JP2017112858A - Novel glucose dehydrogenase - Google Patents

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Kyoichi Nishio
享一 西尾
裕三 小嶋
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裕三 小嶋
庄太郎 山口
Shotaro Yamaguchi
庄太郎 山口
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a flavine adenine dinucleotide (FAD) dependent glucose dehydrogenase (E. C.1.1.99.10) (FAD-GDH) useful for glucose measurement, and to provide applications thereof.SOLUTION: The present invention relates to an enzyme agent for glucose measurement containing FAD-GDH as an active ingredient having (1) an action: catalyzing a reaction to oxidize a hydroxyl group of glucose in the presence of electron acceptors and produce glucono-δ-lactone; (2) substrate specificity: having the reactivity to D-xylose of 15% or less when the reactivity to D-glucose is 100%; (3) pH stability: being stable at pH 4 to 6; and (4) amino acid sequences : including a particular amino acid sequence or an amino acid sequence 80% or more identical to the amino acid sequence, to a reagent for glucose measurement containing the FAD-GDH as an active ingredient, to a kit for glucose measurement comprising the reagent for glucose measurement, and to a glucose sensor containing FAD-GDH.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は新規グルコースデヒドロゲナーゼ(グルコース脱水素酵素)に関する。詳しくは、アスペルギルス属由来のフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.99.10)及びその用途に関する。   The present invention relates to a novel glucose dehydrogenase (glucose dehydrogenase). Specifically, the present invention relates to a flavin adenine dinucleotide (FAD) -dependent glucose dehydrogenase (E.C.1.1.99.10) derived from the genus Aspergillus and its use.

糖尿病患者は年々増加しており、糖尿病患者、特にインスリン依存性の患者は血糖値を日常的に監視し血糖をコントロールする必要がある。近年、酵素を用いてリアルタイムで簡便にかつ正確に測定できる自己血糖測定器で糖尿病患者の血糖値をチェック出来るようになった。グルコースセンサ(例えば、自己血糖測定器に使用されるセンサ)用として、グルコースオキシダーゼ(E.C.1.1.3.4)、PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.5.2)(例えば特許文献1〜3を参照)が開発されたが、酸素反応性、マルトース、ガラクトースへの反応性が問題となった。この問題を解決すべく、FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(以下、「FAD-GDH」と略称する)が開発された(例えば特許文献4、5、非特許文献1〜4を参照)。   The number of diabetic patients is increasing year by year, and diabetic patients, particularly those who are dependent on insulin, need to monitor blood glucose levels on a daily basis and control blood sugar levels. In recent years, it has become possible to check the blood glucose level of diabetic patients with an auto-blood glucose meter that can easily and accurately measure in real time using an enzyme. Glucose oxidase (EC1.1.3.4) and PQQ-dependent glucose dehydrogenase (EC1.1.5.2) (see, for example, Patent Documents 1 to 3) have been developed for glucose sensors (for example, sensors used in self blood glucose meters). However, oxygen reactivity, reactivity to maltose and galactose became problems. In order to solve this problem, FAD-dependent glucose dehydrogenase (hereinafter abbreviated as “FAD-GDH”) has been developed (see, for example, Patent Documents 4 and 5 and Non-Patent Documents 1 to 4).

一般に、糖尿病判定検査時には、経口グルコース負荷試験だけでなく、経口キシロース負荷試験、経静脈キシロース負荷試験が実施される。FAD-GDHは概してキシロースへ反応することが知られており、FAD-GDHを用いた場合、上記負荷試験時に血糖値へ影響することが問題となる。   Generally, at the time of a diabetes determination test, not only an oral glucose tolerance test but also an oral xylose tolerance test and a transvenous xylose tolerance test are performed. FAD-GDH is generally known to react with xylose, and when FAD-GDH is used, there is a problem in that it affects blood glucose levels during the above-mentioned load test.

特開2000−350588号公報JP 2000-350588 A 特開2001−197888号公報JP 2001-197888 A 特開2001−346587号公報JP 2001-346687 A 国際公開第2004/058958号パンフレットInternational Publication No. 2004/058958 Pamphlet 国際公開第2007/139013号パンフレットInternational Publication No. 2007/139013 Pamphlet 国際公開第2015/060150号パンフレットInternational Publication No. 2015/060150 Pamphlet

Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. I. Induction of its synthesis by p-benzoquinone and hydroquinone, T.C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 139, 265-276 (1967).Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. I. Induction of its synthesis by p-benzoquinone and hydroquinone, T.C.Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 139, 265-276 (1967). Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. II. Purification and physical and chemical properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 139, 277-293 (1967).Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae.II.Purification and physical and chemical properties, T.C.Bak, Biochim.Biophys. Acta, 139, 277-293 (1967). Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. III. General enzymatic properties, T.C. Bak, Biochim. Biophys. Acta, 146, 317-327 (1967).Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. III. General structural properties, T.C.Bak, Biochim. Biophys. Acta, 146, 317-327 (1967). Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. IV. Histidyl residue as an active site, T.C. Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 146, 328-335 (1967).Studies on the glucose dehydrogenase of Aspergillus oryzae. IV. Histidyl residue as an active site, T.C.Bak, and R. Sato, Biochim. Biophys. Acta, 146, 328-335 (1967).

FAD-GDHはキシロースに対する反応性の問題はあるものの、基質特異性に優れ、また、グルコースオキシダーゼのように測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けることがないため、グルコースセンサ用の酵素として有望視されている。FAD-GDHを実用化するにあたっては、上記の通り、キシロースに対する反応性が問題となる。本発明は、このような状況に鑑み、特にグルコースセンサ用として実用性の高い新規FAD-GDH及びその用途等を提供することを課題とする。尚、キシロースに対する反応性が低いFAD-GDHも報告されているが(特許文献6)、グルコースセンサに応用した場合に特に重要となるpH安定性等の特性は明らかにされておらず、その実用的価値は不明である。   Although FAD-GDH has a problem of reactivity to xylose, it has excellent substrate specificity and is unlikely to be affected by dissolved oxygen in the measurement sample like glucose oxidase. Has been. In putting FAD-GDH into practical use, the reactivity with xylose becomes a problem as described above. In view of such circumstances, it is an object of the present invention to provide a novel FAD-GDH that is highly practical, particularly for glucose sensors, and uses thereof. In addition, although FAD-GDH having low reactivity to xylose has been reported (Patent Document 6), characteristics such as pH stability which are particularly important when applied to a glucose sensor have not been clarified, and its practical use. Target value is unknown.

上記課題を解決すべく本発明者は、広範な微生物を対象として大規模なスクリーニングを実施した。その結果、キシロースに対する反応性が低い新規FAD-GDHを取得することに成功した。当該FAD-GDHの特性を調べたところ、pH安定性に優れ、グルコースセンサ用途に適し且つ実用性が高いことが判明した。   In order to solve the above problems, the present inventor conducted large-scale screening for a wide range of microorganisms. As a result, a novel FAD-GDH having low reactivity to xylose was successfully obtained. When the characteristics of the FAD-GDH were examined, it was found that the FAD-GDH was excellent in pH stability, suitable for glucose sensor applications, and highly practical.

更なる検討の結果、取得に成功した新規FAD-GDHのアミノ酸配列及び遺伝子配列を同定することに成功した。同定したアミノ酸配列を問い合わせ配列として公共のデータベースで検索したところ、グルコースオキシダーゼとして登録されている配列と同一であった。FAD-GDHではなくグルコースオキシダーゼとして登録されていた事実は、当該タンパク質が物質としては既知であることを示す一方で、当該タンパク質の予想できない新規用途が見出されたことを意味する。   As a result of further studies, the inventors succeeded in identifying the amino acid sequence and gene sequence of a novel FAD-GDH that was successfully obtained. When the identified amino acid sequence was searched as a query sequence in a public database, it was identical to the sequence registered as glucose oxidase. The fact that it was registered as glucose oxidase rather than FAD-GDH indicates that the protein is known as a substance, while an unexpected new use of the protein has been found.

以上の通り、本発明者らの検討によって、グルコースオキシダーゼとして既知のタンパク質が、実際にはFAD-GDHとして機能し、且つグルコースセンサ用途に適したものであることが明らかとなった。   As described above, the inventors' studies have revealed that a protein known as glucose oxidase actually functions as FAD-GDH and is suitable for glucose sensor applications.

