JP2017090156A - Method and device for determining life and death of mold - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、カビの生死判定方法及びカビの生死判定装置に関する。 The present invention relates to a mold life / death determination method and a mold life / death determination apparatus.
カビ等の微生物を検出する方法はいくつか知られており、中でも、簡便に検出できる方法として微生物の蛍光を測定する方法がある。例えば、特許文献１には、固体又は半固体培地上の微生物を検出及びキャラクタリゼーションする方法であって、（ａ）１以上の微生物コロニーを含むことが既知である又は含む可能性がある固体又は半固体培地を走査して前記培地上のあらゆるコロニーを検出するステップと、（ｂ）前記ステップ（ａ）で検出した１以上のコロニーを解析して、前記コロニー内の微生物の自家蛍光（ＩＦ）測定値特性を生成するステップと、（ｃ）前記自家蛍光（ＩＦ）測定値に基づいて前記コロニー内の前記微生物のキャラクタリゼーションを行うステップとを含むことを特徴とする方法が記載されている。 There are several known methods for detecting microorganisms such as mold, and among them, there is a method for measuring the fluorescence of microorganisms as a method that can be easily detected. For example, Patent Document 1 discloses a method for detecting and characterizing microorganisms on a solid or semi-solid medium, where (a) a solid or a known or possibly containing one or more microbial colonies Scanning a semi-solid medium to detect any colonies on the medium; (b) analyzing one or more colonies detected in the step (a), and autofluorescence (IF) of microorganisms in the colonies A method is described that includes generating a measurement characteristic and (c) characterizing the microorganism in the colony based on the autofluorescence (IF) measurement.
また、特許文献２には、植物体の病原菌感染診断方法であって、検出対象となる病原菌自体及び当該病原菌が分泌する水溶性分泌物質の蛍光スペクトルから１又は複数の励起波長及び蛍光波長を決定するステップと、植物体自体又は植物体に接触する、若しくは接触した物質から選択される被検物質に対して、前記１又は複数の励起波長に対応する励起光を照射し、前記１又は複数の蛍光波長に対応する蛍光を測定するステップと、前記１又は複数の蛍光波長に対応する蛍光が検出された場合に前記病原菌に感染している、又は感染するおそれがあると診断するステップと、を含む、植物体の病原菌感染診断方法が記載されている。 Patent Document 2 discloses a method for diagnosing a plant pathogen infection, and determines one or a plurality of excitation wavelengths and fluorescence wavelengths from the fluorescence spectrum of the pathogen itself to be detected and the water-soluble secretory substance secreted by the pathogen. Irradiating an excitation light corresponding to the one or more excitation wavelengths to a test substance selected from the step of contacting the plant itself or the plant body, or the contacted substance, and the one or more Measuring fluorescence corresponding to the fluorescence wavelength, and diagnosing that the pathogen is infected or likely to be infected when fluorescence corresponding to the one or more fluorescence wavelengths is detected. Including a method for diagnosing pathogen infection of a plant body.
しかしながら、特許文献１及び２に記載の方法は、カビ等の微生物の検出及び同定に関するものであり、カビ等の微生物の生死を判定することはできなかった。一般的に、微生物の中でもカビは菌糸がわずかに残っているだけで再発生してしまうため、特にその生死を判定することが必要である。現状では、カビの生死を簡便に判定する方法がないため、カビを除去するために、例えば、農業分野では農薬が繰り返し使用され、博物館等にある文化財についてはアルコール殺菌が繰り返し行われている。しかしながら、これらの対処法は、農作物の安全性の低下、コストの増加、アルコールによる文化財の変質のリスクの増加等の問題をまねき、好ましくない。 However, the methods described in Patent Documents 1 and 2 relate to the detection and identification of microorganisms such as molds, and cannot determine the viability of microorganisms such as molds. In general, fungi among microorganisms are regenerated only by a small amount of mycelia remaining, so it is particularly necessary to determine whether they are alive or dead. At present, there is no simple method for determining the life and death of mold, so to eliminate mold, for example, agricultural chemicals are repeatedly used in agricultural fields, and alcohol sterilization is repeatedly performed on cultural assets in museums, etc. . However, these countermeasures are not preferable because they lead to problems such as a decrease in the safety of crops, an increase in costs, and an increase in the risk of alteration of cultural properties due to alcohol.
そこで、本発明は、上記事情に鑑み、簡便にカビの生死を判定することができる、生死判定方法及び生死判定装置を提供することを目的とする。 Then, an object of this invention is to provide the life-and-death determination method and the life-and-death determination apparatus which can determine the life and death of mold | fungi simply in view of the said situation.
本発明は、カビの生死判定方法であって、カビに対し、２６０〜３００ｎｍの波長の第一の励起光、及び３２０〜３７０ｎｍの波長の第二の励起光を照射する励起光照射工程と、カビからの３１０〜３８０ｎｍの波長の第一の蛍光及び３９０〜５００ｎｍの波長の第二の蛍光を測定する蛍光測定工程と、第一の蛍光及び第二の蛍光の蛍光強度比に基づき、カビの生死を判定する判定工程と、を備える、方法を提供する。 The present invention is a mold life / death determination method, wherein the mold is irradiated with a first excitation light having a wavelength of 260 to 300 nm and a second excitation light having a wavelength of 320 to 370 nm. Based on the fluorescence measurement step of measuring the first fluorescence having a wavelength of 310 to 380 nm and the second fluorescence having a wavelength of 390 to 500 nm from the mold, and the fluorescence intensity ratio of the first fluorescence and the second fluorescence, And a determination step for determining whether the patient is alive or dead.
本発明は、後述の実施例に記載のとおり、カビには特有の自家蛍光（第一の蛍光と第二の蛍光）があり、培養時間の経過と共に、生きているカビでは、第一の蛍光の蛍光強度の方が第二の蛍光の蛍光強度よりも顕著に増加する傾向があり、死んでいるカビでは、第一の蛍光の蛍光強度がほとんど増加せずに、第二の蛍光の蛍光強度が顕著に増加する傾向があるという、本発明者らが新たに見出した知見に基づいている。この知見に基づき、本発明者らは更に、生きているカビと死んでいるカビでは、第一の蛍光及び第二の蛍光の蛍光強度比に顕著な差があり、この蛍光強度比を指標とすることで、簡便にカビの生死を判定できることを見出した。本発明はこの新規な知見に基づいており、第一の蛍光及び第二の蛍光の蛍光強度比を指標とした判定を行うものであるため、簡便にカビの生死を判定できる。 In the present invention, as described in Examples below, the mold has its own autofluorescence (first fluorescence and second fluorescence). As the culture time elapses, The fluorescence intensity of the second fluorescence tends to increase significantly than the fluorescence intensity of the second fluorescence, and in the mold that is dead, the fluorescence intensity of the second fluorescence is hardly increased, while the fluorescence intensity of the first fluorescence hardly increases. This is based on the knowledge newly found by the present inventors that there is a tendency to increase significantly. Based on this finding, the present inventors further have a significant difference in the fluorescence intensity ratio between the first fluorescence and the second fluorescence between the living mold and the dead mold, and this fluorescence intensity ratio is used as an index. By doing so, it was found that the viability of fungi can be easily determined. Since the present invention is based on this novel finding and makes a determination using the fluorescence intensity ratio of the first fluorescence and the second fluorescence as an index, the viability of the mold can be easily determined.
上記判定工程において、蛍光強度比が式（１）で表される比であり、蛍光強度比が基準値以下のときに、カビが死んでいると判定してもよい。また、上記判定工程では、蛍光強度比が基準値を超える時に、カビが生きていると判定してもよい。
蛍光強度比＝第一の蛍光の蛍光強度／第二の蛍光の蛍光強度・・・（１）
基準値は、測定条件に応じて適切な値を選択すればよい。
In the determination step, the mold may be determined to be dead when the fluorescence intensity ratio is a ratio represented by the formula (1) and the fluorescence intensity ratio is equal to or less than a reference value. In the determination step, it may be determined that the mold is alive when the fluorescence intensity ratio exceeds the reference value.
Fluorescence intensity ratio = fluorescence intensity of the first fluorescence / fluorescence intensity of the second fluorescence (1)
As the reference value, an appropriate value may be selected according to the measurement conditions.
上記方法は、カビが、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属菌、グロメレラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）属菌、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属菌、バーティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属菌及びパッサローラ（Ｐａｓｓａｌｏｒａ）属菌からなる群から選択される１種又は２種以上であってもよい。 In the above method, the mold is selected from the group consisting of the genus Colletotrichum, the genus Glomerella, the Fusarium genus, the Verticillium genus, and the Passalora genus 1 type or 2 types or more may be sufficient.
本発明はまた、カビの生死判定装置であって、カビに対し、２６０〜３００ｎｍの波長の第一の励起光、及び３２０〜３７０ｎｍの波長の第二の励起光を照射する励起光照射手段と、カビからの３１０〜３８０ｎｍの波長の第一の蛍光及び３９０〜５００ｎｍの波長の第二の蛍光を測定する蛍光測定手段と、第一の蛍光及び第二の蛍光の蛍光強度比を算出する算出手段と、を備える、装置を提供する。 The present invention is also a mold life / death determining apparatus, wherein the mold is irradiated with first excitation light having a wavelength of 260 to 300 nm and second excitation light having a wavelength of 320 to 370 nm. , A fluorescence measuring means for measuring the first fluorescence having a wavelength of 310 to 380 nm and the second fluorescence having a wavelength of 390 to 500 nm from the mold, and calculating the fluorescence intensity ratio of the first fluorescence and the second fluorescence Means for providing an apparatus.
上記励起光照射手段が１つ又は複数の光源を含んでいてもよい。 The excitation light irradiation means may include one or a plurality of light sources.
上記蛍光測定手段が１つ又は複数の蛍光測定器を含んでいてもよい。また、上記蛍光測定手段が１次元蛍光測定器及び２次元蛍光測定器のうち少なくとも１種であってもよい。 The fluorescence measuring means may include one or more fluorescence measuring devices. Further, the fluorescence measuring means may be at least one of a one-dimensional fluorescence measuring instrument and a two-dimensional fluorescence measuring instrument.
上記装置は、蛍光強度比が基準値以下のときに前記カビが死んでいると判定する、又は基準値を超えるときに前記カビが生きていると判定する、判定手段を更に備えていてもよい。 The apparatus may further include a determination unit that determines that the mold is dead when the fluorescence intensity ratio is equal to or less than a reference value, or determines that the mold is alive when the ratio exceeds a reference value. .
上記装置は、カビが、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属菌、グロメレラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）属菌、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属菌、バーティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属菌及びパッサローラ（Ｐａｓｓａｌｏｒａ）属菌からなる群から選択される１種又は２種以上であってもよい。 In the above device, the mold is selected from the group consisting of the genus Collototricum, the genus Glomerella, the genus Fusarium, the genus Verticillium, and the genus Passalora. 1 type or 2 types or more may be sufficient.
