JP2017090465A - 電気化学測定方法および電気化学測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】生体試料の投入および回収に伴って生じる電流ノイズを抑制することができる電気化学測定方法を提供する。【解決手段】電気化学測定方法は、ウェルと、ウェル内に設けられた作用電極とを有する電気化学測定デバイスを用いた電気化学測定方法であって、作用電極に測定電圧を印加して、作用電極に流れる第一の電流値を測定するステップＳ０２０と、その後、作用電極に非測定電圧を印加するステップＳ０２５と、その後、作用電極に対して非測定電圧を印加した状態で、ウェル内に生体試料を投入するステップＳ０３０と、その後、作用電極に測定電圧を印加して、作用電極に流れる第二の電流値を測定するステップＳ０４０と、を備える。【選択図】図５

Description

本開示は、細胞又は組織等の活動状態を測定、解析するための電気化学測定方法および電気化学測定装置に関する。

細胞や組織は、様々な物質を輸送、消費することによって活動している。例えば、胚は、周囲の酸素を消費しながら細胞***を行う。そのため、細胞や組織等の試料の周囲の環境を測定することにより、その試料の活動状態について解析することができる。

試料の周囲の環境を測定する方法としては、例えば、作用電極が設けられた電気化学測定デバイスを用いて、試料を含む溶液の電気化学測定を行う方法がある。

尚、この出願に関連する先行技術文献としては、例えば、特許文献１が知られている。

国際公開第２０１０／０５５９４２号

本開示の電気化学測定方法は、ウェルと、ウェル内に設けられた作用電極とを有する電気化学測定デバイスを用いて生体試料を測定する方法である。

電気化学測定方法は、作用電極に測定電圧を印加して、作用電極に流れる第一の電流値を測定するステップと、その後、作用電極に非測定電圧を印加するステップと、その後、作用電極に対して非測定電圧を印加した状態で、ウェル内に生体試料を投入するステップと、その後、作用電極に測定電圧を印加して、作用電極に流れる第二の電流値を測定するステップと、を備える。

また、本開示の電気化学測定装置は、ウェルと、ウェル内に設けられた作用電極とを有する電気化学測定デバイスを用いて電気化学測定を行う電気化学測定装置である。

電気化学測定装置は、電気化学測定デバイスを載置する載置部と、電気化学測定デバイスの作用電極に電気的に接続される端子と、作用電極に印加する電圧を制御する制御部と、を備えている。

制御部は、作用電極に測定電圧を印加し、生体試料を投入する前の、作用電極に流れる第一の電流値を測定し、その後、作用電極に非測定電圧を印加し、その後、生体試料が電気化学測定デバイスに投入された後に、作用電極に測定電圧を印加し、作用電極に流れる第二の電流値を測定する。

図１は、本実施の形態１における電気化学測定デバイスの斜視図である。 図２は、本実施の形態１における電気化学測定装置の斜視図である。 図３は、本実施の形態１における電気化学測定デバイスの断面模式図である。 図４は、本実施の形態１における電気化学測定デバイスの上面模式図である。 図５は、本実施の形態１における電気化学測定方法を示すフローチャートである。 図６は、本実施の形態１における電圧印加プロトコルを示すグラフである。 図７は、本実施の形態１の変形例１における電圧印加プロトコルを示すグラフである。 図８は、本実施の形態１の変形例２における電気化学測定方法を示すフローチャートである。 図９は、本実施の形態１の変形例２における電圧印加プロトコルを示すグラフである。 図１０は、本実施の形態２における電気化学測定デバイスの上面図である。 図１１は、本実施の形態２における電気化学測定方法を示すフローチャートである。 図１２は、本実施の形態２における電圧印加プロトコルを示すグラフである。 図１３は、本実施の形態２における電圧印加プロトコルの区間１１の一例を示すグラフである。 図１４は、本実施の形態２における電圧印加プロトコルの区間１１の別の例を示すグラフである。

従来の電気化学測定において、生体試料の投入または回収は、測定電圧を印加した状態で行われる。そのため、作用電極には、生体試料の投入および回収に伴う電流ノイズが流れる。生じた電流ノイズは、正確な電気化学測定を妨げる可能性がある。

以下では、本開示の実施の形態に係る電気化学測定方法および電気化学測定装置について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本開示の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置及び接続形態などは、一例であり、本開示を限定する趣旨ではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本開示の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。

また、各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。各図において、実質的に同一の構造については同一の符号を付しており、重複する説明は省略または簡略化している。

（実施の形態１）
図１は、本実施の形態における電気化学測定デバイス１０の斜視図である。図２は、本実施の形態における電気化学測定装置３０の斜視図である。図３は、本実施の形態における電気化学測定デバイス１０の断面模式図である。図３は、図１の線３-３における断面図を示している。図４は、本実施の形態における電気化学測定デバイスの上面模式図である。

電気化学測定デバイス１０は、胚等の細胞または組織などの生体試料１０１の活動状態を測定するためのデバイスである。

電気化学測定デバイス１０は、容器１１と電極チップ１２とを備える。容器１１は、上部容器１１ａと下部容器１１ｂとを有する。

容器１１は、容器１１の内部に実装された電極チップ１２を有する。容器１１は、測定液１０２を溜めるための貯留部１３を有する。貯留部１３の底面には、逆円錐形状のウェル１４が複数設けられている。生体試料１０１は、ウェル１４の内部に配置される。容器
１１は、例えば、樹脂成型等により作製される。

電極チップ１２は、領域１５および作用電極１６を有する。領域１５は、生体試料１０１を配置するための場所である。作用電極１６は、生体試料１０１の電気化学測定に用いられる。