以下の発明は、以上の成果及び考察に基づく。
[1]以下の特徴、即ち、
(1)作用: 電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する;
(2)基質特異性: D-グルコースに対する反応性を100%としたときのD-キシロースに対する反応性が15%以下である;
(3)pH安定性: pH4〜6で安定である;
(4)アミノ酸配列: 配列番号1に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と80%以上同一のアミノ酸配列を含む;
を備えるグルコースデヒドロゲナーゼを有効成分とした、グルコース測定用酵素剤。
[2]前記グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列と85%以上同一のアミノ酸配列である、[1]に記載のグルコース測定用酵素剤。
[3]前記グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列である、[1]に記載のグルコース測定用酵素剤。
[4]アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フォエチダス又はアスペルギルス・アウレウスに由来する酵素である、[1]〜[3]のいずれか一項に記載のグルコース測定用酵素剤。
[5]アスペルギルス・ニガーがCBS 513.88株であり、アスペルギルス・フォエチダスがNBRC4312株である、[4]に記載のグルコース測定用酵素剤。
[6][1]〜[5]のいずれか一項に定義したグルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
[7][1]〜[5]のいずれか一項に定義したグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用試薬。
[8][7]に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
[9][1]〜[5]のいずれか一項に定義したグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
The following invention is based on the above results and considerations.
[1] The following features:
(1) Action: catalyzes a reaction in which glucose hydroxyl group is oxidized to produce glucono-δ-lactone in the presence of an electron acceptor;
(2) Substrate specificity: The reactivity to D-xylose is 15% or less when the reactivity to D-glucose is 100%;
(3) pH stability: stable at pH 4-6;
(4) Amino acid sequence: The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence that is 80% or more identical to the amino acid sequence;
An enzyme agent for measuring glucose, comprising as an active ingredient glucose dehydrogenase comprising
[2] The enzyme agent for glucose measurement according to [1], wherein the amino acid sequence of the glucose dehydrogenase is 85% or more identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[3] The enzyme agent for glucose measurement according to [1], wherein the amino acid sequence of the glucose dehydrogenase is an amino acid sequence 90% or more identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[4] The enzyme agent for glucose measurement according to any one of [1] to [3], which is an enzyme derived from Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus foreidas, or Aspergillus aureus.
[5] The enzyme agent for glucose measurement according to [4], wherein Aspergillus niger is CBS 513.88 strain and Aspergillus foretida is NBRC4312 strain.
[6] A glucose measurement method comprising measuring glucose in a sample using the glucose dehydrogenase defined in any one of [1] to [5].
[7] A reagent for measuring glucose, comprising the glucose dehydrogenase defined in any one of [1] to [5].
[8] A glucose measurement kit comprising the glucose measurement reagent according to [7].
[9] A glucose sensor comprising a glucose dehydrogenase defined in any one of [1] to [5].

Aspergillus awamori No.1751株の培養液から精製した酵素(精製酵素)のSDS-PAGEによる分析の結果。Mは分子量マーカー(上から200、116、97.2、66.4、44.3KDa)を表し、レーン番号はSuperdex 200で分離した際のフラクション番号である。The result of the analysis by SDS-PAGE of the enzyme (purified enzyme) refine | purified from the culture solution of Aspergillus awamori No.1751 strain. M represents a molecular weight marker (200, 116, 97.2, 66.4, 44.3 KDa from the top), and the lane number is a fraction number when separated with Superdex 200. Aspergillus aureus No.2062株の培養液から精製した酵素(精製酵素)のSDS-PAGEによる分析の結果。Mは分子量マーカー(上から200、116、97.2、66.4、44.3KDa)を表し、レーン番号はSuperdex 200で分離した際のフラクション番号である。The result of the analysis by SDS-PAGE of the enzyme (purified enzyme) refine | purified from the culture solution of Aspergillus aureus No.2062 strain. M represents a molecular weight marker (200, 116, 97.2, 66.4, 44.3 KDa from the top), and the lane number is a fraction number when separated with Superdex 200. Aspergillus awamori No.1751株の精製酵素のpH安定性。所定の処理(37℃、1時間)の後、残存活性を測定した。PH stability of purified enzyme of Aspergillus awamori No.1751 strain. After predetermined treatment (37 ° C., 1 hour), the residual activity was measured. Aspergillus aureus No.2062株の精製酵素のpH安定性。所定の処理(37℃、1時間)の後、残存活性を測定した。PH stability of purified enzyme of Aspergillus aureus No.2062 strain. After predetermined treatment (37 ° C., 1 hour), the residual activity was measured. N末端アミノ酸配列を問い合わせ配列としたBLAST解析の結果。Results of BLAST analysis using the N-terminal amino acid sequence as a query sequence.

1.用語
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。用語「単離された」は、天然の状態、即ち、自然界において存在している状態のものと区別するために使用される。単離するという人為的操作によって、天然の状態とは異なる状態である、「単離された状態」となる。単離されたものは、天然物自体と明確且つ決定的に相違する。
1. Terminology The term “isolated” is used herein interchangeably with “purified”. The term “isolated” is used to distinguish it from its natural state, ie, one that exists in nature. An artificial operation of isolation results in an “isolated state” that is different from the natural state. What has been isolated is clearly and critically different from the natural product itself.

単離された酵素の純度は特に限定されない。但し、純度の高いことが要求される用途への適用が予定されるのであれば、単離された酵素の純度は高いことが好ましい。   The purity of the isolated enzyme is not particularly limited. However, if application to a use requiring high purity is planned, it is preferable that the purity of the isolated enzyme is high.

2.グルコース測定用酵素剤
本発明の第1の局面はグルコース測定用酵素剤を提供する。本発明の酵素剤の有効成分は、以下の特性を備えるグルコースデヒドロゲナーゼ(以下、「本酵素」ともいう)である。まず、本酵素は次の反応、即ち、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。一方、本酵素は基質特異性に優れ、D-グルコースに対して選択的に作用する。詳しくは、本酵素はD-キシロースに対する反応性が低い。具体的にはD-グルコースに対する反応性を100%としたときのD-キシロースに対する反応性が15%以下である。
2. Glucose-measuring enzyme agent The first aspect of the present invention provides an enzyme agent for glucose measurement. The active ingredient of the enzyme agent of the present invention is glucose dehydrogenase (hereinafter also referred to as “the present enzyme”) having the following characteristics. First, this enzyme catalyzes the following reaction, that is, the reaction of oxidizing the hydroxyl group of glucose in the presence of an electron acceptor to produce glucono-δ-lactone. On the other hand, this enzyme has excellent substrate specificity and acts selectively on D-glucose. Specifically, this enzyme has low reactivity with D-xylose. Specifically, the reactivity to D-xylose when the reactivity to D-glucose is 100% is 15% or less.

一方、本酵素はマルトースやD-ガラクトースなどに対する反応性も極めて低い。D-グルコースに対する反応性を100%としたときのマルトースに対する反応性、D-グルコースに対する反応性を100%としたときのD-ガラクトースに対する反応性は、いずれも5%以下、好ましくは3%以下である。更に好ましくは当該反応性が1%以下である。更に更に好ましくは当該反応性が実質0%である(即ちマルトース及びガラクトースに対する実質的な反応性がない)。   On the other hand, this enzyme has extremely low reactivity with maltose and D-galactose. The reactivity to maltose when the reactivity to D-glucose is 100% and the reactivity to D-galactose when the reactivity to D-glucose is 100% are both 5% or less, preferably 3% or less It is. More preferably, the reactivity is 1% or less. Even more preferably, the reactivity is substantially 0% (ie there is no substantial reactivity to maltose and galactose).

以上のような優れた基質特異性を有する本酵素は、試料中のグルコース量を正確に測定するための酵素として好ましい。即ち、本酵素によれば試料中にD-キシロースやマルトース或いはD-ガラクトースなどの夾雑物が存在していた場合であっても目的のグルコース量をより正確に測定することが可能である。従って本酵素は、試料中にこのような夾雑物の存在が予想又は懸念される用途(典型的には血液中のグルコース量の測定)に適したものであるといえ、しかも当該用途も含め様々な用途に適用可能であること、即ち汎用性が高いともいえる。尚、本酵素の反応性及び基質特異性は、後述の実施例に示す方法で測定・評価することができる。   The present enzyme having excellent substrate specificity as described above is preferable as an enzyme for accurately measuring the amount of glucose in a sample. That is, according to this enzyme, the target glucose level can be measured more accurately even when impurities such as D-xylose, maltose or D-galactose are present in the sample. Therefore, it can be said that this enzyme is suitable for applications in which the presence of such contaminants is expected or concerned (typically, measurement of the amount of glucose in blood), and there are various applications including such applications. It can be said that it is applicable to various uses, that is, versatility is high. In addition, the reactivity and substrate specificity of this enzyme can be measured and evaluated by the method shown in the below-mentioned Example.