本発明によれば、簡便にカビの生死を判定することができる、生死判定方法及び生死判定装置を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the life-and-death determination method and the life-and-death determination apparatus which can determine the life and death of mold | fungi simply can be provided.
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, a mode for carrying out the present invention (hereinafter referred to as “the present embodiment”) will be described in detail. The present invention is not limited to the following embodiments.
＜カビの生死判定方法＞
本実施形態の方法は、カビの生死判定方法であって、カビに対し、２６０〜３００ｎｍの波長の第一の励起光、及び３２０〜３７０ｎｍの波長の第二の励起光を照射する励起光照射工程とカビからの３１０〜３８０ｎｍの波長の第一の蛍光及び３９０〜５００ｎｍの波長の第二の蛍光を測定する蛍光測定工程と、第一の蛍光及び第二の蛍光の蛍光強度比に基づき、カビの生死を判定する判定工程と、を備える。
<Method for determining mold life and death>
The method according to the present embodiment is a mold life / death determination method, in which excitation light irradiation is performed to irradiate mold with first excitation light having a wavelength of 260 to 300 nm and second excitation light having a wavelength of 320 to 370 nm. Based on the fluorescence measurement step of measuring the first fluorescence with a wavelength of 310-380 nm and the second fluorescence with a wavelength of 390-500 nm from the process and mold, and the fluorescence intensity ratio of the first fluorescence and the second fluorescence, A determination step of determining whether mold is alive or dead.
本明細書において「生きているカビ」とは、判定に用いたカビを適切な培地上で培養した際に胞子の発芽及び菌糸の伸長による菌集落の拡大がみられるものを指し、「死んでいるカビ」とは、判定に用いたカビを適切な培地上で培養した際に胞子の発芽及び菌糸の伸長による菌集落の拡大がみられないものを指す。 As used herein, “living mold” refers to a mold in which the mold used for the determination is cultured on an appropriate medium, and spore germination and expansion of the fungal colony due to hyphal elongation are observed. "Mold mold" refers to a mold in which the mold used for determination is cultured on an appropriate medium, and no bacterial colonies are expanded due to spore germination and hyphal elongation.
（励起光照射工程）
この工程ではカビに対し、２つの異なる波長の励起光を照射する。第一の励起光は２６０〜３００ｎｍの波長の光である。第一の励起光は、２７０〜３００ｎｍの波長の光であってもよく、２８０〜３００ｎｍの波長の光であってもよく、２９０ｎｍの波長の光であってもよい。
(Excitation light irradiation process)
In this step, the mold is irradiated with two different wavelengths of excitation light. The first excitation light is light having a wavelength of 260 to 300 nm. The first excitation light may be light having a wavelength of 270 to 300 nm, light having a wavelength of 280 to 300 nm, or light having a wavelength of 290 nm.
第二の励起光は３２０〜３７０ｎｍの波長の光である。第二の励起光は、３３０〜３７０ｎｍの波長の光であってもよく、３４０〜３７０ｎｍの波長の光であってもよく、３７０ｎｍの波長の光であってもよい。第一の励起光及び第二の励起光は、それぞれ独立に照射してもよく、同時に照射してもよい。 The second excitation light is light having a wavelength of 320 to 370 nm. The second excitation light may be light having a wavelength of 330 to 370 nm, light having a wavelength of 340 to 370 nm, or light having a wavelength of 370 nm. The first excitation light and the second excitation light may be irradiated independently or simultaneously.
第一の励起光及び第二の励起光は、当該励起光に対応するカビからの蛍光の検出が可能なように照射すればよく、例えば、カビ本体に直接照射してもよい。 What is necessary is just to irradiate the 1st excitation light and the 2nd excitation light so that the fluorescence from the mold | fungi corresponding to the said excitation light can be detected, for example, you may irradiate the mold main body directly.
（蛍光測定工程）
この工程では、カビからの３１０〜３８０ｎｍの波長の第一の蛍光及び３９０〜５００ｎｍの波長の第二の蛍光を測定する。
(Fluorescence measurement process)
In this step, a first fluorescence having a wavelength of 310 to 380 nm and a second fluorescence having a wavelength of 390 to 500 nm from the mold are measured.
第一の蛍光は、第一の励起光によって生じ、３３０〜３４０ｎｍの波長領域に蛍光のピークトップを有する。第一の蛍光の蛍光強度は、生きているカビの数に応じて顕著に変化する傾向にある。 The first fluorescence is generated by the first excitation light, and has a fluorescence peak top in a wavelength region of 330 to 340 nm. The fluorescence intensity of the first fluorescence tends to change significantly depending on the number of living molds.
第二の蛍光は、第二の励起光によって生じ、４２０ｎｍ付近の波長に蛍光のピークトップを有する。第二の蛍光の蛍光強度は、判定に用いるカビの死んでいる総数に応じて顕著に変化する傾向にある。 The second fluorescence is generated by the second excitation light and has a peak peak of fluorescence at a wavelength near 420 nm. The fluorescence intensity of the second fluorescence tends to change significantly depending on the total number of molds used for determination.
励起光照射工程及び蛍光測定工程は、例えば、蛍光分光光度計等により行うことができる。励起光照射工程では、このような機器によって、上述した第一の励起光及び第二の励起光に対応する波長の光を照射することができる。また、蛍光測定工程では、第一の蛍光として、３１０〜３８０ｎｍの波長の光を測定してもよく、３２０〜３７０ｎｍの波長の光を測定してもよく、３２０〜３５０ｎｍの波長の光を測定してもよく、３４０ｎｍの波長の光を測定してもよく、第二の蛍光として、３９０〜５００ｎｍの波長の光を測定してもよく、３９０〜４５０ｎｍの波長の光を測定してもよく、４００〜４５０ｎｍの波長の光を測定してもよく、４２０ｎｍの波長の光を測定してもよい。目的とする励起光及び蛍光を得るために、分光素子等を用いて波長を制御してもよい。 The excitation light irradiation step and the fluorescence measurement step can be performed by, for example, a fluorescence spectrophotometer. In the excitation light irradiation step, light having a wavelength corresponding to the first excitation light and the second excitation light described above can be irradiated by such an apparatus. In the fluorescence measurement step, as the first fluorescence, light having a wavelength of 310 to 380 nm may be measured, light having a wavelength of 320 to 370 nm may be measured, and light having a wavelength of 320 to 350 nm may be measured. Alternatively, light having a wavelength of 340 nm may be measured, light having a wavelength of 390 to 500 nm may be measured as the second fluorescence, and light having a wavelength of 390 to 450 nm may be measured. , Light with a wavelength of 400 to 450 nm may be measured, or light with a wavelength of 420 nm may be measured. In order to obtain target excitation light and fluorescence, the wavelength may be controlled using a spectroscopic element or the like.
（判定工程）
この工程では、蛍光測定工程で測定した、第一の蛍光及び第二の蛍光の蛍光強度比から、カビの生死を判定する。
(Judgment process)
In this step, the viability of the mold is determined from the fluorescence intensity ratio of the first fluorescence and the second fluorescence measured in the fluorescence measurement step.
カビの生死の判定に用いる蛍光強度比は、第一の励起光の波長領域内の励起光による第一の蛍光の波長領域全体の蛍光強度と、第二の励起光の波長領域内の励起光による第二の蛍光の波長領域内全体の蛍光強度との比であってもよく、第一の蛍光の波長領域内の特定の波長の蛍光強度と、第二の蛍光の波長領域内の特定の波長の蛍光強度との比であってもよい。第一の蛍光の波長領域内の特定の波長の蛍光強度と、第二の蛍光の波長領域内の特定の波長の蛍光強度との比を、蛍光強度比として用いる際は、波長領域内において最も蛍光強度が強いとき（ピーク波長）の蛍光強度の値を用いて算出してもよい。 The fluorescence intensity ratio used to determine whether mold is alive or not is determined by the excitation intensity within the wavelength region of the first excitation light and the excitation light within the wavelength region of the second excitation light. May be the ratio of the fluorescence intensity of the entire wavelength in the second fluorescence wavelength region, the fluorescence intensity of the specific wavelength in the wavelength region of the first fluorescence, and the specific fluorescence in the wavelength region of the second fluorescence It may be a ratio of the wavelength to the fluorescence intensity. When the ratio of the fluorescence intensity at a specific wavelength in the wavelength region of the first fluorescence and the fluorescence intensity at a specific wavelength in the wavelength region of the second fluorescence is used as the fluorescence intensity ratio, You may calculate using the value of fluorescence intensity when fluorescence intensity is strong (peak wavelength).
蛍光強度比は、例えば、式（１）で表される比であってもよい。
蛍光強度比＝第一の蛍光の蛍光強度／第二の蛍光の蛍光強度・・・（１）
この蛍光強度比が基準値以下となったときに、判定対象のカビが死んでいると判定してよい。つまり、蛍光強度比が基準値を超える時には、判定対象のカビが生きていると判定してもよい。
The fluorescence intensity ratio may be, for example, a ratio represented by the formula (1).
Fluorescence intensity ratio = fluorescence intensity of the first fluorescence / fluorescence intensity of the second fluorescence (1)
When the fluorescence intensity ratio becomes equal to or less than the reference value, it may be determined that the determination target mold is dead. That is, when the fluorescence intensity ratio exceeds the reference value, it may be determined that the determination target mold is alive.
蛍光強度比は、例えば、式（２）で表される比であってもよい。
蛍光強度比＝第二の蛍光の蛍光強度／第一の蛍光の蛍光強度・・・（２）
この蛍光強度比が基準値以上となったときに、判定対象のカビが死んでいると判定してよい。つまり、蛍光強度比が基準値未満のときには、判定対象のカビが生きていると判定してもよい。
The fluorescence intensity ratio may be, for example, a ratio represented by formula (2).
Fluorescence intensity ratio = fluorescence intensity of the second fluorescence / fluorescence intensity of the first fluorescence (2)
When the fluorescence intensity ratio becomes equal to or higher than the reference value, it may be determined that the determination target mold is dead. That is, when the fluorescence intensity ratio is less than the reference value, it may be determined that the mold to be determined is alive.
以下、式（１）で表される「蛍光強度比」に基づいて詳細に説明する。なお、式（２）で表される「蛍光強度比」についても同様に実施することができる。 Hereinafter, it demonstrates in detail based on "fluorescence intensity ratio" represented by Formula (1). In addition, it can implement similarly about "fluorescence intensity ratio" represented by Formula (2).