領域１５は、例えば電極チップ１２の上面に設けられる凹部である。なお、領域１５は、電極チップ１２の凹部に限られない。例えば、領域１５は、電極チップ１２の平面の一部であってもよい。

複数の作用電極１６は、領域１５の周囲を取り囲むように設けられている。このような構成にすることにより、領域１５に配置される生体試料１０１と作用電極１６との距離を一定に保つことができる。

なお、作用電極１６は、領域１５の中心からの距離が異なるように、複数個配置されていてもよい。これにより、電気化学測定デバイス１０は、生体試料１０１からの距離の異なる複数の位置で電気化学測定を行うことができる。

電気化学測定デバイス１０において、下部容器１１ｂと、電極チップ１２と、上部容器１１ａが、順に積層されている。ウェル１４の底部には、貫通孔５３が形成されており、貫通孔５３は、上部容器１１ａの下部を貫通している。この構成により、ウェル１４の底部にて、電極チップ１２の作用電極１６が露出している。

容器１１の周囲の段差部分の下面には、接続端子１７が設けられている。接続端子１７は、作用電極１６と電気的に接続されている。接続端子１７は、電気化学測定装置３０などの計測機器に接続される。

容器１１と電極チップ１２との間には、測定液１０２の漏出を抑制するため、シール材１８が設けられている。

なお、作用電極１６は、領域１５の中に設けられていてもよい。また、接続端子１７は、作用電極１６と電気的に接続されていれば、容器１１のどこに形成されていてもよい。

また、電気化学測定デバイス１０において、ウェル１４の底面に形成される貫通孔５３を形成せず、ウェル１４の底面が塞がれた状態でもよい。そして、領域１５および作用電極１６は、電極チップ１２上ではなく、容器１１のウェル１４の底面に直に設けられていてもよい。この場合、電極チップ１２を用いる必要がない。

電気化学測定装置３０は、電気化学測定デバイス１０を用いて、生体試料の電気化学測定を行う。電気化学測定装置３０は、例えば、作用電極１６への電圧の印加や、作用電極１６に流れる電流の測定を行う。

電気化学測定装置３０は、ステージ３１、載置部３２、端子３３、制御部３４およびカバー３５、を有する。

電気化学測定デバイス１０は、ステージ３１上の載置部３２に載置される。載置部３２は、例えば、ステージ３１の上面に設けられる凹部を有する。電気化学測定デバイス１０は、載置部３２の凹部に固定される。

ステージ３１には端子３３が設けられている。端子３３は、電気化学測定デバイス１０
の接続端子１７と接触する。これにより、作用電極１６は、端子３３と電気的に接続される。また、端子３３は、制御部３４と電気的に接続される。

制御部３４は、作用電極に印加する電圧の大きさおよび印加のタイミングを制御する。制御部３４は、電源回路および電圧印加回路などを含む。これにより、制御部３４は、電圧を印加する指令信号の生成や作用電極への電圧の印加を行うことができる。

また、電気化学測定装置３０は、測定部３６および演算部３７を有してもよい。測定部３６は、例えば、印加された電圧により作用電極１６に流れる電流を測定する。演算部３７は、測定した電流値に基づいて、例えば、生体試料１０１の活性度を算出する。

図２に示すように、制御部３４、測定部３６および演算部３７は、それぞれ独立した回路で構成されていてもよい。あるいは、制御部３４と、測定部３６と、演算部３７とは、１つのＩＣで構成されていてもよい。

カバー３５は、生体試料１０１の測定環境を適切な環境に保持するために設けられる。つまり、カバー３５は、外気と隔離された測定環境を形成する。カバー３５を設けることにより、電気化学測定装置３０は、適切な環境で生体試料１０１を測定できる。

カバー３５は、ステージ３１の上方に設けられる。載置部３２に載置される電気化学測定デバイス１０は、カバー３５に完全に覆われる。

ここで、生体試料１０１の測定における適切な環境とは、例えば、３７℃で空気中に５％の二酸化炭素を有する環境である。この環境を維持するために、電気化学測定装置３０は、二酸化炭素を供給する供給口や、温度センサや、ヒーター等を備えていてもよい。

以下、図３、図４を参照して、生体試料１０１を測定する際の電気化学測定デバイス１０の動作を説明する。

生体試料１０１は、例えば、胚である。胚は、未分化および卵割した受精卵を含む。

胚は、周囲の酸素を消費しながら卵胞内部で分割を行っている。電気化学測定装置３０は、作用電極１６を用いて胚周辺に溶存する酸素量を計測できる。そして、計測した酸素量により、胚の酸素消費の活動状態が確認できる。

貯留部１３には、参照電極２３および対極２４が設けられている。

測定液１０２は、作用電極１６と参照電極２３と対極２４に接するように、貯留部１３およびウェル１４内に充填される。

作用電極１６、参照電極２３および対極２４は、電気化学測定装置３０に電気的に接続される。

電気化学測定装置３０の制御部３４および測定部３６は、例えば、ポテンショスタットである。ポテンショスタットは、参照電極２３に対する作用電極１６の電位を一定にする装置である。

生体試料１０１は、電極チップ１２の上面に形成されている領域１５に配置される。

生体試料１０１の周辺に溶存する酸素量を計測する際は、ポテンショスタットを用いて
作用電極１６に酸化還元電位を印加する。これにより、作用電極１６の周辺に溶存する酸素が還元される。酸素が還元されることにより、作用電極１６に電流が流れる。作用電極１６に流れる電流は、ポテンショスタットにより測定される。

作用電極１６に流れる電流値は、作用電極１６の周辺に溶存する酸素量と相関がある。そのため、生体試料１０１の周囲に配置された作用電極１６の電流値を計測することで、生体試料１０１の周辺の物質濃度である溶存酸素濃度（溶存酸素量）を見積もることができる。