本酵素の由来、即ち本酵素の生産菌はアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・フォエチダス(Aspergillus foetidus)又はアスペルギルス・アウレウス(Aspergillus aureus)である。上記特性を有する本酵素を産生可能である限りにおいて生産菌は限定されない。生産菌の具体例を示せば、アスペルギルス・フォエチダスNBRC4312株、アスペルギルス・ニガーCBS 513.88株(CBS 513.88株及びNBRC4312株は、実施例で使用したAspergillus awamori No.1751株と同一のFAD-GDHを産生する)である。NBRC4312株は独立行政法人製品評価技術基盤機構(NBRC)(〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)から入手できる。CBS 513.88株はオランダ微生物株保存センター(Centraalbureau voor Schimmelcultures : CBS)に保存されている。   The origin of the enzyme, that is, the bacterium producing the enzyme is Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus foetidus or Aspergillus aureus. As long as the present enzyme having the above characteristics can be produced, the producing bacteria is not limited. As specific examples of producing bacteria, Aspergillus foetidus NBRC4312 strain, Aspergillus niger CBS 513.88 strain (CBS 513.88 strain and NBRC4312 strain produce the same FAD-GDH as Aspergillus awamori No.1751 strain used in the examples. ). The NBRC4312 strain can be obtained from the National Institute of Technology and Evaluation (NBRC) (2-5-8 Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818). The CBS 513.88 strain is stored in the Netherlands Microbial Stock Conservation Center (CBS).

生産菌は野生株(天然からの分離株であって、遺伝子操作などの変異・改変処理が施されていないもの)であっても変異株であってもよい。尚、本酵素の遺伝子を宿主微生物に導入して得られた形質転換体を生産菌としてもよい。   The producing bacterium may be a wild strain (separate from nature and not subjected to mutation / modification treatment such as gene manipulation) or a mutant strain. A transformant obtained by introducing the gene of this enzyme into a host microorganism may be used as a production bacterium.

本酵素の更なる特徴は、pH安定性に優れる点である。具体的には、本酵素はpH4.0〜6.0で安定である。即ち、処理に供する酵素溶液のpHがこの範囲内にあれば、37℃、1時間の処理後、70%以上、好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上の活性を維持する。   A further feature of this enzyme is its excellent pH stability. Specifically, this enzyme is stable at pH 4.0 to 6.0. That is, if the pH of the enzyme solution to be treated is within this range, the activity of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more is maintained after treatment at 37 ° C. for 1 hour.

一態様では、本酵素を構成するポリペプチド鎖は、配列番号1に示すアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と等価なアミノ酸配列からなる。ここでの「等価なアミノ酸配列」とは、配列番号1に示すアミノ酸配列と一部で相違するが、当該相違がタンパク質の機能(ここではグルコースデヒドロゲナーゼ活性)に実質的な影響を与えていないアミノ酸配列のことをいう。従って、等価なアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖を有する酵素はグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示す。「グルコースデヒドロゲナーゼ活性」とは、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する活性を意味するが、その活性の程度は、グルコースデヒドロゲナーゼとしての機能を発揮できる限り特に限定されない。但し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖を有する酵素と同程度又はそれよりも高いことが好ましい。   In one embodiment, the polypeptide chain constituting the enzyme consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence equivalent to the amino acid sequence. The “equivalent amino acid sequence” here is partially different from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, but the difference does not substantially affect the function of the protein (here, glucose dehydrogenase activity). Refers to an array. Therefore, an enzyme having a polypeptide chain consisting of an equivalent amino acid sequence exhibits glucose dehydrogenase activity. “Glucose dehydrogenase activity” means the activity of catalyzing the reaction of oxidizing the hydroxyl group of glucose to produce glucono-δ-lactone. The degree of the activity is particularly limited as long as the function as glucose dehydrogenase can be exhibited. Not. However, it is preferably about the same as or higher than the enzyme having a polypeptide chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

「アミノ酸配列の一部の相違」とは、典型的には、アミノ酸配列を構成する1〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは1〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異(変化)が生じていることをいう。ここでのアミノ酸配列の相違はグルコースデヒドロゲナーゼ活性が保持される限り許容される(活性の多少の変動があってもよい)。この条件を満たす限りアミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの「複数」とは例えば全アミノ酸の約30%未満に相当する数であり、好ましくは約20%未満に相当する数であり、さらに好ましくは約10%未満に相当する数であり、より一層好ましくは約5%未満に相当する数であり、最も好ましくは約1%未満に相当する数である。等価タンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列と例えば約80%以上、好ましくは約85%以上、より好ましくは約90%以上、より一層好ましくは約95%以上、さらに好ましくは約98%以上、更に更に好ましくは約99%以上の同一性を有する。   “Partial difference in amino acid sequence” typically means deletion, substitution, or addition, insertion of one to several amino acids, or a combination thereof. This means that a mutation (change) has occurred in the amino acid sequence. The difference in the amino acid sequence here is allowed as long as the glucose dehydrogenase activity is retained (there may be some variation in activity). As long as this condition is satisfied, the positions where the amino acid sequences are different are not particularly limited, and differences may occur at a plurality of positions. The “plurality” herein is, for example, a number corresponding to less than about 30% of all amino acids, preferably a number corresponding to less than about 20%, more preferably a number corresponding to less than about 10%, Even more preferred is a number corresponding to less than about 5%, most preferred a number corresponding to less than about 1%. The equivalent protein is, for example, about 80% or more, preferably about 85% or more, more preferably about 90% or more, still more preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. More preferably, it has about 99% or more identity.

好ましくは、グルコースデヒドロゲナーゼ活性に必須でないアミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を生じさせることによって等価なアミノ酸配列が得られる。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖(例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖(例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)、芳香族側鎖(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。   Preferably, equivalent amino acid sequences are obtained by creating conservative amino acid substitutions at amino acid residues that are not essential for glucose dehydrogenase activity. As used herein, “conservative amino acid substitution” refers to substitution of a certain amino acid residue with an amino acid residue having a side chain having the same properties. Depending on the side chain of the amino acid residue, a basic side chain (eg lysine, arginine, histidine), an acidic side chain (eg aspartic acid, glutamic acid), an uncharged polar side chain (eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine) Cysteine), non-polar side chains (eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), β-branched side chains (eg threonine, valine, isoleucine), aromatic side chains (eg tyrosine, phenylalanine, Like tryptophan and histidine). A conservative amino acid substitution is preferably a substitution between amino acid residues within the same family.

ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの核酸(以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する)の同一性(%)は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる(例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい)。第一の配列の特定位置の分子(アミノ酸残基又はヌクレオチド)が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり(すなわち、同一性(%)=同一位置の数/位置の総数 × 100)、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。   By the way, the identity (%) of two amino acid sequences or two nucleic acids (hereinafter, “two sequences” is used as a term including them) can be determined, for example, by the following procedure. First, two sequences are aligned for optimal comparison (eg, a gap may be introduced into the first sequence to optimize alignment with the second sequence). When a molecule (amino acid residue or nucleotide) at a specific position in the first sequence is the same as the molecule at the corresponding position in the second sequence, it can be said that the molecule at that position is the same. The identity of two sequences is a function of the number of identical positions common to the two sequences (ie, identity (%) = number of identical positions / total number of positions × 100), preferably the optimal alignment Take into account the number and size of gaps required for conversion.

