JP2017088601A - Drug delivery agents for administration to living bodies and production methods thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、目的物質を生体投与するための薬物導入剤およびその製造方法に関する。 The present invention relates to a drug introduction agent for biologically administering a target substance and a method for producing the same.
炭酸アパタイトは、水酸アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）の水酸基（ＯＨ−）の一部を炭酸基（ＣＯ３ ２−）にて置換した化学構造を有する。特許文献１には、物質を細胞内に導入するための担体として炭酸アパタイトを用いることが提案されている。具体的に特許文献１には、目的の物質及びリン酸カルシウム系材料から構成される複合体粒子をｐＨ８．０からｐＨ６．０に変化させた場合において、ｐＨ６．０に変化させてから所定時間内に、ｐＨ８．０において存在していた前記複合体粒子の少なくとも５０％が溶解する細胞導入剤が開示されている。ただし、炭酸アパタイトは、一次粒子径は小さいが凝集性が強く、二次粒子径が大きいという問題があったため、ＥＰＲ効果を得るには不十分であった。 Carbonate apatite has a chemical structure in which a part of the hydroxyl group (OH-) of hydroxyapatite (Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ) is substituted with a carbonate group (CO 3 2− ). Patent Document 1 proposes using carbonate apatite as a carrier for introducing a substance into cells. Specifically, Patent Document 1 discloses that when complex particles composed of a target substance and a calcium phosphate material are changed from pH 8.0 to pH 6.0, the pH is changed to pH 6.0 within a predetermined time. Disclosed is a cell introduction agent in which at least 50% of the composite particles present at pH 8.0 are lysed. However, carbonate apatite has a problem that the primary particle size is small but the cohesiveness is strong and the secondary particle size is large, so that the EPR effect is insufficient.
それを解消するための手段として、特許文献２には、リン酸とカルシウムを含む水溶液の炭酸量や反応雰囲気を制御する方法を開示している。しかしながら、これらの従来技術を踏まえても、炭酸アパタイトを物質の細胞内や生体内へと運ぶ担体として実用化するには、更なる改善が必要であった。 As means for solving this problem, Patent Document 2 discloses a method for controlling the amount of carbonic acid and the reaction atmosphere of an aqueous solution containing phosphoric acid and calcium. However, even in view of these conventional techniques, further improvement is necessary to put carbonate apatite into practical use as a carrier for transporting substances into cells or living bodies.
炭酸アパタイトの粒径が大きい場合、生体投与した場合の安全性の問題が生じる。例えば、粒径が大きい炭酸アパタイトを動静脈投与した場合、血管内塞栓や肝臓および／または腎臓での蓄積が問題となる。また、粒径が小さすぎると、細胞（または組織）への送達効率が低減する。 When the particle size of carbonate apatite is large, a safety problem occurs when administered in vivo. For example, when carbonate apatite having a large particle size is administered intravenously, intravascular embolization or accumulation in the liver and / or kidneys becomes a problem. If the particle size is too small, the delivery efficiency to cells (or tissues) is reduced.
また、従来法の薬物の内包率は３０％前後と低く、細胞導入剤としては満足できるものではなかった。 In addition, the encapsulation rate of conventional drugs is as low as about 30%, which is not satisfactory as a cell introduction agent.
そのため、適切な粒径（平均粒径および最大粒径）を有し、かつ、粒径の分散（σ２）が小さく、薬物内包率が高い炭酸アパタイトの提供が求められる。 Therefore, it is required to provide carbonate apatite having an appropriate particle size (average particle size and maximum particle size), small particle size dispersion (σ 2 ), and high drug encapsulation rate.
本発明者は、低温および／または短時間の重合反応を用いる炭酸アパタイト製造方法を提供することによって、上記課題を解決した。 The present inventor has solved the above problems by providing a method for producing carbonate apatite using a low temperature and / or short time polymerization reaction.
例えば、本発明は、以下を提供する：
（項目１）
炭酸アパタイトの集団が分散した水溶液であって、該炭酸アパタイトの集団の９０％以上が７００ｎｍ以下の粒径を有する、水溶液。
（項目２）
項目１に記載の水溶液であって、前記炭酸アパタイトの集団の９５％以上が７００ｎｍ以下の粒径を有する、水溶液。
（項目３）
項目１に記載の水溶液であって、前記炭酸アパタイトの集団の９８％以上が７００ｎｍ以下の粒径を有する、水溶液。
（項目４）
炭酸アパタイトの集団が分散した水溶液であって、該炭酸アパタイトの集団の平均粒径が３０ｎｍ以下である、水溶液。
（項目５）
項目４に記載の水溶液であって、該炭酸アパタイトの集団の平均粒径が２０ｎｍ以下である、水溶液。
（項目６）
乳化油性物質を含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の水溶液。
（項目７）
前記乳化油性物質が０．５％（ｗ／ｗ）以上含まれ、かつＨＬＢ値が３〜１６である、項目６に記載の水溶液。
（項目８）
増粘剤を含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の水溶液。
（項目９）
粘度が１．３ｍＰａ・ｓ以上である、項目１〜５のいずれか一項に記載の水溶液。
（項目１０）
前記炭酸アパタイトが薬物を内包し、該薬物の内包率が９０％以上である、項目１〜５のいずれか一項に記載の水溶液。
（項目１１）
項目１〜５のいずれか一項に記載の水溶液を含む、薬物を細胞内に送達するための組成物。
（項目１２）
前記薬物が薬剤である、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
求電子剤を含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の水溶液。
（項目１４）
官能基にカルボニル基を持つ物質を含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の水溶液。
（項目１５）
求核剤を含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の水溶液。
（項目１６）
官能基にアミノ基を持つ物質を含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の水溶液。
（項目１７）
前記炭酸アパタイトが薬物を内包し、該薬物の内包率が９８％以上である、項目１３〜１６のいずれか一項に記載の水溶液。
（項目１８）
薬物を内包した炭酸アパタイトの製造方法であって、該方法は、カルシウムイオン、リン酸イオン、炭酸水素イオン、および薬物を含む混合物をインキュベートする工程を包含し、ここで、インキュベートする温度が１０℃以下であり、かつ、インキュベート時間が１０分以内である、方法。
（項目１９）
項目１８に記載の方法であって、ここで、前記インキュベートする時間が１分以内である、方法。
（項目２０）
項目１８または１９に記載の方法であって、ここで、前記混合物が乳化油性物質を含む、方法。
（項目２１）
薬物を内包した炭酸アパタイトを分散した水溶液を調製する方法であって、以下：
（ａ）カルシウムイオン、リン酸イオン、炭酸水素イオン、および薬物を含む混合物をインキュベートする工程であって、ここで、インキュベートする温度が１０℃以下であり、かつ、インキュベート時間が１０分以内である、工程；
（ｂ）インキュベート終了後の混合物を高速遠心する工程；ならびに、
（ｃ）高速遠心して得られた沈殿を１．３ｍＰａ・s以上の粘度を有する水溶液中に分散させる工程、
を包含する、方法。
（項目２２）
項目２１に記載の方法であって、ここで、前記インキュベートする時間が１分以内である、方法。
（項目２３）
項目２１または２２に記載の方法であって、ここで、前記混合物が乳化油性物質を含む、方法。
（項目２４）
項目２１に記載の方法であって、ここで、前記工程（ａ）の少なくとも一部において、混合物に電圧が印加される、方法。
（項目２５）
薬物を内包した炭酸アパタイトの製造方法であって、以下：
（ａ）ＲＯ水製造装置または蒸留水製造装置で製造された水を攪拌機に投入する工程；
（ｂ）リン酸イオン、および、炭酸水素イオンを該攪拌機に投入する工程；
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）によって投入された混合物のｐＨを調整する工程；
（ｄ）工程（ｃ）でｐＨを調整した混合物にカルシウムイオン、および薬物を投入し、１０℃以下で１０分以内でインキュベートする工程；
（ｅ）工程（ｄ）でインキュベート前またはインキュベート後の混合物に乳化油性物質を添加する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で得られた混合物を、ポリプロピレンを塗布した内筒またはポリプロピレン筒を装着した内筒を有する遠心分離機にて遠心分離して、沈殿を得る工程；ならびに、
（ｇ）工程（ｆ）で得られた沈殿を、該筒の上部または底部より自動挿入したノズルにて、空気、蒸留水、生理食塩水、および増粘剤からなる群から選択される物質を噴射し回収する工程、
を包含する方法。
（項目２６）
項目２５に記載の方法であって、さらに、
（ｈ）工程（ｇ）で回収した沈殿をボトル詰めし、凍結乾燥する工程、
を包含する方法。
（項目２７）
項目１〜５のいずれか一項に記載の水溶液を含む癌の処置または予防のための薬学的組成物であって、ここで、前記炭酸アパタイトが薬物を内包する、薬学的組成物。
例えば、本発明はまた、以下を提供する：
（項目Ａ１）
薬物を投与する方法であって、該薬物を内包する炭酸アパタイトを含有する組成物を投与する工程を包含し、ここで、該炭酸アパタイトの集団の９０％以上が７００ｎｍ以下の粒径を有する、方法。
（項目Ａ２）
項目Ａ１に記載の方法であって、前記炭酸アパタイトの集団の９５％以上が７００ｎｍ以下の粒径を有する、方法。
（項目Ａ３）
項目Ａ１に記載の方法であって、前記炭酸アパタイトの集団の９８％以上が７００ｎｍ以下の粒径を有する、方法。
（項目Ａ４）
項目Ａ１に記載の方法であって、前記炭酸アパタイトの集団の平均粒径が３０ｎｍ以下である、方法。
（項目Ａ５）
項目Ａ１に記載の方法であって、該炭酸アパタイトの集団の平均粒径が２０ｎｍ以下である、方法。
（項目Ａ６）
前記組成物が乳化油性物質を含む、項目Ａ１に記載の方法。
（項目Ａ７）
前記組成物に前記乳化油性物質が０．５％（ｗ／ｗ）以上含まれ、かつ前記組成物のＨＬＢ値が３〜１６である、項目Ａ６に記載の方法。
（項目Ａ８）
前記組成物が増粘剤を含む、項目Ａ１に記載の方法。
（項目Ａ９）
前記組成物の粘度が１．３ｍＰａ・ｓ以上である、項目Ａ１に記載の方法。
（項目Ａ１０）
前記組成物における前記薬物の内包率が９０％以上である、項目Ａ１に記載の方法。
（項目Ａ１１）
前記組成物が求電子剤を含む、項目Ａ１に記載の方法。
（項目Ａ１２）
前記組成物が求核剤を含む、項目Ａ１に記載の方法。
（項目Ａ１３）
前記薬物がｍｉＲＮＡである、項目Ａ１に記載の方法。
（項目Ａ１４）
癌を治療または予防する方法であって、薬物を内包する炭酸アパタイトを含有する組成物を投与する工程を包含し、ここで、該炭酸アパタイトの集団の９０％以上が７００ｎｍ以下の粒径を有する、方法。
（項目Ａ１５）
前記薬物がｍｉＲＮＡである、項目Ａ１４に記載の方法。
（項目Ａ１６）
前記薬物が抗癌剤である、項目Ａ１４に記載の方法。
（項目Ａ１７）
薬物を内包した炭酸アパタイトの製造方法であって、該方法は、カルシウムイオン、リン酸イオン、炭酸水素イオン、および、薬物を含む混合物をインキュベートする工程を包含し、ここで、インキュベートする温度が１０℃以下であり、かつ、インキュベート時間が１０分以内である、方法。
（項目Ａ１８）
項目Ａ１７に記載の方法であって、ここで、前記インキュベートする時間が１分以内である、方法。
（項目Ａ１９）
項目Ａ１７に記載の方法であって、ここで、前記混合物が乳化油性物質を含む、方法。
（項目Ａ２０）
薬物を内包した炭酸アパタイトを分散した水溶液を調製する方法であって、以下：
（ａ）カルシウムイオン、リン酸イオン、炭酸水素イオン、および薬物を含む混合物をインキュベートする工程であって、ここで、インキュベートする温度が１０℃以下であり、かつ、インキュベート時間が１０分以内である、工程；
（ｂ）インキュベート終了後の混合物を高速遠心する工程；ならびに、
（ｃ）高速遠心して得られた沈殿を１．３ｍＰａ・s以上の粘度を有する水溶液中に分散
させる工程、
を包含する、方法。
（項目Ａ２１）
項目Ａ２０に記載の方法であって、ここで、前記インキュベートする時間が１分以内である、方法。
（項目Ａ２２）
項目Ａ２０に記載の方法であって、ここで、前記混合物が乳化油性物質を含む、方法。
（項目Ａ２３）
項目Ａ２０に記載の方法であって、ここで、前記工程（ａ）の少なくとも一部において、混合物に電圧が印加される、方法。
（項目Ａ２４）
薬物を内包した炭酸アパタイトの製造方法であって、以下：
（ａ）ＲＯ水製造装置または蒸留水製造装置で製造された水を攪拌機に投入する工程；
（ｂ）リン酸イオン、および炭酸水素イオンを該攪拌機に投入する工程；
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）によって投入された混合物のｐＨを調整する工程；
（ｄ）工程（ｃ）でｐＨを調整した混合物にカルシウムイオン、および薬物を投入し、１０℃以下で１０分以内でインキュベートする工程；
（ｅ）工程（ｄ）でインキュベート前またはインキュベート後の混合物に乳化油性物質を添加する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で得られた混合物を、ポリプロピレンを塗布した内筒またはポリプロピレン筒を装着した内筒を有する遠心分離機にて遠心分離して、沈殿を得る工程；ならびに、
（ｇ）工程（ｆ）で得られた沈殿を、該筒の上部または底部より自動挿入したノズルにて、空気、蒸留水、生理食塩水、および増粘剤からなる群から選択される物質を噴射し回収する工程、
を包含する方法。
（項目Ａ２５）
項目Ａ２４に記載の方法であって、さらに、
（ｈ）工程（ｇ）で回収した沈殿をボトル詰めし、凍結乾燥する工程、
を包含する方法。
For example, the present invention provides the following:
(Item 1)
An aqueous solution in which a carbonate apatite population is dispersed, wherein 90% or more of the carbonate apatite population has a particle size of 700 nm or less.
(Item 2)
Item 2. The aqueous solution according to Item 1, wherein 95% or more of the carbonate apatite population has a particle size of 700 nm or less.
(Item 3)
Item 4. The aqueous solution according to Item 1, wherein 98% or more of the carbonate apatite population has a particle size of 700 nm or less.
(Item 4)
An aqueous solution in which a carbonate apatite population is dispersed, wherein the average particle size of the carbonate apatite population is 30 nm or less.
(Item 5)
Item 5. The aqueous solution according to Item 4, wherein the carbonate apatite population has an average particle size of 20 nm or less.
(Item 6)
The aqueous solution according to any one of Items 1 to 5, comprising an emulsified oily substance.
(Item 7)
Item 7. The aqueous solution according to Item 6, wherein the emulsified oily substance is contained in an amount of 0.5% (w / w) or more and the HLB value is 3 to 16.
(Item 8)
The aqueous solution according to any one of Items 1 to 5, comprising a thickener.
(Item 9)
The aqueous solution according to any one of items 1 to 5, wherein the viscosity is 1.3 mPa · s or more.
(Item 10)
The aqueous solution according to any one of Items 1 to 5, wherein the carbonate apatite encapsulates a drug, and the encapsulation rate of the drug is 90% or more.
(Item 11)
A composition for delivering a drug into a cell, comprising the aqueous solution according to any one of items 1 to 5.
(Item 12)
Item 12. The composition according to Item 11, wherein the drug is a drug.
(Item 13)
The aqueous solution according to any one of Items 1 to 5, comprising an electrophile.
(Item 14)
The aqueous solution according to any one of Items 1 to 5, comprising a substance having a carbonyl group as a functional group.
(Item 15)
The aqueous solution according to any one of Items 1 to 5, comprising a nucleophile.
(Item 16)
The aqueous solution according to any one of Items 1 to 5, comprising a substance having an amino group as a functional group.
