した鉗子及び外科用ブレードの助けにより、種子を切開し、胚軸を除き、乾燥を避けるため、蒸留水を含むペトリディッシュに移した。次に、実体顕微鏡の助けにより、葉原基を切り出し、頂端***組織領域を露呈した。層流フード中のフィルターペーパーに胚を移し、過剰な水を取り除き、それは、屈折する粒子に対する障壁として振る舞う形質転換効率を低下させることができる。衝突について、１６ｍｍ径の中心塩（デッドゾーン）は、無菌鉗子を用いて、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ Ｓａｌｔ）、３％スクロース及び０．８％フィタゲル（ｐＨ５．７）を含む小さなペトリディッシュ中に設計された。実体顕微鏡の助けにより、プレート中の溝に胚を配置し、頂端***組織領域を上に向けた。担体メンブレン支持体及び支持シリンダーを火で滅菌し、４つの破壊メンブレンセットを別々にし、使用するまでイソプロパノール中に浸漬し続けた。担体メンブレンをそれらの支持体中に集めた。
Embryo isolation and preparation of support plates for impact Embryos were isolated from hydrated seeds using a dehumidifier and an air conditioner that brought to low room humidity. With the help of sterile forceps and a surgical blade, the seeds were dissected and removed from the hypocotyl and transferred to a petri dish containing distilled water to avoid drying. Next, the leaf primordium was excised with the aid of a stereomicroscope to expose the apical meristem region. Transfer embryos to filter paper in a laminar flow hood and remove excess water, which can reduce transformation efficiency acting as a barrier to refracting particles. For collision, a 16 mm diameter central salt (dead zone) is placed in a small petri dish containing MS medium (Murashige and Skog Salt), 3% sucrose and 0.8% phytagel (pH 5.7) using sterile forceps. Designed. With the help of a stereomicroscope, the embryo was placed in a groove in the plate and the apical meristem region was facing up. The carrier membrane support and support cylinder were sterilized by fire and the four disrupted membrane sets were separated and kept immersed in isopropanol until used. Carrier membranes were collected in their support.
タングステン微粒子の滅菌及び洗浄
遠沈管において、６０ｍｇのＭ１０タングステン微粒子を計量し、それは、約１００回の発射には十分な材料である。この遠沈管に、１０ｍＬの７０％エタノールを添加した；溶液を激しくホモジナイズし、撹拌機上で、動きを維持するには十分な速度で１５分間維持した。１５．０００ｇで５分の遠心分離工程を行い、微粒子沈下の阻害を避けるために、マイクロピペットの助けにより、上清を除去し、捨てた。１ｍＬの滅菌蒸留水をこのチューブに添加し、混合物を撹拌機を用いて激しくホモジナイズし、もう一度１５．０００ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、洗浄工程を２回繰り返した。最終洗浄し、上清を捨てた後、微粒子を１ｍＬの５０％グリセロール（Ｖ／Ｖ）中に再懸濁した。
Sterilization and cleaning of tungsten microparticles In a centrifuge tube, 60 mg of M10 tungsten microparticles are weighed, which is enough material for about 100 firings. To this centrifuge tube was added 10 mL of 70% ethanol; the solution was homogenized vigorously and maintained on the agitator for 15 minutes at a rate sufficient to maintain motion. A centrifugation step was performed at 15.000 g for 5 minutes and the supernatant was removed and discarded with the aid of a micropipette to avoid inhibition of microparticle settlement. 1 mL of sterile distilled water was added to the tube and the mixture was vigorously homogenized using a stirrer and again centrifuged at 15.000 g for 5 minutes. The supernatant was discarded and the washing process was repeated twice. After a final wash and discarding the supernatant, the microparticles were resuspended in 1 mL of 50% glycerol (V / V).