基準値は、測定条件に応じて適切な値を選択すればよい。基準値は、例えば、判定対象となるカビにおいて、複数の生きているカビと死んでいるカビの蛍光強度比を測定し、それに基づき予め決定した値とすることができる。この場合、基準値は、生きているカビの蛍光強度比と死んでいるカビの蛍光強度比を区別できる値とすればよい。例えば、基準値は、生きているカビの蛍光強度比の値の９０％の値であってもよく、８０％の値であってもよく、７０％の値であってもよく、６０％の値であってもよく、５０％の値であってもよい。このような基準値の設定であれば、経時的に観察をすることなく、カビの生死を判定することができる。 As the reference value, an appropriate value may be selected according to the measurement conditions. The reference value can be a value determined in advance based on, for example, measuring the fluorescence intensity ratio of a plurality of living molds and dead molds in molds to be determined. In this case, the reference value may be a value that can distinguish the fluorescence intensity ratio of the living mold from the fluorescence intensity ratio of the dead mold. For example, the reference value may be 90% of the value of the fluorescence intensity ratio of living mold, 80%, 70%, 60% The value may be 50%. With such a reference value setting, it is possible to determine whether mold is alive without observing over time.
基準値の一例としては、以下のものが挙げられる。例えば、２９０ｎｍの波長の第一の励起光及び３７０ｎｍの波長の第二の励起光を照射し、第一の蛍光の波長領域から３４０ｎｍの波長の蛍光の蛍光強度と、第二の蛍光の蛍光領域から４２０ｎｍの波長の蛍光の蛍光強度とを選択した場合において、カビを熱処理（例えば、８０℃）した際には、カビが完全に死んでいると判定できる基準値は２．５である。また、同様の波長を用いた場合において、カビをアルコール（例えば、８０％エタノール）で処理した際には、カビが完全に死んでいると判定できる基準値は５である。 Examples of the reference value include the following. For example, the first excitation light having a wavelength of 290 nm and the second excitation light having a wavelength of 370 nm are irradiated, the fluorescence intensity of the fluorescence having a wavelength of 340 nm from the wavelength region of the first fluorescence, and the fluorescence region of the second fluorescence. When the fluorescence intensity of the fluorescence having a wavelength of from 420 to 420 nm is selected, when the mold is heat-treated (for example, 80 ° C.), the reference value for determining that the mold is completely dead is 2.5. Further, when the same wavelength is used, when the mold is treated with alcohol (for example, 80% ethanol), the reference value that can determine that the mold is completely dead is 5.
カビを経時的に観察し、カビの生死を判定する場合、基準値は、検査対象となるカビで前もって決めた値であってもよく、時間を追って複数回で測定する場合は初回に測定した値であってもよく、殺菌処理（熱処理、アルコール処理、薬剤の投与等）をする場合は殺菌処理前に測定した値であってもよく、又はこれらの値の９０％の値であってもよく、８０％の値であってもよく、７０％の値であってもよく、６０％の値であってもよく、５０％の値であってもよい。 When observing mold over time and determining mold viability, the reference value may be a predetermined value for the mold to be inspected, or the first time when measuring multiple times over time It may be a value, and when sterilization treatment (heat treatment, alcohol treatment, drug administration, etc.), it may be a value measured before sterilization treatment, or 90% of these values Alternatively, the value may be 80%, 70%, 60%, or 50%.
（カビ）
本実施形態の方法の判定対象となるカビとしては、糸状菌であれば種類を問わない。カビとしては、例えば、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属菌、グロメレラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）属菌、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属菌、バーティシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属菌及びパッサローラ（Ｐａｓｓａｌｏｒａ）属菌であってもよい。本実施形態の方法において、判定対象となるカビは、１種であってもよいし、２種以上が混在していてもよい。
(Mold)
The mold to be determined by the method of the present embodiment is not limited as long as it is a filamentous fungus. The mold may be, for example, a genus Colletotrichum, a genus Glomerella, a Fusarium genus, a Verticillium genus, or a Passalora genus. In the method of the present embodiment, the mold to be determined may be one type, or two or more types may be mixed.
コレトトリカム属菌としては、例えば、コレトトリカム・フルクチコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ）、コレトトリカム・カーサミ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｒｔｈａｍｉ）、コレトトリカム・シアメンセ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｉａｍｅｎｓｅ）、コレトトリカム・グロエオスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）、コレトトリカム・シモンジ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｉｍｍｏｎｄｓｉｉ）、コレトトリカム・アキュテータム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ａｃｕｔａｔｕｍ）等が挙げられる。 The Colletotrichum genus, for example, Colletotrichum-Furukuchikora (Colletotrichum fructicola), Colletotrichum-Kasami (Colletotrichum carthami), Colletotrichum-Shiamense (Colletotrichum siamense), Colletotrichum Gros Eos polio Lee Death (Colletotrichum gloeosporioides), Colletotrichum-Shimonji (Colletotrichum simmondsii) And Colletotrichum accutum and the like.
グロメレラ属菌としては、例えば、グロメレラ・シングラータ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ）等が挙げられる。 Examples of the genus Glomerella include Glomerella singulata.
フザリウム属菌としては、例えば、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）等が挙げられる。 Examples of the genus Fusarium include Fusarium oxysporum.
バーティシリウム属菌としては、例えば、バーティシリウム・ダーリア（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａ）等が挙げられる。 Examples of Verticillium spp. Include Verticillium dahlia.
パッサローラ属菌としては、例えば、パッサローラ・フルバ（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ）等が挙げられる。 Examples of the genus Passarola include, for example, Passarora fulva.
本実施形態の方法は、カビ本体を直接用いてもよい。何らかの殺菌処理等を施した後、その殺菌効果を確認するために本実施形態の方法を用いる際は、殺菌処理等を施す前に一度蛍光を測定した後、施してから２日間以上経過したカビを用いて再び測定することが好ましく、施してから３日間以上経過したカビを用いて再び測定することがより好ましい。殺菌処理等を施してから上記期間を経過していれば、もしカビが死んでいる場合、その蛍光強度比は生きているカビの蛍光強度比に比べ十分に低くなるため、より正確にカビの生死を判定できる傾向にある。殺菌処理としては、例えば、熱処理、アルコール処理、紫外線照射、防カビ剤、農薬等の薬剤処理等が挙げられる。 The method of the present embodiment may directly use the mold body. When using the method of the present embodiment to confirm the sterilization effect after performing some sterilization treatment, etc., mold is measured after measuring fluorescence once before sterilization treatment, etc. It is preferable to measure again using, and it is more preferable to measure again using a mold that has passed 3 days or more after application. If the above period has elapsed since the sterilization treatment, etc., if the mold is dead, the fluorescence intensity ratio will be sufficiently lower than the fluorescence intensity ratio of the live mold, There is a tendency to be able to judge life and death. Examples of the sterilization treatment include heat treatment, alcohol treatment, ultraviolet irradiation, fungicides, chemical treatment of agricultural chemicals, and the like.
本実施形態の方法によれば、蛍光強度比から、簡便にカビの生死を判定することができる。そのため、本実施形態の方法によれば、例えば、過度の農薬散布による農作物の安全性の低下、コストの上昇、文化財の過度のアルコール殺菌による変質等を防ぐことができる。また、殺菌処理等を施した後、その殺菌効果を確認するために本実施形態の方法を用いることもできる。予め設定していた値を基準値として用いた際には、判定に用いた殺菌処理後のカビの蛍光強度比が基準値を超え、カビが死んでいると判定されない場合であっても、その蛍光強度比から基準値を除した値と、殺菌処理前の生きているカビの蛍光強度比から基準値を除した値とを比較することで、どの程度の割合のカビが死んでいるかを判定することもできる。殺菌処理前に測定した値を基準値として用いた際には、基準値に対する、判定に用いた殺菌処理後のカビの蛍光強度比の割合を求めることで、どの程度の割合のカビが死んでいるかを判定することもできる。 According to the method of the present embodiment, it is possible to easily determine whether mold is alive or not from the fluorescence intensity ratio. Therefore, according to the method of the present embodiment, it is possible to prevent, for example, a decrease in the safety of crops due to excessive spraying of agricultural chemicals, an increase in cost, and alteration of cultural properties due to excessive alcohol sterilization. Moreover, after performing a sterilization process etc., in order to confirm the sterilization effect, the method of this embodiment can also be used. When using a preset value as a reference value, even if the fluorescence intensity ratio of the mold after sterilization treatment used for the determination exceeds the reference value and it is not determined that the mold is dead, By comparing the value obtained by subtracting the reference value from the fluorescence intensity ratio and the value obtained by subtracting the reference value from the fluorescence intensity ratio of living mold before sterilization treatment, it is determined how much mold is dead. You can also When the value measured before the sterilization treatment is used as the reference value, the ratio of the mold's fluorescence intensity ratio after the sterilization treatment used for the determination relative to the reference value is determined. It can also be determined.
＜装置＞
本実施形態の装置は、カビの生死判定装置であって、カビに対し、２６０〜３００ｎｍの波長の第一の励起光、及び３２０〜３７０ｎｍの波長の第二の励起光を照射する励起光照射手段と、カビからの３１０〜３８０ｎｍの波長の第一の蛍光及び３９０〜５００ｎｍの波長の第二の蛍光を測定する蛍光測定手段と、第一の蛍光及び第二の蛍光の蛍光強度比を算出する算出手段と、を備える。
<Device>
The apparatus according to this embodiment is a mold life / death determination apparatus, and irradiates mold with first excitation light having a wavelength of 260 to 300 nm and second excitation light having a wavelength of 320 to 370 nm. Means, fluorescence measurement means for measuring first fluorescence with a wavelength of 310 to 380 nm and second fluorescence with a wavelength of 390 to 500 nm from the mold, and calculating a fluorescence intensity ratio between the first fluorescence and the second fluorescence Calculating means.
（励起光照射手段）
励起光照射手段は、当該励起光に対応するカビからの蛍光の検出が可能なように照射すればよく、例えば、カビ本体に直接励起光を照射してもよい。励起光照射手段は、２６０〜３００ｎｍの波長の第一の励起光、及び３２０〜３７０ｎｍの波長の第二の励起光を照射できる光源である。このような光源としては、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザー半導体（ＬＤ）、固体レーザー、液体レーザー、ガスレーザー、自由電子レーザー、化学レーザー等のレーザー、水銀ランプ、キセノンランプ、メタルハライドランプ、ナトリウムランプ、重水素ランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯であってもよく、中でも、水銀ランプ、重水素ランプ、キセノンランプ並びに半導体光源であるＬＥＤ及びＬＤであってもよい。励起光照射手段は１つの光源であってもよく、複数の光源であってもよい。第一の励起光及び第二の励起光の波長は、上述した波長を用いてもよい。
(Excitation light irradiation means)
The excitation light irradiating means may be irradiated so that fluorescence from the mold corresponding to the excitation light can be detected. For example, the mold main body may be directly irradiated with the excitation light. The excitation light irradiation means is a light source that can irradiate first excitation light having a wavelength of 260 to 300 nm and second excitation light having a wavelength of 320 to 370 nm. Examples of such light sources include light-emitting diodes (LEDs), laser semiconductors (LDs), solid-state lasers, liquid lasers, gas lasers, free electron lasers, chemical lasers, lasers such as mercury lamps, xenon lamps, metal halide lamps, and sodium. A lamp, a deuterium lamp, a halogen lamp, or a fluorescent lamp may be used. Among them, a mercury lamp, a deuterium lamp, a xenon lamp, and a semiconductor light source LED and LD may be used. The excitation light irradiation means may be a single light source or a plurality of light sources. The wavelengths described above may be used as the wavelengths of the first excitation light and the second excitation light.