(Item 17)
The aqueous solution according to any one of Items 13 to 16, wherein the carbonate apatite encapsulates a drug, and the encapsulation rate of the drug is 98% or more.
(Item 18)
A method for producing a carbonate apatite encapsulating a drug comprising the step of incubating a mixture containing calcium ions, phosphate ions, hydrogen carbonate ions and a drug, wherein the incubation temperature is 10 ° C. A method wherein the incubation time is within 10 minutes.
(Item 19)
19. The method according to item 18, wherein the incubation time is within 1 minute.
(Item 20)
20. A method according to item 18 or 19, wherein the mixture comprises an emulsified oily substance.
(Item 21)
A method of preparing an aqueous solution in which a carbonate apatite encapsulating a drug is dispersed, comprising the following:
(A) a step of incubating a mixture containing calcium ions, phosphate ions, bicarbonate ions, and a drug, wherein the incubation temperature is 10 ° C. or less and the incubation time is within 10 minutes Process;
(B) high-speed centrifugation of the mixture after completion of incubation; and
(C) a step of dispersing a precipitate obtained by high-speed centrifugation in an aqueous solution having a viscosity of 1.3 mPa · s or more,
Including the method.
(Item 22)
Item 22. The method according to Item 21, wherein the incubation time is within 1 minute.
(Item 23)
23. The method according to item 21 or 22, wherein the mixture comprises an emulsified oily substance.
(Item 24)
22. The method according to item 21, wherein a voltage is applied to the mixture in at least part of the step (a).
(Item 25)
A method for producing a carbonated apatite containing a drug, comprising:
(A) A step of introducing water produced by an RO water production apparatus or distilled water production apparatus into a stirrer;
(B) introducing a phosphate ion and a bicarbonate ion into the stirrer;
(C) adjusting the pH of the mixture charged in steps (a) and (b);
(D) adding calcium ions and a drug to the mixture adjusted in pH in step (c) and incubating at 10 ° C. or less within 10 minutes;
(E) adding an emulsified oily substance to the mixture before or after incubation in step (d);
(F) Centrifugating the mixture obtained in step (e) in a centrifuge having an inner cylinder coated with polypropylene or an inner cylinder fitted with a polypropylene cylinder to obtain a precipitate; and
(G) A substance selected from the group consisting of air, distilled water, physiological saline, and a thickener is added with a nozzle that automatically inserts the precipitate obtained in step (f) from the top or bottom of the cylinder. Jetting and collecting process,
Including the method.
(Item 26)
26. A method according to item 25, further comprising:
(H) Bottled precipitate recovered in step (g) and freeze-dried;
Including the method.
(Item 27)
6. A pharmaceutical composition for treating or preventing cancer comprising the aqueous solution according to any one of items 1 to 5, wherein the carbonate apatite encloses a drug.
For example, the present invention also provides:
(Item A1)
A method for administering a drug comprising the step of administering a composition comprising carbonate apatite encapsulating the drug, wherein 90% or more of the carbonate apatite population has a particle size of 700 nm or less, Method.
(Item A2)
The method according to item A1, wherein 95% or more of the carbonate apatite population has a particle size of 700 nm or less.
(Item A3)
The method according to item A1, wherein 98% or more of the carbonate apatite population has a particle size of 700 nm or less.
(Item A4)
The method according to item A1, wherein an average particle size of the carbonate apatite population is 30 nm or less.
(Item A5)
The method according to item A1, wherein the average particle size of the carbonate apatite population is 20 nm or less.
(Item A6)
The method of item A1, wherein the composition comprises an emulsified oily substance.
(Item A7)
The method according to Item A6, wherein the emulsified oily substance is contained in the composition in an amount of 0.5% (w / w) or more, and the HLB value of the composition is 3 to 16.
(Item A8)
The method of item A1, wherein the composition comprises a thickener.
(Item A9)
The method according to Item A1, wherein the viscosity of the composition is 1.3 mPa · s or more.
(Item A10)
The method according to Item A1, wherein the encapsulation rate of the drug in the composition is 90% or more.
(Item A11)
The method of item A1, wherein the composition comprises an electrophile.
(Item A12)
The method of item A1, wherein the composition comprises a nucleophile.
(Item A13)
The method of item A1, wherein the drug is a miRNA.
(Item A14)
A method of treating or preventing cancer comprising the step of administering a composition containing carbonate apatite encapsulating a drug, wherein 90% or more of the carbonate apatite population has a particle size of 700 nm or less ,Method.
(Item A15)
The method of item A14, wherein the drug is a miRNA.
(Item A16)
The method according to Item A14, wherein the drug is an anticancer drug.
(Item A17)
A method for producing a carbonate apatite encapsulating a drug comprising the step of incubating a mixture containing calcium ions, phosphate ions, hydrogen carbonate ions and a drug, wherein the incubation temperature is 10 A method wherein the temperature is not higher than 0 C and the incubation time is within 10 minutes.
(Item A18)
The method according to item A17, wherein said incubation time is within 1 minute.
(Item A19)
The method according to item A17, wherein the mixture comprises an emulsified oily substance.
(Item A20)
A method of preparing an aqueous solution in which a carbonate apatite encapsulating a drug is dispersed, comprising the following:
(A) a step of incubating a mixture containing calcium ions, phosphate ions, bicarbonate ions, and a drug, wherein the incubation temperature is 10 ° C. or less and the incubation time is within 10 minutes Process;
(B) high-speed centrifugation of the mixture after completion of incubation; and
(C) a step of dispersing a precipitate obtained by high-speed centrifugation in an aqueous solution having a viscosity of 1.3 mPa · s or more,
Including the method.
(Item A21)
The method according to item A20, wherein the incubation time is within 1 minute.
(Item A22)
The method according to item A20, wherein the mixture comprises an emulsified oily substance.
(Item A23)
The method of item A20, wherein a voltage is applied to the mixture in at least a portion of step (a).
(Item A24)
A method for producing a carbonated apatite containing a drug, comprising:
(A) A step of introducing water produced by an RO water production apparatus or distilled water production apparatus into a stirrer;
(B) introducing phosphate ions and bicarbonate ions into the stirrer;
(C) adjusting the pH of the mixture charged in steps (a) and (b);
(D) adding calcium ions and a drug to the mixture adjusted in pH in step (c) and incubating at 10 ° C. or less within 10 minutes;
(E) adding an emulsified oily substance to the mixture before or after incubation in step (d);
(F) Centrifugating the mixture obtained in step (e) in a centrifuge having an inner cylinder coated with polypropylene or an inner cylinder fitted with a polypropylene cylinder to obtain a precipitate; and
(G) A substance selected from the group consisting of air, distilled water, physiological saline, and a thickener is added with a nozzle that automatically inserts the precipitate obtained in step (f) from the top or bottom of the cylinder. Jetting and collecting process,
Including the method.
(Item A25)
The method according to item A24, further comprising:
(H) Bottled precipitate recovered in step (g) and freeze-dried;
Including the method.
適切な粒径（平均粒径および最大粒径）を有し、かつ、粒径の分散（σ２）が小さく、薬物内包率の高い炭酸アパタイトが提供される。本発明の炭酸アパタイトを用いることによって、細胞への薬物の送達を高効率で安全に行うことを可能とする。 Carbonate apatite having an appropriate particle size (average particle size and maximum particle size), small particle size dispersion (σ 2 ), and high drug encapsulation rate is provided. By using the carbonate apatite of the present invention, it is possible to safely and efficiently deliver a drug to cells.
以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。本明細書で使用する「％」は、そうでないと明記しない限り重量％（ｗ／ｗ％）を意味する。 The present invention will be described below. It should be understood that the terms used in this specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified. Thus, unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control. As used herein, “%” means weight percent (w / w%) unless otherwise specified.
（用語の定義）
本発明で使用される「炭酸アパタイト」の組成自体は公知である。炭酸アパタイトは、水酸アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）の水酸基（ＯＨ−）の一部を炭酸基（ＣＯ３ ２−）にて置換した化学構造を有し、一般式Ｃａ１０−ｍＸｍ（ＰＯ４）６（ＣＯ３）１−ｎＹｎで表すことができる。ここで、Ｘは、炭酸アパタイトにおけるＣａを部分的に置換しうる元素であればよく、例えば、Ｓｒ、Ｍｎ、希土類元素等を挙げることができる。ｍは、通常０以上１以下の正数であり、好ましくは０以上０．１以下であり、より好ましくは０以上０．０１以下であり、更に好ましくは０以上０．００１以下である。Ｙは、炭酸アパタイトにおけるＣＯ３を部分的に置換しうる単位であり、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ等を例示することができる。ｎは、通常０以上０．１以下の正数であり、好ましくは０以上０．０１以下であり、より好ましくは０以上０．００１以下であり、更に好ましくは０以上０．０００１以下である。本発明の炭酸アパタイトは、代表的には、例えば、ｐＨ８．０からｐＨ６．０に変化させた場合において、ｐＨ６．０に変化させてから所定時間内に、ｐＨ８．０において存在していた前記複合体粒子の少なくとも５０％が溶解する特性を有することを特徴とする。
本明細書において使用する「炭酸アパタイト」は、「薬物」を内包し、薬学的組成物または医薬組成物を生成することができる。本発明の薬学的組成物または医薬組成物の調製において、当業者は、癌をはじめ種々の疾患の治療・予防に利用することができる。本発明において、治療および/または予防の目的である疾患および/または状態に適切な薬物を選択することができる。
(Definition of terms)
The composition of “carbonate apatite” used in the present invention is known per se. Carbonate apatite has a chemical structure in which a hydroxyl group (OH-) of hydroxyapatite (Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ) is partially substituted with a carbonate group (CO 3 2− ). Ca 10-m X m (PO 4) 6 (CO 3) can be represented by 1-n Y n. Here, X may be any element that can partially replace Ca in the carbonate apatite, and examples thereof include Sr, Mn, and a rare earth element. m is a positive number of usually 0 or more and 1 or less, preferably 0 or more and 0.1 or less, more preferably 0 or more and 0.01 or less, and still more preferably 0 or more and 0.001 or less. Y is a unit that can partially substitute CO 3 in carbonate apatite, and examples thereof include OH, F, and Cl. n is usually a positive number of 0 or more and 0.1 or less, preferably 0 or more and 0.01 or less, more preferably 0 or more and 0.001 or less, and further preferably 0 or more and 0.0001 or less. . The carbonate apatite of the present invention is typically present at the pH 8.0 within a predetermined time after the change to pH 6.0 when the pH is changed from 8.0 to 6.0, for example. It is characterized in that at least 50% of the composite particles have the property of dissolving.
As used herein, “carbonate apatite” can encapsulate “drug” to produce a pharmaceutical composition or pharmaceutical composition. In the preparation of the pharmaceutical composition or pharmaceutical composition of the present invention, those skilled in the art can use it for the treatment and prevention of various diseases including cancer. In the present invention, an appropriate drug can be selected for the disease and / or condition that is the purpose of treatment and / or prevention.
本明細書において使用される用語「粒径」とは、レーザー回折分析装置を用いて体積基準にて測定される値をいう。この測定では、別個の粒子として認識可能な独立した粒子の粒径を測定する。そのため、複数の粒子が凝集している場合は、それらの集合体を一つの粒子と判断する。 As used herein, the term “particle size” refers to a value measured on a volume basis using a laser diffraction analyzer. In this measurement, the particle size of an independent particle that can be recognized as a separate particle is measured. Therefore, when a plurality of particles are aggregated, the aggregate is determined as one particle.
本明細書において使用される用語「平均粒径」とは、測定部位を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて測定した全ての粒子の粒径の平均値をいう。 The term “average particle diameter” used in this specification refers to the average value of the particle diameters of all the particles measured at the measurement site using an atomic force microscope (AFM).
本明細書において使用される用語「乳化油性物質」とは、細胞への投与に適合性の任意の油性（疎水性）の成分または両親媒性の成分であって、乳化する能力を有する成分をいう。本発明で使用する乳化油性物質としては、例えば、精製大豆油を有効成分とするイントラリポス（登録商標）、イコサペント酸エチル、リン脂質ＰＥＧ（リン脂質にＰＥＧを結合した物質）が挙げられるがこれらに限定されない。また、これらを適宜組み合わせたものを使用してもよい。 As used herein, the term “emulsifying oily substance” refers to any oily (hydrophobic) or amphiphilic component that is compatible with administration to cells and has the ability to emulsify. Say. Examples of the emulsified oily substance used in the present invention include Intralipos (registered trademark) containing purified soybean oil as an active ingredient, ethyl icosapentate, and phospholipid PEG (a substance obtained by binding phospholipid to PEG). It is not limited to. Moreover, you may use what combined these suitably.
本明細書において使用される用語「増粘剤」とは、細胞への投与に適合性の任意の物質であって水溶液の粘性を増大する物質をいう。本発明で使用する増粘剤としては、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、グリセリン、フルクトース、キシリトール、トレハロースなどの糖類、ならびに、ＰＥＧが挙げられるがこれらに限定されない。また、これらを適宜組み合わせたものを使用してもよい。 As used herein, the term “thickening agent” refers to any substance that is compatible with administration to cells and that increases the viscosity of an aqueous solution. Examples of the thickener used in the present invention include, but are not limited to, sugars such as glucose, sucrose, lactose, glycerin, fructose, xylitol, trehalose, and PEG. Moreover, you may use what combined these suitably.
本明細書において使用される用語「薬物」とは、細胞および／または組織への送達が意図される任意の物質をいう。薬物は、薬剤（例えば、薬理学的効果を奏する物質）であってもよい。本発明で使用する薬物としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、sｉ
ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の核酸（核酸医薬）、酵素、ペプチド又はタンパク質、各種ペプチド性ホルモン等のポリペプチド、フルオロウラシルなどの代謝拮抗剤、シクロホスファミドなどのアルキル化剤、シスプラチンなどの白金製剤、ベバシズマブなどの分子標的薬、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン）などの各種抗癌剤、各種抗生物質、ホルモン剤、ビタミン剤、抗アレルギー剤、中枢神経系疾患治療薬、循環器官疾患治療薬、呼吸器官系疾患治療薬、消化器官系疾患治療薬、泌尿生殖器官疾患治療薬等が挙げられるがこれらに限定されない。また、これらの複数を適宜組み合わせたものを使用してもよい。
As used herein, the term “drug” refers to any substance intended for delivery to cells and / or tissues. The drug may be a drug (for example, a substance having a pharmacological effect). Examples of the drug used in the present invention include DNA, RNA, antisense RNA, si
Nucleic acids (nucleic acid drugs) such as RNA and miRNA, enzymes, peptides or proteins, polypeptides such as various peptide hormones, antimetabolites such as fluorouracil, alkylating agents such as cyclophosphamide, platinum preparations such as cisplatin, bevacizumab Molecular target drugs such as, various anticancer drugs such as topoisomerase inhibitors (eg, irinotecan), various antibiotics, hormones, vitamins, antiallergic drugs, central nervous system disease drugs, cardiovascular disease drugs, respiratory system diseases Examples include, but are not limited to, therapeutic agents, digestive system disease therapeutic agents, urogenital organ disease therapeutic agents, and the like. Moreover, you may use what combined these plurality suitably.
本明細書において使用される用語「薬物の内包率」とは、投入した薬物のうち炭酸アパタイトに担持される薬物の割合をいう。例えば、内包率は、
（炭酸アパタイトに担持される薬物の量）／（投入した薬物の全量）
によって算出される。好ましくは、本発明における薬物の内包率は、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上である。
As used herein, the term “drug inclusion rate” refers to the proportion of a drug carried on carbonate apatite out of the charged drug. For example, the inclusion rate is
(Amount of drug supported on carbonate apatite) / (Total amount of drug added)
Is calculated by Preferably, the encapsulation rate of the drug in the present invention is 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more.