タングステン微粒子のＤＮＡコーティング
１．５ｍＬの遠沈管に、５０μＬの微粒子懸濁液を分注し、ホモジナイゼーションのために１５分間ソニケーターに供し、このようにして、微粒子の凝集を避け、均一な沈殿を可能にした。最小６μｇに同等なＤＮＡを上清に添加し、マイクロピペットの助けにより、穏やかにホモジナイズした。５０μＬのＣａＣｌ2（２．５Ｍ）を溶液に添加し、穏やかにホモジナイズした後、２０μＬのスペルミジンを添加した。さらにホモジナイゼーション後、適合したチューブ撹拌機で、溶液を１０分間、室温にて、穏やかに回転させながらインキュベートした。チューブを１０秒間、最大速度で沈降させ、上清を注意深く除去し、捨て、微粒子の再懸濁液を避けた。１５０μＬの１００％エタノールを添加した；溶液を激しくホモジナイズし、１０秒間、最大速度（スピン）でもう一度遠心分離した。上清を除去し、洗浄工程をもう一度繰り返した。上清を捨てた後、最終洗浄で、２４μＬの１００％エタノールは、激しくホモジナイズされた試料に添加された。最後に、上清の３．２μＬのアリコートは、メンブレン支持体上に予め配置された各担体メンブレンの中心領域に適用された。各沈殿は、ＤＮＡで被覆された微粒子を含む６個の担体メンブレンを調製するには十分である。微粒子の適用後、シリカゲルを含むプレート上でメンブレンを即座に保存し、解剖チャンバーに維持した。それは、５０％を超える空気の相対湿度の状態へのＤＮＡ被覆された微粒子の曝露が凝集を可能するためであり、結果として、外来遺伝子発現の頻度を減少させる。
Tungsten microparticle DNA coating 50 μL microparticle suspension is dispensed into a 1.5 mL centrifuge tube and subjected to a sonicator for 15 min for homogenization, thus avoiding microparticle aggregation and uniform precipitation Made possible. DNA equivalent to a minimum of 6 μg was added to the supernatant and gently homogenized with the aid of a micropipette. 50 μL CaCl 2 (2.5 M) was added to the solution and homogenized gently, followed by 20 μL spermidine. After further homogenization, the solution was incubated with a suitable tube stirrer for 10 minutes at room temperature with gentle rotation. The tube was allowed to settle for 10 seconds at maximum speed and the supernatant was carefully removed and discarded to avoid resuspension of the microparticles. 150 μL of 100% ethanol was added; the solution was homogenized vigorously and centrifuged again at maximum speed (spin) for 10 seconds. The supernatant was removed and the washing process was repeated once more. After discarding the supernatant, 24 μL of 100% ethanol was added to the vigorously homogenized sample at the final wash. Finally, a 3.2 μL aliquot of the supernatant was applied to the central region of each carrier membrane previously placed on the membrane support. Each precipitate is sufficient to prepare six carrier membranes containing microparticles coated with DNA. After application of the microparticles, the membrane was immediately stored on a plate containing silica gel and maintained in the dissection chamber. That is because exposure of DNA-coated microparticles to conditions of relative humidity of air above 50% allows aggregation and consequently reduces the frequency of foreign gene expression.
遺伝子銃の使用及び衝突実験
いくつかの変更を加えたが、Ａｒａｇａｏら（Ｃｒｏｐ．Ｓｃｉ．４２：１２９８−１３０２（２００２））によって開発されたプロトコールに従って、根こぶ線虫に感受性である品種ＢＲＳ１３３及びＰｉｎｔａｄｏ由来の大豆種子胚の***組織部位を発射の標的とした。衝突前、層流フードを７０％エタノールで清潔にし、ＵＶ照射（１５分間）により滅菌した。保持スクリーン、胚を含むペトリディッシュ、４つセットであり、イソプロパノールに浸漬した破壊メンブレン、及び外来ＤＮＡを含む担体メンブレンをオペレーターの近くに維持した。ヘリウムガスシリンダーのバルブを開け、圧力を１．２００ｐｓｉに設定した。その後、破壊メンブレンセット（３００ｐｓｉ／メンブレン）は、高圧ヘリウムガスチャンバーの遠端に配置し、密封スクリューをきつく閉め、高圧チャンバーを反転させ、真空チャンバーにフィットさせた。衝突されるべき材料を含むプレートを配置し、支持体シリンダー上に、ＤＮＡ被覆された微粒子を含む、保持スクリーン及び担体メンブレン支持体も配置した。注意深く、支持体シリンダーを配置し、真空チャンバーを閉めた。圧力が２７ｐｏｌ／Ｈｇに到達するまで、チャンバー内で真空を可能にする値を緩やかに開け、このとき、このバルブを閉じた。高圧チャンバー内にヘリウムガスを押し込めるバルブを開き、破壊膜がヘリウムガスの存在により曲がりを示したとき、引き金を押すことによって発射した。発射後、バルブを閉じ、一方、高圧チャンバーからのヘリウムガスを放出するバルブを開いた。その後、真空を開放するバルブをゆっくり開け、衝突される胚を含むプレートを装置から取り出した。各衝突では、これらの工程を繰り返した。各衝突後、大部分の胚を異なるプレートに移し、非生物的及び生物的ストレスに供した。しかしながら、いくつかの胚は、ＢＡＰ ５ｍｇ／ｍＬ（ベンジルアミノプリン）３％スクロース、０．６％寒天（ｐＨ）を添加したＭＳ培地を含むプレートに移し、その中で、再生誘導のために、１８時間維持され、２８℃で光から保護された。