なお、対極２４は、設けなくてもよい。すなわち、参照電極２３は、参照電極２３としての役割のほかに、対極２４としての役割を有してもよい。

図５は、本実施の形態における電気化学測定方法のフローチャートである。図６は、作用電極１６に印加される電圧の印加タイミングの一例を示す電圧印加プロトコルである。

以下、図５および図６を参照して、胚等の単一の生体試料１０１の酸素消費量の電気化学測定方法について説明する。ここで、単一の生体試料１０１は、１つの細胞、１つの細胞塊および１つの組織である。測定液１０２中で分散した状態で含まれている複数の細胞は、単一の生体試料１０１に含まない。

電極チップ１２の上面には、領域１５の中心から異なる距離に配置される複数の作用電極１６が設けられている。

本実施の形態における電気化学測定方法は、容器１１に測定液１０２を注入するステップ（Ｓ０１０）と、作用電極１６に測定電圧Ｖｍを印加して、生体試料１０１を投入する前のブランク状態の第一の電流値Ｉ₁を測定するステップ（Ｓ０２０）と、作用電極１６に非測定電圧Ｖｎを印加するステップ（Ｓ０２５）と、生体試料１０１を投入するステップ（Ｓ０３０）と、作用電極１６に測定電圧Ｖｍを印加して、生体試料１０１を投入した後の第二の電流値Ｉ₂を測定するステップ（Ｓ０４０）と、作用電極１６に非測定電圧Ｖｎを印加するステップ（Ｓ０４５）と、生体試料１０１を回収するステップ（Ｓ０５０）と、作用電極１６に測定電圧Ｖｍを印加して、生体試料１０１を回収した後のブランク状態の第三の電流値Ｉ₃を測定するステップ（Ｓ０６０）と、測定した電流値Ｉ₁、Ｉ₂、Ｉ₃から測定液１０２中の物質濃度である溶存酸素濃度（溶存酸素量）を算出するステップ（Ｓ０７０）とからなる。この溶存酸素濃度の変化から、生体試料１０１の活性が計測される。

ステップＳ０１０では、容器１１の貯留部１３及びウェル１４に測定液１０２を注入する。測定液１０２は、作用電極１６、参照電極２３および対極２４と接触している。そして、電気化学測定デバイス１０を電気化学測定装置３０の載置部３２に載置する。このとき、接続端子１７は端子３３と接触している。なお、本実施例においては、作用電極１６および対極２４として、白金電極を用いて説明する。また、参照電極２３として、銀／塩化銀電極を用いて説明する。ただし、電極材料は、これらに限定されるものではない。

ここで、測定液１０２が予め充填された容器１１においては、ステップ（Ｓ０２０）から始めてもよい。

ステップＳ０２０では、作用電極１６に測定電圧Ｖｍを印加して、生体試料１０１を投入する前の第一の電流値Ｉ₁を測定する。測定電圧Ｖｍは、図６に示す区間１で印加される。測定電圧Ｖｍは、酸化還元電位である。本実施の形態において、測定電圧Ｖｍは、例えば−０．６Ｖである。また、区間１は、１２０秒から２４０秒の間の区間である。区間
１は、１０秒間以上、１２０秒間以下であることが好ましい。なお、電気化学測定の測定時間を短くする目的においては、区間１を５秒以上、１０秒以下としてもよい。

区間１の前の区間において、非測定電圧Ｖｎが印加されている。ここで、測定電圧Ｖｍは、測定する際に印加する電圧である。非測定電圧Ｖｎは、電極に電流が流れないように印加する電圧である。

測定電圧Ｖｍが作用電極１６に印加されることにより、作用電極１６の周辺の溶存酸素が還元されるため、作用電極１６に酸素還元電流が流れる。測定部３６は、作用電極１６に流れる第一の電流値Ｉ₁を測定する。

このように、ステップＳ０２０では、生体試料１０１の影響を受けないブランク状態の測定液１０２に含まれる溶存酸素濃度（溶存酸素量）に起因する第一の電流値Ｉ₁を測定できる。

ステップＳ０２５では、作用電極１６に非測定電圧Ｖｎを印加する。そして、ステップＳ０３０では、生体試料１０１を投入する。非測定電圧Ｖｎは、図６に示す区間２で印加される。非測定電圧Ｖｎは、電気化学測定装置３０の開回路電圧である。本実施の形態において、非測定電圧Ｖｎは、例えば、０．２Ｖである。また、区間２は、２４０秒から３６０秒の間の区間である。区間２は、３０秒間以上、１２０秒間以下であることが好ましい。

生体試料１０１は、作用電極１６に非測定電圧Ｖｎが印加された状態で、領域１５に配置される。領域１５には、１つの生体試料１０１が配置される。作用電極１６には電流が流れていないので、生体試料１０１を領域１５に配置する際の電流ノイズを抑えることができる。

また、生体試料１０１が作用電極１６に接触してしまった場合でも、生体試料１０１に電流が流れることはないので、生体試料１０１がダメージを受けるということを防止できる。

ステップＳ０４０では、生体試料１０１を投入した後の第二の電流値Ｉ₂を測定する。

測定電圧Ｖｍは、図６に示す区間３で印加される。測定電圧Ｖｍは、酸化還元電位である。本実施の形態において、測定電圧Ｖｍは、例えば−０．６Ｖである。また、区間３は、３６０秒から４８０秒の間の区間である。区間３は、１０秒間以上、１２０秒間以下であることが好ましい。なお、電気化学測定の測定時間を短くする目的においては、区間１を５秒以上、１０秒以下としてもよい。