本明細書において使用される用語「求電子剤」とは、異なる化学種間で電子の授受を伴いながら化学反応を生成する反応において、電子を受け取る側の薬物をいう。本発明で使用する求電子剤としては、アセトアミノフェン、アセトサリチル酸、アスコルビン酸、ジアゼパム、などの官能基にカルボニル基を持つ物質が挙げられるがこれらに限定されない。また、これらを適宜組み合わせたものを使用してもよい。理論に拘束されることは望まないが、負電荷を帯びた薬物（例えば、核酸）を求電子剤により引き寄せ、粒子に内包させる。その中でも、官能基にカルボニル基を持つ物質の場合は、特にその効果が顕著であると考えられる。 As used herein, the term “electrophile” refers to a drug that receives an electron in a reaction that generates a chemical reaction while transferring electrons between different chemical species. Examples of the electrophile used in the present invention include, but are not limited to, substances having a carbonyl group in a functional group such as acetaminophen, acetosalicylic acid, ascorbic acid, diazepam, and the like. Moreover, you may use what combined these suitably. Although not wishing to be bound by theory, a negatively charged drug (eg, nucleic acid) is attracted by an electrophile and encapsulated in particles. Among these, in the case of a substance having a carbonyl group as a functional group, the effect is considered to be particularly remarkable.
本明細書において使用される用語「求核剤」とは、異なる化学種間で電子の授受を伴いながら化学反応を生成する反応において、電子を供与する側の薬物をいう。本発明で使用する求核剤としては、グリシン、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミンなどの官能基にアミノ基を持つ物質が挙げられるがこれらに限定されない。また、これらを適宜組み合わせたものを使用してもよい。理論に拘束されることは望まないが、正電荷を帯びた薬物（例えば、抗癌剤）を求核剤により引き寄せ、粒子に内包させる。その中でも、官能基にアミノ基を持つ物質の場合は、特にその効果が顕著であると考えられる。 As used herein, the term “nucleophile” refers to a drug that donates electrons in a reaction that generates a chemical reaction with the transfer of electrons between different chemical species. Examples of the nucleophile used in the present invention include, but are not limited to, substances having an amino group in a functional group such as glycine, adrenaline, noradrenaline, and dopamine. Moreover, you may use what combined these suitably. Although not wishing to be bound by theory, a positively charged drug (eg, an anticancer drug) is attracted by a nucleophile and encapsulated in the particles. Among them, in the case of a substance having an amino group as a functional group, the effect is considered to be particularly remarkable.
本発明の炭酸アパタイトの製造において使用される「カルシウムイオン」の供給源は、特に限定されることはないが、例えば、塩化カルシウムが挙げられるがこれに限定されない。 The source of “calcium ions” used in the production of the carbonate apatite of the present invention is not particularly limited, and examples include, but are not limited to, calcium chloride.
本発明の炭酸アパタイトの製造において使用される「リン酸イオン」の供給源は、特に限定されることはないが、例えば、リン酸二水素ナトリウム二水和物が挙げられるがこれに限定されない。 The source of “phosphate ions” used in the production of the carbonate apatite of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include, but are not limited to, sodium dihydrogen phosphate dihydrate.
本発明の炭酸アパタイトの製造において使用される「炭酸水素イオン」の供給源は、特に限定されることはないが、例えば、炭酸水素ナトリウムが挙げられるがこれに限定されない。 The source of “bicarbonate ions” used in the production of the carbonate apatite of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include sodium bicarbonate, but are not limited thereto.
本発明の炭酸アパタイトの製造における、カルシウムイオン、リン酸イオン、および、炭酸水素イオンを含む混合物をインキュベートするｐＨとしては、例えば、ｐＨ６．０〜９．０、ｐＨ７．０〜８．０、約ｐＨ７．５が挙げられるがこれらに限定されない。 In the production of the carbonate apatite of the present invention, the pH at which the mixture containing calcium ions, phosphate ions, and bicarbonate ions is incubated may be, for example, pH 6.0 to 9.0, pH 7.0 to 8.0, about pH 7.5 may be mentioned, but not limited thereto.
本発明の炭酸アパタイトの製造において使用されるインキュベート温度としては、好ましくは、１０℃以下、９℃以下、８℃以下、７℃以下、６℃以下、５℃以下、４℃以下、３℃以下、２℃以下が挙げられるがこれらに限定されない。ただし、混合物の凍結を避けることが好ましいので、例えば、１℃以上、２℃以上、３℃以上、４℃以上、５℃以上、６℃以上、７℃以上が使用される。 The incubation temperature used in the production of the carbonate apatite of the present invention is preferably 10 ° C or lower, 9 ° C or lower, 8 ° C or lower, 7 ° C or lower, 6 ° C or lower, 5 ° C or lower, 4 ° C or lower, 3 ° C or lower. Although 2 degrees C or less is mentioned, it is not limited to these. However, since it is preferable to avoid freezing of the mixture, for example, 1 ° C or higher, 2 ° C or higher, 3 ° C or higher, 4 ° C or higher, 5 ° C or higher, 6 ° C or higher, 7 ° C or higher is used.
本発明の炭酸アパタイトの製造において使用されるインキュベート温度を低温にすると、平均粒径が小さくなる。そのため、インキュベート温度を調整することによって生成される炭酸アパタイトの粒径を制御することが可能となる。理論に拘束されることは望まないが、より低温でインキュベートすると、粒子のブラウン運動が抑制され、その結果、粒子の凝集が抑制されるためであると考えられる。 When the incubation temperature used in the production of the carbonate apatite of the present invention is lowered, the average particle size becomes smaller. Therefore, it is possible to control the particle size of the carbonate apatite produced by adjusting the incubation temperature. Although not wishing to be bound by theory, it is considered that incubation at a lower temperature suppresses the Brownian motion of particles, and as a result, suppresses aggregation of particles.
本発明の炭酸アパタイトの製造において使用されるインキュベート時間としては、好ましくは、１０分以下、９分以下、８分以下、７分以下、６分以下、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、９０秒以下、７５秒以下、６０秒以下、４５秒以下、３０秒以下が挙げられるがこれらに限定されない。また、インキュベート時間は、好ましくは、１０秒以上、１５秒以上、２０秒以上、２５秒以上、３０秒以上、３５秒以上、４０秒以上、４５秒以上、５０秒以上、５５秒以上である。理論に拘束されることは望まないが、例えば、インキュベート温度を８℃にした場合、炭酸アパタイトの生成反応は約１分以内に終了し、それ以降は凝集反応が促進されると考えられる。 The incubation time used in the production of the carbonate apatite of the present invention is preferably 10 minutes or less, 9 minutes or less, 8 minutes or less, 7 minutes or less, 6 minutes or less, 5 minutes or less, 4 minutes or less, 3 minutes or less. Examples include, but are not limited to, 2 minutes or less, 90 seconds or less, 75 seconds or less, 60 seconds or less, 45 seconds or less, or 30 seconds or less. The incubation time is preferably 10 seconds or more, 15 seconds or more, 20 seconds or more, 25 seconds or more, 30 seconds or more, 35 seconds or more, 40 seconds or more, 45 seconds or more, 50 seconds or more, 55 seconds or more. . Although not wishing to be bound by theory, for example, when the incubation temperature is set to 8 ° C., it is considered that the formation reaction of carbonate apatite is completed within about 1 minute, and the aggregation reaction is promoted thereafter.
本発明の炭酸アパタイトの製造において使用される反応（インキュベート）は、例えば、リン酸イオンおよび炭酸水素イオンを含む混合物にカルシウムイオンを添加することによって開始することができる。また、インキュベートはインキュベート混合物に増粘剤および／または乳化油性物質を添加することによって終了することができる。ただし、１分以内という短時間で生成反応がほぼ終了するため、最初から乳化油性物質または増粘剤を加えても構わない。 The reaction (incubation) used in the production of the carbonate apatite of the present invention can be initiated, for example, by adding calcium ions to a mixture containing phosphate ions and bicarbonate ions. Incubation can also be terminated by adding thickeners and / or emulsified oily substances to the incubation mixture. However, since the production reaction is almost completed in a short time of 1 minute or less, an emulsified oily substance or a thickener may be added from the beginning.
本発明の炭酸アパタイトを含む水溶液中の乳化油性物質の濃度は、代表的には０．１％（ｗ／ｗ）以上、０．２％（ｗ／ｗ）以上、０．３％（ｗ／ｗ）以上、０．４％（ｗ／ｗ）以上、０．５％（ｗ／ｗ）以上、０．６％（ｗ／ｗ）以上、０．７％（ｗ／ｗ）以上、０．８％（ｗ／ｗ）以上、０．９％（ｗ／ｗ）以上、１．０％（ｗ／ｗ）以上であり、２．０％（ｗ／ｗ）以下、１．８％（ｗ／ｗ）以下、１．６％（ｗ／ｗ）以下、１．４％（ｗ／ｗ）以下、１．２％（ｗ／ｗ）以下、１．０％（ｗ／ｗ）以下、０．８％（ｗ／ｗ）以下、０．６％（ｗ／ｗ）以下である。乳化油性物質のＨＬＢ値は、代表的には３〜１６、好ましくは６〜１０である。理論に拘束されることは望まないが、化学反応であるがゆえ、粒子生成はほぼ瞬時に完了するため、反応前または反応後に乳化油性物質を投与することにより、超微細粒子生成の途中で反応を停止させ凝集を抑制すると考えられる。 The concentration of the emulsified oily substance in the aqueous solution containing the carbonate apatite of the present invention is typically 0.1% (w / w) or more, 0.2% (w / w) or more, 0.3% (w / w). w) or more, 0.4% (w / w) or more, 0.5% (w / w) or more, 0.6% (w / w) or more, 0.7% (w / w) or more, 0. 8% (w / w) or more, 0.9% (w / w) or more, 1.0% (w / w) or more, 2.0% (w / w) or less, 1.8% (w / W) or less, 1.6% (w / w) or less, 1.4% (w / w) or less, 1.2% (w / w) or less, 1.0% (w / w) or less, 0 0.8% (w / w) or less, 0.6% (w / w) or less. The emulsified oily substance typically has an HLB value of 3 to 16, preferably 6 to 10. Although it is not desired to be bound by theory, since it is a chemical reaction, particle formation is completed almost instantaneously, so it is possible to react during the production of ultrafine particles by administering an emulsified oily substance before or after the reaction. It is considered that the agglutination is stopped and aggregation is suppressed.
本発明の水溶液中に含まれる炭酸アパタイトの集団は、集団の９０％以上が７００ｎｍ以下の粒径を有する、集団の９５％以上が７００ｎｍ以下の粒径を有する、集団の９８％以上が７００ｎｍ以下の粒径を有する、集団の９９％以上が７００ｎｍ以下の粒径を有する、集団の９０％以上が６００ｎｍ以下の粒径を有する、集団の９５％以上が６００ｎｍ以下の粒径を有する、集団の９８％以上が６００ｎｍ以下の粒径を有する、集団の９９％以上が６００ｎｍ以下の粒径を有する、集団の９０％以上が５００ｎｍ以下の粒径を有する、集団の９５％以上が５００ｎｍｎｍ以下の粒径を有する、集団の９８％以上が５００ｎｍ以下の粒径を有する、集団の９９％以上が５００ｎｍ以下の粒径を有する、集団の９０％以上が４００ｎｍ以下の粒径を有する、集団の９５％以上が４００ｎｍ以下の粒径を有する、集団の９８％以上が４００ｎｍ以下の粒径を有する、あるいは、集団の９９％以上が４００ｎｍ以下の粒径を有する。
本発明の炭酸アパタイトの集団の特徴である上記に示した粒径を達成するためには、炭酸アパタイトを超音波処理することは不要である。超音波処理は炭酸アパタイト粒子を破壊するため炭酸アパタイトの粒径を小さくすることは可能であるが、粒子の破壊は均一に行われないため、結果として、炭酸アパタイト集団に含まれる各炭酸アパタイト粒子の粒径は大きく異なる。粒径のばらつきは、医薬組成物・薬学的組成物として使用する場合の大きなデメリットとなる。超音波処理を受けた炭酸アパタイトの粒子は凝集しやすい。そのため、超音波処理した炭酸アパタイトを医薬組成物・薬学的組成物として使用する場合には速やかに投与する必要があり、例えば、フィルター処理などによるサイズ分画をさらに行うことは困難である。これに対して、本発明の炭酸アパタイトの集団は超音波処理を受けていないため、数分以上または数十分以上放置しても凝集することがない。例えば、上記に示した本発明の炭酸アパタイトの集団の粒径の特徴は、例えば、本発明の炭酸アパタイト集団を室温（例えば、２５℃）で、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４５分間、または、６０分間放置した後でも維持される。
また、本発明の炭酸アパタイトは超音波処理を必要としないため室温で数分以上または数十分以上放置しても凝集することがない（溶液中で分散した状態を保つ）ことから、凝集を防止するため（溶液中で分散状態を保つため）のアルブミンの添加は不要である。したがって、本発明の炭酸アパタイトが分散した溶液は、好ましくは、アルブミンを含まない溶液または実質的に含まない溶液である。本発明によって作製される医薬組成物・薬学的組成物は、アルブミンを含まないことから、アルブミンに起因する疾患のリスクを回避することができる。
The group of carbonate apatite contained in the aqueous solution of the present invention is such that 90% or more of the group has a particle size of 700 nm or less, 95% or more of the group has a particle size of 700 nm or less, and 98% or more of the group has 700 nm or less. 99% or more of the population having a particle size of 700 nm or less, 90% or more of the population having a particle size of 600 nm or less, 95% or more of the population having a particle size of 600 nm or less 98% or more has a particle size of 600 nm or less, 99% or more of the population has a particle size of 600 nm or less, 90% or more of the population has a particle size of 500 nm or less, 95% or more of the population has a particle size of 500 nm or less 98% or more of the population having a particle size has a particle size of 500 nm or less, 99% or more of the population has a particle size of 500 nm or less, and 90% or more of the population has a particle size of 400 nm or less Having more than 95% of the population have a particle size of less than 400 nm, more than 98% of the population have a particle size of less than 400 nm, or more than 99% of the population have a particle size of less than 400 nm.
In order to achieve the above-described particle size characteristic of the carbonate apatite group of the present invention, it is unnecessary to ultrasonically treat the carbonate apatite. Since ultrasonic treatment destroys the carbonate apatite particles, it is possible to reduce the particle size of the carbonate apatite, but because the particles are not uniformly broken, as a result, each carbonate apatite particle included in the carbonate apatite population The particle diameters of these are very different. The variation in particle size is a major disadvantage when used as a pharmaceutical composition / pharmaceutical composition. The carbonate apatite particles that have undergone ultrasonic treatment tend to aggregate. Therefore, when using ultrasonicated carbonate apatite as a pharmaceutical composition / pharmaceutical composition, it is necessary to administer it promptly. For example, it is difficult to further perform size fractionation by filtering or the like. In contrast, the carbonate apatite population of the present invention has not been subjected to ultrasonic treatment, and therefore does not aggregate even if left for several minutes or more. For example, the particle size characteristics of the carbonate apatite population of the present invention shown above are, for example, the carbonate apatite population of the present invention at room temperature (eg, 25 ° C.) for 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes, 20 minutes, It is maintained even after 30 minutes, 45 minutes, or 60 minutes.
In addition, since the carbonate apatite of the present invention does not require sonication, it does not aggregate even if it is left at room temperature for several minutes or more than several tens of minutes (keep it dispersed in a solution). It is not necessary to add albumin to prevent (to keep the dispersion in the solution). Therefore, the solution in which the carbonate apatite of the present invention is dispersed is preferably a solution not containing albumin or a solution substantially free of albumin. Since the pharmaceutical composition / pharmaceutical composition prepared by the present invention does not contain albumin, the risk of diseases caused by albumin can be avoided.
本発明の水溶液中に含まれる炭酸アパタイトの集団の平均粒径は、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２０ｎｍ以下、１５ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、７ｎｍ以下、あるいは、５ｎｍ以下である。 The average particle diameter of the carbonate apatite group contained in the aqueous solution of the present invention is 50 nm or less, 40 nm or less, 30 nm or less, 20 nm or less, 15 nm or less, 10 nm or less, 7 nm or less, or 5 nm or less.