Gene gun use and collision experiments Variety BRS133 sensitive to root-knot nematodes according to the protocol developed by Aragao et al. (Crop. Sci. 42: 1298-1302 (2002)) with some changes. The meristem site of Pintado-derived soybean seed embryo was targeted for firing. Prior to impact, the laminar flow hood was cleaned with 70% ethanol and sterilized by UV irradiation (15 minutes). A retention screen, a Petri dish containing embryos, a set of four, a disrupted membrane immersed in isopropanol, and a carrier membrane containing foreign DNA were kept close to the operator. The helium gas cylinder valve was opened and the pressure was set to 1.200 psi. Thereafter, the disruption membrane set (300 psi / membrane) was placed at the far end of the high pressure helium gas chamber, the sealing screw was tightly closed, the high pressure chamber was inverted, and fitted into the vacuum chamber. A plate containing the material to be struck was placed, and a holding screen and carrier membrane support containing DNA coated microparticles were also placed on the support cylinder. Carefully place the support cylinder and close the vacuum chamber. The value allowing vacuum in the chamber was opened slowly until the pressure reached 27 pol / Hg, at which time the valve was closed. When a valve that pushed helium gas into the high-pressure chamber was opened and the fractured film showed bending due to the presence of helium gas, firing was performed by pushing the trigger. After firing, the valve was closed while the valve that released helium gas from the high pressure chamber was opened. Thereafter, the valve for releasing the vacuum was slowly opened, and the plate containing the embryo to be collided was removed from the apparatus. These steps were repeated for each collision. After each collision, most embryos were transferred to different plates and subjected to abiotic and biological stress. However, some embryos are transferred to plates containing MS medium supplemented with BAP 5 mg / mL (benzylaminopurine) 3% sucrose, 0.6% agar (pH), in which for regeneration induction, Maintained for 18 hours and protected from light at 28 ° C.
トランスジェニック胚の選択
トランスジェニック細胞と非トランスジェニック細胞との識別は、個別に又は同じ形質転換ベクター中の対象遺伝子に連結して、酵素活性を有するタンパク質を発現する選択遺伝子を植物ゲノムに導入することにより行うことができる。作用様式に従って、マーカー遺伝子は、抗生物質への耐性を付与する遺伝子、除草剤への耐性を付与する遺伝子、及びポジティブ選択を有するマーカー遺伝子として分類される（Ｂｒａｓｉｌｅｉｒｏ ａｎｄ Ｄｕｓｉ （１９９９），Ｉｎ：ＴＯＲＲＥＳ，Ａ．Ｃ；ＣＡＬＤＡＳ，Ｌ．Ｓ．；ＢＵＳＯ，Ｊ．Ａ．Ｅｄ．Ｃｕｌｔｕｒａ ｄｅ ｔｅｃｉｄｏｓ．ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｇａｏ ｇｅｎｅｔｉｃａ ｄｅ Ｐｌａｎｔａｓ．Ｂｒａｓｉｌｉａ：Ｅｍｂｒａｐａ−ＳＰＩ／Ｅｍｂｒａｐａ−ＣＮＰＨ，１９９９．ｐ．６７９−７３５．ｖ．２）。遺伝子ａｈａｓは、除草剤への耐性を付与する遺伝子に分類される。この遺伝子は、アセトヒドロキシル酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）酵素の改変形態をコードし、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）としても知られている。この配列の６５３位への変異により、アスパラギンによるセリンの置換をもたらし、改変酵素を生じさせ、除草剤クラスのイミダゾリノンによって認識されない。この遺伝子で形質転換された***組織細胞は、選択分子の***組織部位への全体の転移及び内因性ＡＨＡＳ酵素の不活性化の基づくプロセスにおいて、除草剤Ｉｍａｚａｐｙｒの存在下で選択される。選択剤は頂端***組織に局在するため、非トランスジェニック細胞は死滅し、植物に生育するトランスジェニック細胞の生存が支持される（Ａｒａｇａｏ ａｎｄ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒｏ（２００２），Ｊ．Ｐ．Ｐｈｙｓｉｏ，１４（Ｉ））。このようにして、再生後、いくつかの胚は、選択培地ＭＳ、３＆スクロース、０．１５μＭのＩｍａｚａｐｙｒ除草剤、０．８％寒天及びＢ５ビタミン（ｐＨ５．７）を含むプラスチックカップに移され、約４５日間、成長チャンバーで、２８℃にて、１６時間の光周期で生育された。光強度は５０μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１であり、相対湿度は８０％を超えた。次に、再生された植物は、オートクレーブされた砂：バーミキュライト（１：１）を含むプラスチックカップに移され、栄養溶液（ｐＨ６．６）で加筆された。後に、順化のために、カップをプラスチックバックで覆い、必要に応じて栄養溶液で散水し、さらに２８〜３０日間、成長チャンバーで生育した。順化のこの器官の経過後、プラスチックバッグを取り除き、特異的プライマーを用いたＰＣＲ技術を介して、分子分析及び陽性植物の特定のために試料回収が可能な限り、通常に発育させることができた。