二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。本発明の核酸分子に等価なヌクレオチド配列を得るには例えば、NBLASTプログラムでscore = 100、wordlength = 12としてBLASTヌクレオチド検索を行えばよい。本酵素に等価なアミノ酸配列を得るには例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム(例えばXBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー(IGH Montpellier、フランス)またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ=12、ギャップペナルティ=4とすることができる。   Comparison of two sequences and determination of identity can be accomplished using a mathematical algorithm. Specific examples of mathematical algorithms available for sequence comparison are described in Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. There is an algorithm modified in Acad. Sci. USA 90: 5873-77, but it is not limited to this. Such an algorithm is incorporated into the NBLAST and XBLAST programs (version 2.0) described in Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. In order to obtain a nucleotide sequence equivalent to the nucleic acid molecule of the present invention, for example, a BLAST nucleotide search may be performed with score = 100 and wordlength = 12, using the NBLAST program. In order to obtain an amino acid sequence equivalent to this enzyme, for example, a BLAST polypeptide search may be performed using the XBLAST program with score = 50 and wordlength = 3. To obtain a gap alignment for comparison, the Gapped BLAST described in Altschul et al. (1997) Amino Acids Research 25 (17): 3389-3402 can be used. When utilizing BLAST and Gapped BLAST, the default parameters of the corresponding programs (eg, XBLAST and NBLAST) can be used. Please refer to http://www.ncbi.nlm.nih.gov for details. Examples of other mathematical algorithms that can be used for sequence comparison include the algorithm described in Myers and Miller (1988) Comput Appl Biosci. 4: 11-17. Such an algorithm is incorporated in the ALIGN program available for example on a GENESTREAM network server (IGH Montpellier, France) or an ISREC server. When using the ALIGN program for comparison of amino acid sequences, for example, a PAM120 residue mass table can be used, with a gap length penalty = 12 and a gap penalty = 4.

二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重=12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重=2、3、又は4として決定することができる。また、二つの核酸配列の相同度を、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで利用可能)のGAPプログラムを用いて、ギャップ加重=50、ギャップ長加重=3として決定することができる。   The identity of two amino acid sequences, using the Gloss program of the GCG software package, using a Blossom 62 matrix or PAM250 matrix, gap weight = 12, 10, 8, 6, or 4, gap length weight = 2, 3 Or 4 can be determined. In addition, the degree of homology between two nucleic acid sequences can be determined using the GAP program in the GCG software package (available at http://www.gcg.com) with gap weight = 50 and gap length weight = 3. it can.

本酵素が、より大きいタンパク質(例えば融合タンパク質)の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。   The enzyme may be part of a larger protein (eg, a fusion protein). Examples of sequences added in the fusion protein include sequences useful for purification, such as multiple histidine residues, and additional sequences that ensure stability during recombinant production.

上記アミノ酸配列を有する本酵素は、遺伝子工学的手法によって容易に調製することができる。例えば、本酵素をコードするDNAで適当な宿主細胞(例えば大腸菌)を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜精製される。このように組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするDNAと他の適当なDNAとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び/又は脂質の付加や、あるいはN末端若しくはC末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。   This enzyme having the amino acid sequence can be easily prepared by genetic engineering techniques. For example, it can be prepared by transforming a suitable host cell (for example, E. coli) with DNA encoding the present enzyme and recovering the protein expressed in the transformant. The recovered protein is appropriately purified according to the purpose. Thus, if this enzyme is obtained as a recombinant protein, various modifications are possible. For example, if a DNA encoding this enzyme and another appropriate DNA are inserted into the same vector and a recombinant protein is produced using the vector, the peptide consists of a recombinant protein linked to any peptide or protein. This enzyme can be obtained. In addition, modification may be performed so that addition of sugar chain and / or lipid, or processing of N-terminal or C-terminal may occur. By the modification as described above, extraction of recombinant protein, simplification of purification, addition of biological function, and the like are possible.

本酵素は、本酵素の生産菌から取得することができる。具体的には、例えば、アスペルギルス・フォエチダスNBRC4312株、アスペルギルス・ニガーCBS 513.88株を培養するステップ(ステップ(1))及び培養後の培養液及び/又は菌体より、グルコースデヒドロゲナーゼを回収するステップ(ステップ(2))を行い、本酵素を製造する。   This enzyme can be obtained from a bacterium producing this enzyme. Specifically, for example, a step of culturing Aspergillus foetidus NBRC4312 strain and Aspergillus niger CBS 513.88 strain (Step (1)) and a step of recovering glucose dehydrogenase from the culture medium and / or cells after the culture (Step) (2)) to produce this enzyme.

培養法及び培養条件は目的の酵素が生産されるものである限り特に限定されない。即ち、グルコースデヒドロゲナーゼが生産されることを条件として、使用する微生物の培養に適合した方法や培養条件を適宜設定できる。以下、培養条件として培地、培養温度及び培養時間を例示する。   The culture method and culture conditions are not particularly limited as long as the target enzyme is produced. That is, on the condition that glucose dehydrogenase is produced, a method and culture conditions suitable for the culture of the microorganism to be used can be appropriately set. Hereinafter, examples of the culture conditions include a medium, a culture temperature, and a culture time.

培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、如何なるものでも良い。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。培地のpHは例えば約3〜8、好ましくは約5〜7程度に調整し、培養温度は通常約10〜50℃、好ましくは約25〜35℃程度で、1〜15日間、好ましくは2〜5日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。   Any medium can be used as long as the microorganism to be used can grow. For example, carbon sources such as glucose, sucrose, gentiobiose, soluble starch, glycerin, dextrin, molasses, organic acids, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium phosphate, ammonium acetate, or peptone, yeast extract, corn steep liquor, casein Nitrogen sources such as hydrolysates, bran and meat extracts, and further added with inorganic salts such as potassium salts, magnesium salts, sodium salts, phosphates, manganese salts, iron salts and zinc salts can be used. In order to promote the growth of the microorganisms to be used, vitamins, amino acids and the like may be added to the medium. The pH of the medium is adjusted to, for example, about 3 to 8, preferably about 5 to 7, and the culture temperature is usually about 10 to 50 ° C., preferably about 25 to 35 ° C. for 1 to 15 days, preferably 2 to Incubate under aerobic conditions for about 5 days. As the culture method, for example, a shaking culture method or an aerobic deep culture method using a jar fermenter can be used.

以上の条件で培養した後、培養液又は菌体よりグルコースデヒドロゲナーゼを回収する(ステップ(2))。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過(例えば珪藻土をろ過助剤としたろ過)、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより目的の酵素を得ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、ビーズ処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的の酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程(菌体の破砕、分離、精製)を行ってもよい。尚、各精製工程では原則としてグルコースデヒドロゲナーゼ活性を指標として分画を行い、次のステップへと進む。但し、予備試験などによって、適切な条件を既に設定可能な場合にはこの限りでない。   After culturing under the above conditions, glucose dehydrogenase is recovered from the culture solution or the cells (step (2)). When recovering from the culture solution, for example, the culture supernatant is filtered (for example, filtration using diatomaceous earth as a filter aid), the insoluble matter is removed by centrifugation, etc., and then concentrated by ultrafiltration membrane, ammonium sulfate precipitation, etc. The target enzyme can be obtained by performing separation and purification by appropriately combining salting-out, dialysis, various types of chromatography, and the like. On the other hand, when recovering from the microbial cells, the target enzyme can be obtained by crushing the microbial cells by, for example, pressure treatment, ultrasonic treatment, bead treatment, etc., followed by separation and purification in the same manner as described above. . After the cells are collected from the culture solution in advance by filtration, centrifugation, or the like, the above series of steps (crushing, separating, and purifying the cells) may be performed. In each purification process, in principle, fractionation is performed using glucose dehydrogenase activity as an index, and the process proceeds to the next step. However, this does not apply when appropriate conditions can be set by preliminary tests.

本酵素を組換え体として取得することも可能である。即ち、本酵素の遺伝子を導入した形質転換体を用いて本酵素を製造することにしてもよい。この態様の製造法ではまず、本酵素の遺伝子を導入した形質転換体を用意する。本明細書において「本酵素の遺伝子」とは、それを発現させた場合に本酵素が得られる核酸のことをいい、本酵素のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸をも含む。また、コドンの縮重も考慮される。   It is also possible to obtain this enzyme as a recombinant. That is, the present enzyme may be produced using a transformant into which the gene of the present enzyme has been introduced. In the production method of this embodiment, first, a transformant into which the gene for this enzyme has been introduced is prepared. In the present specification, the term “gene of the present enzyme” refers to a nucleic acid obtained from the present enzyme when expressed, and includes a nucleic acid having a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the present enzyme. Such a nucleic acid is also included in which a sequence that does not encode an amino acid sequence is added. Codon degeneracy is also considered.