このように、ステップＳ０４０では、生体試料１０１の呼吸活動の影響を受ける溶存酸素濃度（溶存酸素量）に起因する第二の電流値Ｉ₂を測定できる。

領域１５に置かれた生体試料１０１は、呼吸活動に伴い、測定液１０２中の周囲の溶存酸素を消費する。そのため、測定液１０２中の生体試料１０１の近傍では、酸素が少ない状態になる。また、測定液１０２中の溶存酸素は、生体試料１０１から遠くなるほど測定液１０２の飽和溶存酸素の状態に近づく。

生体試料１０１の呼吸活動が活発であるほど、生体試料１０１の近傍では酸素が多く消費される。すなわち、生体試料１０１の周辺に形成される酸素濃度勾配の大きさは、生体試料１０１である受精卵の呼吸活動量によって決定される。

ステップＳ０４５では、作用電極１６に非測定電圧Ｖｎを印加する。ステップＳ０５０では、生体試料１０１を回収する。非測定電圧Ｖｎは、図６に示す区間４で印加される。非測定電圧Ｖｎは、電気化学測定デバイス１０に接続された計測機器を含む電気化学測定装置３０全体の開回路電圧である。このとき、電気化学測定デバイス１０には、測定液１０２が充填されている。本実施の形態において、非測定電圧Ｖｎは、例えば、０．２Ｖである。また、区間４は、４８０秒から６００秒の間の区間である。区間４は、３０秒間以上、１２０秒間以下であることが好ましい。

生体試料１０１は、作用電極１６に非測定電圧Ｖｎを印加された状態で、測定液１０２から取り出される。このとき、作用電極１６には電流が流れていないので、生体試料１０１を取り出す際の電流ノイズを抑えることができる。

また、生体試料１０１が作用電極１６に接触してしまった場合でも、生体試料１０１に電流が流れないので、生体試料１０１がダメージを受けるということを防止できる。

ステップＳ０６０では、作用電極１６に測定電圧Ｖｍを印加して、生体試料１０１を回収した後の第三の電流値Ｉ₃を測定する。測定電圧Ｖｍは、図６に示す区間５で印加される。測定電圧Ｖｍは、酸化還元電位である。本実施の形態において、測定電圧Ｖｍは、例えば−０．６Ｖである。また、区間５は、６００秒から７２０秒の間の区間である。区間５は、１０秒間以上、１２０秒間以下であることが好ましい。なお、電気化学測定の測定時間を短くする目的においては、区間１を５秒以上、１０秒以下としてもよい。

測定電圧Ｖｍが作用電極１６に印加されることにより、作用電極１６の周辺の溶存酸素が還元されるため、作用電極１６に酸素還元電流が流れる。測定部３６は、作用電極１６に流れる第三の電流値Ｉ₃を測定する。

このように、ステップＳ０６０では、生体試料１０１の影響を直接受けないブランク状態の測定液１０２に含まれる溶存酸素濃度に起因する第三の電流値Ｉ₃を測定できる。

なお、ステップＳ０２０、ステップＳ０４０およびステップＳ０６０の測定電圧Ｖｍは同じ値であることが好ましい。また、ステップＳ０３０およびステップＳ０５０の非測定電圧Ｖｎは同じ値であることが好ましい。

さらに、区間１、区間３および区間５は、同じ時間であることが好ましい。また区間２および区間４は同じ時間であることが好ましい。

ステップＳ０７０では、測定した第一の電流値Ｉ₁、第二の電流値Ｉ₂および第三の電流値Ｉ₃を用いて、溶存酸素濃度（溶存酸素量）を算出する。

以下では、ステップＳ０４０で計測した第二の電流値Ｉ₂を用いて、ステップＳ０４０における生体試料１０１の周囲の溶存酸素濃度の算出方法について説明する。

まず、（式１）に示すように、各作用電極１６で測定した第一の電流値Ｉ₁で、各作用電極１６の第二の電流値Ｉ₂を割ることにより、各作用電極１６の電流変化率Ｉ^* ₂を求める。

Ｉ^* ₂＝Ｉ₂／Ｉ₁ （式１）
このようにすることで、複数の作用電極１６に流れる第一の電流値Ｉ₁および第二の電流値Ｉ₂の絶対値が異なっても、電流変化率Ｉ^* ₂として規格化できる。

先述のように、ステップＳ０４０では、生体試料１０１の酸素消費に伴い、生体試料１０１の近傍で溶存酸素濃度が低い状態になる。また、生体試料１０１から遠くなるほど、生体試料１０１が測定液１０２中の溶存酸素に及ぼす影響は小さくなる。

よって、ステップＳ０４０では、生体試料１０１の近傍の作用電極１６の電流変化率Ｉ^* ₂は大きくなる。また、生体試料１０１から遠方になるほど、作用電極１６の電流変化率Ｉ^* ₂は小さくなる。

各作用電極１６での電流変化率Ｉ^* ₂は、各作用電極１６の生体試料１０１からの距離に反比例する。

したがって、生体試料１０１からの距離の逆数に対し、各作用電極１６での電流変化率Ｉ^* ₂をプロットして得られる直線の傾きは、生体試料１０１の酸素消費に伴って形成される酸素濃度勾配を示している。

生体試料１０１の酸素消費に伴い形成される酸素濃度勾配は（式２）で表される。

ΔＣ＝Ｃ₀×（Ｉ₁−Ｉ₂）／Ｉ₁×Ｒ／ｒ
＝Ｃ₀×（１−Ｉ^* ₂）×Ｒ／ｒ （式２）
ここで、Ｃ₀はバルクの溶存酸素濃度である。バルクの溶存酸素濃度とは、生体試料１０１を含まない状態の測定液１０２に含まれる溶存酸素濃度のことである。また、ｒは、生体試料１０１の半径である。Ｒは、生体試料１０１の中心から作用電極１６の中心までの距離である。なお、生体試料１０１の中心は、領域１５の中心としてもよい。