励起光照射手段は、第一の励起光及び第二の励起光を得るために、分光素子を設けてもよい。分光素子としては、例えば、バンドパスフィルター、長波長カットフィルター、短波長カットフィルター等が挙げられる。 The excitation light irradiation means may be provided with a spectroscopic element in order to obtain the first excitation light and the second excitation light. Examples of the spectroscopic element include a band pass filter, a long wavelength cut filter, and a short wavelength cut filter.
（蛍光測定手段）
蛍光測定手段は、カビからの蛍光を測定する。蛍光測定手段は、３１０〜３８０ｎｍの波長の第一の蛍光及び３９０〜５００ｎｍの波長の第二の蛍光を測定できる測定器である。測定する蛍光の波長領域は、上述の蛍光測定工程で記載した値を用いてもよい。このような測定器としては、例えば、ラインセンサー型のＣＣＤ、ラインセンサー型のＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）、フォトダイオードアレイや、スポット型測定器であるフォトダイオード、ＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ Ｔｕｂｅ、光電子増倍管）等の１次元蛍光測定器、又は、２次元ＣＣＤ、２次元ＣＭＯＳ等の２次元蛍光測定器等を挙げることができる。１次元蛍光測定器では、測定した蛍光の蛍光強度をそのまま数値として測定することができる。２次元蛍光測定器では、測定した蛍光の蛍光強度を画像として確認することができる。また、２次元蛍光測定器を用いた場合でも、画像の画素から蛍光強度を数値として測定することができる。１次元蛍光測定器を用いた場合、装置の構成が簡単になるという利点があり、２次元蛍光測定器を用いた場合、蛍光を視覚的に確認できるという利点がある。１次元蛍光測定器を用いる場合であっても、ラインセンサー型ＣＣＤ又はラインセンサー型ＣＭＯＳを用いてスキャンしたり、ＰＭＴ等のスポット型測定器を用いてスキャンしたりすることによって、カビからの蛍光を２次元で測定することは可能である。蛍光測定手段は、１つの蛍光測定器であってもよく、複数の蛍光測定器であってもよい。
(Fluorescence measuring means)
The fluorescence measuring means measures fluorescence from the mold. The fluorescence measuring means is a measuring instrument capable of measuring the first fluorescence having a wavelength of 310 to 380 nm and the second fluorescence having a wavelength of 390 to 500 nm. As the fluorescence wavelength region to be measured, the values described in the fluorescence measurement step described above may be used. Examples of such a measuring device include a line sensor type CCD, a line sensor type CMOS (Complementary Metal Oxide Semiconductor), a photodiode array, a photodiode that is a spot type measuring device, a PMT (Photomultiplier Tube), and a photomultiplier. Tube)) or a two-dimensional fluorescence measuring instrument such as a two-dimensional CCD or two-dimensional CMOS. In the one-dimensional fluorescence measuring instrument, the fluorescence intensity of the measured fluorescence can be measured as it is as a numerical value. In the two-dimensional fluorescence measuring device, the fluorescence intensity of the measured fluorescence can be confirmed as an image. Even when a two-dimensional fluorescence measuring device is used, the fluorescence intensity can be measured as a numerical value from the pixels of the image. When a one-dimensional fluorescence measuring device is used, there is an advantage that the configuration of the apparatus is simplified, and when a two-dimensional fluorescence measuring device is used, there is an advantage that fluorescence can be visually confirmed. Even when a one-dimensional fluorescence measuring instrument is used, fluorescence from molds is scanned by scanning using a line sensor type CCD or line sensor type CMOS, or by using a spot type measuring instrument such as PMT. Can be measured in two dimensions. The fluorescence measuring means may be one fluorescence measuring device or a plurality of fluorescence measuring devices.
蛍光測定手段は、第一の蛍光及び第二の蛍光を得るために、分光素子を設けてもよい。分光素子としては、例えば、バンドパスフィルター、長波長カットフィルター、短波長カットフィルター、波長成分を分離する分光器等が挙げられる。 The fluorescence measuring means may be provided with a spectroscopic element in order to obtain the first fluorescence and the second fluorescence. Examples of the spectroscopic element include a band pass filter, a long wavelength cut filter, a short wavelength cut filter, a spectroscope that separates wavelength components, and the like.
（算出手段）
算出手段は、上述した方法によって、蛍光強度比を算出するアルゴリズムを有している。算出手段は、蛍光強度比を算出する。また、カビの生死は、算出手段により算出される蛍光強度比に基づいて、判定することができる。蛍光強度比の算出方法及びカビの生死の判定方法は、上述した方法を用いることができる。算出手段としては、例えば、パーソナルコンピューター等が挙げられる。
(Calculation means)
The calculating means has an algorithm for calculating the fluorescence intensity ratio by the method described above. The calculating means calculates the fluorescence intensity ratio. Moreover, the life or death of mold can be determined based on the fluorescence intensity ratio calculated by the calculation means. The method described above can be used as the method for calculating the fluorescence intensity ratio and the method for determining whether mold is alive or dead. Examples of the calculation means include a personal computer.
（判定手段）
本実施形態の装置は、判定手段を更に備えていてもよい。判定手段は、算出手段で算出した蛍光強度比に基づいて、この蛍光強度比が基準値以下のときにカビが死んでいると判定し、基準値を超えるときにカビが生きていると判定することができる。カビの生死の判定は、上述した方法を用いることができる。基準値は、上述したとおり、測定条件に応じて適切な値を選択すればよい。判定手段としては、例えば、パーソナルコンピューター等が挙げられる。
(Judgment means)
The apparatus of this embodiment may further include a determination unit. Based on the fluorescence intensity ratio calculated by the calculation means, the determination means determines that the mold is dead when the fluorescence intensity ratio is less than or equal to the reference value, and determines that the mold is alive when the fluorescence intensity ratio exceeds the reference value. be able to. The method described above can be used to determine whether mold is alive or dead. As described above, an appropriate value may be selected as the reference value according to the measurement conditions. Examples of the determining means include a personal computer.
（表示手段）
本実施形態の装置は、算出手段により算出された第一の蛍光及び第二の蛍光の蛍光強度比を示す表示手段を更に備えてもよい。また、表示手段は、判定手段によりカビの生死を判定している場合は、その判定結果を更に示してもよい。表示手段としては、例えば、モニター等が挙げられる。
(Display means)
The apparatus of this embodiment may further include a display unit that indicates a fluorescence intensity ratio between the first fluorescence and the second fluorescence calculated by the calculation unit. Moreover, the display means may further indicate the determination result when the determination means determines the life or death of the mold. Examples of the display means include a monitor.
（カビ）
本実施形態の装置に供するカビは、カビ本体を直接用いてもよい。何らかの殺菌処理等を施した後、その殺菌効果を確認するために本実施形態の方法を用いる際は、殺菌処理等を施す直前及び施してから２日間以上、好ましくは３日間以上経過したカビを用いて測定し、得られた蛍光強度比を比較することが好ましい。殺菌処理等を施してから上記期間を経過したカビであれば、死んでいるカビの蛍光強度比は、生きているカビの蛍光強度比に比べ、十分に小さくなるため、より正確にカビの生死を判定できる傾向にある。カビの種類は、上述したものを用いることができる。
(Mold)
The mold provided to the apparatus of the present embodiment may directly use the mold body. When using the method of the present embodiment to confirm the sterilization effect after performing some sterilization treatment, etc., molds that have passed 2 days or more, preferably 3 days or more immediately before and after sterilization treatment, etc. It is preferable to compare the obtained fluorescence intensity ratios. If the mold has passed the above period after sterilization, the fluorescence intensity ratio of the dead mold is sufficiently smaller than the fluorescence intensity ratio of the living mold. It tends to be able to judge. As the mold type, those described above can be used.
本実施形態の装置について、以下、図面を参照しながら好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は省略する。また、図面の寸法比率は、図示の比率に限られるものではない。 Hereinafter, preferred embodiments of the apparatus of the present embodiment will be described in detail with reference to the drawings. In the drawings, the same or corresponding parts are denoted by the same reference numerals, and redundant description is omitted. Further, the dimensional ratios in the drawings are not limited to the illustrated ratios.
図１に示す装置１００は、各種構成要素を制御するコントローラ１から構成される算出手段と、測定結果を表示するモニター２から構成される表示手段と、励起光を照射する光源３、励起光用の分光フィルター５ａ及び５ｂを備える励起光用フィルター交換装置７、並びに集光レンズ９ａから構成される励起光照射手段と、蛍光測定器４、蛍光用の分光フィルター６ａ及び６ｂを備える蛍光用フィルター交換装置８、並びに集光レンズ９ｂから構成される蛍光測定手段とを備える。分光フィルター５ａは第一の励起光の波長の光を、分光フィルター５ｂは第二の励起光の波長の光を通すフィルターである。分光フィルター６ａは第一の蛍光の波長の光を、分光フィルター６ｂは第二の蛍光の波長の光を通すフィルターである。 An apparatus 100 shown in FIG. 1 includes a calculation unit including a controller 1 that controls various components, a display unit including a monitor 2 that displays measurement results, a light source 3 that emits excitation light, and an excitation light source. Excitation light filter exchange device 7 provided with the above-mentioned spectral filters 5a and 5b, and excitation light irradiation means comprising a condenser lens 9a, a fluorescence measuring instrument 4, and a fluorescence filter exchange comprising fluorescence spectral filters 6a and 6b The apparatus 8 and the fluorescence measurement means comprised from the condensing lens 9b are provided. The spectral filter 5a is a filter that passes light having the wavelength of the first excitation light, and the spectral filter 5b is a filter that passes light having the wavelength of the second excitation light. The spectral filter 6a is a filter that transmits light having the first fluorescence wavelength, and the spectral filter 6b is a filter that transmits light having the second fluorescence wavelength.