本酵素の遺伝子は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法、化学合成、PCR法(例えばオーバーラップPCR)或いはこれらの組合せによって、単離された状態に調製することができる。   For the gene of this enzyme, reference to the sequence information disclosed in this specification or the attached sequence listing, standard genetic engineering techniques, molecular biological techniques, biochemical techniques, chemical synthesis, PCR methods (for example, Wrap PCR) or a combination thereof can be prepared in an isolated state.

本酵素の製造に利用できる形質転換体を用意するために、本酵素の遺伝子を含む発現ベクターを作製する。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいう。   In order to prepare a transformant that can be used for the production of the enzyme, an expression vector containing the gene for the enzyme is prepared. As used herein, the term “vector” refers to a nucleic acid molecule capable of transporting a nucleic acid inserted therein into a target such as a cell.

使用目的、宿主細胞等を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはM13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体(pB325、pAT153、pUC8など)等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpCDM8、pMT2PC等を例示することができる。   An appropriate vector is selected in consideration of the purpose of use, the host cell and the like. M13 phage or a modified form thereof, λ phage or a modified form thereof, pBR322 or a modified form thereof (pB325, pAT153, pUC8, etc.), etc., as a vector using E. coli as a host, pYepSec1, pMFa, pYES2 Examples of vectors using insect cells as hosts include pAc and pVL, and examples of vectors using mammalian cells as hosts include pCDM8 and pMT2PC.

「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞(宿主細胞)内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や、発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無(及びその程度)を確認することができる。   “Expression vector” refers to a vector capable of introducing a nucleic acid inserted therein into a target cell (host cell) and allowing expression in the cell. Expression vectors usually contain a promoter sequence necessary for the expression of the inserted nucleic acid, an enhancer sequence that promotes expression, and the like. An expression vector containing a selectable marker can also be used. When such an expression vector is used, the presence / absence (and extent) of introduction of the expression vector can be confirmed using a selection marker.

本酵素の遺伝子のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入(必要な場合)、プロモーターの挿入(必要な場合)等は標準的な組換えDNA技術(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法)を用いて行うことができる。   Standard recombinant DNA techniques (for example, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold, etc.) include insertion of the gene of this enzyme into a vector, insertion of a selectable marker gene (if necessary), insertion of a promoter (if necessary), etc. A known method using a restriction enzyme and DNA ligase, which can be referred to Spring Harbor Laboratory Press, New York.

宿主細胞としては、取り扱いの容易さの点から、大腸菌(エシェリヒア・コリ)、出芽酵母(サッカロマイセス・セレビシエ)などの微生物を用いることが好ましいが、組換えDNAが複製可能で且つ本酵素の遺伝子が発現可能な宿主細胞であれば利用可能である。大腸菌の例としてT7系プロモーターを利用する場合は大腸菌BL21(DE3)pLysS、そうでない場合は大腸菌JM109を挙げることができる。また、出芽酵母の例として出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22あるいは出芽酵母INVSc1(インビトロジェン社)を挙げることができる。   As host cells, it is preferable to use microorganisms such as Escherichia coli (Escherichia coli) and budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) from the viewpoint of ease of handling, but the recombinant DNA can be replicated and the gene of this enzyme is Any host cell capable of expression can be used. Examples of E. coli include E. coli BL21 (DE3) pLysS when T7 promoter is used, and E. coli JM109 otherwise. Examples of budding yeast include budding yeast SHY2, budding yeast AH22, or budding yeast INVSc1 (Invitrogen).

本酵素の遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を得る。形質転換体は上記発現ベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって得ることができる。例えば、塩化カルシウム法(ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー(J.Mol. Biol.)、第53巻、第159頁 (1970))、ハナハン(Hanahan)法(ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー、第166巻、第557頁 (1983))、SEM法(ジーン(Gene)、第96巻、第23頁(1990)〕、チャング(Chung)らの方法(プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ USA、第86巻、第2172頁(1989))、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))等によって実施することができる。   An expression vector containing the gene for this enzyme is introduced into a host cell to obtain a transformant. A transformant can be obtained by transfection or transformation using the above expression vector. For example, the calcium chloride method (J. Mol. Biol., Vol. 53, pp. 159 (1970)), the Hanahan method (Journal of Molecular Biology, Vol. 166, Vol. 557). (1983), SEM (Gene, 96, 23 (1990)), Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 86) Vol., P. 2172 (1989)), calcium phosphate coprecipitation, electroporation (Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161-7165 (1984)), lipofection (Felgner, PL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417 (1984)) and the like.

以上のようにして用意した形質転換体を、それに導入された遺伝子(即ち、本酵素の遺伝子)によってコードされるタンパク質が産生される条件下で培養する(ステップ(i))。様々なベクター宿主系に関して形質転換体の培養条件が公知であり、当業者であれば適切な培養条件を容易に設定することができる。培養ステップに続き、産生されたタンパク質(即ち、グルコースデヒドロゲナーゼ)を回収する(ステップ(ii))。回収及びその後の精製については、上記態様(ステップ(1)及び(2)を含む製造方法)の場合と同様に行えばよい。   The transformant prepared as described above is cultured under conditions that produce a protein encoded by the gene introduced therein (ie, the gene of the present enzyme) (step (i)). Culture conditions for transformants are known for various vector host systems, and those skilled in the art can easily set appropriate culture conditions. Following the culture step, the produced protein (ie, glucose dehydrogenase) is recovered (step (ii)). The recovery and subsequent purification may be performed in the same manner as in the case of the above-described embodiment (production method including steps (1) and (2)).

酵素の精製度は特に限定されないが、例えば比活性が10〜1000(U/mg)、好ましくは比活性が50〜500(U/mg)の状態に精製することができる。また、最終的な形態は液体状であっても固体状(粉体状を含む)であってもよい。   The degree of purification of the enzyme is not particularly limited. For example, the enzyme can be purified to have a specific activity of 10 to 1000 (U / mg), preferably 50 to 500 (U / mg). The final form may be liquid or solid (including powder).

本発明の酵素剤は有効成分(本酵素)の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。   In addition to the active ingredient (the present enzyme), the enzyme agent of the present invention may contain excipients, buffers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline and the like. As the excipient, starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, glycerol and the like can be used. Phosphate, citrate, acetate, etc. can be used as the buffer. As the stabilizer, propylene glycol, ascorbic acid or the like can be used. As preservatives, phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like can be used. As preservatives, ethanol, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.

3.グルコース測定法
本発明は、本酵素を用いたグルコース測定法も提供する。本発明のグルコース測定法では本酵素による酸化還元反応を利用して試料中のグルコース量を測定する。この反応による変化が利用できる各種用途に本発明を適用可能である。
3. Glucose Measuring Method The present invention also provides a glucose measuring method using the present enzyme. In the glucose measuring method of the present invention, the amount of glucose in a sample is measured using an oxidation-reduction reaction by this enzyme. The present invention can be applied to various uses in which changes due to this reaction can be used.

本発明は例えば血糖値の測定、食品(調味料や飲料など)中のグルコース濃度の測定などに利用される。また、発酵食品(例えば食酢)又は発酵飲料(例えばビールや酒)の製造工程において発酵度を調べるために本発明を利用してもよい。   The present invention is used, for example, for measurement of blood glucose level, measurement of glucose concentration in food (such as seasonings and beverages), and the like. Moreover, you may utilize this invention in order to investigate a fermentation degree in the manufacturing process of fermented foods (for example, vinegar) or fermented drinks (for example, beer and liquor).

4.グルコース測定用試薬、キット、センサ
本発明は、本酵素を含むグルコース測定用試薬も提供する。当該試薬は上記の本発明のグルコース測定法に使用される。グルコース測定用試薬の安定化や使用時の活性化等を目的として、血清アルブミン、タンパク質、界面活性剤、糖類、糖アルコール、無機塩類等を添加してもよい。
4). Glucose measuring reagent, kit, sensor The present invention also provides a glucose measuring reagent containing the enzyme. The reagent is used in the glucose measurement method of the present invention described above. Serum albumin, proteins, surfactants, saccharides, sugar alcohols, inorganic salts, and the like may be added for the purpose of stabilizing the glucose measuring reagent and activating it during use.