胚などの球形の生体試料１０１においては、呼吸活動により、生体試料１０１の中心から球面状に酸素濃度勾配が形成されると考えられる。そのため、球形の生体試料１０１の表面への酸素流束の総和は、Ｆｉｃｋの第一法則に従うので、（式３）で表される。

Ｆ＝４πｒＤΔＣ （式３）
ここで、Ｄは、測定液１０２中の溶存酸素の拡散係数である。

本実施の形態では、生体試料１０１は、領域１５に配置されているので、領域１５の中心から半球面状に拡散していると考えられる。したがって、本実施の形態における生体試料１０１の酸素消費量は（式４）で表される。

Ｆ＝２πｒＤΔＣ （式４）
ステップＳ０２０およびステップＳ０６０での溶存酸素濃度勾配および酸素流束も、上記と同じようにして求められる。すなわち、第一の電流値Ｉ₁、第二の電流値Ｉ₂および第三の電流値Ｉ₃を用いて、各ステップにおける溶存酸素濃度勾配および酸素流速を算出し、ステップＳ０４０の酸素流速の大きさから生体試料１０１の活性が計測される。

なお、実際には、作用電極１６の表面の付着物等により、各作用電極１６に流れる酸素還元電流の値は経時的に減少する。

また、ウェル１４の内部の対流の影響により、ブランク状態においてもウェル１４の内部に酸素流束が形成されている場合がある。

そのため、生体試料１０１の酸素消費量の精度を上げるため、ステップＳ０４０で求めた酸素流束を、ステップＳ０２０およびステップＳ０６０のブランク状態での酸素流束で
補正してもよい。

なお、算出する物質濃度は、溶存酸素濃度に限られない。例えば、物質濃度は、生体試料１０１の活性を示す物質の濃度であってもよい。

また、生体試料１０１の電気化学測定は、本実施の形態における電気化学測定方法の一部のステップにより行ってもよい。例えば、第一と第二の電流値だけ測定してもよく、また第一の電流値は測らずに、第二と第三の電流値を測定してもよい。

前述のように、電気化学測定装置３０の制御部３４は、本実施例における電気化学測定方法を行うために、作用電極１６に測定電圧Ｖｍを印加し、生体試料１０１を投入する前の第一の電流値Ｉ₁を測定するステップと、生体試料１０１を電気化学測定デバイス１０に投入する前のタイミングで、作用電極１６に非測定電圧Ｖｎを印加するステップと、作用電極１６に測定電圧Ｖｍを印加し、生体試料１０１を投入した後の第二の電流値Ｉ₂を測定するステップと、生体試料１０１を電気化学測定デバイス１０から回収する前のタイミングで、作用電極１６に非測定電圧Ｖｎを印加するステップと、作用電極１６に測定電圧を印加し、生体試料１０１を回収した後の第三の電流値Ｉ₃を測定するステップと、を行う。

（変形例１）
図７は、本実施の形態における電圧印加プロトコルの変形例１を示したグラフである。

本変形例は、前述の実施の形態と、区間１、区間３および区間５における測定電圧Ｖｍの印加方法が異なる。

以下、本変形例について説明する。

本変形例において、測定電圧Ｖｍは、パルス状の波形で印加される。すなわち、例えば、ステップＳ０２０の区間１において、測定電圧Ｖｍと非測定電圧Ｖｎとを交互に繰り返すように、作用電極１６に印加する。区間３および区間５においても同じである。各区間において、１パルスにおける測定電圧Ｖｍの印加時間は、１秒以上、１０秒以下であることが好ましい。また、各区間において、少なくとも２回のパルス波形を与える。図７に示す例では、区間１において測定電圧Ｖｍを３回印加している。測定電圧Ｖｍの印加時間は、５秒である。

また、測定電圧Ｖｍの間の非測定電圧Ｖｎの印加時間は、１秒以上、２５秒以下である。

非測定電圧Ｖｎの印加時間は、測定電位Ｖｍの印加時間と等しくてもよい。例えば、測定電位Ｖｍの印加時間を５秒とする場合、非測定電位Ｖｎの印加時間は５秒であってもよい。

なお、区間１、区間３および区間５で印加される電圧の、パルス波形は等しいことが好ましい。つまり、図６に示す電圧波形のパルス幅および周期は等しいことが好ましい。

パルス状の電圧を印加することにより、測定される電流の波形もパルス状の波形となる。このとき、例えば、区間１の最初のパルスで得られた電流値を用いて、他の電流値を規格化してもよい。これにより、規格化された酸素還元電流値を得ることができる。

印加電圧をパルス状にすることで、生体試料１０１が領域１５に配置された状態での電
圧印加の積算時間を短くすることができる。

電圧印加の積算時間を短くすることにより、酸素の還元によって生じる還元物が作用電極１６の表面に蓄積することを抑えることができる。これにより、作用電極１６に流れる電流値の経時的な減少を抑制できる。また、生体試料１０１が還元物によって受けうる影響も小さくすることができる。