Selection of transgenic embryos Discrimination between transgenic cells and non-transgenic cells can be performed individually or linked to the gene of interest in the same transformation vector to introduce a selection gene that expresses a protein with enzymatic activity into the plant genome. Can be done. According to the mode of action, marker genes are classified as genes that confer resistance to antibiotics, genes that confer resistance to herbicides, and marker genes with positive selection (Brasileiro and Dusi (1999), In: TORRES). CALAS, LS; BUSO, JA Ed. Culture de tecidos. And transformagao genetica de Plantas. Brasilia: Embrapa-SPI / Embrapa-NPH, 79-35. 2). Gene ahas is classified as a gene that confers resistance to herbicides. This gene encodes a modified form of the acetohydroxylate synthase (AHAS) enzyme, also known as acetolactate synthase (ALS). A mutation to position 653 of this sequence results in a substitution of serine by asparagine, resulting in a modified enzyme that is not recognized by the herbicide class imidazolinones. Mesenchymal cells transformed with this gene are selected in the presence of the herbicide Imazapyr in a process based on the overall transfer of the select molecule to the meristem site and inactivation of the endogenous AHAS enzyme. Since the selective agent is localized in the apical meristem, non-transgenic cells die and support the survival of transgenic cells growing in plants (Aragao and Brasiliro (2002), JP Physio, 14 (I )). Thus, after regeneration, some embryos are transferred to plastic cups containing selective medium MS, 3 & sucrose, 0.15 μM Imazapyr herbicide, 0.8% agar and B5 vitamin (pH 5.7), Grown for about 45 days in a growth chamber at 28 ° C. with a 16 hour photoperiod. The light intensity was 50 μmol m-2s-1 and the relative humidity exceeded 80%. The regenerated plants were then transferred to plastic cups containing autoclaved sand: vermiculite (1: 1) and retouched with nutrient solution (pH 6.6). Later, for acclimatization, the cups were covered with plastic bags, sprinkled with nutrient solution as needed, and grown in a growth chamber for an additional 28-30 days. After the course of this organ of acclimatization, the plastic bag can be removed and allowed to grow normally as long as sample recovery is possible for molecular analysis and positive plant identification via PCR techniques using specific primers. It was.
種々のストレスに供されたトランスジェニック胚を用いた実験
根こぶ線虫に感受性であり、種々の発現カセット（親感受性株ＢＲＳ１３３（Ｓ−ｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨＳＰ ＢＲＳ１３３）及び耐性集団ＪＦ７０２７由来の個体（Ｒ−ｐＡＧ１／プロモーターＧｍＨＳＰ ＪＦ７０２７）から増幅されたＧｍｈｓｐ１７．６−Ｌ遺伝子のプロモーター領域を含む）で形質転換された大豆品種ＢＲＳ１３３及びＰｉｎｔａｄｏ由来の胚は、生物的ストレス、この場合は、Ｍ．ジャワニカのジャワニカＪ２による接種、及び非生物的ストレス、例えば、熱、冷却、塩分及び脱水（干ばつ）に供された。非トランスジェニック胚（ＣＮ−負の対象）及びｐＡＧ１プラスミドのみで形質転換した胚（ＣＰ−正の対象）を同じ処置に供した。熱ストレスを適用し、胚を２５℃（室温）、３５℃及び４５℃（温室中）にて維持した。４℃（冷蔵庫）及び１５℃（温室）の処理は冷却ストレスに用いた。これらのストレスは、２時間、４時間、及び２４時間の時点で溶液中で胚に適用された。脱水（干ばつ）は、温室にて３７℃にて行い、フィルターペーパー上で２時間、４時間、及び６時間の時点で維持した。塩分ストレスについては、胚は、２００ｍＭ及び４００ｍＭのＮａＣｌ濃度で２４時間維持された。生物的ストレスは、２４時間、４８時間、及び７２時間、Ｊ２発生段階（２．０００〜３．０００のＪ２／ｍＬ）で線虫を含む溶液で胚を維持することによって行われた。図１７は、ストレスをどのように適用したかを示す。