本発明の水溶液中に含まれる炭酸アパタイトの集団の粒径の分散「σ２」は、好ましくは０．１以下、より好ましくは０．０５以下、さらに好ましくは０．０１以下であるがこれらに限定されない。 The dispersion of the particle size “σ 2 ” of the carbonate apatite group contained in the aqueous solution of the present invention is preferably 0.1 or less, more preferably 0.05 or less, and even more preferably 0.01 or less. It is not limited.
本発明の炭酸アパタイトの水溶液は、例えば、高速遠心して得られた炭酸アパタイト沈殿を水溶液中に分散させることによって調製可能である。分散させる水溶液の粘度としては、例えば、０．５ｍＰａ・s以上、０．６ｍＰａ・s以上、０．７ｍＰａ・s以上、０．８ｍＰａ・s以上、０．９ｍＰａ・s以上、１．０ｍＰａ・s以上、１．１ｍＰａ・s以上、１．２ｍＰａ・s以上、１．３ｍＰａ・s以上、１．４ｍＰａ・s以上、１．５ｍＰａ・s以上、１．６ｍＰａ・s以上、１．７ｍＰａ・s以上、１．８ｍＰａ・s以上、ならびに、５．０ｍＰａ・s以下、４．５ｍＰａ・s以下、４．０ｍＰａ・s以下、３．５ｍＰａ・s以下、３．０ｍＰａ・s以下、２．９ｍＰａ・s以下、２．８ｍＰａ・s以下、２．７ｍＰａ・s以下、２．６ｍＰａ・s以下、２．５ｍＰａ・s以下、２．４ｍＰａ・s以下、２．３ｍＰａ・s以下、２．２ｍＰａ・s以下、２．１ｍＰａ・s以下、２．０ｍＰａ・s以下が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明で使用する高速遠心としては、例えば、８，０００Ｇ以上、９，０００Ｇ以上、１０，０００Ｇ以上、１１，０００Ｇ以上、１２，０００Ｇ以上、１３，０００Ｇ以上、１４，０００Ｇ以上、例えば、８，０００Ｇ、９，０００Ｇ、１０，０００Ｇ、１１，０００Ｇ、１２，０００Ｇ、１３，０００Ｇ、および、１４，０００Ｇが挙げられるがこれらに限定されない。
The aqueous solution of carbonate apatite of the present invention can be prepared, for example, by dispersing a carbonate apatite precipitate obtained by high-speed centrifugation in an aqueous solution. The viscosity of the aqueous solution to be dispersed is, for example, 0.5 mPa · s or more, 0.6 mPa · s or more, 0.7 mPa · s or more, 0.8 mPa · s or more, 0.9 mPa · s or more, 1.0 mPa · s or more. Or more, 1.1 mPa · s or more, 1.2 mPa · s or more, 1.3 mPa · s or more, 1.4 mPa · s or more, 1.5 mPa · s or more, 1.6 mPa · s or more, 1.7 mPa · s or more 1.8 mPa · s or less, 5.0 mPa · s or less, 4.5 mPa · s or less, 4.0 mPa · s or less, 3.5 mPa · s or less, 3.0 mPa · s or less, 2.9 mPa · s or less 2.8 mPa · s or less, 2.7 mPa · s or less, 2.6 mPa · s or less, 2.5 mPa · s or less, 2.4 mPa · s or less, 2.3 mPa · s or less, 2.2 mPa · s or less 2.1 mPa · s or less, 2.0 mPa · s or less. But it is not limited to.
Examples of the high-speed centrifugation used in the present invention include 8,000 G or more, 9,000 G or more, 10,000 G or more, 11,000 G or more, 12,000 G or more, 13,000 G or more, 14,000 G or more, for example, 8 , 1,000 G, 9,000 G, 10,000 G, 11,000 G, 12,000 G, 13,000 G, and 14,000 G.
薬物を内包した炭酸アパタイトの製造方法は特定の方法に限定されることはないが、例えば、以下：
（ａ）ＲＯ水製造装置または蒸留水製造装置で製造された水を攪拌機に投入する工程；
（ｂ）リン酸イオン、および、炭酸水素イオンを該攪拌機に投入する工程；
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）によって投入された混合物のｐＨを調整する工程；
（ｄ）工程（ｃ）でｐＨを調整した混合物にカルシウムイオン、および薬物を投入し、低温（例えば、、約１０℃、約９℃、約８℃、約７℃、約６℃、約５℃、約４℃、約３℃、または、約２℃）かつ短時間（例えば、１０分以下、９分以下、８分以下、７分以下、６分以下、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、９０秒以下、７５秒以下、６０秒以下、４５秒以下、または、３０秒以下）インキュベートする工程；
（ｅ）工程（ｄ）でインキュベート前またはインキュベート後の混合物に乳化油性物質を添加する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で得られた混合物を、ポリプロピレンを塗布した内筒またはポリプロピレン筒を装着した内筒を有する遠心分離機にて遠心分離して、沈殿を得る工程；ならびに、
（ｇ）工程（ｆ）で得られた沈殿を、該筒の上部または底部より自動挿入したノズルにて、空気、蒸留水、生理食塩水、および増粘剤からなる群から選択される物質を噴射し回収する工程、
を包含する方法によって製造することが可能である。
（薬物）
本発明において使用する薬物としては、例えば、核酸医薬の有効成分である核酸分子、ならびに、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。核酸医薬としては、例えば、デコイ、アンチセンス、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、および、ＣｐＧオリゴが挙げられるがこれらに限定されない。
ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ分子）は、一般に２０〜２５ヌクレオチド長である。ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡと呼ばれるより長い前駆体ＲＮＡ分子（「前駆体ｍｉＲＮＡ」）からプロセスされる。前駆体ｍｉＲＮＡは、非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体ｍｉＲＮＡは、ステムループまたは折り畳み様構造を形成することを可能にする相補性の２つの領域を有し、核内でＤｒｏｓｈａと呼ばれる酵素によって切断される。Ｄｒｏｓｈａは、リボヌクレアーゼＩＩＩ様ヌクレアーゼである。Ｄｒｏｓｈａによって切断されることによって生成されたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは次に細胞質でＤｉｃｅｒと呼ばれる酵素によってスプライシングされ、ＲＩＳＣに取り込まれた後にｍｉＲＮＡとなる。ｍｉＲＮＡは、典型的にはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのステムループ中のステムの一部である。
本発明においては、所望の薬理効果・生理学的効果に基づき、種々の核酸医薬（例えば、ｍｉＲＮＡ）を用いることができる。核酸医薬は、例えば、５’末端のリン酸基もしくはヒドロキシル基の置換；ホスホジエステル結合の他の結合様式（例えば、ホスホロチオエート結合）への変換；および/または糖修飾（例えば、２’Ｏ−Ｍｅ修飾）などを含んでもよい。
使用可能なｍｉＲＮＡとしては、限定されることはないが、例えば、
［ｍｉＲ−３４ａ］ ５’−ｕｇｇｃａｇｕｇｕｃｕｕａｇｃｕｇｇｕｕｇｕ−３’（配列番号１）、
［ｍｉＲ−１４８ａ］ ５’−ｕｃａｇｕｇｃａｃｕａｃａｇａａｃｕｕｕｇｕ−３’（配列番号２）、および、
［ｍｉＲ−２００ａ］ ５’−ｕａａｃａｃｕｇｕｃｕｇｇｕａａｃｇａｕｇｕ−３’（配列番号３）
が挙げられるがこれらに限定されない。本発明においては、前駆体ｍｉＲＮＡ、または、前駆体ｍｉＲＮＡをコードする核酸もまた薬剤として使用可能である。
（内包率の改善）
本発明の製造方法を用いた場合、薬物の内包率（炭酸アパタイトへの内包率）は従来技術よりも格段に優れている。さらに薬物の内包率を改善する方法としては、例えば、内包反応を起こす溶液に電圧を印加して、例えば、負電荷を帯びた薬物（例えば、核酸）が正電荷を帯びたカルシウムイオンと接触する確率を増加する方法が挙げられる。または、正電荷を帯びた薬物（例えば、抗癌剤）が負電荷を帯びた炭酸アパタイトと接触する確率を増加する方法が挙げられる。ただし、薬物は電荷を帯びていなくても良い。これは、炭酸アパタイトやカルシウムイオンが電荷を帯びているため電圧印加によって溶液中を移動し、薬物と接触する確率が増加するためである。また、抗癌剤は負電荷を帯びていても良い。これは、正電荷を帯びたカルシウムイオンと接触する確率が増加するためである。
印加電圧は、１００Ｖ〜１０００Ｖであるが、これに限定されない。好ましくは、２００〜６００Ｖ、より好ましくは３６０〜４６０Ｖである。印加は、極短時間、好ましくは、０．６ｍｓ〜１．０ｍｓの１パルスを、３〜５０回、約５秒毎に行うが、これに限定されない。電圧印加1回ごとに印加の方向（＋極と−極の向き）を１８０度変えることで、（ａ）負電荷を帯びた薬物と正電荷を帯びたカルシウムイオンが、あるいは、（ｂ）正電荷を帯びた薬物と負電荷を帯びた炭酸アパタイトが、偏らずに混合液中を移動できるようになり、接触の機会が格段に増え、結果として、内包率が改善される。
（処方）
本発明の水溶液を医薬組成物・薬学的組成物として使用する場合、組成物に含まれる担体としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物オイル、リポソーム）、およびその組み合わせを含むがそれらに限定されない、溶剤または分散媒質が挙げられる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング剤の使用によって；例えば、液体ポリオールまたは脂質などの担体における分散による必要とされる粒子サイズの維持によって；例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用によって；またはそのような方法の組み合わせによって維持され得る。多くの場合において、例えば糖、塩化ナトリウム、またはその組み合わせなどの等張剤を含むことが好ましいと思われる。
本発明の医薬組成物・薬学的組成物は、他の追加の抗癌剤と共に製剤化されていてもよく、また他の追加の抗癌剤と併用投与されてもよい。このような抗癌剤としては、限定されることはないが、例えば、シクロホスファミド水和物、イホスファミド、チオテパ、ブスルファラン、メルファラン、ニムスチン塩酸塩、ラニムスチン、ダカルパジン、テモゾロミド等のアルキル化剤；メトトレキサート、ペメトレキセドナトリウム水和物、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、カペシタビン、タガフール、シタラビン、ゲムシタビン塩酸塩、フルダラビン燐酸エステル、ネララビン、クラドリビン、レボホリナートカルシウム等の代謝拮抗剤；ドキソルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩、プラルビシン、エピルビシン塩酸塩、イダルビシン塩酸塩、アクラルビシン塩酸塩、アムルビシン塩酸塩、ミトキサントロン塩酸塩、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ブレオマシイン塩酸塩、ペプロマイシン塩酸塩、ジノスタチンスチマラマー、カリケアマイシン等の抗生物質；ビンクリスチン硫酸塩、ビンブラスチン硫酸塩、ビンデシン硫酸塩、パクリタキセル等の微小管阻害剤；アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾール塩酸塩水和物等のアロマターゼ阻害剤；シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン等の白金製剤；イリノテカン塩酸塩水和物、ノギテカン塩酸塩、エトポシド、ソブゾキサン等のトポイソメラーゼ阻害剤；プレドニゾロン、デキサメサゾンなどの副腎皮質ステロイド；サリドマイドおよびその誘導体であるレナリドマイド；プロテアーゼ阻害剤であるボルテゾミブ等が挙げられる。これら追加の抗癌剤は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
The method for producing the carbonate apatite encapsulating the drug is not limited to a specific method.
(A) A step of introducing water produced by an RO water production apparatus or distilled water production apparatus into a stirrer;
(B) introducing a phosphate ion and a bicarbonate ion into the stirrer;
(C) adjusting the pH of the mixture charged in steps (a) and (b);
(D) Calcium ions and a drug are added to the mixture whose pH has been adjusted in step (c), and low temperature (eg, about 10 ° C., about 9 ° C., about 8 ° C., about 7 ° C., about 6 ° C., about 5 ° C.) ℃, about 4 ℃, about 3 ℃, or about 2 ℃) and a short time (for example, 10 minutes or less, 9 minutes or less, 8 minutes or less, 7 minutes or less, 6 minutes or less, 5 minutes or less, 4 minutes or less, 3 minutes or less, 2 minutes or less, 90 seconds or less, 75 seconds or less, 60 seconds or less, 45 seconds or less, or 30 seconds or less) incubating;
(E) adding an emulsified oily substance to the mixture before or after incubation in step (d);
(F) Centrifugating the mixture obtained in step (e) in a centrifuge having an inner cylinder coated with polypropylene or an inner cylinder fitted with a polypropylene cylinder to obtain a precipitate; and
(G) A substance selected from the group consisting of air, distilled water, physiological saline, and a thickener is added with a nozzle that automatically inserts the precipitate obtained in step (f) from the top or bottom of the cylinder. Jetting and collecting process,
It is possible to manufacture by the method of including.
(Drug)
Examples of the drug used in the present invention include, but are not limited to, a nucleic acid molecule that is an active ingredient of a nucleic acid drug, and peptides, polypeptides, and proteins. Examples of nucleic acid drugs include, but are not limited to, decoy, antisense, miRNA, siRNA, aptamer, and CpG oligo.
miRNAs (microRNA molecules) are generally 20-25 nucleotides in length. miRNAs are processed from longer precursor RNA molecules ("precursor miRNAs") called pri-miRNAs. The precursor miRNA is transcribed from a non-protein coding gene. The precursor miRNA has two regions of complementarity that allow it to form a stem loop or fold-like structure and is cleaved in the nucleus by an enzyme called Drosha. Drosha is a ribonuclease III-like nuclease. The pre-miRNA generated by being cleaved by Drosha is then spliced in the cytoplasm by an enzyme called Dicer and becomes miRNA after being incorporated into RISC. The miRNA is typically part of the stem in the stem loop of the pri-miRNA.
In the present invention, various nucleic acid drugs (for example, miRNA) can be used based on desired pharmacological effects and physiological effects. Nucleic acid pharmaceuticals, for example, replace the phosphate or hydroxyl group at the 5 ′ end; convert phosphodiester linkages to other binding modes (eg, phosphorothioate linkages); and / or sugar modifications (eg, 2′O-Me). Modification) and the like.
The miRNA that can be used is not limited, but for example,
[MiR-34a] 5′-uggcagugucuugaugcugugu-3 ′ (SEQ ID NO: 1),
[MiR-148a] 5'-ucaguggcacuacagaacauugu-3 '(SEQ ID NO: 2), and
[MiR-200a] 5'-uaacacugucuguguacacuguu-3 '(SEQ ID NO: 3)
However, it is not limited to these. In the present invention, a precursor miRNA or a nucleic acid encoding the precursor miRNA can also be used as a drug.
(Improvement of inclusion rate)
When the production method of the present invention is used, the drug encapsulation rate (encapsulation rate in carbonate apatite) is far superior to the prior art. Further, as a method for improving the encapsulation rate of a drug, for example, a voltage is applied to a solution that causes an encapsulation reaction, and, for example, a negatively charged drug (for example, a nucleic acid) contacts positively charged calcium ions. There is a method of increasing the probability. Alternatively, there is a method of increasing the probability that a positively charged drug (for example, an anticancer drug) comes into contact with a negatively charged carbonate apatite. However, the drug may not be charged. This is because carbonate apatite and calcium ions are charged and move through the solution by applying a voltage, increasing the probability of contact with the drug. In addition, the anticancer agent may be negatively charged. This is because the probability of contact with positively charged calcium ions increases.
The applied voltage is 100V to 1000V, but is not limited thereto. Preferably, it is 200-600V, More preferably, it is 360-460V. The application is performed for a very short time, preferably 1 pulse of 0.6 ms to 1.0 ms, 3 to 50 times every about 5 seconds, but is not limited thereto. By changing the direction of application (direction of + pole and -pole) by 180 degrees for each voltage application, (a) negatively charged drug and positively charged calcium ion, or (b) positive The charged drug and the negatively charged carbonate apatite can move through the mixed solution without being biased, and the chance of contact is greatly increased. As a result, the inclusion rate is improved.