（変形例２）
図８は、本変形例における電気化学測定方法のフローチャートである。図９は、本実施の形態における電圧印加プロトコルの変形例２を示したグラフである。

本変形例は、実施の形態と、区間１の前に測定電圧Ｖｍを印加する区間１０がさらに設けられている点で異なる。

以下、本変形例について説明する。

本変形例における電気化学測定方法は、第一の電流値Ｉ₁を測定するステップＳ０２０の前に、作用電極１６に流れる電流値を安定化させるステップＳ０１５を有する。

容器１１に測定液を注入するステップＳ０１０の後に、ステップＳ０１５を行う。

ステップＳ０１５では、作用電極１６に測定電圧Ｖｍを印加する。測定電圧Ｖｍは、区間１０において印加される。

ステップＳ０１５を行った後、ステップＳ０２０以降の測定を順に行う。

区間１０は、作用電極１６が安定化するために必要な時間である。また、作用電極１６に流れる電流の値をモニタリングしながら、測定電圧Ｖｍの印加時間を決定してもよい。

電気化学測定デバイス１０に測定液を注入後、初めて電圧を印加するときには、計測機器や作用電極１６の状態によって大きな過渡電流が流れることがある。

ステップＳ０２０における第一の電流値Ｉ₁を測定する前に、予め測定電圧Ｖｍを印加しておくことで、ステップＳ０２０の測定において、過渡電流の影響を低減することができる。

また、作用電極１６に流れる電流の値は、しばらくの間、作用電極１６に電圧を印加することにより、ある程度電流の値が減少したところで安定化状態となる。このように、作用電極１６の状態を安定化させることができる。

したがって、予め測定電圧Ｖｍを作用電極１６に印加しておくことにより、ステップＳ０２０において計測される第一の電流値Ｉ₁の電流変動を小さくできる。

また、ステップＳ０１５を設けることで、作用電極１６および計測機器の異常を、ステップＳ０２０の測定を行う前に検出できる。そして、異常が発生した場合は、ステップＳ０１５で得られる酸素還元電流を元にエラーを表示器（図示せず）などに表示できる。なお、ステップＳ０１５で作用電極１６に印加する測定電圧Ｖｍは、一定の電圧でも、パルス状の電圧でもよい。

（実施の形態２）
以下、本実施の形態における生体試料１０１の電気化学測定方法について、図面を参照しながら説明する。なお、本実施の形態において、実施の形態１と同様の構成については同一符号を付し、その詳細な説明は省略する。

図１０は、本実施の形態における電気化学測定デバイス５０の上面図である。本実施の形態は、電気化学測定デバイス５０に設けられた複数の生体試料１０１を並列して測定する測定方法を提供する点で、実施の形態１と異なる。

電気化学測定デバイス５０は、貯留部１３に複数のウェル４１、４２、４３、４４を有する。本実施の形態では、ウェル４１、４２、４３、４４を総称してウェル１４とする。ウェル１４の数は、２個以上、６個以下が好ましい。各ウェル１４の下側に、電極チップ１２が配置されている。ウェル４１の内部には、作用電極６１が設けられる。ウェル４２の内部には、作用電極６２が設けられる。ウェル４３の内部には、作用電極６３が設けられる。ウェル４４の内部には、作用電極６４が設けられる。本実施の形態では、作用電極６１、６２、６３、６４を総称して作用電極１６とする。

生体試料１０１は、それぞれのウェル１４内の領域１５に１つずつに配置される。

本実施の形態における、電気化学測定デバイス５０の動作方法は、実施の形態１と同じである。

図１１は、本実施の形態における電気化学測定方法を示すフローチャートである。以下に、本実施の形態２における複数の生体試料１０１の活性状態を測定する方法を示す。

本実施の形態における電気化学測定方法は、容器１１に測定液１０２を注入するステップ（Ｓ１００）と、作用電極１６のそれぞれに測定電圧Ｖｍを印加して、各ウェル１４において生体試料１０１を投入する前のブランク状態の第一の電流値Ｉ_1xを測定するステップ（Ｓ２００）と、作用電極１６のそれぞれに非測定電圧Ｖｎを印加するステップ（Ｓ２５０）と、複数の生体試料１０１を各ウェル１４に１つずつ投入するステップ（Ｓ３００）と、作用電極１６のそれぞれに測定電圧Ｖｍを印加して、各ウェル１４において生体試料１０１を投入した後の第二の電流値Ｉ_2xを測定するステップ（Ｓ４００）と、作用電極１６のそれぞれに非測定電圧Ｖｎを印加するステップ（Ｓ４５０）と、各ウェル１４から生体試料１０１を回収するステップ（Ｓ５００）と、作用電極１６のそれぞれに測定電圧Ｖｍを印加して、各ウェル１４において生体試料１０１を回収した後のブランク状態の第三の電流値Ｉ_3xを測定するステップ（Ｓ６００）と、測定した電流値Ｉ_1x、Ｉ_2x、Ｉ_3xから各ウェル１４の測定液１０２中の物質濃度である溶存酸素濃度（溶存酸素量）を算出するステップ（Ｓ７００）とからなる。この溶存酸素濃度の変化から、生体試料１０１の活性が計測される。

図１２は、本実施の形態における電圧印加プロトコルを示したグラフである。図１３は、図１２における区間１１を拡大して示す図である。

ステップＳ１００では、容器１１に測定液１０２を注入する。

ステップＳ２００では、複数のウェル１４のそれぞれに配置された作用電極１６に順に測定電圧Ｖｍを印加して、生体試料１０１を投入する前の第一の電流値Ｉ_1xを複数のウェル１４のそれぞれの作用電極１６で測定する。ここで、第一の電流値Ｉ_1xは、各ウェル１４におけるそれぞれの電流値を示す。測定電圧Ｖｍは、区間１１において、作用電極１６に印加される。

図１３に示す電圧印加プロトコルは、区間１１において、各ウェル１４の作用電極１６に流れる第一の電流値Ｉ_1xを１回ずつ測定する。

以下、電圧の印加方法について、具体的に説明する。

区間１１は、区間Ａと区間Ｂと区間Ｃと区間Ｄとを有する。

区間Ａでは、複数のウェル１４のうちの１つのウェル４１に配置される作用電極６１に測定電圧Ｖｍを印加する。これにより、ウェル４１内の作用電極６１に流れる第一の電流値Ｉ₁₁を測定する。