Experiments using transgenic embryos subjected to various stresses Sensitive to root-knot nematodes and various expression cassettes (parent sensitive strain BRS133 (S-pAG1 / promoter GmHSP) BRS133) and embryos derived from soybean varieties BRS133 and Pintado transformed with individuals from resistant population JF7027 (including the promoter region of Gmhsp17.6-L gene amplified from R-pAG1 / promoter GmHSP JF7027) Stress, in this case M.P. Javanica was inoculated with Javanica J2 and subjected to abiotic stress such as heat, cooling, salinity and dehydration (drought). Non-transgenic embryos (CN-negative subjects) and embryos transformed only with the pAG1 plasmid (CP-positive subjects) were subjected to the same treatment. Thermal stress was applied and the embryos were maintained at 25 ° C. (room temperature), 35 ° C. and 45 ° C. (in the greenhouse). Treatments at 4 ° C. (refrigerator) and 15 ° C. (greenhouse) were used for cooling stress. These stresses were applied to the embryos in solution at 2 hours, 4 hours, and 24 hours. Dehydration (drought) was performed at 37 ° C. in a greenhouse and maintained on filter paper at 2, 4, and 6 hours. For salinity stress, embryos were maintained at 200 mM and 400 mM NaCl concentrations for 24 hours. Biological stress was performed by maintaining embryos in a solution containing nematodes at the J2 developmental stage (2.000-3.000 J2 / mL) for 24, 48, and 72 hours. FIG. 17 shows how the stress was applied.
種々の発現カセットを用いて形質転換され、種々のストレスに供された胚における組織化学的アッセイ
Ｇｕｓ遺伝子の発現産物は、組織化学的アッセイを通じて、植物組織におけるその酵素的活性を検出することによって、選択のマーカーレポーターとして使用され得る。この定量的方法は、ｂ−グルクロニダーゼ酵素によって、酸素の存在下で不溶性の青色沈澱物をもたらす二量体を生じさせる、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−ｇｌｕｃ）基質の開裂に基づいている。この方法論は、組織特異性、プロモーターの単離、トランスジェニック植物の同定、及び移動条件に関する遺伝子発現制御研究を補助する（Ｂｒａｓｉｌｅｉｒｏ（１９９８），Ｉｎ：Ｂｒａｓｉｌｅｉｒｏ，Ａ．Ｃ．Ｍ．；Ｃａｒｎｅｉｒｏ，Ｖ．Ｔ．Ｃ．（ｅｄ．）．Ｍａｎｕａｌ ｄｅ ｔｒａｎｓ ｆｏｒｍａｃａｏ ｇｅｎｅｔｉｃａ ｄｅ ｐｌａｎｔａｓ．Ｂｒａｓｉｌｉａ：Ｅｍｂｒａｐａ − ＳＰＩ／Ｅｍｂｒａｐａ−Ｃｅｎａｒｇｅｎ，１９９８，ｐ．１４３−１５４；Ａｒａｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ，１０１：１−６））。このようにして、種々のカセットで形質転換され、その後に種々のストレスに供された、２つの遺伝子型であるＢＲＳ１３３とＰｉｎｔａｄｏの胚をプレートに移し、試料を覆うには十分な体積でＸ−Ｇｌｕｃ反応緩衝液を添加した。この緩衝液は、８５ｍＬのジメチルホルムアミド中に８．５ｍｇのＸ−Ｇｌｕｃを希釈することによって調製された。リン酸緩衝液（ＮａＨ２ＰＯ４−５０ｍＭ ｐＨ７．０）は、１７ｍＬ、最後は１７ｍＬのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の体積に添加された。この溶液を調製後、冷蔵庫で保存した。胚及び緩衝液を含むプレートを密封し、暗所中、温室にて３７℃で約１６時間インキュベートした。その後、緩衝液を取り除き、１ｍＬの７０％エタノールを添加して、反応を停止させた。試料を実体顕微鏡（ＳＱＺ−ＤＳ４−ＢＩ（Ｔｅｃｎｉｖａｌ））下で分析し、画像を獲得して結果を書面にした。組織化学的アッセイは、ストレスに供した後、試薬Ｘ−Ｇｌｕｃが実施さえると、品種ＢＲＳ１３３はより強い応答を示すことが示され、これは、青色スポットが明確であり、形質転換された細胞を示す制限された領域において視認されるためである。この不溶性の青色沈澱物は、β−グルクロニダーゼをコードする構築カセットに存在するＧｕｓ遺伝子反応産物であり、この酵素は、Ｏ２の存在下で沈殿する二量体を形成するＸ−Ｇｌｕｃ基質と反応する。品種Ｐｉｎｔａｄｏからの胚アッセイ結果を分析する場合、ストレスの大部分において、正の青色スポットは検出されなかった。この品種では、内因性ＧＵＳ発現がより高く、完全な青色胚をもたらし、その結果が分析と干渉する。大豆胚のバックグランド内因性ＧＵＳ活性は以前の研究において報告されていた。Ｈｕ及び共同研究者（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，９：１−５，１９９０）は、５３の種々の植物種を分析し、葉、果実部分、種子及び胚における固有のＧＵＳ活性を試験した。この研究では、大豆は、新鮮な果実由来の成熟胚と脱水された種子の成熟胚において、強力な正の染色を示し、内因性ＧＵＳ活性の結果を示した。このようにして、熱ストレスは、温室中で２時間、４時間、及び２４時間、２５℃、３５℃、及び４５℃の温度にトランスジェニック胚を供することによって適用された。図１８、１９及び２０は、それぞれ、試験された両品種に対するこれらの処置を示す。冷却ストレスは、冷蔵庫及び温室中で、２時間、４時間、及び２４時間、４℃及び１５℃の温度にトランスジェニック胚を供することによって適用された（図２１及び２２）。このストレスについて、組織化学的反応の陽性青色スポットに関する、品種間の相違は、Ｐｉｎｔａｄｏ胚においてより非常に顕著であり、それらは構造的に青色であり、内因性ＧＵＳ活性に起因している。従前の文献（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，９：１−５）に記載されている。もう一度、品種ＢＲＳ１３３由来の胚は、組織化学的アッセイに対してより良好な応答を示し、それは、この品種が選択されるものであり、この研究の次の工程で使用されなければならないことを示す。塩分ストレス実験は、対照としての水、２００ｍＭ、４００ｍＭの濃度のＮａＣｌ濃度に２４時間、トランスジェニック胚を維持することによって行われた。品種ＢＲＳ１３３由来の胚は、このアッセイに正に応答し続け、制限された領域で青色スポットを示し、以前のストレスとは相違し、品種Ｐｉｎｔａｄｏは明らかでありかつ検出可能な応答を示さなかった。図２３はそれらの結果を示す。干ばつストレスは、フィルターペーパー上に３７℃で胚を配置し、温室中で２時間、４時間、及び６時間維持することによって適用された。もう一度、品種ＢＲＳ１３３は、組織化学的アッセイに陽性応答を示し、一方、品種Ｐｉｎｔａｄｏは、再度、陰性応答を示した。後者は、図２４に示される通り、内因性ＧＵＳ発現の結果として、胚の非特異的な青色染色を示した。根こぶ線虫Ｍ．ジャワニカの感染段階であるジャワニカＪ２を用いて、品種ＢＲＳ１３３及びＰｉｎｔａｄｏ由来の胚への感染は生物的ストレスを構築した。約２０００〜３０００のＪ２／ ｍＬをトランスジェニック試料とともにインキュベートし、２４時間、４８時間及び７２時間維持した。