以下、図１に示す装置１００の使用例を示す。光源３からの励起光１０は励起光用フィルター交換装置７の分光フィルター５ａに入り、第一の励起光に対応する波長の光を透過させる。励起光１０を集光レンズ９ａにより希望するサイズの光束にしてカビ１２に照射し、カビ１２を励起する。カビ１２からの蛍光１１を集光レンズ９ｂで集めて、蛍光用フィルター交換装置８の分光フィルター６ａに入れ、第一の蛍光に対応する波長の光を選別して透過させ、蛍光測定器４で蛍光を測定し、その蛍光強度を測る。次に、分光フィルター５ａ及び６ａを、それぞれ分光フィルター５ｂ及び６ｂに交換し、第一の蛍光の蛍光強度を測るのと同じ操作をして、第二の蛍光の蛍光強度を測る。蛍光測定器４で測った第一の蛍光及び第二の蛍光の蛍光強度をコントローラ１に送る。コントローラ１は受信値を２つに分けて記録する。分離のタイミングは分光フィルターの切り替えタイミングと同調させる。コントローラ１は分光フィルターの切り替えごとに受信情報を積分し、２種類の蛍光強度の測定値として経時的に記録し、モニター２に表示する。また、コントローラ１は記録した数字を累積して、それぞれの値を記録し、モニター２に表示する。検査者は表示された蛍光強度の比の値を比較して、カビの生死を判断することができる。 Hereinafter, usage examples of the apparatus 100 shown in FIG. 1 will be described. Excitation light 10 from the light source 3 enters the spectral filter 5a of the excitation light filter exchange device 7 and transmits light having a wavelength corresponding to the first excitation light. The mold 12 is irradiated with the excitation light 10 as a light beam having a desired size by the condenser lens 9a to excite the mold 12. The fluorescence 11 from the mold 12 is collected by the condensing lens 9b, put into the spectral filter 6a of the filter exchange device 8 for fluorescence, and the light having the wavelength corresponding to the first fluorescence is selected and transmitted. Measure fluorescence and measure the fluorescence intensity. Next, the spectral filters 5a and 6a are replaced with spectral filters 5b and 6b, respectively, and the fluorescence intensity of the second fluorescence is measured by performing the same operation as measuring the fluorescence intensity of the first fluorescence. The fluorescence intensity of the first fluorescence and the second fluorescence measured by the fluorescence measuring instrument 4 is sent to the controller 1. The controller 1 records the received value in two parts. The separation timing is synchronized with the switching timing of the spectral filter. The controller 1 integrates the received information every time the spectral filter is switched, records the measured values of two types of fluorescence intensity over time, and displays them on the monitor 2. Further, the controller 1 accumulates the recorded numbers, records each value, and displays it on the monitor 2. The examiner can determine whether the mold is alive or not by comparing the displayed ratio values of the fluorescence intensity.
図１に示す装置１００によれば、波長の異なる２種類の励起光を回転するフィルターで分離して交互に試料に当て、それぞれの蛍光を回転フィルターで分離して交互に測定することができる。 According to the apparatus 100 shown in FIG. 1, two types of excitation light having different wavelengths can be separated by a rotating filter and alternately applied to a sample, and each fluorescence can be separated by a rotating filter and measured alternately.
図２に示す装置２００は、各種構成要素を制御するコントローラ１から構成される算出手段と、測定結果を表示するモニター２から構成される表示手段と、励起光を照射する光源３ａ及び３ｂ、励起光用の分光フィルター５ａ及び５ｂ、並びに集光レンズ９ａ及び９ｃから構成される励起光照射手段と、蛍光測定器４ａ及び４ｂ、蛍光用の分光フィルター６ａ及び６ｂ、並びに集光レンズ９ｂ及び９ｄから構成される蛍光測定手段とを備える。分光フィルター５ａは第一の励起光の波長の光を、分光フィルター５ｂは第二の励起光の波長の光を通すフィルターである。分光フィルター６ａは第一の蛍光の波長の光を、分光フィルター６ｂは第二の蛍光の波長の光を通すフィルターである。 An apparatus 200 shown in FIG. 2 includes a calculation unit configured by a controller 1 that controls various components, a display unit configured by a monitor 2 that displays measurement results, light sources 3a and 3b that emit excitation light, and excitation. Excitation light irradiation means composed of light spectral filters 5a and 5b and condenser lenses 9a and 9c, fluorescence measuring instruments 4a and 4b, fluorescent spectral filters 6a and 6b, and condenser lenses 9b and 9d And configured fluorescence measuring means. The spectral filter 5a is a filter that passes light having the wavelength of the first excitation light, and the spectral filter 5b is a filter that passes light having the wavelength of the second excitation light. The spectral filter 6a is a filter that transmits light having the first fluorescence wavelength, and the spectral filter 6b is a filter that transmits light having the second fluorescence wavelength.
以下、図２に示す装置２００の使用例を示す。光源３ａからの励起光１０ａを分光フィルター５ａで第一の励起光に対応する波長の光に選別して集光レンズ９ａに入れ、希望するサイズの光束にして励起光１０ａとしてカビ１２に当てる。カビ１２からの蛍光１１ａを集光レンズ９ｂで集め、分光フィルター６ａで第一の蛍光に対応する波長の光を選別して透過させ、蛍光測定器４ａで測定し、第一の蛍光の蛍光強度を測る。他方、光源３ｂからの励起光１０ｂを分光フィルター５ｂで第二の励起光に対応する波長の光に選別して集光レンズ９ｃに入れ、希望するサイズの光束にして励起光１０ｂとしてカビ１２に当てる。カビ１２からの蛍光１１ｂを集光レンズ９ｄで集め、分光フィルター６ｂで第二の蛍光に対応する波長の光を選別して透過させ、蛍光測定器４ｂで測定し、第二の蛍光の蛍光強度を測る。２つの蛍光測定器４ａ及び４ｂで測定した蛍光１１ａ及び１１ｂの蛍光強度をコントローラ１に伝えて、それぞれの蛍光の蛍光強度の値及び比をモニター２で表示する。検査者は表示された蛍光強度の比の値を比較して、カビの生死を判断することができる。 Hereinafter, a usage example of the apparatus 200 illustrated in FIG. 2 will be described. The excitation light 10a from the light source 3a is selected into light having a wavelength corresponding to the first excitation light by the spectral filter 5a, put into the condensing lens 9a, and applied to the mold 12 as the excitation light 10a as a light beam having a desired size. The fluorescence 11a from the mold 12 is collected by the condensing lens 9b, light having a wavelength corresponding to the first fluorescence is selected and transmitted by the spectral filter 6a, measured by the fluorescence measuring instrument 4a, and the fluorescence intensity of the first fluorescence. Measure. On the other hand, the excitation light 10b from the light source 3b is sorted into light having a wavelength corresponding to the second excitation light by the spectral filter 5b and put into the condensing lens 9c to be converted into a light beam having a desired size and to the mold 12 as the excitation light 10b. Hit it. The fluorescence 11b from the mold 12 is collected by the condensing lens 9d, light having a wavelength corresponding to the second fluorescence is selected and transmitted by the spectral filter 6b, measured by the fluorescence measuring instrument 4b, and the fluorescence intensity of the second fluorescence. Measure. The fluorescence intensities of the fluorescence 11a and 11b measured by the two fluorescence measuring devices 4a and 4b are transmitted to the controller 1, and the values and ratios of the respective fluorescence intensities are displayed on the monitor 2. The examiner can determine whether the mold is alive or not by comparing the displayed ratio values of the fluorescence intensity.
図２に示す装置２００によれば、波長の異なる二つの光源からの二つの励起光路と、二つの蛍光光路とを通る波長の異なる二つの蛍光を二つの光測定器で測定できる。そのため、装置２００は、第一の蛍光及び第二の蛍光の蛍光強度を同時に取得することができる。 According to the apparatus 200 shown in FIG. 2, two excitation light paths from two light sources having different wavelengths and two fluorescences having different wavelengths passing through the two fluorescence light paths can be measured by two light measuring devices. Therefore, the apparatus 200 can acquire the fluorescence intensity of the first fluorescence and the second fluorescence at the same time.
図３に示す装置３００は、各種構成要素を制御するコントローラ１から構成される算出手段と、測定結果を表示するモニター２から構成される表示手段と、励起光を照射する光源３ａ及び３ｂと、励起光用の分光フィルター５ａ及び５ｂ、集光レンズ９ａ及び９ｃ、ミラー１３ａ及び１３ｂ、並びにダイクロイックミラー１４ａ及び１４ｂから構成される励起光照射手段と、蛍光測定器４ａ及び４ｂ、蛍光用の分光フィルター６ａ及び６ｂ、並びに集光レンズ９ｂ及び９ｄから構成される蛍光測定手段と、対物レンズ系１５と、を備える。分光フィルター５ａは第一の励起光の波長の光を、分光フィルター５ｂは第二の励起光の波長の光を通すフィルターである。分光フィルター６ａは第一の蛍光の波長の光を、分光フィルター６ｂは第二の蛍光の波長の光を通すフィルターである。 An apparatus 300 shown in FIG. 3 includes a calculation unit including a controller 1 that controls various components, a display unit including a monitor 2 that displays measurement results, light sources 3a and 3b that emit excitation light, Excitation light radiating means composed of excitation light spectral filters 5a and 5b, condenser lenses 9a and 9c, mirrors 13a and 13b, and dichroic mirrors 14a and 14b, fluorescence measuring instruments 4a and 4b, fluorescence spectral filters 6a and 6b, and a fluorescence measuring means including condenser lenses 9b and 9d, and an objective lens system 15. The spectral filter 5a is a filter that passes light having the wavelength of the first excitation light, and the spectral filter 5b is a filter that passes light having the wavelength of the second excitation light. The spectral filter 6a is a filter that transmits light having the first fluorescence wavelength, and the spectral filter 6b is a filter that transmits light having the second fluorescence wavelength.
以下、図３に示す装置３００の使用例を示す。光源３ａからの励起光１０ａを分光フィルター５ａで第一の励起光に対応する波長の光に選別して集光レンズ９ａに入れ、希望するサイズの光束にした励起光１０ａをミラー１３ａ及びダイクロイックミラー１４ａで反射し、その後、対物レンズ系１５を介してカビ１２に当てる。カビ１２からの蛍光１１ａを集光レンズ９ｂで集め、分光フィルター６ａで第一の蛍光に対応する波長の光を選別して透過させ、蛍光測定器４ａで測定し、第一の蛍光の蛍光強度を測る。他方、光源３ｂからの励起光１０ｂを分光フィルター５ｂで第二の励起光に対応する波長の光に選別して集光レンズ９ｃに入れ、希望するサイズの光束にして励起光１０ｂをミラー１３ｂ及びダイクロイックミラー１４ｂで反射し、その後、対物レンズ系１５を介してカビ１２に当てる。カビ１２からの蛍光１１ｂを集光レンズ９ｄで集め、分光フィルター６ｂで第二の蛍光に対応する波長の光を選別して透過させ、蛍光測定器４ｂで測定し、第二の蛍光の蛍光強度を測る。２つの蛍光測定器４ａ及び４ｂで測定した蛍光１１ａ及び１１ｂの蛍光強度をコントローラ１に伝えて、それぞれの蛍光の蛍光強度の値及び比をモニター２で表示する。検査者は表示された蛍光強度の比の値を比較して、カビの生死を判断することができる。 Hereinafter, usage examples of the apparatus 300 illustrated in FIG. 3 will be described. The excitation light 10a from the light source 3a is selected into light having a wavelength corresponding to the first excitation light by the spectral filter 5a and is put into the condenser lens 9a, and the excitation light 10a having a desired size is converted into the mirror 13a and the dichroic mirror. Then, the light is reflected by 14 a and then applied to the mold 12 through the objective lens system 15. The fluorescence 11a from the mold 12 is collected by the condensing lens 9b, light having a wavelength corresponding to the first fluorescence is selected and transmitted by the spectral filter 6a, measured by the fluorescence measuring instrument 4a, and the fluorescence intensity of the first fluorescence. Measure. On the other hand, the excitation light 10b from the light source 3b is selected into light having a wavelength corresponding to the second excitation light by the spectral filter 5b, and is put into the condensing lens 9c to be converted into a light beam of a desired size, and the excitation light 10b is converted into the mirror 13b and The light is reflected by the dichroic mirror 14 b and then applied to the mold 12 via the objective lens system 15. The fluorescence 11b from the mold 12 is collected by the condensing lens 9d, light having a wavelength corresponding to the second fluorescence is selected and transmitted by the spectral filter 6b, measured by the fluorescence measuring instrument 4b, and the fluorescence intensity of the second fluorescence. Measure. The fluorescence intensities of the fluorescence 11a and 11b measured by the two fluorescence measuring devices 4a and 4b are transmitted to the controller 1, and the values and ratios of the respective fluorescence intensities are displayed on the monitor 2. The examiner can determine whether the mold is alive or not by comparing the displayed ratio values of the fluorescence intensity.