(Prescription)
When the aqueous solution of the present invention is used as a pharmaceutical composition / pharmaceutical composition, the carrier contained in the composition includes water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol and the like), lipid (for example, Triglycerides, vegetable oils, liposomes), and combinations thereof, including but not limited to solvents or dispersion media. Proper fluidity is achieved, for example, by the use of a coating such as lecithin; for example, by the maintenance of the required particle size by dispersion in a carrier such as a liquid polyol or lipid; for example, the use of a surfactant such as hydroxypropylcellulose. Or by a combination of such methods. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars, sodium chloride, or combinations thereof.
The pharmaceutical composition / pharmaceutical composition of the present invention may be formulated together with other additional anticancer agents, or may be administered in combination with other additional anticancer agents. Examples of such anticancer agents include, but are not limited to, alkylating agents such as cyclophosphamide hydrate, ifosfamide, thiotepa, busulphalan, melphalan, nimustine hydrochloride, ranimustine, dacarpazine, and temozolomide; methotrexate , Pemetrexed sodium hydrate, fluorouracil, doxyfluridine, capecitabine, tagafur, cytarabine, gemcitabine hydrochloride, fludarabine phosphate, nelarabine, cladribine, levofolinate calcium, etc .; doxorubicin hydrochloride, daunorubicin hydrochloride, prrubicin hydrochloride, prrubicin hydrochloride Idarubicin hydrochloride, aclarubicin hydrochloride, amrubicin hydrochloride, mitoxantrone hydrochloride, mitomycin C, actinomycin D, bleomasii Antibiotics such as hydrochloride, peplomycin hydrochloride, dinostatin stimamarer, calicheamicin; microtubule inhibitors such as vincristine sulfate, vinblastine sulfate, vindesine sulfate, paclitaxel; anastrozole, exemestane, letrozole, Aromatase inhibitors such as fadrozol hydrochloride hydrate; platinum preparations such as cisplatin, carboplatin, nedaplatin, oxaliplatin; topoisomerase inhibitors such as irinotecan hydrochloride hydrate, nogitecan hydrochloride, etoposide, sobuzoxane; Steroid; thalidomide and its derivative lenalidomide; and protease inhibitor bortezomib. These additional anticancer agents may be used alone or in combination of two or more.
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。なお、本発明の炭酸アパタイトの製造は特定の装置のみによって可能となるものではないが、例えば、図１６に示す装置を利用することができる。 The present invention will be described below based on examples, but the following examples are provided for illustrative purposes only. Accordingly, the scope of the present invention is not limited to the above detailed description of the invention nor the following examples, but is limited only by the scope of the claims. In addition, although manufacture of the carbonate apatite of this invention is not possible only by a specific apparatus, the apparatus shown in FIG. 16 can be utilized, for example.
（実施例１：インキュベート温度の影響）
本実施例では、以下のとおりに炭酸アパタイトの製造を行って、インキュベート温度による粒子径への影響を調べた。
・８℃に保冷した蒸留水９０ｍｌに炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）０．７４ｇおよび１Ｍリン酸二水素ナトリウム二水和物（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）１８０μＬを添加し、さらに、全量１００ｍｌになるように蒸留水を加えた。
・水溶液のｐＨを７．５に調整した（ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いた）。
・０．２２μｍフィルターに通して２５ｍｌずつチューブ４本に分注した。
・チューブ１本に対して１Ｍ ＣａＣｌ２ ２９０μＬを加え、ＶＯＬＴＥＸで撹拌した（５〜１０秒程度）。
・４℃、８℃、１２℃、１６℃、２０℃、２４℃、２８℃、３２℃、または、３７℃で３０分間インキュベートした。
(Example 1: Influence of incubation temperature)
In this example, carbonate apatite was produced as follows, and the influence of the incubation temperature on the particle size was examined.
・ To 90 ml of distilled water kept at 8 ° C., 0.74 g of sodium hydrogen carbonate (NaHCO 3 ) and 180 μL of 1M sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH 2 PO 4 .2H 2 O) were added, and a total volume of 100 ml Distilled water was added so that
Adjust the pH of the aqueous solution to 7.5 (using HCl or NaOH).
-Passed through a 0.22 μm filter and dispensed into 4 tubes of 25 ml each.
· A 1M CaCl 2 290μL added to one tube, and stirred at Voltex (about 5 to 10 seconds).
Incubated at 4 ° C, 8 ° C, 12 ° C, 16 ° C, 20 ° C, 24 ° C, 28 ° C, 32 ° C, or 37 ° C for 30 minutes.
このときの粒子径の分布（Ｄ５０、メジアン径）を、堀場製作所のＰＡＲＴＩＣＡ ＬＡ９６０を用いて決定した。測定値は体積基準値である。その結果は、以下のとおりである。 The particle size distribution (D50, median diameter) at this time was determined using PARTICA LA960 from Horiba. The measured value is a volume reference value. The results are as follows.
（表１）
種々のインキュベート温度を用いて製造した炭酸アパタイトの粒径
温度 Ｄ５０（メジアン径）
４℃ ０．３８１
８℃ ０．６７７
１２℃ ０．７５４
１６℃ ０．８８７
２０℃ ２．５３７
２４℃ ５．７０７
２８℃ １１．０４２
３２℃ １４．５９０
３７℃ １６．０１７。
(Table 1)
Particle size of carbonate apatite produced using various incubation temperatures
Temperature D50 (median diameter)
4 ° C 0.381
8 ° C 0.677
12 ° C 0.754
16 ° C 0.887
20 ° C 2.537
24 ° C 5.707
28 ° C 11.042
32 ° C 14.590
37 ° C 16.017.
低温（８℃）または高温（３７℃）の場合のより詳細な粒度分布を図１に示した。低温（８℃）の場合は、高温（３７℃）の場合よりも小さい粒子径のピークが高かった。高温（３７℃）サンプルは各試薬量を１／２とした。これらの結果から、１０℃以下のインキュベート温度が適切であると理解できる。理論に拘束されることは望まないが、粒径が小さくなる原因は、より低温でインキュベートすると、粒子のブラウン運動が抑制され、その結果、粒子の凝集が抑制されるためであると考えられる。 A more detailed particle size distribution at low temperature (8 ° C.) or high temperature (37 ° C.) is shown in FIG. In the case of low temperature (8 ° C.), the peak of small particle diameter was higher than that in the case of high temperature (37 ° C.). In the high temperature (37 ° C.) sample, the amount of each reagent was halved. From these results, it can be understood that an incubation temperature of 10 ° C. or lower is appropriate. Although not wishing to be bound by theory, it is considered that the reason why the particle size becomes smaller is that when incubated at a lower temperature, Brownian motion of the particles is suppressed, and as a result, aggregation of the particles is suppressed.
（実施例２：インキュベート時間の影響）
実施例１と同様の実験を行った。ただし、インキュベート温度を８℃にし、図２に示される時間、インキュベートを行った。堀場製作所のＰＡＲＴＩＣＡ ＬＡ９６０を用いて測定した結果を図２に示す。この結果から、同じ低温度であってもインキュベート時間が短くなるほど二次凝集体生成が抑制されると考えられる。また、８℃・１分のインキュベートで生成した炭酸アパタイト粒子をＡＦＭで撮影した画像を図３Ａに示す。Ｚｍの値は凡そ粒子の直径の値を示している。図３Ｂは、各Ｚｍを有する粒子の頻度を示す。
(Example 2: Effect of incubation time)
The same experiment as in Example 1 was performed. However, the incubation temperature was 8 ° C., and incubation was performed for the time shown in FIG. FIG. 2 shows the results of measurement using PARTICA LA960 from Horiba. From this result, it is considered that the generation of secondary aggregates is suppressed as the incubation time becomes shorter even at the same low temperature. Moreover, the image which image | photographed the carbonate apatite particle | grains produced | generated by 8 degreeC and 1 minute incubation with AFM is shown to FIG. The value of Zm is approximately the value of the diameter of the particle. FIG. 3B shows the frequency of particles with each Zm.
理論に拘束されることは望まないが、例えば、インキュベート温度を８℃にした場合、炭酸アパタイトの生成反応は約１分以内に終了し、それ以降は凝集反応が促進されると考えられる。 Although not wishing to be bound by theory, for example, when the incubation temperature is set to 8 ° C., it is considered that the formation reaction of carbonate apatite is completed within about 1 minute, and the aggregation reaction is promoted thereafter.
（実施例３：乳化油性物質添加の影響）
本実施例では、以下のとおりに炭酸アパタイトの製造を行った。結果を図４に示す。
・８℃に保冷した蒸留水９０ｍｌに炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）０．７４ｇおよび１Ｍリン酸二水素ナトリウム二水和物（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）１８０μＬを添加し、さらに、全量１００ｍｌになるように蒸留水を加えた。
・水溶液のｐＨを７．５に調整した（ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いた）。
・０．２２μｍフィルターに通して２５ｍｌずつチューブ４本に分注した。
・チューブ１本に対して１Ｍ ＣａＣｌ２ ２９０μＬを加え、ＶＯＬＴＥＸで撹拌した（５〜１０秒程度）。
・８℃で１分間インキュベートした。
・乳化油性物質（イントラリポス）を濃度１％となるように加え、１０分、６０分、２４時間放置した。
(Example 3: Effect of addition of emulsified oily substance)
In this example, carbonate apatite was produced as follows. The results are shown in FIG.
・ To 90 ml of distilled water kept at 8 ° C., 0.74 g of sodium hydrogen carbonate (NaHCO 3 ) and 180 μL of 1M sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH 2 PO 4 .2H 2 O) were added, and a total volume of 100 ml Distilled water was added so that
Adjust the pH of the aqueous solution to 7.5 (using HCl or NaOH).
-Passed through a 0.22 μm filter and dispensed into 4 tubes of 25 ml each.
· A 1M CaCl 2 290μL added to one tube, and stirred at Voltex (about 5 to 10 seconds).
Incubated at 8 ° C for 1 minute.
-An emulsified oily substance (intralipos) was added to a concentration of 1% and left for 10 minutes, 60 minutes, and 24 hours.
２４時間まで水溶液を放置しても全ての粒子が７００ｎｍ以下であった。理論に拘束されることは望まないが、図４に示される結果は、乳化油性物質の油性による凝集抑制効果であると考えられる。ただし、乳化油性物質は凍結により凝集抑制効果が減弱・消失するため、上清とともに乳化油性物質を破棄し、沈殿物に増粘剤を加えた後、凍結し、実施例４を施行した。 Even when the aqueous solution was allowed to stand for 24 hours, all the particles were 700 nm or less. Although not wishing to be bound by theory, it is considered that the result shown in FIG. 4 is an effect of suppressing aggregation due to the oiliness of the emulsified oily substance. However, the emulsified oily substance diminished / disappeared by freezing, and the emulsified oily substance was discarded together with the supernatant, and after adding a thickener to the precipitate, it was frozen and Example 4 was carried out.
（実施例４：増粘剤添加の影響）
本実施例では、以下のとおりに炭酸アパタイトの製造を行った。
・８℃に保冷した蒸留水９０ｍｌに炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）０．７４ｇおよび１Ｍリン酸二水素ナトリウム二水和物（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）１８０μＬを添加し、さらに、全量１００ｍｌになるように蒸留水を加えた。
・水溶液のｐＨを７．５に調整した（ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いた）。
・０．２２μｍフィルターに通して２５ｍｌずつチューブ４本に分注した。
・チューブ１本に対して１Ｍ ＣａＣｌ２ ２９０μＬを加え、ＶＯＬＴＥＸで撹拌した（５〜１０秒程度）。
・８℃で１分間インキュベートした。
・乳化油性物質（イントラリポス）を濃度１％となるように加えた。
・高速遠心１３，０００Ｇを３分間行い、上清とともに乳化油性物質を破棄し、沈殿に対して増粘剤（グリセリン４０％＋グルコース１０％）でピペッティングを行い、回収した。
・ピペッティングして得られた炭酸アパタイトが分散した水溶液を５０ｍｌバイアル瓶に１０ｍｌずつ小分けして−８０℃の冷凍庫で凍結した。
・バイアル瓶を凍結乾燥機に入れて、１２時間程度凍結乾燥した。
・凍結乾燥後に得られたパウダー化炭酸アパタイトのバイアル瓶を−８０℃冷凍庫に保存した。
(Example 4: Effect of addition of thickener)
In this example, carbonate apatite was produced as follows.
・ To 90 ml of distilled water kept at 8 ° C., 0.74 g of sodium hydrogen carbonate (NaHCO 3 ) and 180 μL of 1M sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH 2 PO 4 .2H 2 O) were added, and a total volume of 100 ml Distilled water was added so that
Adjust the pH of the aqueous solution to 7.5 (using HCl or NaOH).
-Passed through a 0.22 μm filter and dispensed into 4 tubes of 25 ml each.
· A 1M CaCl 2 290μL added to one tube, and stirred at Voltex (about 5 to 10 seconds).
Incubated at 8 ° C for 1 minute.
-An emulsified oily substance (intralipos) was added to a concentration of 1%.
-High-speed centrifugation 13,000G was performed for 3 minutes, the emulsified oily substance was discarded together with the supernatant, and the precipitate was pipetted with a thickener (glycerin 40% + glucose 10%) and collected.
-An aqueous solution in which carbonate apatite dispersed by pipetting was dispersed was divided into 10 ml portions in 50 ml vials and frozen in a freezer at -80 ° C.
-The vial was placed in a lyophilizer and lyophilized for about 12 hours.
-The powdered carbonate apatite vial obtained after lyophilization was stored in a -80 ° C freezer.
結果を図５に示す。凍結乾燥溶解後の粒子は全て（少なくとも９８％以上が）７００ｎｍ以下であり、この粒子を数時間放置しても粒子径は変化しなかった。理論に拘束されることは望まないが、図５に示される結果は、増粘剤による粘性増加により粒子のブラウン運動が抑制され、その結果、粒子の凝集が抑制されるためであると考えられる。 The results are shown in FIG. The particles after lyophilization and dissolution were all 700% or less (at least 98% or more), and even when these particles were allowed to stand for several hours, the particle diameter did not change. Although not wishing to be bound by theory, it is considered that the result shown in FIG. 5 is that the Brownian motion of the particles is suppressed by the increase in viscosity by the thickener, and as a result, the aggregation of the particles is suppressed. .
（実施例５：核酸内包率における、低温・短時間反応および求電子剤添加の効果）
８℃・１０分間のインキュベートにおける反応および求電子剤（アセトアミノフェン）の添加による核酸内包率を図６に示す。実施例２と同様の条件を用いて実験を行った。（反応液１１５ｍｌに対して核酸７ｍｇ使用）ただし、全粒子径をナノサイズに抑えながら薬物の内包率を高めるためにインキュベート時間を１０分とした。この結果は、負電荷を帯びた薬物を内包する場合には、求電子剤添加により内包率が向上することを実証するものである。理論に拘束されることは望まないが、まず、低温・短時間により生成された超微細粒子が高率に薬物（例えば、核酸）を内包させ、未だ粒子に内包されず遊離状態の負電荷を帯びた薬物（例えば、核酸）を求電子剤により引き寄せ、粒子にほぼ全ての薬物（例えば、核酸）を内包させると考えられる。同様に、正電荷を帯びた薬物を内包する場合には、求核剤添加により内包率が向上することが理解できる。
（実施例６：核酸内包率における、電圧印加の効果）
使用した核酸量を４０ｍｇとした以外は、実施例５に記載の実験と同様の条件を用いて、低温・短時間インキュベートで「電圧印加なし」と「電圧印加あり」の場合を比較した。電圧印加の条件は、電圧３６０〜４６０Ｖで０．６〜１．０ｍｓのパルスを１回印加するステップを５秒毎に行い、これを合計５０回繰り返した。結果を図７に示す。４０ｍｇの核酸を使用した場合の結果のみを示すが、使用した核酸量をこれ以上、または以下とした場合でも同様に電圧印加による核酸内包率の顕著な改善が見られた。電圧は、２枚の並行な電極間に混合液（塩化カルシウム＋核酸）を入れて電圧をかけることによって印加した。電極間では均一な層のように電流が流れる。理論に拘束されることは望まないが、電流が流れた際、負電荷を帯びた核酸はプラス電極側へ、正電荷を帯びたカルシウムイオンはマイナス電極側へ移動し、核酸とカルシウムイオンとの接触の機会が大幅に向上した結果、炭酸アパタイトの核酸内包率が向上したと考えられる。
電圧は複数回かけることがより好ましく、1回ごとに電流方向を逆にすることがより好ましいと考えられる。その理由は、核酸とカルシウムイオンが毎回逆方向へ移動するため、接触の機会がさらに増加すると考えられるからである。
(Example 5: Effect of low temperature and short time reaction and addition of electrophile on nucleic acid encapsulation rate)
The reaction in incubation at 8 ° C. for 10 minutes and the nucleic acid encapsulation rate by addition of an electrophile (acetaminophen) are shown in FIG. The experiment was performed using the same conditions as in Example 2. (7 mg of nucleic acid was used for 115 ml of the reaction solution) However, the incubation time was set to 10 minutes in order to increase the drug encapsulation rate while keeping the total particle size to nano-size. This result demonstrates that the inclusion rate is improved by the addition of an electrophile when a negatively charged drug is encapsulated. Although not wishing to be bound by theory, first, ultrafine particles generated at a low temperature and for a short time encapsulate drugs (for example, nucleic acids) at a high rate, so that they are not encapsulated in the particles yet and have a free negative charge. It is considered that the charged drug (for example, nucleic acid) is attracted by the electrophile, and almost all the drug (for example, nucleic acid) is encapsulated in the particles. Similarly, when encapsulating a positively charged drug, it can be understood that the encapsulation rate is improved by adding a nucleophile.