結果は、品種ＢＲＳ１３３（図２５）は、組織化学的アッセイの陽性の青色スポットを示したことを表し、これは、カセット発現が満足いくように起きたことを示す。この時間を経過したとき、胚は、それらの局面が改変され、赤茶色を示し、対照試料を含むことを示している。この変化は、７２時間後により視認され、感染時に、ホルモン及び物質を注射する染色の感染形態によって胚を攻撃することによって引き起こすことができ、それは、宿主植物の根において起こるのと同じように、細胞改変を可能にする。しかしながら、Ｒと命名された胚は、耐性カセットｐＡＧ１／プロモーターＧｍｈｓｐ ＪＦ７０２７で形質転換されたものであり、影響が少ないという局面を有し、７２時間で接種された試料は、元の局面を維持し、白色であり、これは、どうも、より高い数のＡＴ（ｎ）繰り返しで、耐性集団ＪＦ７０２７からの個体由来のＧｍｈｓｐ１７．β−Ｌ遺伝子のプロモーター領域を含むカセットが、おそらく、より高い発現レベルのシャペロンにより、病原体攻撃に対するより良好な応答を示すことを示唆している。Ｐｉｎｔａｄｏ由来の胚はまた、Ｊ２線虫の接種により生物的ストレスに供された場合、構成的に青色に染色される組織化学的アッセイに対して負の応答に加えて、色の変化の応答を示し、４８時間から、特に７２時間からより顕著であった。図２６は結果を示す。
Histochemical assay in embryos transformed with various expression cassettes and subjected to various stresses The expression product of the Gus gene can be detected through histochemical assay by detecting its enzymatic activity in plant tissues. Can be used as a marker reporter for selection. This quantitative method uses 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-bD-glucuronide (X), which produces a dimer with the b-glucuronidase enzyme that results in an insoluble blue precipitate in the presence of oxygen. -Gluc) based on cleavage of the substrate. This methodology aids gene expression control studies on tissue specificity, promoter isolation, transgenic plant identification, and migration conditions (Brasileiro (1998), In: Brasiliro, ACM; Carneiro, V TC (ed.) Manual de transforma genetica de plantas.Brasilia: Embrapa-SPI / Embrapa-Cenargen, 1998, p.143-154; Aragao et al. (G) et al. 101: 1-6)). Thus, embryos of two genotypes, BRS133 and Pintado, transformed with various cassettes and subsequently subjected to various stresses were transferred to a plate and X-volume in sufficient volume to cover the sample. Gluc reaction buffer was added. This buffer was prepared by diluting 8.5 mg X-Gluc in 85 mL dimethylformamide. Phosphate buffer (NaH2PO4-50 mM pH 7.0) was added to a volume of 17 mL and finally 17 mL of Triton X-100. This solution was prepared and stored in a refrigerator. Plates containing embryos and buffer were sealed and incubated for about 16 hours at 37 ° C. in a greenhouse in the dark. Thereafter, the buffer was removed and 1 mL of 70% ethanol was added to stop the reaction. Samples were analyzed under a stereomicroscope (SQZ-DS4-BI (Tecnival)), images were acquired and results were written. Histochemical assays showed that after reagent X-Gluc, when subjected to stress, cultivar BRS133 showed a stronger response, indicating that the blue spots were clear and transformed cells were This is because it is visually recognized in the limited area shown. This insoluble blue precipitate is the Gus gene reaction product present in the building cassette encoding β-glucuronidase, which reacts with the X-Gluc substrate forming a dimer that precipitates in the presence of O 2. . When analyzing embryo assay results from cultivar Pintado, no positive blue spots were detected in most of the stress. In this breed, endogenous GUS expression is higher, resulting in a complete blue embryo, the result of which interferes with the analysis. Background endogenous GUS activity of soybean embryos has been reported in previous studies. Hu and co-workers (Plant Cell Reports, 9: 1-5, 1990) analyzed 53 different plant species and tested intrinsic GUS activity in leaves, fruit parts, seeds and embryos. In this study, soybeans showed strong positive staining in mature embryos from fresh fruit