図３に示す装置３００によれば、波長の異なる二つの光源からの二つの励起光路と、二つの蛍光光路とを通る波長の異なる二つの蛍光を二つの光測定器で測定できる。そのため、装置３００は、第一の蛍光及び第二の蛍光の蛍光強度を同時に取得することができる。 According to the apparatus 300 shown in FIG. 3, two excitation light paths from two light sources having different wavelengths and two fluorescences having different wavelengths passing through the two fluorescence light paths can be measured by two light measuring devices. Therefore, the apparatus 300 can acquire the fluorescence intensity of the first fluorescence and the second fluorescence at the same time.
図４に示す装置４００は、各種構成要素を制御するコントローラ１から構成される算出手段と、測定結果を表示するモニター２から構成される表示手段と、励起光を照射する光源３、励起光用の分光フィルター５、及び集光レンズ９ａから構成される励起光照射手段と、スペクトル測定用の蛍光測定器４、波長成分を分離する分光器１６、及び集光レンズ９ｂから構成される蛍光測定手段とを備える。分光フィルター５は第一の励起光及び第二の励起光の波長の光を通すフィルターである。分光器１６は、カビより生じた蛍光を、第一の蛍光及び第二の蛍光の波長を含む、様々な波長成分に分離する。 An apparatus 400 shown in FIG. 4 includes a calculation unit including a controller 1 that controls various components, a display unit including a monitor 2 that displays measurement results, a light source 3 that emits excitation light, and an excitation light source. Excitation light irradiating means comprising the spectral filter 5 and the condenser lens 9a, a fluorescence measuring instrument 4 for measuring the spectrum, a spectrometer 16 for separating the wavelength components, and a fluorescence measuring means comprising the condenser lens 9b. With. The spectral filter 5 is a filter that transmits light having the wavelengths of the first excitation light and the second excitation light. The spectroscope 16 separates the fluorescence generated from the mold into various wavelength components including the wavelengths of the first fluorescence and the second fluorescence.
以下、図４に示す装置４００の使用例を示す。光源３から照射される、第一の励起光及び第二の励起光の波長域を含む励起光１０は、分光フィルター５により、範囲外の波長が除去される。その後、励起光１０は、集光レンズ９ａによって希望するサイズの光束に調整され、カビ１２に当てられる。カビ１２からの蛍光１１は集光レンズ９ｂによって集められ、分光器１６に入って波長成分に空間分離されてスペクトル１７となり、分光器１６から出る。スペクトル１７の各成分はスペクトル測定用の蛍光測定器４によって測定され、その蛍光強度が測定される。光源３及び蛍光測定器４は、コントローラ１によってどちらか片方だけがオン状態となるように調節される。この調節により励起光１０及び蛍光１１は時間的に分離される。また、蛍光測定を効率よく行うために、光源３がスイッチオフになってから蛍光測定器４がオンになるまでの時間間隔は、コントローラ１により指定される。蛍光測定器４で得られた測定データはコントローラ１に伝えられ、コントローラ１はそのデータを基にして第一の蛍光及び第二の蛍光の成分を分離してそれぞれ積分する。第一の蛍光及び第二の蛍光の蛍光強度とその比がモニター２に表示される。 Hereinafter, usage examples of the apparatus 400 illustrated in FIG. 4 will be described. The excitation light 10 that includes the wavelength ranges of the first excitation light and the second excitation light emitted from the light source 3 is removed by the spectral filter 5 from wavelengths outside the range. Thereafter, the excitation light 10 is adjusted to a light beam of a desired size by the condenser lens 9 a and applied to the mold 12. The fluorescence 11 from the mold 12 is collected by the condenser lens 9 b, enters the spectrometer 16, is spatially separated into wavelength components, becomes a spectrum 17, and exits the spectrometer 16. Each component of the spectrum 17 is measured by the fluorescence measuring instrument 4 for spectrum measurement, and the fluorescence intensity is measured. The light source 3 and the fluorescence measuring device 4 are adjusted by the controller 1 so that only one of them is turned on. By this adjustment, the excitation light 10 and the fluorescence 11 are separated in time. Further, in order to efficiently perform fluorescence measurement, the controller 1 designates a time interval from when the light source 3 is switched off to when the fluorescence measuring instrument 4 is turned on. Measurement data obtained by the fluorescence measuring instrument 4 is transmitted to the controller 1, and the controller 1 separates and integrates the first fluorescence component and the second fluorescence component based on the data. The fluorescence intensity and the ratio of the first fluorescence and the second fluorescence are displayed on the monitor 2.
図４に示す装置４００によれば、光源及び光測定器は片方だけがスイッチオンになり、光源からの励起光が蛍光の測定値に混ざらないように調整することができる。 According to the apparatus 400 shown in FIG. 4, only one of the light source and the optical measuring device is switched on, and the excitation light from the light source can be adjusted so as not to be mixed with the measured fluorescence value.
本発明は上記説明した実施形態に限定されず様々な変形態様が可能である。 The present invention is not limited to the embodiment described above, and various modifications can be made.
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated more concretely, this invention is not limited to these Examples.
（実施例１）
実施例では、以下のカビを用いた。
・コレトトリカム・フルクチコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ）ＭＡＦＦ ２３８５５４
・コレトトリカム・カーサミ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｒｔｈａｍｉ）ＭＡＦＦ ２３８５５５
・コレトトリカム・シアメンセ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｉａｍｅｎｓｅ）ＭＡＦＦ ７４４１０６
・グロメレラ・シングラータ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ）ＭＡＦＦ ２３８６５７
・コレトトリカム・グロエオスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）ＭＡＦＦ ２３８６５９
・コレトトリカム・シモンジ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｉｍｍｏｎｄｓｉｉ）ＭＡＦＦ ２３９７７３
・フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＭＡＦＦ １０３０３６
・バーティシリウム・ダーリア（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）ＭＡＦＦ ２３５６４１
・バーティシリウム・ダーリア（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）ＭＡＦＦ ２３５６５７
・パッサローラ・フルバ（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ）ＭＡＦＦ ３０６７０５
・フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＭＡＦＦ ２３９２１５
Example 1
In the examples, the following molds were used.
・ Colletotrichum fructicola MAFF 238554
・ Colletotrichum carthami MAFF 238555
・ Colletotrichum siemense MAFF 744106
-Glomerella singulata MAFF 238657
・ Colletotrichum gloeosporioides MAFF 238659
・ Colletotrichum simmondsi MAFF 239773
・ Fusarium oxysporum MAFF 103036
Verticillium dahlia MAFF 235641
・ Verticillium dahlia MAFF 235657
Passarola fulva MAFF 306705
Fusarium oxysporum MAFF 239215
カビのコロニーを培養している寒天培地を８０℃で０〜４８時間静置した。所定の時間が経過した後、寒天培地を室温に戻し、３日間静置した。３日間経過した寒天培地上のカビのコロニーに対して、蛍光分光光度計を用いて、蛍光を測定した。蛍光は、波長２００〜５００ｎｍの範囲において１０ｎｍ間隔で走査して励起し、波長２００〜７００ｎｍの範囲において１０ｎｍ間隔で走査して蛍光測定することにより測定した。カビの生死の確認は８０℃で熱処理したカビの断片を新しい寒天培地に移して培養し、２日後に菌糸の伸長が観察されるかどうかで判断した。 The agar medium in which mold colonies were cultured was allowed to stand at 80 ° C. for 0 to 48 hours. After a predetermined time elapsed, the agar medium was returned to room temperature and allowed to stand for 3 days. Fluorescence was measured using a fluorescence spectrophotometer for mold colonies on the agar medium after 3 days. Fluorescence was measured by scanning at 10 nm intervals in the wavelength range of 200 to 500 nm and excited, and scanning at 10 nm intervals in the wavelength range of 200 to 700 nm. The confirmation of mold viability was determined by transferring the mold pieces heat-treated at 80 ° C. to a new agar medium and culturing them, and whether or not mycelial elongation was observed after 2 days.
菌糸の伸長の観察では、８０℃の熱処理が３０分間以内のものは培養２日後に菌糸が確認され、カビが生きていることが示された。一方、８０℃の熱処理が１時間以上のものは、培養６日後でも菌糸の伸長が確認されず、カビが死んでいることが示された。図５は、８０℃で様々な時間処理したカビ（フザリウム・オキシスポラム）のコロニーの断片を新鮮な寒天培地上で培養してから６日後の培養結果を示す図である。８０℃で熱処理したカビは二つのタイプに分かれ、一つのタイプは０〜３０分間で熱処理したカビで、菌糸を再生してコロニーを形成した。もう一つのタイプは１時間以上で熱処理したカビで、菌糸を全く再生しなかった。したがって、８０℃の熱処理を１時間以上行ったカビを、死んでいるカビと判定した。 The observation of mycelial elongation showed that mycelia were confirmed after 2 days of culturing at 80 ° C. within 30 minutes, indicating that mold was alive. On the other hand, when the heat treatment at 80 ° C. was 1 hour or longer, no mycelial elongation was confirmed even after 6 days of culture, indicating that mold was dead. FIG. 5 is a diagram showing the culture results after 6 days from the cultivation of mold (Fusarium oxysporum) colony fragments treated at 80 ° C. for various times on a fresh agar medium. Molds heat-treated at 80 ° C. were divided into two types. One type was mold heat-treated for 0 to 30 minutes, and the mycelium was regenerated to form colonies. The other type was mold that had been heat-treated for over 1 hour and did not regenerate mycelium at all. Therefore, mold that had been heat-treated at 80 ° C. for 1 hour or more was determined to be dead mold.