グルコース測定用試薬を測定キットの構成要素にすることもできる。換言すれば、本発明は、上記グルコース測定用試薬を含むキット(グルコース測定用キット)も提供する。本発明のキットは必須の構成要素として上記グルコース測定用試薬を含む。また、反応用試薬、緩衝液、グルコース標準液、容器などを任意の要素として含む。尚、本発明のグルコース測定キットには通常、使用説明書が添付される。   A reagent for measuring glucose can also be used as a component of the measurement kit. In other words, the present invention also provides a kit (glucose measurement kit) containing the glucose measurement reagent. The kit of the present invention contains the above-mentioned reagent for glucose measurement as an essential component. In addition, a reaction reagent, a buffer solution, a glucose standard solution, a container and the like are included as optional elements. The glucose measurement kit of the present invention usually includes an instruction manual.

本酵素を利用してグルコースセンサを構成することが可能である。即ち、本発明は、本酵素を含むグルコースセンサも提供する。本発明のグルコースセンサの典型的な構造では、絶縁性基板上に作用電極及び対極を備えた電極系が形成され、その上に本酵素とメディエータを含む試薬層が形成される。参照電極も備えた測定系を用いることにしてもよい。このような、いわゆる3電極系の測定系を用いれば、参照電極の電位を基準として作用電極の電位を表すことが可能となる。各電極の材料は特に限定されない。作用電極及び対極の電極材料の例を示せば、金(Au)、カーボン(C)、白金(Pt)、チタン(Ti)である。メディエータとしては、フェリシアン化合物(フェリシアン化カリウムなど)、金属錯体(ルテニウム錯体、オスミウム錯体、バナジウム錯体など)、キノン化合物(ピロロキノリンキノンなど)などが使用される。尚、グルコースセンサの構成、グルコースセンサを利用した電気化学的測定法については、例えば、バイオ電気化学の実際−バイオセンサ・バイオ電池の実用展開−(2007年3月発行、シーエムシー出版)に詳しい。   A glucose sensor can be constructed using this enzyme. That is, this invention also provides the glucose sensor containing this enzyme. In a typical structure of the glucose sensor of the present invention, an electrode system including a working electrode and a counter electrode is formed on an insulating substrate, and a reagent layer containing the present enzyme and mediator is formed thereon. A measurement system that also includes a reference electrode may be used. If such a so-called three-electrode measurement system is used, the potential of the working electrode can be expressed based on the potential of the reference electrode. The material of each electrode is not particularly limited. Examples of the electrode material for the working electrode and the counter electrode are gold (Au), carbon (C), platinum (Pt), and titanium (Ti). As the mediator, a ferricyan compound (such as potassium ferricyanide), a metal complex (such as a ruthenium complex, an osmium complex, or a vanadium complex), a quinone compound (such as pyrroloquinoline quinone), or the like is used. The structure of the glucose sensor and the electrochemical measurement method using the glucose sensor are detailed in, for example, the actual bioelectrochemistry-practical deployment of biosensors and biobatteries-(published in March 2007, CMC Publishing). .

1.微生物からのスクリーニング
公的機関から入手した保存菌株や自然界から入手した菌株を含む13,000株を培養して得られた培養液を試料として、以下の条件、即ち、グルコースデヒドロゲナーゼ活性が高いこと、マルトースに反応しないこと、キシロースへの反応性が低いこと、及びグルコースオキシダーゼ活性を示さないこと、を満たすものを以下の方法で選出した。
1. Screening from microorganisms Using as a sample a culture solution obtained by culturing 13,000 strains including stocks obtained from public institutions and strains obtained from the natural world, the following conditions, namely, high glucose dehydrogenase activity, maltose Those satisfying that no reaction, low reactivity to xylose, and no glucose oxidase activity were selected by the following method.

グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法
(測定試液)
100 mmol/L PIPES cont. 0.1%(w/v) Triton X-100 pH 7.0: 24mL
3 mmol/L 1-Methoxy PMS(Phenazine methanesulfate): 2mL
6.6 mmol/L NTB(Nitrotetrazorium blue): 1mL
1 mol/L グルコース: 3mL
Method for measuring glucose dehydrogenase activity (measuring solution)
100 mmol / L PIPES cont. 0.1% (w / v) Triton X-100 pH 7.0: 24mL
3 mmol / L 1-Methoxy PMS (Phenazine methanesulfate): 2mL
6.6 mmol / L NTB (Nitrotetrazorium blue): 1mL
1 mol / L glucose: 3mL

(測定手順)
サンプルを20μLずつ96wellプレートに分注後、測定試液を1ウェルあたり200μLずつ添加し、37℃、60分後、570nmの吸光度をプレートリーダーで測定した。上記測定試液のうち、グルコースをマルトース又はキシロースへ変更して同様に測定し、マルトース、キシロースへの反応性も確認した。
(Measurement procedure)
After dispensing 20 μL of each sample into a 96-well plate, 200 μL of measurement reagent was added per well, and after 60 minutes at 37 ° C., the absorbance at 570 nm was measured with a plate reader. Among the above measuring solutions, glucose was changed to maltose or xylose and the same measurement was performed, and the reactivity to maltose and xylose was also confirmed.

グルコースオキシダーゼ活性の測定方法
(測定試液)
100 mmol/L PIPES cont. 0.1%(w/v) Triton X-100 pH 7.0: 23mL
5g/dL フェノール試液: 0.5mL
25u/mL PO“Amano”3(天野エンザイム株式会社)溶液: 3mL
0.5g/dL 4-アミノアンチピリン試液: 0.5mL
1 mol/L グルコース: 3mL
Method for measuring glucose oxidase activity (measuring solution)
100 mmol / L PIPES cont. 0.1% (w / v) Triton X-100 pH 7.0: 23mL
5g / dL phenol reagent: 0.5mL
25u / mL PO “Amano” 3 (Amano Enzyme Inc.) solution: 3mL
0.5g / dL 4-aminoantipyrine test solution: 0.5mL
1 mol / L glucose: 3mL

(測定手順)
サンプルを20μLずつ96wellプレートに分注後、測定試液を1ウェルあたり200μLずつ添加し、37℃、60分後、500nmの吸光度をプレートリーダーで測定した。
(Measurement procedure)
After dispensing 20 μL of each sample into a 96-well plate, 200 μL of the measurement reagent was added per well, and after 60 minutes at 37 ° C., the absorbance at 500 nm was measured with a plate reader.

検討の結果、マルトースに反応せず、キシロースへの反応性が低く、しかもグルコースオキシダーゼではない、Aspergillus awamori No.1751株とAspergillus aureus No.2062株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼが見出された。Aspergillus awamori No.1751株とAspergillus aureus No.2062株について、マルトース及びキシロースへの反応性とグルコースオキシダーゼ(GO)活性を以下の表に示す。マルトース及びキシロースへの反応性は、グルコースへの反応性を100%としたときの相対値(マルトース(又はキシロース)を基質とした場合の測定値/グルコースを基質とした場合の測定値 × 100)で表した。また、グルコースオキシダーゼ(GO)はグルコースデヒドロゲナーゼに対する相対値(グルコースオキシダーゼ(GO)活性の測定値/グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定値 × 100)で表した。比較のため、グルコースオキシダーゼ(Aspergillus niger由来)、PQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(Acinetobacter calcoaceticus由来)、FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(Aspergillus oryzae由来)の結果も示した。   As a result of the investigation, glucose dehydrogenase produced by Aspergillus awamori No.1751 and Aspergillus aureus No.2062 strains was found that does not react with maltose, has low reactivity with xylose, and is not glucose oxidase. The following table shows reactivity to maltose and xylose and glucose oxidase (GO) activity for Aspergillus awamori No. 1751 and Aspergillus aureus No. 2062. The reactivity to maltose and xylose is relative value when the reactivity to glucose is 100% (measured value when maltose (or xylose) is used as substrate / measured value when glucose is used as substrate x 100) Expressed in Glucose oxidase (GO) was expressed as a relative value to glucose dehydrogenase (measured value of glucose oxidase (GO) activity / measured value of glucose dehydrogenase activity × 100). For comparison, results of glucose oxidase (derived from Aspergillus niger), PQQ-dependent glucose dehydrogenase (derived from Acinetobacter calcoaceticus), and FAD-dependent glucose dehydrogenase (derived from Aspergillus oryzae) are also shown.