区間Ｂでは、複数のウェル１４のうちの１つのウェル４２に配置される作用電極６２に測定電圧Ｖｍを印加する。これにより、ウェル４２内の作用電極６２に流れる第一の電流値Ｉ₁₂を測定する。

区間Ｃでは、複数のウェル１４のうちの１つのウェル４３に配置される作用電極６３に測定電圧Ｖｍを印加する。これにより、ウェル４３内の作用電極６３に流れる第一の電流値Ｉ₁₃を測定する。

区間Ｄでは、複数のウェル１４のうちの１つのウェル４４に配置される作用電極６４に測定電圧Ｖｍを印加する。これにより、ウェル４４内の作用電極６４に流れる第一の電流値Ｉ₁₄を測定する。

それぞれの区間において、作用電極１６に印加する測定電圧Ｖｍは、パルス状の電圧を印加している。なお、それぞれの区間において、作用電極１６に印加する測定電圧Ｖｍは、一定の電圧であってもよい。

このように、測定電圧Ｖｍを印加する作用電極１６を順に切り替えることにより、各作用電極に流れる第一の電流値Ｉ_1xを順に測定できる。

ステップＳ２５０では、作用電極１６のそれぞれに非測定電圧Ｖｎを印加する。そして、ステップＳ３００では、複数の生体試料１０１を複数のウェル１４のそれぞれに１つずつ投入する。非測定電圧Ｖｎは、区間１２において作用電極１６に印加される。

ステップＳ４００では、複数のウェル１６のそれぞれに配置された作用電極１６に順に測定電圧Ｖｍを印加して、生体試料１０１を投入した後の第二の電流値Ｉ_2xを複数のウェル１４のそれぞれの作用電極１６で測定する。ここで、第二の電流値Ｉ_2xは、各ウェル１４におけるそれぞれの電流値を示す。測定電圧Ｖｍは、区間１３において、作用電極１６に印加される。

ステップＳ４００において測定電圧Ｖｍは、ステップＳ２００と同じ電圧印加方法により作用電極１６に印加される。これによりに、第二の電流値Ｉ_2xを測定できる。

ステップＳ４５０では、作用電極１６のそれぞれに非測定電圧Ｖｎを印加する。そして、ステップＳ５００では、複数の生体試料１０１を回収する。非測定電圧Ｖｎは、区間１４において作用電極１６に印加される。

ステップＳ６００では、複数のウェル１４のそれぞれに配置された作用電極１６に順に測定電圧Ｖｍを印加して、生体試料１０１を回収した後の第三の電流値Ｉ_3xを複数のウェル１４のそれぞれの作用電極１６で測定する。ここで、第三の電流値Ｉ_3xは、各ウェル１
４におけるそれぞれの電流値を示す。測定電圧Ｖｍは、区間１５において、作用電極１６に印加される。

ステップＳ６００において測定電圧Ｖｍは、ステップＳ２００と同じ電圧印加方法により作用電極１６に印加される。これによりに、第三の電流値Ｉ_3xを測定できる。

ステップＳ７００では、測定した電流値Ｉ_1x、Ｉ_2x、Ｉ_3xから各ウェル１４の測定液１０２中の溶存酸素濃度（溶存酸素量）を算出する。

図１４は、本実施の形態における、別の電圧印加プロトコルを示したグラフである。

図１４に示すように、ステップＳ２００、ステップＳ４００およびステップＳ６００において、複数のウェル１４のそれぞれに配置された作用電極１６に順に測定電圧Ｖｍを印加する操作を複数回繰り返す。これにより、第一の電流値Ｉ_1x、第二の電流値Ｉ_2xおよび第三の電流値Ｉ_3xを測定する。つまり、各ステップの電流値計測において、区間Ａ〜Ｄが複数回繰り返される。

制御部３４は、各ウェル１４の作用電極１６に印加する測定電圧Ｖｍを、１パルス毎に作用電極１６を切り替えて印加する。このように、１パルス毎にウェルの切り替えを行うことによって、ステップＳ２００、Ｓ６００でのブランク測定およびステップＳ４００での生体試料の活性測定における各ウェル１４の測定の時間間隔を、ほぼ同じにすることができる。なお、１回の操作のそれぞれの区間に作用電極１６に印加される測定電圧Ｖｍは、１パルス分に限らず、複数のパルス波形を有してもよい。

パルス数の総和は、測定する受精卵の個数の倍数とする。

なお、作用電極６１に印加される測定電圧Ｖｍのパルス数およびパルス幅は、他の作用電極６２、６３、６４に印加される測定電圧Ｖｍのパルス数およびパルス幅と等しいことが好ましい。

以上、一つまたは複数の態様に係る電気化学測定方法および電気化学測定装置について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、この実施の形態に限定されるものではない。例えば、電気化学測定方法は、実行されるプログラムであってもよい。

本開示の趣旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を本実施の形態に施したものや、異なる実施の形態における構成要素を組み合わせて構築される形態も、一つまたは複数の態様の範囲内に含まれてもよい。

本開示にかかる電気化学測定方法および電気化学測定装置は、生体試料の投入または回収に伴って生じる電流ノイズを抑制することができる。

本開示の電気化学測定方法および電気化学測定装置は、受精卵や細胞等の生体由来物の活性状態の計測において有用である。

１０，５０ 電気化学測定デバイス
１１ 容器
１１ａ 上部容器
１１ｂ 下部容器
１２ 電極チップ
１３ 貯留部
１４，４１，４２，４３，４４ ウェル
１５ 領域
１６，６１，６２，６３，６４ 作用電極
１７ 接続端子
１８ シール材
２３ 参照電極
２４ 対極
３０ 電気化学測定装置
３１ ステージ
３２ 載置部
３３ 端子
３４ 制御部
３５ カバー
３６ 測定部
３７ 演算部
５３ 貫通孔
１０１ 生体試料
１０２ 測定液