(Example 6: Effect of voltage application on nucleic acid encapsulation rate)
Using the same conditions as in the experiment described in Example 5 except that the amount of nucleic acid used was 40 mg, the cases of “no voltage application” and “voltage application” were compared in the low-temperature and short-time incubation. The voltage application condition was that a step of applying a pulse of 0.6 to 1.0 ms once at a voltage of 360 to 460 V was performed every 5 seconds, and this was repeated 50 times in total. The results are shown in FIG. Only the results when 40 mg of nucleic acid was used are shown, but even when the amount of nucleic acid used was more or less than that, a remarkable improvement in the nucleic acid encapsulation rate by applying voltage was also observed. The voltage was applied by putting a mixed solution (calcium chloride + nucleic acid) between two parallel electrodes and applying a voltage. A current flows between the electrodes like a uniform layer. Although not wishing to be bound by theory, when an electric current flows, a negatively charged nucleic acid moves to the positive electrode side, and a positively charged calcium ion moves to the negative electrode side. It is considered that the nucleic acid encapsulation rate of carbonate apatite was improved as a result of the significant improvement of the contact opportunity.
It is more preferable to apply the voltage a plurality of times, and it is more preferable to reverse the current direction every time. The reason is that it is considered that the chance of contact further increases because the nucleic acid and calcium ions move in the opposite directions each time.
（実施例７：本発明の核酸内包炭酸アパタイトによるヒト肺癌細胞株を用いた抗腫瘍細胞実験）
本実施例では以下のとおりに核酸内包炭酸アパタイトによる細胞実験を行い、本発明の低温・短時間インキュベートと、従来技術の高温・長時間インキュベートとで抗腫瘍効果を比較した。
Example 7 Antitumor Cell Experiment Using Human Lung Cancer Cell Line with Nucleic Acid-Encapsulated Carbonate Apatite of the Present Invention
In this example, cell experiments using nucleic acid-encapsulated carbonate apatite were performed as follows, and the antitumor effects were compared between the low-temperature and short-time incubation of the present invention and the conventional high-temperature and long-time incubation.
（細胞）
本実施例ではＡ５４９細胞株（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株）を用いたが、これに限定されない。例えば、実施例８の結果から明らかなように、Ａ５４９細胞株以外の細胞株、例えば、ＨＣＴ１１６（ヒト結腸腺癌細胞株）、ＭＩＡ ＰａＣａ−２（ヒト膵臓腺癌細胞株）、Ｈｅｐ−Ｇ２（ヒト肝癌細胞株）、ＯＣＵＢ−Ｍ（ヒト乳癌細胞株）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞株）、ＳＨ−１０−ＴＣ（ヒト胃癌細胞株）、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３（ヒト卵巣癌細胞株）等を用いてもよい。６ウェルのプレートを使用して、培地は１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを用い、２．０×１０５個／ウェルの細胞を撒いた。（１）トランスフェクションを行わないネガティブコントロール（ＮＣ）。（２）ｍｉＲ−ネガティブコントロール（ｍｉＲ−ＮＣ）内包炭酸アパタイト。（３）核酸を内包していない炭酸アパタイト（８℃１０分と３７℃３０分）。（４）核酸内包炭酸アパタイト（３．０μｇ／ウェル）（８℃１０分と３７℃３０分）。各サンプル数はｎ＝３とした。これらを２４時間、４８時間、７２時間でそれぞれ計測した。
(cell)
Although the A549 cell line (human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cell line) was used in this example, it is not limited thereto. For example, as is apparent from the results of Example 8, cell lines other than the A549 cell line, such as HCT116 (human colon adenocarcinoma cell line), MIA PaCa-2 (human pancreatic adenocarcinoma cell line), Hep-G2 ( Human liver cancer cell line), OCUB-M (human breast cancer cell line), HeLa (human cervical cancer cell line), SH-10-TC (human gastric cancer cell line), NIH: OVCAR-3 (human ovarian cancer cell line) Etc. may be used. Using a 6-well plate, the medium was seeded with 2.0% 10 5 cells / well using 10% FBS-DMEM. (1) Negative control (NC) without transfection. (2) miR-negative control (miR-NC) encapsulated carbonate apatite. (3) Carbonate apatite (8 ° C. for 10 minutes and 37 ° C. for 30 minutes) not containing nucleic acid. (4) Nucleic acid-containing carbonate apatite (3.0 μg / well) (8 ° C. for 10 minutes and 37 ° C. for 30 minutes). The number of samples was n = 3. These were measured at 24 hours, 48 hours, and 72 hours, respectively.
（核酸）
本実施例ではｍｉＲ−３４ａ（５’−ｕｇｇｃａｇｕｇｕｃｕｕａｇｃｕｇｇｕｕｇｕ−３’（配列番号１））を使用したが、これに限定されない。例えば、ｍｉＲ−１４８ａ（５’−ｕｃａｇｕｇｃａｃｕａｃａｇａａｃｕｕｕｇｕ−３’（配列番号２））、ｍｉＲ−２００ａ（５’−ｕａａｃａｃｕｇｕｃｕｇｇｕａａｃｇａｕｇｕ−３’（配列番号３））等を使用してもよい。また、これらを適宜組み合わせたものを使用してもよい。
(Nucleic acid)
In this example, miR-34a (5′-uggcagugucuugaugcugugu-3 ′ (SEQ ID NO: 1)) was used, but is not limited thereto. For example, miR-148a (5′-ucacugcacuacagaacuuugu-3 ′ (SEQ ID NO: 2)), miR-200a (5′-uaacacugucugaacugagu-3 ′ (SEQ ID NO: 3)) and the like may be used. Moreover, you may use what combined these suitably.
（低温・短時間インキュベート）
・８℃に保冷した蒸留水９０ｍｌに炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）０．７４ｇおよび１Ｍリン酸二水素ナトリウム二水和物（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）１８０μＬを添加し、さらに、全量１００ｍｌになるように蒸留水を加えた。
・水溶液のｐＨを７．５に調整した（ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いた）。
・０．２２μｍフィルターに通して２５ｍｌのチューブ３本に２０ｍｌずつ分注した。
・１本目に対しては、ｍｉＲ−３４ａを３０μｇ加えて軽く撹拌した。２本目に対してはｍｉＲ−ＮＣ（ネガティブコントロール）（株式会社ＲＮＡｉ 万能ネガコン）を３０μｇ加えて軽く撹拌した。３本目に対しては何も加えなかった（ネガティブコントロール（ＮＣ））。
・２０ｍｌに対して１Ｍ ＣａＣｌ２ ２３２μＬを加え、ＶＯＬＴＥＸで撹拌した（５〜１０秒程度）。
・８℃で１０分間インキュベートした。
・全てのサンプルについて、以下の高温・長時間インキュベート処理および共通プロトコール処理を行った。
(Low temperature, short time incubation)
・ To 90 ml of distilled water kept at 8 ° C., 0.74 g of sodium hydrogen carbonate (NaHCO 3 ) and 180 μL of 1M sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH 2 PO 4 .2H 2 O) were added, and a total volume of 100 ml Distilled water was added so that
Adjust the pH of the aqueous solution to 7.5 (using HCl or NaOH).
-20 ml each was dispensed into three 25 ml tubes through a 0.22 μm filter.
-For the first, 30 μg of miR-34a was added and lightly stirred. For the second, 30 μg of miR-NC (negative control) (RNAi Universal Negative Con) was added and lightly stirred. Nothing was added to the third (negative control (NC)).
· 20 ml of 1M CaCl 2 232μL added to, and stirred at Voltex (about 5 to 10 seconds).
Incubated at 8 ° C for 10 minutes.
All samples were subjected to the following high-temperature / long-time incubation treatment and common protocol treatment.
（高温・長時間インキュベート）
・室温の蒸留水９０ｍｌに炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）０．３７ｇおよび１Ｍリン酸二水素ナトリウム二水和物（ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）９０μＬ、１Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）１８０μＬを添加し、さらに、全量１００ｍｌになるように蒸留水を加えた。
・水溶液のｐＨを７．５に調整した（ＨＣｌまたはＮａＯＨを用いた）。
・０．２２μｍフィルターに通して２５ｍｌのチューブ２本に２０ｍｌずつ分注した。
・１本目に対してはｍｉＲ−３４ａを３０μｇ加えて軽く撹拌した。２本目に対しては何も加えなかった。
・２０ｍｌに対して１Ｍ ＣａＣｌ２ ８０μＬを加え、ＶＯＬＴＥＸで撹拌した（５〜１０秒程度）。
・３７℃ ３０分間インキュベートした。
・次に下記共通プロトコールを行った。
(High temperature and long time incubation)
Add 0.37 g of sodium hydrogen carbonate (NaHCO 3 ) and 90 μL of 1M sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH 2 PO 4 .2H 2 O) to 180 ml of room temperature distilled water and 180 μL of 1M calcium chloride (CaCl 2 ) Further, distilled water was added so that the total amount became 100 ml.
Adjust the pH of the aqueous solution to 7.5 (using HCl or NaOH).
-20 ml each was dispensed into two 25 ml tubes through a 0.22 μm filter.
-30 μg of miR-34a was added to the first and lightly stirred. Nothing was added for the second.
-80 μL of 1M CaCl 2 was added to 20 ml and stirred with VOLTEX (about 5 to 10 seconds).
Incubated for 30 minutes at 37 ° C.
-Next, the following common protocol was performed.
（共通プロトコール）
・上記チューブ計５本に対して高速遠心を４℃で１３，０００Ｇ・３分間行い、上清を破棄し、沈殿に対して２０ｍｌの１０％ＦＢＳ-ＤＭＥＭでピペッティングを行い、回収し
た。
・１ウェルにつき２ｍｌを撒いてトランスフェクションを行い、１ウェルへのｍｉＲ−３４ａ投与量を３．０μｇとした。
・３７℃・５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内で培養した。
・２４時間、４８時間、７２時間で細胞数をカウントした。測定にはＣＯＵＮＴＥＳＳ ＩＩ ＦＬを用いた。
(Common protocol)
-The above 5 tubes were centrifuged at 13,000 G for 3 minutes at 4 ° C, the supernatant was discarded, and the precipitate was collected by pipetting with 20 ml of 10% FBS-DMEM.
-2 ml per well was used for transfection, and the dose of miR-34a per well was 3.0 μg.
And cultured at · 37 ℃ · 5% CO 2 concentrations of the incubator.
-The cell number was counted in 24 hours, 48 hours, and 72 hours. COUNTESS II FL was used for the measurement.
結果を図８に示す。四角「□」は、トランスフェクションを行わないネガティブコントロール（ＮＣ）の結果を示す。バツ「×」は、ｍｉＲ−ネガティブコントロール（ｍｉＲＮＡ活性を持たない分子「ｍｉＲ−ＮＣ」）内包炭酸アパタイトを示す。インキュベートは８℃１０分間行った。三角「△」は、３７℃３０分のインキュベートをすることによって製造した核酸ｍｉＲ−３４ａを内包する炭酸アパタイト３．０μｇを各ウェルに添加した結果を示す。丸「●」は、８℃１０分のインキュベートをすることによって製造した核酸ｍｉＲ−３４ａを内包する炭酸アパタイト３．０μｇを各ウェルに添加し、２４時間後、４８時間後、および、７２時間後に生細胞数を測定した結果を示す。各サンプル数はｎ＝３とした。投入した核酸量は同じであるにもかかわらず、低温・短時間インキュベートでは抗腫瘍効果が顕著であった。理論に拘束されることは望まないが、低温・短時間インキュベートによって超微細粒子が多く生成されて核酸内包率が向上し、さらに粒子径が小さいことで細胞へのトランスフェクション効率も向上したためと考えられる。図８には示していないが、核酸を内包していない炭酸アパタイトは、ＮＣやｍｉＲ−ＮＣなど内包炭酸アパタイトのネガティブコントロールの結果と差がなく、炭酸アパタイト自体には抗腫瘍効果はないと考えられる。 The results are shown in FIG. Square “□” indicates the result of the negative control (NC) in which no transfection was performed. The cross “x” indicates a miR-negative control (a molecule “miR-NC” having no miRNA activity) encapsulated carbonate apatite. Incubation was performed at 8 ° C. for 10 minutes. The triangle “Δ” indicates the result of adding 3.0 μg of carbonate apatite encapsulating the nucleic acid miR-34a produced by incubation at 37 ° C. for 30 minutes to each well. The circle “●” indicates that 3.0 μg of carbonate apatite containing nucleic acid miR-34a produced by incubation at 8 ° C. for 10 minutes was added to each well, and after 24, 48, and 72 hours. The result of measuring the number of viable cells is shown. The number of samples was n = 3. Despite the same amount of nucleic acid added, the antitumor effect was remarkable when incubated at a low temperature for a short time. Although not wishing to be bound by theory, it is thought that many ultrafine particles are produced by incubation at low temperature for a short time, the nucleic acid encapsulation rate is improved, and the transfection efficiency into cells is also improved due to the small particle size. It is done. Although not shown in FIG. 8, carbonate apatite not encapsulating nucleic acid is not different from the results of negative control of encapsulated carbonate apatite such as NC and miR-NC, and carbonate apatite itself has no antitumor effect. It is done.