Figure 2017112858
Figure 2017112858

Aspergillus awamori No.1751株とAspergillus aureus No.2062株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼは、既存のPQQ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ及びFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼと比較して優位にマルトース及びキシロースへの反応性が低いことがわかる。尚、Aspergillus awamori No.1751株は独立行政法人製品評価技術基盤機構(NBRC)(〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に保存されているAspergillus foetidus Thom&Raper NBRC 4312と同一株である。   Glucose dehydrogenase produced by Aspergillus awamori No.1751 and Aspergillus aureus No.2062 strains is significantly less reactive to maltose and xylose than existing PQQ-dependent glucose dehydrogenases and FAD-dependent glucose dehydrogenases Recognize. Aspergillus awamori No.1751 is the same as Aspergillus foetidus Thom & Raper NBRC 4312 stored in the National Institute of Technology and Evaluation (NBRC) (2-5-8 Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818) Is a stock.

2.精製酵素の調製
以上の検討によって見出された、Aspergillus awamori No.1751株とAspergillus aureus No.2062株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼについて、その精製酵素を取得すべくAspergillus awamori No.1751株とAspergillus aureus No.2062株を小麦ふすまを用いた固体培養で30℃、5日間培養した。得られた培養麹から酵素を抽出し、粗酵素液とした。
2. Preparation of purified enzyme Aspergillus awamori No. 1751 and Aspergillus aureus No. 1751 and Aspergillus aureus No. 1751 and Aspergillus aureus No. 1751 and Aspergillus aureus No. The .2062 strain was cultured at 30 ° C. for 5 days in solid culture using wheat bran. The enzyme was extracted from the obtained culture cake to obtain a crude enzyme solution.

粗酵素液を精製(塩析、疎水結合クロマト、イオン交換クロマト、ゲル濾過クロマトグラフィー)し、精製酵素を得た。精製酵素をゲル濾過(GEヘルスケア社製Superdex 200を使用)及びSDS-PAGEで分析した。Aspergillus awamori No.1751株のSDS-PAGEの結果を図1に、Aspergillus aureus No.2062株のSDS-PAGEの結果を図2に示す。Aspergillus awamori No.1751株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼ活性が最も高いフラクション(No.36)、及びAspergillus aureus No.2062株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼ活性が最も高いフラクション(No.32)を以降の実験に使用した。   The crude enzyme solution was purified (salting out, hydrophobic bond chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography) to obtain a purified enzyme. The purified enzyme was analyzed by gel filtration (using Superdex 200 manufactured by GE Healthcare) and SDS-PAGE. The results of SDS-PAGE of Aspergillus awamori No.1751 strain are shown in FIG. 1, and the results of SDS-PAGE of Aspergillus aureus No.2062 strain are shown in FIG. The fraction with the highest glucose dehydrogenase activity produced by Aspergillus awamori No.1751 (No.36) and the fraction with the highest glucose dehydrogenase activity produced by Aspergillus aureus No.2062 (No.32) were used in the subsequent experiments. did.

3.精製酵素の基質特異性確認
上記2.で得た精製酵素の基質特異性を調べた。
(活性測定方法)
FAD-GDHは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してD-グルコノ-δ-ラクトンを生成する反応を触媒する。FAD-GDH活性の測定は下記の反応系で行った。

Figure 2017112858
尚、式中のPMSはフェナジンメタンスルフェート(Phenazine methanesulfate)を表し、NTBはニトロテトラゾリウムブルー(Nitrotetrazorium blue)を表す。反応(1)において、グルコースの酸化に伴って還元型PMSが生成し、更に反応(2)において還元型PMSによるNTBの還元により生成したDiformazanを570nmの波長で測定する。 3. Confirmation of substrate specificity of purified enzyme 2. The substrate specificity of the purified enzyme obtained in (1) was examined.
(Activity measurement method)
FAD-GDH catalyzes the reaction of oxidizing the hydroxyl group of glucose in the presence of an electron acceptor to produce D-glucono-δ-lactone. The FAD-GDH activity was measured using the following reaction system.
Figure 2017112858
In addition, PMS in a formula represents phenazine methanesulfate (Phenazine methanesulfate) and NTB represents nitrotetrazolium blue (Nitrotetrazorium blue). In reaction (1), reduced PMS is generated as glucose is oxidized, and Diformazan generated by reduction of NTB by reduced PMS in reaction (2) is measured at a wavelength of 570 nm.

酵素活性は、以下の計算式によって算出される。

Figure 2017112858
尚、式中のVtは総液量を、Vsはサンプル量を、20.1はDiformazanの0.5μ molあたりの吸光度係数(cm2 / 0.5μ mol)を、1.0は光路長(cm)を、dfは希釈倍数をそれぞれ表す。 The enzyme activity is calculated by the following calculation formula.
Figure 2017112858
In the formula, Vt is the total liquid volume, Vs is the sample volume, 20.1 is the absorbance coefficient (cm 2 /0.5 μmol) per 0.5 μmol of Diformazan, 1.0 is the optical path length (cm), and df is Each dilution factor is indicated.

0.1%(w/v)トリトンX-100を含む100mmol/L PIPES-NaOH緩衝液pH7.0 2.4mL、1mol/L D-グルコース溶液0.3mL、3 mmol/L PMS溶液0.2mL、及び6.6 mmol/L NTB溶液0.1mLを混合し、37℃で5分間保温後、酵素液0.1mLを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行と共に570nmに吸収を持つDiformazanが生成される。1分間あたりの570nmにおける吸光度の増加を測定し、FAD-GDH活性を測定した。Aspergillus awamori No.1751株についての測定結果を以下の表に示す。尚、グルコースをマルトース又はキシロースへ変更して同様に測定し、マルトース、キシロースへの反応性を確認した。比較のため、Aspergillus oryzaeの生産するグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH”Amano”8 天野エンザイム株式会社)の結果を併記した。

Figure 2017112858
100 mmol / L PIPES-NaOH buffer pH 7.0 2.4 mL containing 0.1% (w / v) Triton X-100, 0.3 mL of 1 mol / L D-glucose solution, 0.2 mL of 3 mmol / L PMS solution, and 6.6 mmol / L NTB solution (0.1 mL) was mixed and incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and then the enzyme solution (0.1 mL) was added to start the reaction. Diformazan having absorption at 570 nm is generated as the enzymatic reaction proceeds. The increase in absorbance at 570 nm per minute was measured, and FAD-GDH activity was measured. The measurement results for Aspergillus awamori No. 1751 are shown in the following table. In addition, glucose was changed into maltose or xylose and measured in the same manner, and the reactivity to maltose and xylose was confirmed. For comparison, the results of glucose dehydrogenase produced by Aspergillus oryzae (GDH “Amano” 8 Amano Enzyme Co., Ltd.) are also shown.
Figure 2017112858

Aspergillus awamori No.1751株とAspergillus aureus No.2062株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼは、Aspergillus oryzaeの生産するグルコースデヒドロゲナーゼと比較してキシロースへの反応性が低く、さらにマルトースには反応せず、血糖測定に適した性質を有していることが判明した。   Glucose dehydrogenase produced by Aspergillus awamori No. 1751 and Aspergillus aureus No. 2062 is less reactive to xylose than glucose dehydrogenase produced by Aspergillus oryzae, and does not react with maltose for blood glucose measurement. It was found to have suitable properties.

4.精製酵素のpH安定性確認
上記2.で得た精製酵素のpH安定性を調べた。1 U/mLになるように酵素液を各種pHの緩衝液で調製後、37℃、1時間加温処理した。その後、測定に用いる緩衝液で希釈し、上記3.と同じ方法で残存活性を測定した。
4). Confirmation of pH stability of purified enzyme 2. The pH stability of the purified enzyme obtained in (1) was examined. The enzyme solution was prepared with various pH buffers so as to be 1 U / mL, followed by heating at 37 ° C. for 1 hour. Then, it is diluted with a buffer used for measurement, and the above 3. Residual activity was measured by the same method.