図６には、フザリウム・オキシスポラムを８０℃で２分間処理したカビ（生きているカビ）の蛍光スペクトルを示す（励起波長２００〜５００ｎｍ、蛍光波長２００〜７００ｎｍ）。図７には、フザリウム・オキシスポラムを８０℃で２時間処理したカビ（死んでいるカビ）の蛍光スペクトルを示す（励起波長２００〜５００ｎｍ、蛍光波長２００〜７００ｎｍ）。図６及び図７を比較すると、３２０〜３７０ｎｍの波長の励起光により生じる３９０〜５００ｎｍの波長の第二の蛍光は、生きているカビよりも死んでいるカビで強く観測され、２７０〜３００ｎｍの波長の励起光により生じる３２０ｎｍ〜３８０ｎｍの第一の蛍光は、生きているカビに顕著に観測された。 FIG. 6 shows a fluorescence spectrum of mold (living mold) treated with Fusarium oxysporum at 80 ° C. for 2 minutes (excitation wavelength: 200 to 500 nm, fluorescence wavelength: 200 to 700 nm). FIG. 7 shows the fluorescence spectrum of mold (dead mold) treated with Fusarium oxysporum at 80 ° C. for 2 hours (excitation wavelength: 200 to 500 nm, fluorescence wavelength: 200 to 700 nm). Comparing FIGS. 6 and 7, the second fluorescence having a wavelength of 390 to 500 nm generated by the excitation light having a wavelength of 320 to 370 nm is observed more strongly in the dead mold than in the living mold, and is in the range of 270 to 300 nm. The first fluorescence of 320 nm to 380 nm generated by the excitation light with the wavelength was significantly observed in the living mold.
図８は、８０℃で熱処理したカビにおける、２９０ｎｍの波長の励起光により生じる３４０ｎｍの波長の第一の蛍光、及び３７０ｎｍの波長の励起光により生じる４２０ｎｍの波長の第二の蛍光の蛍光強度を示す図である。カビの８０℃熱処理によって、３４０ｎｍの波長の第一の蛍光の蛍光強度が減少する一方で、４２０ｎｍの波長の第二の蛍光の蛍光強度は増加した。図９は、二つの蛍光の変化を明確にするために、図８のデータを規格化して示す図である。規格化は、未処理のカビでの二つの蛍光の蛍光強度をともに１．０として、様々な時間で熱処理したカビの二つの蛍光強度を算出した。３０分以内の熱処理では、二つの蛍光の蛍光強度が同じような割合で変化した。一方、１時間以上の熱処理では、第一の蛍光の蛍光強度は減少し、第二の蛍光の蛍光強度は著しく増加することが明確になった。図１０は、８０℃で熱処理したカビにおける、３４０ｎｍの波長の第一の蛍光及び４２０ｎｍの波長の第二の蛍光の蛍光強度比（３４０ｎｍの波長の蛍光の蛍光強度／４２０ｎｍの波長の蛍光の蛍光強度）を示す図である。この結果から、カビが死ぬにつれて蛍光強度比が減少する傾向が示された。８０℃３０分以内で熱処理したカビは生きており、８０℃で１時間熱処理したカビは完全に死んでいたことを考慮すると、熱処理を用いた際には、蛍光強度比が２．５以下の場合、カビが死んでいると判定できることが示された。８０℃で１時間熱処理したカビの蛍光強度比の値は、熱処理を行っていないカビ（未処理）の蛍光強度比の値の２１．４％だった。 FIG. 8 shows the fluorescence intensities of the first fluorescence having a wavelength of 340 nm generated by excitation light having a wavelength of 290 nm and the second fluorescence having a wavelength of 420 nm generated by excitation light having a wavelength of 370 nm in mold heat-treated at 80 ° C. FIG. The 80 ° C. heat treatment of the mold decreased the fluorescence intensity of the first fluorescence at a wavelength of 340 nm, while increasing the fluorescence intensity of the second fluorescence at a wavelength of 420 nm. FIG. 9 is a diagram showing the data of FIG. 8 normalized in order to clarify the change of the two fluorescences. For normalization, the two fluorescence intensities of the molds heat-treated at various times were calculated with both the fluorescence intensities of the two untreated molds at 1.0. In the heat treatment within 30 minutes, the fluorescence intensity of the two fluorescences changed at a similar rate. On the other hand, it became clear that the fluorescence intensity of the first fluorescence decreased and the fluorescence intensity of the second fluorescence significantly increased in the heat treatment for 1 hour or more. FIG. 10 shows the fluorescence intensity ratio of the first fluorescence having a wavelength of 340 nm and the second fluorescence having a wavelength of 420 nm in the mold heat-treated at 80 ° C. (fluorescence intensity of fluorescence having a wavelength of 340 nm / fluorescence of fluorescence having a wavelength of 420 nm). It is a figure which shows intensity | strength. From this result, it was shown that the fluorescence intensity ratio tends to decrease as the mold dies. Considering that the mold heat-treated within 30 minutes at 80 ° C. is alive and the mold heat-treated at 80 ° C. for 1 hour was completely dead, the fluorescence intensity ratio is 2.5 or less when using the heat treatment. The case showed that the mold can be determined dead. The value of the fluorescence intensity ratio of the mold heat-treated at 80 ° C. for 1 hour was 21.4% of the value of the fluorescence intensity ratio of the mold not subjected to the heat treatment (untreated).
図１１には、８０℃で熱処理したカビの蛍光の蛍光強度比の時間変化を示す。８０℃で８分間処理したカビ（生きているカビ）と、８０℃で８時間処理したカビ（死んでいるカビ）を室温に戻し、熱処理後１〜４８時間の範囲の所定時間に、第一の蛍光と第二の蛍光の二つの蛍光強度を測定して、取得したデータから蛍光強度比を求めた。図１１の縦軸の目盛は蛍光強度比を規格化した数字であり、処理１時間後の比の値を基準として、それぞれの所定時間での比を規格化した。８分間熱処理したカビでは、蛍光強度比は処理後４８時間までにほとんど変わらなかった。８時間熱処理したカビでは、蛍光強度比は処理後８時間まではほぼ一定であったが、２４時間後に若干減少し、４８時間後に更に減少した。この結果から、生きているカビの蛍光強度比は日にちが経っても変わらないが、死んでいるカビの蛍光強度比は日にちが経つと減少することが判った。したがって、カビの生死の判定には、殺菌処理して３日以上経過したカビを用いることが好ましいと考えられる。 FIG. 11 shows the change over time in the fluorescence intensity ratio of the fluorescence of the mold heat-treated at 80 ° C. The mold treated at 80 ° C. for 8 minutes (living mold) and the mold treated at 80 ° C. for 8 hours (dead mold) are returned to room temperature, and after the heat treatment, at a predetermined time in the range of 1 to 48 hours, The two fluorescence intensities, i.e., the second fluorescence, were measured, and the fluorescence intensity ratio was determined from the acquired data. The scale on the vertical axis in FIG. 11 is a number obtained by standardizing the fluorescence intensity ratio, and the ratio at each predetermined time is normalized based on the value of the ratio after 1 hour of treatment. In the mold heat-treated for 8 minutes, the fluorescence intensity ratio hardly changed by 48 hours after the treatment. In the mold heated for 8 hours, the fluorescence intensity ratio was almost constant until 8 hours after the treatment, but decreased slightly after 24 hours and further decreased after 48 hours. From this result, it was found that the fluorescence intensity ratio of living molds did not change with the passage of time, but the fluorescence intensity ratio of dead molds decreased with the passage of days. Therefore, it is considered preferable to use fungi that have been sterilized for 3 days or more to determine the viability of the fungi.
熱処理時間に依存した蛍光強度の変化又は蛍光強度比の変化のどちらがカビの生死と関連するかを、カビを６０℃で熱処理することにより調べた。カビを６０℃で０〜２４時間処理し、所定の時間が経過した後、カビを室温に戻した。６０℃処理したカビの断片を新しい寒天培地に移して培養し、６日後に、断片がコロニーを再生したかどうかを調べたところ、全てのカビが新しいコロニーを形成した。したがって、６０℃２４時間以内の熱処理では、カビは生きていると判断した。６０℃処理から３日後、様々な時間で６０℃処理したカビの蛍光を測定した。 Whether the change in the fluorescence intensity depending on the heat treatment time or the change in the fluorescence intensity ratio is related to mold viability was examined by heat treating the mold at 60 ° C. The mold was treated at 60 ° C. for 0 to 24 hours, and after a predetermined time, the mold was returned to room temperature. Mold fragments treated at 60 ° C. were transferred to a new agar medium and cultured. After 6 days, it was examined whether the fragments regenerated colonies. All molds formed new colonies. Therefore, it was determined that the mold was alive in the heat treatment at 60 ° C. within 24 hours. Three days after the treatment at 60 ° C., the fluorescence of the mold treated at 60 ° C. for various times was measured.
図１２には、０〜２４時間の範囲の所定の時間で６０℃熱処理したカビの二つの蛍光の蛍光強度を示す。３０分間以内の６０℃処理では、２ピークの蛍光強度に大きな変化はなかったが、処理時間が１時間を超えると、二つのピークはともに蛍光強度が増加し始め、１６時間以上の６０℃熱処理では、両方の蛍光強度が減少した。この蛍光強度の変化にも関わらず、カビは生きていることから、熱処理による蛍光強度の増加は、カビの死と直接的に関連しないと思われる。図１３には、６０℃熱処理したカビの蛍光強度の比を示す。蛍光強度比は０〜２４時間の６０℃熱処理で顕著な違いを示さなかった。この結果、生きているカビでは、蛍光強度が増減しても、蛍光強度比は保たれることが判った。したがって、カビの生死には蛍光強度の変化よりも、むしろ蛍光強度比が関連すると考えられる。 FIG. 12 shows the fluorescence intensities of the two molds that were heat-treated at 60 ° C. for a predetermined time ranging from 0 to 24 hours. In the treatment at 60 ° C. within 30 minutes, the fluorescence intensity of the two peaks did not change significantly, but when the treatment time exceeded 1 hour, the fluorescence intensity of both peaks started to increase, and the heat treatment at 60 ° C. for 16 hours or more. In both cases, the fluorescence intensity decreased. Despite this change in fluorescence intensity, molds are alive, so it seems that an increase in fluorescence intensity due to heat treatment is not directly related to mold death. FIG. 13 shows the ratio of the fluorescence intensity of the mold heat-treated at 60 ° C. The fluorescence intensity ratio showed no significant difference in the heat treatment at 60 ° C. for 0 to 24 hours. As a result, it was found that the fluorescence intensity ratio was maintained in the living mold even when the fluorescence intensity increased or decreased. Therefore, it is considered that the fluorescence intensity ratio is related to the life and death of mold, rather than the change in fluorescence intensity.