（実施例８：本発明の核酸内包炭酸アパタイトによるヒト結腸腺癌細胞株を用いた抗腫瘍細胞実験）
ヒト結腸腺癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞株に対して、実施例７と同様の実験を行い、腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を試験した。具体的には、６ウェルのプレートを使用し、培地には１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを用い、１．２×１０５個／ウェルの細胞を播種し、種々の核酸を内包する炭酸アパタイト３．０μｇを各ウェルに添加し、腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を試験した。その結果を、図９に示す。図中の記号は、図８と同様である。
実施例７の結果と同様の結果が得られた。すなわち、投入した核酸量は同じであるにもかかわらず、低温・短時間インキュベートでは抗腫瘍効果が顕著であった。理論に拘束されることは望まないが、低温・短時間インキュベートによって超微細粒子が多く生成されて核酸内包率が向上し、さらに粒子径が小さいことで細胞へのトランスフェクション効率も向上したためと考えられる。図９には示していないが、核酸を内包していない炭酸アパタイトについて種々の異なるインキュベート温度を用いて作製したネガティブコントロールについて実験を行ったところ、インキュベート温度に拘わらず、ＮＣやｍｉＲ−ＮＣなど内包炭酸アパタイトのネガティブコントロールの結果と差がなく、炭酸アパタイト自体には抗腫瘍効果はないと考えられる。
その他の癌細胞株を使用した抗腫瘍細胞実験でも同様に、低温・短時間インキュベートでは抗腫瘍効果が顕著であった（データ示さず）。
（実施例９：電圧が印加された核酸を使用した場合の、ヒト結腸腺癌細胞株を用いた抗腫瘍細胞実験）
電圧が印加された核酸の抗腫瘍効果が変質していないかを確認するために、ヒト結腸腺癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞株に対して、実施例８に記載の実験と同様の実験を行い、腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を試験した。核酸はｍｉＲ−３４ａを使用し、電圧の印加は核酸と塩化カルシウムの混合液に対して、３６０〜４６０Ｖ、５０回を約５秒間隔で行った。２．０×１０５個／ウェルの細胞を播種し、電圧を印加して調製した核酸内包炭酸アパタイトと、電圧を印加することなく調製した核酸内包炭酸アパタイトそれぞれ３．０μｇを各ウェルに添加し、腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を試験した。その結果を、図１０に示す。四角「□」は、トランスフェクションを行わないネガティブコントロール（ＮＣ）の結果を示す。三角「△」は、電圧を印加することなく８℃１０分のインキュベートをすることによって製造した核酸ｍｉＲ−３４ａ内包炭酸アパタイト３．０μｇを各ウェルに添加した結果を示す。丸「●」は、電圧を印加して８℃１０分のインキュベートをすることによって製造した核酸ｍｉＲ−３４ａ内包炭酸アパタイト３．０μｇを各ウェルに添加し、２４時間後、４８時間後、および、７２時間後に生細胞数を測定した結果を示す。
図１０の結果より、電圧が印加された核酸から抗腫瘍効果は消失しておらず、電圧が印加されていない核酸と同じ機能を有していることが確認された。
（実施例１０：担癌ヌードマウスを用いた抗腫瘍効果実験）
担癌ヌードマウスを用いた抗腫瘍効果実験を行った。実験手順の概略は、以下のとおりである。
（１．ヒト胃癌細胞株を用いて作製したモデルマウスでの実験）
（１．１．炭酸アパタイト溶液の調製）
炭酸アパタイト溶液を以下のようにして調製した。
・８℃に保冷した蒸留水によって１００ｍｌとした溶液中にＮａＨＣＯ３ ０．７４ｇ、１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ １８０μｌを含む緩衝液を調製し、この緩衝液のｐＨを７．５に調整した後、０．２２μｍフィルターでろ過滅菌した。
・上記の緩衝液０．６４４ｍｌをチューブに分注し、各チューブに対して、ｍｉＲ−３４ａ核酸２８μｇを添加し、次に、１Ｍ ＣａＣｌ２ ７．４７μｌを添加した。
・混合物を８℃で１０分間インキュベートし、１３，０００Ｇで３分間遠心し、上清を破棄した。
・各チューブの沈殿を生理食塩水０．７ｍｌに溶解し、ｍｉＲ−１４８ａ ２８μｇ／０．７ｍｌの溶液とし、直ちに氷冷した。
・４μｇの核酸を含む溶液０．１ｍｌを、マウス一匹あたりの投与に使用する。
（１．２．担癌ヌードマウスの調製）
ＳＨ−１０−ＴＣ（ヒト胃癌）細胞株を７週齢の雌性ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ・Ｓｌｃ・ｎｕ／ｎｕ）の背部皮下に移植した担癌モデルのヌードマウスを使用した。平均腫瘍体積が８０ｍｍ３を超えた日に、なるべく各群の間の平均腫瘍体積差が小さくなるように各群６匹のマウス（ｎ＝６）にて群分けを行い、炭酸アパタイトを、１４日間、隔日で７回の投与を行い、各群の平均腫瘍体積の変化を記録した。
（１．３．結果）
移植日、ならびに、移植の４日後、８日後、１１日後、および１４日後の腫瘍体積を測定した結果（平均値±標準誤差）を図１１に示す。ダイヤ「◆」は、生理食塩水を尾静脈注射したマウスの結果を示す。白四角「□」は、ネガティブコントロールであるｍｉＲ−ＮＣを尾静脈注射したマウスの結果を示す。黒四角「■」は、ｍｉＲ−１４８ａを尾静脈注射したマウスの結果を示す。「※」は、ｍｉＲ−１４８ａ群がｍｉＲ−ＮＣ群に対してｐ＜０．０５で有意差がある場合を示す。
（２．ヒト結腸腺癌細胞株を用いて作製したモデルマウスでの実験）
上記ヒト結腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）を用いた以外は、上記「１．ヒト胃癌細胞株を用いて作製したモデルマウスでの実験」と同様の実験を行った。核酸分子としては、ｍｉＲ−３４ａを用いた。「＊＊」は、ｍｉＲ−３４ａ群がｍｉＲ−ＮＣ群に対してｐ＜０．０１で有意差がある場合を示す。結果を図１２に示す。図中の記号は、図１１と同様である。ただし、黒四角「■」は、ｍｉＲ−３４ａを尾静脈注射したマウスの結果を示す。
（３．考察）
ヒト胃癌細胞株およびヒト結腸腺癌細胞株のいずれを用いたモデルマウスにおいても、核酸内包炭酸アパタイトを投与した群では平均腫瘍体積の顕著な増加抑制が確認された。
（実施例１１：カニクイザルを用いた核酸内包炭酸アパタイトの静脈内投与試験）
核酸内包炭酸アパタイトの人体投与の想定量をカニクイザルの体重で換算し、１日１回×１０日間連続投与することで安全性を確かめた。具体的には、ヒトの体重を５０ｋｇとしたときにｍｉＲＮＡの１回投与量を１０ｍｇだと仮定し、例えばカニクイザルの体重が３ｋｇの場合に１頭への投与量は１回０．６ｍｇを通常量とした。本試験では１回に倍量（３ｋｇならば１．２ｍｇ）を投与して安全性の確認を行った。１回投与量は、核酸（ｍｉＲ−３４ａ）量として１．２ｍｇ（雄：０．２４ｍｇ／ｋｇ、雌：０．４０ｍｇ／ｋｇ）とした。
投与した核酸内包炭酸アパタイトの調製プロトコールは以下のとおりである。
・８℃に保冷した蒸留水によって２７．６ｍｌとした溶液中にＮａＨＣＯ３ ０．２０４ｇ、１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ ４９．６８μｌを含む緩衝液を調製し、この緩衝液のｐＨを７．５に調整した後、０．２２μｍフィルターでろ過滅菌した。
・ｍｉＲ−３４ａ核酸１２００μｇを添加し、次に、１Ｍ ＣａＣｌ２ ３２０．２μｌを添加した。
・混合物を８℃で１分間インキュベートし、２０％イントラリポス１．３９４ｍｌを添加し（最終濃度１％）、さらに、８℃で１０分間インキュベートし、４℃ １３，０００Ｇで３分間遠心し、上清を破棄した。
・各チューブの沈殿に５０％グリセリン１．６５６ｍｌ（濃度３０％）と５０％グルコース１．１０４ｍｌ（濃度２０％）を添加して溶解し、ｍｉＲ−３４ａ １２００μｇ／１．３８ｍｌの溶液とした。投与直前に生理食塩水で１．５倍希釈して使用した（グリセリン最終濃度２０％、グルコース最終濃度１３．３％）。
その結果、一般状態、体重、摂餌量、尿検査及び血液化学検査に核酸内包炭酸アパタイト投与による影響を示唆する変化はみられなかった。これによって、使用する核酸と炭酸アパタイトは、生体に対して毒性がなく、血管内塞栓などを生じさせないことが確認された。
その他、ｍｉＲ−３４ａ・ｍｉＲ−１４８ａ・ｍｉＲ−２００ａをそれぞれ１４日間で７回隔日投与する静脈内反復投与試験・オキサリプラチンとシスプラチンを使用した静脈内単回投与試験・他にも２つの実験系、全ての静脈内投与試験において、カニクイザルに何ら異常が見られないことを確認した。
（実施例１２：臨床試験）
（１．臨床試験用の核酸内包炭酸アパタイトの調製）
・４℃に保冷した蒸留水（注射用）によって１１５ｍｌとした溶液中にＮａＨＣＯ３ ２．５５３ｇ、１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ ６２１μｌを含む緩衝液を調製し、この緩衝液をｐＨ７．５に調整した後、０．２２μｍフィルターでろ過滅菌し、２８．７５ｍｌずつ４本のチューブに分注した。
・各チューブに３．７５ｍｇの核酸を添加し、次に、１Ｍ ＣａＣｌ２ １０００．５μｌを添加した。
・２０％イントラリポス１．５１３ｍｌを添加し（最終濃度１％）、４℃で１０分間インキュベートし、４℃ ９１００Ｇで５分間遠心し、上清を破棄した。
・４本のチューブの沈殿に５０％グリセリン９．０ｍｌ（最終濃度３０％）と５０％グルコース６．０ｍｌ（最終濃度２０％）を添加して溶解し、容量３０ｍｌのバイアル瓶に入れて凍結保存した（１バイアルあたり、溶液１５ｍｌ、核酸１５ｍｇ）。
（２．大腸癌・多発性肝転移の６３歳男性を対象とする臨床試験）
薬物として、ｍｉＲ−１４８ａを内包する炭酸アパタイトを点滴静注にてｍｉＲ−１４８ａ １５ｍｇ／日を投与した（炭酸アパタイト溶液１５ｍｌ＋生理食塩水１００ｍｌ）。１日１回の投与を１０日間連続した投与を１クールとした。一回の投与時間を３０分間とした。１回のｍｉＲＮＡ投与量は、ＣＴ画像を基に患者の腫瘍総体積から決定した。
治療前と治療後のＣＴの結果を、図１３に示す。肝転移巣（丸で囲われた部分）の消失がＣＴ検査により確認された。これによって、核酸内包炭酸アパタイトが網内系に捕捉・処理されることなく効果的に癌組織に送達されており、癌治療薬として非常に有効であることが確認された。また、副作用が無かったことから、核酸内包炭酸アパタイトは循環血中内で崩壊せずに、癌組織に送達され、癌細胞内に貪食された後に核酸を放出していることも確認された。
（３．膵臓癌の７６歳男性を対象とする臨床試験）
薬物として、ｍｉＲ−３４ａを内包する炭酸アパタイトを点滴静注にてｍｉＲ−３４ａ １５ｍｇ／日を投与した（炭酸アパタイト溶液１５ｍｌ＋生理食塩水１００ｍｌ）。１日１回の投与を１０日間連続した投与を１クールとした。一回の投与時間を３０分間とした。
治療前と治療後のＣＴの結果を、図１４に示す。膵体部原発巣（丸で囲われた部分）の大幅な縮小がＣＴ検査により確認された。膵臓癌は癌発見時には既に手術不可能となっている場合が多く、また非常に抗癌剤の効きにくい癌であるため、本試験の結果は、膵臓癌に対して核酸内包炭酸アパタイトが非常に有効な治療薬と成り得ることを示すものである。
（４．臨床試験用の抗癌剤内包炭酸アパタイトの調製）
薬物をオキサリプラチン６４ｍｇとした以外は、上記「１．臨床試験用の核酸内包炭酸アパタイトの調製」と同じ方法で、抗癌剤内包炭酸アパタイトを調製した。
（５．食道癌・多発性肺転移の５５歳男性を対象とする臨床試験）
抗癌剤としてオキサリプラチンを内包する炭酸アパタイトを点滴静注にてオキサリプラチン ６４ｍｇ／日を投与した（炭酸アパタイト溶液１５ｍｌ＋生理食塩水１００ｍｌ）。１週間あたり１回の投与を８週間連続した投与を１クールとした。一回の投与時間を６０分間とした。１回の抗癌剤投与量は、患者の体表面積から決定した。１回の炭酸アパタイト投与量は、炭酸アパタイトに含まれるカルシウム量が、カルチコール注射液（８．５％）の成人に対する上限量／日を超えない範囲で決定した。
治療前と治療後のＣＴの結果を、図１５に示す。肺転移巣（丸で囲われた部分）の消失がＣＴ検査により確認された。この結果は、ｍｉＲＮＡのような核酸のみならず、抗癌剤の投与においても本発明の炭酸アパタイトが際立って優れていることを実証するものである。
前記以外にも、多数の症例で効果を確認している。
(Example 8: Antitumor cell experiment using human colon adenocarcinoma cell line with nucleic acid-encapsulated carbonate apatite of the present invention)
The same experiment as in Example 7 was performed on the HCT116 cell line, which is a human colon adenocarcinoma cell line, to test the growth inhibitory effect on tumor cells. Specifically, using a 6-well plate, using DMEM supplemented with 10% FBS as a medium, seeding cells at 1.2 × 10 5 cells / well, and containing a variety of nucleic acids, carbonate apatite 3 0.0 μg was added to each well to test the growth inhibitory effect on tumor cells. The result is shown in FIG. The symbols in the figure are the same as those in FIG.
Results similar to those of Example 7 were obtained. That is, despite the same amount of nucleic acid added, the antitumor effect was remarkable when incubated at a low temperature for a short time. Although not wishing to be bound by theory, it is thought that many ultrafine particles are produced by incubation at low temperature for a short time, the nucleic acid encapsulation rate is improved, and the transfection efficiency into cells is also improved due to the small particle size. It is done. Although not shown in FIG. 9, experiments were conducted on negative controls prepared using various different incubation temperatures for carbonate apatite that did not contain nucleic acid, and inclusions such as NC and miR-NC were observed regardless of the incubation temperature. There is no difference from the result of the negative control of carbonate apatite, and carbonate apatite itself is considered to have no antitumor effect.
Similarly, in anti-tumor cell experiments using other cancer cell lines, the anti-tumor effect was remarkable when incubated at a low temperature for a short time (data not shown).
(Example 9: Anti-tumor cell experiment using human colon adenocarcinoma cell line when nucleic acid to which voltage was applied was used)
In order to confirm whether or not the antitumor effect of the nucleic acid to which voltage was applied was altered, an experiment similar to the experiment described in Example 8 was performed on the HCT116 cell line, which is a human colon adenocarcinoma cell line. The growth inhibitory effect on tumor cells was tested. The nucleic acid used was miR-34a, and voltage was applied to a mixed solution of nucleic acid and calcium chloride at 360 to 460 V, 50 times at intervals of about 5 seconds. 2.0 × 10 5 cells / well are seeded, and a nucleic acid-encapsulated carbonate apatite prepared by applying a voltage and a nucleic acid-encapsulated carbonate apatite prepared without applying a voltage are added to each well. The growth inhibitory effect on tumor cells was tested. The result is shown in FIG. Square “□” indicates the result of the negative control (NC) in which no transfection was performed. The triangle “Δ” shows the result of adding 3.0 μg of nucleic acid miR-34a-encapsulating carbonate apatite prepared by incubation at 8 ° C. for 10 minutes without applying voltage to each well. The circle “●” indicates that 3.0 μg of nucleic acid miR-34a-encapsulated carbonate apatite produced by applying voltage and incubating at 8 ° C. for 10 minutes was added to each well, 24 hours later, 48 hours later, and The result of measuring the number of viable cells after 72 hours is shown.
From the results in FIG. 10, it was confirmed that the antitumor effect was not lost from the nucleic acid to which voltage was applied, and that it had the same function as the nucleic acid to which voltage was not applied.
(Example 10: Antitumor effect experiment using a tumor bearing nude mouse)
An anti-tumor effect experiment using a tumor bearing nude mouse was conducted. The outline of the experimental procedure is as follows.
(1. Experiments with model mice prepared using human gastric cancer cell lines)
(1.1. Preparation of carbonate apatite solution)
A carbonate apatite solution was prepared as follows.
Prepare a buffer solution containing 0.74 g of NaHCO 3 and 180 μl of 1M NaH 2 PO 4 .2H 2 O in a solution made up to 100 ml with distilled water kept at 8 ° C., and adjust the pH of this buffer to 7.5. Then, it was sterilized by filtration through a 0.22 μm filter.