and dehydrated seeds, indicating endogenous GUS activity results. Thus, heat stress was applied by subjecting the transgenic embryos to temperatures of 25 ° C., 35 ° C., and 45 ° C. in a greenhouse for 2, 4, and 24 hours. Figures 18, 19 and 20 show these treatments for both varieties tested, respectively. Cooling stress was applied by subjecting the transgenic embryos to temperatures of 4 ° C. and 15 ° C. in refrigerators and greenhouses for 2, 4, and 24 hours (FIGS. 21 and 22). For this stress, the differences between varieties regarding positive blue spots of histochemical response are much more pronounced in the Pintado embryo, they are structurally blue and are attributed to endogenous GUS activity. It is described in a previous document (Hu et al. (1990), Plant Cell Reports, 9: 1-5). Once again, embryos from breed BRS133 show a better response to histochemical assays, indicating that this breed is selected and must be used in the next step of this study. . Salinity stress experiments were performed by maintaining transgenic embryos in water as a control, NaCl concentrations of 200 mM, 400 mM for 24 hours. Embryos from cultivar BRS133 continued to respond positively to this assay, showing a blue spot in a restricted area, and unlike previous stress, cultivar Pintado was clear and showed no detectable response. FIG. 23 shows the results. Drought stress was applied by placing embryos on filter paper at 37 ° C. and maintaining in the greenhouse for 2, 4, and 6 hours. Once again, cultivar BRS133 showed a positive response to the histochemical assay, while cultivar Pintado again showed a negative response. The latter showed non-specific blue staining of the embryo as a result of endogenous GUS expression, as shown in FIG. Root-knot nematode M. Infection of embryos from cultivars BRS133 and Pintado constructed biological stress using Javanica J2, the infection stage of Javanica. Approximately 2000-3000 J2 / mL was incubated with the transgenic samples and maintained for 24, 48 and 72 hours. The results indicated that breed BRS133 (FIG. 25) showed a positive blue spot in the histochemical assay, indicating that cassette expression occurred satisfactorily. When this time has elapsed, the embryos have been modified in their aspects, showing a reddish brown color, indicating that they contain a control sample. This change is more visible after 72 hours and can be triggered by attacking the embryo with an infectious form of staining that injects hormones and substances upon infection, as occurs in the roots of the host plant, Allows cell modification. However, the embryo designated R is resistant cassette pAG1 / promoter Gmhsp. Samples that were transformed with JF7027 and had a low impact aspect, and the sample that was inoculated at 72 hours maintained the original aspect and were white, which apparently has a higher number of AT ( n) Repeat, Gmhsp17. from individuals from resistant population JF7027. It suggests that the cassette containing the promoter region of the β-L gene shows a better response to pathogen attack, presumably due to higher expression levels of chaperones. Pintado-derived embryos also exhibited a color change response in addition to a negative response to histochemical assays that constitutively stain blue when subjected to biological stress by inoculation with J2 nematodes. It was more pronounced from 48 hours, especially from 72 hours. FIG. 26 shows the results.