カビの生死と蛍光強度比との関係が、消毒用エタノール（８０％エタノール）による殺菌に適用できるかどうかを調べた。寒天培地と共にカビのコロニーを一辺約１０ｍｍの正方形に切り取り、切り取ったカビ断片を消毒用エタノールに１６時間浸した。消毒用エタノールからカビ断片を取り出し、蒸留水に３０分間浸してエタノールを除いた後、培養液に３０分間浸してカビの増殖に必要な養分を寒天に染み込ませた。カビ断片を培養液から取り出し、余分な水分を濾紙で吸い取り、室温に静置した。消毒用エタノールの代わりに蒸留水を用いてコントロール実験を行った。処理カビ断片は室温に静置し、蛍光測定を２４時間間隔で４日間行った。カビの生死は処理カビの断片をそのまま室温で静置して、処理カビ断片からの菌糸の伸長の有無によって判断した。 It was investigated whether the relationship between mold life and death and fluorescence intensity ratio can be applied to sterilization with disinfectant ethanol (80% ethanol). A fungal colony was cut into a square having a side of about 10 mm together with an agar medium, and the cut mold fragment was immersed in disinfecting ethanol for 16 hours. Mold pieces were taken out from the disinfecting ethanol, soaked in distilled water for 30 minutes to remove the ethanol, and then immersed in a culture solution for 30 minutes to soak the nutrients necessary for mold growth into the agar. Mold fragments were removed from the culture solution, excess water was blotted with filter paper, and allowed to stand at room temperature. Control experiments were conducted using distilled water instead of disinfecting ethanol. The treated mold fragment was allowed to stand at room temperature, and fluorescence measurement was performed at 24 hour intervals for 4 days. The viability of the mold was determined by allowing the treated mold fragment to stand at room temperature as it was, and determining whether the mycelium was elongated from the treated mold fragment.
図１４には、消毒用エタノールで処理したカビの二つの蛍光、すなわち波長２９０ｎｍの励起で生じる波長３４０ｎｍの第一の蛍光と、波長３７０ｎｍの励起で生じる波長４２０ｎｍの第二の蛍光のそれぞれの蛍光強度を毎日測定し、処理後４日間における蛍光強度の経日変化を示す。図１５には、消毒用エタノールの代わりに蒸留水で処理したカビでの蛍光強度の経日変化を示す。消毒用エタノールで処理したカビでは、第一の蛍光の蛍光強度は４日間でほとんど変わらなかったが、第二の蛍光の蛍光強度は増加した。蒸留水で処理したカビでは、第一の蛍光の蛍光強度は著しく増加し、第二の蛍光の蛍光強度もわずかに増加した。図１６には、消毒用エタノール又は蒸留水で処理したカビにおける蛍光強度比の経日変化を示す。処理した後の初日における両方の蛍光強度比は大きく違わなかったが、翌日から互いに対照的な変化を示した。蛍光強度比は、消毒用エタノールで処理したカビでは減少し、逆に、蒸留水で処理したカビでは増加した。アルコール処理が終了をしてから３日後のカビの蛍光強度比の値は、蒸留水処理が終了してから３日後のカビの蛍光強度比の値の２３．０％だった。 FIG. 14 shows two fluorescences of mold treated with disinfecting ethanol, ie, first fluorescence having a wavelength of 340 nm generated by excitation at a wavelength of 290 nm and second fluorescence having a wavelength of 420 nm generated by excitation at a wavelength of 370 nm. The intensity is measured every day and shows the daily change in fluorescence intensity over 4 days after treatment. FIG. 15 shows changes over time in fluorescence intensity in fungi treated with distilled water instead of disinfecting ethanol. In the mold treated with disinfecting ethanol, the fluorescence intensity of the first fluorescence hardly changed after 4 days, but the fluorescence intensity of the second fluorescence increased. In fungi treated with distilled water, the fluorescence intensity of the first fluorescence increased significantly and the fluorescence intensity of the second fluorescence also increased slightly. FIG. 16 shows changes over time in the fluorescence intensity ratio in fungi treated with disinfecting ethanol or distilled water. Both fluorescence intensity ratios on the first day after treatment were not significantly different, but showed contrasting changes from the next day. The fluorescence intensity ratio decreased in mold treated with disinfecting ethanol, and conversely increased in mold treated with distilled water. The value of the mold fluorescence intensity ratio 3 days after the end of the alcohol treatment was 23.0% of the value of the mold fluorescence intensity ratio 3 days after the end of the distilled water treatment.
図１７には、消毒用エタノールで処理したカビ断片の６日後の実体顕微鏡像を示す。カビ断片とその周囲の様子は処理直後と変わらず、再生した菌糸は見られなかった。この観察から、消毒用エタノールで処理したカビは死んでいると判断した。図１８には、コントロール実験として蒸留水で処理したカビ断片の３日後の実体顕微鏡像を示す。蒸留水で処理したカビは、翌日に断片から新しい菌糸を伸ばし始め、３日後には断片の全周から菌糸を密集させてコロニーを形成した。この観察から、蒸留水で処理したカビは生きていると判断した。 FIG. 17 shows a stereoscopic microscope image of a mold fragment treated with disinfecting ethanol after 6 days. The mold fragment and the surrounding area were the same as immediately after the treatment, and the regenerated mycelium was not seen. From this observation, it was determined that mold treated with disinfecting ethanol was dead. FIG. 18 shows a stereoscopic microscope image after 3 days of a mold fragment treated with distilled water as a control experiment. Molds treated with distilled water started to spread new mycelia from the fragments the next day, and after 3 days, the mycelia were concentrated from the entire periphery of the fragments to form colonies. From this observation, it was determined that the mold treated with distilled water was alive.
消毒用エタノールで処理したカビと蒸留水で処理したカビの蛍光強度比の変化を培養結果と照合すると、生きているカビでは、第一の蛍光と第二の蛍光の蛍光強度が共に増え、蛍光強度比も増加した。死んでいるカビでは、第二の蛍光が顕著に増えたので、蛍光強度比は逆に減少した。したがって、消毒用エタノールでのカビ殺菌では、カビの生死を、蛍光強度比の経日変化によって判定できることが判った。 When the change in the fluorescence intensity ratio between mold treated with disinfectant ethanol and mold treated with distilled water is compared with the culture results, the fluorescence intensity of the first fluorescence and the second fluorescence in the living mold both increase. The intensity ratio also increased. In the dead mold, the fluorescence intensity ratio decreased conversely because the second fluorescence increased significantly. Therefore, it was found that mold sterilization with disinfectant ethanol can determine the viability of mold by the daily change in fluorescence intensity ratio.
その他の種類のカビを用いた場合でも、フザリウム・オキシスポラムと同様の蛍光特性を示した。そのため、この蛍光強度比によるカビの生死の判定は、カビの種類に限定されないことが示された。 Even when other types of mold were used, the same fluorescence characteristics as Fusarium oxysporum were exhibited. Therefore, it was shown that the determination of mold life and death based on this fluorescence intensity ratio is not limited to the mold type.
１…コントローラ、２…モニター、３、３ａ、３ｂ…光源、４、４ａ、４ｂ…蛍光測定器、５、５ａ、５ｂ…分光フィルター、６ａ、６ｂ…分光フィルター、７…励起光用フィルター交換装置、８…蛍光用フィルター交換装置、９ａ、９ｂ、９ｃ、９ｄ…集光レンズ、１０、１０ａ、１０ｂ…励起光、１１、１１ａ、１１ｂ…蛍光、１２…カビ、１３ａ、１３ｂ…ミラー、１４ａ、１４ｂ…ダイクロイックミラー、１５…対物レンズ系、１６…分光器、１７…スペクトル、１００、２００、３００、４００…装置 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Controller, 2 ... Monitor, 3, 3a, 3b ... Light source 4, 4a, 4b ... Fluorescence measuring device 5, 5a, 5b ... Spectral filter, 6a, 6b ... Spectral filter, 7 ... Filter exchange apparatus for excitation light 8 ... Fluorescent filter changer, 9a, 9b, 9c, 9d ... Condensing lens, 10, 10a, 10b ... Excitation light, 11, 11a, 11b ... Fluorescence, 12 ... Mold, 13a, 13b ... Mirror, 14a, 14b ... Dichroic mirror, 15 ... Objective lens system, 16 ... Spectroscope, 17 ... Spectrum, 100, 200, 300, 400 ... Apparatus
Claims (9)
前記カビに対し、２６０〜３００ｎｍの波長の第一の励起光、及び３２０〜３７０ｎｍの波長の第二の励起光を照射する励起光照射工程と、
前記カビからの３１０〜３８０ｎｍの波長の第一の蛍光及び３９０〜５００ｎｍの波長の第二の蛍光を測定する蛍光測定工程と、
前記第一の蛍光及び前記第二の蛍光の蛍光強度比に基づき、前記カビの生死を判定する判定工程と、を備える、方法。 A method for determining mold life and death,
An excitation light irradiation step of irradiating the mold with a first excitation light having a wavelength of 260 to 300 nm and a second excitation light having a wavelength of 320 to 370 nm;
A fluorescence measurement step of measuring a first fluorescence having a wavelength of 310 to 380 nm and a second fluorescence having a wavelength of 390 to 500 nm from the mold;
A determination step of determining whether the mold is viable based on a fluorescence intensity ratio between the first fluorescence and the second fluorescence.
蛍光強度比＝第一の蛍光の蛍光強度／第二の蛍光の蛍光強度・・・（１） In the determination step, the fluorescence intensity ratio is a ratio represented by Formula (1), and it is determined that the mold is dead when the fluorescence intensity ratio is equal to or less than a reference value, or the fluorescence intensity ratio is a reference The method of claim 1, wherein the mold is determined to be alive when a value is exceeded.
Fluorescence intensity ratio = fluorescence intensity of the first fluorescence / fluorescence intensity of the second fluorescence (1)
前記カビに対し、２６０〜３００ｎｍの波長の第一の励起光、及び３２０〜３７０ｎｍの波長の第二の励起光を照射する励起光照射手段と、
前記カビからの３１０〜３８０ｎｍの波長の第一の蛍光及び３９０〜５００ｎｍの波長の第二の蛍光を測定する蛍光測定手段と、
前記第一の蛍光及び前記第二の蛍光の蛍光強度比を算出する算出手段と、
を備える、装置。 A mold life / death determination device,
Excitation light irradiation means for irradiating the mold with first excitation light having a wavelength of 260 to 300 nm and second excitation light having a wavelength of 320 to 370 nm;
Fluorescence measuring means for measuring a first fluorescence having a wavelength of 310 to 380 nm and a second fluorescence having a wavelength of 390 to 500 nm from the mold;
Calculating means for calculating a fluorescence intensity ratio between the first fluorescence and the second fluorescence;
An apparatus comprising:
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