Claims (15)

1. ウェルと、前記ウェル内に設けられた作用電極とを有する電気化学測定デバイスを用いた電気化学測定方法であって、
   前記作用電極に測定電圧を印加して、前記作用電極に流れる第一の電流値を測定するステップと、
   その後、前記作用電極に非測定電圧を印加するステップと、
   その後、前記作用電極に対して前記非測定電圧を印加した状態で、前記ウェル内に生体試料を投入するステップと、
   その後、前記作用電極に前記測定電圧を印加して、前記作用電極に流れる第二の電流値を測定するステップと、
   を備える、電気化学測定方法。
2. 前記第二の電流値を測定するステップの後に、前記作用電極に前記非測定電圧を印加するステップと、
   その後、前記作用電極に対して前記非測定電圧を印加した状態で、前記生体試料を回収するステップと、
   その後、前記作用電極に前記測定電圧を印加して、第三の電流値を測定するステップと、
   をさらに備える、請求項１に記載の電気化学測定方法。
3. 前記非測定電圧は、前記電気化学測定デバイスに接続される電気化学測定装置の開回路電圧である、
   請求項１に記載の電気化学測定方法。
4. 前記作用電極に印加される測定電圧は、パルス状の波形である、
   請求項１に記載の電気化学測定方法。
5. 前記作用電極に測定電圧を印加して前記第一の電流値を測定するステップの前に、前記作用電極に前記測定電圧を印加するステップと、
   をさらに備える、請求項１に記載の電気化学測定方法。
6. 前記第一の電流値と、前記第二の電流値と、前記第三の電流値に基づいて、前記第一の電流値を測定するステップと、前記第二の電流値を測定するステップと、前記第三の電流値を測定するステップのそれぞれにおける前記生体試料の周囲の物質濃度を算出するステップと、
   前記物質濃度の変化量から前記生体試料の活性を計測するステップと、
   をさらに備える、請求項２に記載の電気化学測定方法。
7. 前記物質濃度を算出するステップにおいて、前記第一の電流値および前記第三の電流値を用いて、前記第二の電流値を補正する、
   請求項６に記載の電気化学測定方法。
8. 複数のウェルと、前記複数のウェルのそれぞれに設けられた複数の作用電極とを有する電気化学測定デバイスを用いた電気化学測定方法であって、
   前記複数の作用電極に、順に測定電圧を印加して、前記複数の作用電極のそれぞれに流れる第一の電流値を測定するステップと、
   その後、前記複数の作用電極のそれぞれに、非測定電圧を印加するステップと、
   その後、前記複数の作用電極のそれぞれに対して前記非測定電圧を印加した状態で、前記複数のウェルのそれぞれに複数の生体試料を１つずつ投入するステップと、
   その後、前記複数の作用電極のそれぞれに、順に前記測定電圧を印加して、前記作用電極のそれぞれに流れる第二の電流値を測定するステップと、
   を備える、電気化学測定方法。
9. 前記第二の電流値を測定するステップの後に、前記複数の作用電極のそれぞれに前記非測定電圧を印加するステップと、
   その後、前記複数の作用電極のそれぞれに対して前記非測定電圧を印加した状態で、前記複数の生体試料を回収するステップと、
   その後、前記複数の作用電極に、順に前記測定電圧を印加して、前記作用電極のそれぞれに流れる第三の電流値を測定するステップと、
   をさらに備える、請求項８に記載の電気化学測定方法。
10. 前記第一の電流値と、前記第二の電流値と、前記第三の電流値とを測定するそれぞれのステップにおいて、前記測定電圧は、前記複数のウェルのそれぞれに配置された前記作用電極に１回ずつ印加される、
    請求項９に記載の電気化学測定方法。
11. 前記作用電極に印加される１回の前記測定電圧は、パルス状の測定電圧である、
    請求項１０に記載の電気化学測定方法。
12. 前記第一の電流値と、前記第二の電流値と、前記第三の電流値とを測定するそれぞれのステップにおいて、
    前記複数の作用電極のそれぞれに、順に前記測定電圧を印加する操作を複数回繰り返す、
    請求項９に記載の電気化学測定方法。
13. ウェルと、前記ウェル内に設けられた作用電極とを有する電気化学測定デバイスを用いて、電気化学測定を行う電気化学測定装置であって、
    前記電気化学測定デバイスを載置する載置部と、
    前記電気化学測定デバイスの前記作用電極に電気的に接続される端子と、
    前記作用電極に印加する電圧を制御する制御部と、を備え、
    前記制御部は、
    前記作用電極に測定電圧を印加し、生体試料を投入する前の、前記作用電極に流れる第一の電流値を測定し、
    その後、前記作用電極に非測定電圧を印加し、
    その後、前記生体試料が前記電気化学測定デバイスに投入された後に、前記作用電極に前記測定電圧を印加し、前記作用電極に流れる第二の電流値を測定する、
    電気化学測定装置。
14. 前記制御部は、
    前記第二の電流値を測定した後、前記作用電極に非測定電圧を印加し、
    前記生体試料が前記電気化学測定デバイスから回収された後、前記作用電極に前記測定電圧を印加して、第三の電流値を測定する、
    請求項１３に記載の電気化学測定装置。
15. 前記非測定電圧は、電気化学測定装置の開回路電圧である、
    請求項１３に記載の電気化学測定装置。

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