生物的ストレス及び非生物的ストレスに供された後、組織化学的アッセイはマーカー遺伝子Ｇｕｓの存在を検出した、品種ＢＲＳ１３３及びＰｉｎｔａｄｏに対する示された結果から結論付けることがえきるが、しかし、高い内因性活性も、特に品種Ｐｉｎｔａｄｏにおいて観察され、異なる材料が形質転換プロセスへの明確な応答を示したことを示唆している。 After being subjected to biological and abiotic stress, histochemical assays can be concluded from the results shown for cultivars BRS133 and Pintado, which detected the presence of the marker gene Gus, but with high intrinsic Sexual activity was also observed, especially in the cultivar Pintado, suggesting that the different materials showed a distinct response to the transformation process.
Ｇｕｓ発現はまさに形質転換の証拠として考えられると言及するには価値があるが、植物ゲノムへのＧｕｓ遺伝子の組込みの決定的証拠としては不十分である（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（１９９０），Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ ７９：１２９−１３４）。内因性ＤＮＡ配列の組込みの決定的証拠は、分子生物学的技術を介して、特異的プローブを用いてゲノムＤＮＡハイブリダイゼーションによって与えられる。 Although it is worth mentioning that Gus expression is considered just as evidence of transformation, it is insufficient as definitive evidence of the integration of the Gus gene into the plant genome (Potrykus (1990), Physiologia Plantarum 79: 129 -134). Definitive evidence of integration of endogenous DNA sequences is provided by genomic DNA hybridization using specific probes via molecular biological techniques.
Claims (18)
（ｉ）対象遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターエレメント内のＡＴ(n)挿入物を担持する発現カセットを用いて植物細胞を安定に形質転換し；
（ｉｉ）植物細胞の増殖条件下で安定に形質転換された植物細胞を培養し；
（ｉｉｉ）（ｉ）のカセットがそのゲノムに安定に組み込まれたトランスジェニック植物を再生する
ことを含み、ここで、前記トランスジェニック植物は、対照植物と比較した場合に、異なるレベルの遺伝子発現を示す前記方法。 A method for controlling the expression level of a coding sequence in a plant, comprising:
(I) stably transforming plant cells with an expression cassette carrying an AT (n) insert in a promoter element operably linked to the gene of interest;
(Ii) culturing plant cells stably transformed under the growth conditions of the plant cells;
(Iii) regenerating a transgenic plant in which the cassette of (i) is stably integrated into its genome, wherein said transgenic plant exhibits a different level of gene expression when compared to a control plant. Said method to show.
（ｉ）対象遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターエレメント内にＡＴ(n)挿入物を担持する発現カセットを用いて植物細胞を安定に形質転換し；
（ｉｉ）植物細胞の増殖条件下で安定に形質転換された植物細胞を培養し；
（ｉｉｉ）安定に遺伝子的に改変された植物を再生する
ことを含む前記方法。 A method for obtaining a genetically modified plant comprising an AT (n) -insert comprising:
(I) stably transforming plant cells using an expression cassette carrying an AT (n) insert in a promoter element operably linked to the gene of interest;
(Ii) culturing plant cells stably transformed under the growth conditions of the plant cells;
(Iii) The method comprising regenerating a stably genetically modified plant.
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