-0.644 ml of the above buffer solution was dispensed into tubes, and 28 μg of miR-34a nucleic acid was added to each tube, followed by 7.47 μl of 1M CaCl 2 .
The mixture was incubated at 8 ° C. for 10 minutes, centrifuged at 13,000 G for 3 minutes and the supernatant discarded.
The precipitate in each tube was dissolved in 0.7 ml of physiological saline to prepare a solution of miR-148a 28 μg / 0.7 ml, and immediately cooled on ice.
• 0.1 ml of solution containing 4 μg of nucleic acid is used for administration per mouse.
(1.2. Preparation of tumor-bearing nude mice)
A tumor-bearing model nude mouse in which the SH-10-TC (human gastric cancer) cell line was transplanted subcutaneously to the back of a 7-week-old female nude mouse (BALB / c · Slc · nu / nu) was used. On the day when the average tumor volume exceeded 80 mm 3 , the mice were divided into groups of 6 mice (n = 6) so that the average tumor volume difference between the groups was as small as possible. Seven doses were performed every other day for 7 days, and changes in the average tumor volume of each group were recorded.
(1.3. Results)
FIG. 11 shows the results of the measurement of the tumor volume on the day of transplantation and on the 4th, 8th, 11th, and 14th days after transplantation (mean ± standard error). The diamond “♦” indicates the result of the mouse injected with saline through the tail vein. White squares “□” show the results of mice injected with tail vein injection of miR-NC as a negative control. The black square “■” indicates the result of mice injected with miR-148a via the tail vein. “*” Indicates a case where the miR-148a group is significantly different from the miR-NC group at p <0.05.
(2. Experiments with model mice prepared using human colon adenocarcinoma cell line)
Except for using the above human colon cancer cell line (HCT116), an experiment similar to “1. Experiment with model mouse prepared using human gastric cancer cell line” was performed. MiR-34a was used as the nucleic acid molecule. “**” indicates a case where the miR-34a group is significantly different from the miR-NC group at p <0.01. The results are shown in FIG. The symbols in the figure are the same as those in FIG. However, the black square “■” indicates the result of mice injected with miR-34a via the tail vein.
(3. Discussion)
In the model mice using both human gastric cancer cell line and human colon adenocarcinoma cell line, significant increase suppression of average tumor volume was confirmed in the group administered with nucleic acid-encapsulating carbonate apatite.
(Example 11: Intravenous administration test of nucleic acid-containing carbonate apatite using cynomolgus monkey)
The estimated amount of nucleic acid-encapsulated carbonate apatite for human administration was converted to the body weight of cynomolgus monkey, and the safety was confirmed by administering once a day for 10 days continuously. Specifically, assuming that the body weight of a human is 50 kg, a single dose of miRNA is assumed to be 10 mg. For example, when the body weight of a cynomolgus monkey is 3 kg, the dose per head is usually 0.6 mg. The amount. In this study, safety was confirmed by administering a double dose (1.2 mg for 3 kg) at a time. The single dose was 1.2 mg (male: 0.24 mg / kg, female: 0.40 mg / kg) as the amount of nucleic acid (miR-34a).
The protocol for preparing the administered nucleic acid-containing carbonate apatite is as follows.
Prepare a buffer solution containing 0.204 g of NaHCO 3 and 49.68 μl of 1M NaH 2 PO 4 .2H 2 O in a solution made 27.6 ml with distilled water kept at 8 ° C., and adjust the pH of this buffer to 7 Then, the solution was sterilized by filtration through a 0.22 μm filter.
• 1200 μg of miR-34a nucleic acid was added, followed by 320.2 μl of 1M CaCl 2 .
Incubate the mixture at 8 ° C. for 1 minute, add 1.394 ml of 20% Intralipos (final concentration 1%), further incubate at 8 ° C. for 10 minutes, centrifuge at 4 ° C., 13,000 G for 3 minutes, top Abandoned Kiyo.
-1.656 ml of 50% glycerin (concentration 30%) and 1.104 ml of 50% glucose (concentration 20%) were added to the precipitate in each tube and dissolved to prepare a solution of miR-34a 1200 μg / 1.38 ml. Immediately before administration, it was diluted 1.5 times with physiological saline and used (final glycerin concentration 20%, final glucose concentration 13.3%).
As a result, there were no changes suggesting the effects of administration of nucleic acid-encapsulated carbonate apatite in general conditions, body weight, food intake, urinalysis and blood chemistry tests. As a result, it was confirmed that the nucleic acid and carbonate apatite used were not toxic to the living body and did not cause intravascular embolization.
In addition, repeated intravenous administration study in which miR-34a, miR-148a, and miR-200a are each administered 7 times every 14 days, single intravenous administration study using oxaliplatin and cisplatin, and two other experimental systems In all intravenous administration tests, it was confirmed that no abnormality was observed in cynomolgus monkeys.
(Example 12: Clinical trial)
(1. Preparation of nucleic acid-containing carbonate apatite for clinical trials)
A buffer solution containing 2.553 g of NaHCO 3 and 621 μl of 1M NaH 2 PO 4 .2H 2 O in a solution made up to 115 ml with distilled water (for injection) kept at 4 ° C. was prepared, and this buffer solution was adjusted to pH 7.5. Then, the solution was sterilized by filtration with a 0.22 μm filter, and dispensed into 4 tubes of 28.75 ml each.
• 3.75 mg of nucleic acid was added to each tube, followed by 1000.5 μl of 1M CaCl 2 .
-1.513 ml of 20% Intralipos was added (final concentration 1%), incubated at 4 ° C. for 10 minutes, centrifuged at 9 ° C. at 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was discarded.
・ Add 90 ml of 50% glycerin (final concentration 30%) and 6.0 ml of 50% glucose (final concentration 20%) to the precipitate in the four tubes, dissolve, and store in a 30 ml vial. (15 ml of solution, 15 mg of nucleic acid per vial).
(2. Clinical trial for a 63-year-old man with colorectal cancer and multiple liver metastases)
As a drug, 15 mg / day of miR-148a was administered by intravenous infusion of carbonate apatite encapsulating miR-148a (15 ml of carbonate apatite solution + 100 ml of physiological saline). The administration once a day for 10 consecutive days was defined as one course. One administration time was 30 minutes. A single miRNA dose was determined from the patient's total tumor volume based on CT images.
The results of CT before and after treatment are shown in FIG. The disappearance of the liver metastases (circled part) was confirmed by CT examination. As a result, it was confirmed that the nucleic acid-encapsulated carbonate apatite was effectively delivered to the cancer tissue without being trapped and processed by the reticuloendothelial system, and was very effective as a cancer therapeutic agent. In addition, since there were no side effects, it was also confirmed that the nucleic acid-encapsulated carbonate apatite was not disintegrated in the circulating blood, but was delivered to the cancer tissue and released after being phagocytosed in the cancer cell.
(3. Clinical trial for 76-year-old male with pancreatic cancer)
As a drug, 15 mg / day of miR-34a was administered by intravenous drip infusion of carbonate apatite containing miR-34a (15 ml of carbonate apatite solution + 100 ml of physiological saline). The administration once a day for 10 consecutive days was defined as one course. One administration time was 30 minutes.
The results of CT before and after treatment are shown in FIG. A significant reduction in the pancreatic body primary lesion (circled portion) was confirmed by CT examination. Since pancreatic cancer is often inoperable at the time of cancer detection, and because it is a cancer that is extremely difficult to treat with anticancer agents, the results of this study show that nucleic acid-containing carbonate apatite is very effective against pancreatic cancer. It shows that it can be a therapeutic drug.
(4. Preparation of anticancer drug-containing carbonate apatite for clinical trials)
Anticancer agent-encapsulated carbonate apatite was prepared in the same manner as in “1. Preparation of nucleic acid-encapsulated carbonate apatite for clinical trials” except that the drug was 64 mg oxaliplatin.
(5. Clinical trial for 55-year-old male with esophageal cancer and multiple lung metastases)
As an anticancer agent, apatite carbonate containing oxaliplatin was administered by intravenous infusion of oxaliplatin 64 mg / day (15 ml carbonate apatite solution + 100 ml physiological saline). One administration per week for 8 consecutive weeks was taken as one course. One administration time was 60 minutes. One dose of the anticancer drug was determined from the body surface area of the patient. The dose of carbonate apatite was determined in such a range that the amount of calcium contained in carbonate apatite did not exceed the upper limit amount / day for adults of cartilol injection (8.5%).
The results of CT before and after treatment are shown in FIG. The disappearance of lung metastases (circled area) was confirmed by CT examination. This result demonstrates that the carbonate apatite of the present invention is remarkably superior not only in nucleic acids such as miRNA but also in the administration of anticancer agents.
In addition to the above, the effect has been confirmed in many cases.
本発明における炭酸アパタイトの製造方法においては、インキュベート温度およびインキュベート時間によって、精密な粒径（平均粒径、粒径の分散および最大粒径）が制御できる。その結果、細胞および／または組織への薬物の送達に適切な炭酸アパタイトの製造が可能となる。本願発明により、薬物高内包率で、最大粒径７００ｎｍ以下、平均粒径３０ｎｍ以下の全ナノサイズの炭酸アパタイトを用いて、末期癌患者の残存癌に応じた、選択的治療遺伝子や抗癌剤などの集中的なデリバリーが行われ、身体に負担がなく、高い抗腫瘍効果を有する治療が飛躍的に発展すると考えられる。 In the method for producing carbonate apatite in the present invention, the precise particle size (average particle size, particle size dispersion and maximum particle size) can be controlled by the incubation temperature and incubation time. As a result, it is possible to produce carbonate apatite suitable for drug delivery to cells and / or tissues. According to the invention of the present application, using a carbonate apatite having a high drug encapsulation rate, a maximum particle size of 700 nm or less and an average particle size of 30 nm or less, a selective therapeutic gene, an anticancer agent, etc. according to the residual cancer of the terminal cancer patient It is considered that treatment with intensive delivery, no burden on the body, and high anti-tumor effect will develop dramatically.
Claims (27)
（ａ）カルシウムイオン、リン酸イオン、炭酸水素イオン、および薬物を含む混合物をインキュベートする工程であって、ここで、インキュベートする温度が１０℃以下であり、かつ、インキュベート時間が１０分以内である、工程；
（ｂ）インキュベート終了後の混合物を高速遠心する工程；ならびに、
（ｃ）高速遠心して得られた沈殿を１．３ｍＰａ・s以上の粘度を有する水溶液中に分散
させる工程、
を包含する、方法。 A method of preparing an aqueous solution in which a carbonate apatite encapsulating a drug is dispersed, comprising the following:
(A) a step of incubating a mixture containing calcium ions, phosphate ions, bicarbonate ions, and a drug, wherein the incubation temperature is 10 ° C. or less and the incubation time is within 10 minutes The process;
(B) high-speed centrifugation of the mixture after completion of incubation; and
(C) a step of dispersing a precipitate obtained by high-speed centrifugation in an aqueous solution having a viscosity of 1.3 mPa · s or more,
Including the method.
（ａ）ＲＯ水製造装置または蒸留水製造装置で製造された水を攪拌機に投入する工程；
（ｂ）リン酸イオン、および、炭酸水素イオンを該攪拌機に投入する工程；
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）によって投入された混合物のｐＨを調整する工程；
（ｄ）工程（ｃ）でｐＨを調整した混合物にカルシウムイオン、および薬物を投入し、１０℃以下で１０分以内でインキュベートする工程；
（ｅ）工程（ｄ）でインキュベート前またはインキュベート後の混合物に乳化油性物質を添加する工程；
（ｆ）工程（ｅ）で得られた混合物を、ポリプロピレンを塗布した内筒またはポリプロピレン筒を装着した内筒を有する遠心分離機にて遠心分離して、沈殿を得る工程；ならびに、
（ｇ）工程（ｆ）で得られた沈殿を、該筒の上部または底部より自動挿入したノズルにて、空気、蒸留水、生理食塩水、および増粘剤からなる群から選択される物質を噴射し回収する工程、
を包含する方法。 A method for producing a carbonated apatite containing a drug, comprising:
(A) A step of introducing water produced by an RO water production apparatus or distilled water production apparatus into a stirrer;
(B) introducing a phosphate ion and a bicarbonate ion into the stirrer;
(C) adjusting the pH of the mixture charged in steps (a) and (b);
(D) adding calcium ions and a drug to the mixture adjusted in pH in step (c) and incubating at 10 ° C. or less within 10 minutes;
(E) adding an emulsified oily substance to the mixture before or after incubation in step (d);
(F) Centrifugating the mixture obtained in step (e) in a centrifuge having an inner cylinder coated with polypropylene or an inner cylinder fitted with a polypropylene cylinder to obtain a precipitate; and
(G) A substance selected from the group consisting of air, distilled water, physiological saline, and a thickener is added with a nozzle that automatically inserts the precipitate obtained in step (f) from the top or bottom of the cylinder. Jetting and collecting process,
Including the method.
（ｈ）工程（ｇ）で回収した沈殿をボトル詰めし、凍結乾燥する工程、
を包含する方法。 26. The method of claim 25, further comprising:
(H) Bottled precipitate recovered in step (g) and freeze-dried;
Including the method.
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO2018030338A1 (en) * | 2016-08-08 | 2018-02-15 | 浩文 山本 | Adjuvant composition |
| WO2018220665A1 (en) * | 2017-05-29 | 2018-12-06 | 敏宏 赤池 | Cell transfer agent |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05255095A (en) * | 1992-03-13 | 1993-10-05 | Advance Co Ltd | Intravascular injection |
| JP2003500202A (en) * | 1999-05-26 | 2003-01-07 | シエーリング アクチエンゲゼルシャフト | Method for producing morphologically uniform microparticles and nanoparticles by micromixer |
| JP2006509838A (en) * | 2002-11-12 | 2006-03-23 | 財団法人理工学振興会 | Cell introduction agent, cell introduction method, method for producing cell introduction agent, composition for producing cell introduction agent, and kit for producing cell introduction agent |
| JP2010524859A (en) * | 2007-04-13 | 2010-07-22 | ユニバーシティー オブ ノース テキサス ヘルス サイエンス センター アット フォートワース | Activated PLGA nanoparticle formulation loaded with active agent for use in targeted cancer nanotherapy |
| JP2014105197A (en) * | 2012-11-28 | 2014-06-09 | Hirofumi Yamamoto | Super apatite ultrafine nanoparticle |
-
2016
- 2016-11-07 JP JP2016217225A patent/JP6302531B2/en active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05255095A (en) * | 1992-03-13 | 1993-10-05 | Advance Co Ltd | Intravascular injection |
| JP2003500202A (en) * | 1999-05-26 | 2003-01-07 | シエーリング アクチエンゲゼルシャフト | Method for producing morphologically uniform microparticles and nanoparticles by micromixer |
| JP2006509838A (en) * | 2002-11-12 | 2006-03-23 | 財団法人理工学振興会 | Cell introduction agent, cell introduction method, method for producing cell introduction agent, composition for producing cell introduction agent, and kit for producing cell introduction agent |
| JP2010524859A (en) * | 2007-04-13 | 2010-07-22 | ユニバーシティー オブ ノース テキサス ヘルス サイエンス センター アット フォートワース | Activated PLGA nanoparticle formulation loaded with active agent for use in targeted cancer nanotherapy |
| JP2014105197A (en) * | 2012-11-28 | 2014-06-09 | Hirofumi Yamamoto | Super apatite ultrafine nanoparticle |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018030338A1 (en) * | 2016-08-08 | 2018-02-15 | 浩文 山本 | Adjuvant composition |
| JPWO2018030338A1 (en) * | 2016-08-08 | 2019-06-13 | 浩文 山本 | Adjuvant composition |
| JP7016317B2 (en) | 2016-08-08 | 2022-02-21 | 浩文 山本 | Adjuvant composition |
| WO2018220665A1 (en) * | 2017-05-29 | 2018-12-06 | 敏宏 赤池 | Cell transfer agent |
| JPWO2018220665A1 (en) * | 2017-05-29 | 2020-04-02 | 敏宏 赤池 | Cell transfection agent |
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