Aspergillus awamori No.1751株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼの測定結果を図3に、Aspergillus aureus No.2062株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼの測定結果を図4に示す。いずれもpH 4〜pH 6の範囲において高い安定性を示した(残存活性が90%以上)。即ち、pH安定性に優れ、グルコースセンサ用途に適し且つ実用性が高いことが判明した。   The measurement result of glucose dehydrogenase produced by Aspergillus awamori No.1751 strain is shown in FIG. 3, and the measurement result of glucose dehydrogenase produced by Aspergillus aureus No.2062 strain is shown in FIG. All showed high stability in the range of pH 4 to pH 6 (residual activity was 90% or more). That is, it was proved that the pH stability was excellent, it was suitable for glucose sensor applications and was highly practical.

5.N末端アミノ酸及びアミノ酸配列の決定
Aspergillus awamori No.1751株の活性ピークであるフラクションNo.36と、Aspergillus aureus No.2062株の活性ピークであるフラクションNo.32をSDS-PAGEで分離して得られたバンドについて、常法に従い、PVDF膜へブロッティングした後、N末アミノ酸解析を実施したところ、約60KDaのタンパク質(図1矢印、図2矢印)で「GPQYDYIVVGGGTSGLVVA(配列番号3)」の配列情報が得られた。同配列を問い合わせ配列として、NCBIが提供するBLAST解析を実施したところ、グルコースオキシダーゼファミリーである可能性が高いことが判明した。BLAST解析結果を図5に示す。
5. Determination of N-terminal amino acid and amino acid sequence
About the band obtained by separating fraction No. 36 which is the active peak of Aspergillus awamori No. 1751 strain and fraction No. 32 which is the active peak of Aspergillus aureus No. 2062 strain by SDS-PAGE, After blotting to a PVDF membrane, N-terminal amino acid analysis was performed. As a result, sequence information of “GPQYDYIVVGGGTSGLVVA (SEQ ID NO: 3)” was obtained with a protein of about 60 KDa (arrows in FIGS. 1 and 2). When BLAST analysis provided by NCBI was performed using the same sequence as a query sequence, it was found that there is a high possibility of being a glucose oxidase family. The BLAST analysis results are shown in FIG.

一方で、糸状菌由来のグルコースオキシダーゼファミリーはいくつか知られており、C末側に共通のモチーフを有することが知られている。中でも相同性の高い部分の配列情報「N,V/L,RVVDASV,L/M/I/F,P」からアンチセンスプライマー「NGGNADNACNSWRGCRTCNACNACNCKNAVRTT(配列番号4)」を設計した。本プライマーとN末アミノ酸配列をもとにして設計したプライマーを用いて、ゲノムDNAをテンプレートにPCRで増幅し、常法に従い塩基配列を決定した。さらに、得られた部分配列から常法に従いインバースPCRの方法で未決定部分の配列を決定し、全長塩基配列を入手したところ、Aspergillus awamori No.1751株とAspergillus aureus No.2062株で全く同じ配列(配列番号5)であった。得られた配列(配列番号5)はイントロン配列を含むことから、イントロン予測ソフトFGENESH(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fgenesh&group=programs&subgroup=gfind)を用いてイントロン部分を予測し、新規FAD-GDHの遺伝子配列(配列番号2)を入手し、得られた遺伝子配列から新規FAD-GDHのアミノ酸配列(配列番号1)を決定した。   On the other hand, several glucose oxidase families derived from filamentous fungi are known, and are known to have a common motif on the C-terminal side. Among them, the antisense primer “NGGNADNACNSWRGCRTCNACNACNCKNAVRTT (SEQ ID NO: 4)” was designed from the sequence information “N, V / L, RVVDASV, L / M / I / F, P” of the highly homologous portion. Using this primer and a primer designed based on the N-terminal amino acid sequence, genomic DNA was amplified as a template by PCR, and the nucleotide sequence was determined according to a conventional method. Furthermore, the sequence of the undetermined portion was determined by the inverse PCR method according to the conventional method from the obtained partial sequence, and the full-length base sequence was obtained. Aspergillus awamori No.1751 and Aspergillus aureus No.2062 were identical in sequence. (SEQ ID NO: 5). Since the obtained sequence (SEQ ID NO: 5) contains an intron sequence, the intron portion was determined using intron prediction software FGENESH (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fgenesh&group=programs&subgroup=gfind). The gene sequence (SEQ ID NO: 2) of the novel FAD-GDH was obtained by prediction, and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the novel FAD-GDH was determined from the obtained gene sequence.

決定したアミノ酸配列(配列番号1)をBLAST(登録商標)で検索したところ、アスペルギルス・ニガーのグルコースオキシダーゼとして登録されている配列(glucose oxidase[Aspergillus niger CBS 513.88, Accession No. XP_001391138])と100%同一であった。即ち、グルコースオキシダーゼとして既知のタンパク質が、実際にはFAD-GDHとして機能することが判明した。   When the determined amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) was searched with BLAST (registered trademark), the sequence registered as glucose oxidase of Aspergillus niger (glucose oxidase [Aspergillus niger CBS 513.88, Accession No. XP_001391138]) and 100% It was the same. That is, it was found that a protein known as glucose oxidase actually functions as FAD-GDH.

本発明のグルコースデヒドロゲナーゼはキシロースに対する反応性が低く、またpH安定性に優れる。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは特にグルコースセンサへの利用に適したものであり、その実用性は高い。   The glucose dehydrogenase of the present invention has low reactivity with xylose and is excellent in pH stability. The glucose dehydrogenase of the present invention is particularly suitable for use in a glucose sensor, and its practicality is high.

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。   The present invention is not limited to the description of the embodiments and examples of the invention described above. Various modifications may be included in the present invention as long as those skilled in the art can easily conceive without departing from the description of the scope of claims. The contents of papers, published patent gazettes, patent gazettes, and the like specified in this specification are incorporated by reference in their entirety.

Claims (9)

以下の特徴、即ち、
(1)作用: 電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する;
(2)基質特異性: D-グルコースに対する反応性を100%としたときのD-キシロースに対する反応性が15%以下である;
(3)pH安定性: pH4〜6で安定である;
(4)アミノ酸配列: 配列番号1に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と80%以上同一のアミノ酸配列を含む;
を備えるグルコースデヒドロゲナーゼを有効成分とした、グルコース測定用酵素剤。
The following features:
(1) Action: catalyzes a reaction in which glucose hydroxyl group is oxidized to produce glucono-δ-lactone in the presence of an electron acceptor;
(2) Substrate specificity: The reactivity to D-xylose is 15% or less when the reactivity to D-glucose is 100%;
(3) pH stability: stable at pH 4-6;
(4) Amino acid sequence: The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence that is 80% or more identical to the amino acid sequence;
An enzyme agent for measuring glucose, comprising as an active ingredient glucose dehydrogenase comprising
前記グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列と85%以上同一のアミノ酸配列である、請求項1に記載のグルコース測定用酵素剤。   The enzyme agent for glucose measurement according to claim 1, wherein the amino acid sequence of the glucose dehydrogenase is an amino acid sequence that is 85% or more identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. 前記グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列である、請求項1に記載のグルコース測定用酵素剤。   The enzyme agent for glucose measurement according to claim 1, wherein the amino acid sequence of the glucose dehydrogenase is an amino acid sequence 90% or more identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フォエチダス又はアスペルギルス・アウレウスに由来する酵素である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のグルコース測定用酵素剤。   The enzyme agent for glucose measurement according to any one of claims 1 to 3, which is an enzyme derived from Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus feutilus or Aspergillus aureus. アスペルギルス・ニガーがCBS 513.88株であり、アスペルギルス・フォエチダスがNBRC4312株である、請求項4に記載のグルコース測定用酵素剤。   The enzyme agent for glucose measurement according to claim 4, wherein Aspergillus niger is CBS 513.88 strain and Aspergillus foreidas is NBRC4312 strain. 請求項1〜5のいずれか一項に定義したグルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。   A glucose measuring method, wherein glucose in a sample is measured using the glucose dehydrogenase defined in any one of claims 1 to 5. 請求項1〜5のいずれか一項に定義したグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用試薬。   A reagent for measuring glucose, comprising the glucose dehydrogenase defined in any one of claims 1 to 5. 請求項7に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。   A glucose measurement kit comprising the glucose measurement reagent according to claim 7. 請求項1〜5のいずれか一項に定義したグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。   A glucose sensor comprising a glucose dehydrogenase as defined in any one of claims 1-5.
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